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I
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Rodolfo Ugalde, por permitirme realizar la Tesis en su laboratorio, por su generosidad, por su
entusiasmo y por la libertad para trabajar.
A Diego Comerci, por su capacidad de guía, por estar siempre dispuesto a discutir mis resultados, por
transmitirme sus conocimientos, por su buena memoria y por su confianza en mí desde el comienzo.
A Juan Ugalde, por los primeros pasos con las “Brucellas” y por los plásmidos que vinieron desde Yale.
A mis compañeros del laboratorio 321: Rodrigo Sieira, Juan Manuel Spera, Lucas Bukata, Viviana
Lepek, Claudia Herrmann, Cintia Sanchez, Mariela Del Giudice, Valeria Conforte y Jeremías Herzog; y
a mis compañeros del laboratorio 320: Mara Roset, Andrés Ciocchini, Florencia Iannino y Diego Rey
Serantes. Gracias por los buenos momentos que compartimos durante todos estos años.
Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, por el sustento económico.
Al Dr. Jean-Pierre Gorvel y a Suzana Salcedo, por recibirme en su laboratorio del CIML en Marsella, y
a EMBO por el sustento económico para la realización del viaje.
A Nelly Mendoza, Teresa Fernandez, Federico Lazo, Nicolás Bruni, M. Fernanda Peri, Zulma Torres,
Miguel Flores, Néstor Del Castillo, Ernesto Schimenovich, Mirna Ibáñez, Susana Perini, Mónica Romanello,
Paola Scabone, Carmen Reartes, Fabio Fraga y Graciela Gotz. Gracias por su colaboración durante
estos años.
A Pablo Briones, por su ayuda con la edición de esta tesis.
A mis compañeros del IIB, por su colaboración permanente.
A mis amigos, por compartir conmigo tantos momentos lindos de la vida.
II
A mi familia, por su confianza, por su apoyo, y por ser un constante ejemplo de trabajo y perseverancia.
A Diego, por todos estos años juntos, por su paciencia, por su apoyo, y por todas las demás formas de
demostrarme su amor.
III
Parte de los resultados obtenidos en este trabajo de tesis han sido publicados en los siguientes
artículos:
- Salcedo SP, Marchesini MI, Lelouard H, Fugier E, Jolly G, et al. 2008. Brucella Control of Dendritic Cell
Maturation Is Dependent on the TIR-Containing Protein Btp1. PLoS Pathog 4(2): e21. doi:10.1371/
journal.ppat.0040021
- Marchesini MI, Ugalde JE, Czibener C, Comerci DJ and Rodolfo Ugalde. 2004. N-terminal-capturing
screening system for the isolation of Brucella abortus genes encoding surface exposed and secreted
proteins. Microbial Pathogenesis 37: 95–105.
IV
ABREVIATURAS
ADN: ácido desoxirribonucléico
Amp: ampicilina
AMP: adenosina monofosfato
AMPc: adenosina monofosfato cíclico
ARN: ácido ribonucléico
ATP: adenosina trifosfato
BMDC (bone marrow-derived dendritic cells): Células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón
BMDM (bone marrow-derived macrophages): Macrófagos derivados de médula ósea de ratón
BSA: albúmina sérica bovina
CAT: cloranfenicol acetil transferasa
Cb: carbenicilina
CDs: células dendríticas
Cm: cloranfenicol
cpm: cuentas por minuto
DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol
DO: densidad óptica
EDTA: ácido etilendiaminotetraacético
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay): Inmunoanálisis ligado a enzimas
FITC: isotiocianato de fluoresceína
Gm: gentamicina
IF: inmunofluorescencia
IPTG: isopropil-β-D-tiogalactopiranósido
Kan: kanamicina
kDa: kiloDaltons
Kpb: kilopares de bases
LB: medio de cultivo Luria-Bertani
LPS: lipopolisacárido
mCi: miliCurie
MEM: medio esencial mínimo
MOI (multiplicity of infection): multiplicidad de infección
Nal: ácido nalidíxico
V
ON (overnight): durante la noche
p. i.: post-infección
PAGE (polyacrylamide gel electroforesis): electroforesis en gel de poliacrilamida
pb: pares de bases
PBS (phosphate buffered saline): buffer fosfato salino
PCR (polymerase chain reaction): reacción en cadena de la polimerasa
PM: peso molecular
PMSF (phenylmethylsulphonyl fluoride): fluoruro de fenil metil sulfonilo
rpm: revoluciones por minuto
RE: retículo endoplásmico
SDS (sodium dodecyl sulphate): dodecil-sulfato de sodio
SFB: suero fetal bovino
TBS (Tris Buffered Saline): buffer tris salino
TCA (trichloroacetic acid): ácido tricloroacético
TF: peptidil prolil cis trans isomerasa, trigger factor
TLRs: receptores Toll-like
Tris: 2 amino-2 hidroximetil-1,3-propanodiol
TSB (Tryptic Soy Broth): medio de cultivo tripticasa de soja
UFC: unidad formadora de colonia
VCB: Vacuola que contiene a Brucella
VI
ÍNDICE
RESUMEN………………………………………………………………………………………..................1
SUMMARY……………………………………………………………………………………......................2
INTRODUCCIÓN GENERAL
LA BRUCELOSIS……………………………………………………………………………….................3
Perspectiva histórica…………………………………………………………………………...................3
La enfermedad………………………………………………………………………………...................3
EL GÉNERO BRUCELLA………………………………………………………………………................5
BIOLOGÍA CELULAR DE BRUCELLA………………………………………………………...............6
Internalización ………………………………………………………………………………...................6
Tráfico intracelular……………………………………………………………………………..................7
Factores de virulencia………………………………………………………………………….................9
SISTEMAS BACTERIANOS DE SECRECIÓN DE PROTEÍNAS....................................................11
Sistema de secreción general Sec……………………………………………………………..................12
Sistemas de secreción tipo I…………………………………………………………………...................13
Sistemas de secreción tipo II………………………………………………………………….................13
Sistemas de secreción tipo III…………………………………………………………………...............13
Sistemas de secreción tipo IV…………………………………………………………………...............15
Sistemas de secreción tipo V o Autotransportadores………………………………………….................18
Sistemas de secreción tipo VI…………………………………………………………………...............19
ROL DE LOS SISTEMAS DE SECRECIÓN TIPO IV EN LA VIRULENCIA……………..............19
Metodologías utilizadas en la identificación de las proteínas translocadas………………….....................19
Sustratos del sistema de secreción tipo IV ……………………………………………………................21
Señal de secreción……………………………………………………………………………................23
Sistema de secreción VirB de Brucella………………………………………………………................24
ANTECEDENTES Y OBJETIVOS……………………………………………………………................25
Capítulo I - Identificación de proteínas de Brucella abortus secretadas in vitro
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………...............27
VII
RESULTADOS………………………………………………………………………………….................29
Construcción de una colección de fusiones traduccionales a cat …………………………….................29
Identificación de proteínas secretadas………………………………………………………..................29
Análisis de la secreción de las proteínas de fusión por Western Blot………………………....................31
Caracterización de las proteínas de fusión……………………………………………………................32
Análisis de la secreción de las proteínas identificadas por Western Blot……………………...................33
Estudio de la participación de las proteínas identificadas en la virulencia de B. abortus……...................35
DISCUSIÓN………………………………………………………………………………………..............36
Capítulo II - Identificación de proteínas de Brucella abortus secretadas intracelularmente
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………................41
RESULTADOS…………………………………………………………………………………..................43
La toxina Adenilato Ciclasa de Bordetella pertussis: proteína reportera de
translocación intracelular……………………………………………………………………....................43
Identificación de proteínas de B. abortus con dominios eucariotas…....................................................43
Construcción de fusiones traduccionales a CyaA…………………………………………….................48
Identificación de proteínas de B. abortus translocadas al citoplasma eucariota………………................50
Identificación de proteínas translocadas por el sistema VirB de B. abortus…………………..................52
Análisis del rol de las proteínas BAB1_0279 y BAB1_0756 en el control de la
maduración de las células dendríticas infectadas con B. abortus……………………………..................53
DISCUSIÓN………………………………………………………………………………………..............58
Capítulo III-Caracterización de la proteína BAB2_0123, sustrato del sistema VirB de Brucella abortus
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………...............62
RESULTADOS…………………………………………………………………………………..................62
Análisis in silico de BAB2_0123……………………………………………………………..................62
Detección de BAB2_0123 en células infectadas por microscopía …………………………...................66
Detección de la translocación de BAB2_0123 en macrófagos por Western Blot…………….................68
Análisis de la expresión de la proteína BAB2_0123 en B. abortus…………………………..................69
Determinación de la localización subcelular de la proteína BAB2_0123 en B. abortus……....................70
VIII
Determinación de la secuencia aminoacídica requerida para la translocación
de BAB2_0123 al citoplasma eucariota………………………………………………………................71
Análisis del rol de la proteína translocada por el sistema VirB en la virulencia de B. abortus……...................73
Determinación de la toxicidad de BAB2_0123 en levaduras………………………………….................75
Expresión de la proteína BAB2_0123 en células de mamífero………………………………..................75
DISCUSIÓN………………………………………………………………………………………..............79
CONCLUSIONES...............................................................................................................................85
PERSPECTIVAS FUTURAS……………………………………………………………………...............87
MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………………….....................88
Condiciones de cultivo y medios…...…………………………………………………………....................88
Cepas bacterianas y plásmidos……………......………………………………………………..................88
Técnicas de biología molecular……………....…………………………………………………..................88
Purificación de ADN genómico………….....…………………………………………………...................88
Construcción del plásmido pDK51……………......…………………………………………….................89
Construcción de los plásmidos pCAT I, II y III…….....……………………………………….....................89
Construcción de la colección de fusiones traduccionales a cat……….....………………………..................90
Identificación de proteínas de fusión con actividad CAT en E. coli…………….....……………...................90
Identificación de las proteínas de fusión secretadas en B. abortus 2308…………....…………....................90
Detección de la secreción de las fusiones a CAT por Western Blot………………....…………....................91
Análisis de secuencia y búsqueda en bases de datos……………………………….....………..................92
Análisis Bioinformático………………………………………………………………......….....................92
Obtención de anticuerpos contra las proteínas de secreción identificadas………….…......……...................92
Detección de Trigger factor (TF) por Western Blot……………………………………......….….............93
Análisis de la secreción de la proteína de fusión TF(1-35)::CAT en mutantes virB……………........................93
Construcción de la cepa mutante B. abortus 2308 flgE::Gm……………………………….........................93
Construcción de la cepa mutante B. abortus 2308 tf::Gm………………………………….........................94
Construcción de la cepa mutante B. abortus 2308 intimina::Gm……………………………......................94
Construcción de las cepas mutantes por deleción B. abortus Δp74 y Δp84………………….......................95
Cultivo de células……………………………………………………………….………….....................96
Ensayos de infección en células. …………………………………………………….……….....................96
IX
Ensayos de infección en ratones……………………………………………………………......................97
Construcción de los plásmidos pBCSP31-cyaA y pvirB-cyaA………………………………...................97
Construcción de las fusiones traduccionales a cyaA………………………………………….................98
Obtención de anticuerpos anti-CyaA………………………………………………………......................98
Análisis de expresión de las fusiones a cyaA por Western Blot…………………….………...................98
Detección de translocación al citoplasma del dominio CyaA.................................................……….....99
Alineamientos múltiples…………………………………………………………………….....................99
Construcción de las cepas mutantes btp1-, btp2- y btp1btp2-………………………………...................99
Cuantificación de IL-12(p40/p70) …………………………………………………………...................100
Medición de actividad Luciferasa……………………………………………………………................100
Construcción de fusiones traduccionales al epítope 3xFLAG………………………………..................100
Construcción de la cepa merodiploide B. abortus 2308 ba20123::3xFLAG ………………..................101
Microscopía de Inmunofluorescencia………………………………………………………...................101
Anticuerpos usados en Microscopía de Inmunofluorescencia………………………………..................102
Análisis de expresión de las fusiones a 3xFLAG por Western Blot………………………….................102
Detección de BAB_20123::3xFLAG en células infectadas por Western Blot ……………....................102
Construcción del plásmido pGemT-ba20123………………………………………………..................103
Obtención de anticuerpos anti-BAB2_0123…………………………………………………................103
Análisis de la expresión de BAB_20123 in vitro por Western Blot ………………………...................104
Preparación de membranas totales………………………………………………………….................104
Construcción de las fusiones traduccionales ba20123-cyaA y cyaA-ba20123……………….............104
Construcción de la cepa mutante B. abortus ba20123::Kan………………………………….............105
Ensayo de toxicidad en levaduras……………………………………………………………................105
Construcción de los plásmidos pMyc-ba20123 (1-153) y pMyc-ba20123 (25-153) ……….................106
Ensayos de transfección…………………………………………………………………….................106
Secuenciación……………………………………………………………………………….................107
APÉNDICE……………………………………………………………………………………..................112
REFERENCIAS………………………………………………………………………………..….............113
Resumen - 1
RESUMEN
Las proteínas de superficie y secretadas por microorganismos patógenos constituyen, en muchos casos,
determinantes clave de su virulencia. Brucella abortus es una bacteria Gram negativa, intracelular facultativa,
y el agente causal de la brucelosis. El análisis de los genomas de las distintas especies de Brucella no reveló la
presencia de factores de virulencia clásicos tales como adhesinas o toxinas. Por este motivo, uno de los objetivos
de esta tesis fue la identificación de proteínas secretadas in vitro, y la evaluación de su participación en la
virulencia. En el primer capítulo se describe el uso de una metodología novedosa, diseñada con el propósito de
identificar proteínas secretadas al medio de cultivo por B. abortus. Mediante la generación de fusiones de
extremos amino-terminales de proteínas de B. abortus a la proteína reportera cloranfenicol acetil transferasa, se
identificaron diez proteínas de fusión secretadas al medio de cultivo. Por medio de experimentos de Western Blot
con un antisuero específico se demostró que una de las proteínas, la enzima trigger factor, es secretada al
medio de cultivo por B. abortus. Además, se determinó que esta proteína participa en los procesos de virulencia
de la bacteria en el modelo de infección murino.
Experimentos recientes demostraron que el sistema de secreción tipo IV de Brucella, denominado VirB,
es esencial para la replicación intracelular y para la persistencia de la bacteria en ratones infectados. Se especula
que moléculas efectoras translocadas al citoplasma de la célula huésped por la maquinaria VirB serían las
responsables de dirigir el tráfico intracelular de la vacuola que contiene a la bacteria, para el establecimiento de
un nicho de replicación intracelular. Teniendo en cuenta estos antecedentes, y el rol de los sistemas de secreción
tipo IV en la translocación de moléculas efectoras al citoplasma del huésped en otras especies patógenas, se
propuso la identificación de sustratos del sistema VirB de B. abortus. En el segundo capítulo se describe el
análisis in silico del proteoma teórico de B. abortus, mediante el cual se pudieron identificar ocho proteínas con
dominios y/o motivos de interacción propios de eucariotas, consideradas sustratos putativos del sistema VirB.
Para detectar la translocación intracelular de estas proteínas se construyeron fusiones a la proteína reportera
adenilato ciclasa de Bordetella pertussis. El análisis in silico del proteoma de B. abortus, acoplado al uso de la
enzima adenilato ciclasa, hicieron posible la identificación de dos proteínas translocadas intracelularmente, una
de las cuales, BAB2_0123, es transportada por el sistema VirB de B. abortus. En el tercer capítulo se confirma
la secreción de BAB2_0123 por el sistema VirB, se determina que la secuencia amino-terminal es necesaria
para la translocación de la proteína al citoplasma de la célula huésped, y se analiza la localización de BAB2_0123
Resumen - 2
en experimentos de expresión en células de mamíferos, los que permiten sugerir una posible interacción de la
proteína con el citoesqueleto de actina.
SUMMARY
Surface as well as secreted proteins are usually the main virulence factors of pathogenic bacteria.
Brucella abortus is a Gram negative bacterium and the causative agent of brucellosis. Since classical
virulence factors, such as toxins or adhesins, are absent in Brucella, one of the goals of this thesis was the
identification of in vitro secreted proteins that might be involved in virulence. In the first chapter, a novel
method for the identification of proteins secreted to the culture medium by B. abortus is described. A
library of B. abortus N-terminal protein fragments fused to the reporter enzyme chloramphenicol acetytl
transferase was generated and ten fusion proteins were identified as secreted to the culture medium. By
means of Western Blot analysis with a specific antibody we were able to confirm that the enzyme trigger
factor is secreted to the culture medium. What is more, it was demonstrated that trigger factor is involved
in virulence of B. abortus in mice.
Recently, it was demonstrated that Brucella type IV secretion system (VirB) is essential for intracellular
replication and persistence of Brucella spp. in infected mice. Considering the role of type IV secretion
systems in the delivery of effector molecules to the host cell cytoplasm by other pathogenic bacteria, it is
speculated that proteins delivered by Brucella VirB system are involved in modulating traffic events in
order to allow the biogenesis of a replicative vacuole. In order to identify VirB substrates, the second part
of the thesis was focused on proteins intracellularly translocated by B. abortus. The second chapter
includes in silico analysis of B. abortus proteome, which revealed the presence of eight proteins with
eukaryotic domains that were considered putative VirB substrates. To evaluate intracellular translocation
of these proteins, fusions to Bordetella pertussis adenylate cyclase were generated. In silico analysis of B.
abortus proteome, in conjunction with the use of adenylate cyclase reporter enzyme, allowed the identification
of two intracellularly translocated proteins. One of these proteins, BAB2_0123, is translocated by Brucella
VirB system. In the third chapter, VirB dependent secretion of BAB2_0123 is confirmed, and it is
demonstrated that its amino-terminal region is necessary for translocation into the host cell cytoplasm.
Finally, ectopic expression of BAB2_0123 in mammalian cells suggests some kind of interaction with
actin cytoskeleton.
INTRODUCCIÓN GENERAL
Introducción- 3
INTRODUCCIÓN GENERAL
LA BRUCELOSIS
Perspectiva histórica
El análisis de los restos óseos de los residentes de Herculano, muertos tras la erupción del volcán Vesubio
en el año 79 D. C., reveló la presencia de lesiones típicas de brucelosis en más del 17% de los habitantes. La alta
incidencia de la enfermedad pudo explicarse al analizar por microscopía electrónica de barrido el queso de cabra
carbonizado y encontrado junto a los restos humanos. Allí se encontraron formas coco-bacilares morfológicamente
similares a Brucella spp. (Capasso, 2002). Dieciocho siglos más tarde, precisamente en 1887, Sir David Bruce
logra aislar el agente causal de la “fiebre de Malta” a partir de una muestra de hígado de un soldado británico
muerto por esta afección en Malta (Bruce, 1887). La especie originalmente denominada Micrococcus melitensis,
fue rebautizada Brucella melitensis en honor a David Bruce. En 1905, se demuestra la naturaleza zoonótica de
la enfermedad al aislar la bacteria a partir de leche de cabra (Godfroid et al., 2005).
La enfermedad
La brucelosis es una zoonosis que afecta a varios mamíferos incluyendo vacas, cabras, cerdos, ovejas,
roedores, perros y algunos mamíferos marinos. Los síntomas de la enfermedad en animales son placentitis y
aborto en hembras preñadas, y esterilidad y orquitis en machos (Nicoletti, 1989). La enfermedad afecta la
capacidad reproductiva de muchos animales criados para su consumo, lo que provoca severas pérdidas económicas.
Actualmente, la brucelosis está ampliamente distribuida y afecta a numerosos países de Europa (principalmente
en la cuenca del Mediterráneo), Medio Oriente, Asia, África y Latinoamérica (Godfroid et al., 2005). En Argentina,
se calcula que las pérdidas económicas causadas por la enfermedad, principalmente por la infección del ganado
bovino con Brucella abortus, rondan los 60 millones de dólares por año (SENASA, 2000).
En el hospedador primario la enfermedad se disemina entre individuos por vía venérea o por contacto de
las mucosas (conjuntivas, respiratorias y digestivas) con tejidos infectados (abortos, placentas) o con secreciones
(leche) (Smith y Ficht, 1990). En un primer momento, la bacteria provoca una infección sistémica y posteriormente
se localiza en órganos relacionados con el sistema retículo endotelial tales como hígado, bazo y nódulos linfáticos,
y en órganos reproductores y glándulas mamarias. La invasión del tejido trofoblástico del útero grávido y la
rápida multiplicación de la bacteria terminan produciendo los síntomas característicos de aborto e infertilidad.
Introducción- 4
Durante la infección, Brucella se localiza y replica intracelularmente en células fagocíticas profesionales
(macrófagos) y no profesionales (trofoblastos) del hospedador. Los macrófagos infectados migran hacia los
nódulos linfáticos, lugar en el que las bacterias se pueden liberar por lisis celular, permitiendo su diseminación y
reiniciando el ciclo de infección.
La enfermedad se transmite a humanos por la ingestión de lácteos contaminados no pasteurizados, por
contacto con animales infectados a través de heridas y mucosas conjuntivas, o por inhalación de aerosoles. Por
este motivo, la brucelosis es considerada una enfermedad de riesgo ocupacional para ciertos trabajos que exigen
el contacto con vacas, cabras o cerdos (trabajadores de frigoríficos, trabajadores rurales, veterinarios, etc.) y
para trabajadores de laboratorios microbiológicos. La transmisión entre humanos por vía sexual o por transplante
de órganos ha sido ocasionalmente reportada (Mantur et al., 1996).
La gravedad de la enfermedad y la ausencia de vacunas para el humano, han llevado a que las especies
Brucella suis, B. abortus y B. meltensis sean consideradas potenciales agentes de bioterrorismo. Una característica
llamativa de B. melitensis en relación a su posible uso como arma biológica, es que un pequeño inóculo de entre
10 y 100 microorganismos es suficiente para causar infección (Pappas et al., 2006). Sin embargo, los largos
períodos de incubación antes del desarrollo de la enfermedad hacen poco factible el uso de Brucella spp. como
armas biológicas (Pappas et al., 2006).
Luego del contagio, y después de un período de incubación de dos a cuatro semanas, se manifiesta la
etapa aguda de la brucelosis humana caracterizada principalmente por fiebre ondulante, sudoración nocturna,
fatiga, anorexia, pérdida de peso, cefalea y artralgia. El tratamiento efectivo de la enfermedad consiste en una
terapia por tiempo prolongado con una combinación de antibióticos (rifampicina y doxiciclina) (Corbel, 1997). En
ausencia de tratamiento, la enfermedad puede alcanzar la fase crónica, en la que se pueden manifestar focos de
infección que causan artritis, endocarditis, meningitis y desórdenes neurológicos que pueden producir depresión
(Smith y Ficht, 1990).
El diagnóstico definitivo de la brucelosis humana se realiza mediante el aislamiento de la bacteria a partir
de tejidos infectados como sangre o médula ósea. Sin embargo, dado que la sensibilidad de estas técnicas es baja
y requiere largos tiempos debido al lento crecimiento de Brucella, se realizan diagnósticos presuntivos por medio
de la detección de anticuerpos anti-Brucella en suero (Godfroid et al., 2005).
Debido a que las vacunas desarrolladas para animales son patógenas para humanos, la prevención de la
brucelosis humana depende fundamentalmente del control de la enfermedad en los animales que constituyen el
reservorio de la enfermedad. Los principales métodos de control, y eventual erradicación, de la brucelosis animal
Introducción- 5
son el aislamiento de los animales infectados, la vacunación con cepas atenuadas y, en menor medida, la aplicación
del rifle sanitario (Godfroid et al., 2005)
EL GÉNERO BRUCELLA
Las bacterias del género Brucella son cocobacilos Gram negativos que pertenecen al subgrupo α-2 de
las proteobacterias (Moreno et al., 1990). En este grupo también se ubican los géneros Ochrobactrum, Rhizobium,
Rhodobacter, Agrobacterium, Bartonella y Rickettsia, algunos de los cuales incluyen especies que también
son capaces de establecer asociaciones íntimas con organismos eucarióticos, ya sea como patógenos o como
endosimbiontes.
El género Brucella está constituido por 8 especies que fueron clasificadas en función de la preferencia
de hospedador. Estas son: B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B. canis, B. neotomae, B. pinnipedialis
sp. nov. y B. ceti sp. nov. Algunas de estas especies poseen un único hospedador mamífero, mientras que otras
poseen una preferencia de hospedadores más laxa, siendo capaces de infectar a más de una especie animal e
incluso, en algunos casos, al hombre.
B. abortus es la principal responsable de la brucelosis bovina y también es capaz de infectar humanos.
Constituye la especie de Brucella más diseminada en el mundo, por lo cual representa un gran riesgo de infección
zoonótica para el hombre. B. melitensis es la responsable de la forma más severa de la enfermedad en humanos.
Infecta principalmente a cabras y ovejas, aunque también es capaz de infectar a camellos y dromedarios. B.
suis, otra especie que infecta humanos, se encuentra habitualmente en cerdos y también en poblaciones naturales
de liebres, caribúes, renos y alces. B. ovis, B. canis y B. neotomae son las especies menos distribuidas, infectan
principalmente a ovejas, perros y ratas del desierto del género Neotoma, respectivamente. B. canis también es
capaz de infectar y causar la enfermedad en humanos, aunque esto es muy poco frecuente, aún en países donde
la prevalencia de infección en perros es alta. Por el contrario, B. ovis y B. neotomae no representan un riesgo
para el hombre. Finalmente, B. pinnipedialis sp. nov. y B. ceti sp. nov. son capaces de infectar cetáceos y
pinnípedos, respectivamente. Recientemente, fue descripta B. microti sp. nov., una especie aislada de roedores
salvajes en Europa Central (Scholz et al., 2008).
El genoma de Brucella está organizado en dos cromosomas de 2,2 Mpb y 1,1 Mpb, no habiéndose
identificado plásmidos u otros elementos genéticos movilizables. Los genomas de B. suis, B. melitensis y B.
abortus fueron recientemente secuenciados (Chain et al., 2005; DelVecchio et al., 2002; Halling et al., 2005;
Introducción- 6
Paulsen et al., 2002). Los estudios de genómica comparativa entre estas tres especies demostraron que más del
90% de los genes poseen entre un 98% y un 100% de identidad a nivel nucleotídico y presentan el mismo
ordenamiento en el cromosoma. La comparación de los genomas reveló que el género Brucella ha sufrido en
forma especie-específica, un número importante de inactivaciones genéticas debido a mutaciones puntuales,
microdeleciones o corrimientos en el marco de lectura que condujeron a la formación de pseudogenes en los
distintos linajes (Chain et al., 2005). Si bien hasta la fecha no se han identificado los determinantes genéticos
responsables de la especificidad de hospedador de las distintas especies de Brucella, la comparación entre los
patrones de pseudogenización observados en las tres especies secuenciadas hasta el momento, indica que las
inactivaciones genéticas se acumulan mayoritariamente en sistemas relacionados con el transporte a través de
membranas (17-24% del total de pseudogenes según la especie), la síntesis de estructuras de membrana externa
(9%), y la regulación transcripcional (6%). Considerando el alto grado de conservación genética entre las tres
especies, la acumulación diferencial de pseudogenes en reguladores transcripcionales y estructuras de membrana
externa podría estar relacionada con el establecimiento de la especificidad de hospedador.
BIOLOGÍA CELULAR DE BRUCELLA
La virulencia de Brucella radica principalmente en su capacidad de invadir, sobrevivir y replicarse en
células fagocíticas y no fagocíticas. Debido a que puede cultivarse in vitro y sobrevive en el ambiente por
períodos cortos de tiempo, Brucella es considerada un “patógeno intracelular facultativo”. Sin embargo, si se
considera que las células de mamíferos constituyen el nicho privilegiado para su multiplicación y que los mamíferos
constituyen el principal, sino el único, reservorio de Brucella, esta bacteria debe ser considerada esencialmente
un “patógeno intracelular” (Celli, 2006).
Internalización
Recientemente, distintos grupos de investigación demostraron en forma independiente que la internalización
de Brucella en la célula hospedadora está mediada por la interacción de la bacteria con rafts lipídicos, dominios
de la membrana plasmática eucariota que se caracterizan por ser ricos en colesterol, esfingolípidos, gangliósidos
GM1 y proteínas asociadas a membrana por glicosilfosfatidilinositol (Naroeni y Porte, 2002; Watarai et al.,
2002). Experimentos de microscopía electrónica y videomicroscopía realizados por el grupo de Watarai mostraron
que Brucella, luego de contactar la membrana plasmática de la célula eucariota, se desplaza sobre la superficie
Introducción- 7
de la misma (fenómeno al que denominaron bacterial swimming) produciéndose a su vez una especie de
selección de microdominios de la membrana con los cuales la bacteria interactúa en forma previa a la internalización
(Watarai et al., 2002). Según los resultados de este grupo, una vez que la bacteria hace contacto con los rafts
lipídicos se produce membrane ruffling y la posterior internalización de la bacteria por macropinocitosis (Watarai
et al., 2002).
En un trabajo posterior, los mismos autores proponen que la entrada de Brucella se produce mediante el
contacto de la chaperona bacteriana Hsp60 con la proteína priónica celular PrPc, en un proceso mediado por la
maquinaria de secreción de proteínas VirB (Watarai et al., 2003). Sobre la base de los resultados obtenidos a
partir de experimentos realizados con mutantes virB, Watarai y colaboradores proponen que las interacciones
mediadas por el sistema VirB determinan en forma simultánea la vía de entrada y el destino que sufrirá Brucella
en el interior de la célula huésped, siendo indispensables para dirigir el tráfico intracelular de la vacuola que
contiene a Brucella, de forma tal que logre establecer su nicho de replicación. Sin embargo, existe cierta
controversia en cuanto al rol de la maquinaria VirB durante la entrada a la célula huésped y el efecto de esta
última sobre el tráfico intracelular de la vacuola que contiene a la bacteria. Trabajos independientes en los que se
realizaron experimentos de infección de distintos tipos de células en cultivo, mostraron que durante los eventos
tempranos del tráfico intracelular de B. abortus, el comportamiento de distintas cepas mutantes virB es
indistinguible del de la cepa salvaje (Celli et al., 2003; Comerci et al., 2001). Por otro lado, en experimentos
realizados recientemente por el grupo de J. P. Liautard se observó que la Prpc del huésped no juega ningún rol en
la infección de macrófagos J774 o de la línea derivada de macrófagos de humano THP-1 con B. suis o B.
abortus (Fontes, 2004).
A su vez, ha sido reportado que mutantes rugosas (carecen del antígeno O en el LPS) de B. suis son
internalizadas por los macrófagos por un mecanismo independiente de los rafts lipídicos que determina que las
vacuolas que contienen a Brucella se fusionen rápidamente con los lisosomas, proceso que culmina con la
destrucción de la bacteria (Porte et al., 2003). Estos resultados, además de confirmar que la entrada mediada
por rafts lipídicos es determinante para la supervivencia de Brucella en etapas tempranas de la infección,
demuestran la importancia del LPS intacto en la entrada de Brucella a la célula hospedadora.
Tráfico intracelular
Los patógenos intracelulares poseen la capacidad de persistir y multiplicarse en el interior de fagocitos
profesionales, lo cual implica la presencia de mecanismos que promueven la evasión de la actividad antimicrobiana
Introducción- 8
de estas células. Esta actividad involucra la internalización de los agentes infecciosos por fagocitosis y su posterior
degradación. Luego de la internalización, las partículas fagocitadas se localizan en un compartimiento membranoso
denominado fagosoma. Posteriormente, se produce la maduración del fagosoma a lo largo de la vía endocítica.
En este proceso madurativo, el fagosoma sufre modificaciones en los componentes de membrana y adquiere en
forma secuencial y transitoria marcadores de endosomas tempranos (por ejemplo Rab5 y EEA1), de endosomas
tardíos, y de lisosomas (LAMP, H+-ATPasa, catepsina, etc.) (Duclos y Desjardins, 2000). Como resultado de
este proceso, se produce la maduración de la vesícula endocítica, la fusión con el lisosoma, y la formación de un
compartimiento acídico llamado fagolisosoma en el cual la bacteria fagocitada es degradada por enzimas hidrolíticas.
A pesar de la complejidad de las funciones microbicidas de los fagocitos, los patógenos han desarrollado
diversos mecanismos que le permiten subvertir estos mecanismos de defensa para evitar su destrucción, y en el
caso de los patógenos intracelulares, replicarse en el interior de estas células. Algunas de las estrategias utilizadas
por los patógenos intracelulares para sobrevivir y multiplicarse en el interior de la célula hospedadora son: i)
disrupción de la membrana del fagosoma y escape hacia el citoplasma; ii) arresto de la maduración de los
fagosomas en distintos estadios anteriores a la fusión con los lisosomas; iii) desarrollo de mecanismos de adaptación
que les permitan sobrevivir dentro de los fagolisosomas.
Como se mencionó anteriormente, las especies patógenas del género Brucella tienen la capacidad de
invadir y replicar intracelularmente en células fagocíticas (macrófagos de las líneas J774.A1 y THP1, y células
dendríticas) (Celli et al., 2003; Liautard et al., 1996; Salcedo et al., 2008) y en células no-fagocíticas (HeLa,
Vero, trofoblastos y fibroblastos 3T3) (Delrue et al., 2001; Pizarro-Cerda et al., 1998a; Pizarro-Cerda et al.,
2000).
El tráfico intracelular de Brucella se caracterizó mediante el análisis por microscopía de
inmunofluorescencia de células infectadas in vitro (Celli et al., 2003; Detilleux et al., 1990; Pizarro-Cerda et al.,
1998a; Pizarro-Cerda et al., 1998b). Según estos estudios, Brucella utiliza mecanismos similares para controlar
su supervivencia y replicación intracelulares en los distintos tipos de células hospedadoras. La única diferencia
entre fagocitos profesionales y no profesionales, es que en estos últimos la bacteria explota la vía autofágica
(Pizarro-Cerda et al., 1998a). A partir de estos estudios se ha concluido que, aunque un porcentaje importante de
bacterias es degradado en fagolisosomas, una fracción de las bacterias intracelulares pueden eludir el camino
endocítico dirigiendo su tráfico intracelular hacia un compartimento subcelular apto para su replicación.
Varios estudios han demostrado que una vez internalizada, Brucella es rodeada de una membrana
constituyendo la Vacuola que Contiene a Brucella (VCB), la cual es capaz de evadir la vía endocítica y promover
Introducción- 9
la formación de la vacuola replicativa (Kohler et al., 2002b; Kohler et al., 2003). Durante los primeros minutos
de la infección, la VCB colocaliza con marcadores de membrana de endosomas tempranos (Rab5 y EEA1).
Esta interacción es rápida y transitoria, dado que esta colocalización se reduce drásticamente durante los primeros
30 minutos post-infección. La pérdida de EEA1 se ve acompañada simultáneamente por el aumento de la colocalización con el marcador LAMP-1 de endosomas tardíos y lisosomas. Aunque esta colocalización también es
transitoria, la cinética de la pérdida de este marcador es más lenta que para el caso de EEA1. Recientemente, se
ha demostrado que la VCB también adquiere los marcadores Rab7 y RILP (Rab-interacting lysosomal protein),
característicos de endosomas tardíos/lisosomas. Además, la fusión con lisosomas resulta esencial para que la
VCB madure y derive en una vacuola apta para la replicación intracelular (Starr et al., 2008).
Se ha demostrado que en los primeros estadíos de la infección, la VCB adquiere marcadores de retículo
endoplasmático como sec61β y calnexina (Celli et al., 2003; Pizarro-Cerda et al., 1998a; Pizarro-Cerda et al.,
1998b), aumentando la proporción de vacuolas positivas para estos marcadores a medida que transcurre la
infección. Estos resultados estarían indicando que existe un permanente intercambio de componentes con el
retículo endoplásmico o membranas derivadas del mismo. La replicación exponencial de la bacteria comienza
entre las 4 y 12 horas post-infección, incrementándose el número de bacterias en 1 ó 3 órdenes de magnitud,
dependiendo del sistema estudiado. El compartimento subcelular en el que replica Brucella posee marcadores
moleculares (sec61β, calnexina, calreticulina y PDI) y características funcionales (vacuolización luego del
tratamiento con proaerolisina) de retículo endoplásmico, tanto en fagocitos profesionales como en líneas de
células epiteliales (Abrami et al., 1998; Celli et al., 2003). En la Figura 1 se muestra un esquema que detalla el
tráfico intracelular de Brucella en macrófagos.
Estas evidencias permiten proponer que la supervivencia de Brucella en el interior de la célula hospedadora
se debe a su capacidad para controlar la maduración del fagosoma que la contiene, interrumpiendo de ese modo
el camino endocítico, impidiendo la degradación en fagolisosomas y promoviendo la biogénesis de una vacuola
derivada del retículo endoplásmico apta para su replicación.
Factores de virulencia
La característica principal de todo organismo patógeno es su capacidad de evadir los mecanismos de
defensa del huésped. Para ello, es imprescindible que se establezca una comunicación huésped-patógeno,
generalmente llevada a cabo por moléculas denominadas factores de virulencia. La identificación de los genes
Introducción- 10
Figura 1. Representación esquemática del tráfico intracelular de Brucella en macrófagos. Luego de una
internalización mediada por rafts lipídicos (1), Brucella reside en una vacuola denominada BCV (por Brucella
Containing Vacuole) que interactúa con endosomas tempranos y adquiere los marcadores EEA, Rab5 y TfR (2).
Posteriormente, la BCV interactúa de manera transiente con endosomas tardíos y lisosomas, y adquiere los marcadores
LAMP1, catepsina D y Rab7 (3). En este punto, las BCVs que interactúan y se fusionan con membranas derivadas del
retículo endoplásmico (4) logran establecer una organela apta para la replicación que posee los marcadores calnexina,
calreticulina, sec61β y PDI (5). Por el contrario, las bacterias que residen en BCVs que se fusionan con lisosomas son
degradadas en fagolisosomas (6). Adaptado de Fugier et al., 2007.
que codifican para estos factores y la elucidación de sus mecanismos de acción son los principales objetivos de
estudio de la microbiología de los patógenos bacterianos.
Brucella no posee factores de virulencia clásicos tales como fimbrias, flagelos, cápsulas, exotoxinas,
enzimas citolíticas, plásmidos, fagos lisogénicos; incluso su lipopolisacárido posee menor actividad endotóxica
que el de otras bacterias Gram negativas (Moreno et al., 1981).
Entre los principales factores de virulencia descriptos hasta el momento en Brucella se encuentran el
sistema de dos componentes BvrR/BvrS (Guzman-Verri et al., 2002; Sola-Landa et al., 1998), los glucanos β1,2-cíclicos (Arellano-Reynoso et al., 2005; Briones et al., 2001; Inon de Iannino et al., 1998; Roset et al., 2004,
2006) y el sistema de secreción de proteínas de Tipo IV VirB (Comerci et al., 2001; Sieira et al., 2000; Sieira et
al., 2004) (Fig. 2). El sistema de dos componentes BvrR/BvrS es esencial para la invasión y replicación intracelular.
Por su parte, los glucanos β-1,2-cíclicos son centrales para la evasión de la fusión entre las VCBs y los lisosomas.
Introducción- 11
Respecto del sistema de secreción VirB, trabajos realizados por nuestro grupo de investigación utilizando
células HeLa, así como estudios realizados por otros investigadores en fagocitos profesionales, permitieron
comprobar que este sistema tiene un rol fundamental en el control del tráfico intracelular y de la maduración de
las VCBs (Celli et al., 2003; Comerci et al., 2001). El sistema de secreción VirB no es requerido durante las
primeras etapas de la infección como el LPS y los glucanos β-1,2 cíclicos, pero sí para la interacción sostenida
y la fusión de las VCBs con el retículo endoplásmico. Esta interacción de las VCBs con el retículo endoplásmico
tiene lugar en dominios específicos del retículo denominados ERES (por endoplasmic reticulum exit sites).
Tales interacciones requieren del sistema de secreción VirB y de la acción de la GTPasa Sar1 de la célula
hospedadora, cuya actividad es esencial para la formación del nicho replicativo de Brucella (Celli et al., 2005).
Figura 2. Representación esquemática de la evasión de la vía endocítica degradativa mediante la expresión de
factores de virulencia en Brucella. La entrada de la bacteria mediada por rafts lipídicos es dependiente del LPS. El
sistema de dos componentes BvrR/BvrS, el LPS y los glucanos β-1,2 cíclicos son esenciales para los primeros
eventos del tráfico intracelular de la VCB. La interacción y fusión de las VCBs con membranas del retículo endoplásmico
para el establecimiento de un nicho replicativo dependen del sistema de secreción tipo IV VirB. BvrR, Brucella
virulence-related regulatory protein; BvrS, Brucella virulence-related sensory protein; CGS, glucano β-1,2 cíclico
sintasa; LPS, lipopolisacárido; VirB, sistema de secreción tipo IV. Adaptado de Fugier et al., 2007.
SISTEMAS BACTERIANOS DE SECRECIÓN DE PROTEÍNAS
La exportación de factores de virulencia es una función central de los microorganismos patógenos que
modulan los procesos celulares del hospedador con el objetivo de asegurar la supervivencia intracelular. Toxinas,
adhesinas y moléculas efectoras que ejercen su acción en el citoplasma de la célula huésped, son transportadas
Introducción- 12
por complejas maquinarias multiprotéicas denominadas sistemas de secreción. En la Figura 3 se esquematizan
los principales sistemas de secreción de bacterias Gram negativas.
Sistema de secreción general Sec
El transporte de proteínas no plegadas hacia el periplasma se lleva a cabo por una maquinaria de translocación
que posee varias subunidades y que se conoce como sistema de secreción general Sec (Rusch y Kendall, 2007;
Yahr y Wickner, 2000). Las proteínas que se translocan a través de esta maquinaria contienen un péptido señal
en el extremo amino-terminal que es clivado, liberando a la proteína madura en el espacio periplásmico. Si la
proteína posee señales adicionales, éstas pueden ser reconocidas por distintas maquinarias encargadas de su
transporte a través de la membrana externa.
Figura 3. Representación esquemática de los principales sistemas de secreción en bacterias Gram negativas. El
transporte de proteínas a través de la membrana externa puede ser dependiente o independiente del sistema
secretorio general Sec. Las principales ramas terminales del sistema Sec son el sistema chaperone-usher involucrado
en la síntesis de adhesinas, el sistema de secreción tipo V (T5SS) y el sistema de secreción tipo II (T2SS). Los
sistemas de secreción tipo I, III y IV (T1SS, T3SS y T4SS) no dependen del camino secretorio general. En estos
sistemas, las maquinarias de secreción forman un canal que atraviesa ambas membranas. Al pie de la figura se
muestran ejemplos de especies patógenas que utilizan estos sistemas de secreción. Tomado de Gerlach y Hensel,
2007.
Introducción- 13
Sistemas de secreción tipo I
Los sistemas de secreción tipo I poseen generalmente tres componentes: un translocador de membrana
interna de la familia de transportadores ABC (por ATP binding cassette), un componente periplasmático MFP
(por membrane fusion protein) que acopla los componentes de membrana interna y externa, y un componente
de membrana externa OMP (por outer membrane protein). Estos componentes básicos conforman un canal de
secreción que atraviesa las membranas interna y externa, y que carece de apéndices de superficie. La secreción
por sistemas de tipo I es dependiente de la hidrólisis de ATP y se produce en un solo paso, en forma independiente
del sistema de secreción general Sec (Driessen et al., 1998). La señal de exportación se encuentra generalmente
en el extremo carboxilo-terminal de la proteína secretada. Un ejemplo del rol de los sistemas de secreción tipo I
en la virulencia de patógenos bacterianos es la secreción de la α-hemolisina de E. coli uropatógena (Fath y
Kolter, 1993), la cual es exportada mediante la maquinaria de secreción Hly, que consta de tres componentes:
HlyB (transportador ABC), HlyD (componente MFP) y TolC (componente OMP).
Sistemas de secreción tipo II
Los sistemas de secreción tipo II poseen de 12 a 16 componentes. En este caso la secreción ocurre en
dos pasos: la proteína primero es transportada al periplasma a través del sistema de secreción general Sec, y
luego de ser liberada al espacio periplásmico mediante el clivaje del péptido señal, es transportada hacia el medio
extracelular por la maquinaria de secreción tipo II. El reconocimiento de las proteínas secretadas por este
sistema es altamente específico, y aunque el consenso de exportación todavía no se conoce, se supone que la
señal percibida es un componente estructural de la proteína exportada (Sandkvist, 2001).
Los sistemas de secreción tipo II cumplen un rol esencial en la virulencia de numerosas bacterias patógenas
de animales y plantas, como por ejemplo la maquinaria codificada por los genes eps de Vibrio cholerae,
responsables de la secreción de la toxina colérica; los genes pul de Klebsiella oxytoca, que participan en la
exportación de pululanasa; y los genes out de Erwinia carotovora, necesarios para la secreción de una pectato
liasa (Sandkvist, 2001).
Sistemas de secreción tipo III
Los sistemas de secreción tipo III son capaces de translocar efectores bacterianos hacia el interior de
las células del huésped en forma independiente del sistema secretorio Sec. Algunos de sus componentes presentan
homología con el cuerpo basal del flagelo, indicando que poseen un origen evolutivo común (Hueck, 1998).
Introducción- 14
Los sistemas de secreción tipo III están constituidos por aproximadamente 20 componentes que conforman
una maquinaria que protruye por fuera de la bacteria formando una estructura de tipo “aguja” que se logró
visualizar por microscopía electrónica de transmisión (Galan y Collmer, 1999). En algunas bacterias, la regulación
transcripcional y el ensamblaje de los aparatos de secreción tipo III se encuentran acoplados mediante la secreción
a través del mismo sistema de un regulador transcripcional negativo (Hughes et al., 1993).
Estos sistemas son capaces de translocar proteínas directamente desde el citoplasma al exterior de la
bacteria, atravesando la membrana interna, la capa de peptidoglicano y la membrana externa bacteriana; así
como también la membrana plasmática y/o la pared celular de la célula huésped. En un primer momento, se
especuló que la señal para la translocación a través de los sistemas de secreción tipo III se encontraba en los
primeros 15 aminoácidos del extremo amino-terminal de las proteínas exportadas. Sin embargo, posteriormente
se observó en el sistema Yop de Yersinia que un cambio en el marco de lectura que codifica esta región no altera
la exportación de la proteína codificada, sugiriendo que la señal podría estar contenida en el ARN mensajero
(Cheng et al., 1997). Actualmente, existen evidencias que sugieren que los sustratos de exportación serían
reconocidos por chaperonas específicas encargadas de transportar las proteínas efectoras hasta el aparato de
secreción tipo III (Lee y Galan, 2004).
La translocación de efectores a través de sistemas de secreción tipo III representa un claro ejemplo de
comunicación bacteria-célula huésped que ocurre en varias especies de bacterias patógenas. En los patógenos
intracelulares en los que estos sistemas son necesarios para la virulencia, los componentes secretados interfieren
con funciones celulares del huésped y permiten así su supervivencia y replicación. Entre los numerosos ejemplos
existentes, como los sistemas Ysc de Yersinia, Hrp de Pseudomonas syringae y Esc de E. coli enterohemorrágica,
cabe destacar los sistemas de secreción tipo III codificados por las islas de patogenicidad SPI-1 y SPI-2 de
Salmonella typhimurium (por Salmonella Pathogenicity Island 1 y 2). Estos últimos actúan en distintos estadíos
de la infección intracelular con Salmonella. Los efectores secretados por SPI-1 son inyectados en el citoplasma
de la célula huésped e inducen rearreglos de actina que promueven la internalización de la bacteria. Estos son,
entre otros, el intercambiador GTP-GDP SopE, la fosfoinositol fosfatasa SopB y la proteína de unión a actina
SipA (Galan y Collmer, 1999). Los efectores secretados por SPI-2 intervienen alterando el tráfico endocítico.
Por ejemplo, la proteína SpiC inhibe la fusión de la vacuola que contiene a Salmonella con los lisosomas,
mientras que la proteína SifA cumple un rol en el reestablecimiento de la normal maduración de los fagosomas
una vez que la bacteria alcanzó su nicho replicativo (Scott y Holden, 2003).
Introducción- 15
Sistemas de secreción tipo IV
La clasificación de los sistemas de secreción tipo IV se basó inicialmente en la similitud con la maquinaria
de translocación VirB-VirD4 de Agrobacterium tumefaciens, el sistema prototípico de esta familia cuya estructura
ha sido ampliamente estudiada. Este sistema posee una alta similitud de secuencia con sistemas de conjugación
de bacterias Gram negativas, por lo que se supone que ambos evolucionaron a partir de un ancestro común. El
rol fundamental que cumple el sistema VirB de A. tumefaciens es transportar el complejo nucleoprotéico TDNA, compuesto por ADN simple cadena asociado a proteínas, desde el citoplasma bacteriano hacia el interior
de la célula vegetal. Una vez en el interior de la célula del huésped, el T-DNA es transportado hacia el núcleo de
la célula vegetal y posteriormente se integra en el genoma. La expresión de genes contenidos en el T-DNA
desencadena en el tejido vegetal la formación de tumores de tipo agalla y la producción de opinas, compuestos
que son sintetizados por la planta y utilizados por Agrobacterium como fuente de carbono.
El sistema VirB de A. tumefaciens está codificado por doce genes (virB1-virB11 y virD4) cuyos
productos se ensamblan constituyendo un complejo multiprotéico que posee tanto componentes de membrana
interna, como periplásmicos y de membrana externa (Fig. 4). Se postuló que la estructura básica del sistema
VirB de A. tumefaciens consta de ATPasas localizadas en la membrana interna, un canal que atraviesa las dos
membranas bacterianas, y proteínas extracelulares que forman un pilus (Fig. 5).
Figura 4. Esquema del sistema de secreción VirB/D4 de Agrobacterium tumefaciens. Tomado de Backert y
Meyer, 2006.
Introducción- 16
El gen virB1 codifica para una proteína que posee en la región amino-terminal dominios homólogos a
transglicosilasas líticas bacterianas. A raíz de esta observación, se postuló que una de las posibles funciones de
VirB1 sería la de degradar al peptidoglicano de la pared para permitir el ensamblaje del sistema de secreción
completo. Las mutantes virB1 de A. tumefaciens son capaces, aunque con una eficiencia reducida, de inducir la
formación de tumores en plantas (Berger y Christie, 1994). Sobre la base de estos resultados y teniendo en
cuenta la presencia de otras transglicosilasas líticas en el genoma de Agrobacterium, se sugirió que la función
recién mencionada de VirB1 podría ser redundante. Por otro lado, se observó también la presencia de una forma
clivada de VirB1, denominada VirB1* (compuesta por los 73 aminoácidos de la parte carboxilo-terminal de
VirB1), que puede ser procesada y secretada en ausencia del resto de los genes virB y es capaz de formar
complejos con VirB9. Se postuló que VirB1* podría participar en el ensamblaje y/o funcionamiento del transportador
(Zupan et al., 1998).
Figura 5. Representación esquemática de los componentes energéticos, del canal y del pilus del sistema de
secreción VirB/D4 de Agrobacterium tumefaciens. Tomado de Cascales y Christie, 2003.
El gen virB2 codifica para un polipéptido de 121 aminoácidos que es procesado por proteólisis, sufriendo
luego una ciclación por unión de los aminoácidos Gln48 y Gly121. Este proceso, que es independiente del resto de
los genes virB, produce una proteína madura cíclica de 74 aminoácidos (Eisenbrandt et al., 1999). Se postuló que
Introducción- 17
la forma procesada de VirB2 cumple una función estructural, siendo la subunidad cíclica la que compone el pilus
del aparato de secreción de A. tumefaciens. Para el ensamblaje de VirB2 y la formación del pilus T se requieren
todos los genes virB. Se observó que la proteína VirB5 copurifica con preparaciones de pilus T, por lo cual se
sugirió que VirB5 probablemente funciona asistiendo y facilitando el transporte, o bien estabilizando la
mulitmerización y el ensamblaje de las subunidades del pilus (VirB2 cíclico) (Lai y Kado, 2000).
VirB4 posee un motivo de unión a ATP de tipo Walker, cuya integridad es esencial para su actividad y
para la virulencia de A. tumefaciens. Se construyeron cepas merodiploides que contienen copias salvajes de
virB4, así como también un alelo con una mutación en la secuencia codificante del motivo Walker A. Se observó
que las cepas merodiploides mostraron una virulencia atenuada en plantas y una eficiencia reducida para la
transferencia del plásmido IncQ a cepas receptoras. El fenotipo dominante de la mutación indicó que VirB4
probablemente forma parte de complejos multiméricos, cuya función es impedida por la incorporación de la
proteína mutante que carece de actividad ATPasa (Berger y Christie, 1993).
Se observó que las proteínas VirB3 y VirB4 poseen una alta similitud de secuencia con TraL y TraC de
E. coli (codificadas por el plásmido F), las cuales son proteínas accesorias necesarias para la formación del pilus
F, pero no son componentes estructurales del mismo. Sobre la base de estas observaciones, se propuso que
VirB3 y la ATPasa de membrana interna VirB4 participarían en el ensamblaje del aparato de secreción en A.
tumefaciens (Zupan et al., 1998).
VirB6 es una proteína de membrana interna que posee cinco dominios transmembrana, y se supone que
cumple un rol estructural formando parte del canal de secreción del sistema. Se observó que VirB6 posee
dominios funcionales involucrados en la interacción de VirB6 con el sustrato (T-DNA) y con la transferencia del
mismo a otros componentes estructurales del canal (VirB8, VirB2 y VirB9), participando así en interacciones
entre distintas subunidades del sistema necesarias para la secreción del T-DNA (Jakubowski et al., 2004).
VirB7 es una lipoproteína que se encuentra asociada a la membrana externa. Es capaz de formar
homodímeros y heterodímeros con VirB9 mediante puentes disulfuro. Se observó que la localización de VirB7 en
la membrana externa se produce aún en ausencia de otras proteínas VirB, lo que sugiere que podría participar en
eventos tempranos del ensamblaje del sistema de secreción (Fernandez et al., 1996). Mutantes virB7 mostraron
reducción en los niveles celulares, de VirB4, 5, 8, 9, 10 y 11, indicando que la síntesis, o bien la estabilidad de estos
factores, depende de la presencia de VirB7 (Fernandez et al., 1996).
El producto del gen virB10 es una proteína integral de membrana interna, con un dominio carboxiloterminal periplasmático y un pequeño dominio amino-terminal en el lado citoplasmático. Se observó que VirB10
Introducción- 18
interacciona con varias proteínas VirB, tanto de la membrana interna como de la membrana externa. Estudios
recientes mostraron que VirB10 sufre cambios estructurales en respuesta a la utilización de ATP por parte de
VirB11 y VirD4, y se propuso que mediante este proceso VirB10 actuaría, en forma dependiente de energía,
como un “puente” que vincularía los componentes de membrana interna y externa del canal de secreción (Cascales
y Christie, 2004).
VirB11 es la segunda ATPasa que contiene el sistema VirB de A. tumefaciens. Al igual que VirB4,
también posee un dominio de unión a ATP Walker A esencial para su actividad. Se encuentra asociada a la
membrana interna y posee la capacidad de formar multímeros en forma dependiente de la hidrólisis de ATP. En
base a la estructura cristalina de una proteína de Helicobacter pylori homóloga a VirB11, HP0525, se propuso
que VirB11 se agrupa formando hexámeros (Yeo et al., 2000). Se supone que VirB11 actúa tanto en el ensamblaje
del sistema como en la secreción del sustrato en reacciones ATP dependientes. En trabajos recientes realizados
con inmunoprecipitación de proteínas unidas al T-DNA se mostró que el sustrato se transloca formando contactos
en forma secuencial con las proteínas VirD4 (una proteína accesoria del sistema que acopla el sustrato al
sistema de secreción propiamente dicho), VirB11, VirB6, VirB8 y por último VirB7, VirB2 y VirB9 (Atmakuri et
al., 2004).
Originalmente, la familia de sistemas de secreción IV estaba constituida por el sistema VirB de A.
tumefaciens y dos sistemas relacionados codificados por la región tra del plásmido pKM101 y por el operón ptl
de Bordetella pertussis. En los últimos años, la cantidad de sistemas de secreción tipo IV descriptos se incrementó
considerablemente, identificándose dichos sistemas en numerosas especies de bacterias patógenas tales como
Helicobacter pylori (genes cag), Legionella pneumophila (dot/icm), Bartonella spp. (virB), Brucella spp.
(virB), Wolbachia spp. (virB), Coxiella burnetii (dot/icm) y Burkholderia cenocepacia. En la sección
siguiente se describirán en detalle los sustratos identificados, la señal para su translocación, así como su participación
en la virulencia.
Sistemas de secreción tipo V o Autotransportadores
En numerosos casos estos sistemas constituyen la rama terminal del camino secretorio general Sec. Los
autotransportadores poseen en la misma cadena polipeptídica el precursor de la molécula secretada así como la
maquinaria de secreción. La señal en el extremo amino-terminal dirige el transporte del polipéptido hacia el
periplasma a través del sistema de secreción Sec. Luego del clivaje del péptido señal, la proteína madura se
inserta en la membrana externa de la bacteria formando un barril de láminas β. El dominio pasajero pasa a través
Introducción- 19
del canal quedando la porción amino-terminal de la proteína expuesta en la superficie de la bacteria, donde en
varios casos es liberada por clivaje proteolítico. Como ejemplos de transporte a través de este sistema de
secreción se pueden mencionar la secreción de la adhesina AIDA-1 de E. coli enteropatógena (Maurer et al.,
1999) y de la toxina vacuolizante VacA de Helicobacter pylori (Cover, 1996).
Sistemas de secreción tipo VI
Estos sistemas de secreción fueron recientemente descriptos y aún no están muy bien caracterizados.
Tienen la capacidad de transportar proteínas hacia el espacio extracelular sin el requerimiento de una señal
amino-terminal hidrofóbica. Recientemente, se identificó el sistema de secreción tipo VI de Vibrio cholerae
como un determinante más de la virulencia de esta especie patógena (Pukatzki et al., 2006). Este sistema de
secreción también fue identificado en Pseudomonas aeruginosa, y se demostró la translocación del sustrato
Hcp1 en pacientes con fibrosis quística infectados de manera crónica con la bacteria (Mougous et al., 2006).
ROL DE LOS SISTEMAS DE SECRECIÓN TIPO IV EN LA VIRULENCIA
De forma análoga a lo que ocurre con los sistemas de secreción descriptos anteriormente, en muchos
casos, los sistemas de secreción tipo IV cumplen un rol esencial en la virulencia de bacterias patógenas mediando
la translocación de proteínas efectoras hacia el interior de la célula huésped (Fig. 6).
Metodologías utilizadas en la identificación de las proteínas translocadas
Los ensayos diseñados para la identificación de sustratos de secreción tipo IV incluyen una variedad de
metodologías. Sin embargo, la herramienta más poderosa consiste en la generación de fusiones a una proteína
reportera cuya actividad sólo es detectada cuando la proteína de fusión es translocada a la célula eucariota.
Entre las proteínas reporteras más utilizadas se encuentran la recombinasa Cre y la adenilato ciclasa de Bordetella
pertussis. En el caso de la recombinasa Cre, su actividad puede monitorearse al detectar un fenotipo producto
de la recombinación específica en los sitios lox de células eucariotas especialmente modificadas. Mediante el
uso de esta metodología se identificaron los sustratos VirE2, VirF y VirE3 de Agrobacterium tumefaciens
(Schrammeijer et al., 2003; Vergunst et al., 2000). Por su parte, la enzima adenilato ciclasa eleva los niveles
intracelulares de AMPc al activarse con la calmodulina presente en el citoplasma eucariota (Dautin et al., 2002).
Fusiones a esta proteína reportera han sido ampliamente utilizadas desde que fuera empleada por primera vez en
Introducción- 20
la caracterización de un sustrato del sistema tipo III de Yersinia (Sory y Cornelis, 1994). Muchos de los sustratos
del sistema Dot/Icm de Legionella pneumophila fueron identificados y caracterizados por medio de fusiones a
la adenilato ciclasa, entre ellos están DrrA, Ralf, YlfA, YlfB, LepA, LepB y SdeA (Bardill et al., 2005;
Campodonico et al., 2005; Chen et al., 2004; Murata et al., 2006; Nagai et al., 2005). En un trabajo reciente, se
ha descripto el uso de la proteína reportera β-lactamasa TEM1 en la identificación de los sustratos VceA y
VceC del sistema VirB de Brucella (de Jong et al., 2008). La translocación de la proteína al citoplasma puede
monitorearse al microscopio ya que se produce un cambio de color de las células cargadas con un sustrato
fluorescente. Por último, las modificaciones que sufren las proteínas en el citoplasma eucariota también constituyen
un indicador de su translocación. Tal es el caso de la proteína CagA de Helicobacter pylori que es fosforilada
por kinasas del huésped (Stein et al., 2000).
Figura 6. Representación esquemática de los efectos de la translocación de algunos sustratos de secreción tipo IV.
El transporte de moléculas efectoras hacia el citoplasma de la célula eucariota altera varios procesos celulares: en
Agrobacterium tumefaciens la translocación del T-DNA y de las proteínas VirF, VirE2, VirE3 y VirD2 induce la síntesis
de opinas y la formación de tumores al modular los niveles hormonales en la planta; en Helicobacter pylori, la
proteína CagA modula varías vías de señalización relacionadas con la diferenciación celular, proliferación y motilidad;
la toxina PT de Bordetella pertussis interfiere con las vías de señalización dependientes de proteína G; RalF de
Legionella pneumophila recluta la GTPasa ARF a la vacuola que contiene a la bacteria para promover la supervivencia
intracelular. Tomado de Cascales y Christie, 2003.
Introducción- 21
Sustratos del sistema de secreción tipo IV
En la Tabla 1 se listan la mayoría de los sustratos de sistemas de secreción tipo IV identificados hasta la
fecha. Las especies incluidas son todas patógenas, a excepción de Mesorhizobium loti que es un simbionte de
plantas leguminosas. Agrobacterium tumefaciens es una especie patógena de plantas dicotiledóneas en las que
produce tumores conocidos como “agallas”; Bartonella es un género que agrupa varias especies que infectan
eritrocitos y células endoteliales originando diversas enfermedades; Bordetella pertussis infecta células del
tracto respiratorio originando la enfermedad conocida como tos convulsa; Helicobacter pylori infecta células
del epitelio gástrico y en muchos casos la infección es la causa de úlceras pépticas e incluso cáncer; Legionella
pneumophila infecta macrófagos alveolares originando un tipo de neumonía conocida como “enfermedad del
legionario”; por último, y como ya se mencionó anteriormente, las especies del género Brucella son los agentes
causales de la brucelosis.
Para algunos de los sustratos identificados se conoce la función, e incluso se han identificado los ligandos
eucariotas. El sistema más prolífico es sin duda el Dot/Icm de L. pneumophila, para el cual se han identificado
más de 80 sustratos, aunque sólo se conoce la función de unos pocos (Heidtman et al., 2009). El análisis de los
dominios y motivos presentes en estos sustratos reveló la presencia de los motivos estructurales coiled coil, y
de los dominios eucariotas Sec7, acetiltransferasa, fosfolipasa A2, repeticiones ricas en leucina, repeticiones
ankirina, entre otras (Ninio y Roy, 2007). En muchos casos, la identificación de nuevos sustratos tipo IV surgió
como resultado del análisis in silico del proteoma de la bacteria en busca de estos dominios (de Felipe et al.,
2005; Pan et al., 2008).
A diferencia de lo que ocurre con cepas mutantes en los sistemas de secreción, y a pesar de que en
muchos casos la función de la proteína translocada permite sugerir que es esencial para la supervivencia intracelular
de la bacteria, deleciones en los genes que codifican estas proteínas generalmente tienen poco o ningún efecto
sobre la capacidad de replicación intracelular del microorganismo (Heidtman et al., 2009; Murata et al., 2006;
Nagai et al., 2002; Ninio et al., 2005; VanRheenen et al., 2006). Estos resultados plantean la posibilidad de que
las proteínas translocadas tengan funciones redundantes. Por ejemplo, en L. pneumophila se han descripto seis
genes que codifican para proteínas translocadas por el sistema Dot/Icm de la familia SidE (Luo e Isberg, 2004).
También podría ocurrir que proteínas con distintas actividades bioquímicas medien proceso celulares similares.
Esto ha sido demostrado para los efectores SopE y SopB del sistema de secreción tipo III de Salmonella
enterica Serovar Typhimurium. Ambos promueven la internalización de la bacteria al activar Rho GTPasas
(Patel y Galan, 2006).
Introducción- 22
Tabla 1. Sustratos del Sistema de Secreción Tipo IV
Especie
Agrobacterium
tumefaciens
SST4*
VirB/D4
Sustrato
VirD2
VirD5
VirE2
VirE3
VirF
Agrobacterium
rhizogenes
VirB/D4
MobA
Atu6154
GALLS
Mesorhizobium
loti
VirB/D4
Msi059
Msi061
Legionella
pneumophila
Dot/Icm
RalF
LidA
DotA
SidA-H
SdhA
SdeA
SidJ
SidM
(DrrA)
LepA, LepB
WipA,
WipB
YlfA, YlfB
VipA
VipD
VipF
VpdA,
VpdB
Función
Interacción con las proteínas del
huésped AtKAPD, CypA, PP2C,
RocA y Roc4. Localización nuclear e
integración del T-DNA
Determinación del rango de huésped
Formación de poros en la membrana,
protección del T-DNA, interacción
con las proteínas del húesped VIP1 y
VIP2, y localización nuclear e
integración del T-DNA
Interacción con la proteína del
huésped AtKAPD y con VirE2
Determinación del rango de huésped
y proteólisis de VIP1 y VirE2
Protección del T-DNA, promoción
de la localización nuclear y de la
integración del T-DNA en el genoma
de la célula vegetal
Desconjugación
de
proteínas
estabilizadas por SUMOilación
Marcado de proteínas para su
degradación
Intercambiador de la GTPasa ARF
Anclado de vesículas a la membrana
del fagosoma y unión a la GTPasa
Rab1
Formación de poros en la membrana
del huésped
Inhibición
macrófagos
de
apoptosis
en
Reclutamiento de vesículas del
retículo endoplásmico a la vacuola
que contiene a Legionella
Intercambiador de la GTPasa Rab1
Alteración de la vía exocítica en
protozoos
Referencias
(Tzfira y Citovsky,
2002; Tzfira et al., 2004)
(Vergunst et al., 2005)
(Citovsky et al., 2004;
Duckely y Hohn, 2003;
Tzfira y Citovsky, 2002;
Ward et al., 2002)
(Tzfira et al., 2004)
(Tzfira et al., 2004;
Vergunst et al., 2005)
(Vergunst et al., 2005)
(Vergunst et al., 2005)
(Hodges et al., 2004)
(Hubber et al., 2004)
(Hubber et al., 2004)
(Nagai et al., 2002)
(Conover et al., 2003;
Derre e Isberg, 2005;
Machner e Isberg, 2006)
(Conover et al., 2003;
Nagai y Roy, 2003)
(Luo e Isberg, 2004)
(Laguna et al., 2006)
(Bardill et al., 2005)
(Liu y Luo, 2007)
(Murata et al., 2006)
(Chen et al., 2004)
(Ninio et al., 2005)
Promoción de la unión y fusión de
vesículas a la vacuola que contiene a
Legionella
Alteración del tráfico de la enzima
carboxipeptidasa Y
Interferencia en la formación de
cuerpos multivesiculares
Inhibición del tráfico de proteínas
lisosomales
(Campodonico et al.,
2005)
(Shohdy et al., 2005)
(Shohdy et al., 2005)
(Shohdy et al., 2005)
(VanRheenen et al.,
2006)
Introducción- 23
Tabla 1, continuación.
Especie
Legionella
pneumophila
SST4*
Dot/Icm
Sustrato
LegL3, 5, 7,
LegLC4, 8,
5, 2, LegG2
LegC3,
LegC7
LubX
AnkX
SetA, Ceg9,
Ceg19
PieA
Helicobacter
pylori
Cag
CagA
Peptidoglicano
Bordetella
pertussis
Bartonella spp.
Brucella spp.
Ptl
Toxina AB5
VirB/D4
Trw
VirB
Bep A-G
Función
Alteración del tráfico intracelular
Poliubiquitinación de Clk1
Inhibición del transporte vesicular
dependiente de microtúbulos
Alteración del tráfico intracelular
Alteración de la morfología de los
lisosomas
Desfosforilación de algunas proteínas
del huésped como cortactina y ezrina.
Unión a SPH2, CSK, ZO-1, JAM,
Arp2/3, N-WASP, Rho GTPasas y al
receptor HGF/SF
Inducción de la actividad del
promotor NF-NB en células del
epitelio gástrico y reconocimiento de
Nod1
Interacción con proteínas Gi/o
DEJheterotriméricas
Inhibición de apoptosis en células
endoteliales (BepA)
VceA, VceC
Referencias
(de Felipe et al., 2005)
(de Felipe et al., 2008)
(Kubori et al., 2008)
(Pan et al., 2008)
(Heidtman et al., 2009)
(Ninio et al., 2009)
(Hatakeyama, 2004)
(Viala et al., 2004)
(Burns, 2003)
(Schmid et al., 2006;
Schulein et al., 2005)
(de Jong et al., 2008)
*SST4: Sistema de secreción tipo IV
Señal de secreción
El análisis de la proteína VirE2 aportó las primeras evidencias a favor de la localización carboxilo-terminal
de la señal de secreción (Schrammeijer et al., 2003). Posteriormente, un análisis por mutagénesis de la proteína
VirF identificó la secuencia consenso con carga neta positiva R-X(7)-R-X-R-X-R-X-X (n) (Vergunst et al.,
2005). Esta secuencia fue detectada en varios sustratos tipo IV, entre ellos Msi059 y Msi061 de Mesorhizobium
loti y la relaxasa MobA del plásmido RSF1010 (Vergunst et al., 2005) (Fig. 7).
Sin embargo, en algunos sustratos la información para la translocación está contenida en otras partes de
la proteína. Por ejemplo, CagA de Helicobacter pylori contiene información para su translocación en ambos
extremos de la proteína (Hohlfeld et al., 2006). Resultados similares fueron descriptos para LepA y LepB de
Legionella pneumophila (Chen et al., 2004). Por su parte, los componentes de la toxina Pertussis contienen un
péptido señal y son transportados primero al periplasma por el sistema Sec y luego atraviesan la membrana
externa por un sistema tipo IV (Burns, 2003). En Bartonella, las proteínas BepA-G tienen una señal de secreción
Introducción- 24
bipartita que incluye, además del extremo carboxilo-terminal cargado positivamente, un dominio de 140 aminoácidos
denominado BID (Schulein et al., 2005).
Figura 7. Señales de secreción en sustratos del sistema tipo IV. En color rojo se indican las regiones de las
proteínas que contienen información para su secreción. BepD requiere además el dominio BID (en naranja). A la
derecha se muestra la secuencia aminoacídica del motivo carboxilo-terminal con carga positiva, común a varios
sustratos tipo IV. Tomado de Cambronne y Roy, 2006.
Sistema de secreción VirB de Brucella
Como se mencionó anteriormente en esta Introducción General, el sistema de secreción VirB de Brucella
es uno de los principales determinantes de la virulencia de la bacteria.
Los genes que codifican para las proteínas VirB están organizados en un operón en el cromosoma II.
Estudios realizados en nuestro laboratorio han demostrado que cepas mutantes en los genes virB son incapaces
de replicar en células HeLa y de persistir en el bazo de ratones infectados (Sieira et al., 2000). Mediante el
análisis del tráfico intracelular de mutantes virB en células HeLa y en macrófagos derivados de médula ósea, se
demostró que este sistema es requerido durante los eventos tardíos de la maduración de la VCB, para la biogénesis
de una organela replicativa derivada del retículo endoplásmico (Celli et al., 2003; Comerci et al., 2001).
El análisis del perfil de expresión de los genes virB mediante el uso de la proteína reportera β-galactosidasa,
reveló que en cultivo estos genes se transcriben durante la fase estacionaria de la curva de crecimiento en medio
rico (Sieira et al., 2000). En células tipo macrofágicas de la línea J774.A1, la transcripción de los genes virB se
induce después de la internalización, alcanzándose un máximo a las 5 horas post-infección (Sieira et al., 2004).
Recientemente, se identificaron dos sustratos del sistema VirB de Brucella: VceA y VceC (de Jong et
al., 2008). Ambas son proteínas hipotéticas sin una función conocida y están codificadas por genes que están coregulados con el operón virB.
ANTECEDENTES Y OBJETIVOS
Antecedentes y Objetivos - 25
ANTECEDENTES Y OBJETIVOS
En especies de bacterias patógenas, la expresión de proteínas en superficie y la secreción de proteínas
tienen un rol clave en la interacción huésped-patógeno. Toxinas y adhesinas son en muchos casos indispensables
para establecer una infección exitosa. El análisis de los genomas de bacterias del género Brucella no reveló la
presencia de moléculas con estas características, por lo que la identificación de moléculas secretadas o de
superficie no canónicas podría contribuir a la comprensión de los mecanismos de virulencia de la bacteria.
Por otro lado, durante los últimos años se describió en distintas especies del género Brucella la presencia
de un sistema de secreción tipo IV. En un trabajo realizado en nuestro laboratorio se identificaron en el genoma
de B. abortus dos marcos de lectura abiertos con alta homología a genes del operón virB de A. tumefaciens y
ptl de de B. pertussis (Ugalde, 1999). Además, se caracterizó la estructura del operón virB de B. abortus y se
observó que cepas mutantes virB son incapaces de replicar en fagocitos no profesionales y persistir en el bazo
de ratones infectados (Sieira et al., 2000). Como se mencionó en la Introducción General, trabajos posteriores
demostraron que los genes virB de Brucella son esenciales para la evasión de la vía endocítica degradativa y
para el establecimiento del nicho replicativo de la bacteria durante la infección de células HeLa (Comerci et al.,
2001) y macrófagos (Celli et al., 2003).
A partir de las evidencias obtenidas se postula que el sistema VirB de Brucella sería el encargado de
translocar al citoplasma eucariota moléculas efectoras que permitirían modular el tráfico de la VCB con el
objetivo de establecer un nicho de replicación intracelular en compartimientos derivados del retículo endoplásmico.
A partir de estos antecedentes se propusieron los siguientes objetivos:
Objetivo general:
-identificar y caracterizar proteínas secretadas por Brucella abortus
Antecedentes y Objetivos - 26
Objetivos particulares:
-identificar proteínas secretadas in vitro y analizar su participación en la virulencia (Capítulo I)
-identificar proteínas secretadas intracelularmente y determinar si son sustratos del sistema VirB (Capítulo II)
-caracterizar los sustratos del sistema VirB (Capítulo III)
CAPÍTULO I
Capítulo I - 27
Capítulo I - Identificación de proteínas de Brucella abortus secretadas in vitro
INTRODUCCIÓN
El transporte de proteínas a través de la envoltura celular bacteriana es una función básica presente en
todos los grupos de bacterias. El análisis de un número importante de genomas bacterianos reveló que
aproximadamente el 17% de los genomas de Proteobacterias codifica para proteínas con secuencia señal para
el translocón Sec o GSP (por General Secretory Pathway) (Bendtsen et al., 2005).
Las proteínas secretadas son esenciales para diversos procesos bacterianos como la biogénesis de la
envoltura celular, la adquisición de nutrientes, la motilidad y la transducción de señales, entre otros. Sin embargo,
la importancia de las proteínas secretadas se hace más evidente en bacterias patógenas las cuales, para poder
establecer una infección exitosa, deben subvertir los procesos celulares de sus huéspedes con el fin de evadir la
respuesta inmune y lograr una colonización eficiente. Esta interacción huésped-patógeno está basada
principalmente en factores que se ubican en la superficie de la bacteria (adhesinas) o que son secretados al
medio extracelular (toxinas y moléculas efectoras). En este sentido, los sistemas de secreción de proteínas
tienen un rol crucial al transportar estos determinantes de virulencia a su sitio de acción.
Distintas metodologías se han utilizado con el fin de identificar proteínas secretadas en bacterias.
Inicialmente, la estrategia más usada consistió en generar fusiones a proteínas reporteras como la fosfatasa
alcalina (Finn et al., 1991; Taylor et al., 1989) o TEM β-lactamasa (BlaM) (Broome-Smith et al., 1990). En
trabajos más recientes, se describen análisis proteómicos de sobrenadantes de cultivos bacterianos (Bumann et
al., 2002; Hughes et al., 2002; Kim et al., 2002; Tan et al., 2002).
La mayoría de las proteínas secretadas son sintetizadas como pre-proteínas con un péptido señal en el
extremo amino-terminal necesario para dirigir la proteína al GSP (Gennity et al., 1990; Lingappa y Blobel, 1980;
Silhavy et al., 1983). El péptido señal consiste en uno o más aminoácidos cargados positivamente (dominio N),
seguidos de un tracto hidrofóbico de 10-20 aminoácidos (dominio H) y un extremo carboxilo más polar (dominio
C) que contiene el sitio de clivaje (Gennity et al., 1990; Silhavy et al., 1983). El péptido es clivado por la
peptidasa de señal luego del transporte de la proteína a través de la membrana interna y dirigido desde el
periplasma hacia la maquinaria encargada de la translocación a través de la membrana externa en el caso de
bacterias Gram negativas (Chang et al., 1982; Dalbey y Wickner, 1985).
Capítulo I - 28
En este capítulo se describe el uso de la proteína reportera cloranfenicol acetil transferasa (CAT) en la
identificación de proteínas de B. abortus 2308 secretadas al medio de cultivo. Para ello, se generó una colección
de fusiones traduccionales de extremos amino-terminales de proteínas de B. abortus a la proteína reportera
CAT. Para detectar la secreción de las proteínas de fusión se midió la actividad de esta enzima en los sobrenadantes
de cultivo.
Capítulo I - 29
RESULTADOS
Construcción de una colección de fusiones traduccionales a cat
Con el objetivo de identificar proteínas secretadas por B. abortus, se generó una colección de fusiones
traduccionales de extremos amino-terminales de proteínas a la proteína reportera CAT. Para ello, fragmentos de
ADN de B. abortus se clonaron en el sitio SmaI de los plásmidos pCAT (Fig. 8). Las fusiones se generaron en
un vector replicativo en Brucella y bajo un promotor constitutivo de B. abortus (Pbcsp31). El gen que codifica
para CAT no incluyó un codón de inicio ni un sitio de unión al ribosoma para forzar la fusión de fragmentos
amino-terminales de proteínas de B. abortus (ver Materiales y Métodos).
0BCSP
pCAT I
EcoRI
EcoRI
SacII
cccggg ggatcca
CAT
SacII
SmaI BamHI
0BCSP
pCAT III
CAT
SmaI BamHI
0BCSP
pCAT II
cccggg ggatcc
EcoRI
cccggg ggatcca
ag
SmaI BamHI
CAT
SacII
Figura 8. Representación esquemática de los vectores pCAT I, II y III utilizados para la construcción de las
fusiones traduccionales a cat. En el sitio SmaI se clonaron los fragmentos de ADN genómico de B.abortus
digeridos con la enzima AluI (ver Materiales y Métodos). Pbcsp31: promotor del gen bcsp31; cat: gen que codifica
para la enzima cloranfenicol acetil transferasa.
Identificación de proteínas secretadas
Las fusiones traduccionales con actividad CAT (fragmentos amino-terminales de proteínas fusionados a
CAT que aportaron un codón de inicio y un sitio de unión al ribosoma, ambos ausentes en el gen reportero) fueron
identificadas en la cepa Escherichia coli DH5α, dado que el promotor usado es compatible con esta cepa de E.
coli (Comerci et al., 1998). En esta etapa se identificaron 864 clones resistentes a cloranfenicol, es decir, que
portaban plásmidos que codifican para fusiones con actividad CAT. Estos plásmidos fueron purificados y
electroporados en B. abortus.
Capítulo I - 30
Para evaluar la secreción de las proteínas de fusión en B. abortus, se realizaron mediciones de actividad
CAT en los sobrenadantes de cultivo. En la reacción se midió la formación de [14C]-cloranfenicol butirilado a
partir de sobrenadantes de cultivo, n-butiril CoA y [14C]-cloranfenicol. Debido al gran número de clones a
analizar (1728), las mediciones de actividad enzimática se hicieron sobre una mezcla de sobrenadantes provenientes
de 8 clones. Para asegurar una buena cobertura, se realizaron 216 mediciones de actividad. Teniendo en cuenta
que en el 86% de las mediciones se observaron valores de actividad menores a 3.000 cpm, se estableció este
valor como punto de corte (Fig. 9). Es decir, se consideraron como no secretadas aquellas fusiones cuyos
sobrenadantes de cultivo mostraban valores de actividad menores a 3.000 cpm. Para aquellos casos en los que
se obtuvo una actividad enzimática superior al valor de corte (30 mediciones), se analizaron los sobrenadantes de
cultivo individualmente, encontrándose en todos los casos por lo menos un clon con una actividad CAT extracelular
mayor a 3.000 cpm (Fig. 10a y 10b). Al finalizar el análisis se identificaron 33 clones que expresaban fusiones
secretadas.
110
100
90
.¢MERODEMEDICIONES
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 - 1000
1001-2000 2001-3000
3001-4000
4001-5000
5001-6000 6001-7000 7001-8000
8001-9000 9001-10000 10001-11000
CPM
Figura 9. Histograma de frecuencia de los valores de actividad CAT extracelular correspondientes a
216 mediciones (cada medición se realizó sobre una mezcla de sobrenadantes de cultivo provenientes
de 8 clones). Dentro del cuadro se muestran las mediciones que incluyeron al menos un clon con
actividad mayor al valor de corte (3.000 cpm).
cpm
Capítulo I - 31
5000
4500
4000
3500
3000
A
2500
2000
1500
1000
500
0
1B9A 1B9B
1B9C 1B9D
1B9E
1B9F
1B9G 1B9H
CLON
20000
pm
ccpm
B
18000
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
1B5A
1B5B
1B5C
1B5D
1B5E
1B5F
1B5G
1B5H
CLON
Figura 10. Actividad CAT extracelular de los clones pertenecientes a los grupos 1B9 (a) y 1B5 (b). Con
asteriscos se indican los clones que portan fusiones secretadas.
Análisis de la secreción de las proteínas de fusión por Western Blot
Con el objetivo de confirmar la secreción de las proteínas de fusión, se analizaron por Western Blot las
proteínas de los sobrenadantes de cultivo (previamente precipitadas con ácido tricloroacético) utilizando un
anticuerpo policlonal anti-CAT (Fig. 11). Para descartar lisis celular o blebbing (liberación de vesículas de
membrana externa con contenido citoplasmático y/o periplasmático, (Mashburn-Warren y Whiteley, 2006;
McBroom et al., 2006)), se realizaron los correspondientes controles usando en el Western Blot antisueros
contra marcadores citoplasmáticos (fosfoglucomutasa) o de membrana externa respectivamente (Outer
membrana protein 2b). Luego de realizar estos controles y teniendo en cuenta que hubo clones que se aislaron
más de una vez (ver análisis de secuencia más abajo), se identificaron 10 proteínas cuyos fragmentos aminoterminales fusionados a CAT promovieron la secreción de la proteína de fusión. Como se observa en la Figura
11, los niveles de expresión de las distintas proteínas de fusión fueron similares y sólo en la calle 6 se detectaron
productos de degradación de la proteína de fusión.
Capítulo I - 32
88
65
56
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
38
33.5
A#!4
65
A0'-
38
A/MPB
Figura 11. Análisis de la secreción de las proteínas de fusión por Western Blot. Las proteínas del extracto
total y de los sobrenadantes de cultivo (precipitadas con ácido tricloroacético) se analizaron en 10% SDSPAGE. Las proteínas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa y se detectaron con un anticuerpo
anti-CAT, y sueros anti-PGM (fosfoglucomutasa) y anti-omp2b (Outer membrane protein 2b). Calles 1 y 2:
extracto total y sobrenadante de cultivo de B. abortus conteniendo el plásmido pBBR-MCS 1 (Cmr). Calles 312: volúmenes equivalentes de sobrenadantes de cultivo en fase estacionaria temprana de cepas de B.
abortus conteniendo plásmidos que codifican para las fusiones 1B5B, 1B5F, 4B1B, 4B1C, 5A3E, 5B7B, 5B10C,
7A8C, 7A8E y 8A2A. Sobre la izquierda se indica la posición de los marcadores de peso molecular (en kDa).
Caracterización de las proteínas de fusión
Los fragmentos fusionados a cat se amplificaron por PCR, se secuenciaron usando un oligonucleótido
específico complementario a la región 5´ de cat, y las secuencias se analizaron con los programas blastx y blastp
del servicio en red BLAST. En todos los casos, los fragmentos secuenciados correspondieron a porciones
amino-terminales de proteínas de B. abortus, con un codón de inicio y un sitio de unión al ribosoma (Shine
Dalgarno) tal como se requería para la correcta expresión de las proteínas de fusión. De las diez proteínas
identificadas, siete son homólogas a proteínas con una función conocida y las tres restantes son proteínas hipotéticas
(Tabla 2). En todos los casos los valores de actividad CAT extracelulares fueron mayores al punto de corte y
cuatro de las diez proteínas fueron aisladas en más de una oportunidad. En cinco de las proteínas identificadas se
predijo una secuencia señal amino-terminal y/o la presencia de segmentos transmembrana. El número de
aminoácidos fusionados a CAT varió de 5 a 386 y no pudo identificarse una secuencia consenso que fuera la
responsable de promover la secreción de las fusiones. En todos los casos los pesos moleculares aparentes de las
proteínas de fusión fueron consistentes con los valores predichos a partir de la secuencia aminoacídica anotada
(Fig. 11).
Capítulo I - 33
Tabla 2. Caracterización de las proteínas de fusión a CAT secretadas.
Nombre
de
la fusión
Nro. de
veces
aislada
Actividad
CAT
(cpm)‡
Nro. de aa.
fusionados/Nro.
de aa. totales
Péptido
Señal §
Nro. de
segmentos
TM*
Función
1B5B
1
13.063,2
5/552
No
(MI)
12
(43-65)
Citocromo C Oxidasa,
Subunidad I
1B5F
2
18.022,5
8/74
Sí
4B1B
2
9.357,7
9/1553
No
4B1C
1
9.118,7
386/396
Sí
2
(26-48)
2
(177-199)
-
5A3E
1
45.099,8
35/479
No
-
Trigger factor
5B7B
1
69.594,8
184/239
No
(C)
-
Regulador de respuesta
BvrR
5B10C
1
15.014,6
51/84
No
-
Proteína hipotética
7A8C
2
41.327,5
240/384
No
-
Proteína de la familia
Intimina/Invasina
7A8E
1
7.404,9
21/191
8A2A
3
8.776,0
232/408
Sí
(MI)
No
(C)
5
(25-46)
-
Proteína hipotética
Proteína hipotética
Proteína flagelar FlgE
Proteína BioY
Dihidrolipoamida
acetiltransferasa
‡ Medida en sobrenadantes de cultivos en fase estacionaria temprana. Los valores de actividad son
representativos de 3 mediciones. §Predicción de péptido señal usando los programas SignalP 3.0
(Bendtsen et al., 2004) y PSORTb v.2.0.4 (Gardy et al., 2005). Entre paréntesis se indica la localización
celular según PSORTb: MI: membrana interna; C: citosólica. *Predicción de segmentos transmembrana
(TM) usando el programa SOSUI 1.11 (Mitaku e Hirokawa, 1999; Mitaku et al., 2002). Entre paréntesis
se indica la posición del primer segmento transmembrana predicho. El tamaño de los péptidos fuisonados
a CAT se calculó teniendo en cuenta el codón de inicio anotado para B. abortus. aa.: aminoácidos.
Análisis de la secreción de las proteínas identificadas por Western Blot
Con el objetivo de confirmar la secreción de algunas de las proteínas identificadas (full length y sin
fusionar a CAT) al medio extracelular, se precipitaron las proteínas de los sobrenadantes de cultivo de B. abortus
2308 y se analizaron por Western Blot con antisueros específicos. Para esto, se construyeron los correspondientes
plásmidos de expresión y se produjeron las proteínas recombinantes en E. coli. Éstas se purificaron y se inocularon
Capítulo I - 34
en ratones a partir de los cuales se obtuvieron sueros reactivos para las siguientes proteínas: trigger factor (TF),
proteína flagelar FlgE, proteína de la familia Intimina/Invasina (intimina), proteína hipotética de 84 aminoácidos
(p84) y proteína hipotética de 74 aminoácidos (p74).
Los experimentos de Western Blot revelaron la presencia de la proteína TF en el sobrenadante de cultivo
de B. abortus 2308. A pesar de que se encontraron niveles menores de proteína en el sobrenadante de cultivo de
la cepa mutante virB1::Kan, la secreción no resultó dependiente del sistema VirB de B. abortus, cuyos
componentes se expresan en la fase estacionaria del crecimiento (Fig. 12A). Resultados similares se obtuvieron
al analizar la actividad CAT en los sobrenadantes de cultivo de las cepas mutantes virB1::Kan, virB10::Kan y
ΔvirB11 que expresan los 35 aminoácidos del extremo amino-terminal de la proteína TF fusionados a CAT (Fig.
12C). Si bien se observa una reducción de la actividad para la cepa virB1::Kan, las otras dos mutantes mostraron
niveles similares al de la cepa parental salvaje, confirmando que la proteína de fusión a CAT se secreta de forma
independiente del sistema VirB.
Por otro lado, no pudo detectarse expresión de FlgE, intimina, ni p74 por medio de esta metodología, al
menos en las condiciones ensayadas. Por último, aunque se observó expresión de la proteína hipotética p84
usando extractos totales, no pudo detectarse su presencia en los sobrenadantes de cultivo.
!
4&REC
B
#
"ABORTUS
%4
3N
"ABORTUS
VIR"+AN
3N
%4
Figura 12. Análisis de la secreción de la enzima
trigger factor (TF) al medio de cultivo de manera
VirB independiente. Las proteínas de los extractos
totales (ET) y de los sobrenadantes de cultivo (Sn)
correspondientes a las cepas B. abortus 2308 y
virB1::Kan, se analizaron por 10% SDS-PAGE.
También se incluyó la proteína TF recombinante (rec).
Las proteínas fueron transferidas a una membrana
de nitrocelulosa y se detectaron con antisueros
policlonales anti-TF (A) y anti-PGM para descartar
lisis celular (B). Sobre la izquierda se indica la
posición de los marcadores de peso molecular (en
kDa). (C) Actividad CAT medida en los
sobrenadantes de cultivo de la cepa salvaje B.
abortus 2308 (WT) y de las mutantes virB1::Kan,
virB10::Kan y ΔvirB11 (virB1, virB10 y virB11 )
que expresan la proteína de fusión TF(1-35)::CAT. Las
barras del gráfico indican la media más el error
estándar de dos determinaciones independientes. *
P<0,05. El análisis estadístico se realizó con una
prueba t de Student.
Capítulo I - 35
Estudio de la participación de las proteínas identificadas en la virulencia de B. abortus
Para determinar si las proteínas identificadas cumplen un rol en la virulencia de B. abortus, se construyeron
las cepas mutantes en los genes que codifican para las siguientes proteínas: trigger factor (TF), proteína flagelar
FlgE, intimina, y dos proteínas hipotéticas de 84 (p84) y 74 (p74) aminoácidos, respectivamente. Estas cepas se
obtuvieron por inserción de un cassette de resistencia a un antibiótico en el gen de interés o por deleción del gen
en el caso de p74 y p84 (ver Materiales y Métodos).
Se analizó la replicación intracelular de las cepas mutantes y de la cepa parental (B. abortus 2308)
utilizando el modelo de infección de células HeLa (epiteliales humanas) y células macrofágicas murinas (línea
J774.A1). Para ambas líneas celulares y en todos los tiempos post-infección (p.i.) ensayados, el número de
bacterias intracelulares de las cepas mutantes se mantuvo en niveles similares a los de la cepa parental.
Para analizar la virulencia de las cepas mutantes en ratones BALB/c, se inyectaron en forma intraperitoneal
cantidades equivalentes de bacterias viables de la cepa parental y de las cepas mutantes en ratones hembras de
70 días de edad. A los 15 y 30 días p.i. los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y se midió en
número de UFC por bazo. Con excepción de la mutante en el gen que codifica para la proteína trigger factor
(B. abortus tf::Gm), el resto de las mutantes mostraron una colonización de los bazos similar a la cepa parental
para los dos tiempos p.i. ensayados.
Como se muestra en la Figura 13, el número de bacterias viables recuperadas a partir de bazos de
ratones inoculados con la mutante B. abortus tf::Gm fue significativamente menor que el número obtenido a
partir de bazos de ratones inoculados con la cepa parental, tanto a los 15 como a los 30 días p.i. (P=0,0078 y
P=0,0005, respectivamente). Estos resultados sugieren la participación de esta proteína en los procesos de
virulencia en ratón.
,OG5&#BAZO
"ABORTUS "ABORTUS TF'M
D¤ASPI
D¤ASPI
Figura 13. Persistencia de la mutante B. abortus
tf::Gm en bazo de ratones infectados. El número de
bacterias viables en bazo fue determinado a los 15
y 30 días p. i. según se describe en Materiales y
Métodos. Los valores representan las medias más
los errores estándard (n=4). * P<0,05. El análisis
estadístico se realizó con una prueba t de Student.
Capítulo I - 36
Poco tiempo después de obtenidos estos resultados, el grupo de J.J. Letesson publicó un trabajo en el que
demuestra que los genes flagelares fliF, fliI y fliC de B. melitensis 16M son necesarios para establecer una
infección crónica en el modelo murino (Fretin et al., 2005). Teniendo en cuenta estos resultados, se infectaron
ratones BALB/c con la cepa mutante flgE::Gm y se evaluó la persistencia de esta cepa en el bazo esta vez a los
90 días p.i. A pesar de que el número promedio de UFC/bazo en los ratones infectados con la cepa parental fue
mayor que para la cepa mutante, las diferencias no resultaron estadísticamente significativas (P=0,077) (Fig.
14). Si bien la cepa mutante parece atenuada en ratones, los resultados no se comparan con los obtenidos por el
grupo de Letesson que encuentra que las cepas mutantes de B. melitensis 16M en genes flagelares son
prácticamente eliminadas de los bazos a las 12 semanas p.i.
,OG5&#BAZO
Figura 14. Persistencia de la mutante B.
abortus flgE::Gm en bazo de ratones
infectados. El número de bacterias viables en
bazo fue determinado a los 90 días p. i. según
se describe en Materiales y Métodos. Los
valores representan las medias más los errores
estándard (n=3). El análisis estadístico se
realizó con prueba t de Student.
"ABORTUS
"ABORTUS
FLG%'M
DISCUSIÓN
Con el fin de identificar proteínas secretadas por B. abortus, se utilizó una estrategia que consistió en
generar una colección de fusiones traduccionales a una proteína reportera cuya actividad pudiera ser fácilmente
detectable en sobrenadantes de cultivo sólo si el fragmento fusionado es un segmento amino-terminal de una
proteína que porta información para su translocación al medio extracelular. De esta manera, pudieron identificarse
10 fragmentos amino-terminales de proteínas de B. abortus que promovieron la translocación de las proteínas de
fusión.
El tamaño de los fragmentos fusionados a CAT varió de 5 a 386 aminoácidos, lo que sugiere que el
sistema permite analizar fusiones de tamaños variables. Resultados similares se obtuvieron al utilizar la fosfatasa
Capítulo I - 37
alcalina como proteína reportera, generándose fusiones de 23 a 388 aminoácidos (Ward et al., 2001) y de 60 a
207 aminoácidos (Wiker et al., 2000).
Cinco de las proteínas de fusión identificadas tienen predicción de péptido señal y/o segmentos
transmembrana como se muestra en la Tabla 2. Las cinco proteínas restantes, a pesar de no tener predicción de
péptido señal ni segmentos transmembrana, poseen información para su secreción en el fragmento aminoterminal fusionado a CAT. Las proteínas con predicción de segmentos transmembrana pudieron ser secretadas
ya que los fragmentos incluidos en la fusión no poseen la señal de retención en la membrana (ver posición del
primer segmento transmembrana predicho en la Tabla 2). De esta manera, la metodología implementada también
permitió la identificación de proteínas de superficie.
En la Tabla 3 se muestra un resumen de las características de las proteínas identificadas y los antecedentes
en relación a su probable localización celular. Varias de las proteínas identificadas ya fueron descriptas como
proteínas de superficie o secretadas en otros sistemas. La identificación de proteínas de supuesta localización
citosólica, como BvrR o trigger factor, resultó inesperada en un primer momento. Sin embargo, numerosos
trabajos reportan la localización extracelular de factores de transcripción y chaperonas (ver Tabla3).
A pesar de que las especies del género Brucella se describen como no móviles (Alton, 1975), están
presentes en sus genomas los genes que codifican para la mayoría de las proteínas flagelares. Sin embargo, está
ausente el sistema de quimiotaxis necesario para un flagelo funcional (Chain et al., 2005). Además, varios de los
genes que codifican para las proteínas flagelares están pseudogenizados. No obstante, bajo ciertas condiciones
de cultivo, B. melitensis 16M es capaz de ensamblar un flagelo que es necesario para el establecimiento de una
infección crónica en ratones (Fretin et al., 2005). Contrariamente, la expresión de la proteína flagelar FlgE de B.
abortus no pudo ser detectada bajo las condiciones estándares de cultivo ni tampoco bajo la condición en la que
se expresan las proteínas flagelares de B. melitensis. Sin embargo, la atenuación de la cepa mutante en el
ensayo de infección de ratones podría sugerir algún rol de esta proteína en la virulencia, en concordancia con lo
que fue descripto para B. melitensis 16M (Fretin et al., 2005).
La proteína hipotética de 74 aminoácidos y la proteína de la familia Intimina/Invasina tampoco pudieron
detectarse por Western Blot en extractos totales de B. abortus. Una posible explicación para este resultado es
que las proteínas no se expresen en las condiciones de cultivo utilizadas para la preparación de los extractos
totales. Cabe destacar que las fusiones traduccionales a CAT se generaron bajo un promotor constitutivo de
Brucella para asegurar la expresión de las proteínas de fusión. Por otro lado, si bien pudo detectarse la expresión
de la proteína hipotética de 84 aminoácidos en extractos totales, no se obtuvieron los mismos resultados cuando
Capítulo I - 38
Tabla 3. Características y antecedentes de las proteínas identificadas.
Nombre de
la fusión
1B5B
Nro. de
acceso
BAB1_0493
1B5F
BAB2_0260
4B1B
BAB1_1043
4B1C
BAB2_1098
5A3E
BAB1_0917
5B7B
BAB1_2092
5B10C
BAB1_1280
7A8C
BRA2009
7A8E
BAB1_0530
8A2A
BAB1_1922
Características y antecedentes
Citocromo c Oxidasa, Subunidad I. Proteína integral de membrana
plasmática, componente de la cadena respiratoria. Entre las proteínas de
superficie o secretadas por bacterias de los géneros Bordetella y
Actinobacillus, se han identificado componentes de la cadena respiratoria
(Tu et al., 2001; Ward et al., 2001).
Proteína hipotética. Esta proteína tiene predicción de péptido señal y dos
segmentos transmembrana. Además, posee el dominio Citocromo c
Oxidasa, Subunidad IV (NCBI Conserved Domains Database, Valor E= 8
E-08). Estos datos sugieren que esta proteína podría ser componente de la
cadena respiratoria al igual que BAB1_0493. De hecho, proteínas
homólogas están anotadas como Subunidad IV de la Citocromo c
Oxidasa.
Proteína hipotética. Esta proteína tiene predicción de dos segmentos
transmembrana. Además, contiene el dominio HAMP (Pfam, Valor E=
2,9 E-03) presente en proteínas sensoras (kinasas de histidina) de los
sistemas de dos componentes bacterianos.
Proteína Flagelar FlgE. Es un componente extracelular del flagelo
(Jones y Aizawa, 1991). Se ha reportado la secreción de proteínas
flagelares al medio de cultivo en Salmonella typhimurium (Komoriya et
al., 1999), Bordetella bronchiseptica (Tu et al., 2001) y Helicobacter
pylori (Bumann et al., 2002).
Trigger factor. Esta es una enzima con actividad peptidil-prolil cis trans
isomerasa. Se ha descripto tanto la secreción como la presencia de estas
enzimas en la superficie de bacterias como por ejemplo Helicobacter
pilory (Kim et al., 2002) y Chlamydia pneumoniae (Montigiani et al.,
2002).
Regulador transcripcional BvrR. Esta es la única de las proteínas
identificadas que se supone tiene una localización citoplasmática por su
capacidad de unirse al ADN y regular la transcripción de genes. Sin
embargo, existen reportes de reguladores transcripcionales que son
secretados o están en la superficie bacteriana como ToxR de Vibrio
cholerae (Miller et al., 1987), BglG de Escherichia coli (Lopian et al.,
2003), FlgM de Salmonella typhimurium (Hughes et al., 1993) y EspR de
Mycobacterium tuberculosis (Raghavan et al., 2008).
Proteína hipotética. A pesar de estar anotada como proteína hipotética,
la cepa de B. abortus mutante en este gen ('p84) es deficiente en su
crecimiento a temperatura ambiente (Marchesini, resultados no
publicados).
Proteína de la familia Intimina/Invasina (proteína polimórfica en las
distintas especies de Brucella). Las proteínas de esta familia son adhesinas
que participan en la adhesión y en la entrada a la célula eucariota en
bacterias entéricas (Isberg et al., 1987) y en especies patógenas del género
Leptospira (Matsunaga et al., 2003).
Proteína BioY. Esta proteína tiene predicción de péptido señal y cinco
segmentos transmembrana, lo que sugiere que es una proteína de
membrana interna. En Sinorhizobium meliloti el gen que codifica para esta
proteína se cotranscribe con genes que codifican para transportadores tipo
ABC que transportan biotina desde las raíces de la alfalfa hacia la bacteria
(Entcheva et al., 2002). En Rhizobium etli, BioY está involucrada en el
transporte de biotina (Guillen-Navarro et al., 2005).
Dihidrolipoamida acetiltransferasa (SucB). Componente del complejo
2-oxoglutarato deshidrogenasa. Esta proteína fue descripta como
inmunogénica en la brucelosis ovina (Teixeira-Gomes et al., 1997a;
Teixeira-Gomes et al., 1997b), lo que sugiere que la proteína podría
localizarse en la superficie en B. abortus.
Capítulo I - 39
se analizaron los sobrenadantes de cultivo. Esto podría deberse a que el ensayo de Western Blot con el antisuero
policlonal anti-p84 no es lo suficientemente sensible para detectar la proteína en el sobrenadante, o a que la
proteína no se secreta en las condiciones de cultivo empleadas.
Como se observa en la Figura 12, la proteína trigger factor pudo detectarse en el sobrenadante de cultivo
de B. abortus 2308, un resultado que confirma su secreción al medio extracelular. TF fue originalmente descripta
como una chaperona citoplasmática en Escherichia coli requerida para la translocación de proOmpA (Crooke
y Wickner, 1987). Esta enzima tiene actividad peptidil-prolil cis trans isomerasa y asiste el plegamiento de las
proteínas en el citosol a medida que estas son sintetizadas en los ribosomas. Sin embargo, existen reportes que
describen la secreción o asociación de estas enzimas a la superficie de bacterias, como el caso de HP0175 de
Helicobacter pylori (Basak et al., 2005), PpiB y Mip de Legionella pneumophila (Debroy et al., 2006;
Soderberg y Cianciotto, 2008), y la enzima peptidil-prolil cis trans isomerasa D (BAB1_1162) de B. abortus
(Connolly et al., 2006). En un trabajo reciente, se ha descripto la presencia de la chaperona Hsp60 en la membrana
de B. abortus (Watarai et al., 2003). Asimismo, la chaperona DnaK pudo ser detectada en la envoltura celular
de B. melitensis utilizando técnicas de microscopía electrónica (Cloeckaert et al., 1996). Las chaperonas Hsp60
y Hsp70 también están asociadas a la membrana en Streptococcus agalactiae (Hughes et al., 2002). Lo mismo
fue reportado para Hsp70 en Chlamydia pneumoniae (Montigiani et al., 2002). Por último, Hsp60 de L.
pnuemophila se asocia predominantemente con la membrana externa y se acumula en el espacio endosomal de
bacterias que replican intracelularmente (Garduno et al., 1998).
Además de secretarse al medio extracelular, TF tiene un rol en la virulencia de B. abortus en ratones.
Recientemente, en un análisis de signature-tagged mutagénesis de B. melitensis 16M durante la fase aguda de
infección en ratones, se pudo identificar una mutante con una inserción en el gen que codifica para TF (Lestrate
et al., 2003). Resultados similares se obtuvieron al analizar la virulencia de una cepa mutante de B. suis 1330 en
el gen que codifica para la chaperona DnaK. Esta mutante es incapaz de replicar en macrófagos murinos y es
rápidamente eliminada del bazo de ratones infectados (Kohler et al., 2002a).
La presencia de TF en el medio extracelular y la atenuación de la virulencia en ratones de las cepas
mutantes de B. abortus y B. melitensis, sugieren la participación de esta enzima en el plegamiento de proteínas
de membrana o secretadas, que probablemente constituyan determinantes de la virulencia de Brucella spp.
Experimentos adicionales son necesarios para determinar el mecanismo mediante el cual la proteína TF participa
de los procesos de virulencia de Brucella y para comprender el mecanismo de secreción de esta enzima ya que
Capítulo I - 40
no posee un péptido señal ni secuencias transmembrana y su localización extracelular es independiente del
sistema de secreción VirB de Brucella.
Sobre la base de los resultados obtenidos puede concluirse que la metodología utilizada para la identificación
de proteínas de B. abortus de superficie y secretadas al medio de cultivo fue validada ya que se encontró la
proteína extracelular FlgE, una proteína inmunogénica de Brucella (SucB), proteínas con predicción de péptido
señal y/o segmentos transmembrana, así como también proteínas previamente identificadas en otros sistemas
mediante el uso de diversas metodologías. Además, pudo confirmarse la secreción de la proteína TF mediante
el uso de un antisuero policlonal específico. Sin embargo, esta metodología debe complementarse con ensayos
que descarten lisis celular y blebbing para asegurar que no haya contaminación con proteínas citosólicas. Por
último, el análisis de las proteínas secretadas por B. abortus permitió la identificación de una enzima involucrada
en la patogénesis de la bacteria en ratones en concordancia con los resultados obtenidos en B. melitensis 16M
(Lestrate et al., 2003).
Si bien la metodología empleada en la identificación de proteínas de superficie o secretadas al medio de
cultivo permitió descartar la participación del sistema VirB en la secreción de la enzima TF, el perfil de activación
intracelular del operón virB hizo necesaria la implementación de técnicas que posibiliten la detección de proteínas
translocadas al citoplasma de la célula huésped.
En el próximo capítulo se describe el uso de una proteína reportera que permite detectar la translocación
de proteínas de B. abortus al citoplasma eucariota al elevar los niveles intracelulares de AMPc.
CAPÍTULO II
Capítulo II - 41
Capítulo II - Identificación de proteínas de Brucella abortus secretadas intracelularmente
INTRODUCCIÓN
En el Capítulo I de esta tesis se describe el uso de una metodología para la identificación de proteínas de
B. abortus secretadas al medio de cultivo. Una de las proteínas identificadas, la enzima trigger factor, pudo
detectarse en los sobrenadantes de cultivo con un antisuero policlonal específico y se demostró que cumple un
rol en la patogénesis de B. abortus en ratones. El mecanismo de secreción de trigger factor aún no se conoce,
pero se determinó que no depende del sistema de secreción Tipo IV de Brucella.
Los sistemas de secreción bacterianos tipo IV son complejos multiprotéicos presentes en especies patógenas
como Helicobacter pylori, Legionella pneumophila y Bartonella henselae, entre otras (Backert y Meyer,
2006). Estas especies utilizan el sistema de secreción tipo IV para translocar al citosol de la célula huésped
proteínas efectoras que modulan ciertas funciones de la célula eucariota durante el proceso de infección. Como
se mencionó en la Introducción General de la tesis, en B. abortus este sistema de secreción se denomina VirB
y es esencial para la supervivencia y replicación dentro de la célula huésped y para la virulencia en el modelo
murino (Sieira et al., 2000). Moléculas efectoras secretadas por el sistema VirB serían las responsables de
evadir la vía endocítica degradativa, permitiendo así el establecimiento de un nicho de replicación intracelular en
compartimientos derivados del retículo endoplasmático, proceso que es central para que se genere una infección
duradera y exitosa (Celli et al., 2003; Comerci et al., 2001; Starr et al., 2008).
Recientemente, se conoció que la activación intracelular de los genes virB de B. abortus alcanza un
máximo de expresión a las 5 hs p.i. (Sieira et al., 2004). Sobre la base de estos antecedentes, y considerando que
se carece de un sistema que permita emular la actividad in vivo, consideramos apropiado realizar un análisis de
las proteínas de B. abortus secretadas intracelularmente, con particular interés en aquellas translocadas por el
sistema VirB. Estas moléculas serían las responsables de modular el tráfico intracelular de la vacuola que
contiene a la bacteria, constituyendo probables determinantes de virulencia de Brucella.
Con el objetivo de detectar la translocación de proteínas de B. abortus al citoplasma de la célula infectada,
se hizo un análisis in silico del proteoma teórico de B. abortus y se construyeron fusiones traduccionales a la
proteína reportera Adenilato Ciclasa de Bordetella pertussis. Una vez translocado al citoplasma eucariota, el
dominio catalítico de esta toxina se activa con la calmodulina allí presente y eleva los niveles de AMPc en el
Capítulo II - 42
citosol (Dautin et al., 2002). Este sistema fue utilizado por primera vez para analizar la secreción de YopE, un
sustrato del sistema de secreción tipo III de Yersinia enterocolitica (Sory y Cornelis, 1994). A partir de ese
momento, ha sido ampliamente empleado en la identificación y caracterización de moléculas efectoras de sistemas
de secreción tipo III y tipo IV bacterianos (Campodonico et al., 2005; Cunnac et al., 2004; Sory et al., 1995;
Subtil et al., 2001).
En este capítulo se describe por primera vez el uso de este sistema en la detección de proteínas translocadas
intracelularmente por B. abortus, con el objetivo de identificar sustratos de la maquinaria de secreción VirB.
Capítulo II - 43
RESULTADOS
La toxina Adenilato Ciclasa de Bordetella pertussis: proteína reportera de translocación intracelular
Una aproximación al análisis de proteínas translocadas intracelularmente consiste en la construcción de
fusiones de proteínas de B. abortus al dominio catalítico (CyaA) de la toxina Adenilato Ciclasa de Bordetella
pertussis. Esta enzima sintetiza AMPc a partir de ATP, pero únicamente en presencia del activador calmodulina
se alcanzan niveles suprafisiológicos de AMPc (Dautin et al., 2002). Teniendo en cuenta que la calmodulina sólo
está presente en el citoplasma eucariota, y que el dominio catalítico de la toxina no contiene información para su
transporte al citoplasma, sólo aquellas fusiones que porten alguna señal para su translocación tendrán actividad
y los niveles de AMPc intracelulares de las células infectadas con las cepas que expresen estas fusiones aumentarán
(Fig. 15). De esta manera, se podrán identificar proteínas translocadas al citoplasma eucariota, una característica
esperable para los efectores del sistema VirB.
#£LULA)NFECTADA
#A-
.¢CLEO
#A#A#A8
#YA!
#A-
!-0
!
#YA
8
6IR"
#A-
&AGOSOMACON"ABORTUS
EXPRESANDOPROTE¤NADEFUSI˜N
!-0C
#A-
Figura 15. Representación esquemática del sistema elegido para la detección de proteínas de B. abortus
translocadas intracelularmente. En células infectadas, aquellas fusiones X-CyaA translocadas al citoplasma
eucariota (por el sistema VirB u otro) se activan al unirse a calmodulina (CaM) y catalizan la síntesis de AMPc
a partir de AMP.
Identificación de proteínas de B. abortus con dominios eucariotas
Con el propósito de seleccionar las proteínas de B. abortus 2308 que se fusionarían a CyaA, se realizó un
análisis in silico del proteoma teórico de la bacteria mediante el cual se escogieron aquellas proteínas que
Capítulo II - 44
presentan motivos y/o dominios de interacción proteína-proteína propios de eucariotas. Esta característica les
confiere a las proteínas la capacidad potencial de interaccionar con proteínas del huésped y “manipular” ciertas
funciones celulares, tal como se describió en otras especies patógenas (Cazalet et al., 2004; Chen et al., 2004;
de Felipe et al., 2005; Luo e Isberg, 2004; Nagai et al., 2002).
Como se muestra en la Figura 16, todos los marcos de lectura abiertos de B. abortus 2308 fueron analizados
con los programas Pfam (Finn et al., 2008) y SMART (Letunic et al., 2009; Schultz et al., 1998) en busca de
“dominios eucariotas”. Se consideraron “dominios eucariotas” aquellos motivos ampliamente distribuidos en
Eukarya y poco representados en Archea y Bacteria, y que tienen funciones conocidas asociadas con eucariotas
(Ponting et al., 1999). En aquellos casos en los cuales se predijo la presencia de coiled coils, las proteínas
fueron analizadas con el programa COILS (Lupas et al., 1991). En la siguiente etapa, las proteínas candidatas se
analizaron con BLAST (blastp) y se escogieron aquellas proteínas poco representadas en bacterias.
0DUFRVGHOHFWXUDDELHUWRVGH%DERUWXV
60$573IDP\&2,/6
3URWHtQDVVLQGRPLQLRV
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Figura 16. Diagrama de flujo del análisis bioinformático realizado para identificar proteínas de B.
abortus con dominios eucariotas.
Al concluir el análisis se eligió un grupo de ocho proteínas de B. abortus para fusionar a CyaA (Fig. 17, AH). En la Tabla 4 se muestran los dominios y/o motivos encontrados en las proteínas seleccionadas con el análisis
bioinformático.
Capítulo II - 45
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Figura 17. Representación esquemática de las proteínas de B. abortus seleccionadas para fusionar a CyaA.
Para cada proteína se representan los dominios encontrados y se indica el número de aminoácidos. A:
BAB1_0756; B: BAB1_0279; C: BAB1_1865; D: BAB2_0123; E: BAB1_1720; F: BAB1_0891; G: BAB2_0413;
H: BAB2_0245. TIR: Toll/Interleukin-1 Receptor. CC: Coiled-Coil. PS: Péptido Señal. Sel1: repeticiones
Sel1-like. PGB1: dominio de unión a peptidoglicano. WD40: repeticiones WD-40. La predicción de péptido
señal se hizo usando los programas SignalP 3.0 (Bendtsen et al., 2004) y PSORTb v.2.0.4 (Gardy et al., 2005).
A continuación se describen brevemente los dominios y motivos identificados, y para algunos se menciona
la prevalencia en bacterias patógenas.
TIR: Toll/Interleukin-1 Receptor. Este es un dominio de señalización intracelular presente en el receptor
de Interleuquina 1, en el receptor Toll de Drosophila melanogaster, y en los receptores Toll-like (TLRs) y
proteínas adaptadoras (MyD88, MAL, TRIF, TRAM y SARM). El dominio contiene tres regiones altamente
conservadas (Slack et al., 2000) y media interacciones proteína-proteína entre TLRs y los componentes de
transducción de señales, las cuales son esenciales para los procesos de inmunidad innata en mamíferos. Este
dominio también está presente en proteínas de plantas y se considera que está involucrado en la resistencia a
patógenos (Burch-Smith y Dinesh-Kumar, 2007). Recientemente, se describió la presencia de una proteína con
este dominio en Salmonella enterica serovar Enteriditis, y se demostró su rol en la cascada de señalización vía
TLRs, así como su participación en los procesos de virulencia en células y ratones (Newman et al., 2006). En
Paracoccus denitrificans también se identificó una proteína con un dominio TIR que tiene capacidad de
interactuar con los dominios TIR de TLR4 y MyD88 (Low et al., 2007). En ambos casos se sugiere que las
Capítulo II - 46
proteínas bacterianas podrían interferir con los procesos de inmunidad innata permitiendo que la infección no sea
advertida por el huésped.
Tabla 4. Dominios y/o motivos presentes en las proteínas de B. abortus
seleccionadas para fusionar a CyaA.
Proteína
Nro. de acceso *
Valor E
BAB1_0756
Dominios y/o
motivos (Pfam)
TIR (PF01582)
A
B
BAB1_0279
TIR (PF01582)
7x10-11
C
BAB1_1865
Coiled coil
--
D
BAB2_0123
Coiled coil
--
E
BAB1_1720
Sel1 (PF08238)
F
BAB1_0891
Sel1 (PF08238)
G
BAB2_0413
Coiled coil
2x10-24
(COG 0790: TPRsubfamilia Sel1)
1x10-22
( COG 0790: TPRsubfamilia Sel1)
--
H
BAB2_0245
1x10-70
Sel1 (PF08238)
2x10-15
( COG 0790: TPRsubfamilia Sel1)
PGB1 (PF01471)
WD40 (PF00400)
3x10-10
1x10-13
Todos los dominios fueron identificados con los programas Pfam (Finn et al., 2008) y
SMART (Letunic et al., 2009; Schultz et al., 1998), a excepción del dominio TIR de
BAB1_0756, que fue detectado con el programa Conserved Domains Database v.2.16
(Marchler-Bauer et al., 2009). *El nro. de acceso corresponde a las proteínas de B. abortus
2308. Valor de E según el programa Conserved Domains Database v.2.16.
Coiled Coils. Los coiled-coils son motivos estructurales en los que 2-7 α-hélices están enrolladas de
forma paralela o anti-paralela. Las proteínas eucariotas con estructuras coiled-coils participan en diversas
funciones celulares incluyendo regulación transcripcional, síntesis de tRNA y la formación de complejos fusogénicos
por medio de proteínas SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor),
entre otros (Burkhard et al., 2001; Lupas, 1996). En procariotas se conocen pocas estructuras tridimensionales
Capítulo II - 47
de proteínas con coiled-coils. Algunas de las proteínas estudiadas incluyen un regulador transcripcional (Renzoni
et al., 2001), un sensor de membrana (Surette y Stock, 1996), y componentes estructurales que participan del
ensamblado del flagelo (Mimori-Kiyosue et al., 1997) y del pili tipo IV (Parge et al., 1995). En la especie
patógena Legionella pneumophila, varios de los sustratos del sistema de secreción Dot-Icm poseen predicción
de coiled coils (Chen et al., 2004; Luo e Isberg, 2004; Ninio y Roy, 2007). Asimismo, se ha descripto la
presencia de estos motivos en varios sustratos del sistema de secreción tipo III de Escherichia coli (EPEC/
EHEC), Yersinia spp., Salmonella spp., Shigella flexneri y Pseudomonas aeruginosa (Delahay y Frankel,
2002).
Sel1: repeticiones Sel1-like. El motivo TPR (tetratrico peptide repeat) fue originalmente descripto en
proteínas del ciclo de división celular de Saccharomyces cerevisiae (Hirano et al., 1990; Sikorski et al., 1990).
Este motivo es ubicuo en la naturaleza y se encuentra en proteínas con funciones no relacionadas en organismos
de todos los géneros. El motivo TPR está definido por una secuencia degenerada de 34 aminoácidos con un
arreglo consenso que alterna residuos grandes y pequeños, y una alta conservación especialmente en las posiciones
8, 20 y 27 (Sikorski et al., 1990). Estos residuos conservados permiten la creación de un par de alfa-hélices
antiparalelas. La presencia de varios motivos TPR (3 a 16), permiten la formación de una estructura alfasuperhélice (Das et al., 1998). Esta estructura compleja y única, origina distintos surcos que facilitan interacciones
proteína-proteína específicas. La capacidad de las proteínas con motivos TPR de interactuar con otras proteínas,
hace posible su participación en procesos celulares centrales como mitosis, represión transcripcional y transporte
de proteínas (Dodt y Gould, 1996; King et al., 1995; Tzamarias y Struhl, 1994). En bacterias, las proteínas con
motivos TPR están involucradas en varias funciones que incluyen regulación genética, funcionamiento del motor
flagelar, plegamiento de proteínas y virulencia (Broms et al., 2003; Core y Perego, 2003; Okabe et al., 2005;
Wattiau et al., 1994). Las chaperonas PcrH de Pseudomonas aeruginosa, LcrH de Yersinia spp., y CesD de
Escherichia coli EPEC, requeridas para la translocación de efectores por el sistema tipo III, contienen motivos
TPR (Broms et al., 2003; Broms et al., 2006; Pallen et al., 2003; Wattiau et al., 1994).
El motivo Sel1-like repeats (SLR) es un subtipo de TPR originalmente identificado en la proteína
extracelular Sel1 de Caenorhabditis elegans (Grant y Greenwald, 1996). Esta proteína y sus homólogos están
involucrados en interacciones entre células que determinan el destino de las células durante el desarrollo (Grant
y Greenwald, 1996). El motivo SLR tiene una definición menos estricta que el TPR, con una longitud que varía
entre 36 y 40 aminoácidos (Mittl y Schneider-Brachert, 2007). No obstante, el motivo consenso es comparable
y por consiguiente el plegamiento es considerado equivalente. Por lo tanto, se postula que las proteínas con estos
Capítulo II - 48
dominios también median interacciones proteína-proteína, y el motivo es preferentemente encontrado en proteínas
eucariotas (Mittl y Schneider-Brachert, 2007). Las proteínas EnhC, LpnE y LidL de L. pneumophila contienen
motivos SLR y se ha demostrado que son importantes para la interacción entre la bacteria y la célula huésped
(Cirillo et al., 2000; Newton et al., 2006; Newton et al., 2007).
PGB1: dominio de unión a peptidoglicano. Este domino está compuesto de tres alfa-hélices (Foster, 1991).
Se encuentra en los extremos amino o carboxilo terminales de enzimas que degradan la pared celular de bacterias
(Gooley et al., 1994). Este dominio tiene la función general de unir peptidoglicano. Muchas de las proteínas que
presentan este dominio aún no han sido caracterizadas. Algunas son peptidasas como la enzima muramoilpentapéptido carboxipeptidasa.
WD40: repeticiones WD-40. Este dominio está formado por repeticiones de 40 aminoácidos, que
generalmente terminan en el dipéptido Trp-Asp (W-D). El número de repeticiones puede variar entre 4 y 16. Las
proteínas con repeticiones W-D están implicadas en funciones muy variadas como transducción de señales,
regulación de la transcripción, control del ciclo celular y apoptosis (Neer et al., 1994). La función común a todas
las proteínas que tienen estas repeticiones es la coordinación del ensamblado de complejos multiprotéicos, en los
cuales la interacción entre proteínas ocurre a nivel de las repeticiones. La especificidad está determinada por las
secuencias que flanquean las repeticiones. Ejemplos de estos complejos son las proteínas G, el factor de transcripción
TAFII y la E3 ubiquitina ligasa (Li y Roberts, 2001; Smith et al., 1999).
Construcción de fusiones traduccionales a CyaA
Los genes que codifican para las proteínas seleccionadas se clonaron en fase con el dominio catalítico
de la toxina adenilato ciclasa (CyaA), en un vector replicativo en Brucella, y bajo un promotor constitutivo de B.
abortus (Pbcsp31) o bajo el promotor del operón virB (PvirB), el cual se activa intracelularmente (Fig. 18). Además,
se incluyeron como controles las proteínas VirB2 (extracelular), VirB6 (proteína integral de membrana interna),
VirB7 (proteína asociada a la membrana externa) y la proteína flagelar FlgE (extracelular). En el caso que las
fusiones a estas proteínas queden asociadas a la membrana o en el espacio endosomal, el dominio CyaA no
puede activarse y no habría un aumento del AMPc intracelular.
Se construyeron un total de 24 fusiones al extremo amino-terminal de CyaA (12 con cada promotor), y los
plásmidos que codifican para las proteínas de fusión se introdujeron en B. abortus 2308 mediante conjugación
biparental (ver Materiales y Métodos).
Capítulo II - 49
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Figura 18. Representación esquemática de los vectores pBCSP31-cyaA y pvirB-cyaA utilizados para la
construcción de las fusiones traduccionales a CyaA. Entre los sitios BamHI y SpeI se clonaron los genes de
B. abortus que codifican para las proteínas seleccionadas (ver Materiales y Métodos). Pbcsp31: promotor del
gen bcsp31, PvirB: promotor del operón virB. CyaA: dominio catalítico de la toxina adenilato ciclasa.
Para corroborar la correcta expresión de las proteínas de fusión en B. abortus, se hicieron experimentos
de Western Blot usando un antisuero policlonal anti-CyaA. Para obtener este antisuero se clonó el dominio
catalítico de la toxina adenilato ciclasa en un vector de expresión. Una vez expresada la proteína en Escherichia
coli, ésta se purificó y se inmunizaron ratones para obtener los sueros reactivos (ver Materiales y Métodos).
Mediante los experimentos de Western Blot, usando cantidades equivalentes de proteínas de extractos totales de
las cepas que expresan las fusiones, pudo corroborarse que la expresión de las fusiones bajo el promotor virB
era muy débil en comparación con el promotor constitutivo (Fig. 19). Estos resultados están en concordancia con
el patrón de activación intracelular del operón virB (Sieira et al., 2004). Por lo tanto, en los experimentos que
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siguen se utilizaron sólo las cepas que expresan las fusiones bajo el promotor del gen bcsp31.
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Figura 19. Análisis de la expresión de las proteínas de fusión FlgE-CyaA y BAB1_1865-CyaA por Western
Blot. Cantidades equivalentes de proteínas de los extractos totales de las cepas que expresan las fusiones bajo
los promotores Pbcsp31 y PvirB se analizaron por 10% SDS-PAGE y las proteínas se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa. Para el Western Blot se usó un suero que reconoce a la proteína CyaA. Sobre la izquierda se indica
la posición de los marcadores de peso molecular (en kDa).
Capítulo II - 50
Además, se verificó que las cepas de B. abortus que expresan las fusiones pudieran infectar y replicar en
las células macrofágicas que se iban a usar en el ensayo de translocación al citoplasma de las proteínas de
fusión. Este último control es importante para descartar que el aumento de AMPc intracelular sea producto de la
lisis de la bacteria dentro de la célula huésped y no de la translocación al citoplasma del dominio CyaA. Para
verificar esto, se infectaron células tipo macrofágicas murinas de la línea J774.A1 y se analizó el número de
UFC recuperadas después de lisar las células infectadas a las 4, 24 y 48 hs p.i. A las 4 hs p.i., el número de UFC
recuperadas de las células infectadas con las cepas que expresan las fusiones fue similar o mayor que el de las
células infectadas con la cepa conteniendo el plásmido con CyaA sin fusionar (ver Figura A del Apéndice, pág
112). Por otro lado, sólo la cepa que expresa la fusión VirB6-CyaA fue incapaz de replicar en estas células,
mostrando un fenotipo similar al de las mutantes en genes del operón virB en infecciones de células HeLa (Sieira
et al., 2000). Probablemente, la expresión de la proteína de fusión VirB6-CyaA en la cepa merodiploide impide
la correcta formación de complejos multiméricos, lo que genera un sistema de secreción no funcional.
Identificación de proteínas de B. abortus translocadas al citoplasma eucariota
Luego de realizar los controles descriptos en los párrafos anteriores, se infectaron células macrofágicas
murinas de la línea J774 A.1 con las cepas de B. abortus que expresan las 12 fusiones. También se incluyeron
una cepa que expresa el dominio CyaA sin fusionar (bajo el promotor del gen bcsp31) y otra que contiene el
plásmido vacío (pBBR MCS-4). A las 5 hs p.i. se lisaron las células y se analizaron los niveles de AMPc
intracelulares mediante un ensayo de ELISA (ver Materiales y Métodos). Como puede observarse en la Figura
20, dos de las proteínas de fusión ensayadas, BAB1_1865-CyaA y BAB2_0123-CyaA, se translocaron al
citoplasma del macrófago aumentando significativamente los niveles intracelulares de AMPc en las células
infectadas con las cepas que expresan estas fusiones.
Luego, se analizó la concentración de AMPc intracelular a distintos tiempos p.i. en las células infectadas
con las cepas que expresan las fusiones translocadas BAB1_1865-CyaA y BAB2_0123-CyaA. Para ambas
proteínas de fusión se encontró que los niveles de AMPc alcanzan un máximo entre las 2 y las 5 hs p.i., y que hay
una disminución en la concentración a las 21 hs p.i. (Fig. 21A y B). Estos resultados están en concordancia con
el patrón de expresión de los genes virB en función del tiempo p.i., sugiriendo que ambas proteínas podrían ser
translocadas a través de este sistema (Sieira et al., 2004).
Capítulo II - 51
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Figura 20. Valores de AMPc intracelulares en macrófagos J774.A1 infectados con cepas de B. abortus que expresan
las proteínas A-H, proteínas del sistema VirB (VirB2, VirB6 y VirB7) y la proteína flagelar FlgE, todas fusionadas
a la proteína reportera CyaA. A: BAB1_0756; B: BAB1_0279; C: BAB1_1865; D: BAB2_0123; E: BAB1_1720; F:
BAB1_0891; G: BAB2_0413; H: BAB2_0245. Como controles se incluyeron infecciones con una cepa que expresa
CyaA sin fusionar bajo el promotor del gen bcsp31 (CyaA) y una cepa que contiene el plásmido en el que se hicieron
las construcciones (pBBR MCS-4). También se cuantificó el AMPc en células sin infectar (Sin Infección). Los
macrófagos se lisaron a las 5 horas post-infección y se cuantificó el AMPc intracelular con un ensayo de ELISA (ver
Materiales y Métodos). Las barras del gráfico indican la media más el error estándar de dos determinaciones
independientes.
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Figura 21. Contenido de AMPc intracelular en macrófagos J774.A1 infectados con las cepas de B. abortus que
expresan las fusiones BAB1_1865-CyaA y BAB2_0123-CyaA a distintos tiempos p.i. Se cuantificó el AMPc
intracelular de células infectadas con las cepas que expresan BAB1_1865-CyaA (A) o BAB2_0123-CyaA (B) a las 2,
5 y 21 hs p.i. Como control se incluyó la cepa que expresa CyaA sin fusionar (CyaA). También se cuantificó el AMPc
en células sin infectar (S/Inf.) a las 21 hs p.i. El AMPc intracelular se cuantificó con un ensayo de ELISA (ver
Materiales y Métodos). Las barras del gráfico indican la media más el error estándar de dos determinaciones
independientes.
Capítulo II - 52
Identificación de proteínas translocadas por el sistema VirB de B. abortus
Con el objetivo de determinar si la translocación de las fusiones BAB1_1865-CyaA y BAB2_0123-CyaA
al citoplasma del macrófago es un proceso dependiente del sistema VirB, se infectaron células con cepas que
expresan estas fusiones y que son mutantes en genes del operón virB, y se compararon los niveles intracelulares
de AMPc con los obtenidos para las células infectadas con la cepa parental.
Se usaron tres cepas mutantes previamente caracterizadas en el laboratorio: virB1::Kan, virB10::Kan
(Comerci et al., 2001; Sieira et al., 2000) y una cepa con una deleción en el gen que codifica para virB11 (D.
Comerci, sin publicar). Al analizar los niveles de AMPc intracelulares en células infectadas con las cepas mutantes
en genes virB, se encontró que la fusión BAB1_1865-CyaA puede translocarse al citoplasma, aún en ausencia
de un sistema VirB funcional (Fig. 22A). Por otro lado, la proteína de fusión BAB2_0123-CyaA requiere una
maquinaria VirB íntegra para su translocación al citoplasma (Fig. 22B). A modo de control, se verificó la expresión
de la fusión BAB2_0123-CyaA en todas las cepas para descartar que la disminución significativa en los niveles
de AMPc intracelular en las células infectadas con las cepas mutantes virB se deba a una disminución en los
niveles de proteína (Fig. 23).
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Figura 22. Translocación de las fusiones BAB1_1865-CyaA y BAB2_0123-CyaA en cepas mutantes virB. Las
fusiones BAB1_1865-CyaA (A) y BAB2_0123-CyaA (B) se expresaron en la cepa parental (wt) y en las cepas
mutantes virB1::Kan, virB10:Kan y ΔvirB11 (virB1, virB10 y virB11). Los macrófagos infectados con estas
cepas se lisaron a las 5 horas post-infección. Como control se incluyó la cepa parental que expresa CyaA sin
fusionar (CyaA wt). También se cuantificó el AMPc en células sin infectar (Sin Infección). El AMPc intracelular se
cuantificó con un ensayo de ELISA (ver Materiales y Métodos). Las barras del gráfico indican la media más el
error estándar de dos determinaciones independientes.
Capítulo II - 53
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Figura 23. Análisis de la expresión de la proteína de fusión
BAB2_0123-CyaA en las cepas mutantes virB por Western
Blot. Cantidades equivalentes de proteínas de los extractos
totales de la cepa parental (2308) y de las mutantes virB (virB1,
virB10 y virB11) que expresan la fusión BAB2_0123-CyaA se
analizaron por 12,5% SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron
a una membrana de nitrocelulosa y para el Western Blot se usó
un suero que reconoce a la proteína CyaA. En la primera calle
se incluyó la proteína recombinante purificada (CyaArec). Sobre
la izquierda se indica la posición de los marcadores de peso
molecular (en kDa).
Análisis del rol de las proteínas BAB1_0279 y BAB1_0756 en el control de la maduración de las
células dendríticas infectadas con B. abortus
Si bien el principal objetivo del análisis in silico del proteoma de B. abortus fue la identificación de
potenciales sustratos del sistema de secreción VirB, la presencia del dominio TIR en dos proteínas alentó la
realización de una serie de experimentos con el propósito de demostrar la capacidad inmunomodulatoria de las
mismas. A continuación, se hace una breve descripción de los resultados más importantes que demuestran el rol
de las proteínas BAB1_0279 y BAB1_0756 en el control de la maduración de las células dendríticas.
La respuesta inmune ante una infección bacteriana se basa en la acción combinada de los componentes
innato y adquirido del sistema inmune. Las células dendríticas (CDs), componentes esenciales de la inmunidad
innata, median el reconocimiento de los patógenos ya que se encuentran estratégicamente localizadas en los
sitios de entrada de las bacterias. Además, tienen la capacidad de migrar desde los tejidos periféricos hacia los
órganos linfoides secundarios para estimular la respuesta T y desencadenar los mecanismos de inmunidad
(Banchereau y Steinman, 1998).
Las CDs expresan lectinas y receptores Toll-like (TLRs) que reconocen diversas moléculas características
de patógenos y contribuyen a determinar el tipo de respuesta inmune que se va a desarrollar. La activación de las
CDs ante un estímulo microbiano consiste en un número significativo de cambios a nivel morfológico y bioquímico
como la secreción de IL-12 y el aumento de la expresión en superficie de moléculas coestimulatorias y moléculas
del complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHCII). La activación de las CDs, proceso conocido como
Capítulo II - 54
maduración, es requerida para estimular las células T y eliminar patógenos (Banchereau y Steinman, 1998). Sin
embargo, numerosas especies de bacterias patógenas han desarrollado mecanismos para subvertir las funciones
de las CDs y evadir el sistema inmune. Por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis interfiere con la señalización
vía TLRs, bloqueando la maduración de las CDs y la producción de IL-12 (Geijtenbeek et al., 2003). En este
caso, la respuesta inmune es redireccionada y se produce la secreción de IL-10, una citoquina inmunosupresora
que permite el establecimiento de una infección crónica.
Como se mencionó anteriormente, las proteínas BAB1_0279 y BAB1_0756 de B. abortus poseen el
dominio de señalización intracelular TIR (ver Tabla 4). Estas proteínas fueron denominadas Btp1 y Btp2 (por
Brucella TIR protein), respectivamente. La comparación entre Btps y los dominios TIR de las proteínas humanas
TLR2, TLR4, SIGIRR y TIRAP, reveló un alto nivel de conservación en los Boxes 1 y 2 característicos de este
dominio (Fig. 24A y B).
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Figura 24. Alineamiento de Btp1 y Btp2 con dominios TIR humanos. Las secuencias de las proteínas Btp1
(BAB1_0279) (A) y Btp2 (BAB1_0756) (B) se compararon con las secuencias correspondientes a los dominios
TIR de las proteínas humanas TLR2 (AAH33756), TLR4 (CAH72619), SIGIRR (CAG33619) y TIRAP (AAH32474).
Con recuadros azules se indican las secuencias conservadas distintivas del dominio TIR (Box 1 y Box 2). El
alineamiento se generó usando el programa MAFFT 4.0 (Katoh et al., 2002; Katoh et al., 2005).
Capítulo II - 55
El gen que codifica para Btp1 está en una isla genómica de 20Kpb del cromosoma I, la cual parece haber
sido adquirida recientemente mediante un evento de integración mediado por fago (Chain et al., 2005). Btp1 es
homóloga a TlpA y PdTLP, dos proteínas de Salmonella enterica serovar Enteriditis y Paracoccus denitrificans,
respectivamente, que poseen el dominio TIR y son capaces de interferir con la señalización vía TLRs in vitro
(Low et al., 2007; Newman et al., 2006). Btp1 también es homóloga a las proteínas Tcps (por TIR containing
protein) de B. melitensis y Escherichia coli CFT073 uropatógena, las cuales bloquean la cascada de señalización
vía TLRs al interactuar, por medio del dominio TIR, con la proteína adaptadora MyD88 (Cirl et al., 2008). Por su
parte, la proteína Btp2 es homóloga a varias proteínas bacterianas aún no caracterizadas que contienen el
dominio TIR (COG 4916, E=1x10-70).
Con el propósito de determinar si las proteínas Btp1 y Btp2 tienen capacidad inmunomodulatoria, se
generaron las cepas mutantes btp1-, btp2- y la doble mutante btp1btp2-. Inicialmente, se confirmó que las cepas
mutantes pudieran replicar de manera similar a la cepa salvaje en células dendríticas derivadas de médula ósea
de ratón (BMDC) (Fig. 25A y B).
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4IEMPOPIHS
Figura 25. Replicación intracelular de las cepas mutantes btp1-, btp2- y btp1btp2- en BMDC. Las células se
infectaron con las cepas B. abortus 2308 (wt) y con las cepas mutantes btp1-, btp2- y btp1btp2-. (A) A las horas
p.i. indicadas las células se lisaron y se enumeraron las UFC según se describe en Materiales y Métodos. (B) A
las 24 hs p.i. las células se fijaron y se procesaron para inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-Brucella
(verde) y anti-MHCII (rojo). Las muestras se analizaron con un microscopio láser confocal marca Zeiss, con un
objetivo 63X.
En un trabajo reciente se demostró que, a diferencia de muchos patógenos intracelulares, Brucella inhibe
la maduración de las CDs infectadas (Billard et al., 2007). A fin de establecer la participación de Btp1 y Btp2 en
el control de las funciones de las CDs, se evaluó la maduración de BMDC infectadas con las cepas mutantes y
Capítulo II - 56
con la cepa salvaje. La maduración de las CDs se caracteriza por la expresión en superficie de moléculas
coestimulatorias y moléculas MHCII, por el agrupamiento de cuerpos multivesiculares alrededor del centro
organizador de microtúbulos (Pierre et al., 1997), y por la formación de conglomerados de proteínas ubiquitinadas
denominados DALIS (por dendritic cell aggregosome-like induced structures) (Lelouard et al., 2002). La
formación de DALIS puede monitorearse por microscopía mediante el uso del anticuerpo FK2 que reconoce
proteínas mono y poliubiquitinadas. Cuando se analizó la formación de DALIS por microscopía, se encontraron
porcentajes significativamente mayores de BMDC con DALIS en células infectadas con las cepas mutantes
btp1-, btp2- y btp1btp2-, en comparación con la cepa salvaje (Fig. 26A). Las cepas mutantes fueron capaces de
inducir la formación de DALIS de manera similar a B. abortus inactivada por calor (HKB, por heat-killed
Brucella). Por lo tanto, la capacidad de B. abortus de inhibir la formación de DALIS, y probablemente la
maduración de las CDs, depende de las proteínas Btp1 y Btp2. Además, se detectó un aumento en la expresión
y secreción de IL-12 (Fig. 26B) en BMDC infectadas con las cepas mutantes, confirmando la participación de
las proteínas en el control de las funciones de las CDs. Sin embargo, los niveles de IL-12 fueron menores que en
las células infectadas con HKB, sugiriendo que existen otros factores involucrados en la inhibición de la maduración
de las CDs.
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Figura 26. Determinación del rol de Btp1 y Btp2 en la inhibición de la maduración de las células dendríticas. (A)
Cuantificación de BMDC con DALIS. Las células fueron infectadas por 24hs con medio (neg), con Brucella
inactivada por calor (HKB), con la cepa salvaje B. abortus 2308 (wt) o con las mutantes btp1-, btp2- y btp1btp2-.
Las diferencias entre la cepa salvaje B. abortus 2308 (wt) y las cepas btp1- (P = 0.0002), btp2- (P = 0.001) y btp1btp2(P = 0.0002) fueron significativas. (B) Análisis de secreción de IL-12 (p40/p70) al medio de cultivo de BMDC
infectadas. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre wt y btp1btp2- (P = 0.0009). En todos
los casos las barras representan las medias más los errores estándar de tres determinaciones independientes. El
análisis estadístico se realizó con prueba t de Student.
Capítulo II - 57
Considerando que las vías de señalización a través de los TLRs son esenciales para inducir la maduración
de las CDs y para la secreción de citoquinas proinflamatorias, nos propusimos determinar si Btp1 y Btp2 son
capaces de bloquear la cascada de señalización vía TLRs. Para ello, se expresaron cantidades crecientes de
Btp1 o Btp2 fusionadas al epítope c-Myc junto con cantidades constantes de TLR2 o TLR9 en células HEK293T
que contienen el plásmido reportero NF-κB-luciferasa. Luego, se analizó la actividad luciferasa en presencia de
ligandos apropiados. Se incluyó la proteína efectora PipB2 de Salmonella como control negativo, ya que se ha
demostrado que esta proteína afecta el reclutamiento de kinesina y no la señalización intracelular (Henry et al.,
2006). Se encontró que Btp1 bloquea la vía de señalización a través de TLR2 de manera dosis-dependiente, y no
así la vía dependiente de TLR9. Por su parte, Btp2 inhibe la señalización dependiente de TLR2 y TLR9 (Fig.
27). En conjunto, estos resultados demuestran que Btp1 y Btp2 son capaces de interferir con la señalización vía
!CTIVIDAD,UCIFERASA2ELATIVA
!CTIVIDAD,UCIFERASA2ELATIVA
TLRs in vitro.
Figura 27. Análisis de la interferencia de Btp1 y Btp2 en las vías de señalización por TLRs. Células HEK293T
fueron transientemente transfectadas con tres construcciones: un plásmido reportero NF-κB-luciferasa y c-MycBtp1, o c-Myc-Btp2, o c-Myc-PipB2 o un plásmido vacío junto con TLR2 (panel superior) o TLR9 (panel inferior).
Las cantidades de Btp se indican en la figura (ng). Las barras representan las medias más los errores estándar de
tres determinaciones independientes. Las células se estimularon durante las 6 hs anteriores a la medición de la
actividad luciferasa con PAM (500ng/μl) o con CpG (1μM), para TLR2 y TLR9, respectivamente.
Capítulo II - 58
Por último, se evaluó el rol de las proteínas Btp1 y Btp2 in vivo mediante un ensayo de infección de
ratones. A los 30 días p.i. no se encontraron diferencias en el número de bacterias en el bazo de ratones
infectados con la cepa salvaje y con la cepa doble mutante btp1btp2- (Fig. 28). Sin embargo, a tiempos p.i. más
largos, el número de UFC en el bazo de ratones infectados con la doble mutante fue significativamente superior
(P=0,0004 a los 75 días p.i.). Interesantemente, desde los 60 días p.i. en adelante, los ratones infectados con la
cepa doble mutante mostraron claros signos de caquexia. Además, a los 75 y 90 días p.i., los bazos de los ratones
infectados con esta cepa estaban agrandados y contenían lesiones macroscópicas. El análisis histopatológico de
estos bazos reveló que las lesiones correspondían a granulomas. En conjunto, estos resultados permiten sugerir
que Btp1 y Btp2 modulan la respuesta inmune del huésped durante la fase crónica de la infección con B.
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abortus, ejerciendo, probablemente, algún control sobre la inflamación.
4IEMPOPID¤AS
Figura 28. Análisis del rol de Btp1 y Btp2 in vivo. Ratones hembras BALB/c fueron inoculados
intraperitonealmente con cantidades equivalentes de bacterias de la cepa salvaje B. abortus 2308 (wt) o de
la doble mutante btp1btp2-. El número de bacterias viables en bazo fue determinado a los 30, 60, 75 y 90 días
p.i. según se describe en Materiales y Métodos. Los valores representan las medias más los desvíos
estándar (n=3).
DISCUSIÓN
Actualmente, dos hipótesis permiten explicar el origen de factores de virulencia en bacterias patógenas:
evolución convergente y transferencia horizontal de genes (Stebbins y Galan, 2001). La convergencia evolutiva
es el proceso mediante el cual las mutaciones en el material genético y la presión de selección dan lugar al
surgimiento de nuevos factores que aumentan la infectividad del patógeno. La transferencia horizontal implica la
Capítulo II - 59
incorporación de material genético eucariota (generalmente del huésped) al genoma bacteriano, el cual conserva,
al menos en parte, su actividad original.
Como resultado del análisis in silico del proteoma teórico de B. abortus, pudieron identificarse ocho
proteínas con dominios de interacción propios de eucariotas. En contraposición a lo que ocurre en B. abortus, la
abundancia relativa de esta clase de proteínas es muy alta en Legionella pneumophila (Cazalet et al., 2004; de
Felipe et al., 2005; Ninio y Roy, 2007). Esta especie tiene un genoma de tamaño comparable al de B. abortus y
posee el mayor número de efectores tipo IV identificados hasta la fecha (Economou et al., 2006). Aproximadamente
el 80% de estas moléculas efectoras tienen dominios eucariotas que les permitirían modular ciertas funciones de
la célula huésped tales como invasión, tráfico y apoptosis (Ninio y Roy, 2007). Se postula que estas proteínas son
el resultado de la transferencia horizontal de genes (Amor et al., 2005; Cazalet et al., 2004; de Felipe et al.,
2005; Nagai et al., 2002). La diferencia en la abundancia de proteínas con dominios eucariotas podría explicarse
si se considera el nicho ecológico de cada especie. Mientras que B. abortus es un patógeno intracelular con un
nicho ecológico confinado, L. pneumophila es una especie de vida libre que infecta amebas y tiene la capacidad
de sobrevivir y replicar en macrófagos alveolares, una característica que permite definirla como patógeno
oportunista. Por lo tanto, el gran repertorio de moléculas efectoras con dominios eucariotas de L. pneumophila
refleja la diversidad de ambientes al que está expuesta esta bacteria y permitiría explicar su capacidad de
replicar en células eucariotas poco relacionadas filogenéticamente.
Teniendo en cuenta los antecedentes mencionados, se decidió utilizar el sistema de la proteína reportera
adenilato ciclasa para evaluar la translocación al citoplasma de las proteínas de B. abortus con dominios eucariotas,
consideradas efectores putativos del sistema VirB. Para ello, se construyeron fusiones al dominio CyaA bajo dos
promotores: el del operón virB, inducido intracelularmente, y el promotor constitutivo del gen bcsp31. Si bien es
un requisito del sistema que las proteínas se expresen intracelularmente, como ocurriría bajo el promotor virB, se
decidió utilizar el promotor constitutivo para asegurar una buena expresión de las proteínas de fusión.
En una primera etapa, y luego de realizar la puesta a punto del sistema en B. abortus, se identificaron dos
proteínas de fusión a CyaA translocadas al citoplasma eucariota que produjeron un aumento del AMPc intracelular:
BAB1_1865 y BAB2_0123. Ambas son proteínas hipotéticas que poseen el motivo estructural coiled-coil
implicado en interacciones proteína-proteína. Usando la misma metodología, se determinó que el aparato de
secreción tipo IV de Brucella es requerido para la translocación de la proteína de fusión BAB2_0123-CyaA.
Como se observa en la Fig. 22B, los niveles de AMPc intracelulares de las células infectadas con las cepas
mutantes virB que expresan la fusión son significativamente menores que los de las células infectadas con la
Capítulo II - 60
cepa salvaje 2308. Sin embargo, las células infectadas con la cepa mutante virB1::Kan (mutante con inserción
de cassette polar en virB1) mostraron niveles intracelulares de AMPc superiores a los de las células infectadas
con las otras dos cepas mutantes, sugiriendo que en esta mutante el sistema de secreción estaría funcionando
parcialmente. Esto podría deberse a la presencia de un promotor, recientemente descripto, entre los genes virB1
y virB2 del operón (de Jong et al., 2008). Por lo tanto, en la cepa mutante virB1::Kan los genes del operón
podrían ser transcriptos a partir de virB2 y sus productos serían capaces de ensamblar un sistema de secreción
funcional. El producto del gen virB1, que codifica para una transglicosidasa lítica que degrada el peptidoglicano
para el ensamblaje del complejo VirB, no es un componente esencial del sistema. Se ha demostrado que la
delgada capa de mureína en bacterias Gram negativas permite un ensamblado reducido del aparato de secreción,
aún en ausencia de proteínas ortólogas (Koraimann, 2003). Además, se postula que la función de VirB1 también
podría ser llevada a cabo por enzimas citosólicas (Holtje, 1998). Por lo tanto, la cepa virB1::Kan podría translocar
la proteína de fusión BAB2_0123-CyaA al citoplasma eucariota y producir un aumento del AMPc intracelular
como se muestra en la Fig. 22B, aunque no se alcanzan los mismos niveles que con la cepa salvaje.
La proteína de fusión BAB1_1865–CyaA también se translocó al citoplasma del macrófago y produjo un
aumento del AMPc intracelular. Sin embargo, el aumento fue de aproximadamente un orden de magnitud menor
que para la proteína de fusión BAB2_0123-CyaA. Esta diferencia podría deberse a que la tasa de secreción de
BAB2_0123-CyaA es mayor que la de BAB1_1865–CyaA y/o a que la proteína de fusión BAB1_1865–CyaA
tiene menor estabilidad. Otra diferencia con BAB2_0123-CyaA radica en que la secreción de BAB1_1865–
CyaA es independiente del sistema VirB de B. abortus. Hasta el momento, el único sistema de secreción de
Brucella que se conoce que se activa intracelularmente es el sistema tipo IV. Sin embargo, no puede descartarse
la existencia de otro/s mecanismo/s de secreción, aún no descripto/s, que sean los encargados de translocar la
proteína de fusión BAB1_1865–CyaA al citoplasma eucariota.
El análisis in silico del proteoma de B. abortus reveló la presencia del dominio TIR en las proteínas
BAB1_0756 y BAB1_0279 (Btp1 y Btp2). Ambas proteínas tienen la capacidad de interferir con la maduración
de las células dendríticas del huésped y de bloquear la cascada de señalización vía TLRs in vitro. Es probable
que el control que la bacteria ejerce sobre las funciones de las CDs favorezca la infección y/o promueva el
establecimiento de la fase crónica de la enfermedad. Resta determinar cuáles son las moléculas blanco de Btp1
y Btp2 para comprender sus roles durante la infección in vivo.
El dominio TIR es un dominio de señalización intracelular, lo que hace suponer que las proteínas Btp1 y
Btp2 de B. abortus deben ser translocadas al citoplasma eucariota para ejercer su acción. Si bien la proteína
Capítulo II - 61
TcpC de Escherichia coli CFT073, homóloga a Btp1, es secretada y se acumula intracelularmente para ejercer
su acción (Cirl et al., 2008), no pudo detectarse la presencia de Btp1 y Btp2 fusionadas a CyaA en el citoplasma
de macrófagos infectados. Un análisis detallado de la secuencia aminoacídica del extremo carboxilo-terminal de
estas proteínas revela la presencia de residuos conservados, por fuera del dominio TIR. Para determinar si esta
secuencia está involucrada en la translocación de las proteínas, sería necesario construir proteínas de fusión con
el dominio CyaA en el extremo amino-terminal de manera de permitir que la secuencia quede disponible para ser
reconocida por la maquinaria de secreción.
Considerando que cepas mutantes en genes virB de B. suis controlan la maduración de las células dendríticas
humanas de manera similar a la cepa salvaje (Billard et al., 2008), es poco probable que este sistema este
involucrado en la translocación de Btp1 y Btp2 a su sitio de acción.
En resumen, el análisis bioinformático del proteoma de B. abortus acoplado al uso de la proteína reportera
adenilato ciclasa, hicieron posible la identificación de dos proteínas de B. abortus translocadas al citoplasma de
la célula huésped, una de las cuales es transportada por el sistema de secreción tipo IV. Asimismo, la búsqueda
de proteínas con dominios eucariotas permitió la identificación de dos proteínas con capacidad inmunomodulatoria,
que probablemente estén implicadas en el establecimiento de la fase crónica de la enfermedad.
En el siguiente capítulo de esta tesis se caracterizará a la proteína BAB2_0123, sustrato del sistema VirB
de B. abortus.
CAPÍTULO III
Capítulo III- 62
Capítulo III-Caracterización de la proteína BAB2_0123, sustrato del sistema VirB de Brucella abortus
INTRODUCCIÓN
En el capítulo anterior se describe la identificación de una proteína de B. abortus translocada al citoplasma
eucariota a través del sistema de secreción VirB. En este capítulo se confirma la translocación mediante el
análisis de células infectadas por microscopía de fluorescencia y a la vez se detecta la translocación de la
proteína en macrófagos infectados por Western Blot. Asimismo, se analiza la expresión in vitro de la proteína,
así como su localización subcelular y la secuencia señal requerida para su translocación al citoplasma eucariota.
Por último, y con el propósito de conocer la función de la proteína durante la infección, se caracteriza el fenotipo
de la cepa mutante en ensayos de infección de células y ratones, se analiza el efecto de la sobreexpresión de la
proteína en levaduras y se estudia la localización subcelular de la proteína expresada en células de mamíferos.
RESULTADOS
Análisis in silico de BAB2_0123
La proteína identificada como sustrato del sistema de secreción VirB de B. abortus BAB2_0123, posee
153 aminoácidos y tiene un peso molecular teórico de 16,7 kDa. Está anotada como proteína hipotética en los
genomas de las ocho especies del género Brucella secuenciadas hasta la fecha. El análisis in silico de la
secuencia aminoacídica reveló la presencia de un péptido señal, un segmento transmembrana en el extremo
amino terminal y un gran dominio coiled coil central (Fig. 29). El programa Multicoil predijo la formación de un
coiled coil dimérico con una probabilidad de 0,86 (Wolf et al., 1997).
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Figura 29. Secuencia aminoacídica de la proteína BAB2_0123, sustrato del sistema VirB de B. abortus. Entre
líneas punteadas se indica la predicción de péptido señal, con el sitio de corte en SLA-AL. En verde, se muestra el
segmento transmembrana predicho (comprende los aminoácidos 4-26) y en rojo se indica el motivo estructural coiled
coil (comprende los aminoácidos 39-114). La predicción de péptido señal se hizo con los programas PSORTb v.2.0.4
(Gardy et al., 2005) y SignalP 3.0 (Bendtsen et al., 2004). Para la predicción del segmento transmembrana se usaron los
programas SOSUI 1.11 (Mitaku y Hirokawa, 1999; Mitaku et al., 2002), HMMTOP 2.0 (Tusnady y Simon, 1998, 2001) y
TMHMM 2.0 (Krogh et al., 2001). La predicción de coiled coils se hizo con los programas COILS (Lupas et al., 1991)
y Parcoil2 (McDonnell et al., 2006). Los números indican la posición de los aminoácidos en la secuencia.
Capítulo III- 63
La secuencia de la proteína está completamente conservada en todas las especies de Brucella
secuenciadas, a excepción de un cambio en el aminoácido de la posición 106 de la proteína BMEII1111 de B.
melitensis 16M, donde hay un residuo de cisteína en lugar de arginina. La proteína de B. abortus tiene un 80%
de identidad con la proteína hipotética Oant_4219 de Ochrobactrum anthropi ATCC 49188 y un 32% de
identidad con la proteína conservada hipotética BARBAKC583_1150 de Bartonella bacilliformis KC583 (Fig.
30). No existen proteínas homólogas en otras especies procariotas. Las proteínas Oant_4219 y
BARBAKC583_1150, poseen, al igual que BAB2_0123, predicción de péptido señal, así como de una hélice
transmembrana y un motivo coiled coil en la misma región de la secuencia aminoacídica.
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Figura 30. Alineamiento múltiple de las secuencias de BAB2_0123 (B. abortus 2308), BMEII111 (B. melitensis
16M), Oant_4219 (Ochrobactrum anthropi ATCC 49188) y BARBAKC583_1150 (Bartonella bacilliformis
KC583). El alineamiento se generó usando el programa MAFFT 4.0 (Katoh et al., 2002; Katoh et al., 2005). Los
residuos conservados están coloreados en azul. Con un recuadro rojo se muestra el residuo de cisteína en la
secuencia de BMEII111.
Al analizar el contexto genómico del gen que codifica para BAB2_0123, se encontró que éste se encuentra
formando parte de un operón en uno de los tres clusters de genes flagelares en el cromosoma II de B. abortus
(Fig. 31). El mismo contexto genómico se encontró para la proteína conservada hipotética BARBAKC583_1150
Capítulo III- 64
de Bartonella bacilliformis KC583 y para la proteína hipotética Oant_4219 de Ochrobactrum anthropi ATCC
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Figura 31. Representación esquemática del contexto genómico del gen que codifica para BAB2_0123. Cada flecha
representa un marco de lectura abierto y las puntas de las flechas indican el sentido de la transcripción. Debajo de
cada marco abierto de lectura se indica el nombre de la proteína codificada.
Cuando se analizó la secuencia de BAB2_0123 con el programa PSI-BLAST (position-specific iterated
BLAST), que permite identificar ciertos motivos conservados entre proteínas que presentan un porcentaje bajo
de identidad, se encontró similitud con la región carboxilo-terminal de la proteína eucariota cortactina (E=3x10-8
con proteína de H. sapiens en la segunda iteración). Teniendo en cuenta estos resultados, se construyó un
alineamiento múltiple que incluye la proteína de B. abortus y algunas proteínas de vertebrados (Fig. 32). La
región de la proteína BAB2_0123 comprendida en el alineamiento corresponde a la secuencia entre los aminoácidos
48 y 142, coincidiendo con la región que tiene predicción de coiled-coil dimérico.
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Figura 32. Alineamiento múltiple de BAB2_0123 de B. abortus y de la cortactina (Cttn) de Bos taurus (AAI14762),
Gallus gallus (NP_990799), Mus musculus (AAH11434), Ornithorhynchus anatinus (XP_001507265) y Homo
sapiens (NP_005222). Los residuos conservados están coloreados en azul. Los números indican la posición de los
aminoácidos en la secuencia. El alineamiento se realizó con el programa MAFFT 4.0 (Katoh et al., 2002; Katoh et al.,
2005).
Capítulo III- 65
La cortactina es una proteína multimodular que participa en la regulación del citoesqueleto de actina (Fig.
33). En el extremo amino-terminal posee el dominio NTA (por N-terminal acidic) que se une y activa al
complejo Arp2/3 (Uruno et al., 2001; Weaver et al., 2001). A continuación presenta 6,5 repeticiones en tándem
de 37 aminoácidos (HS1_rep) que median la unión a F-actina y están implicadas en la colocalización de la
proteína y la actina cortical (Uruno et al., 2001; Weed et al., 2000). Hacia la región carboxilo-terminal posee una
α-hélice seguida de una región regulatoria rica en residuos prolina, serina, treonina y tirosina. Esta región es
blanco de varias kinasas de serina-treonina y tirosina que regulan la actividad de de la proteína (Cosen-Binker y
Kapus, 2006). Finalmente, en el extremo carboxilo terminal tiene un dominio SH3 (Scr homology 3) que une la
proteína N-WASP, que a su vez se une y activa al complejo Arp2/3 (Mizutani et al., 2002). Por lo tanto, la
proteína cortactina tiene capacidad de regular la polimerización de actina mediante dos mecanismos: por medio
de la unión del complejo Arp2/3 al dominio NTA y/o mediante el reclutamiento de N-WASP al dominio SH3. La
proteína ha sido involucrada en numerosos procesos celulares como el ensamblado de actina cortical, endocitosis,
formación de uniones estrechas y adherentes, migración celular, etc. (Daly, 2004; Weed y Parsons, 2001). Como
resultado del análisis de la proteína de H. sapiens con los programas SMART y COILS, se predijo un motivo
coiled-coil entre las posiciones 348-401, a continuación de las repeticiones HS1. Esta región es la que está
incluida en el alineamiento con la proteína BAB2_0123 de B. abortus.
Figura 33. Representación esquemática de los dominios de la proteína eucariota cortactina. NTA: se une y
activa al complejo Arp2/3; Repeats: repeticiones en tándem que median la unión a F-actina; Helical: hélice α
sin una función conocida; PST: región regulatoria rica en residuos prolina, serina y treonina. Y-rich: región
regulatoria rica en residuos tirosina; SH3: dominio de unión a varias proteínas, entre ellas la proteína N-WASP,
que a su vez se une y activa al complejo Arp2/3. Debajo de los dominios funcionales se indican las proteínas
que se unen a cortactina y las kinasas que la fosforilan. Con un recuadro en línea punteada se indica la región
con similitud a BAB2_0123. Adaptado de Cosen-Binker y Kapus, 2006.
Capítulo III- 66
Detección de BAB2_0123 en células infectadas por microscopía
Con el propósito de confirmar la translocación al citoplasma eucariota de la proteína BAB2_0123 de B.
abortus, se analizaron células infectadas por microscopía confocal láser. Para ello, y con el objetivo de tener
mayores niveles de sensibilidad, se construyó una cepa de B. abortus que expresa la proteína BAB2_0123
fusionada al epítope 3xFLAG (2308 pBBR ba20123::3xFLAG-1). La proteína de fusión está codificada en un
plásmido replicativo en Brucella y se expresa bajo un promotor constitutivo (ver Materiales y Métodos). Con
esta cepa se infectaron macrófagos derivados de médula ósea murinos y se detectó la proteína usando un
anticuerpo monoclonal que reconoce al epítope FLAG. A las 4 horas post-infección se observó un 65,19±0,028 %
de macrófagos infectados FLAG positivos. De manera similar a lo descripto para otras moléculas efectoras del
sistema de secreción tipo IV (Bardill et al., 2005; Conover et al., 2003; Luo e Isberg, 2004; Nagai et al., 2002),
la marca de la proteína se localizó por fuera de la bacteria, en las vecindades de las VCBs (Fig. 34A). Al analizar
la cinética de adquisición de FLAG en las VCBs se observó que aproximadamente un 15% de las VCBs son
FLAG positivas después de 1 y 4 horas de infección. Este porcentaje es menor al 10% a las 24 hs p.i. (Fig. 34B).
Para poder corroborar que la translocación es dependiente del sistema VirB, se hicieron infecciones con una
cepa que expresa la proteína de fusión y que es mutante en virB10 (virB10::kan pBBR ba20123::3xFLAG).
Contrariamente a lo observado para la cepa salvaje, en las células infectadas con la cepa mutante virB10::Kan
pBBR ba20123::3xFLAG no pudo detectarse la proteína por fuera de la bacteria, en las vecindades de las
VCBs (Fig. 34C). Se verificó por Western Blot la expresión de la proteína de fusión en las cepas salvaje y
mutante para descartar que la diferencia entre ambas cepas se deba a distintos niveles de expresión de la
proteína (Fig. 34D). Los resultados obtenidos a partir del análisis de células infectadas por microscopía confocal
láser están en concordancia con los obtenidos en los ensayos con la proteína reportera CyaA, confirmando así la
translocación dependiente del sistema VirB de la proteína BAB2_0123.
Teniendo en cuenta que los experimentos de microscopía descriptos anteriormente fueron hechos con
una cepa de B. abortus que expresa la proteína BAB2_0123::3xFLAG bajo un promotor constitutivo, se quiso
determinar qué ocurría al infectar células con una cepa que expresa la proteína sustrato del sistema VirB bajo su
propio promotor. Para ello, se obtuvo la cepa merodiploide 2308 ba20123::3xFLAG pBBR-GFP, que tiene una
copia del gen que codifica para la proteína BAB2_0123 fusionada a 3xFLAG en el cromosoma y cuya expresión
está regulada por su propio promotor. Además, posee un plásmido que codifica para la proteína verde fluorescente
(pBBR-GFP). Con esta cepa se infectaron macrófagos de la línea J774.A1 y a las 4hs p.i. se analizó la localización
Capítulo III- 67
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Figura 34. Detección de la proteína BAB2_0123::3xFLAG en células macrofágicas derivadas de médula ósea de
ratón. Las células se infectaron con la cepa salvaje B. abortus 2308 pBBR ba20123::3xFLAG-1 (A) o con la cepa
mutante B. abortus virB10::Kan pBBR ba20123::3xFLAG (C). Las células infectadas se fijaron a las 4 hs p.i. Las
bacterias se detectaron usando un antisuero policlonal anti-Brucella y un anticuerpo secundario conjugado a FITC.
La proteína fusionada al epítope 3xFLAG se detectó con un anticuerpo monoclonal anti-FLAG y un anticuerpo
secundario conjugado a Texas Red. El ADN del núcleo se detectó con To-Pro 3. Las puntas de flecha señalan la
localización de la proteína BAB2_0123 por fuera de la bacteria, en las vecindades de la VCB. Las muestras se
analizaron con un microscopio láser confocal marca Zeiss, modelo LSM 510 con un objetivo 63X. (B) Cinética de
adquisición de FLAG en las VCBs en células infectadas con la cepa 2308 pBBR ba20123::3xFLAG-1. A las horas p.i.
indicadas se cuantificó la colocalización de las VCBs con BAB2_0123::3xFLAG. Las barras corresponden a la media
más el desvío estándar de dos determinaciones independientes. (D) Análisis de la expresión de la proteína de fusión
BAB2_0123::3xFLAG en la cepa parental B. abortus 2308 pBBR ba20123::3xFLAG-1 y en la mutante virB10::Kan
pBBR ba20123::3xFLAG por Western Blot. Cantidades equivalentes de proteínas provenientes de extractos totales
de ambas cepas se analizaron por 12,5% SDS-PAGE y las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa.
Para el Western Blot se usó un anticuerpo monoclonal anti-FLAG.
de la proteína con un anticuerpo anti-FLAG por inmunofluorescencia indirecta. Como puede observarse en la
Figura 35, la marcación correspondiente a la proteína se localizó por fuera de las bacterias, en las cercanías de
las VCBs. Estos resultados son idénticos a los obtenidos cuando se infectaron macrófagos derivados de médula
ósea murinos con la cepa B. abortus 2308 que expresa la proteína de fusión BAB2_0123::3xFLAG bajo el
Capítulo III- 68
promotor lac del plásmido pBBR-MCS4. Por último, es importante mencionar que la proteína BAB2_0123
también pudo ser detectada en las VCBs cuando se hicieron infecciones con una cepa salvaje y se usó un
antisuero policlonal específico contra la proteína, confirmando una vez más la translocación de la misma en
células infectadas.
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Figura 35. Detección de la proteína BAB2_0123::3xFLAG
en células macrofágicas de la línea J774.A1. Las células
infectadas con la cepa 2308 ba20123::3xFLAG pBBR-GFP se
fijaron a las 4 hs p.i. La proteína fusionada al epítope 3xFLAG
se detectó con un anticuerpo monoclonal anti-FLAG y un
anticuerpo secundario conjugado a Alexa 568. El ADN del
núcleo se detectó con DAPI. Las puntas de flecha señalan la
localización de la proteína BAB2_0123 por fuera de la bacteria
en las vecindades de la VCB. Las muestras se analizaron con
un microscopio de epifluorescencia Nikon E600, con un
objetivo 100X.
Detección de la translocación de BAB2_0123 en macrófagos por Western Blot
Para confirmar la translocación de la proteína BAB2_0123 al citoplasma eucariota por el sistema VirB, se
empleó una técnica de extracción con saponina similar a la utilizada en el análisis de moléculas efectoras de
Yersinia y Legionella (Derre e Isberg, 2005; Lee et al., 1998; VanRheenen et al., 2006). Para ello, se infectaron
células macrofágicas de la línea J774.A1 con las cepas B. abortus 2308 pBBR ba20123::3xFLAG-1 o
virB10::Kan pBBR ba20123::3xFLAG. A las 4 hs p.i., las células fueron tratadas con un buffer que contiene
saponina. Este es un detergente que lisa las células, pero no lisa las bacterias ni libera proteínas citosólicas
bacterianas. Luego de un paso de centrifugación, las fracciones solubles en este detergente fueron filtradas para
descartar bacterias enteras y analizadas por Western Blot con un anticuerpo anti-FLAG (ver Materiales y
Métodos). Como era de esperar para una proteína translocada, BAB2_0123 se encontró en la fracción soluble
de la extracción con saponina cuando las células se infectaron con la cepa salvaje. Sin embargo, la proteína no
pudo detectarse en esta fracción cuando se usó la cepa mutante virB10::Kan para la infección (Fig. 36). Estos
resultados son consistentes con los obtenidos al utilizar la proteína reportera adenilato ciclasa y al analizar células
infectadas mediante técnicas de microscopía, confirmando una vez más la translocación de la proteína BAB2_0123
por el sistema VirB.
Capítulo III- 69
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Figura 36. Análisis de la translocación de BAB2_0123::3xFLAG en macrófagos infectados de manera VirB
dependiente. Células J774.A1 fueron infectadas con las cepas B. abortus 2308 pBBR ba20123::3xFLAG-1o
virB10::Kan pBBR ba20123::3xFLAG, y a las 4 hs p.i. fueron tratadas con un buffer con saponina y procesadas
como se describe en Materiales y Métodos. Las proteínas de las fracciones solubles en saponina (S) y de los
extractos totales (ET) de las cepas usadas en la infeccón, fueron analizadas por 12,5% SDS-PAGE y transferidas
a una membrana de nitrocelulosa. Para el Western Blot se uso un anticuerpo anti-FLAG.
Análisis de la expresión de la proteína BAB2_0123 en B. abortus
Con el propósito de caracterizar el perfil de expresión de la proteína BAB2_0123 in vitro, se analizaron
por Western Blot extractos totales de proteínas preparados a partir de alícuotas de cultivo correspondientes a
diferentes puntos de la curva de crecimiento en medio TSB (Fig. 37A). A fin de aumentar la sensibilidad, se
utilizó la cepa merodiploide 2308 ba20123::3xFLAG que, como se mencionó anteriormente, tiene una copia del
gen que codifica para la proteína BAB2_0123 fusionada a 3xFLAG en el cromosoma, y cuya expresión está
regulada por su propio promotor. Al analizar la expresión de la proteína con un anticuerpo monoclonal anti-FLAG,
se encontraron niveles de expresión similares a lo largo de la curva de crecimiento en medio TSB (Fig. 37B,
panel superior). Resultados similares se observaron al utilizar un antisuero policlonal contra la proteína BAB2_0123.
En este caso se pudieron detectar dos bandas con diferente movilidad electroforética. La banda de mayor peso
molecular corresponde a la proteína de fusión a 3xFLAG, cuya expresión está bajo el control del promotor del
gen ba20123 (Fig. 37B, panel central). La banda de menor peso molecular (aproximadamente 18 kDa)
corresponde a la proteína nativa sin fusionar a 3xFLAG y cuya expresión está regulada por el promotor lac del
plásmido pk18mob. En el panel inferior de la Figura 37B se muestra un control de carga con un anticuerpo
monoclonal que reconoce a la proteína RibH2 de B. abortus. A modo de control, y para confirmar que la proteína
se expresa en la cepa salvaje, se muestra un Western Blot donde se detecta la proteína BAB2_0123 en un
extracto total de la cepa 2308 pero no en un extracto total de la cepa mutante ba20123::Kan (Fig. 37C). Estos
resultados indican que la proteína BAB2_0123 se expresa in vitro, alcanzándose niveles similares de proteína a
lo largo de la curva de crecimiento en medio TSB.
Capítulo III- 70
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Figura 37. Análisis de la expresión in vitro de
BAB2_0123. (A) Curva de crecimiento de la cepa
merodiploide 2308 ba20123::3xFLAG en medio
TSB. (B) Cantidades equivalentes de proteínas de
extractos totales, correspondientes a alícuotas del
cultivo en diferentes puntos de la curva de
crecimiento, se analizaron por 15% SDS-PAGE. Las
proteínas se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa. Para el Western Blot se usó un
anticuerpo monoclonal anti-FLAG (α-FLAG, panel
superior), un suero que reconoce la proteína
BAB2_0123 (α-BAB2_0123, panel central) y un
anticuerpo monoclonal anti-RibH2 (α-RibH2, panel
inferior). En la primera calle del panel central se
incluyó la proteína recombinante BAB2_0123
purificada. (C) Cantidades equivalentes de
proteínas de extractos totales de las cepas 2308 y
ba20123::Kan fueron analizadas por 15% SDSPAGE. Las proteínas se transfirieron a una
membrana de nitrocelulosa y para el Western Blot
se usó el antisuero policlonal α-BAB2_0123. Sobre
la izquierda se indica la posición de los marcadores
de peso molecular (en kDa).
Determinación de la localización subcelular de la proteína BAB2_0123 en B. abortus
Como se mencionó anteriormente, la proteína BAB2_0123 tiene predicción de péptido señal y un segmento
transmembrana en su extremo amino-terminal. Para determinar la localización subcelular de la proteína en B.
abortus se prepararon membranas totales de las cepas 2308 pBBR ba20123::3xFLAG-1 y 2308
ba20123::3xFLAG. Estas cepas expresan la proteína de fusión codificada en un plásmido bajo un promotor
constitutivo, o en el cromosoma bajo el promotor del gen ba20123, respectivamente. Las proteínas de membrana
y de los extractos totales se analizaron en 15% SDS-PAGE, seguido de Western Blot con un anticuerpo antiFLAG y un antisuero policlonal anti-BAB2_0123. Como puede observarse en la Figura 38, la proteína
Capítulo III- 71
BAB2_0123::3xFLAG se asocia a la fracción de membranas totales en las dos cepas de B. abortus estudiadas.
La cepa merodiploide se incluyó para controlar que la localización de la proteína en la membrana no sea un
artefacto de la sobreexpresión en la cepa que contiene el plásmido. La banda de mayor peso molecular que se
detecta con el antisuero policlonal anti-BAB2_0123 corresponde a la proteína fusionada 3xFLAG, mientras que
la de peso molecular cercano a 18kDa corresponde a la proteína nativa. Estos resultados indican que la proteína
de BAB2_0123 tiene capacidad de asociarse a la fracción de membranas totales de B. abortus.
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Figura 38. Análisis de la localización subcelular de BAB2_0123. Las proteínas de los extractos totales (ET) y
de las membranas totales (MT) de las cepas 2308 pBBR ba20123::3xFLAG-1 (panel superior) y 2308
ba20123::3xFLAG (panel inferior) se analizaron por 15% SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a membranas
de nitrocelulosa y para los Western Blots se usó un anticuerpo monoclonal anti-FLAG (α-FLAG) y un antisuero
policlonal anti-BAB2_0123 (α-BAB2_0123). Sobre la izquierda se indica la posición de los marcadores de peso
molecular (en kDa).
Determinación de la secuencia aminoacídica requerida para la translocación de BAB2_0123 al
citoplasma eucariota
Con el objetivo de determinar la secuencia aminoacídica mínima requerida para la translocación de la
proteína BAB2_0123 al citoplasma eucariota, se construyeron una serie de deleciones amino-terminales de la
proteína fusionada a la enzima reportera adenilato ciclasa. Los fragmentos delecionados incluyeron el extremo
amino-terminal, con predicción de péptido señal y un segmento transmembrana, y el motivo estructural coiled
coil central. También se generó la fusión de la proteína completa al extremo carboxilo-terminal de la proteína
reportera (Fig. 39A).
Capítulo III- 72
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Figura 39. Análisis de la secuencia aminoacídica requerida para la translocación de BAB2_0123 al citoplasma eucartiota.
(A) Representación esquemática de las proteínas de fusión a la enzima reportera CyaA. Los números indican la posición
de los aminoácidos en la secuencia. En negro se muestra la región con predicción de péptido señal y un segmento
transmembrana y en azul la secuencia con predicción del motivo estructural coiled coil. (B) Contenido de AMPc intracelular
en macrófagos J774.A1 infectados con las cepas de B. abortus que expresan las fusiones a-f. Como control se incluyó la
cepa que expresa CyaA sin fusionar (CyaA). También se cuantificó el AMPc en células sin infectar (Sin Infección). Las
células se lisaron a las 5hs p.i. y el AMPc intracelular se cuantificó con un ensayo de ELISA (ver Materiales y Métodos).
Las barras del gráfico indican la media más el error estándar de dos determinaciones independientes. (C) Detección de la
proteína BAB2_0123 fusionada al epítope 3xFLAG en células macrofágicas derivadas de médula ósea de ratón. Las
células se infectaron con la cepa B. abortus 2308 pBBR ba20123::3xFLAG-1 (panel izquierdo) o con la cepa B. abortus
2308 pBBR ba20123::3xFLAG-25 (panel derecho). Las células infectadas se fijaron a las 4 hs p.i. Las bacterias se
detectaron usando un antisuero policlonal anti-Brucella y un anticuerpo secundario conjugado a FITC. La proteína
fusionada al epítope 3xFLAG se detectó con un anticuerpo monoclonal anti-FLAG y un anticuerpo secundario conjugado
a Texas Red. El ADN del núcleo se detectó con To-Pro 3. Las puntas de flecha señalan la localización de la proteína
BAB2_0123 por fuera de la bacteria, en las vecindades de la VCB. Las muestras se analizaron con un microscopio láser
confocal marca Zeiss, modelo LSM 510 con un objetivo 63X. (D) Análisis de la expresión de la proteína de fusión
BAB2_0123::3xFLAG en la cepas B. abortus 2308 pBBR ba20123::3xFLAG 1 y 25 por Western Blot. Cantidades equivalentes
de proteínas provenientes de extractos totales de ambas cepas se analizaron por 12,5% SDS-PAGE y las proteínas se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Para el Western Blot se usó un anticuerpo monoclonal anti-FLAG.
Capítulo III- 73
Las cepas de B. abortus 2308 que expresan estas proteínas de fusión se usaron para infectar células tipo
macrofágicas de la línea J774. A1. A las 5 horas post-infección, las células se lisaron y se cuantificó el AMPc
intracelular. Como se observa en la Figura 39B, ninguna de las proteínas con deleciones amino-terminales pudo
ser translocada al citoplasma eucariota. Lo mismo ocurrió con la proteína de fusión que tiene el dominio catalítico
CyaA en el extremo amino-terminal. Para confirmar estos resultados se obtuvo una cepa que expresa la proteína
de fusión a 3xFLAG con una deleción de 25 aminoácidos en el extremo amino-terminal (B. abortus 2308 pBBR
ba20123::3xFLAG-25). Con esta cepa se infectaron macrófagos derivados de médula ósea murinos y se
intentó detectar la proteína usando un anticuerpo monoclonal que reconoce al epítope FLAG. A diferencia de lo
observado en las células infectadas con la cepa que expresa la proteína de fusión a 3xFLAG completa, en las
que la marca de la proteína se localiza por fuera de la bacteria, en las cercanías de las VCBs (Fig. 39C, panel
izquierdo), en las células infectadas con la cepa que expresa la proteína de fusión truncada en su extremo aminoterminal no pudo detectarse la marca de la proteína (Fig. 39C, panel derecho). Se verificó por Western Blot la
expresión de las proteínas de fusión completa y truncada para descartar que la diferencia entre ambas cepas se
deba a distintos niveles de expresión de las proteínas (Fig. 39D). En conjunto, estos resultados sugieren que la
señal para la translocación se ubica en los 25 aminoácidos del extremo amino-terminal de la proteína BAB2_0123.
Análisis del rol de la proteína translocada por el sistema VirB en la virulencia de B. abortus
Teniendo en cuenta que el sistema de secreción VirB de Brucella es esencial para la replicación intracelular
y para la persistencia de la bacteria en ratones infectados, se decidió analizar la participación de la proteína
BAB2_0123, sustrato del sistema VirB, en los procesos de virulencia de B. abortus. Para ello, se construyó una
cepa mutante por inserción de un cassette de resistencia a antibiótico en el gen de interés y se analizó el fenotipo
de esta cepa en ensayos de infección de células y ratones. Se infectaron células epiteliales (HeLa y trofoblastos
humanos JEG-3), células dendríticas (BMDC) y macrófagos derivados de médula ósea de ratón (BMDM) y
células de la línea macrofágica murina J774 A.1. En la Figura 40 se muestran las curvas de replicación intracelular
en BMDC, BMDM y células trofoblásticas JEG-3. En ningún caso se encontraron diferencias en el número de
bacterias intracelulares entre las cepas salvaje y mutante. Por otra parte, tampoco se encontraron diferencias en
la persistencia en el bazo de ratones infectados a los 30 y 60 días p.i. (Fig. 41). Estos resultados indican que la
proteína no es esencial para la replicación intracelular en células en cultivo, ni para la colonización del bazo de
ratones infectados.
Capítulo III- 74
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Figura 40. Replicación intracelular de la cepa parental B. abortus 2308 y de la cepa mutante B. abortus
ba20123::Kan en (A) Células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón (BMDC), (B) en Células macrofágicas
derivadas de médula ósea de ratón (BMDM) y (C) en trofoblastos humanos de la línea JEG-3. Cada valor
corresponde a la media ± el desvió estándar de dos experimentos independientes.
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Figura 41. Persistencia de la mutante B. abortus ba20123::Kan en bazo de ratones infectados. El número de
bacterias viables en bazo fue determinado a los 30 y 60 días p.i. según se describe en Materiales y Métodos. Los
valores representan las medias más los desvíos estándar (n=4).
Capítulo III- 75
Determinación de la toxicidad de BAB2_0123 en levaduras
La especie Saccharomyces cerevisiae comparte muchas de las vías de tráfico intracelular con eucariotas
superiores (Hurley y Emr, 2006; Katzmann et al., 2002), y constituye, por lo tanto, un modelo atractivo para el
estudio de factores de virulencia bacterianos.
Recientemente, la expresión ectópica en S. cerevisiae se ha convertido en una herramienta muy valiosa
a la hora de identificar y caracterizar proteínas efectoras de Chlamydia, Shigella, Pseudomonas, Yersinia,
Salmonella y Legionella (Campodonico et al., 2005; de Felipe et al., 2008; Derre e Isberg, 2005; Heidtman et
al., 2009; Kramer et al., 2007; Kumar et al., 2006; Lesser y Miller, 2001; Sato et al., 2003; Shohdy et al., 2005;
Sisko et al., 2006; Valdivia, 2004). En muchos casos, las proteínas efectoras bacterianas tienen la capacidad de
interferir con el tráfico intracelular causando defectos en el crecimiento e incluso letalidad en S. cerevisiae.
Para determinar si la proteína BAB2_0123 tiene un efecto tóxico sobre S. cerevisiae, se obtuvo una cepa
que expresa la proteína bajo el control de un promotor regulado por galactosa (GAL1) (Ver Materiales y Métodos).
La actividad del promotor GAL1 es inducida por galactosa y reprimida por glucosa. De esta manera, las cepas
conteniendo el plásmido vacío o la construcción con el gen ba20123 fueron crecidas en un medio con glucosa
hasta fase estacionaria, y a partir de estos cultivos se hicieron diluciones seriadas que se plaquearon en réplica
en placas con glucosa o galactosa. Si bien la galactosa tiene un efecto sobre el crecimiento de las levaduras, este
efecto no se debe a la sobreexpresión de la proteína BAB2_0123. La cepa que contiene el plásmido p416GAL1ba20123, así como la cepa con p416GAL1 vacío muestran el mismo defecto en el crecimiento en placas con
galactosa (Fig. 42A). Por otra parte, se verificó la inducción y represión del promotor GAL1, confirmando la
expresión del gen ba20123 en un medio con galactosa (Fig. 42B). Estos resultados indican que la proteína
BAB2_0123, sustrato del sistema VirB de B. abortus, no tiene un efecto tóxico cuando es sobreexpresada en
S. cerevisiae.
Expresión de la proteína BAB2_0123 en células de mamífero
En muchos casos, la localización subcelular de proteínas bacterianas expresadas ectópicamente en células
eucariotas puede proporcionar información relevante acerca de su función (Sisko et al., 2006). De esta manera,
para continuar con la caracterización de la proteína BAB2_0123, y con el objetivo de obtener información
acerca de su rol en la infección, se hicieron experimentos de expresión ectópica en células de mamíferos. Para
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Capítulo III- 76
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Figura 42. Análisis de la toxicidad de BAB2_0123 en S. cerevisiae. (A) Las cepas de levadura conteniendo el plásmido
con el gen ba20123 bajo el control del promotor GAL1 (p416GAL1-ba20123) o el plásmido vacío (p416GAL1) se
crecieron en medio YNB con glucosa hasta fase estacionaria. A partir de estos cultivos se hicieron diluciones seriadas
en PBS que se plaquearon en YNB con glucosa (reprime la expresión de ba20123) o galactosa (induce la expresión de
ba20123). (B) Cantidades equivalentes de proteínas de extractos totales de la cepa que contiene p416GAL1-ba20123
crecida en un medio con glucosa o galactosa fueron analizadas por 10% SDS-PAGE. Para el Western Blot se usó un
suero que reconoce a la proteína BAB2_0123. En la primera calle se incluyó la proteína recombinante BAB2_0123
fusionada a 6xHis. Con una flecha se indica la banda correspondiente a la proteína expresada en S. cerevisiae. Sobre la
izquierda se indica la posición de los marcadores de peso molecular (en kDa).
ello, se construyó un vector que permite expresar la proteína fusionada al epítope c-Myc en células eucariotas
(ver Materiales y Métodos). Este vector se usó para transfectar células HeLa y COS-7 de manera transiente.
En las células transfectadas se analizó la localización subcelular de la proteína mediante microscopía confocal
láser usando un anticuerpo monoclonal que reconoce a c-Myc.
El análisis por microscopía reveló que la proteína se localiza alrededor del núcleo y en estructuras
membranosas y tubulares que se extienden desde la envoltura nuclear hacia la periferia de la célula (Fig. 43).
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Figura 43. Expresión ectópica de c-Myc-BAB2_0123 en células HeLa. Las células se fijaron a las 20 hs post-transfección.
La proteína BAB2_0123 se detectó usando un anticuerpo anti-c-Myc y un anticuerpo secundario conjugado a FITC. El
ADN del núcleo se detectó con To-Pro 3. Las muestras se analizaron con un microscopio láser confocal marca Zeiss,
modelo LSM 510 con un objetivo 63X.
Capítulo III- 77
Para poder determinar en qué compartimiento subcelular se localizaba la proteína, se probaron diversos
marcadores de organelas celulares. Se encontró que la proteína expresada ectópicamente colocaliza con el
marcador de retículo endoplasmático (RE) calreticulina (Fig. 44). Estos resultados indican que la proteína
BAB2_0123 expresada en células eucariotas se localiza en las membranas del RE, la misma organela que la
bacteria explota para establecer su nicho replicativo.
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#ALRETICULINA
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#ALRETICULINA
3UPERPOSICI˜N
Figura 44. Expresión ectópica de c-Myc-BAB2_0123 en células HeLa. Las células se fijaron a las 20 hs post-transfección.
La proteína BAB2_0123 se detectó usando un anticuerpo anti-c-Myc y un anticuerpo secundario conjugado a FITC. La
proteína calreticulina se detectó usando un anticuerpo anti-calreticulina y un anticuerpo secundario conjugado a Alexa568. El ADN nuclear se detectó con DAPI. Las flechas indican estructuras detectadas con anti-c-Myc y anti-calreticulina.
Las muestras se analizaron con un microscopio de epifluorescencia Nikon E600 con un objetivo 100X.
Sin embargo, la predicción de péptido señal en la proteína BAB2_0123 permite sugerir que la colocalización
con membranas del RE es producto del reconocimiento de la secuencia señal por la maquinaria de secreción
eucariota. Por lo tanto, se decidió analizar la localización subcelular de la proteína BAB2_0123 sin el fragmento
amino-terminal que tiene predicción de péptido señal y de un segmento transmembrana (ver Fig. 29). Para ello,
se construyó un vector que permite expresar la proteína truncada (aminoácidos 25 a 153) fusionada al epítope cMyc. Las células HeLa transfectadas con esta nueva construcción modificaron radicalmente su forma y se
detectó la formación de proyecciones tipo lamelipodios. La marca de la proteína dejó de estar asociada a las
membranas del RE para relocalizarse en la membrana plasmática (Fig. 45, panel superior). La formación de
lamelipodios así como la relocalización de la proteína en la membrana plasmática, plantearon la posibilidad de que
la proteína truncada colocalice con filamentos de actina. Esto pudo confirmarse al tratar las células transfectadas
con Faloidina-rodamina (Fig. 45, panel inferior). La relocalización subcelular de la proteína truncada sugiere que
Capítulo III- 78
el segmento transmembrana y/o la secuencia señal están siendo reconocidos por la maquinaria eucariota reteniendo
a la proteína en el RE. Cuando se remueve el fragmento amino-terminal se promueve la formación de proyecciones
tipo lamelipodios y la proteína colocaliza con filamentos de actina en estas proyecciones celulares.
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#ALRETICULINA
3UPERPOSICI˜N
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&ACTINA
3UPERPOSICI˜N
Figura 45. Expresión ectópica de c-Myc-BAB2_0123 truncada (aminoácidos 25-153) en células HeLa. Las células se
fijaron a las 20 hs post-transfección. La proteína BAB2_0123 truncada se detectó usando un anticuerpo anti-c-Myc y
un anticuerpo secundario conjugado a FITC. La proteína calreticulina (panel superior) se detectó usando un anticuerpo
anti-calreticulina y un anticuerpo secundario conjugado a Alexa-568. Para marcar F-actina (panel inferior) se usó
Faloidina conjugada a rodamina. Las flechas indican las proyecciones tipo lamelipodios que se forman como producto
de la transfección con la proteína truncada. Las muestras se analizaron con un microscopio de epifluorescencia Nikon
E600 con un objetivo 100X.
Estos resultados son interesantes si se tiene en cuenta la similitud de la proteína BAB2_0123 con la
proteína eucariota cortactina. Esta proteína se une a F-actina y se localiza en el citoesqueleto cortical y en
lamelipodios (Weed y Parsons, 2001). También se describió la presencia de cortactina en los conos de crecimiento
de neuronas, en los podosomas de osteoclastos, en los invadopodios de células tumorales y en los sitios de
reordenamiento de actina inducidos por virus y bacterias patógenos (Daly, 2004; Lua y Low, 2005; Pfaff y
Jurdic, 2001). Considerando estos antecedentes, se decidió analizar si existe colocalización entre la proteína
BAB2_0123 truncada y cortactina. Para ello, se cotransfectaron células con un vector que expresa la proteína
de Brucella truncada y fusionada a c-Myc y un vector que expresa la proteína cortactina fusionada a GFP.
Como se observa en la Figura 46, la cortactina se dispone en la periferia de la célula colocalizando con BAB2_0123
truncada en lamelipodios.
Capítulo III- 79
'&0#ORTACTINA
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Figura 46. Colocalización entre c-Myc-BAB2_0123 truncada y GFP-Cortactina en células HeLa. Las células
cotransfectadas fueron fijadas a las 20 hs post-transfección. La proteína BAB2_0123 truncada se detectó usando un
anticuerpo anti-c-Myc y un anticuerpo secundario conjugado a Alexa 568. Las flechas indican colocalización entre
ambas proteínas en las proyecciones celulares. Las muestras se analizaron con un microscopio de epifluorescencia
Nikon E600 con un objetivo 100X.
DISCUSIÓN
Los resultados expuestos en esta parte de la tesis han permitido caracterizar la proteína BAB2_0123,
sustrato del sistema de secreción tipo IV de B. abortus.
Esta proteína muestra homología con dos proteínas procariotas: Oant_4219 y BARBAKC583_1150. Es
importante destacar que las especies en las que se encuentran estos homólogos, Ochrobactrum anthropi ATCC
49188 y Bartonella bacilliformis KC583, son capaces de establecer, al igual que Brucella, asociaciones estrechas
con la célula eucariota (Berg et al., 2005; Dehio, 2005). Además, Ochrobactrum anthropi ATCC 49188 posee
un sistema de secreción tipo IV codificado en el plásmido pOANT01. Teniendo en cuenta la conservación del
contexto genómico de los genes que codifican para las tres proteínas homólogas, así como la presencia en ellas
del motivo estructural coiled coil, se podría sugerir una función conservada en estas proteínas relacionadas.
Por otra parte, se pudo detectar similitud entre BAB2_0123 y la proteína eucariota cortactina, encargada
de la regulación del citoesqueleto de actina. Los residuos conservados corresponden a la región con predicción
Capítulo III- 80
de motivo coiled coil en ambas proteínas. Como se mencionó en el capítulo anterior, estos motivos estructurales
median interacciones proteína-proteína y son muy abundantes en moléculas efectoras de los sistemas de secreción
tipo III y tipo IV (Delahay y Frankel, 2002; Ninio y Roy, 2007).
Los resultados obtenidos al analizar la translocación intracelular de BAB2_0123 usando la proteína reportera
CyaA, pudieron ser confirmados mediante el estudio de células infectadas por microscopía confocal y de
inmunofluorescencia. Este análisis reveló la presencia de la proteína BAB2_0123-3xFLAG en las vecindades de
las VCBs en células infectadas con la cepa salvaje pero no con una cepa mutante virB. Resultados similares se
obtuvieron al analizar la localización de los efectores LidA, SidC, SdeC, DrrA y SdhA, translocados por el
sistema Dot/Icm de Legionella pneumophila (Bardill et al., 2005; Conover et al., 2003; Laguna et al., 2006;
Luo e Isberg, 2004; Murata et al., 2006). En este punto resulta interesante destacar que no todas las VCBs
fueron positivas para la marcación de la proteína, indicando que sólo un subgrupo de bacterias estaría translocando
la proteína al citoplasma eucariota. Considerando que alrededor del 90% de las bacterias que infectan macrófagos
son degradadas, es posible que aquellas que translocan proteínas efectoras, entre ellas BAB2_0123, sean las
que logran establecer un nicho replicactivo intracelular. Sería interesante seguir el destino intracelular de las
VCBs que colocalizan con la marca de la proteína a lo largo del tiempo, para poder determinar si logran replicar
en compartimientos derivados del RE.
La translocación de la proteína BAB2_0123 dependiente del sistema VirB también pudo confirmarse al
analizar por Western Blot las fracciones solubles en detergente de macrófagos infectados. Una vez más, se pudo
detectar la proteína translocada en la fracción soluble en saponina de células infectadas con la cepa salvaje, pero
no con una cepa mutante virB.
Cuando se analizó el perfil de expresión de BAB2_0123 in vitro, se encontraron niveles de proteína
similares a lo largo de la curva de crecimiento de la cepa que expresa BAB2_123::3xFLAG bajo su propio
promotor en medio rico. Asimismo, es importante mencionar que también se pudo detectar la proteína en las
cercanías de las VCBs en células infectadas con esta cepa a las 4 hs p.i. Estos resultados indican que la bacteria
cuenta con un pool endógeno de BAB2_0123 al momento de la infección. Resultados similares se encontraron
para el efector RalF de Legionella pneumophila, donde la translocación de la proteína efectora no está asociada
a su traducción (Nagai et al., 2005).
Debido a la predicción de péptido señal y de un segmento transmembrana en el extremo amino-terminal
de BAB2_0123, se analizó la localización subcelular de la proteína. Se encontró que la proteína se halla asociada
a la fracción de membranas totales, aunque no se pudo determinar si es una proteína integral de membrana. La
Capítulo III- 81
presencia de hélices transmembrana también ha sido descripta para los efectores LepB, YlfA y YlfB de Legionella
pneumophila (Campodonico et al., 2005; Chen et al., 2004). Se ha postulado que estos dominios podrían mediar
interacciones entre compartimientos membranosos.
Mediante la construcción de una serie de deleciones de BAB2_0123 se determinó la secuencia aminoacídica
requerida para la translocación de la proteína al citoplasma eucariota. El análisis de la translocación de proteínas
de fusión al dominio CyaA reveló que los 25 aminoácidos del extremo amino-terminal son esenciales para dirigir
a BAB2_0123 al citoplasma eucariota. Estos resultados pudieron confirmarse al estudiar por microscopía de
fluorescencia células infectadas con una cepa que expresa la proteína truncada y fusionada a 3xFLAG, en las
que la marca de la proteína no pudo detectarse en las vecindades de las VCBs. Además, la proteína con el
dominio CyaA fusionado al extremo amino-terminal de BAB2_0123 tampoco se transloca al citoplasma de la
célula huésped. En conjunto, estos resultados indican que la secuencia señal y/o el segmento transmembrana son
requeridos para la translocación de la proteína por el sistema VirB. Sin embargo, un análisis detallado del Western
Blot que se muestra en la Fig. 39D, donde se analizan las proteínas de fusión a 3xFLAG completa y truncada,
revela que ambas proteínas tienen la misma movilidad electroforética, a pesar de tener una diferencia de 25
aminoácidos entre ellas. Estos resultados son compatibles con un procesamiento de la proteína completa, generando
especies del mismo peso molecular. Hasta aquí, contrariamente a lo reportado para algunos sustratos tipo IV, los
resultados demuestran que la señal para la secreción se encuentra en el extremo amino-terminal de BAB2_0123.
Si bien no existe una secuencia consenso, la señal de secreción de algunos efectores tipo IV consiste en
una secuencia con carga neta positiva en el extremo carboxilo-terminal de la proteína (Cambronne y Roy, 2006).
Sin embargo, existen excepciones a esta regla. Por ejemplo, la molécula efectora CagA de Helicobacter pylori
contiene información necesaria para su translocación en ambos extremos de la proteína (Hohlfeld et al., 2006).
Otro ejemplo lo constituye la toxina Pertussis, cuyos componentes son translocados al periplasma de manera Sec
dependiente, y luego atraviesan la membrana externa por un sistema de secreción tipo IV (Burns, 2003). Las
proteínas LepA y LepB de Legionella pneumophila constituyen otro ejemplo similar a CagA, ya que la información
para su translocación parece estar contenida en ambos extremos de las proteínas (Chen et al., 2004). En VceC,
uno de los dos sustratos del sistema VirB de Brucella identificados hasta la fecha, los 20 aminoácidos del
extremo carboxilo-terminal parecen ser esenciales para su translocación (de Jong et al., 2008). No obstante, las
secuencias carboxilo-terminales de las proteínas de B. suis y B. abortus no están conservadas y además VceC
tiene predicción de una hélice transmembrana en su extremo amino-terminal. Por su parte, VceA, el otro sustrato
VirB de Brucella identificado, posee predicción de péptido señal. En definitiva, la ruta exacta de la mayoría de
Capítulo III- 82
los sustratos de secreción tipo IV aún no se conoce. En este caso, los resultados parecen plantear la posibilidad
de que la proteína BAB2_0123 se secrete de manera Sec dependiente y que el intermediario periplasmático sea
translocado a través de la membrana externa por el sistema VirB como fue reportado para los sustratos VirD2,
VirE2 y VirF del sistema VirB de Agrobacterium tumefaciens (Pantoja et al., 2002) (Fig. 47). Experimentos
adicionales son necesarios para determinar detalladamente el mecanismo de secreción de BAB2_0123 por el
sistema VirB.
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Figura 47. Esquema del mecanismo propuesto para la translocación BAB2_0123. (1) La proteína sintetizada en
el citoplasma es dirigida por el péptido señal (en violeta) al sistema de secreción general Sec. (2) Una vez en el
periplasma, la proteína es transportada a través de la membrana externa por la maquinaria de secreción VirB. (3)
Finalmente, la proteína podría quedar asociada a la membrana de la VCB y/o ser liberada al citoplasma de la célula
huésped para ejercer su acción.
Con el objetivo de determinar el rol de la proteína BAB2_0123 en la virulencia de B. abortus, se analizó
el fenotipo de la cepa mutante en ensayos de infección de células y ratones. En ningún caso se encontraron
diferencias entre la cepa salvaje y la mutante. La ausencia de un fenotipo atenuado en la virulencia de la cepa
mutante sugiere la existencia de redundancia funcional entre los efectores VirB de Brucella, tal como se describió
para sustratos tipo III y tipo IV de Pseudomonas aeruginosa y Legionella pneumophila, respectivamente
(Collmer et al., 2000; Guttman et al., 2002; Machner e Isberg, 2006; Murata et al., 2006; Nagai et al., 2002;
Ninio et al., 2005). No obstante, hasta que no se identifiquen más sustratos del sistema tipo IV de Brucella, ésta
es una hipótesis difícil de contrastar. Una explicación alternativa para estos resultados permite sugerir que la
función de la proteína BAB2_0123 no afecta directamente la replicación intracelular o la persistencia de la
bacteria en el bazo de ratones infectados, sino algún otro proceso que no se evidencia al analizar el número de
bacterias intracelulares de la cepa mutante en ensayos de infección.
Capítulo III- 83
A fin de obtener información acerca de la función biológica de BAB2_0123, se hicieron experimentos de
expresión ectópica en levaduras y en células de mamífero. Como se describió en la sección Resultados, muchos
efectores tipo IV alteran el tráfico vesicular en levaduras generando defectos en el crecimiento e incluso letalidad.
Sin embargo, la expresión de BAB2_0123 en levaduras no generó estos defectos. No obstante, es preciso
señalar que la proteína se expresó con la secuencia señal en su extremo amino-terminal, lo que pudo provocar
que la proteína quede retenida en el RE, privada de ejercer su acción. Sería interesante determinar si la proteína
expresada sin el péptido señal genera algún fenotipo defectuoso en levaduras, lo que daría un indicio que
BAB2_0123 está alternando alguna vía de trafico intracelular conservada en eucariotas.
La expresión ectópica de BAB2_0123 en células de mamífero reveló la asociación de la proteína con las
membranas del RE. Estos resultados fueron confirmados indirectamente por experimentos de Western Blot con
extractos totales de proteínas preparados a partir de lisados de células transfectadas. La presencia de bandas de
un peso molecular mayor que el esperado es compatible con la modificación por el agregado de azúcares en el
RE y Golgi. Estos resultados indican que la secuencia señal y/o el segmento transmembrana son reconocidos por
la maquinaria eucariota dirigiendo la proteína a la vía secretoria. Por este motivo, se analizó el efecto de la
expresión de la proteína sin la secuencia señal ni el segmento transmembrana, para asegurar que pueda ejercer
su acción sin quedar retenida en el RE. El análisis de las células transfectadas con esta nueva construcción
reveló que la proteína truncada se relocaliza en proyecciones de la membrana plasmática tipo lamelipodios y
colocaliza con actina cortical y cortactina en los lamelipodios. Este hallazgo es interesante si se tiene en cuenta
la similitud entre BAB2_0123 y cortactina, y plantea la posibilidad de que ambas proteínas interactúen a nivel del
motivo estructural coiled coil. Se ha reportado que la cortactina es un blanco explotado por muchas bacterias
patógenas como Escherichia coli (EPEC y EHEC), Shigella y Helicobacter, entre otras (Selbach y Backert,
2005). Estas bacterias regulan el citoesqueleto de actina de la célula huésped para promover la formación del
pedestal en el caso de E. coli, o la invasión en el caso de Shigella. La proteína Tir, efectora del sistema de
secreción tipo III de E. coli, tiene capacidad de interactuar con cortactina y de inducir la polimerización de actina
para la formación del pedestal (Cantarelli et al., 2002). Si bien los experimentos de expresión ectópica no
reflejan lo que ocurre durante la infección, constituyen una aproximación experimental a la hora de indagar la
función de una proteína hipotética como BAB2_0123. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se puede
sugerir que BAB2_0123 tendría algún rol en la regulación del citoesqueleto de actina durante la infección con B.
abortus. Una posibilidad, es que la proteína una vez insertada en la membrana de la VCB tenga capacidad de
reclutar actina o la maquinaria que regula el citoesqueleto de actina en las cercanías de la VCB para promover
Capítulo III- 84
el tráfico retrógrado hacia las membranas del RE. Experimentos futuros son necesarios para determinar la
interacción directa entre cortactina y BAB2_0123, y dilucidar el rol de este sustrato del sistema de secreción tipo
IV en la infección con Brucella.
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS
Conclusiones - 85
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en esta tesis permiten formular las siguientes conclusiones:
1. La implementación de una metodología novedosa, especialmente diseñada para la identificación de
proteínas de superficie y secretadas al medio de cultivo, fue apropiada para la detección de proteínas de
B. abortus con estas características. La generación de fusiones a la proteína reportera cloranfenicol
acetil transferasa hizo posible la identificación de diez proteínas potencialmente secretadas o de superficie
de B. abortus.
2. La proteína trigger factor es secretada al medio de cultivo de manera VirB independiente y está
involucrada en la patogénesis de B. abortus en el modelo de infección murino.
3. El análisis in silico del proteoma teórico de B. abortus reveló la presencia de al menos ocho proteínas
con dominios y/o motivos de interacción propios de eucariotas.
4. Las proteínas Btp1 y Btp2 de B. abortus poseen el dominio de señalización intracelular TIR y contribuyen
en la inhibición de la maduración de las células dendríticas interfiriendo con la cascada de señalización
vía TLRs.
5. El uso de la proteína reportera adenilato ciclasa, acoplado al análisis in silico del proteoma de B. abortus,
permitió la identificación de dos proteínas translocadas intracelularmente, una de las cuales es sustrato
del sistema de secreción VirB.
6. La proteína BAB2_0123, identificada como sustrato del sistema VirB, es homóloga a las proteínas
Oant_4219 de Ochrobactrum anthropi y BARBAKC583_1150 de Bartonella bacilliformis, y muestra
similitud a la proteína eucariota cortactina. BAB2_0123 no es requerida para la replicación intracelular
de la bacteria, ni para el establecimiento de la infección en el modelo murino.
Conclusiones - 86
7. Mediante técnicas de microscopía se determinó que en células infectadas la proteína sustrato del sistema
de secreción VirB se localiza por fuera de la bacteria, en las vecindades de las VCBs.
8. El análisis de deleción reveló que la señal para la secreción de BAB2_0123 por el sistema VirB está
contenida en el extremo amino-terminal de la proteína. Estos resultados plantean la posibilidad de que la
proteína tenga un intermediario periplásmico que es translocado a través de la membrana externa por el
sistema de secreción tipo IV.
9. La expresión ectópica del sustrato del sistema VirB en células de mamíferos reveló la presencia de la
proteína truncada en proyecciones tipo lamelipodios que colocalizan con actina cortical y cortactina.
Estos resultados permiten sugerir la interacción entre BAB2_0123 y el citoesqueleto de actina y/o la
maquinaria encargada de su regulación.
Perspectivas Futuras - 87
PERSPECTIVAS FUTURAS
En esta tesis se describe la secreción de la chaperona trigger factor y su participación en la virulencia de
B. abortus. Resta determinar el mecanismo de secreción de esta proteína y conocer los procesos en los que
participa para establecer un proceso infectivo en el modelo murino.
En este trabajo de tesis también se describe la identificación de un sustrato del sistema de secreción
VirB de B. abortus. Como ya se mencionó en la Introducción General, el sistema VirB de Brucella es necesario
para la interacción y fusión de las VCBs con membranas del RE para la biogénesis de una vacuola replicativa.
Se especula que moléculas efectoras translocadas por este sistema de secreción son las responsables de redirigir
el tráfico intracelular de las VCBs con el objetivo de establecer un nicho replicativo.
Los experimentos de expresión ectópica en células HeLa y la similitud de la proteína BAB2_0123 con la
proteína eucariota cortactina, permiten sugerir la interacción de la proteína con el citoesqueleto de actina o con
la maquinaria encargada de su regulación. La identificación de las moléculas blanco del sustrato de secreción
VirB identificado brindará información acerca del rol de la proteína en la vida intracelular de Brucella.
Por otro lado, mediante el análisis de deleción se determinó que la señal para la secreción de BAB2_0123
por el sistema VirB está contenida en los 25 aminoácidos del extremo amino-terminal de la proteína. Estos
resultados sugieren la existencia de un intermediario periplásmico y la secreción en dos pasos del sustrato VirB
identificado. Por este motivo, se propone determinar en forma detallada el mecanismo de secreción de la proteína
a través del sistema VirB.
Finalmente, a partir de los resultados que demuestran que las proteínas Btp1 y Btp2 de B. abortus están
involucradas en el control de la maduración de las células dendríticas, nos proponemos caracterizar de manera
detallada los mecanismos moleculares que permitan explicar cómo Btp1 y Btp2 interfieren con los procesos de
inmunidad innata del huésped para el establecimiento de una infección crónica. En este sentido, la identificación
de moléculas del huésped que interactúan con Btp1 y Btp2, así como el conocimiento de los mecanismos
involucrados en su translocación, brindarán información valiosa acerca del rol que cumplen estas proteínas
durante la infección.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos - 88
MATERIALES Y MÉTODOS
Condiciones de cultivo y medios
Las cepas de Brucella abortus fueron cultivadas a 37°C en agitador rotatorio (250 rpm) o en placas de
petri con ágar 1.5% por 24-48 hs en medio tripticasa de soja (TSB) con el agregado de antibióticos según el
requerimiento de cada cepa. Los antibióticos utilizados a la concentración final indicada fueron: kanamicina
(Kan) 50 μg/ml, gentamicina (Gm) 3 μg/ml, ampicilina (Amp) 50 μg/ml, carbenicilina (Cb) 50 μg/ml, cloranfenicol
(Cm) 20 μg/ml y ácido nalidíxico (Nal) 5 μg/ml.
Las cepas de Escherichia coli fueron cultivadas a 37°C en agitador rotatorio (250 rpm) o en placas de
petri con ágar 1.5% por 12-18 hs en medio Luria-Bertani (LB) o Terrific Broth con el agregado de antibióticos
según el requerimiento de cada cepa. Los antibióticos utilizados a la concentración final indicada fueron: Amp
(100 μg/ml), Kan (50 μg/ml), Cm (20 μg/ml) y Gm (20 μg/ml).
Cepas bacterianas y plásmidos
Las cepas bacterianas y plásmidos utilizados en esta tesis se listan en la Tabla I (ver pág. 108).
Técnicas de biología molecular
Las técnicas de biología molecular se realizaron según lo descripto en Ausubel (1987), Sambrook
(1989) y las indicaciones de los fabricantes.
Purificación de ADN genómico
Para la extracción y purificación de ADN genómico de B. abortus se siguió la técnica del CTAB (Cetyl
Trimethyl Ammonium Bromide) (Meade et al., 1982) con algunas modificaciones. Las bacterias fueron
cosechadas por centrifugación a 4000 x g (aproximadamente 1 g de peso húmedo), lavadas dos veces y
resuspendidas en una solución 10 mM Tris pH 7.6, 10 mM EDTA. Luego fueron sometidas a lisis por el
agregado de SDS 0.5% final y proteinasa K, 100 μg/ml. Se incubó 1 h a 37°C. Luego de la incubación, se
agregó NaCl hasta llevar la concentración a 0.8 M y se agregó una solución de CTAB/NaCl para acomplejar y
remover la pared celular, polisacáridos y proteínas. Se incubó a 65°C por 30 min. y se procedió a la extracción
con cloroformo/alcohol isoamílico. La fase acuosa conteniendo el ADN genómico se extrajo con un volumen
igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y la fase acuosa fue precipitada con 0.6 volúmenes de isopropanol.
Materiales y Métodos - 89
El ADN genómico precipitado fue secado y resuspendido en buffer TE (Tris-EDTA) y congelado a -20°C para
su posterior uso.
Construcción del plásmido pDK51
El plásmido pBBR MCS-4 (Kovach et al., 1995) fue digerido con las enzimas de restricción SphI y
KpnI para eliminar el promotor lac. Los extremos cohesivos resultantes se transformaron en extremos romos
con T4 DNA polimerasa (New England Biolabs) y posteriormente se religaron. Mediante este procedimiento se
generó el plásmido pDK51.
Construcción de los plásmidos pCAT I, II y III
Se amplificó mediante PCR el gen que codifica para la enzima cloranfenicol acetil transferasa (CAT)
usando como templado el ADN del plásmido pRIBOTEX-CAT (Martinez-Calvillo et al., 1997). Los
oligonucleótidos primers utilizados en la reacción de PCR fueron 5´-CGGATCCGAGAAAAAAATCACTG-3´
y 5´-ACCGCGGTTACGCCCCGCCCTGC-3´, que contienen los sitios de restricción BamHI y SacII,
respectivamente. El producto de PCR generado, que carece de un sitio de unión al ribosoma (secuencia Shine
Dalgarno) y de un codón de inicio de la traducción, fue clonado en el vector pGem-T-Easy (Promega). El
fragmento de ADN que contiene la secuencia promotora del gen bcsp31 se amplificó por PCR usando como
templado ADN
genómico
de
B.
abortus
2308
y
los
oligonucleótidos
primers
5´-
CGGATCCCGGGAATACCAGTCCTCTTC-3´ y 5´-CGGAATTCAAGCGATTGTATTCTT-3´, que contienen
los sitios de restricción SmaI y EcoRI, respectivamente. El producto de la amplificación fue clonado en el vector
pGem-T-Easy. Los fragmentos que codifican para CAT y para el promotor BCSP31 fueron escindidos de los
vectores pGem-T-Easy con las enzimas BamHI-SacII y SmaI-EcoRI, respectivamente, y ligados al plásmido
pDK51 digerido con las mismas enzimas. El plásmido obtenido se denominó pCAT I (ver Fig. 8, Capítulo I).
Para generar los plásmidos con los otros dos marcos de lectura se amplificó el gen que codifica para CAT con
el
oligonucleótido
primer
forward
5'-CGGATCCAGAGAAAAAAATCACTG-3'
o
5'-
CGGATCCAGGAGAAAAAAATCACT-3', que agregan uno o dos nucleótidos inmediatamente después del
sitio BamHI. Los productos de amplificación se clonaron en el vector pGem-T-Easy y fueron escindidos con las
enzimas BamHI y SacII y ligados a pCAT I digerido con las mismas enzimas. De esta manera se obtuvieron los
plásmidos pCAT II y pCAT III (ver Fig. 8, Capítulo I). Para la preparación del ADN plasmídico se transformaron
Materiales y Métodos - 90
células E. coli DH5α competentes con pCAT I, pCAT II y pCAT III. Los plásmidos fueron purificados usando
columnas midi-prep (Qiagen).
Construcción de la colección de fusiones traduccionales a cat
El ADN genómico de B. abortus 2308 fue parcialmente digerido con la enzima AluI. Los fragmentos
de ADN de pesos moleculares entre 0.5 Kpb y 1.5 Kpb se ligaron al sitio SmaI de una mezcla equimolecular de
pCAT I, II y III. Los productos de las ligaciones se transformaron en células E. coli DH5α competentes.
Identificación de proteínas de fusión con actividad CAT en E. coli
Las células transformadas en el paso anterior se cultivaron en placas de LB-ágar conteniendo
cloranfenicol a una concentración final de 6 μg/ml por 48hs (para poder aislar todas las fusiones, incluso aquellas
con un bajo nivel de actividad CAT). Se identificaron 864 colonias resistentes a cloranfenicol que se cultivaron
individualmente en 2 ml de medio Terrific broth con ampicilina. Los cultivos fueron agrupados en 9 grupos de 96
clones y los plásmidos fueron extraídos y purificados en masa. Células electrocompetentes de B. abortus 2308
se electroporaron con cada uno de los 9 grupos de plásmidos y luego de la recuperación ON se plaquearon en
TSB-ágar con carbenicilina. Se recuperaron 192 clones de cada evento de electroporación (1728 clones totales).
Estos clones se ordenaron en placas de 96 pocillos para su posterior identificación.
Identificación de las proteínas de fusión secretadas en B. abortus 2308
Debido al gran número de clones a analizar, la identificación de las proteínas de fusión secretadas se
realizó utilizando mezclas de sobrenadantes de cultivo. De esta manera, se realizaron 216 mediciones de actividad
CAT usando sobrenadantes de cultivo de 8 clones de B. abortus inoculados en 5 ml de medio líquido TSB
conteniendo carbenicilina. Luego de 16-18 hs de cultivo en agitación a 37ºC, 0.5 ml de cultivo en fase estacionaria
temprana fueron centrifugados durante 15 min. a 1.000 x g. Estos sobrenadantes fueron sometidos a una
segunda ronda de centrifugación a 18.000 x g por 15 min. Los sobrenadantes fueron luego filtrados usando un
filtro de 0.22 μm de tamaño de poro para eliminar las bacterias que pudieran quedar. La secreción de las
proteínas de fusión al sobrenadante de cultivo se determinó midiendo la formación de [14C]-cloranfenicol
butirilado como se describe en Seed y Sheen (1988). La mezcla de reacción incluyó: 10 μl de muestra
(sobrenadante filtrado), 34 μl de 0.25 M Tris HCl (pH 8.0), 2.5 μl de [14C]-Cloranfenicol (0.05 mCi/ml) y 3.5 μl
de Butiril-CoA (5 mg/ml) en un volumen final de 50 μl. Las reacciones se incubaron por 30 min. a 37ºC. Las
Materiales y Métodos - 91
reacciones fueron extraídas dos veces con xileno y el [14C]-cloranfenicol butirilado se recuperó en la fase
orgánica. Esta fase fue extraída dos veces con 0.25 M Tris HCl (pH 8.0) para reducir la cantidad de cloranfenicol
sin modificar presente en la fase orgánica. Por último, se cuantificó la radioactividad por centelleo líquido. Como
control positivo de la reacción se incluyó un lisado de una cepa de B. abortus 2308 que contiene el plásmido
pBBR MCS-1 (Kovach et al., 1995) y que expresa CAT de manera constitutiva. El sobrenadante de cultivo de
B. abortus 2308 se incluyó como control negativo.
Detección de la secreción de las fusiones a CAT por Western Blot
Las cepas de B.abortus conteniendo las fusiones traduccionales se cultivaron ON a 37ºC en 15 ml de
medio TSB con carbenicilina. Los cultivos fueron centrifugados por 15 min. a 1000 x g y se separaron volúmenes
de sobrenadantes correspondientes a 3 DO600. Estos sobrenadantes fueron sometidos a una segunda ronda de
centrifugación a 18.000 x g por 15 min. Los sobrenadantes fueron filtrados usando membranas de 0.22 μm de
poro para remover las bacterias que pudieran haber quedado luego de las centrifugaciones. Las proteínas de los
sobrenadantes fueron precipitadas ON a 4ºC con TCA a una concentración final de 10%. Luego, se centrifugó
a 18.000 x g por 30 min. y los pellets se lavaron dos veces con acetona helada para eliminar los restos de TCA.
Los pellets se secaron y se resuspendieron en buffer de muestra para SDS-PAGE. En caso de ser necesario se
neutralizó el pH con una solución de NaOH 0.1M. La cepa de B. abortus conteniendo el plásmido pBBR
MCS-1 se cultivó ON a 37ºC en 15 ml de medio TSB con cloranfenicol. Para la preparación del extracto total
se separó un volumen de cultivo correspondiente a 3 DO600, éste se centrifugó y el pellet se resuspendió en
buffer de muestra para SDS-PAGE. Para la preparación del sobrenadante de la cepa control, se procedió del
mismo modo que para las cepas conteniendo las fusiones.
Los sobrenadantes y el extracto total se analizaron por 10% SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Las proteínas
se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Inmobilon-NC, Millipore) (Burnette, 1981) y se detectaron
usando una dilución 1:2.000 de la fracción IgG del antisuero CAT (Sigma) y una dilución 1:10.000 de un anticuerpo
secundario anti-IgG de conejo congujado a peroxidada de rábano (DAKO Corp., Carpintería, CA). Se reveló
por quimioluminiscencia (Supersignal West Pico chemiluminiscent substrate detection reagents, Pierce Chemical,
Co) según las indicaciones del fabricante.
Para eliminar los anticuerpos pegados a las membranas (stripping) se utilizó un buffer conteniendo
2% p/v SDS, 62.5 mM Tris HCl pH 6.8 y 100 mM β-mercaptoetanol. Las membranas se incubaron a 50-70º C
por 30 min. y se lavaron 2 veces (10 min) con buffer TBS. Las membranas se incubaron con una dilución 1:500
Materiales y Métodos - 92
de un antisuero policlonal que reconoce la proteína fosfoglucomutasa (PGM) de Agrobacterium tumefaciens
(Ugalde et al., 1998). En una segunda incubación se usó una dilución 1:500 de un antisuero policlonal que
reconoce a la proteína de membrana externa 2b (Omp2b) de B. abortus (D.J. Comerci, sin publicar).
Análisis de secuencia y búsqueda en bases de datos
Los fragmentos de ADN genómico de B. abortus fusionados a CAT se amplificaron por PCR utilizando
como templados los plásmidos purificados a partir de B. abortus y los oligonucleótidos primers 5´ACGATGCCATTGGGATAT-3´ y 5´-CGGAATTCAAGCGATTGTATTCTT-3´. Los productos de PCR se
clonaron en el vector pGem-T-Easy y se secuenciaron usando el oligonucleótido primer 5´ACGATGCCATTGGGATAT-3´ que es complementario a la región 5´ del gen cat. Para el análisis de secuencia
se utilizaron los programas BLASTx, BLASTp, PSI-BLAST y Conserved Domain Database v.2.16 (CDD)
(Marchler-Bauer et al., 2009) del servicio en red BLAST (Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997) del
National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Análisis Bioinformático
La predicción de péptido señal se hizo con los programas PSORTb v.2.0.4 (Gardy et al., 2005) y
SignalP 3.0 (Bendtsen et al., 2004). Para la predicción de segmentos transmembrana se usaron los programas
SOSUI 1.11 (Mitaku y Hirokawa, 1999; Mitaku et al., 2002), HMMTOP 2.0 (Tusnady y Simon, 1998, 2001) y
TMHMM 2.0 (Krogh et al., 2001). La predicción de coiled coils se hizo con los programas COILS (Lupas et
al., 1991), Parcoil2 (McDonnell et al., 2006) y Multicoil (Wolf et al., 1997). Estos programas están disponibles
en http://ca.expasy.org/tools/. El análisis de los dominios se hizo con los programas SMART (Letunic et al.,
2009; Schultz et al., 1998) y Pfam 23.0 (Finn et al., 2008), también disponibles en http://ca.expasy.org/tools/, y
Conserved Domain Database v.2.16 (CDD) (Marchler-Bauer et al., 2009) disponible en http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml.
Obtención de anticuerpos contra las proteínas de secreción identificadas
Las secuencias de ADN que codifican para las proteínas de secreción seleccionadas para generar
anticuerpos se amplificaron por PCR usando los oligonucléotidos que se muestran en la Tabla II (ver pág. 110)
y que contienen los sitios de restricción BamHI y HindIII. Los fragmentos de ADN amplificados se digirieron
con las enzimas BamHI y HindIII y se ligaron al vector de expresión pTrcHisB (Invitrogen) digerido con las
Materiales y Métodos - 93
mismas enzimas. Los plásmidos resultantes se introdujeron en la cepa de E. coli DH5α-F’IQ por transformación
y se indujo la expresión de las proteínas con 0.1 mM IPTG durante 3 hs a 37°C. Las proteínas recombinantes
fusionadas a un epítope de seis residuos de histidina se purificaron por cromatografía de afinidad a quelatos
metálicos y se inyectaron en ratones utilizando un esquema estándar de inmunización.
Detección de Trigger factor (TF) por Western Blot
Las cepas B. abortus 2308 y virB1::Kan fueron cultivadas a 37°C en 20 ml de medio TSB hasta fase
estacionaria temprana. Se separaron 15 ml de cultivo y se procesaron para el análisis de proteínas en el sobrenadante
tal como se describió para el análisis de proteínas de fusión a CAT. Asimismo, se separaron alícuotas de los
cultivos para el análisis de las proteínas en los extractos totales. Los sobrenadantes y extractos totales se analizaron
por 10% SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (InmobilonNC, Millipore) (Burnette, 1981) y se detectaron usando una dilución 1:1.000 del antisuero policlonal anti-TF y
una dilución 1:10.000 de un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón congujado a peroxidada de rábano (DAKO
Corp., Carpintería, CA). Se reveló por quimioluminiscencia (Supersignal West Pico chemiluminiscent substrate
detection reagents, Pierce Chemical, Co) según las indicaciones del fabricante.
Análisis de la secreción de la proteína de fusión TF(1-35)::CAT en mutantes virB
El plásmido que codifica para la proteína de fusión TF(1-35)::CAT fue introducido en las cepas mutantes
virB1::Kan, virB10::Kan y ΔvirB11 por conjugación biparental (Comerci et al., 1998). Para determinar la
secreción de la proteína de fusión, las cepas se cultivaron en medio TSB y se determinó la actividad CAT en los
sobrenadantes como se describió anteriormente. Las reacciones fueron incubadas a 37°C por 15 min.
Construcción de la cepa mutante B. abortus 2308 flgE::Gm
Para la construcción de la mutante flgE::Gm se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente
1.2 Kpb usando los oligonucleótidos FlgE forward y reverse (ver Tabla II, pág. 110) conteniendo los sitios de
restricción BamHI y HindIII respectivamente. El producto de amplificación digerido con BamHI y HindIII se
clonó en el vector pUC19 (Stratagene) digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante se digirió con la
enzima NotI y en ese sitio se clonó un cassette de resistencia a gentamicina. El plásmido obtenido de la ligación
se electroporó en B. abortus 2308. Este plásmido es incapaz de replicar autónomamente en Brucella por lo que
funciona como vector suicida. Las colonias que sufrieron eventos de doble recombinación homóloga fueron
Materiales y Métodos - 94
seleccionadas en placas TSB con el agregado de gentamicina y repicadas en réplica a placas TSB carbenicilina.
Las colonias Gmr Cbs fueron seleccionadas y sometidas a análisis de PCR para confirmar que el gen salvaje
había sido reemplazado por la copia interrumpida por el cassette gentamicina. Este procedimiento generó la
mutante flgE::Gm.
Construcción de la cepa mutante B. abortus 2308 tf::Gm
Para la construcción de la mutante tf::Gm se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1.7
Kpb
usando
los
oligonucleótidos
5´-GGGGTACCGGCGAATTTGGTGCG-3´
y
5´-
CGGAATTCTTCAGCCGTCCGTCC´-3´ conteniendo los sitios de restricción KpnI y EcoRI, respectivamente.
El producto de amplificación conteniendo parte de la secuencia que codifica para TF se clonó en el vector
pBluescript II KS (+/-) (Stratagene). El plásmido resultante se digirió con la enzima HindIII y en ese sitio se
clonó un cassette de resistencia a gentamicina. El plásmido producto de la ligación se electroporó en B. abortus
2308. Este plásmido es incapaz de replicar autónomamente en Brucella por lo que funciona como vector
suicida. Las colonias que sufrieron eventos de doble recombinación homóloga fueron seleccionadas en placas
TSB con el agregado de gentamicina y repicadas en réplica a placas TSB carbenicilina. Las colonias Gmr Cbs
fueron seleccionadas y sometidas a análisis de PCR para confirmar que el gen salvaje había sido reemplazado
por la copia interrumpida por el cassette gentamicina. Este procedimiento generó la mutante tf::Gm.
Construcción de la cepa mutante B. abortus 2308 intimina::Gm
Para la construcción de la mutante intimina::Gm se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente
1.05 Kpb usando los oligonucleótidos Intimina forward y reverse (ver Tabla II, pág. 110) conteniendo los sitios
de restricción BamHI y HindIII respectivamente. El producto de amplificación digerido se clonó en el vector
pGem-T (Promega). El plásmido resultante se digirió con la enzima EcoRI y en ese sitio se clonó un cassette de
resistencia a gentamicina. El plásmido obtenido de la ligación se electroporó en B. abortus 2308. Este plásmido
es incapaz de replicar autónomamente en Brucella por lo que funciona como vector suicida. Las colonias que
sufrieron eventos de doble recombinación homóloga fueron seleccionadas en placas TSB con el agregado de
gentamicina y repicadas en réplica a placas TSB carbenicilina. Las colonias Gmr Cbs fueron seleccionadas y
sometidas a análisis de PCR para confirmar que el gen salvaje había sido reemplazado por la copia interrumpida
por el cassette gentamicina. Este procedimiento generó la mutante intimina::Gm.
Materiales y Métodos - 95
Construcción de las cepas mutantes por deleción B. abortus Δp74 y Δp84
Para la generación de la cepa mutante Δp74 se realizaron dos reacciones de PCR utilizando como
molde ADN genómico de B. abortus 2308 y los oligonucleótidos BamHI74-up 5’CGGGATCCGTTGCGGCGATGGCTTCGG-3’
(con
tccagactgctacgtatcgcTGCCATTTCAGTTCCACCCAT-3’,
sitio
o
gcgatacgtagcagtctggaGCCTGGTTCCTTCTTTCGTGA-3’
los
y
BamHI)
y
5’-
oligonucleótidos
5’-
SpeI74-down
5’-
GGACTAGTGCGAAAAGTGCTGCGCCCG-3’ (con sitio SpeI). Estos amplicones, de aproximadamente 500
pb, corresponden a las regiones 5’ y 3’ del gen que codifica para la proteína BAB2_0260. Ambos fragmentos,
que contienen la zona complementaria indicada en letras minúsculas en la secuencia de los oligonucleótidos,
fueron desnaturalizados, apareados y posteriormente se realizaron tres ciclos de elongación utilizando la enzima
Pfx (Invitrogen) y deoxinucleótidos en ausencia de oligonucleótidos. El producto de la elongación fue
posteriormente utilizado como molde para una reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos BamHI74-up y
SpeI74-down. El producto de PCR conteniendo al gen que codifica para la proteína BAB2_0260 con una
deleción interna de 62 codones fue digerido con las enzimas BamHI y SpeI y clonado en el plásmido pBluescriptsacB/R (Sieira et al., 2004), generando el plásmido pBluescript-Δp74-sacB/R. Este plásmido se electroporó en
la cepa B. abortus 2308. Se seleccionaron las colonias simples recombinantes por resistencia a carbenicilina y
sensibilidad a sacarosa 10%. Las colonias aisladas se cultivaron 24 horas en TSB sin antibióticos y se plaquearon
en TSB agar conteniendo sacarosa 10%, con el objetivo de seleccionar las bacterias en las que el plásmido
pBluescript-Δp74-sacB/R se escindió por simple recombinación homóloga. Las colonias se plaquearon en TSB
agar o TSB agar suplementado con carbenicilina. Se realizó un análisis por PCR de las colonias sensibles a
carbenicilina utilizando los oligonucleótidos BamHI74-up y SpeI74-down para confirmar la deleción del gen de
interés. De esta manera se generó la cepa mutante por deleción no marcada B. abortus Δp74.
Para la generación de la cepa mutante Δp84 se siguieron los mismos procedimientos utilizando los
oligonucleótidos BamHI84-up 5’-CGGGATCCCGCTGGGCGGAACCGGCAA-3’ (con sitio BamHI) y 5’tccagactgctacgtatcgcCCGGTTTATTGCACCCGGCAT-3’,
gcgatacgtagcagtctggaATTCTCGACGTCGATTCTTGA-3’
GGACTAGTCCGATGGTCAGCGGAAAGC-3’ (con sitio SpeI).
o
los
y
oligonucleótidos
5’-
SpeI84-down
5’-
Materiales y Métodos - 96
Cultivo de células
Las células HeLa, COS-7, HEK293T y JEG-3 fueron cultivadas en botellas de 75 cm2 (Falcon; BectonDickinson) a 37°C en atmósfera de CO2 al 5% con Medio Mínimo Esencial de Dulbecco (MEM; Gibco BRL)
suplementado con suero fetal bovino (Gibco BRL) al 5% y 2 mM glutamina sin el agregado de antibióticos
(medio de cultivo celular). Las células fueron usadas entre los pasajes 1 y 15 y fueron divididas 1:10 o 1:4 dos
veces por semana. Para las inoculaciones de la monocapas, las placas de cultivo de 24 pocillos (Falcon; BectonDickinson) fueron sembradas con 500 μl de 1x104 o 1x105 células por pocillo. Para el análisis por microscopía,
las células fueron sembradas en placas de 6 o 24 pocillos conteniendo cubreobjetos de vidrio de 12 mm de
diámetro.
Los mismos procedimientos se utilizaron para cultivar la línea celular murina J774.A1. En este caso el
medio de cultivo utilizado fue RPMI 1640 (Gibco BRL) suplementado con suero fetal bovino 5% (Gibco BRL)
y 2 mM glutamina.
Las células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón (BMDC) se prepararon siguiendo el protocolo
descripto en (Inaba et al., 1992) a partir de fémures de hembras de 7-8 semanas de edad de la cepa C57BL/6. Las
células macrofágicas derivadas de médula ósea de ratón (BMDM) se prepararon a partir de fémures de hembras
de 7-8 semanas de edad de la cepa C57BL/6 según el protocolo descripto en de Chastellier et al. (1993).
Ensayos de infección en células
Las diferentes cepas de B. abortus fueron inoculadas en 5 ml de medio líquido TSB, con el agregado de
antibióticos según el requerimiento de cada una. Después de 18-20 hs de cultivo a 37°C y 250 rpm (fase
logarítmica), las bacterias fueron agregadas al medio de cultivo celular sin el agregado de antibióticos. Para las
células HeLa y JEG-3 se usó una multiplicidad de infección (MOI) 100-500:1 y para macrófagos J774 A.1,
BMDM y BMDC 20-50:1. El número de unidades formadoras de colonia (UFC) fue estimado por comparación
de la densidad óptica del cultivo a 600 nm contra una curva estándar y determinados por conteo retrospectivo.
En las placas de 24 pocillos (1x105 células/ pocillo) destinadas al ensayo de infección, el medio fue removido y
las células inoculadas con las bacterias resuspendidas en medio MEM o RPMI 1640 según el tipo celular. Para
asegurar un contacto estrecho entre las células y las bacterias, las placas fueron centrifugadas por 10 min. a
400 x g a temperatura ambiente e inmediatamente incubadas a 37ºC en atmósfera de CO2 al 5% (tiempo 0).
Luego de 20 minutos (macrófagos) ó 1 hora (HeLa) las células fueron lavadas con buffer fosfato salino (PBS
pH 7.4) y posteriormente se agregó medio fresco completo suplementado con 50 μg/ml de Gm y 100 μg/ml de
Materiales y Métodos - 97
estreptomicina para eliminar las bacterias no internalizadas. El medio de cultivo de células fue reemplazado a
las 24 horas por medio fresco con el agregado de gentamicina y estreptomicina. A los tiempos indicados postinfección, el número de bacterias intracelulares viables fue determinado de la siguiente forma: las monocapas
fueron lavadas 3 veces con buffer fosfato salino estéril (PBS pH 7.4), y las células fueron lisadas con Tritón X100 0.1% en agua bidestilada estéril durante 10 minutos. Los lisados fueron diluidos en forma seriada en PBS y
plaqueados en medio TSB-agar con los antibióticos apropiados. Las UFC fueron determinadas después de 3-4
días de incubación a 37ºC.
Ensayos de infección en ratones
La virulencia en ratones fue determinada por recuento de bacterias viables en el bazo de los animales
a diferentes tiempos post-infección. Ratones hembras de la línea BALB/c de aproximadamente 70 días de edad
fueron inyectados intraperitonealmente con 1x105 UFC de las diferentes cepas en 0.2 ml de solución 150 mM
NaCl. A diferentes tiempos post-infección los ratones fueron sacrificados, los bazos removidos y homogeneizados
en 2 ml de solución 150 mM NaCl estéril. El recuento de bacterias viables, en los inóculos de infección o en los
lisados de bazos, se determinó por dilución seriada y recuento de colonias en placas de TSB-agar, suplementadas
con antibióticos cuando fuera requerido. Las UFC fueron determinadas después de 3-4 días de incubación a
37ºC.
Construcción de los plásmidos pBCSP31-cyaA y pvirB-cyaA
El plásmido pDK51 (derivado de pBBR MCS-4, sin promotor lac, ver Tabla I) se digirió con las enzimas
EcoRI y SmaI y en esos sitios se clóno el promotor del operón virB o el del gen bcsp31. Los fragmentos de ADN
conteniendo estas secuencias se obtuvieron por amplificación por PCR usando como templado el ADN genómico
de B. abortus 2308 y los oligonucleótidos pVirEcoRI-pVirSmaI y pBCSP31EcoRI-pBCSP31SmaI,
respectivamente (ver Tabla III, pág. 111). Los plásmidos resultantes se digirieron con las enzimas XbaI y SacI
y en esos sitios se clonó el dominio catalítico de la toxina Adenilato Ciclasa de Bordetella pertussis (CyaA). La
secuencia de ADN que codifica para CyaA se amplificó por PCR usando como templado el plásmido pMS107
(Sory y Cornelis, 1994) y los oligonucleótidos CyAXbaI y CyASacI (ver Tabla III, pág. 111). Los plásmidos
resultantes se denominaron pvirB-cyaA y pBCSP31-cyaA (ver Fig. 18, Capítulo II).
Materiales y Métodos - 98
Construcción de las fusiones traduccionales a cyaA
Las secuencias de ADN que codifican para las proteínas de B. abortus seleccionadas para fusionar a
cyaA se amplificaron por PCR utilizando oligonucleótidos con los sitios de restricción BamHI y SpeI en sus
extremos (ver Tabla III, pág. 111). Los plásmidos pvirB-cyaA y pBCSP31-cyaA se digirieron con estas enzimas
y en estos sitios se clonaron en fase las secuencias de B. abortus. Los plásmidos obtenidos fueron secuenciados
utilizando el oligonucleótido primer 5´-CCTTCGCCACGGCCTTGATGC-3´ (complementario a la región 5´ del
gen cyaA) para verificar el marco de lectura correcto de las fusiones. Los plásmidos se introdujeron en la cepa
E. coli S17.1 (λpir) y luego se transfirieron a las cepas de B. abortus por conjugación biparental (Comerci et
al., 1998). Las transconjugantes se seleccionaron en placas con medio TSB suplementadas con ampicilina (50
μg/ml) y ácido nalidíxico (5 μg/ml).
Obtención de anticuerpos anti-CyaA
El fragmento de ADN que codifica para el dominio catalítico de la toxina adenilato ciclasa se amplificó
por PCR usando el plásmido pMS107 (Sory y Cornelis, 1994) como templado y los oligonucleótidos 5´CGGGATCCAATGCAGCAATCGCATCAGGCT-3
y
5´-
CGGAATTCTCACACCCCATCAAGGCTGTCATA-3´, conteniendo los sitios BamHI y EcoRI,
respectivamente. El fragmento de ADN amplificado se digirió con las enzimas BamHI y EcoRI y se ligó al
vector de expresión pTrcHisB (Invitrogen) digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante se introdujo
en la cepa de E. coli DH5α-F’IQ por transformación y se indujo la expresión de la proteína con 0.1 mM IPTG
durante 3 hs a 37°C. La proteína recombinante fusionada a un epítope de seis residuos de histidina se purificó
por cromatografía de afinidad a quelatos metálicos y se inyectaron en ratones utilizando un esquema estándar
de inmunización.
Análisis de expresión de las fusiones a cyaA por Western Blot
Las cepas de B. abortus 2308 conteniendo los plásmidos con las fusiones a cyaA se cultivaron en
medio TSB a 37°C y se cosecharon durante la fase estacionaria de la curva de crecimiento. Cantidades
equivalentes de proteínas se analizaron por SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Las proteínas se transfirieron a una
membrana de nitrocelulosa (Inmobilon-NC, Millipore) (Burnette, 1981) y se detectaron con una dilución 1:1000
del antisuero policlonal anti-CyaA. Luego se incubó con un anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón
Materiales y Métodos - 99
conjugado a peroxidasa de rábano (DAKO Corp.) y se reveló por quimioluminiscencia (Supersignal West Pico
chemiluminiscent substrate detection reagents, Pierce Chemical, Co) según las indicaciones del fabricante.
Detección de translocación al citoplasma del dominio CyaA
Para ensayar la translocación al citoplasma de las proteínas de fusión a CyaA se infectaron células de la
línea macrofágica J774.A1 con las cepas de B. abortus que expresan las fusiones. Las infecciones se realizaron
en placas de 96 pocillos (1x105 células/pocillo) y se usó una multiplicidad de infección 250:1. El resto de la
infección procedió de manera similar a la descripta anteriormente. A diferentes tiempos p.i. las células se lavaron
5 veces con PBS y se lisaron con el buffer de lisis provisto por el fabricante del kit usado para la cuantificación
del AMPc. Los lisados se usaron inmediatamente o se congelaron a -70ºC. Los niveles de AMPc intracelulares
se determinaron usando el kit cAMP Biotrak Enzymeimmunoassay (EIA) System (Amersham Biosciences,
RPN225) siguiendo las indicaciones del fabricante.
Alineamientos múltiples
Los alineamientos múltiples se realizaron con el programa MAFFT 4.0 (Katoh et al., 2002; Katoh et al.,
2005), disponible en http://www.ebi.ac.uk/.
Construcción de las cepas mutantes btp1-, btp2- y btp1btp2El fragmento de ADN que codifica para la proteína Btp1 fue amplificado por PCR con los oligonucleótidos
primers 5‘-caaaactctttcccgcatgcga-3´ y 5´-tcagataagggaatgcagttct-3´, y ligado al vector pGem-T-Easy (Promega).
El plásmido resultante se denominó pGemT-btp1. Por su parte, el fragmento de ADN que codifica para la
proteína Btp2 fue amplificado por PCR con los oligonucleótidos primers 5´-acgcgacctttccggctccctt-3´ y 5´ttcggctagacaggaatgcatg-3´. El producto de amplificación se ligó al vector pGem-T-Easy (Promega). El plásmido
resultante se denominó pGemT-btp2. Ambos plásmidos se linealizaron con la enzima EcoRV. En ese sitio se
clonó un cassette de resistencia a gentamicina o a kanamicina en pGemT-btp1 o en pGemT-btp2,
respectivamente. Los plásmidos obtenidos fueron electroporados en B. abortus, donde son incapaces de replicar
autónomamente, por lo que funcionan como vectores suicidas. Las colonias que sufrieron eventos de doble
recombinación homóloga fueron seleccionadas en placas TSB con el agregado de gentamicina o kanamicina y
repicadas en réplica a placas TSB con carbenicilina. Las colonias Gmr Cbs o KanrCbs fueron seleccionadas y
sometidas a análisis por PCR para confirmar que el gen salvaje había sido reemplazado por la copia interrumpida
Materiales y Métodos - 100
por el cassette con resistencia a antibiótico. Este procedimiento generó las mutantes btp1- y btp2-. Para generar
la cepa doble mutante btp1btp2-, el plásmido pGemT-btp2::Kan fue electroporado en la cepa btp1-. Las
colonias KanrCbs fueron seleccionadas y sometidas a análisis por PCR para confirmar que el gen btp2 había
sido reemplazado por la copia interrumpida por el cassette con resistencia a kanamicina.
Cuantificación de IL-12(p40/p70)
La cuantificación de esta citoquina en los sobrenadantes de células infectadas se hizo mediante un ELISA
(Abcys).
Medición de actividad Luciferasa
Células HEK293T fueron transfectadas transientemente con 0.4 μg de ADN: 50 ng de plásmidos TLR,
200 ng del plásmido reportero pBIIXLuc, 5 ng de Renilla luciferasa (pRL-null, Promega) y las cantidades indicadas
de c-Myc-Btp o c-Myc-PipB2. La cantidad total de ADN se mantuvo constante mediante el agregado de vector
vacío. Cuando fue necesario se agregó Pam2CSK4 (1 ng/μl) o CpG ODN1826 (10 μM) por 6 hs. Luego, las
células fueron lisadas y se midió la actividad luciferasa usando Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega).
Construcción de fusiones traduccionales al epítope 3xFLAG
El gen que codifica la proteína BAB2_0123 se clonó en fase con el epítope 3xFLAG en el plásmido
pBAD24-3xFLAG (Spano et al., 2008). Para esto, se amplificó el gen por PCR usando los oligonucleótidos
20123 BamHI (ver Tabla III, pág. 111) y 5´- CGCCATGGCTGCCTGTCCCGCCAGTTCAAC-3´ con el sitio
NcoI. El producto de amplificación digerido con las enzimas BamHI y NcoI se clonó en el plásmido pBAD243xFLAG digerido con las mismas enzimas. El fragmento de ADN conteniendo el gen ba20123 fusionado a
3xFLAG se escindió con las enzimas BamHI y XbaI y se ligó al pBBR MCS-4 digerido con las mismas
enzimas. El plásmido resultante se denominó pBBR-ba20123::3xFLAG-1 y se introdujo en la cepa E. coli
S17.1 (λpir). Luego se transfirió a las cepas B. abortus 2308 y B. abortus virB10::Kan por conjugación biparental
(Comerci et al., 1998). Las transconjugantes se seleccionaron en placas con medio TSB suplementadas con
ampicilina (50 μg/ml), ácido nalidíxico (5 μg/ml) y kanamicina (50 μg/ml) para la cepa mutante virB10::Kan.
Para generar la fusión de la proteína truncada (codones 25-153) al epítope 3xFLAG, se amplificó el ADN
usando los oligonucleótidos primers 5´-CGGGATCCATGGGCCGCAAGGCCAATGAA-3´ conteniendo al sitio
BamHI y 5´- CGCCATGGCTGCCTGTCCCGCCAGTTCAAC-3´ con el sitio NcoI. Los pasos de clonado y
Materiales y Métodos - 101
obtención de la cepa de B. abortus 2308 conteniendo el plásmido que codifica para la proteína de fusión
truncada (pBBR-ba20123::3xFLAG-25) fueron idénticos a los descriptos para la proteína completa.
Construcción de la cepa merodiploide B. abortus 2308 ba20123::3xFLAG
El fragmento BamHI-XbaI conteniendo el gen ba20123 fusionado a 3xFLAG se liberó por digestión con
estas enzimas del plásmido pBBR-ba20123::3xFLAG-1 y se ligó en el plásmido pK18mob sacB (Schafer et
al., 1994) digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante se introdujo en la cepa E. coli S17.1 (λpir)
y se transfirió a las cepas de B. abortus por conjugación biparental (Comerci et al., 1998). Las colonias kanr
sacarosas se analizaron por PCR para confirmar la integración sitio específica del fragmento ba20123::3xFLAG
en el cromosoma de B. abortus. La cepa 2308 ba20123::3xFLAG merodiploide conteniendo el plásmido pBBR4GFP se obtuvo por conjugación biparental con una cepa de E. coli S17.1 (λpir) que portaba este plásmido (D.J.
Comerci, sin publicar). Las transconjugantes se seleccionaron en placas con medio TSB suplementadas con
ampicilina (50 μg/ml), ácido nalidíxico (5 μg/ml) y kanamicina (50 μg/ml).
Microscopía de Inmunofluorescencia
A diferentes tiempos post-inoculación, los cubreobjetos fueron lavados 5 veces con PBS (pH 7.4) para
remover las bacterias no adherentes y fijados por 15 min. en paraformaldehído 3%, pH 7.4 a 37ºC. Luego, las
células fueron lavadas tres veces con PBS seguido por una incubación de 10 min. en PBS con NH4Cl 50 mM
para extinguir la fluorescencia debida a los grupos aldehído libres. Posteriormente, los cubreobjetos fueron
incubados con diluciones apropiadas de los anticuerpos primarios en PBS-10% suero de caballo-0.1% saponina
por 20 min. en cámara húmeda a temperatura ambiente. Para el anticuerpo anti-FLAG se usó una solución de
Tritón-X100 0.2% para permeabilizar las células. Después de este período, los cubreobjetos fueron lavados en
PBS-0.1% saponina (dos lavados) e incubados con la dilución apropiada de los anticuerpos secundarios en la
solución arriba descripta y siguiendo el mismo procedimiento. Luego de lavados seriales en PBS-0.1% saponina
(dos lavados), PBS y agua bidestilada, los cubreobjetos fueron montados en portaobjetos sobre gotas de Mowiol
(Aldrich) o FluorSave (Calbiochem) y dejados ON en oscuridad y a temperatura ambiente para permitir el
secado. Los preparados que no fueron analizados inmediatamente fueron guardados a 4ºC. Las muestras se
analizaron en un microscopio láser confocal Marca Zeiss modelo LSM510 (con un objetivo 63X) o en un
microscopio de epifluorescencia Nikon Eclipse E600 con un objetivo Plan Apo 100X. Las imágenes adquiridas
se procesaron con el programa Adobe Photoshop CS (Adobe Systems). Para determinar el porcentaje de macrófagos
Materiales y Métodos - 102
positivos para la marcación con anti-FLAG, se contaron 200 células infectadas. Por su parte, para determinar el
porcentaje de VCB que colocalizaban con FLAG, se contaron un mínimo de 200 bacterias intracelulares. Los
ensayos fueron realizados en duplicado.
Anticuerpos usados en Microscopía de Inmunofluorescencia
El antisuero policlonal de vaca anti-B. abortus 2308 fue obtenido mediante procedimientos estándar
(Pizarro-Cerda et al., 1998). FK2 fue adquirido en Biomol y para MHCII se usó un anticuerpo contra un epítope
citoplasmático conservado (Pierre et al., 1997). El anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 fue adquirido en
Sigma. El anticuerpo hecho en conejo anti-calreticulina fue adquirido en Affinity Bioreagents, Inc. Faloidinarodamina fue adquirido en Molecular Probes. El anticuerpo hecho en ratón anti el epítope c-Myc (9E10) fue
adquirido en Developmental Studies Hybridoma Bank, National Institute of Child Health and Human
Development (University of Iowa). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron: anticuerpo policlonal de
burro anti-IgG de vaca acoplado a FITC; anticuerpo de burro anti-IgG de ratón conjugado a Texas Red; anticuerpo
de cabra anti-IgG de ratón conjugado a Alexa-568; anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado a Alexa488, anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado a Alexa-488 y anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo
conjugado a Alexa-568. Todos los anticuerpos secundarios fueron adquiridos en Molecular Probes. Para la
tinción de ADN se usó DAPI (Sigma) o To-Pro3 (Invitrogen).
Análisis de expresión de las fusiones a 3xFLAG por Western Blot
Las cepas de B. abortus 2308 conteniendo fusiones a 3xFLAG se cultivaron en medio TSB a 37°C y
se cosecharon durante la fase estacionaria de la curva de crecimiento. Cantidades equivalentes de proteínas se
analizaron por SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa
(Inmobilon-NC, Millipore) (Burnette, 1981) y se detectaron con una dilución 1:4000 del anticuerpo monoclonal
anti-FLAG (M2) (Sigma). Luego, se incubó con un anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón conjugado
a peroxidasa de rábano (DAKO Corp.) y se reveló por quimioluminiscencia (Supersignal West Pico
chemiluminiscent substrate detection reagents, Pierce Chemical, Co) según las indicaciones del fabricante.
Detección de BAB_20123::3xFLAG en células infectadas por Western Blot
Aproximadamente 6x107 células de la línea J774.A1 se infectaron con las cepas B. abortus 2308
pBBR ba20123::3xFLAG-1 o virB10::Kan pBBR ba20123::3xFLAG usando una MOI 250:1. A las 4 hs
Materiales y Métodos - 103
p.i., las células se lavaron dos veces con PBS frío y se lisaron con 6 ml de un buffer PBS-0.2% saponina con
cocktail de inhibidores de proteasas (Sigma). Luego de 30 min. a 4°C (con agitación cada 5 min. aproximadamente)
las células se levantaron con rastrillo y los lisados se centrifugaron por 15 min. a 20.000 x g a 4°C. Las
fracciones insolubles se resuspendieron en buffer de muestra para SDS-PAGE. Las fracciones solubles se
filtraron por filtros de 0.22 μm de tamaño de poro para eliminar restos celulares y bacterias, y las proteínas de
estas fracciones se precipitaron con TCA 10% final a 4°C por 30 min. Luego de centrifugar a 18.000 x g por 20
min., los pellets se lavaron dos veces con acetona helada para eliminar los restos de TCA. Los pellets se
secaron y se resuspendieron en buffer de muestra para SDS-PAGE. En caso de ser necesario se neutralizó el
pH con una solución de NaOH 0.1M. Las proteínas de las fracciones solubles (proteínas translocadas al
citoplasma eucariota), insolubles y de los extractos totales de las cepas usadas para las infecciones, se analizaron
por 12,5%-SDS-PAGE (Laemmli, 1970) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Inmobilon-NC,
Millipore) (Burnette, 1981). Para el Western Blot se usó una dilución 1:4000 del anticuerpo anti FLAG (M2)
(Sigma). Luego se incubó con un anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa de
rábano (DAKO Corp.) y se reveló por quimioluminiscencia (Supersignal West Pico chemiluminiscent substrate
detection reagents, Pierce Chemical, Co) según las indicaciones del fabricante.
Construcción del plásmido pGemT-ba20123
Se amplificó por PCR el gen que codifica para BAB2_0123 usando como templado el ADN genómico
de B. abortus 2308 y los oligonucleótidos 20123 BamHI y 20123 SacII (ver Tabla III, pág. 111). El producto de
PCR se clonó en el vector pGem-T-Easy (Promega). El plásmido resultante se denominó pGemT-ba20123.
Obtención de anticuerpos anti-BAB2_0123
La secuencia de ADN que codifica para BAB2_0123 se escindió del plásmido pGemT-ba20123 por
digestión con las enzimas BamHI y PstI. El fragmento de ADN liberado se ligó al vector de expresión pQE30
(Qiagen) digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante se introdujo en la cepa de E. coli M15
(pREP4) (Qiagen) por transformación y se indujo la expresión de la proteína con 0.1 mM IPTG durante 3 hs a
37°C. La proteína recombinante fusionada a un epítope de seis residuos de histidina se purificó por cromatografía
de afinidad a quelatos metálicos y se inyectaron en ratones utilizando un esquema estándar de inmunización.
Materiales y Métodos - 104
Análisis de la expresión de BAB_20123 in vitro por Western Blot
La cepa merodiploide 2308 ba20123::3xFLAG se cultivó en medio TSB a 37°C y en distintos puntos
de la curva de crecimiento se tomaron alícuotas del cultivo para analizar la expresión de BAB_20123. Cantidades
equivalentes de proteínas se analizaron por 15%-SDS-PAGE (Laemmli, 1970) y se transfirieron a una membrana
de nitrocelulosa (Inmobilon-NC, Millipore) (Burnette, 1981). Para el Western Blot se usó una dilución 1:4000
del anticuerpo anti-FLAG (M2) (Sigma), una dilución 1:1000 del suero anti-BAB2_0123 y una dilución 1:1000
del anticuerpo monoclonal anti-RibH2 (Goldbaum et al., 1993) de B. abortus. Luego se incubó con un anticuerpo
secundario de cabra anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa de rábano (DAKO Corp.) y se reveló por
quimioluminiscencia (Supersignal West Pico chemiluminiscent substrate detection reagents, Pierce Chemical,
Co) según las indicaciones del fabricante.
Preparación de membranas totales
Se prepararon a partir de 100 ml de cultivo de las distintas cepas de B. abortus. Las células se cosecharon
por centrifugación a 8.000 x g durante 15 min. a 4°C, se resuspendieron en igual volumen de buffer 15 mM TrisHCl pH 8.0; 0.45 M sacarosa; 8 mM EDTA pH 8.0; 0.4 mg/ml lisozima y se incubaron durante 15 min. a 4°C.
Luego de centrifugar como en el paso anterior, las células se resuspendieron en 2 ml de buffer 50 mM Tris-HCl
pH 7.6; 5 mM MgCl2, 2 mM PMSF; desoxirribonucleasa I (Sigma) (punta de espátula). Las células resuspendidas
se lisaron por sonicación y se centrifugaron a 3.000 x g durante 15 min. a 4°C. El sobrenadante resultante se
ultracentrifugó a 200.000 x g durante 1h 30 min. a 4°C. Las membranas se resuspendieron en 200 μl de buffer
50 mM Tris-HCl pH 7.6; 1 mM PMSF y se conservaron a -20°C.
Construcción de las fusiones traduccionales ba20123-cyaA y cyaA-ba20123
Para generar deleciones amino-terminales de BAB2_0123 fusionadas en fase a CyaA, se usaron los
oligonucleótidos forward 25-20123, 42-20123, 77-20123 o 111-20123 y el oligonucleótido reverse 20123 SpeI
(ver Tabla III, pág. 111) en reacciones de PCR en las que se utilizó ADN de B. abortus 2308 como templado.
Los productos de amplificación digeridos con las enzimas BamHI y SpeI se clonaron en pBCSP31-cyaA. De
esta manera se generaron fusiones a partir de los codones 25, 42, 77 y 111 del gen ba20123 a cyaA. Los
plásmidos
obtenidos
fueron
secuenciados
utilizando
el
oligonucleótido
primer
5´-
CCTTCGCCACGGCCTTGATGC-3´ (complementario a la región 5´ del gen cyaA) para verificar el marco de
lectura correcto de las fusiones. Para generar la fusión que contiene el gen ba20123 en el extremo carboxilo
Materiales y Métodos - 105
terminal, se amplificó el gen por PCR usando los oligonucleótidos 20123 XbaI y 20123 SacII (ver Tabla III, pág.
111) y el producto de PCR digerido con XbaI y SacII se ligó en pBCSP31. El plásmido obtenido se digirió con
las enzimas BamHI y SpeI y en esos sitios se clonó el producto de amplificación por PCR del gen cyaA con los
oligonucleótidos CyA BamHI y CyA SpeI (ver Tabla III, pág. 111) a partir del templado pMS107 (Sory y
Cornelis, 1994). El plásmido obtenido fue secuenciado utilizando el oligonucleótido primer 5´TGCCGAGCGGACGTTCGAAGT-3´ (complementario a la región 3´ del gen cyaA). Los plásmidos se
introdujeron en la cepa E. coli S17.1 (λpir) y luego se transfirieron a la cepa B. abortus 2308 por conjugación
biparental (Comerci et al., 1998). Las transconjugantes se seleccionaron en placas con medio TSB suplementadas
con ampicilina (50 μg/ml) y ácido nalidíxico (5 μg/ml).
Construcción de la cepa mutante B. abortus ba20123::Kan
Se amplificó por PCR el gen que codifica para BAB2_0123 usando como templado el ADN genómico de
B. abortus 2308 y los oligonucleótidos 20123 BamHI y 20123 SpeI (ver Tabla III, pág. 111). El producto de
PCR se clonó en el vector pGem-T-Easy (Promega). El plásmido resultante se digirió con HindIII y los extremos
cohesivos resultantes se transformaron en extremos romos con T4 DNA polimerasa (New England Biolabs).
Un cassette de resistencia a kanamicina (kanr) digerido con HincII se ligó al sitio romo y el plásmido resultante
se electroporó en B. abortus 2308. Todos los plásmidos de la línea pGem-T son incapaces de replicar
autónomamente en Brucella por lo que funcionan como vectores suicidas. Las colonias que sufrieron eventos
de doble recombinación homóloga fueron seleccionadas en placas TSB con el agregado de kanamicina y repicadas
en réplica a placas TSB carbenicilina. Las colonias Kanr Cbs fueron seleccionadas y sometidas a análisis por
PCR para confirmar que el gen salvaje había sido reemplazado por la copia interrumpida por el cassette kanamicina.
Este procedimiento generó la cepa mutante B. abortus ba20123::Kan.
Ensayo de toxicidad en levaduras
El gen que codifica para BAB2_0123 se amplificó por PCR usando los oligonucleótidos primers 5´CGGGATCCATGAGCTTGTTGCTGGCTAAC-3´
(conteniendo
el
sitio
BamHI)
y
5´-
GCCTCGAGTCATGCCTGTCCCGCCAGTTC-3´ (conteniendo el sitio XhoI) y ADN genómico de B. abortus
2308 como templado. El producto de amplificación, digerido con BamHI y XhoI, se clonó en el plásmido
p416GAL1 (Mumberg et al., 1995) bajo el promotor GAL1, que se reprime con glucosa y se induce con
galactosa (Johnston y Davis, 1984). El plásmido resultante (p416GAL1-ba20123) y el plásmido vacío (p416GAL1)
Materiales y Métodos - 106
se transformaron en la cepa KVY117 (SEY6210 Δatg16::LEU2) (Suzuki et al., 2001). Para el ensayo de
toxicidad ambas cepas se cultivaron hasta fase estacionaria en 0.17% YNB (Difco), his, trp y lys (0.002% cada
uno) y glucosa 2%. A partir de estos cultivos se hicieron diluciones seriadas en PBS y se plaquearon en réplica
gotas de 10 μl en placas con glucosa 2% o galactosa 2%. Las placas se incubaron por 3 días a 30°C. Para el
análisis de las proteínas por Western Blot, la cepa conteniendo p416GAL1-ba20123 se cultivó hasta fase
estacionaria en 0.17% YNB (Difco), his, trp y lys (0.002% cada uno) y glucosa 2% o galactosa 2%. Los
extractos totales de proteínas se prepararon a partir de pellets correspondientes a 1 DO (600nm) lavados con 500
μl de agua y resuspendidos en 200 μl de NaOH 0.3 M por 10 min. a temperatura ambiente. Luego de centrifugar
a 13.000 x g por 5 min., los pellets se resuspendieron en buffer de muestra para SDS-PAGE. Las proteínas se
analizaron por 10% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Para el Western Blot se
usó una dilución 1:1.000 de un antisuero policlonal que reconoce a BAB2_0123 y una dilución 1:10.000 de un
anticuerpo secundario anti-IgG de ratón congujado a peroxidada de rábano (DAKO Corp., Carpintería, CA).
Se reveló por quimioluminiscencia (Supersignal West Pico chemiluminiscent substrate detection reagents, Pierce
Chemical, Co) según las indicaciones del fabricante.
Construcción de los plásmidos pMyc-ba20123 (1-153) y pMyc-ba20123 (25-153)
Se amplificaron las secuencias que codifican la proteína BAB2_0123 completa (codones 1-153) o
truncada (codones 25-153) usando como templado ADN genómico de B. abortus 2308 y los oligonucleótidos 5´CGGAATTCCAATGAGCTTGTTGCTGGCTAA-3´ (forward para la proteína completa) o 5´CGGAATTCCAGGCCGCAAGGCCAATGAAACC-3´ (forward para la proteína truncada) y el oligonucleótido
5´-GCCTCGAGTCATGCCTGTCCCGCCAGTTC-3´ (reverse para ambas) que poseen los sitios EcoRI o
XhoI. Los productos de amplificación fueron digeridos y clonados en el vector de expresión eucariota pCMVMyc (Clontech) digerido con las mismas enzimas. Los plásmidos resultantes se denominaron pMyc-ba20123
(1-153) y pMyc-ba20123 (25-153). Los plásmidos para los ensayos de transfección se purificaron a partir de
100 ml de cultivo usando columnas maxi-prep (Qiagen). La calidad del ADN se analizó por absorbancia a 260280 nm en cubetas de cuarzo.
Ensayos de transfección
Las células HeLa o COS-7 se transfectaron transientemente usando Fugene HD (Roche) de acuerdo a
las instrucciones del fabricante.
Materiales y Métodos - 107
Secuenciación
La secuenciación de ADN se llevó a cabo utilizando el secuenciador automático modelo ABI PRISM
377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer Applied Biosystems Division) según las indicaciones del fabricante.
Materiales y Métodos - 108
Tabla I. Cepas y Plásmidos
Cepas o plásmidos
Cepas
B. abortus
2308
virB1::Kan
virB10::Kan
'virB11
flgE::Gm
tf::Gm
btp1btp2btp1btp2ba20123::Kan
2308 pBBR ba20123::3xFLAG-1
2308 pBBR ba20123::3xFLAG-25
virB10::Kan
pBBR ba20123::3xFLAG
2308 ba20123::3xFLAG
2308 ba20123::3xFLAG
pBBR-GFP
E. coli
K12- DH5DF'Iq)
E. coli S17.1 (Opir)
E. coli M15 (pREP4)
Plásmidos
pBBR MCS-1
pBBR MCS-4
pRIBOTEX CAT
pGem-T-Easy
Características(*)
Salvaje, lisa, virulenta, Nalr
2308 Nalr Kanr, inserción de cassette Kanr
polar en virB1
2308 Nalr Kanr, inserción de cassette Kanr
polar en virB10
2308 Nalr Gmr, deleción de virB11 y
reemplazo por cassette no-polar
2308 Nalr Gmr, inserción de cassette Gm
no-polar en flgE
2308 Nalr Gmr, inserción de cassette Gm
no-polar en trigger factor (tf)
2308 Nalr Gmr, inserción de cassette Gmr
en btp1
2308 Nalr Kanr, inserción de cassette Kanr
en btp2
2308 Nalr Gmr Kanr, inserción de cassette
Gmr en btp1y Kanr en btp2
2308 Nalr Kanr, inserción de cassette Kanr
en ba20123
2308 Nalr Ampr, conteniendo pBBR4ba20123::3xFLAG-1
2308 Nalr Ampr, conteniendo pBBR4ba20123::3xFLAG-25
virB10::Kan Ampr, conteniendo pBBR4ba20123::3xFLAG-1
2308 Nalr Kanr, con gen ba20123
fusionado a 3xFLAG en el cromosoma
2308
ba20123::3xFLAG
Ampr,
conteniendo pBBR4-GFP
Fuente o
referencia
Stock del
Laboratorio
(Sieira et al.,
2000)
(Sieira et al.,
2000)
D.J. Comerci, sin
publicar
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
F')80dlacz'M15 '(lacZYA-argF)U169
deoR recA1 endA1hsdR17 (rK+mK+) phoA
supE44 O-thi-1 gyrA96 relA1/F'proAB+
LacIqZ'M15 zzf::Tn5 (Kanr)
Produce la proteína S necesaria para la
replicación de los plásmidos oriR6K (Nals)
Derivada de E. coli K12. NalS, StrS, RifS,
Thi–, Lac–, Ara+, Gal+, Mtl–, F–, RecA+,
Uvr+, Lon+
(Woodcock et al.,
1989)
Vector de clonado de amplio rango de
huésped, Cmr
Vector de clonado de amplio rango de
huésped, Ampr
Vector de expresión de Trypanosoma cruzi,
Cmr
(Kovach et al.,
1995)
(Kovach et al.,
1995)
(MartinezCalvillo et al.,
1997)
Promega
Vector de clonado, Ampr
(Herrero et al.,
1990)
Qiagen
Materiales y Métodos - 109
pUC19
pBluescript II KS (+/-)
pBluescript sacB/R
pTrcHisB
pQE30
pDK51
pCAT
pMS107
pBCSP31-cyaA
pvirB-cyaA
pBAD24-3xFLAG
pBBR-ba20123::3xFLAG-1
pBBR-ba20123::3xFLAG-25
pK18mob sacB
pBBR-GFP
pGemT-ba20123
p416GAL1
p416GAL1-ba20123
pCMV-Myc
pMyc-ba20123 (1-153)
pMyc-ba20123 (25-153)
pGFP-mCttn FL-2
Vector de clonado, Ampr
Vector de clonado, Ampr
Vector de clonado, con cassette sacB/R de
Bacillus subtilis en sitio PstI, Ampr
Vector de expresión, Ampr
Vector de expresión, Ampr
Derivado de pBBR MCS-4 sin el promotor
lac, Ampr
Fragmento BamHI-SacII del gen cat
clonado en pDK51 bajo el promotor del
gen bcsp31 de B. abortus, Ampr
Fragmento de 1.3Kpb conteniendo el gen
cyaA (nucleótidos 4-1216), clonado en
pIC20H, Ampr
Derivado de pDK51, conteniendo el gen
cyaA clonado bajo el promotor del gen
bcsp31 en los sitios XbaI-SacI, Ampr
Derivado de pDK51, conteniendo el gen
cyaA clonado bajo el promotor del operon
virB en los sitios XbaI-SacI, Ampr
Derivado de pBAD24, conteniendo la
secuencia que codifica para 3xFLAG,
Ampr
Fragmento BamHI-XbaI conteniendo el
gen ba20123 fusionado a 3xFLAG,
clonado en pBBR MCS-4, Ampr
Fragmento BamHI-XbaI conteniendo el
gen ba20123 truncado y fusionado a
3xFLAG, clonado en pBBR MCS-4, Ampr
pUC18 movilizable (Kanr) con gen sacB de
Bacillus subtilis
Fragmento EcoRI-KpnI conteniendo el gen
gfp clonado en pBBR MCS-4, Ampr
Fragmento BamHI-SacII conteniendo el
gen ba20123, clonado en pGem-T-easy,
Ampr
Vector de expresión para levaduras, con
promotor GAL1, Ampr
Fragmento BamHI-XhoI conteniendo el
gen ba20123 clonado en p416GAL1, Ampr
Vector de expresión eucariota, Ampr
Fragmento EcoRI-XhoI conteniendo el gen
ba20123, clonado en pCMV-Myc, Ampr
Fragmento EcoRI-XhoI conteniendo el gen
ba20123 (versión truncada), clonado en
pCMV-Myc, Ampr
gen que codifica para la Cortactina murina
clonado en pEGFP-C1, Kanr
Stratagene
Stratagene
(Sieira et al.,
2004)
Invitrogen
Qiagen
Este trabajo
Este trabajo
(Sory y Cornelis,
1994)
Este trabajo
Este trabajo
(Spano et al.,
2008)
Este trabajo
Este trabajo
(Schafer et al.,
1994)
D.J. Comerci, sin
publicar
Este trabajo
(Mumberg et al.,
1995)
Este trabajo
Clontech Labs.
Este trabajo
Este trabajo
(Weed et al.,
2000)
(*) Ampr, resistencia a ampicilina; Gmr, resistencia a gentamicina; Nalr, resistencia a ácido nalidíxico;
Kmr, resistencia a kanamicina; Cmr, resistencia a cloranfenicol.
Materiales y Métodos - 110
Tabla II. Oligonucleótidos utilizados para la obtención de anticuerpos.
Oligonucleótido
Secuencia *
Sitio de
restricción
p79 forward
cgggatccaATGGGTGGAACTGAAATG
BamHI
p79 reverse
cccaagcttTCACGAAAGAAGGAACCAGGC
HindIII
p84 forward
cgggatccaATGCCGGGTGCAATAAAC
BamHI
p84 reverse
cccaagcttTCAGAGATCGACGTCGAGAAT
HindIII
FlgE forward
cgggatccaATGAGCCTCTACGGTATG
BamHI
FlgE reverse
cccaagcttTTATCTCTTCAGATTAACCAG
HindIII
Intimina forward acggatcccGTGGGGCAGGGGGTTACT
BamHI
Intimina reverse
cccaagcttTTATGTAAAATTAAAGTTTCGGCTATT
HindIII
TF forward
cgggatccaATGACAAGAAGTGAAGGT
BamHI
TF reverse
cccaagcttTCAAGCCTCTTCGGACTTGCC
HindIII
* Las secuencias se muestran en sentido 5´-3´. La secuencia en letra minúscula corresponde al
sitio de restricción, con el agregado de dos nucleótidos en el extremo 5´ y un nucleótido antes
del codón de inicio para que se genere una fusión en fase al tracto de histidinas del vector
pTrcHisB.
Materiales y Métodos - 111
Tabla III. Oligonucleótidos utilizados para la construcción de fusiones traduccionales a cyaA.
Oligonucleótido
Secuencia *
virB2 BamHI
virB2 SpeI
virB6 BamHI
virB6 SpeI
virB7 BamHI
virB7 SpeI
FlgE BamHI
FlgE SpeI
CyA XbaI
CyA SacI
CyA BamHI
CyA SpeI
pVir EcoRI
pVir SmaI
pBCSP31 EcoRI
pBCSP31 SmaI
10891 BamHI
10891 SpeI
10279 BamHI
10279 SpeI
10756 BamHI
10756 SpeI
11720 BamHI
11720 SpeI
20413 BamHI
20413 SpeI
20245 BamHI
20245 SpeI
11865 BamHI
11865 SpeI
20123 BamHI
20123 SpeI
20123 XbaI
20123 SacII
25-20123
42-20123
77-20123
111-20123
cgggatccATGAAAACCGCTTCCCCCAGC
ggactagtCCTAAGCAGGTAAGAGGCAAT
cgggatccATGGTTAATCCTGTAATCTTT
ggactagtATCCCTGTTGAACTGGCCGAG
cgggatccATGAAAAAGGTAATCCTTGCT
ggactagtGTCCTCGTAAGTGTCAACGGG
cgggatccATGAGCCTCTACGGTATGATG
ggactagtTCTCTTCAGATTAACCAGCAC
gctctagaATGCAGCAATCGCATCAGGCT
cgagctcTCACACCCCATCAAGGCTGTCATA
cgggatccATGCAGCAATCGCATCAGGCT
cgactagtAAGGCTGTCATAGCCGGAATCCTGGC
cggaattcATGACAGGCATATTTCAACGC
tcccccgggATCGTCTCCTTCTCAGAGAAT
cggaattcAAGCGATTGTATTCTT
tccccgggAATACCAGTCCTCTTC
cgggatccATGCGTAGTCGCAGTTTTTCA
ggactagtGTAACTGCCTTTTACAGCGTA
cgggatccATGTCTAAAGAGAAACAAGCC
ggactagtGATAAGGGAATGCAGTTCTTT
cgggatccGTGCCATGTACATTCGACCTG
ggactagtGGTGATGAGGGCGACGCGCTC
cgggatccTTGTTGCGACATTTCCTCCAG
ggactagtGCGTATGCGCAGATTATTGGC
cgggatccATGCAGGATTTGAGCCAGACG
ggactagtTTTGTTCTTTTCGAGCAGGAG
cgggatccATGCCTACCGTTGCACCGTTC
ggactagtCTCATTCAACGGAACCACGCC
cgggatccATGACTGACCTGATTCACATA
ggactagtGCGAAAGCGGCCCAAAAACGC
cgggatccATGAGCTTGTTGCTGGCTAAC
ggactagtTGCCTGTCCCGCCAGTTCAAC
gctctagaATGAGCTTGTTGCTGGCTAAC
tccccgcggTCATGCCTGTCCCGCCAGTTC
cgggatccATGGGCCGCAAGGCCAATGAA
cgggatccATGGTCGCGGCCGCGTCAAAC
cgggatccATGACGCAGCGCGTGCGCCGT
cgggatccATGACGCCGCCACCCCGGCAG
Sitio de
restricción
BamHI
SpeI
BamHI
SpeI
BamHI
SpeI
BamHI
SpeI
XbaI
SacI
BamHI
SpeI
EcoRI
SmaI
EcoRI
SmaI
BamHI
SpeI
BamHI
SpeI
BamHI
SpeI
BamHI
SpeI
BamHI
SpeI
BamHI
SpeI
BamHI
SpeI
BamHI
SpeI
XbaI
SacII
BamHI
BamHI
BamHI
BamHI
* Las secuencias se muestran en sentido 5´-3´. La secuencia en letra minúscula corresponde al
sitio de restricción, con el agregado de dos nucleótidos en el extremo 5´.
APÉNDICE
Apéndice - 112
,OG5&#MLHSPI
,OG5&#MLHSPI
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#
' Y!
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YA
!
Figura A. Replicación intracelular de las cepas que expresan las proteínas de fusión a CyaA y de la cepa que expresa
el dominio CyaA sin fusionar. Las células tipo macrofágicas J774 A.1 se lisaron a las 4, 24 y 48 hs p.i. y se contaron las
UFC/ml según se describe en Materiales y Métodos. A: BAB1_0756; B: BAB1_0279; C: BAB1_1865; D: BAB2_0123;
E: BAB1_1720; F: BAB1_0891; G: BAB2_0413; H: BAB2_0245. Los valores son representativos de dos experimentos
independientes.
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