universidad austral de chile facultad de ciencias veterinarias

universidad austral de chile facultad de ciencias veterinarias

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
INSTITUTO DE CIENCIAS CLÍNICAS VETERINARIAS
USO DE CÉLULAS MADRE DE ORIGEN ADIPOSO PARA EL
TRATAMIENTO DE TENDINITIS Y DESMITIS EN EQUINOS:
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.
Memoria de Título presentada como parte de
los requisitos para optar al TÍTULO DE
MÉDICO VETERINARIO
CARLA STEPHANY OTONDO CASACUBERTA
VALDIVIA - CHILE
2012
PROFESOR PATROCINANTE
PROFESOR COPATROCINANTE
PROFESORES INFORMANTES
_____ ________________________________
Dr. Bruno Carvalho Menarim
_____ ________________________________
Dr. Hedie Bustamante Díaz
_____________________________________
Dr. Gabriel Morán Ruz
_____ ________________________________
Dr. Francicsco Morera Galleguillos
FECHA DE APROBACIÓN: 28 de junio de 2012
A mis padres y hermana
por su apoyo incondicional.
A mi familia, amigos y profesores
por acompañarme en este camino.
ÍNDICE
Capítulos
Página
1. RESUMEN…………………………………………………………………….
1
2. SUMMARY…………………………………………………………………….
2
3. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….
3
4. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………..
6
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………
8
6. REFERENCIAS………………………………………………………………
18
7. ANEXOS………………………………………………………………………
22
8. AGRADECIMIENTOS………………………………………………………… 24
1
1. RESUMEN
Las afecciones de ligamentos y tendones, representan la causa más prevalente de
claudicación en equinos. Por muchos años la gran cantidad de tratamientos existente no ha
provocado la resolución de estas lesiones, reflejándose en recidivantes manifestaciones clínicas.
Actualmente, se conoce que las células madre extraídas de tejidos como médula ósea, grasa,
células del cordón umbilical, embriones o tejido tendíneo han aportado a la reparación de
tendones y ligamentos, disminuyendo la ocurrencia de recidivas.
El objetivo de este estudio fue realizar una revisión bibliográfica referente al uso las
células madre derivadas de tejido adiposo en el tratamiento de tendinitis y desmitis en equinos.
Para llevarlo a cabo se realizó la búsqueda de información en los libros disponibles en la biblioteca
central de la Universidad Austral de Chile y en las bases datos Pub Med, Science Direct y Wiley.
Cabe destacar que se incorporó en este estudio el material bibliográfico publicado entre los años
2000 y 2011. Se incluyó el uso de reportes de casos clínicos publicados en la página web del
Servicio Internacional de Información Veterinaria (IVIS) y en la página web de la empresa Vet
Stem ®. Del total de estudios citados en esta revisión bibliográfica, la mayor parte correspondió a
publicaciones procedentes de revistas científicas, seguidos de anales de congresos y libros. Al
desglosarse este material, se clasificó según la temática de enfoque general que cada uno exponía y
se determinó que las principales temáticas correspondieron a Generalidades de tendinitis,
Generalidades de desmitis y Células madre de tejido adiposo.
Las células madre son efectivas en el tratamiento de afecciones tendíneas y ligamentares
en equinos, pues tienen la capacidad de adquirir ciertas características fenotípicas y funcionales
como respuesta a los cambios y estímulos del microambiente donde sean implantadas, lo que se
conoce como habilidad de plasticidad. Pueden dar origen a tejidos como tendón y ligamento.
Mediante el uso de células madre provenientes de tejido adiposo para el tratamiento de lesiones
tendíneas y ligamentares, se busca producir el reemplazo del tejido dañado por un tejido similar al
original (constituido principalmente por colágeno tipo I, el cual le otorga resistencia). Por este
motivo, este tratamiento es más ventajoso que los tratamientos convencionales ya que éstos
producen el reemplazo del tejido dañado por tejido cicatricial, el cual posee una mayor proporción
de colágeno tipo III, lo que aumenta las posibilidades de recidivas. En caballos deportistas que
han sufrido lesiones en estos tejidos blandos y han sido tratados con este tipo de células madre se
ha reportado entre 60% y 85,9% de retorno a las actividades previas a la lesión y alrededor de
26% de recidivas. Los conocimientos sobre el comportamiento de las lesiones de los tendones y
ligamentos del caballo han permitido desarrollar nuevas estrategias para el desarrollo de
tratamientos más eficientes para estas afecciones
Palabras clave: desmitis, equino, medicina regenerativa, tendinitis, terapia celular.
2
2. SUMMARY
THE USE OF ADIPOSE DERIVED STEM CELLS FOR THE TREATMENT OF
EQUINE TENDINITIS AND DESMITIS
A REVIEW
Disorders of ligaments and tendons represent the most prevalent cause of lameness in
horses. For many years the large number of existing treatments, have not resolved these type of
injuries, leading to recurrent clinical manifestations. Nowadays it is known that stem cells taken
from tissues such as bone marrow, fat, umbilical cord cells, embryos or tendinous tissue have
contributed to the repair of tendons and ligaments, reducing the occurrence of relapses.
The aim of this study was to execute a bibliographical review regarding the
use of adipose tissue derived stem cells for the treatment of equine tendinitis and desmitis. To
accomplish this, information was searched in books available in the library of the Universidad
Austral of Chile and in databases such as PubMed, Science Direct and Wiley. It is important to
mention, that bibliographic material for this study was |published between years 2000 and 2011.
Clinical case
reports
published on
the
websites of
the International
Veterinary
Information Service (IVIS) and the company Vet Stem ® were included. Of all the studies quoted
in this review, most correspond to publications proceeding from scientific Journals, followed by
congresses’ proceedings and books. When itemized, this material was classified according to the
subject matter of general approach that each one was exposing. The main subjects corresponded
to Generalities of tendinitis, Generalities of desmitis and Adipose derived stem cells.
Stem cells are effective in treating tendon and ligament injuries in horses, since they have
the ability to acquire certain phenotypic and functional changes, in response to stimuli and the
microenvironment where they are implanted, which is known as plasticity. They can
generate tissues such as tendon and ligament. The use of stem cells from adipose tissue to
treat tendon and ligament injuries, conduces the replacement of the damaged tissue by a tissue
similar to the original (composed mainly of type I collagen, which gives resistance). Therefore,
this treatment is more advantageous than conventional treatments, as they produce the
replacement of damaged tissue by scar tissue, which has a higher proportion of type III collagen
and increases the chances of relapses. For sport horses which have suffered injury in these soft
tissues and have been treated with this type of stem cells, it has been reported that between 60%
and 85.9% return to perform at pre-injury levels and about 26% presented recurrences. Available
information regarding the behavior of tendon and ligament injuries in horses has allowed to
development of new strategies for more effective treatments for such conditions.
Keywords: cell therapy, desmitis, horses, regenerative medicine, tendinitis.
3
3. INTRODUCCIÓN
Se ha estimado que la población mundial de equinos es de alrededor de 58 millones de
ejemplares, siendo EE. UU. de América el país con mayor cantidad de estos animales (cerca de
9.500.000). El impacto directo de la industria ecuestre en este país se ha estimado en US$ 39
billones (Deloitte 2005). Actualmente, en Chile existen alrededor de 304.000 cabezas de ganado
equino, 120.000 de las cuales se ubican en las regiones de Bío-Bío, Araucanía, Los Ríos y Los
Lagos (INE 2007). Estos concentran sus actividades tanto en el área deportiva (carreras, rodeo,
enduro y polo) como también en las áreas de recreación y trabajo. Debido a la magnitud de los
montos financieros que implica la actividad, existe actualmente una alta preocupación respecto al
impacto económico que genera este mercado (Mora 2011).
Los equinos deportistas están expuestos a sufrir lesiones músculo esqueléticas pertinentes
a su modalidad. Estas lesiones, que llevan al equino deportista tanto a un compromiso de su vida
como a una disminución de su rendimiento deportivo, adquieren una gran relevancia en la
industria ecuestre, lo que hace muy importante el acabado conocimiento de las mismas (Kane y
col 2000, Ross 2003). La exitosa identificación, manejo y prevención de afecciones en equinos
deportistas requiere un completo entendimiento de las demandas de cada disciplina deportiva y la
forma en que estas alteraciones se manifiestan, con objeto de minimizar las pérdidas económicas
que éstas implican (Dyson 2002). Al respecto, se ha señalado que las claudicaciones son el
problema de mayor prevalencia en estos animales, afectando a todas las razas, edades, actividades
y género (Ross 2003). Dentro de las causas más comunes de claudicación de inicio agudo se
encuentra la tendinitis del tendón flexor digital superficial (TFDS) en el miembro anterior y la
desmitis del ligamento accesorio del tendón flexor digital profundo (TFDP) (Dyson 2002).
En caballos de carreras, el TFDS, el ligamento suspensor (LS) y el ligamento accesorio del
TFDP, son los tejidos blandos que con mayor frecuencia se ven comprometidos en episodios de
claudicación (Smith y Goodship 2004). El TFDS está involucrado en un rango de 8 a 30% de
episodios de claudicación en caballos de esta modalidad (Nixon y col 2008). Se ha reportado que
en estos animales en Estados Unidos, el TFDS es afectado en un 93% de las lesiones de tejidos
blandos de la zona distal de las extremidades, estando 97% de estas lesiones ubicadas en los
miembros anteriores (Dahlgren 2007). En otras modalidades como adiestramiento (Dyson 2002)
y Rodeo Chileno (Mora 2011) entre las causas más comunes de disminución del desempeño en
equinos, se encuentra la desmitis de la porción proximal del LS. En el caso de animales
pertenecientes a esta última modalidad deportiva, se ha reportado que las afecciones de tendones
y ligamentos representan en conjunto un 28,2 % de las causas de claudicación encontrándose el
LS como la estructura afectada en mayor medida (14%), seguido del TFDP (7%) (Mora 2011).
Posterior a una lesión en un tendón o ligamento, se forma una cicatriz que reemplaza el
tejido dañado. Esta es menos funcional que el tejido normal del tendón o ligamento, ya que
cuenta con una mayor proporción de colágeno tipo III, el cual es funcionalmente inferior al
colágeno tipo I que conforma originalmente los tejidos anteriormente nombrados (Davis y Smith
2006). Esto se traduce en una menor resistencia del tendón o ligamento y riesgo sustancial de una
4
nueva lesión. A fin de minimizar esta consecuencia adversa, el tratamiento ideal debe tener como
objetivo evitar la formación excesiva de tejido fibroso y reparar la matriz del tendón (Smith y
Goodship 2004). La introducción de terapias regenerativas como el uso de células madre ofrece
posibles soluciones para una variedad de enfermedades degenerativas en los equinos, debido a su
capacidad de regenerar tejidos dañados como tendones y ligamentos (Clegg y Pinchbeck 2011).
Durante la última década, las investigaciones se han centrado en la medicina regenerativa
celular para el tratamiento clínico de afecciones en humanos y animales. El propósito de la terapia
celular regenerativa en este caso es reducir la formación de cicatrices o regenerar el tejido herido y
que éste vuelva a la normalidad y funcionalidad (Stewart 2010). Las células madre tienen dos
propiedades importantes: producen células que se pueden diferenciar en diversos linajes y tienen
capacidad de autorrenovación. Según su capacidad de diferenciación, las células madre pueden
ser clasificadas en totipotenciales, las cuales son capaces de producir tejido embrionario y
extraembrionario; pluripotenciales, las que pueden generar células diferenciadas a cualquier linaje
celular de las tres capas embrionarias y multipotenciales que son células con capacidad limitada de
diferenciación en un órgano o tejido específico (Fortier 2005). También pueden ser clasificadas
según su origen en dos grandes grupos: embrionarias y adultas. Las embrionarias se derivan de las
células del blastocisto, las cuales tienen el potencial de diferenciarse en todas las líneas celulares
(totipotenciales). Las células madre adultas son poblaciones celulares menores que se encuentran
en los órganos de animales adultos y no tienen el potencial de formar un organismo completo,
pero se pueden diferenciar en líneas celulares específicas. La células madre mesenquimales (MSC)
pertenecen a este grupo (Fortier 2005, Estrada y Venegas 2007, Fortier 2007). Algunas de estas
células actúan como constructores de tejido, mientras que otras pueden modular el sistema
inmune y reducir la inflamación (Smith y Goodship 2004, Stewart 2010).
La mayoría de los autores que han realizado estudios sobre terapia celular regenerativa se
han centrado en las células derivadas de la médula ósea (Stewart 2010). Sin embargo, para el
tratamiento de lesiones de tendones y ligamentos en equinos se han aplicado además las siguientes
alternativas para la extracción de estas células: tejido adiposo (Estrada y Venegas 2007), cordón
umbilical, embriones y tejido tendíneo (Alves y col 2011, Gutiérrez Nibeyro 2011).
El tejido adiposo se origina del mesodermo, similar a la médula ósea y contiene un
estroma que puede ser fácilmente aislado (Vernette y col 2007). Esta fracción vascular estromal de
tejido adiposo consiste en una mezcla heterogénea de células, incluyendo células endoteliales,
células musculares inmaduras, fibroblastos, mastocitos y pre-adipocitos (Oedayrajsingh-Varma y
col 2006, Yanamoto y col 2007), además de un conjunto de células madre que pueden ser
inyectadas directamente en lesiones o ser cultivadas para su propagación (en caso de que se quiera
aumentar la cantidad de estas). Una vez que las células madre han sido extraídas y cultivadas, se
procede a su implantación intralesionalmente en el tendón o ligamento (Nixon y col 2008).
Posterior a la recuperación, al evaluarse histológicamente lesiones tratadas con estas células, se ha
demostrado la presencia de tejido de reparación más organizado comparado con tejido de
reparación de lesiones que no han recibido este tratamiento (Carvalho y col 2011).
Estos antecedentes postulan a las células madre extraídas de tejido adiposo como una
alternativa para el tratamiento de lesiones tendíneas y ligamentares en equinos de deporte. Se
procede a realizar la siguiente revisión bibliográfica con el fin de aclarar información expuesta en
5
los medios de información disponibles y en empresas que comercializan estos productos en base a
criterios científicos.
3.1 OBJETIVOS
3.1.1 OBJETIVO GENERAL
Realizar una revisión del material bibliográfico referente al uso de las células madre de
origen adiposo en el tratamiento de tendinitis y desmitis en equinos.
3.1.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Obtener y seleccionar información a cerca de la anatomofisiología de tendones y
ligamentos, la respuesta de estos a la injuria y a tratamientos convencionales.
2) Obtener y seleccionar información concerniente al uso de células madre derivadas de
tejido adiposo como tratamiento de tendinitis y desmitis en equinos.
3) Destacar las potencialidades de la terapia celular de origen adiposo y aspectos de su
aplicación a tendinitis y desmitis en equinos.
4) Describir e interpretar los hallazgos clínicos, imagenológicos e histológicos de la aplicación
de células madre de origen adiposo en el tratamiento de tendinitis y desmitis en equinos.
6
4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.1 OBTENCIÓN Y SELECCIÓN DE MATERIAL BIBLIOGRÁFICO
La localización del material bibliográfico se realizó mediante la búsqueda en las bases de
datos disponibles en la biblioteca de la Universidad Austral de Chile utilizando las bases datos
PubMed1, Science Direct2 y Wiley3, además de libros disponibles en dicho establecimiento. Se
incluyó el uso de reportes de casos clínicos publicados en la página web del Servicio Internacional
de Información Veterinaria4 (IVIS) y en la página de la empresa Vet Stem ®5.
4.1.1 Criterio de exclusión:
Se consideraron en este estudio los reportes realizados entre los años 2000 y 2011. Para la
localización de los artículos en las bases de datos, fueron utilizados los siguientes términos:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Células madre mesenquimales/ Mesenchymal stem cells
Desempeño/ Performance
Desmitis/ Desmitis
Lesión tendínea/ Tendon injury
Ligamento/ Ligament
Recuperación/ Recovery
Ruptura/ Rupture
Tejido/ Tissue
Tejido adiposo/ Adipose tisssue
Tendinitis/ Tendonitis
Tendón/ Tendonitis
Terapia celular/ Cell therapy
Tratamiento/Treatment
La revisión de los artículos publicados se realizó sobre la base de título, autor(es), fecha de
publicación y resumen. Los criterios de selección para la búsqueda de artículos fueron:
• Equinos/ Equine.
• Medicina Equina/Equine Medicine
1
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
http://www.sciencedirect.com/science/browse/a/fulltext
3
http://www.wiley.com/WileyCDA/
4
http://www.ivis.org/home.asp
5
http://www.vetstem.com/
2
7
4.2 PRESENTACIÓN DE RESULTADOS
En el presente estudio, los resultados obtenidos se presentan en una tabla, en la cual se
clasifica el material bibliográfico utilizado (revistas, libros, anales de congresos y memorias de
título), según la temática abordada en cada una de las referencias. Las temáticas según las cuales se
clasifica el material bibliográfico corresponden a:
-Generalidades de tendinitis.
-Generalidades de desmitis.
-Generalidades de células madre.
-Células madre de tejido adiposo.
-Tratamiento de tendinitis y desmitis con células madre
-Tratamiento de tendinitis y desmitis con células madre extraídas de tejido adiposo.
8
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Al realizar la búsqueda del material bibliográfico, el número de referencias encontradas fue de
84. Posterior a aplicación de los criterios de exclusión, el material bibliográfico consultado incluye:
•
•
•
•
•
•
Reportes científicos: 29
Las revistas más utilizadas fueron Veterinary Clinics Equine, Clinical Techniques in Equine
Practice, Journal of Equine Veterinary Science, Veterinary Surgery y Equine Veterinary Journal.
Libros: 6
Anales de Congresos: 3
Memorias de título: 1
Censo Agropecuario: 1
Cuadro N°1. Agrupación de referencias utilizadas.
REVISTAS
LIBROS ANALES
MEMORIA TOTAL
Generalidades de tendinitis
10
6
1
1
18
Generalidades de desmitis
4
6
1
1
12
Generalidades de células madre
4
0
2
0
6
Células madre de tejido adiposo
Tratamiento de tendinitis y desmitis con
células madre
Tratamiento de tendinitis y desmitis con
células madre extraídas de tejido adiposo.
7
0
0
0
7
5
0
0
0
5
6
0
0
0
6
36
12
4
2
54
Total
Como se aprecia en el Cuadro Nº1, de acuerdo a los términos y criterios de búsqueda, los
temas ‘’Generalidades de tendinitis’’ y ‘’Generalidades de desmitis’’ cuentan con mayor cantidad
de resultados según las publicaciones científicas seleccionadas, mientras que “Tratamiento de
tendinitis y desmitis con células madre’’ y “Tratamiento de tendinitis y desmitis con células madre
extraídas de tejido adiposo” correspondieron a las temáticas con menor cantidad de resultados
9
según el material bibliográfico seleccionado. Queda claro que, según los criterios de selección
utilizados en la presente investigación, hacen falta más estudios que aborden esta materia, ya que
solo a través de investigaciones experimentales y clínicas se podrá conocer el valor real de estas
terapias regenerativas. Si bien es cierto, el número 54 que figura como total de las referencias es
mayor al número autorizado para la realización de Revisiones Bibliográficas, este factor se debe a
que, algunas de las referencias bibliográficas fueron clasificadas en más de una temática.
5.1. ANATOMOFISIOLOGIA TENDÍNEA Y LIGAMENTAR
Los tendones y ligamentos son estructuras muy parecidas desde el punto de vista ultra
estructural. Los tendones son la continuación de los músculos y están formados por una trama de
colágeno que da soporte a las fibras musculares contráctiles. Aparecen como bandas o cordones
blancos de tejido conectivo denso que conectan el vientre muscular a un elemento esquelético
distal. El corte transversal de una superficie tendinosa revela la presencia fascículos y septos
interfasciculares. Los fascículos varían en tamaño y forma y funcionan de manera independiente.
Están formados por fibrillas y éstas a su vez por subfibrillas. Las subfibrillas están compuestas por
microfibrillas de tropocolágeno, las cuales a su vez se conforman por varias moléculas de
colágeno superpuestas (Thorpe y col 2010) (Figura 1). La molécula de colágeno está formada por
tres cadenas de polipéptidos enrolladas en forma de superhélice (Dahlgren 2007). Normalmente,
tendones y ligamentos están constituidos por un 65% a 70% de agua. El colágeno constituye un
80% del peso seco, del cual más del 95% corresponde a colágeno tipo I en tendones (Wang 2006)
y cerca del 85% en ligamentos (Dahlgren 2007). Las fibras están orientadas principalmente en
forma longitudinal, aunque también pueden orientarse en forma transversal y en forma de
espirales (Sharma y Maffulli 2006). El resto del colágeno que forma parte de tendones y
ligamentos corresponde en su mayor parte a colágeno tipo III (Wang 2006) con una pequeña
cantidad de otros tipos de colágeno. Las alteraciones del total de contenido de colágeno y la
distribución de los tipos de colágeno afectan las propiedades biomecánicas de estas estructuras.
En cuanto a sus elementos celulares, los tendones se componen de tenoblastos y tenocitos
inmersos en una matriz extracelular. En conjunto, tenoblastos y tenocitos constituyen entre un 90
y 95% de los elementos celulares del tendón. El 5- 10 % restante lo constituyen condrocitos,
células sinoviales y células capilares (Sharma y Maffulli 2006).
Los tendones trasmiten las fuerzas para mover el esqueleto equino y proveen soporte a la
zona distal de los miembros como es el caso de los tendones flexores digitales (Ferraro y col 2003,
Davis y Smith 2006). Cuando están sanos, presentan un color blanco brillante y tienen una
estructura fibroelástica (Sharma y Maffulli 2006). Funcionan al borde de su límite funcional
durante el ejercicio intenso (Davis y Smith 2006). Al extenderse, los tendones lo hacen bajo una
fuerza pequeña lo que se asocia a la extensión de los fascículos. Esto se conoce como el límite
elástico y se cree que deriva del deslizamiento de las fibras de colágeno. Si la carga continúa más
allá de ese punto el tendón se rompe, lo que ocurre a los 12 kilonewtons (resistencia a la tracción)
en el caso del TFDS (Davis y Smith 2006). Esta ruptura puede deberse también a una
acumulación de micro lesiones producto de ejercicio intenso y la edad avanzada. Los ligamentos
son estructuras que alinean y estabilizan los huesos adyacentes, mantienen la integridad de las
10
articulaciones y ofrecen una resistencia pasiva al movimiento. Son sometidos a fuerzas que van en
variadas direcciones en función de la amplitud del movimiento de las articulaciones (Dahlgren
2007).
Figura 1: Esquema de la conformación de un tendón. Modificado de Thorpe y col (2010)
5.2 TENDINITIS Y DESMITIS
El equino deportista está expuesto a factores que lo predisponen a sufrir lesiones en
tendones y ligamentos. Dentro de estos encontramos la fatiga muscular, mala conformación del
casco, exceso de actividad deportiva, además de lesiones en el miembro colateral (Gillis 2004). En
condiciones normales, existe un equilibrio entre las reacciones catabólicas y anabólicas de
tendones y ligamentos. Este equilibrio es mantenido por la producción de dos tipos de enzimas:
las metaloproteinasas que degradan la matriz extracelular y facilitan la remodelación y sus
inhibidores tisulares que controlan la actividad de estas (Dahlgren 2007, Clutterbuck y col 2010).
Cuando los niveles de ejercicio superan el límite de elasticidad del tejido, se produce un
desequilibrio entre la producción de las dos enzimas anteriormente mencionadas, de esta forma
se produce un daño en el tendón o ligamento (Sharma y Maffulli 2006).
11
Una vez que el tendón o ligamento sufre una lesión, inicialmente se produce hemorragia y
en seguida ocurre una marcada reacción inflamatoria (Figura 2). Esta reacción inflamatoria resulta
en un aumento del flujo sanguíneo, desarrollo de edema, infiltración de neutrófilos, macrófagos,
monocitos y liberación de enzimas proteolíticas. Las células inflamatorias migran al sitio de la
lesión y fagocitan el tejido dañado (Alves y col 2010).
La fase de reparación comienza luego de unos días y dura varios meses. Esta fase se asocia
con una pronunciada respuesta angiogénica e infiltración de fibroblastos (Beredjiklian 2003, Davis
y Smith 2006). Como resultado se produce una cicatriz con una composición diferente a la
original, con mayor proporción de colágeno tipo III (alrededor de 50% frente a 10% del tendón
normal), el cual presenta menor resistencia a la tensión. Durante la fase de remodelación hay una
sustitución incompleta a colágeno tipo I y las fibras de colágeno se organizan de forma paralela,
más parecida al tendón normal y junto a fibroblastos logran la formación del tejido cicatricial.
Este proceso puede durar de semanas a meses y como resultado, el tendón o ligamento reparado
resulta funcionalmente inferior al normal, por lo tanto, predispuesto a volver a lesionarse en los
sitios adyacentes a la lesión (Davis y Smith 2006, Dahlgren 2007).
Figura 2. A: Corte histológico que muestra respuesta angiogénica, marcada infiltración celular y matriz extracelular
desorganizada durante la resolución de una lesión (flecha). B: Aspecto macroscópico de una lesión tendínea. (flecha)
(Alves y col 2011).
La evaluación clínica de las lesiones en tendones y ligamentos puede revelar una
claudicación, calor local, tumefacción y dolor. El examen ultrasonográfico permite la evaluación
del tamaño, forma y ecogenicidad relativa de cada tendón y ligamento y de los tejidos adyacentes.
Con la ayuda de este examen, es factible determinar la localización y la gravedad de la lesión,
como podemos observar en la Figura 3. Esta información ayuda al Médico Veterinario a
establecer un mejor plan terapéutico y un seguimiento ultrasonográfico para controlar la
evolución y establecer el régimen de ejercicio para maximizar la probabilidad de recuperación
(Wrigley 2004).
12
Figura 3. Vista ultrasonográfica de una lesión en el TFDS. Se observa zona hipoecogénica que corresponde a la
lesión. A: Sección transversal. B: Sección longitudinal. (Alves y col 2011).
5.3 TRATAMIENTOS CONVENCIONALES PARA TENDINITIS Y DESMITIS
La crioterapia es indicada debido a sus propiedades antiinflamatorias, analgésicas y
vasoconstrictoras. Esto debe ser complementado con compresión, movilización y ejercicio
controlado. Estas terapias favorecen la cicatrización y remodelación del colágeno y disminuyen el
edema. (Gillis 2004, Davis y Smith 2006). Por otra parte, protocolos farmacológicos sistémicos
como administración de anti-inflamatorios no esteroidales como fenilbutazona (2,2 mg/kg) y
flunixin meglumine (1,1 mg/kg) son utilizados con el fin de disminuir el efecto de las
prostaglandinas mediadoras de la inflamación (Davis y Smith 2006). En cuanto a la
administración de etodolaco, aun se están realizando estudios sobre su potencial uso en equinos
(Moore y Walesby 2004). La aplicación de dexametasona en forma sistémica (0,1 mg/kg como
dosis única) debe realizarse en las primeras 48 horas posteriores a una lesión, debido a que
después de transcurrido este período, este antiinflamatorio esteroidal inhibe la fibroplasia y por lo
tanto, la reparación del tendón o ligamento. La aplicación de medicamentos en forma perilesional
consiste en glicosaminoglicanos polisulfatados, hialuronato de sodio y beta aminoproprionitrilo
fumarato (inhiben las colagenasas y metaloproteinasas) (Davis y Smith 2006). El dimetil
sulfóxido (DMSO) inactiva a los radicales superóxido e inhibe la síntesis de prostaglandinas,
además cuenta con intensa penetración en tejidos. Su aplicación se realiza en forma tópica. La
aplicación de Anti flogísticos se realiza con el fin de evitar el edema en las primeras horas después
de la lesión (Moore y Walesby 2004).
En aquéllos casos en que ninguno de los tratamientos anteriores produzca resultado,
existe la
posibilidad de aplicar un tratamiento quirúrgico. En el caso de tendinitis del TFDS o
TFDP, un posible tratamiento quirúrgico a ser realizado consiste en la desmotomía del ligamento
frenador del tendón correspondiente. Este procedimiento se realiza con el fin de reducir la
tensión del tendón. Sin embargo, la vida deportiva de estos deportistas es limitada ya que un 79%
de los equinos que sufren tendinitis del TFDS y que son tratados con esta técnica quirúrgica, han
13
participado en dos carreras posterior a su recuperación (Davis y Smith 2006). Recientemente, la
aplicación de células madre en el tratamiento de tendinitis ha producido resultados distintos a los
obtenidos a través de terapias convencionales, permitiendo el retorno exitoso a las actividades
deportivas y laborales de muchos caballos (Crovace y col 2007, Frisbie y Smith 2010).
5.4 USO DE TERAPIAS CELULARES EN EQUINOS
Durante mucho tiempo, las lesiones de tendones y ligamentos en equinos han sido una
causa importante de descarte de animales en la mayoría de deportes ecuestres. La mayoría de los
tratamientos descritos producen entre un 40% y 60% de retorno deportivo, sin embargo, la vida
deportiva se acorta notablemente (Nixon y col 2008). A pesar de los avances en la
detección temprana y el manejo de estas lesiones, el riesgo de una nueva lesión se estima que va
entre 43% a 93% (Dahlgren 2007). Dicho aspecto está sujeto a las características funcionales del
tejido de reparación (Dalhgren 2007, Nixon y col 2008). Además, el tejido cicatricial formado no
presenta la elasticidad y resistencia para soportar las altas y repetitivas fuerzas a las que se ven
sometidas estas estructuras (Estrada y col 2007). Por este motivo es necesario reemplazar el tejido
lesionado con una matriz más parecida al tendón y menos parecida a tejido cicatricial. El objetivo
del uso de las terapias en tejidos lesionados es restaurar la arquitectura y la función biomecánica
similar a la original. Estudios recientes han demostrado que el tratamiento con células madre en
este tipo de lesiones, produce una mejoría estructural del tendón y ligamento dañado (Fortier y
Smith 2008) y promueve la organización del colágeno local (Estrada y col 2007).
La célula madre adulta tiene la capacidad de adquirir características fenotípicas y
funcionales en respuesta a los cambios y estímulos del microambiente en que son implantadas, lo
que se conoce como plasticidad celular. Se ha evidenciado gran potencial en la aplicación clínica
debido a su capacidad de expansión in vitro e in vivo y de diferenciarse en varias líneas celulares
incluyendo osteocitos, condrocitos, miocitos, cardiomiocitos, adipocitos, tenocitos, vasos
sanguíneos y neuronas (Oedayrajsingh-Varma y col 2006, Stewart y Stewart 2011). En terapia
equina, para la recuperación de lesiones de tendones y ligamentos, se han aplicado como
alternativas para la extracción de células madre la médula ósea, el tejido adiposo (Estrada y
Venegas 2007), además de células del cordón umbilical, embriones y tejido tendíneo como tejidos
alternativos para la extracción de estas células (Alves y col 2011, Gutierrez-Nibeyro 2011). El
tejido adiposo, por su parte, constituye una fuente abundante y de fácil acceso de células madre
adultas, las cuales tienen aplicaciones en el tratamiento del dolor agudo y trastornos músculo
esqueléticos crónicos (Gimble y Guilak 2003, Schäffler y Büchler 2007).
14
5.5 EXTRACCIÓN Y PROCESAMIENTO DE CÉLULAS MADRE PROVENIENTES
DE TEJIDO ADIPOSO
Previo a la realización de este procedimiento, el equino debe ser sedado. La extracción
de tejido adiposo puede realizarse en la región dorsal a los músculos glúteos (Vidal y col 2007,
Carvalho y col 2011) o en la base de la cola (Figura 4) (Carvalho y col 2011). Esta zona debe ser
preparada asépticamente, la piel y tejido subcutáneo deben ser insensibilizados con la aplicación
de lidocaína al 2% (Sutter 2007, Vidal y col 2007, Carvalho y col 2011). Es preferible realizar
este procedimiento en esta región, debido a la ausencia de grandes vasos sanguíneos y el fácil
acceso. Se extraen entre 5 y 15 ml de tejido adiposo superficialmente a la fascia de los músculos
glúteos. Posteriormente se realiza la sutura de la incisión (Vidal y col 2007, Carvalho y col 2011).
Figura 4: Colección de tejido adiposo depositado en la región de la base de la cola de un equino. A: Tricotomía y
antisepsia de la base de la cola. B: Insición de 10 cm aproximadamente. C: Tejido adiposo equino. (Gentileza Doctor
Armando Carvalho).
La técnica de aislamiento de las células madre provenientes de tejido adiposo en equinos
se basa en el protocolo usado en seres humanos; el tejido adiposo es macerado con una hoja de
bisturí, luego es lavado y agitado suavemente con una fracción de solución buffer fosfato salino
(PBS) para promover la separación en dos fases: la parte superior, consistente en el tejido adiposo
macerado y lavado y el infra nadante que corresponde a células hematopoyéticas suspendidas en
PBS. Esta fracción se elimina. El tejido adiposo (5 ml) es digerido en el mismo volumen de
solución tampón PBS que contiene un 1% de albúmina sérica bovina y 0,1 % de colagenasa tipo I.
Se somete a agitación continua por 50 minutos a 37° C (Hong y col 2006, Vidal y col 2007,
Carvalho y col 2011). Se extrae el pellet resultante y se somete a la centrífuga a 260g por 5
minutos. Para completar la separación de las células estromales de los adipocitos primarios, la
muestra se agita vigorosamente y se centrifuga nuevamente a 260g por 5 minutos. Como
resultado, se obtiene un pellet que corresponde a la fracción vascular- estromal que contiene la
porción de células madre de tejido adiposo. El sobrenadante (compuesto de grasa, adipocitos
primarios y solución de colagenasa) se retira. La fracción vascular-estromal puede ser implantada
directamente o ser suspendida nuevamente en medio de cultivo (10 ml de Dulbecco’s Eagle
modificado - DMEM) (Vidal y col 2007, Carvalho y col 2011). Para determinación de la
viabilidad celular, una pequeña alícuota de la suspensión de las células se centrifuga y el pellet se
15
suspende en un volumen igual de solución buffer (Vidal y col 2007). Posterior a esto se realiza la
tinción con azul tripano de esta solución. Este colorante penetra la membrana de las células
muertas, de esta forma se identifica cuáles son las células viables. Esta técnica es práctica y
sencilla. El conteo las células viables se realiza mediante el uso de un Hemocitómetro (Vidal y col
2007, Carvalho y col 2011).
5.6 CULTIVO DE CÉLULAS MADRE
Las células nucleadas de la fracción vascular-estromal son cultivadas con el propósito de
aumentar la cantidad de éstas y de estimularlas para que expresen factores de crecimiento que
participan en la regeneración del tejido en el cual serán implantadas. Se siembran en un medio de
cultivo estromal a una densidad de 5.000 células nucleadas por centímetro cuadrado en frascos de
cultivo (Vidal y col 2007). Carvalho y col (2011) indican que el cultivo se realiza a una densidad de
105 células/cm2 en placas de cultivo de 25 cm2. Estas placas son incubadas a 37º C bajo 5% de
CO2 , en el medio de cultivo DMEM, que contiene 10% de suero fetal bovino. Este medio es
cambiado cada tres días. Cuando las células existentes en la placa ocupan un 70% (Carvalho y col
2011) a 80% (Vidal y col 2007) de ésta, se realiza la tripsinización y el conteo. El número de
células madre extraídas de tejido adiposo viables luego del cultivo celular varía entre 9.1 x 106 y
17.8 x 106 células en el primer pasaje y entre 10.2 x 106 y 52.9 x 106 células en el segundo pasaje.
Posteriormente, las células son diluidas en 0,5 ml de suero autólogo y se colocan rápidamente en
recipientes que contengan hielo para su uso inmediato en el equino (Carvalho y col 2011).
5.7 TRATAMIENTO DE LESIONES TENDÍNEAS Y LIGAMENTARES CON
CÉLULAS MADRE
Para realizar el implante de las células madre extraídas de tejido adiposo debe realizarse
tricotomía y antisepsia de la zona. Con la ayuda de un equipo de ultrasonido se realiza la
implantación de las células con una jeringa acoplada a una aguja 21-G, esta debe ser posicionada
en el centro de la lesión (Sutter 2007, Carvalho y col 2011). El confinamiento y un programa de
rehabilitación son necesarios para complementar la recuperación de estas afecciones, lo que tarda
entre ocho y catorce meses. (Gillis, 2004). (Anexo Nº 2).
5.7.1 Estudios experimentales
La empresa Vet Stem ®, ha realizado diversos estudios en el ámbito de la medicina
regenerativa. En uno de ellos, se indujo lesión en los TFDS y TFDP en 66 caballos clínicamente
sanos y se procedió a la administración intralesional de células madre extraídas de tejido adiposo.
Se determinó que un 94% de los equinos tratados, resultaron sanos después del transcurso de un
año posterior a la lesión, 77% de estos retornaron al nivel deportivo anterior a la lesión. En otro
estudio, conducido por Nixon y col (2008) se indujo tendinitis en el TFDS de uno de los
16
miemb
bros anteriorres de 8 equuinos adultoss clínicamennte sanos. Siete días desp
pués se reallizó la
6
implan
ntación de 10,83
1
+-3,41 x 10 célulaas madre extrraídas de tejiido adiposo a cuatro de estos.
Pasadaas seis seman
nas, los equiinos fueron eutanasiado s. Luego de realizarse uuna biopsia een los
tendon
nes tratados, se determin
nó mediante evaluación hhistológica qque estos equuinos presen
ntaban
mayor organización
n de las fibraas de colágen
no que los caaballos del ggrupo no trattado. En cuanto al
análisis inmunohisttoquímico, see determinó que en tendoones lesionaddos tratados con células m
madre
extraíd
das de tejido
o adiposo, laa expresión de colágenoo tipo III eraa reducida een comparaciión al
grupo no tratado, y a la vez con
ntenían mejor deposiciónn de colágenoo tipo I.
Carvalho y col (2011),, consideraro
on ocho yegguas clínicam
mente sanas divididas en
n dos
gruposs de cuatro yeguas
y
cada uno (Grupo
o A y B). Se indujo una lesión en ell TFDS de aambos
miemb
bros anteriorres de estas. Treinta días después, see realizó la im
mplantación de 10x106 ccélulas
madre en uno de los dos mieembros anterriores. Las oocho yeguas fueron som
metidas a actiividad
física controlada
c
(A
Anexo Nª3). A las yeguass del grupo A
A, se les realiizó una biop
psia bilateral dde los
tendon
nes 60 días después
d
de la inducción de
d la lesión. E
En el grupo B
B, las yeguas fueron som
metidas
a una biopsia
b
150 días posterio
ores a la induucción de la llesión. No sse detectaron
n diferencias entre
los miiembros trataados y los no
o tratados duurante la evaaluación ultrrasonográficaa realizada 600 días
posteriior a la implaantación de células
c
madre en el Gruppo A y 150 ddías posteriorr a la implanttación
en el grupo
g
B. Los miembros trratados preseentaron mejoor organizacióón histológicca en relación
n a las
extrem
midades conttroles no traatadas. Sin embargo, laas extremidaades tratadass en el Gruupo B
presen
ntaron un asp
pecto mucho
o más cercan
no al tendónn normal (meejor organizaación de la m
matriz
extraceelular y míniimo infiltrado
o celular infl
flamatorio) qque las extrem
midades trataadas de las yyeguas
del Grrupo A (Carvvalho y col 20011) (Figura 5).
Figura 5. Corte histo
ológico 60 días posterior a la
l inducción dde la lesión. A:: Miembro con
ntrol (GA).Moderado
infiltrad
do perivascularr y gran celullaridad. (Tinció
ón Hematoxiliina/Eosina). B
B: Miembro ccontrol (GA). Tejido
conectivvo con ausencia de colágeno
o, infiltrado perrivascular y graan celularidad. (Tinción Masson`s Trichrom
me). C:
Miembrro tratado (GA
A). Fibras de co
olágeno dispueestas en forma paralela, similaar al tendón saano. Poca celuularidad
17
comparado con Grupo Control. (Tinción HE). D: Miembro tratado (GA). Grandes depósitos de colágeno (color
rojo). (Tinción Masson`s Trichrome). (Carvalho y col 2011)
5.7.2 Casos clínicos
Recientemente, en una investigación realizada por Gutierrez- Nibeyro (2011), en la cual
se incluyeron caballos de carrera con lesión en el TFDS (n=13) o desmitis de LS (n=40) tratados
con células madre extraídas de tejido adiposo, se informó que 32 de 53 equinos (60%) retornó a
sus actividades deportivas, no obstante, 14 de los 53 (26%) sufrieron recidivas entre 18 y 24 meses
después. Aunque esta tasa de recidiva puede parecer alta, 7 de esos 14 caballos (50%) había
sufrido recidiva previamente al tratamiento con células madre. Por lo tanto, 7 caballos con una
lesión inicialmente tratada con células madre sufrieron recidiva. La empresa Vet Stem ® realizó
otro estudio en el cual se trataron 62 equinos con desmitis de LS. Después de un año de
seguimiento, se comprobó que un 85,8% de los caballos retornaron al rendimiento deportivo
previo a la lesión. En este estudio no se menciona la cantidad de equinos que sufrieron recidivas.
5.8 CONCLUSIONES
De acuerdo a las condiciones en las cuales se realizó este estudio se concluye que:
.
1) Debido a la sobre extensión de tendones y ligamentos propia de la actividad deportiva, estas
estructuras están predispuestas a sufrir lesiones.
2) La información concerniente al uso de células madre derivadas de tejido adiposo como
tratamiento de afecciones tendíneas y ligamentares es escasa, por lo que se hace necesario realizar
más estudios que aclaren aspectos sobre este eficiente tratamiento.
3) El tratamiento de tendinitis y desmitis con células madre extraídas de tejido adiposo produce
tejido más organizado, mayor proporción de colágeno tipo I, confiere mayor resistencia al tendón
(ligamento), lo cual disminuye la ocurrencia de recidivas.
4) Las lesiones en tendones y ligamentos tratadas con células madre extraídas de tejido adiposo,
producen menor infiltrado inflamatorio que las lesiones no tratadas con este tratamiento; además
de retorno deportivo que va entre un 60% y 85,9% versus un 40% a 60% producto de los
tratamientos convencionales Sin embargo, estos aspectos no son reflejados en la evaluación
ultrasonográfica transcurridos 150 días del tratamiento.
18
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22
7. ANEXOS
7.1 ANEXO 1
En el presente estudio se utilizaron las siguientes abreviaturas:
TFDS: Tendón Flexor Digital Superficial.
TFDP: Tendón Flexor Digital Profundo
LS: Ligamento Suspensor
MSC: Células Madre Mesenquimales
INE: Instituto Nacional de Estadísticas
DMSO: Dimetil Sulfóxido
DMEM: Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium.
7.2 ANEXO 2
Injuria
Día 0-30
Día 30-60
Leve
Caminata 10 min x 2
Caminata 15 min X 2.
Moderada
Severa
Caminata 10 min x 2
Caminata 10 min x 2
Caminata 20 min X 2.
Caminata 25 min. X 2
Progreso
Día 60-90
Día 90-120
Bueno
Moderado
Pobre
Montar 5 min/dìa (caminata)
Montar 5 min/dìa (caminata)
Caminata 60 min/día.
Día 120-150
Agregar 5 min trote cada 2
semanas
Bueno
Moderado
Pobre
Bueno
Moderado
Pobre
Aumentar cada semana 5 minutos
Aumentar cada semana 5 minutos
Montar 20-30 min/día (caminata)
Día 150-180
Aumentar cada semana 5 minutos de
trote
Aumentar cada semana 5 minutos de
Montar 60 min/día (caminata) trote
Re-evaluar el caso
Nuevo tratamiento
Día 180-210
Día 210-240
Agregar 5 min medio galope
Agregar 5 min medio galope cada 2
cada 2 sem.
sem .
Agregar 5 min trote cada 2
Agregar 5 min medio galope cada 2
semanas
sem.
Re-evaluar el caso
Nuevo tratamiento
23
Bueno
Moderado
Pobre
Día 240-270
Agregar trabajo deportivo
(carrera, salto,polo)
Agregar 5 min. medio galope
cada 2 semanas
Re-evaluar el caso
Día 270-300
Listo para la competencia cada 2 sem
.
Trabajo completo.
Nuevo tratamiento
7.3 ANEXO 3
-Día 0 a 44: descanso absoluto (Grupo A y B)
-Día 45 a 60: caminata durante 15 minutos una vez al día (Grupo A y B)
-Día 61 a 90: caminatas durante 15 minutos dos veces al día (Grupo B)
-Día 91 a 120: caminatas durante 30 minutos una vez al día (Grupo B)
-Día 121 a 150: caminatas durante 30 minutos dos veces al día (Grupo B)
24
8.
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a todas las personas que hicieron posible de una u otra forma la realización de
esta Memoria de Título, en especial a:
Mi familia por el cariño y apoyo incondicional que me han brindado durante estos años.
A mi profesor patrocinante Doctor Bruno Cravalho Menarim y co patrocinante Doctor Hedie
Bustamante Diaz, por su apoyo y buena disposición durante el desarrollo de esta Revisión
Bibliográfica.
Finalmente, a mis amigos, con quienes he compartido los momentos más importantes de esta
etapa que hoy finaliza.
25
26