proteómica - Severo Ochoa - Universidad Autónoma de Madrid
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proteómica - Severo Ochoa - Universidad Autónoma de Madrid
II JORNADAS BIENALES DE JÓVENES INVESTIGADORES EN PROTEÓMICA La organización de las Jornadas y la edición de este número especial han corrido a cargo de los siguientes investigadores: Ana María Maldonado Alconada (Universidad de Córdoba) Sira Echevarría Zomeño (Universidad de Córdoba) Raquel González (Universidad de Córdoba) Jesús Vázquez (CBM-SO, UAM, Madrid) Montse Carrascal (CSIC-UAB, Barcelona) Ángel García (Universidad de Santiago de Compostela) Marina Gay (CSIC-UAB, Barcelona) Antonio Marcilla (Universidad de Valencia) Salvador Martínez (CNB-CSIC) Pablo Martínez-Acedo (CBM-SO-UAM ) Antonio Martínez-Ruiz (Hospital de La Princesa, Madrid) Angela Moreno (IAS-CSIC, Córdoba) Pedro Navarro (CBM-SO-UAM) Ana Oleaga (CSIC, Salamanca) Miren J. Omaetxebarría (Universidad País Vasco) Aida Pitarch (Universidad Complutense Madrid) Manuel Rodríguez (Universidad de Córdoba) Eva Rodríguez-Suarez (CIC-Biogune) Cristina Ruíz (INIBIC –A Coruña) Luis Valledor (Universidad de Oviedo) Federico Valverde (CSIC Sevilla) 5 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Sede social: Instituto de Biomedicina de Valencia, C.S.I.C. c/. Jaime Roig, 11. 46010 Valencia 7HO)D[ C.I.F.: G-97465629. Nº. Registro Nacional de Asociaciones: 584180. http://www.cbm.uam.es/seprot Junta Directiva: Fernando J. Corrales. Presidente CIMA - Universidad de Navarra, Pamplona [email protected] Fernando Vivanco. Vicepresidente Universidad Complutense, Fundación Jiménez Díaz, Madrid [email protected] Manuel M. Sánchez del Pino. Secretario Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia [email protected] Eliandre de Oliveira. Tesorera Plataforma de Proteómica, Parc Cientific de Barcelona [email protected] Vocales Ignacio Casal. CIB, CSIC, Madrid [email protected] Concha Gil. Universidad Complutense de Madrid [email protected] Juan Pablo Albar. CNB, UAM, CSIC, Madrid [email protected] Jesús Jorrín. Universidad de Córdoba [email protected] Jesús Vázquez. CBMSO,CSIC-UAM, Madrid [email protected] Juanjo Calvete. IBV, CSIC, Valencia [email protected] Ángel García. Universidad de Santiago de Compostela [email protected] Lucía Monteoliva. Universidad Complutense de Madrid [email protected] Montserrat Carrascal. IIBB, CSIC, IDIBAPS, Barcelona [email protected] PROTEÓMICA Revista de la Sociedad Española de Proteómica Número 5, Febrero 2010 EDITORES RESPONSABLES: Jesús V. Jorrín Jesús Vázquez COMITÉ EDITORIAL: Juan Pablo Albar Juan J. Calvete Montserrat Carrascal Ignacio Casal Fernando Corrales Ángel García Concha Gil Ana María Maldonado Alconada Antonio Martínez Ruiz Lucía Monteoliva Ángela Moreno Eliandre de Oliveira Manuel Sánchez del Pino Fernando Vivanco CORRESPONDENCIA EDITORIAL: Jesús V. Jorrín Novo (Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus de Rabanales, Ed. Severo Ochoa (C6), 14071 Córdoba. E-mail: [email protected]) EDITA: SEPROT 6 3527(Ï0,&$1Ò0(52129,(0%5( PROTEÓMICA. Revista de la Sociedad Española de Proteómica Editada por: Sociedad Española de Proteómica Periodicidad: Semestral (dos números por año, enero-febrero y julio-septiembre). Contenidos: se publicarán artículos originales, comunicaciones breves, artículos de revisión, artículos de difusión, tutoriales, opiniones, notas, resumen de tesis doctorales, y comentarios sobre cualquier aspecto relacionado con la proteómica. Se priorizarán artículos originales sobre aspectos metodológicos o de aplicación al estudio de sistemas biológicos. Incluye información sobre nuestra Sociedad, personas, grupos e instituciones que la componen. Idioma: será el castellano, aunque se admiten contribuciones en otras lenguas, preferentemente inglés. Distribución: España y Latinoamérica, aunque pretendemos que tenga un carácter internacional mediante la distribución a otros países. Se enviarán, sin coste alguno, a los socios de la SEProt, Unidades y Servicios, así como a instituciones y organizaciones públicas o privadas miembros de la sociedad o con actividad relevante en el campo de la proteómica. Publicación: habrá una versión impresa, y una versión “on-line” que aparecerá en la página web de la SEProt y de la Universidad de Córdoba. Editores responsables: Jesús V. Jorrín Novo y Jesús Vázquez Comité editorial: Juan Pablo Albar, Juan J. Calvete, Montserrat Carrascal, Ignacio Casal, Fernando Corrales, Ángel García, Concha Gil, Ana María Maldonado Alconada, Antonio Martínez Ruiz, Lucía Monteoliva, Ángela Moreno, Eliandre de Oliveira. Manuel Sánchez del Pino y Fernando Vivanco Correspondencia Editorial: Jesús V. Jorrín Novo Dpto de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus de Rabanales, Ed. Severo Ochoa (C6), 14071 Córdoba. E-mail: [email protected] Instrucciones a los autores: http://www.cbm.uam.es/seprot/ Envío de los manuscritos: Mediante correo electrónico ([email protected]). I.S.S.N.: 1888-0096 Depósito Legal: CO-1005-07 Edita: SEPROT (Sociedad Española de Proteómica) www.cbm.uam.es/seprot Imprime: Argos Impresores S.L. Córdoba. 3527(Ï0,&$1Ò0(52129,(0%5( 7 Ë1',&('(&217(1,'26 Editorial Jesús V. Jorrín Novo 17 Las II Jornadas para Jóvenes Investigadores en Proteómica, Córdoba 2010 Jesús Vázquez, Ana M. Maldonado-Alconada, Sira Echevarría-Zomeño, Raquel González 18 1. BIOINFORMÁTICA Mesa redonda sobre herramientas en bioinformática Salvador Martínez-Bartolomé, Pedro Navarro, Alex Campos, Marco Trevisán-Herraz, Juan Antonio Vizcaíno, Alberto Medina 20 $QHZYHUVDWLOH¿OHWUDQVODWRUIRU3URWHRPLFVVWDQGDUGV Alberto Medina, Salvador Martínez-Bartolomé, J. Pablo Albar 21 Open-source bioinformatics solutions for the analysis of mass spectrometry-based proteomics data: pipelines and quantitation Alexandre R. Campos 22 Java API for MIAPE generation Emilio Salazar, Miguel A. López, Salvador Martínez-Bartolomé, Alberto Medina, J. Pablo Albar 25 7KH 3URWHRPLFV ,GHQWL¿FDWLRQV GDWDEDVH 35,'( LWV DVVRFLDWHG WRROV DQG WKH ProteomeXchange consortium Juan Antonio Vizcaíno, Florian Reisinger, Richard Côté, Henning Hermjakob 26 Proteopathogen, una base de datos de proteínas para el estudio de la interacción Candida albicans – hospedador Vital Vialás, Rubén Nogales-Cadenas, César Nombela, Alberto Pascual-Montano, Concha Gil 28 Bioinformatics tools for inferring immune-related functions from proteomic data Gema Sanz, Ángeles Jiménez, Ángela Moreno, Juan J. Garrido 30 %,20$5&$'25(6<3$72/2*Ë$6+80$1$6 3URWHLQWDUJHWVRIR[LGDWLYHVWUHVVLQGXFHGE\+XQWLQJWRQGLVHDVHLQKXPDQEUDLQ (YDOXDWLRQRIDQ+'PLFHPRGHO7HW+' M. Alba Sorolla, Isidre Ferrer, José Lucas, Joaquim Ros, Elisa Cabiscol ,GHQWL¿FDFLyQ PHGLDQWH SURWHyPLFD GH SRVLEOHV ELRPDUFDGRUHV SODTXHWDULRV HQ síndrome coronario agudo 32 8 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Andrés F. Parguiña, Isaac Rosa, Lilián Grigorian-Shamagián, Elvis TeijeiraFernández, Jana Alonso, Rosa Agra, José Ramón González-Juanatey, Ángel García 35 $QiOLVLVGHODH[SUHVLyQGLIHUHQFLDOGHSURWHtQDVHQHOVXHURGHUDWRQHV&%/ VLOYHVWUHV UHVSHFWR D UDWRQHV &%/ GH¿FLHQWHV SDUD &' XWLOL]DQGR XQD FROHFFLyQFRPELQDWRULDGHKH[DSpSWLGRVProteoMiner\HOHFWURIRUHVLV' Antonio Rosal, Sonia García-Rodríguez, Esther Zumaquero, Pilar Navarro, Mercedes Zubiaur, Jaime Sancho 37 'HYHORSLQJ 050$VVD\V IRU 3HSWLGH 4XDQWLWDWLRQ The MIDASTM ZRUNÀRZ DQG QtrapTM technology Antonio Serna 38 ,QWHOOLJHQW8VHRI5HWHQWLRQ7LPHIRU+LJKHU2UGHU0XOWLSOH5HDFWLRQ0RQLWRULQJ Multiplexing . Scheduled MRM™ Algorithm Antonio Serna 40 2EHVLGyPLFD FDUDFWHUL]DFLyQ GHO VHFUHWRPD GHO WHMLGR DGLSRVR GH GLIHUHQWHV ORFDOL]DFLRQHVDQDWyPLFDV Arturo Roca-Rivada, Jana Alonso, Omar Al-Massad; Luisa María Seoane, Felipe Casanueva, María Pardo 40 7RS'RZQSURWHRPLFDQDO\VLVRI&6)SURWHLQVIURP$/6SDWLHQWV Claudio Diema, Alex Campos, Núria Omeñaca, Eliandre de Oliveira, Joan Guinovart, Jacques Borg, Marta Vilaseca 43 2SWLPXPPHWKRGGHVLJQHGIRU'',*(RIDUWHULDOLQWLPDDQGPHGLDLVRODWHGE\ laser microdissection Fernando de la Cuesta, Gloria Alvarez-Llamas, Irene Zubiri, Aroa Sanz- Maroto, Alicia Donado, Luis. Rodriguez-Padial, Angel Garcia-Pinto, María González-Bardera, Fernando Vivanco 45 ,GHQWL¿FDFLyQ GH SpSWLGRV HVSHFt¿FRV GH FiQFHU FRORUUHFWDO PHGLDQWH HO XVR GH librerías de fagos T7 impresas en microarrays Ingrid Babel, Rodrigo Barderas, Victor Moreno, Ivan Cristobo, Gabriel Capellá, Ignacio Casal 46 '%OXH1DWLYH6'63$*(DQDO\VLVRIPXOWLSURWHLQFRPSOH[HVRIKXPDQHU\WKURF\WH membrane Irene Zubiri, Gloria Álvarez-Llamas, Fernando de la Cuesta, María González-Barderas, Fernando Vivanco 48 5HJXODWLRQ RI HSLWKHOLDOPHVHQFK\PDO WUDQVLWLRQ LQ FRORQ FDQFHU E\ Į GLK\GUR[\YLWDPLQ'DSURWHRPLFVDSSURDFK Iván Cristobo, María Jesús Larriba, Vivian De los Ríos, Ingrid Babel, Rodrigo Barderas, Alberto Muñoz, Ignacio Casal &RPSUHKHQVLYHSURWHRPLFDQDO\VLVRIKXPDQHQGRPHWULDOÀXLGDVSLUDWH 49 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Juan Casado-Vela, Eva Rodriguez-Suarez, Ibon Iloro, Amagoia Ametzazurra, Nere Alkorta, Juan A. García-Velasco, Roberto Matorra, Begoña Prieto, Sandra González, Daniel Nagore, Laureano Simón, Felix Elortza 9 50 ,GHQWL¿FDWLRQRIELRPDUNHUVLQFRORUHFWDOFDQFHUSUHSRVWFKHPRWKHUDS\E\ 1XFOHLF $FLGV 3URJUDPPDEOH 3URWHLQ 0LFURDUUD\V 1$33$ L),6+ DQG 613V approaches María González, Raquel Bartolomé, Jose María Sayagues, María González, Ana Laura Moro, Elena Andrada, Sahar Sibani, Josh LaBaer, Jacinto García, Alberto Orfao, Manuel Fuentes 53 'HWHFWLRQRISURVWDWHFDQFHUE\XULQH3URWHRPLFV Marina Rigau, Nuria Colome, Juan Morote, Mª Carme Mir, Carlos Ballesteros, Marta Garcia, Miguel Abal, Francesc Canals, Jaume Reventós, Andreas Doll 54 1DQR/&PDVVVSHFWURPHWU\EDVHGSURWHRPLFDQDO\VLVRIVHUXPDQGV\QRYLDOÀXLG samples from osteoarthritis patients Patricia Fernández-Puente, Jesús Mateos, Carolina Fernández-Costa, Cristina RuizRomero, Francisco J. Blanco 56 )XQFWLRQDO3URWHRPLFV%HDGV±EDVHGDUUD\V\VWHPIRUELRPDUNHUGLVFRYHU\ Raquel Bartolomé, María González-González, Jose M. Sayagües, Fridtjof LundJohansen, Alberto Orfao, Manuel Fuentes 58 Anticuerpos a la carta combinando expresión in vitro de proteínas, tecnología de despliegue en fagos y arrays de anticuerpos Rodrigo Barderas, Ingrid Babel, Iván Cristobo, José Ignacio Casal 59 9DOLGDWLRQRI3(')DVDSRWHQWLDOELRPDUNHUIRU16&/& Sonia Blanco-Prieto, Nuria Sánchez-Otero, Ana M. Rodríguez-Piñeiro, M. Isabel Botana-Rial, Francisco J. Rodríguez-Berrocal, María Páez de la Cadena 61 8WLOL]DFLyQ GH 3URWHR0LQHU SDUD HO DQiOLVLV SURWHyPLFR GH PXHVWUDV GH OtTXLGR VLQRYLDO/6GHSDFLHQWHVFRQRVWHRDUWULWLV Sonia García-Rodriguez, María D. Pérez-Mezcua, Antonio Rosal-Vela, Victoria Longobardo, Antonio Larios, Pilar Navarro, Raquel Largo, Gabriel Herrero-Beaumont, Jaime Sancho, Mercedes Zubiaur 63 Estudio de la Estenosis Aórtica Valvular desde un punto de vista proteómico Tatiana Martin-Rojas, Felix Gil-Dones, Luis F. Lopez-Almodovar, Fernando de la Cuesta, Gloria Álvarez-Llamas, Fernando Vivanco, Luis R.. Radial, María G. Barderas 64 0HWDEROLFODEHOOLQJRISULPDU\FXOWXUHKXPDQFDUWLODJHFHOOVWRDQDO\]HWKHHIIHFW RI,QWHUOHXNLQȕLQWKHH[WUDFHOOXODUPDWUL[PHWDEROLVP Valentina Calamia, Beatriz Rocha, Patricia Fernández, Jesús Mateos, Cristina RuizRomero, Francisco J Blanco ,GHQWL¿FDWLRQRIGLIIHUHQWLDOSURWHLQVLQOLYHUFHOOVXSRQGHSOHWLRQRISURKLELWLQ 66 10 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Virginia Sánchez-Quiles, Enrique Santamaría, Laura Sesma, Fernando J. Corrales 68 ,QWURGXFWLRQWR/XFLG3URWHRPLFV6\VWHPDQHZVROXWLRQIRUSHSWLGHDQGSURWHLQ SUR¿OLQJ DQG LGHQWL¿FDWLRQ FRPELQLQJ 5HWHQWDWH &KURPDWRJUDSK\ WR 0$/', 72)DQG72)72)0DVV6SHFWURPHWU\ Francesco Tortorella 70 02',),&$&,21(632675$'8&&,21$/(6 /LTXLG&KURPDWRJUDSK\²(OHFWURQ7UDQVIHU'LVVRFLDWLRQDQGLRQPRELOLW\VWXGLHV RQD472)PDVVVSHFWURPHWHU Keith Compson, James Langridge, Jeffery Brown, Steven Pringle, Iain Campuzano, Richard Chapman 71 6WUDWHJLHVIRUSURWHRPLFDQDO\VLVRIEORRGJO\FDWHGSURWHLQV María Ramírez-Boo, Feliciano Priego-Capote, Alexander Scherl y Jean-Charles Sanchez 72 +3/&)RVIR&KLSXQDQXHYDWHFQRORJtDSDUDHODQiOLVLVVHOHFWLYRGHIRVIRSpSWLGRV PHGLDQWH/&06 Isidro Masana. Reinout Raijmakers, Shabaz Mohammed, Albert Heck, Dayin Lin 75 ,GHQWL¿FDWLRQRIDQHZSKRVSKRU\ODWLRQVLWHLQ()WUDQVFULSWLRQIDFWRU Nerea Osinalde, Miren Josu Omaetxebarria, Kerman Aloria, Ana M. Zubiaga, Asier Fullaondo, Jesús M. Arizmendi 77 (VWDEOHFLPLHQWRGHXQÀXMRGHWUDEDMRHIHFWLYRHQODFDUDFWHUL]DFLyQFXDOLWDWLYD\ cuantitativa del fosfoproteoma David Ovelleiro, Montserrat Carrascal, Joaquin Abian 79 $SUR[LPDFLRQHVPHWRGROyJLFDVSDUDHOHVWXGLRGHOHVWDGRUHGR[WLROGLVXOIXURGH proteínas en muestras vegetales Sira Echevarría-Zomeño, Per Hägglund, Birte Svensson, Ana M. Maldonado Alconada, Jesús V. Jorrín Novo 81 'HFLSKHULQJ WKH 61LWURV\ORPH RI Arabidopsis thaliana during the defense response Ana M. Maldonado-Alconada, Sira Echevarría-Zomeño, Christian Lindermayr, Jörg Durner, Jesús V. Jorrín-Novo 83 &DUDFWHUL]DFLyQ GH 6JOXWDWLRQLODFLyQ GH SURWHtQDV D QLYHO GH SURWHRPD 'L¿FXOWDGHV Esperanza Morato, Sira Echevarría Zomeño, Anabel Marina 85 Lainhibicióndelasíntesisdeóxidonítricodurantelacolestasisinducidaexperimentalmente reduce la lesión hepatocelular al facilitar la homeostasis de nitrosotioles Laura M. López-Sánchez, Fernando J. Corrales, Montserrat Barcos, Isabel Espejo, Juan R. Muñoz-Castañeda, Antonio Rodríguez-Ariza 86 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 11 'HVDUUROORGHPHWRGRORJtDVSDUDODGHWHFFLyQGHPRGL¿FDFLRQHVSRVWUDGXFFLRQDOHV HQ FLVWHtQDV 6QLWURVLODFLyQ \ R[LGDFLyQ PHGLDQWH DSUR[LPDFLRQHV SURWHyPLFDV EDVDGDVHQPDUFDMHÀXRUHVFHQWH\HOHFWURIRUHVLVELGLPHQVLRQDO Daniel Tello, Rubén Fernández-Rodríguez, Antonio Martínez-Ruíz 90 $QDO\VLVRIUHYHUVLEOHDQGLUUHYHUVLEOHSURWHLQPRGL¿FDWLRQVXSRQR[LGDWLYHVWUHVV in Schizosaccharomyces pombe by proteomic approaches Sarela García-Santamarina, Susanna Boronat, Elena Hidalgo 91 La lipoproteína lipasa de rata se nitra in vivo en respuesta a la administración de lipopolisacárido Albert Casanovas, Montserrat Carrascal, Joaquín Abián, Miquel Llobera, M. Dolores López-Tejero 91 $SSOLFDWLRQRIL75$4UHDJHQWVWRUHODWLYHO\TXDQWLI\WKHUHYHUVLEOHUHGR[VWDWHRI cysteines Brian McDonagh, C. Alicia Padilla, J. Antonio Bárcena 93 3527(Ï0,&$&8$17,7$7,9$ 6ROXFLRQHV D 5HWRV $QDOtWLFRV HQ 3URWHyPLFD &XDQWLWDWLYD \ 9DOLGDFLyQ GH Biomarcadores Isidro Masana 94 /XFHV\VRPEUDVGHODFXDQWL¿FDFLyQFRQL75$4 María luz Valero, Virginia Rejas, Manuel Mateo Sánchez del Pino 96 L75$4EDVHGTXDQWLWDWLYHDQDO\VLVRISURWHLQPL[WXUHVZLWKODUJHIROGFKDQJHDQG dynamic range Juan Casado-Vela, María José Martínez-Esteso, Eva Rodríguez, Eva Borrás; Felix Elortza, Roque Bru-Martínez 98 (YDOXDWLRQRI06EEDVHGSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQPHWKRGV Kerman Aloria, Miren Josu Omaetxebarria, Mikel Azkargorta, Johannes P. C. Vissers, Asier Fullaondo, Jesús M. Arizmendi 99 'HVDUUROOR GH XQ 0RGHOR (VWDGtVWLFR 8QLYHUVDO SDUD 3URWHyPLFD &XDQWLWDWLYD 0HGLDQWH0DUFDMH,VRWySLFR(VWDEOH Marco Trevisan-Herraz, Pedro Navarro, Elena Bonzon-Kulichenko, Pablo MartínezAcedo, Daniel Pérez-Hernández, Estefanía Núñez, María Luisa Hernáez, Enrique Calvo, Montserrat Carrascal, Marina Gay, Inmaculada Jorge, Dolores Gutiérrez, Joaquín Abian, Concha Gil, Juan Miguel Redondo, Jesús Vázquez 101 /DEHOIUHH4XDQWLWDWLYH$SSURDFKHVLQ&6)%LRPDUNHU'LVFRYHU\ Alex Campos, Jacques Borg, Claudio Diema, Marta Vilaseca, Eliandre Oliveira A comparison of quantitative proteomics methodologies on a differential experiment on test samples 103 12 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Joan Josep Bech-Serra, Núria Colomé, Marta Monge, Francesc Canals 105 7ULSOH 4XDGUXSROH 0DVV 6SHFWURPHU\%DVHG 3HSWLGH $VVD\V 8VLQJ ,QWHOOLJHQW 650L650 Reiko Kiyonami, Alan Schoen, Amol Prakash, Huy Nguyen, Scott Peterman, Vlad Zabrouskov, Andreas Huhmer, Sarah Robinson, Martin Hornshaw, Madalina Oppermann, Nathalie Selevsek, Bruno Domon 107 3527(Ï0,&$0,&52%,$1$<'(3$5È6,726 5.1 Aspectos generales Problemas en el análisis proteómico de muestras procedentes de organismos ‘raros’ María Luz Valero, Javier Ortiz, Esther Dionís, Laura Cantero, Manuel Mateo Sánchez del Pino. 108 5.2 Proteómica de Microorganismos A) Proteómica de Bacterias Preparación de extractos proteicos bacterianos para el análisis de glicoproteínas PHGLDQWHJHOHVELGLPHQVLRQDOHV\FURPDWRJUDItDVGHD¿QLGDG Alfonso Olaya, Lidia Gómez-Gascón, Manuel J. Rodríguez-Ortega 108 Métodos de enriquecimiento de glicoproteínas bacterianas para su posterior DQiOLVLV\FDUDFWHUL]DFLyQPHGLDQWHHVSHFWURPHWUtDGHPDVDV Lidia Gómez-Gascón, Alfonso Olaya y Manuel J. Rodríguez-Ortega 110 Análisis de la enterotoxina A de Staphylococcus aureus HQ OHFKH SRU LRQL]DFLyQ PHGLDQWH GHVRUFLyQ SRU OiVHU DVLVWLGD SRU PDWUL] DFRSODGD D HVSHFWURPHWUtD GH PDVDVGHWLHPSRGHYXHORMALDI-TOF Isabel Sospedra, Carla Soler, Jose Miguel Soriano, Jordi Mañes 112 Comparación de dos técnicas proteómicas aplicadas al análisis de las proteínas de membrana de Mycoplasma genitalium Noemí Párraga-Niño, Núria Colomé, Francesc Canals, Jaume Piñol, Josep Antoni Pérez Pons, Enrique Querol, Mario Ferrer-Navarro 115 Comparative proteomic analysis of collection and clinical-isolate strains of Stenotrophomonas maltophilia Mario Ferrer-Navarro, Elias Mongiardini, Gerard Torrent, Raquel Planell, Ana Calderón, Teresa Falgueras, Isidre Giber, Xavier Daura 116 B) Proteómica de Hongos Análisis comparativo del proteoma de una cepa industrial de Saccharomyces cerevisiae en dos condiciones de cultivo Carlos Luna, Teresa García-Martínez, Miguel Curto, Juan Carlos Mauricio Estudio proteómico comparativo de células de Saccharomyces cerevisiae libres y ELRLQPRYLOL]DGDV 118 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Teresa García-Martínez, Juan Carlos Mauricio 13 119 (VWXGLR FRPSDUDWLYR GHO SHU¿O SURWHLFR GH FHSDV VLOYHVWUH %< \ PXWDQWH WUNGHSaccharomyces cerevisiae en condiciones de ayuno en K+ Miguel Curto, Clara Navarrete, Luis Valledor, María Luisa Hernández, José Ramos, Jesús Jorrín 121 $QiOLVLV PHGLDQWH '',*( GH OD LQWHUDFFLyQ FRQ VDQJUH GH XQD FHSD GH Saccharomyces cerevisiae potencialmente patógena aislada de suplementos dietéticos Carolina Hernández-Haro, Lucía Monteoliva, Gloria Molero, Concha Gil, María Molina 123 Análisis comparativo de diferentes aproximaciones para el estudio del proteoma de Saccharomyces cerevisiae Dolores Gutiérrez, Mª Luisa Hernaéz, Montserrat Martínez-Gomariz, María Posada, Concha Gil 124 Applying proteomic technologies to dissect molecular aspect of phytopathogenic fungi, a Botrytis cinerea approach Francisco Javier Fernández-Acero, Carlos Garrido, María Carbú, Victoria E. GonzálezRodríguez, Jesús Manuel Cantoral 126 *HOEDVHG SURWHRPLF DQDO\VLV RI Botrytis cinerea. The VLPSOHVW '( UHYHDOV differences in virulence-related protein abundance among strains Raquel González-Fernández, Inmaculada Redondo, Jesús V. Jorrín-Novo 128 Proteomic approach to Botrytis cinerea survival structures Victoria E. González-Rodríguez, Carlos Garrido, Maria Carbú, Jesús Manuel Cantoral, Francisco Javier Fernández-Acero 130 3HU¿OVHUROyJLFRGHODUHVSXHVWDGHDQWLFXHUSRVIUHQWHDOLQPXQRPDGHCandida en el pronóstico de las candidiasis invasivas Aida Pitarch, César Nombela, Concha Gil 131 $QiOLVLV SURWHyPLFR GH OD PDWUL] H[WUDFHOXODU 0( GH ELRSHOtFXODV IRUPDGDV por mutantes del hongo Candida albicansSDUDJHQHVTXHFRGL¿FDQSURWHtQDVTXH contienen el dominio CFEM rico en cisteína y genes implicados en glicosilación Rosario Blanes, Ana M. Pérez, Amelia Murgui, Manuel Casanova, Ángel Domínguez, José P. Martínez 133 Expresión diferencial de proteínas del citoesqueleto del macrófago tras la interacción con Candida albicans3UREOHPDVHQODQRUPDOL]DFLyQGHODVPXHVWUDV Jose Antonio Reales-Calderón, Mª Luisa Hernáez, Mª Dolores Gutiérrez, Gloria Molero, Concha Gil 5.3 Proteómica de Parásitos 135 14 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 3UREOHPiWLFDHQODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVGHSDUiVLWRV Javier Sotillo, Ana Pérez García, María Trelis, Dolores Bernal, Carla Muñoz-Antolí, José Guillermo Esteban, Rafael Toledo, Antonio Marcilla 136 /DV WpFQLFDV GH SURWHyPLFD DSOLFDGDV DO HVWXGLR GH ODV UHODFLRQHV SDUiVLWR KRVSHGDGRUHQODGLUR¿ODULRVLVDQLPDO\KXPDQD Javier González-Miguel, Rodrigo Morchón-García, Ana Oleaga, Mar Siles-Lucas, Ricardo Pérez-Sánchez, Fernando Simón 138 ,GHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVGHNeospora caninum implicadas en procesos de invasión y virulencia Virginia Marugán-Hernández, Javier Regidor-Cerrillo, Gema Álvarez-García, Fiona Tomley, Adriana Aguado-Martínez, Mercedes Gómez-Bautista, Luís Miguel Ortega-Mora 140 $SOLFDFLyQ GH HFXDOL]DGRUHV GH SURWHtQDV SDUD OD LGHQWL¿FDFLyQ GH DQWtJHQRV minoritarios de la saliva de Ornithodoros moubata Ricardo Pérez-Sánchez, Ana Oleaga, Mar Siles-Lucas, Verónica Díaz-Martín, Eduardo de la Torre Escudero, Ana Hernández-González, Raúl Manzano-Román 143 ,GHQWL¿FDFLyQ SURWHyPLFD \ DQiOLVLV ELRLQIRUPiWLFR GH SURWHtQDV VHFUHWDGDV SRU HOSURWR]RRSDUiVLWRTrypanosoma cruziSHUWHQHFLHQWHVDODIDPLOLD0$63Mucin associated Surface Proteins Luis Miguel De Pablos ,Gloria González, Víctor Seco Hidalgo, Isabel María Díaz Lozano, Antonio Osuna 145 ([SHULPHQWDOWKHRUHWLFVWXG\RISHSWLGH¿QJHUSULQWVLQLeishmania parasites M. Auxiliadora Dea-Ayuela, Riccardo Concu, Lázaro G. Perez-Montoto, Eugenio Uriarte, Francisco Bolás-Fernández, Florencia Ubeira, Humberto González-Díaz 147 3527(Ï0,&$9(*(7$/<$1,0$/ 8ELTXLWLQDFLyQGHSURWHtQDVQXFOHDUHVHQODVHxDOL]DFLyQGHOD\XQRGHIRVIDWRHQ plantas Marina Trigueros, Mónica Rojas-Triana, Maria Luisa Irigoyen, Javier Paz-Ares, Vicente Rubio 149 3URWHRPHSUR¿OHDQDO\VLVRIMedicago truncatula leaves in response to Uromyces striatus Mª Ángeles Castillejo, Jesús V. Jorrín, Diego Rubiales 150 Análisis proteómico del desarrollo sexual mediado por anteridiógeno en el JDPHWR¿WRGHOKHOHFKRBlechnum spicant Virginia Menéndez, Luis Valledor, Ángeles Revilla, Helena Fernández 152 Proteome regulation and epigenetic code during Pinus radiata needle maturation Luis Valledor, María Jesús Cañal, Christof Lenz, Roberto Rodríguez, Jesús Jorrín (VWXGLR GH OD UHVSXHVWD DO HVWUpV KtGULFR HQ GRV SREODFLRQHV GH HQFLQD Quercus 153 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 15 ilex subsp. ballota >'HVI@ 6DPS PHGLDQWH XQD DSUR[LPDFLyQ GH SURWHyPLFD comparativa basada en electroforesis bidimensional José Valero Galván, Rafael Mª Navarro Cerrillo, Ma Cristina Romero Rodríguez, David Ariza, Jesús Jorrín Novo 156 'HVDUUROOR\RSWLPL]DFLyQGHOSURFHVRGHH[WUDFFLyQGHSURWHtQDV\HOHFWURIRUHVLV bidimensional en fruta de hueso Esther Giraldo Ramos, Amelia Díaz Méndez, Alfredo García Sánchez 158 Comparative proteomic analysis of Arabidopsis wild-type and Fawrky1 transgenic SODQWV WR FKDUDFWHUL]H WKH IXQFWLRQ RI WKH VWUDZEHUU\ Fragaria x ananassa )D:5.< SURWHLQ DQG LWV $UDELGRSVLV KRPRORJ $W:5.< WZR SRVLWLYH regulators of resistance Alba Ruíz-Ramos, Francisco Amil-Ruíz, Juan Muñoz-Blanco, José Luis Caballero, Ana M. Maldonado Alconada 160 (OHVWXGLRFRPSDUDWLYRSURWHyPLFR\WUDQVFULSWyPLFRGHODUHVSXHVWDDD]~FDUHVHQ Arabidosis thaliana PXHVWUDXQDUHODFLyQHQWUHHOPHWDEROLVPR\HOGHVDUUROORÀRUDO Marina Ribeiro-Pedro, Fátima Ezzahra Said, María Teresa Ruiz, José María Romero, Federico Valverde 162 $',*(SURWHRPLFDQDO\VLVRIZKHDWÀDJOHDIWUHDWHGZLWK7(55$625%IROLDU a free amino acid-based biostimulator María José Martinez-Esteso, Mayte Vilella-Antón, Susana Sellés-Marchart, Anna BottaCatalà, Rafael Piñol-Dastis , Roque Bru-Martinez 164 +LJKWKURXJKSXW ELRORJLFDO DQG IXQFWLRQDO DQDOLV\V RI LQWHUDFWLRQV DPRQJ tetraspanin associated proteins in T Limphocytes using second generation proteomics techniques Daniel Pérez-Hernández, Elena Bonzón-Kulichenko, Pablo Martínez-Acedo, Pedro J. Navarro, Estefanía Núñez, Marco Trevisan-Herraz, María Yáñez-Mo, Mónica SalaValdés, Mª Ángeles Ursa, Francisco Sánchez-Madrid, JesúsVázquez 167 8VHRI3URWHR0LQHULQ9HWHULQDU\5HVHDUFK Anna Marco, Gemma Rovira, Anna Bassols 168 La Proteómica como vía para determinar el origen animal de los productos cárnicos Miguel Ángel Sentandreu, Paul D. Fraser, Enrique Sentandreu, Leticia Mora, Peter M. Bramley 170 3pSWLGRVLQKLELGRUHVGHOD(Q]LPD&RQYHUWLGRUDGH$QJLRWHQVLQD,JHQHUDGRVHQOD digestión in vitro de la carne de cerdo Elizabeth Escudero, Miguel Angel Sentandreu, Keizo Arihara, Fidel Toldrá 172 3pSWLGRVGHULYDGRVGHODWURSRQLQD7JHQHUDGRVHQMDPyQFXUDGR Leticia Mora, Miguel Angel Sentandreu, Fidel Toldrá 175 Instrucciones a los Autores 177 17 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 EDITORIAL Proteómica y las Jornadas caminan y deben caminar de la mano (OQ~PHURFLQFRHVPRQRJUi¿FR\UHFRSLODORVWUDEDMRVSUHVHQWDGRVHQODV³,,-RUQDGDV Bienales de Jóvenes Investigadores en Proteómica”. El proyecto, concebido por Jesús Vázquez, tuvo su bautizo en Barcelona, en febrero de hace dos años, y su organización corrió a cargo de Montse Carrascal y Marina Gay (Proteómica 1, febrero 2008). La segunda edición se traslada a Córdoba, donde podremos recordar con nostalgia y cariño el periodo 2003-2005, el que transcurrió entre la primera reunión formal de proteómica en nuestro país (I Jornadas sobre Proteómica UCO-2003) y el I Congreso de la recién creada SEProt. Como siempre, ¡bienvenidos a esta vuestra casa! Este número aúna dos de los objetivos prioritarios de nuestra Junta directiva para el próximo periodo, las Jornadas para Jóvenes Investigadores y la revista Proteómica, lo que, como co-editor responsable de la segunda, no deja de ser una enorme satisfacción. Estoy convencido que el éxito de ambos proyectos, en especial de la revista, va a depender, en gran medida, de ese caminar juntos. Ya, desde esta editorial, quiero hacer una llamada al grupo de Jóvenes Investigadores de la Sociedad para que os incorporéis al Comité Editorial. He sido un observador privilegiado, y actor pasivo, del devenir de las Jornadas, desde que Jesús Vázquez promovió e impulsó la idea. El excelente trabajo realizado por Anita lo he podido seguir día a día; a pesar de sus continuos desasosiegos, siempre tuve claro, tanto por el proyecto en sí como por su forma de ser y dedicación, que sería un éxito, tanto en el plano FLHQWt¿FRFRPRHQHOVRFLDO'HVGHDTXt$QLWDPLPDVVLQFHURDJUDGHFLPLHQWR\FDULxRWDQWR a nivel personal como en nombre de la Sociedad. Este agradecimiento y cariño ha de hacerse extensivo a Ángela Moreno, la persona que siempre está sin querer estar, y a Jesús Vázquez, el único senior al que dan cabida entre los jóvenes, posición que se ha ganado con creces. Los proyectos no son sólo de una, dos, o tres persona, sino de un buen equipo, y el de las Jornadas no es una excepción. Anita ha contado con la inestimable ayuda de Mª Carmen Molina Ruiz, Sira Echevarría Zomeño y Raquel González, y, ¡como no¡ de María Teresa Montero, al frente de OD6HFUHWDUtD7pFQLFD3HURWRGRHOORQRVLJQL¿FDUtDQDGDVLQHOH[FHOHQWHWUDEDMRHLQLFLDWLYDGH los coordinadores de las diferentes sesiones, y de, lo último aquí, pero primero de las Jornadas, los investigadores que han presentado, como norma general, excelentes trabajos. A todos vosotros, muchísimas gracias! Jesús V. Jorrín Novo 18 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Las II Jornadas de Jóvenes Investigadores en Proteómica, Córdoba 2010 Jesús Vázquez, Ana M. Maldonado-Alconada, Sira Echevarría-Zomeño, Raquel González A raíz del éxito de las “I Jornadas Bienales de Proteómica para Jóvenes Investigadores” (Sitges TXHGy FODUDPHQWH MXVWL¿FDGD OD FHOHEUDFLyQ de este evento en los años alternos a los congresos como parte de las actividades de la Sociedad Española de Proteómica. De hecho, las Jornadas responden a uno de los principales objetivos de la SEProt: ODRUJDQL]DFLyQGHFRQJUHVRVFLHQWt¿FRVFRQHO¿Q de promover la comunicación entre los grupos que usamos la Proteómica. Como bien sabéis, la característica diferencial de estas Jornadas respecto a los congresos convencionales radica en el énfasis en contemplar aspectos prácticos y técnicos al mismo QLYHOTXHORVFLHQWt¿FRV\HQODDSXHVWDGHOD-'SRU los socios “jóvenes” para organizar este evento. EsWDPRVWUHPHQGDPHQWHDJUDGHFLGRVSRUVXFRQ¿DQ]D y su apoyo constante. $O¿QDOL]DUHO&RQJUHVRGH3DPSORQDIHEUHUR 2009) presentamos con mucha ilusión la candidatura para celebrar las “II Jornadas de Jóvenes Investigadores en Proteómica” en la Universidad de Córdoba, un centro con una trayectoria conocida a nivel nacional e internacional por los esfuerzos realizados en esta área y que ha jugado un papel fundamental en el desarrollo de la Proteómica en España. Además de ser la sede de congresos y de cursos relacionados con la Proteómica, cabe recordar razones sentimentales e históricas que ligan Córdoba a la Proteómica. Fue en Córdoba, en febrero de 2003, donde tuvo lugar el Congreso constituyente de la Sociedad Española de Proteómica, y también fue Córdoba la que albergó en 2005 nuestro primer congreso, que coincidió con la creación de la European Proteomics Association. En esta ocasión, una vez más, hemos contado con el apoyo incondicional del Vicerrectorado de Investigación de la Universidad de Córdoba. Queremos dar las gracias especialmente al Profesor D. Enrique Aguilar Benítez de Lugo, Vicerrector de 3ROtWLFD &LHQWt¿FD SRU VX D\XGD SDUD OD ¿QDQFLDFLyQ GH HVWH HYHQWR \ SRU FHGHUQRV HO HGL¿FLR GHO rectorado como sede de estas Jornadas. Sin duda, ODORFDOL]DFLyQ\ODEHOOH]DGHHVWHHGL¿FLRVXSRQHQ un aliciente más para participar en las “II Jornadas Bienales de Jóvenes Investigadores en Proteómica” que se celebrarán en Córdoba los días 11 y 12 de febrero de 2010. Tras la reunión de la JD en marzo del 2009, en la que se aprobó la candidatura de Córdoba, comenzó R¿FLDOPHQWHODRUJDQL]DFLyQGHHVWDV-RUQDGDV7RGD la información en relación a las mismas, que ha ido actualizando a medida que se concretaban los contenidos de las sesiones, se puede encontrar en la dirección http://www.jjip.fundecor.es/, a la que se puede acceder también a través de la página web de la Sociedad. En línea con el espíritu de las mismas y sus objetivos, se hizo hincapié en el carácter ÀH[LEOHGLQiPLFR\SDUWLFLSDWLYRGHHVWHHYHQWR/D acogida fue excelente y hemos recibido multitud de propuestas sobre posibles sesiones temáticas, formas de organizarlas y para participar como coordinadores de las mismas. Una vez recogida la “lluvia de ideas” el ProJUDPD&LHQWt¿FRVHHVWUXFWXUyHQODVVHLVVHVLRQHV temáticas que se detallan a continuación, cada una de ellas coordinadas por expertos en el área (entre paréntesis): Biomarcadores y Patologías Humanas (Ángel García de la Univ. de Santiago de Compostela y Cristina Ruíz del INIBIC, A Coruña); Bioinformática (Salvador Martínez de Bartolomé del CNB-CSIC y Pedro Navarro del CBMSO-CSIC); Proteómica Microbiana y de Parásitos (Aída Pitarch de la Univ. Complutense, Antonio Marcilla de la Univ. de Valencia, Ana Oleaga del CSIC, Salamanca y Manuel Rodríguez de la UCO); Proteómica Vegetal y Animal (Luis Valledor de la Univ. de Oviedo y Federico Valverde del CSIC Sevilla); Proteómica Cuantitativa (Miren J. Omaetxebarría de la Univ. País Vasco y Eva Rodríguez-Suarez del CIC BioguQH\0RGL¿FDFLRQHV3RVWUDQVGXFFLRQDOHV0DULQD Gay y Montse Carrascal del CSIC/UAB, Antonio Martínez-Ruiz del Hospital de La Princesa y Pablo Martínez-Acedo del CBMSO-CSIC). En esta ocasión hay que destacar una novedad HQUHODFLyQDOIRUPDWRGHODVVHVLRQHVFLHQWt¿FDV\D que los coordinadores han tenido total libertad para organizar sus sesiones de la forma que han considerado más apropiada. Además de comunicaciones orales seleccionadas por los coordinadores, habrá 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 paneles, mesas redondas con expertos en cada área, y debates y foros de discusión en los que se tratarán temas concretos sugeridos y votados previamente por los socios. Cualquiera que sea el formato de las sesiones, se ha intentado dar libertad total a los coordinadores y se ha considerado prioritario contemplar WLHPSRVX¿FLHQWHSDUDODGLVFXVLyQ\HOGHEDWHHQ línea con el espíritu del evento. Aunque en el momento de escribir esta reseña no estaba cerrado el plazo de inscripción, a día de hoy el número de participantes en estas Jornadas supera los 150. Hemos recibido 88 comunicaciones, distribuidas entre las diferentes sesiones temáticas, enviadas tanto por grupos con una trayectoria de investigación en proteómica, como por laboratorios que comienzan a hacer sus primeras incursiones en HOiUHD$WHQRUGHOQ~PHUR\GHODFDOLGDGFLHQWt¿FD de los resúmenes recibidos, podemos augurar el éxito de estas Jornadas. Que será el resultado del entusiasmo de los socios y del excelente trabajo que han llevado a cabo los coordinadores de las sesiones FLHQWt¿FDVFRQWDFWDQGRFRQORVLQYHVWLJDGRUHVSDUD que participen y envíen sus comunicaciones, y haciendo una investigación exhaustiva de cuales son las novedades, los retos y las limitaciones técnicas en sus áreas respectivas. Tenemos que mencionar que, dado el alto índice de participación, uno de los principales problemas a los que hemos tenido que hacer frente durante la organización ha sido “llegar a un acuerdo” sobre la distribución del tiempo asignado a cada sesión. En el momento de escribir este resumen estamos todavía intentando resolver esta FXHVWLyQ \ HVSHUHPRV TXH HO 3URJUDPD &LHQWt¿FR GH¿QLWLYRVDWLVIDJDDWRGRVSRULJXDO Convencidos de que el éxito de estas Jornadas depende también de la difusión de sus contenidos, tal y como ocurrió en la anterior edición, éstos apa- 19 recen publicados en forma de resúmenes extendidos en este número de Proteómica. De nuevo, ello ha sido posible gracias a la labor de revisión y edición llevada a cabo por los coordinadores. Está previsto que una vez celebradas las Jornadas, los temas de discusión y debate y las conclusiones obtenidas seUiQUHÀHMDGRVHQXQQ~PHURSRVWHULRUGHODUHYLVWD Como viene siendo habitual en los eventos organizados por la Sociedad, las casas comerciales han respondido con gran generosidad y entusiasmo. Su participación va mucho más lejos de la aportación económica, pero este año queremos agradecer especialmente la ayuda que nos han brindado en HVWHVHQWLGRFRQVLGHUDQGRODDFWXDOVLWXDFLyQ¿QDQciera. Muchas gracias por su generosa participación D7KHUPR6FLHQWL¿F$JLOHQW7HFKQRORJLHV:DWHUV Applied Biosystems, Bio-Rad, Isogen, Bruker, Beckman-Coulter-Izasa, Sigma y Nucliber. Applied Biosystems patrocina el premio a la mejor comunicación (de entre todas la presentadas, tanto en formato póster como comunicación oral) y Thermo 6FLHQWL¿FGRQDUiHOSUHPLRDORVRUJDQL]DGRUHVGH la mejor sesión, ambos dotados de 300€. Queremos agradecer a todas las casas comerciales el apoyo inestimable que nos brindan. De nuevo queremos transmitir nuestro agradecimiento a la JD por su respaldo incondicional, con Fernando Corrales a la cabeza, y a Ángela Moreno cuya ayuda ha sido imprescindible. Muchas gracias también a Mª Carmen Molina por su ayuda y su empeño en que todos se lleven un recuerdo imborrable de Córdoba. Esperamos que esta edición tenga como mínimo el mismo éxito que la anterior. El buen hacer y el entusiasmo demostrado por todos los participantes nos hace creer que así será. Es un placer y un honor recibiros a todos en Córdoba los días 11 y 12 de febrero. 20 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 1. BIOINFORMÁTICA Coordinadores: Salvador Martínez-Bartolomé y Pedro Navarro Mesa redonda sobre herramientas en bioinformática Salvador Martínez-Bartolomé1, Pedro Navarro2, Alex Campos3, Marco Trevisan-Herraz2, Juan Antonio Vizcaíno4, Alberto Medina1 1 ProteoRed – Laboratorio de proteómica del Centro Nacional de Biotecnología – CSIC, Madrid. 2Laboratorio de química de proteínas del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa – CSIC, Madrid. 3Plataforma de 3URWHyPLFD3DUF&LHQWL¿FGH%DUFHORQD4(0%/2XWVWDWLRQ(XURSHDQ%LRLQIRUPDWLFV,QVWLWXWH:HOOFRPH Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, UK. El desarrollo y aparición de nuevas tecnologías aplicadas a la proteómica han dado lugar a un crecimiento espectacular de datos experimentales. La captura, el almacenamiento, el procesamiento y el análisis de estos datos es, en numerosas ocasiones, un cuello de botella que debemos solucionar para seguir avanzando en el campo. Pese a que, paralelamente, han aumentado los proyectos de desarrollo de herramientas y servicios bioinformáticos aplicados a la proteómica, es muy difícil conocer todos los recursos disponibles. Muchos de estos proyectos son de software libre [http:// www.ms-utils.org/wiki/pmwiki.php/Main/SoftwareList], y por tanto, disponibles de forma gratuita, la mayoría de las veces, a través de Internet. La aparición de la proteómica de segunda generación y los análisis a gran escala ha permitido los llamados estudios de biología de sistemas, cuyos análisis serían imposibles de hacer sin herramientas bioinformáticas adecuadas. Por otro lado, es destacable también el avance en los últimos años de nuevas técnicas de marcaje isotópico y label-free que permiten realizar estudios de proteómica cuantitativa. En dichos análisis, es necesario seguir metodologías estadísticas rigurosas para minimizar la detección de falsos cambios de expresión. Numerosos grupos de investigación se resisten a utilizar herramientas no comerciales, o desconocen la existencia de una alternativa. Otro problema existente relativo al manejo de los datos en proteómica es el intercambio de dichos datos entre diferentes plataformas, laboratorios y herramientas. Es por ello por lo que el desarrollo de estándares se hace crucial, y es necesario conocer las herramientas existentes que permiten la conversión entre los formatos propietarios y los estándares. Todas estas cuestiones que surgen alrededor de la proteómica y la bioinformática nos han hecho pensar que un formato de mesa redonda podría ser ideal en unas jornadas que pretenden ser un espacio de intercambio de información entre los proteómicos y bioinformáticos españoles. En dicha mesa redonda pretendemos plantear los problemas que más nos preocupan a los proteómicos y que pueden ser resueltos, al menos en parte, por medio de recursos bioinformáticos. Por ello, se realizó una encuesta, cuyos resultados se muestran a continuación (Figura 1), para elegir de entre unos temas propuestos, los que resultan más interesantes SDUDODFRPXQLGDGFLHQWt¿FDSURWHyPLFD8QDYH]UHFRpilados los prácticamente 200 votos que se recibieron, resultaron destacados tres temas principales: herramientas de biología de sistemas, estadística en proteómica cuantitativa y software libre en proteómica. Figura 1. Número de votaciones obtenidas en la encuesta con la que se sondearon los temas más interesantes para la comunidad proteómica española. Los temas propuestos fueron: “herramientas de biología de sistemas”, “análisis de resultados en proteómica cuantitativa”, “software libre en proteómica”, “combinación de motores de búsqueda”, “estándares en informes de experimentos en proteómica” y “estándares de formato de datos en proteómica”. 21 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Para la sesión hemos buscado personas con la VX¿FLHQWH H[SHULHQFLD \ FRQRFLPLHQWRV FRPR SDUD ser las personas de referencia en el debate sobre dichos temas: database) [1], ha participado en estudios de minería de datos de espectrometría de masas y es participante en el desarrollo de estándares de la iniciativa de HUPO-PSI [2]. Alberto Medina (CNB-CSIC), pionero de la proteómica computacional en España, con dilatada experiencia en temas relacionados con la biología de sistemas como la búsqueda de anotaciones y los repositorios de información biológica y proteómica, así como en temas relacionados con estándares. Cada uno de ellos realizará una muy pequeña introducción de los temas propuestos, y seguidamente se aprovechará la mayor parte del tiempo de la sesión en el intercambio de información entre los asistentes y nuestros “expertos”. Alex Campos (PCB), experimentado usuario de herramientas de software libre aplicadas a la proteómica, así como de estándares y herramientas de conversión de formato de datos. Marco Trevisan (CBMSO-CSIC), uno de los GHVDUUROODGRUHVGHXQVRIWZDUHGHFXDQWL¿FDFLyQGH uso gratuito para instituciones públicas y conocedor de los problemas a resolver con la estadística en la FXDQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDV Juan Antonio Vizcaíno (EMBL-EBI) integrante del proyecto PRIDE (35RWHRPLFV ,'(QWL¿FDWLRQV Creemos que entre los cuatro forman una mesa muy interesante y esperamos que podamos proporcionar una sesión fructífera para todos. Referencias [1] Vizcaino JA, Cote R, Reisinger F, Foster JM, Mueller M, Rameseder J, et al. A guide to the 3URWHRPLFV,GHQWL¿FDWLRQV'DWDEDVHSURWHRPLFV data repository. Proteomics 2009;9:4276-83. [2] Orchard S, Hermjakob H y Apweiler R. The proteomics standards initiative. Proteomics 2003;3:1374-6. $QHZYHUVDWLOH¿OHWUDQVODWRUIRU3URWHRPLFVVWDQGDUGV J. Alberto Medina-Aunon1,2, Salvador Martínez-Bartolomé1,2, J. Pablo Albar1,2 1 Proteomics Facility, National Center for Biotechnology (CNB-CSIC), 2Spanish Proteomics Institute (ProteoRed). Information derived by proteomics experiments such as sample preparation and separation, mass VSHFWURPHWU\SURWHLQLGHQWL¿FDWLRQHWFLVUHSUHsented using different and sometimes incompreKHQVLEOH ¿OH IRUPDWV UHVXOWLQJ QRW YHU\ VXLWDEOH for daily life. To deal with this problem, several initiatives have been developed: HUPO-PSI MIAPE and XML-based formats [1], XML-based repository: PRIDE [2], etc... All of them are contributing effectively within a Proteomics scope, but some lacks regarding the translation between some of the previous schemas are still confusing. In order to contribute to this situation, we have developed a new Sun Java application accessible on the Internet (http://www.proteored.org/). This tool has been designed using common graphics libraries and latest XML parsers offering a friendly and easy LQWHUIDFHDYRLGLQJFRPSOH[FRQ¿JXUDWLRQGLDORJV Currently, the application is able to manage the IROORZLQJ¿OHIRUPDWVSURWHRPLFVVWDQGDUGV0,$PE Gel, MS and MSI documents (MS Excel and XML format), GelML, and PRIDE. To illustrate this innovative work we realized two tests, both of them based on the translation between GelML and MIAPE Gel schemas. Input ¿OHV ZHUH FUHDWLQJ IURP +832 36, 0LFURVRIW Excel template and 2) ProteoRed MIAPE web site (www.proteored.org). Both schemas are perfectly 22 complementary: MIAPE Gel presents a lot of information according to protocols, methods and images and GelML could exchange this information with other bioinformatics tools. In spite of the fact that both present a great combination, some problems appeared during the transformation. For instance, 0,$3(SUHVHQWVDOLQHDOVFKHPDZHOOGH¿QHGSLpeline- whereas GelML is a FUGE based one, dividing the information along several linked sections. Furthermore, any assumption can be done about the cardinality of the relationships between both examSOHV)LQDOO\WKHVHLVVXHVPDGHXVWRGH¿QHDVHWRI FRQ¿JXUDWLRQ¿OHVWRGULYHWKHWUDQVIRUPDWLRQ 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 The described work results a proper correspondence between both formats, allowing a complete translation between MIAPE Gel and GelML schemas. References [1] Martens L, Orchard S, Apweiler R and Hermjakob H. Human proteome organization proteomics standards initiative: data standardization, a view on developments and policy. Mol Cell Proteomics 2007; 6: 1666-1667. [2] Jones P, Côté RG, Martens L, Quinn AF, Taylor CF, Derache : +HUPMDNRE H and Apweiler R. PRIDE: a public repository of protein and SHSWLGHLGHQWL¿FDWLRQVIRUWKHSURWHRPLFVFRPmunity; Nucl Acid Res. 2006; 34 (Database issue): D659-D663. Figure 1. Translation between proteomics standards will be easier. Open-source Bioinformatics Solutions for the Analysis of Mass Spectrometrybased Proteomics Data: Pipelines and Quantitation Alexandre R. Campos Proteomics Platform, Barcelona Science Park, Barcelona, Spain The proteomics community has been generating openly available software framework for systematic proteomic data analyses and management. Processing and analysis of proteomics data involves a complex, PXOWLVWDJHSURFHVVLQFOXGLQJUDZ¿OHSUHSURFHVVLQJ peptide assignment to MSMS experimental spectra, SURWHLQ LGHQWL¿FDWLRQ DQG IXUWKHU YDOLGDWLRQ DQG LQ some cases, MS-based quantitation. Here, I list a number of freely available and open-source computational tools for the analysis of proteomics data. Par- ticularly, I focus on available platforms and pipelines, and software for MS-based quantitation. 1. Platforms and Pipelines for LC-MS and LC-MS/MS Data Analysis :LWKWKHDGYHQWRIQHZJHQHUDWLRQRIPDVVVSHFtrometers arose the necessity of developing new bioinformatics solutions for mining large data sets. In the past years, we have witnessed a dynamic 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 software development process that embraces various functionalities of data analysis process such as the preprocessing of MS data, evaluation and assignment of MS/MS spectra to peptide sequences, comparison and quantitation of multiple LCMS experiments. The burgeoning of proteomics data has fostered the development of a number of public domain proteomics pipelines that integrate a number of open-source, cross-platform tools providing a pluggable development framework for the SURWHRPLFVVFLHQWL¿FFRPPXQLW\,QWKHIROORZLQJ VHFWLRQV,EULHÀ\JRRYHUVRPHRIWKHVHSURMHFWV 7KH7UDQV3URWHRPLF3LSHOLQH733http:// tools.proteomecenter.org/software.php The TPP is a collection of integrated tools for LC-MS/MS data analysis, developed at the Seattle Proteome Center (SPC). The suite includes tools for conversion of instrument vendor’s raw data to mzXML or mzML formats; conversion of spectral search engine (Mascot, X!Tandem, Sequest, Phenyx, OMSSA) results to pepXML format; and statistical validation of search engine results at the peptide- and protein-level with PeptideProphet and ProteinProphet, respectively (and iProphet to combine multiple search results). TPP also supports quantitation analysis for MS1 and MS2 labeling techniques. &3$6 KWWSVZZZODENH\RUJSURMHFW home/begin.view The Computational Proteomics Analysis System (CPAS) is implemented as a Tomcat web-based application for mining LC-MS/MS proteomic experiments. CPAS is distributed with X!Tandem search engine and the PeptideProphet and ProteinProphet validation tools; in addition, it can be also used with other search engines, including Mascot and Sequest. 7KH0606DQDO\WLFPRGXOHHQDEOHVXVHUVWR¿OWHU sort, customize, compare, and export experiment UXQV&3$6FDQDOVREHFRQ¿JXUHGWRSHUIRUP4RU XPRESS quantitation analyses. In contrast to TPP, CPAS helps manage information about biological samples and preparation protocols. 4. TOPP - OpenMS Proteomics Pipeline http://open-ms.sourceforge.net/TOPP.php TOPP is a customizable collection of several small applications, based on OpenMS, an open- 23 source C++ library for LC-MS data management and analysis. The individual applications of TOPP can be grouped into several distinct packages: import/ H[SRUWVLJQDOSURFHVVLQJLGHQWL¿FDWLRQTXDQWLWDWLRQ and analysis. Importing data into TOPP is handled with the FileConverter, which converts several commonly used MS formats into each other. Supported formats are mzML, mzData, mzXML, among other formats. TOPP shares most of the features provided by other pipelines; in addition, TOPP provides a set of computational tools for signal preprocessing (e.g., denoising, baseline correction, and smoothing), and processing (e.g., peak picking, deisotoping, centroiding, and feature extraction). 3URWHLRV6RIWZDUH(QYLURQPHQW3UR6( http://www.proteios.org/ ProSE was initially created as a repository for proteomics data, and just recently has been extended to automate some data assembly and reporting. 3UR6(UXQVRQ7RPFDWVHUYHUDQGSURYLGHVD:HE LQWHUIDFHIRUGDWDDFFHVVDQGDQDO\VLV:KDWPDNHV ProSE different from other platforms is the availability of a programming interface for method developers to write extensions and plug-ins. Extensions and plug-ins make ProSE a highly customizable platform. One can for instance carry out batch searches LQ 2066$ DQG ;7DQGHP YLD WKH :HE LQWHUIDFH and then automatically upload the results to ProSE. In addition, data can be extracted into dedicated database tables for further work with the results, such DV ¿OWHULQJ SURWHLQ LQIHUHQFH DQG FRPELQDWLRQ RI search results. 6. Software for Analysis of MS-based Quantitative Proteomics Data In the past years, MS-based quantitation has emerged as a promising core technology for proWHRPLFVSUR¿OLQJ-DIIHHWDO>@KDYHFODVVL¿HGWKH available MS platforms for quantitative proteomics into three categories: 1) identity-based methods that rely on peptide analysis by data-dependent LC-MS/ 06DQGSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQE\GDWDEDVHVHDUFKLQJ 2) pattern-only methods that focus on production of MS-derived protein patterns, and 3) hybrid identity/pattern-based methods use pattern recognition algorithms to ex post facto assign the identity of LC-MS peaks against databases of peptide sequence, mass, and retention time built from multiple 24 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Graphical User Interface? Operating System DTASelect or pepXML MS1, MS2 and Label-free (Id) Java Yes /2:a MSQuant Instrument vendor rawe Mascot results MS1, MS2 and Label-free (Id) .NET Yes :LQ MaxQuant XCalibur .rawe (high resolution) Mascot results SILAC and labelfree (Id) .NET Yes :LQ mzXML pepXML MS1 C++ Yesb /2:a b XPRESS Type of quantitation Input peptide LGHQWL¿FDWLRQ format MS1/MS2 or mzXML Input spectra format Census Software Language Table 1. Summary of tools for MS-based quantitative proteomics data analysis. ASAPRatio mzXML pepXML MS1 C++ Yes /2:a Multi-Q mzXML pepXML MS2 .NET Yes :LQ iTracker .mgf or .dta none MS2 No Quant .mgf Mascot .dat MS2 Perl Matlab or .NET /2:a /2:a (Matlab) Libra mzXML pepXML MS2 C++ Yesb /2:a APEX none pepXML Label-free (SC) Java Yes /2:a mzXML Feature list (e.g., msInspect) pepXML Label-free (HIP) C++ No /2:a PEPPeR .txt format Label-free (HIP) Perl Yesc /2:a SuperHirn PEPPeR Yes msInspect mzXML pepXML Label-free (Id, HIP, AMT) Java Yes /2:a IDEAL-Q mzXML pepXML Label-free (HIP) .NET Yes :LQ msBID mzXML pepXML Label-free (Id) Java,Perl No /2:a TOPP mzML TOPP adapters MS1, MS2 and Label-free (Id) C++ Yes /2:a 'HFRQ/6¿OHVd or mzXML X!Tandem or Sequest Label-free (AMT) .NET Yes /2:a PNNL pipeline a The acronym L.O.W. refers to Linux, OSX and Windows b Using TPP graphical user interface c Using GenePattern graphical user interface d 'HFRQ/6¿OHVFDQEHH[WUDFWHGIURPP];0/RUDQXPEHURILQVWUXPHQWYHQGRU¶VUDZIRUPDW e 7RFRQYHUWLQVWUXPHQWYHQGRU¶VUDZIRUPDWWKHYHQGRU¶V06DQDO\VLVVRIWZDUHPXVWEHLQVWDOOHG Label-free methods: SC (Spectral Counting); Id (Identity-based); HIP (hybrid identity/pattern-based); and AMT (accurate mass and time) MS1: methods based on precursor intensity or area (e.g., 15N, 18O, SILAC) MS2: methods based on reporter ions in MS/MS (e.g., iTRAQ, TMT) experiments. As MS-based quantitation remains a UDSLGO\GHYHORSLQJ¿HOGZLWKPDQ\GLIIHUHQWH[SHrimental approaches, a large number of open-source (or freely available (academic)) software has been GHYHORSHG DQG PDGH DYDLODEOH IRU WKH VFLHQWL¿F community (Table 1). Reference [1] Jaffe JD, Mani DR, Leptos KC, Church GM, Gillette MA y Carr SA. PEPPeR, a platform for experimental proteomic pattern recognition. Mol Cell Proteomics 2006;5:1927-41. 25 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Java API for MIAPE Generation Emilio Salazar Donate, Miguel Ángel López García, Salvador Martínez-Bartolomé, J. Alberto Medina-Aunon, Juan Pablo Albar ProteoRed, Proteomics Facility, Centro Nacional de Biotecnología (CNB), Consejo Superior de ,QYHVWLJDFLRQHV&LHQWt¿FDV&6,&(0DGULG6SDLQ The HUPO- PSI (Human Proteome OrganizaWLRQ±3URWHRPLFV6WDQGDUG,QLWLDWLYHDLPVWRGH¿ne community standards for data representation in proteomics to facilitate data comparison, exchange DQGYHUL¿FDWLRQ>@ One of these standards is the MIAPE-speci¿FDWLRQV >@ 0,$3( WKH 0LQLPXP ,QIRUPDWLRQ About a Proteomics Experiment, contains the basic reporting guidelines for proteomics. Although, these guidelines are an invaluable support for experiments due to its acceptance by the proteomics UHVHDUFKHUVDQGMRXUQDOVWKHOHYHORIIXO¿OOPHQWIRU every experiment requires a time consuming duty from the user side. The Miape JAVA API (Application Programming Interface) developed by the CNB-ProteoRed Proteomics Bioinformatics Support group provides the user with a powerful, platform-independent programmatic interface to store, retrieve and export MIAPE documents in different formats. The libraries and the documentation are freely available at www.proteored.org/miape-api is via the abstract entity Miape, which includes the information available about the experiment, regardless if it has been generate via XML, manually or it has been retrieved from the database. Moreover, the API allows the user to convert the data from one module to another, favoring the exchange of information in very different formats. The modules are: 7KHDatabase Manager module: retrieves/stores documents from the ProteoRed Database, a relational database which has, so far, more than 700 documents. However, this module can be easily extended to be used in other Databases (relational or not). 7KHXMLPRGXOHLVDEOHWRSDUVH¿OHVIURP different XML formats to generate the MIAPE documents. 7KHFactory module creates a document manually by programmatically adding the information to the document. The language of the API is Java, an object-oriented language, massively used in professional and academia environments due to its maintainability and ÀH[LELOLW\DVZHOODVLWVSODWIRUPLQGHSHQGHQFH The aim of the API is to be integrated into third party software to automatically generate a MIAPE, decreasing the amount of extra work which this normally involves. So far, the user must manually submit this information independently, using the semi-automatic MIAPE generator tool [3], which allows the user to create a MIAPE, using templates with some initial information. The API is divided in several independent modules, which can be extended for customization, (see Figure 1). The interaction between the modules Figure 1. The different modules of the Miape JAVA API and their interactions. 26 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 References [1] Kaiser J. Proteomics. Public-private group maps out initiatives. Science 2002;296:827. >@ 7D\ORU&)3DWRQ1:/LOOH\.6%LQ]3$-XOLDQ RK, Jr., Jones AR, et al. The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE). Nat Biotechnol. 2007; 25:887-93. [3] Martínez-Bartolomé S, Medina-Aunon JA, Jones AR, Albar JP. “Semi-automatic tool to describe, store and compare proteomics experiments based on MIAPE compliant reports”. Proteomics (in press) 2009. 7KH3URWHRPLFV,GHQWL¿FDWLRQVGDWDEDVH35,'(LWVDVVRFLDWHGWRROVDQGWKH ProteomeXchange consortium Juan Antonio Vizcaíno, Florian Reisinger, Richard Côté, Henning Hermjakob (0%/(%,:HOOFRPH7UXVW*HQRPH&DPSXV+LQ[WRQ&DPEULGJH8QLWHG.LQJGRP Abstract 7KH3URWHRPLFV,GHQWL¿FDWLRQV'DWDEDVH35,DE, http://www.ebi.ac.uk/pride) has become one of the main repositories of mass spectrometry derived proteomics data. In this communication we will summarize the main capabilities of the PRIDE system, including its associated tools. Finally, we will introduce the ProteomeXchange consortium, as a collaborative approach to share proteomics data between the most important proteomics repositories. ebi.ac.uk/olsDQGWKH3URWHLQ,GHQWL¿HU&URVV5Hferencing system [3] (PICR, http://www.ebi.ac.uk/ Tools/picr). OLS provides convenient and powerful access to a large number of biomedical ontologies and controlled vocabularies (CVs). PRIDE takes advantage of OLS to store, structure, and present any and all metadata annotations on experiments, proteins, peptides and mass spectra. 7KH35,'(3URWHRPLFV,GHQWL¿FDWLRQVGDWDEDVH (http://www.ebi.ac.uk/pride) at the European Bioinformatics Institute (EBI) provides users with the ability to explore and compare mass spectrometry (MS) based proteomics experiments that reveal details of the protein expression found in a broad range of taxonomic groups, tissues and disease states [1]. PRIDE stores three different kinds of information: SHSWLGHDQGSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQVGHULYHGIURP06 or MS/MS experiments, MS and MS/MS mass spectra as peak lists, and any and all associated metadata. PRIDE is now the recommended submission point for proteomics data for several journals such as Nature Biotechnology, Nature Methods, Molecular and Cellular Proteomics, and Proteomics. The PICR tool on the other hand, is built to overcome one of the most recurrent problems in proteomics: the existence of heterogeneous and changing LGHQWL¿HUVRUDFFHVVLRQQXPEHUVUHIHUULQJWRWKHVDPH protein in different databases. PICR is used to map DOO WKH VXEPLWWHG SURWHLQ LGHQWL¿FDWLRQV LQ 35,'( to all known accession numbers for those proteins in the most important protein databases (including UniProt, IPI, Ensembl and RefSeq, among others). 7KHUHIRUHSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQVLQ35,'(WKDWZHUH originally derived from different databases, or from different time points of the same database, thus become fully comparable. In addition to these two established tools, a new application called Database on Demand [4] (DoD, http://www.ebi.ac.uk/pride/dod) has recently been added to the PRIDE toolkit. This tool allows custom sequence databases to be built in order to optimize the results from search engines for gel-free proteomics experiments. 1. PRIDE associated tools 2. ProteomeXchange Consortium PRIDE relies heavily on two additional tools: the Ontology Lookup Service [2] (OLS, http://www. One of the reasons why proteomics data sharing is not a universal fact yet is the heterogeneity of the 27 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 existing proteomics repositories, each repository having a major focus. This is why the ProteomeXchange consortium was founded [1]. The current members and the way they interact are represented in Figure 1. Guidelines for ProteomeXchange subPLVVLRQVDUHEHLQJ¿QDOL]HGhttp://www.proteomexchange.org), and include three mandatory data types that will have to be included per submission: insWUXPHQW RXWSXW ¿OHV UDZ GDWD SHDN OLVWV DVVRFLDWHGPHWDGDWDDQGSHSWLGHSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQV A large scale ProteomeXchange pilot submission has already been performed containing data from the HUPO Plasma Proteome Project 2 (PPP 2) [5]. Therefore, certain experiments in PRIDE (experiment accession numbers 8172-8544, http://www. ebi.ac.uk/pride/ppp2_links.doFRQWDLQOLQNVWR¿OHV stored in the Tranche repository in the “Experiment View” page. For these experiments, it is therefore already possible to get the original raw data or VHDUFKHQJLQHRXWSXW¿OHVZKLFKDUHQRWVWRUHGDV such in the PRIDE system. Figure 1. 6XPPDU\¿JXUHRIWKH3URWHRPH;FKDQJHFRQVRUWLXPGDWDÀRZ'DWDVXEPLVVLRQVDUHVHQWWRWKHFRQVRUWLXP via PRIDE or NCBI Peptidome. The ProteomeXchange partners then ensure data are distributed internally, ultimately giving users the ability to access the data from any participant database. References [1] Vizcaíno JA, Côté R, Reisinger F, Foster J, Mueller M, Rameseder J, et al. A guide to the 3URWHRPLFV,GHQWL¿FDWLRQV'DWDEDVHSURWHRPLFV data repository. Proteomics 2009;9:4276-83. [2] Côté RG, Jones P, Martens L, Apweiler R. and Hermjakob H. The Ontology Lookup Service: more data and better tools for controlled vocabulary queries. Nucleic Acids Res : [3] Côté RG, Jones P, Martens L, Kerrien S, Reisinger F, Lin Q, et al 7KH 3URWHLQ ,GHQWL¿HU Cross-Referencing (PICR) service: reconciling SURWHLQLGHQWL¿HUVDFURVVPXOWLSOHVRXUFHGDWDbases. BMC Bioinformatics 2007;8:401. [4] Reisinger F. and Martens L. Database on Demand – an online tool for the custom generation of FASTA formatted sequence databases. Proteomics 2009;9:4421-4. [5] Omenn GS, Aebersold R. and Paik YK. 7(th) +832 :RUOG &RQJUHVV RI 3URWHRPLFV ODXQching the second phase of the HUPO Plasma Proteome Project (PPP-2) 16-20 August 2008, Amsterdam, The Netherlands. Proteomics 2009;9:4-6. 28 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Proteopathogen, una base de datos de proteínas para el estudio de la interacción Candida albicans – hospedador Vital Vialás1, Rubén Nogales-Cadenas2, César Nombela1, Alberto Pascual-Montano2, Concha Gil1,3 1 Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid. 2 Departamento de Arquitectura de Computadores y Automática, Facultad de Ciencias Físicas, Universidad Complutense de Madrid. 3 8QLGDGGH3URWHyPLFD8&03DUTXH&LHQWt¿FRGH0DGULG)DFXOWDGGH)DUPDFLD Universidad Complutense de Madrid Existen en la actualidad repositorios públicos en la web para el almacenamiento y gestión de datos SURWHyPLFRVDVtFRPREDVHVGHGDWRVHVSHFt¿FDVGH hongos. Sin embargo, ninguno de ellos está enfocaGRHVSHFt¿FDPHQWHDOiUHDGHLQYHVWLJDFLyQGHKRQgos patógenos y su interacción con el hospedador y contiene además datos experimentales proteómicos. En este contexto presentamos Proteopathogen, una base de datos orientada a recopilar datos experimentales proteómicos y a facilitar el almacenamiento y acceso a un amplio rango de información, abarcando ÀXMRV GH WUDEDMR HQ 3URWHyPLFD GHVGH OD GHVFULSción del experimento que lleva a la preparación de la muestra hasta los parámetros de espectrometría GHPDVDV\ORVSpSWLGRVTXHDSR\DQODVLGHQWL¿FDciones. Proteopathogen está actualmente enfocado hacia Candida albicans y su interacción con macrófagos, sin embargo, datos experimentales relativos a otras especies de hongos patógenos y células de mamíferos pueden ser adecuados para la inserción en la base de datos. Proteopathogen es públicamente accesible en http://proteopathogen.dacya.ucm.es. Candida albicans es un hongo patógeno oportunista presente habitualmente en las mucosas humanas. En individuos inmunocomprometidos puede proliferar excesivamente y provocar candidiasis, una micosis muy extendida y en ocasiones fatal. En este sentido, abordar estudios proteómicos sobre la interacción de Candida con células del sistema inmune es clave para mejorar nuestra comprensión del proceso de infección y puede suponer un paso inicial en investigación básica para el futuro desarrollo de métodos de diagnóstico, vacunas y fármacos antifúngicos. Respecto a la recopilación de información contenida en Proteopathogen, se han incluido datos correspondientes a tres experimentos. Los dos prime- ros corresponden a trabajos de interacción Candida – macrófago [1,2] de los cuales el primero incluye SURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVGHCandida y el segundo, 38 proteínas de macrófago. El tercer estudio es un conjunto de experimentos destinados a la extracción HLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVGHPHPEUDQD\SURWHtnas con anclaje GPI [3] de C. albicans. Además de la información experimental, y con el objetivo de proporcionar una visión más amplia de los datos, se recuperó información relevante de bases de datos en la web. Se obtuvieron de CGD >@ LGHQWL¿FDGRUHV VLQyQLPRV RUWyORJRV HQ Saccharomyces cerevisiae, anotaciones de Gene Ontology y anotaciones para las proteínas de Candida, mientras que en el caso de proteínas de macrófagos murinos, la información equivalente se obtuvo de UniProt [5] y de Mouse Genome Database [6]. También se recuperaron de KEGG [7], e información de estructuras de PDB [8] En cuanto a la arquitectura de la aplicación, la estructura básica consiste en una base de datos MySQL gestionada por la plataforma de desarrollo web Ruby on Rails que permite crear las tablas y relaciones entre los datos, manejar las consultas y mostrar las páginas. El contexto experimental es tratado en Proteopathogen jerárquicamente, mostrando una aproximación general del estudio, en donde se detallan DXWRUHV WtWXOR GH OD SXEOLFDFLyQ H LGHQWL¿FDGRU de PubMed, y dentro de esa descripción general, los experimentos concretos que dan lugar a las LGHQWL¿FDFLRQHV La información sobre una proteína particular se muestra dividida en secciones (Figura 1). En la sección titulada Protein Basic Information se muestran el número de acceso de Uniprot, descripción de la 29 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 proteína, especie, evidencia de la existencia, nombre HVWiQGDUGHOJHQLGHQWL¿FDGRUHVGHEDVHVGHGDWRV HVSHFt¿FDV GH RUJDQLVPR RUWyORJRV \ VHFXHQFLD En la sección Experiments se listan aquellos expeULPHQWRV HQ TXH VH KD LGHQWL¿FDGR OD SURWHtQD HQ particular. Además, y en los casos que las anotaciones estén disponibles, se muestran una o más de las siguientes secciones: anotaciones de Gene Ontology con las correspondientes referencias, rutas de KEGG y CGD, e información estructural de PDB. En todos los casos, las proteínas aparecen relacionadas con los experimentos a los que pertenecen de forma que se puede enlazar con la información UHODWLYD D OD LGHQWL¿FDFLyQ (VWRV GDWRV FRPSUHQden, por una parte parámetros comunes a todas las SURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVHQFDGDH[SHULPHQWRLQFOXyendo la base de datos de la búsqueda, software de DQiOLVLVHQ]LPDGHGLJHVWLyQPRGL¿FDFLRQHV¿MDV\ variables y máximo número permitido de cortes no efectuados. Por otra parte también están presentes ORVGDWRVTXHVHUH¿HUHQDFDGDLGHQWL¿FDFLyQGRQGH se muestran la secuencia de los péptidos, su masa observada y masa teórica y la puntuación. La interfaz pública de Proteopathogen ofrece múltiples formas de consultar el contenido. Es posible navegar por la lista de experimentos y visualizar rápidamente la lista de proteínas pertenecientes a cada uno de ellos, pero también se puede utilizar el formulario de búsqueda. Éste acepta varios tipos de LGHQWL¿FDGRUHV\DGHPiVSHUPLWHUHDOL]DUE~VTXHGDV por texto libre, recuperando una lista de proteínas que muestren coincidencias. Por último, y para mejorar la interactividad con el usuario, Proteopathogen incluye un formulario para el envío de datos. Éstos serán revisados por XQDGPLQLVWUDGRU\XQDYH]YHUL¿FDGRVSRGUiQVHU incluidos en la base de datos. Referencias [1] Fernández-Arenas E, Cabezón V, Bermejo C, Arroyo J, Nombela C, Diez-Orejas R, et al. Integrated genomic and proteomic strategies bring new insight into Candida albicans response upon macrophage interaction. Mol Cell Proteomics 2007; 6: 460-478. [2] Martínez-Solano L, Nombela C, Molero G, Gil C. Differential protein expression of murine macrophages upon interaction with Candida albicans. Proteomics 2006; 6: 133-144. [3] Cabezón V, Llama-Palacios A, Nombela C, Monteoliva, L, Gil C. Analysis of Candida albicans plasma membrane proteome. Proteomics 2009; 12, 9(20):4770-4786. [4] Arnaud MB, Costanzo MC, Skrzypek MS, Binkley G, Lane C, Miyasato SR, et al. The Candida Genome Database (CGD), a community resource for Candida albicans gene and protein information. Nucleic Acids Res 2005; 33:358-363. [5] UniProt Consortium. The Universal Protein Resource (UniProt). Nucleic Acid Res 2008; 36: 190-195. [6] Bult C, Eppig JT, Kadin JA, Richardson JE, Blake JA The Mouse Genome Database (MGD): mouse biology and model systems. Nucleic Acids Res 2008;36: 724-728. [7] Kanehisa M, Araki M, Goto S, Hattori M, Hirakawa M, Itoh M, et al. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucleic Acids Res 2008; 36: 480-484. >@ %HUPDQ +0 :HVWEURRN - )HQJ = *LOOLODQG *%KDW71:HLVVLJ+HWDO7KH3URWHLQ'DWD Bank. Nucleic Acids Res 2000; 28: 235-242. 30 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Bioinformatics tools for inferring immune-related functions from proteomic data Gema Sanz, Ángeles Jiménez, Ángela Moreno, Juan José Garrido Genómica y Mejora Animal, Departamento de Genética, Universidad de Córdoba, Campus de Rabanales, 14071 Córdoba, Spain The development of functional genomics technologies has lead to the generation of large amounts of data that needs to be structured for easier interpretation and full exploitation of the knowledge hidden in huge databases. This is only possible ZKHQ ZH DSSO\ HI¿FLHQW DQDO\VLV WRROV LQ RUGHU WR discover new techniques for data storage, querying, extracting and mining. In the present study, we use an experimental model of response to infection, based in the exposure of neutrophils to LPS from Salmonella typhimurium. Neutrophil activation by LPS involves the production of reactive oxygen intermediates, release of lipid mediators and cytokines, adhesion, and phagocytosis. However, recent studies indicate that a robust transcriptional response, mainly of cytokines, occurs in neutrophils after LPS stimulation, suggesting that this LQÀDPPDWRU\FHOOVGRPXFKPRUHWKDQMXVWUHOHDVLQJ mediators and bactericidal agents [1, 2]. The aim of this study was 2-fold. Firstly, it was intended to identify novel proteins involved in the swine neutrophils response to LPS by using a 2-dimensional gel electrophoresis (2-DE) approach. Despite of the rise of new technologies in quantitative differential proteomics, 2-DE and matrix-assisted laser-desorption ionization time of ÀLJKW PDVV VSHFWURPHWU\ 0$/',72)06 DUH still the most widespread methods for proteomics studies [3]. The differences in protein expression after LPS treatment may lead to the elucidation RI SURWHLQ IXQFWLRQV RU SDWKZD\V RI LQÀDPPDWRU\ processes, which could be involved in immune response against bacterial pathogens. And secondly, it used bioinformatics tools such as Ingenuity Pathway Analysis (IPA, www.ingenuity.com) and Cytoscape (www.cytoscape.org), to analyze how these altered proteins interact in a cellular context to perform certain biological functions. Figure 1. %LRIXQFWLRQVDQGGLVHDVHVVLJQL¿FDQWO\DOWHUHGWKURXJKWKHWLPHFRXUVH. Differentially expressed proteins were subjected to statistical analysis with a Student´s T-test and those categories with p < 0.05 were listed. The number of proteins in each category is shown at the right side of the bars. 31 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Blood samples were collected at the slaughterKRXVHIURP¿YH,EHULDQKHDOWK\SLJVDQGQHXWURSKLOV were isolated with Dextran sedimentation and centrifugation through Ficoll-Paque. For LPS stimulation, the neutrophils were incubated for 6, 9 and 18 hours in presence or absence of 100 ng/ml LPS. Proteins were solubilized and the extracts were pooled and six replicate 2-DE gels for condition (untreated cells and treated with LPS) were analysed by 2-DE. The LPS-induced changes in proteins was subjected to statistical analysis with a Student’s t test after FKHFNLQJ QRUPDOLW\ E\ WKH:LONV6KDSLUR WHVW DQG those spots with p< 0.05 were analyzed by MALDI TOF-TOF (MS/MS). The number of differentially expressed proteins in neutrophils after LPS treatment varied through the time-course. Up today, 44 and 31 proteins for 6 and 18 KRXUVZHUHLGHQWL¿HGUHVSHFWLYHO\'DWDDQDO\VLVZLWK IPA revealed that several immune response-related IXQFWLRQVVXFKDVLQÀDPPDWRU\DQGUHVSLUDWRU\GLVHDse, cellular movement and organization or cell death were altered during the time-course (Figure 1). Differentially expressed proteins in each timepoint were subjected to BiNGO plugin of Cytoscape [4] in order to elucidate the relationship among the altered GO functions through the time course LQDXQL¿HGFRQFHSWXDOIUDPHZRUN7KHUHVXOWVRI WKLVDQDO\VLVDUHVKRZQLQ)LJXUH%ULHÀ\LPPXne related functions such as killing and apoptosis are conserved both at 6 and 18 hours. Similarly, cellular metabolism was also altered through the time course. In conclusion, LPS stimulation alters the patterns of protein expression in neutrophils, and the present UHVXOWV UHSUHVHQW WKH ¿UVW FRPSUHKHQVLYH VWXG\ WR better understanding a complex biological event such as the swine innate immune response. Bioinformatics provides many tools for analyzing protein data sets by visually exploring biological networks, including well-known examples such as IPA and Cytoscape. Since these tools can integrate graph drawing, information visualization, network analysis and biology, we can use them to interpret our results from a proteomic approach in an easy way. Figure 2. BiNGO analysis for 6 and 18 hours. Nodes represent biological functions categories and edges represent the LQWHUDFWLRQDPRQJWKHP6WDWLVWLFDOVLJQL¿FDQFHRIHDFKFDWHJRU\LVVKRZQDVJUH\VFDOHZKHUHEODFNLVWKHPRVWVLJQL¿FDQW function. Node weight indicates the number of interactions. Oligonucleotide Microarrays and Proteomics. CHEST 2002; 121: 75S-76S. References [1] Malcolm KC, Arndt PG, Manos EJ, Jones DA, \:RUWKHQ*60LFURDUUD\DQDO\VLVRIOLSRSRlysaccharide-treated human neutrophils. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2003; 284: L663-L670. >@ )HVVOHU0%0DOFROP.&'XQFDQ0:\:RUthen GS. Lipopolysaccharide Stimulation of the Human Neutrophil: An Analysis of Changes in Gene Transcription and Protein Expression by [3] Monteoliva L y Albar JP. Differential proteomics: An overview of gel and non-gel based DSSURDFKHV %ULH¿QJV LQ )XQF *HQRPLFV DQG Proteomics 2004; 3: 220-239. [4] Maere S, Heymans K and Kuiper M. BiNGO: a Cytoscape plugin to assess overrepresentation of Gene Ontology categories in Biological Networks. Bioinf Applic Note 2005; 16: 3448-3449. 32 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 2. BIOMARCADORES Y PATOLOGÍAS HUMANAS Coordinadores: Ángel García y Cristina Ruiz Protein targets of oxidative stress induced by Huntington disease in human brain Evaluation of an HD mice model: Tet/HD94 M. Alba Sorolla1, Isidre Ferrer2, José Lucas3 Joaquim Ros1, Elisa Cabiscol1 1 Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques, Universitat de Lleida, Spain. 2Institut de Neuropatologia, Servei d’Anatomia Patològica, IDIBELL-Hospital de Bellvitge, Universitat de Barcelona, Spain. 3Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), C/Nicolás Cabrera, 1 Campus Cantoblanco, Universidad Autónoma de Madrid, Spain. Huntington disease (HD) is an inherited neurodegenerative disorder characterized by degeneration of neurons affecting the striatum and the cortex. The disease involves expansion of CAG trinucleotide repeats in the huntingtin gene codifying for glutamines in the htt protein [1]. doxal 5-phosphate kinase, potentially leading to a reduction in PLP availability. PLP is a cofactor of enzymes involved in neurotransmitter metabolism (GABA production). The main goal of this work is to study protein oxidation in post-mortem tissue samples (striatum) from individuals affected of HD. Moreover, a conditional HD mouse model is used to evaluate whether similar proteins are affected in these mice (Tet/HD94) [2]. These mice express a polyQ sequence of 94 glutamines under the control of a doxycycline-regulatable promoter and resembles the human phenotype. Protein oxidation by reactive oxygen species can generate carbonyl groups on the side-chain of several amino acids and these groups can be derivatized by 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) and GHWHFWHGE\:HVWHUQEORW>@:HSHUIRUPHGD' gel electrophoresis analysis followed by anti-DNP :HVWHUQEORWLQRUGHUWRLGHQWLI\R[LGL]HGSURWHLQV in human brain post-mortem samples obtained from striatum of HD patients compared to samples of age and sex-matched controls (Figure 1). A comparison between 8 control-HD pairs was made and spots that showed a ratio of oxidation level HD/ control > 1.5 (once normalized for protein amount) ZHUHLGHQWL¿HGE\30)RU06067DEOH7KH most interesting result was the oxidation of pyri- Figure 1. Oxyproteome analysis of human samples. Comparative analysis revealed several spots with increased oxidaWLRQOHYHOVLQ+',GHQWL¿FDWLRQZDVSHUIRUPHGDQGSURWHLQV listed in Table 1. The results from Tet/HD94 mice show that protein oxidation is increased in HD94 expressing mice (gene on) in striatum, while no differences are observed in cortex and cerebellum (Fig 2). Also, there 33 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Table 1. ,GHQWL¿FDWLRQRIR[LGL]HGSURWHLQVLQ+' SPOT PROTEIN GENE ACCESSION NUMBER MOLECULAR 0$66'$ 1 2 3 112,76 Transitional endoplasmic UHWLFXOXP$73DVH9&3 VCP P55072 89322 50,50 5 7,38 +HDWVKRFNFRJQDWHN'D protein HSC71 P11142 70898 7 ALDH7A1 P49419 55332 Cytosol aminopeptidase LAP3 P28838 56131 T-complex protein 1 subunit beta CCT2 P78371 57452 9 10 ĮHQRODVH ENO1 P06733 47169 1,79 4,88 13 1*1*GLPHWK\ODUJLQLQH dimethylaminohydrolase1 14 3\ULGR[DONLQDVH 1,90 DDHA1 O94460 31122 PDXK O00764 35080 15 16 3,40 5,41 11 12 1,64 2,53 ĮDPLQRDGLSLFVHPLDOGHK\GH dehydrogenase 8 9,02 423,73 4 6 *OXIDATION 1,82 2,42 47,01 3\UXYDWHNLQDVHLVRHQ]\PHV0 M2 PKM2 P14618 57937 17 15,26 4,86 18 ATP synthase subunit alpha ATP5A1 P25705 59751 2,32 19 *O\FHUDOGHK\GHSKRVSKDWH dehydrogenase GAPDH P04406 36053 2,28 20 Cytochrome b-c1 complex subunit 2, mitochondrial UQCRC2 P22695 48413 7,93 CS O75390 51680 &UHDWLQHNLQDVHXELTXLWRXV mitochondrial CKMT1A P12532 47007 &UHDWLQHNLQDVHVDUFRPHULF mitochondrial CKMT2 P17540 47474 Fructose-biphosphate aldolase A ALDOA P04075 39395 Citrate synthase, mitochondrial 21 7,51 *The oxidation level is estimated as a ratio between HD and control oxidation signal, divided by the ratio of their protein amount. 34 is an evident decrease in the pyridoxal 5-phosphate kinase levels in the HD94 expressing mice (gene on), that is recovered after 5 months of doxycycline treatment (gene off), reaching the levels of control mice. Moreover, this protein seems to be more oxidized in the “gene on” mice (Figure 3). 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 As a conclusion, the human oxyproteome experiments show a clear energetic failure and PLP metabolism disruption. Moreover, these evidences are also observed in the mice model, leading to the hypothesis that possible interventions to increase PLP availability and energy production can be taken in account. References Figure 2. Protein oxidation in Tet/HD94 mice. All mice were 24 months old. C: control mice; HD: “gene on” mice; HD+doxy: “gene on” for 19 months + “gene off” for 5 months (doxycycline treatment). )LJXUH Levels and oxidation of pyridoxal 5-phosphate NLQDVHLQ7HW+'PLFH$PSOL¿HGVHFWLRQVRIZHVWHUQEORW anti-PDXK and anti-DNP from 2D gel separation of tissue extracts from striatum of Tet/HD94 mice. [1] Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell 1993; 72: 971-983. [2] Yamamoto Ai, Lucas JJ and Hen R. Reversal of Neuropathology and Motor Dysfunction in a Conditional Model of Huntington disease. Cell 2000; 101:57-66. >@ /HYLQH 5/ :LOOLDPV -$ 6WDGWPDQ (5 DQG Shacter, E. Carbonyl assays for determination RIR[LGDWLYHO\PRGL¿HGSURWHLQV0HWKRGV(Qzymol. 1994; 233: 346-357. 35 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 ,GHQWL¿FDFLyQPHGLDQWHSURWHyPLFDGHSRVLEOHVELRPDUFDGRUHVSODTXHWDULRVHQ síndrome coronario agudo Andrés F. Parguiña1, Isaac Rosa1, Lilián Grigorian-Shamagián2, Elvis Teijeira-Fernández2, Jana Alonso2, Rosa Agra2, José Ramón González-Juanatey2, Ángel García1 1 Dpto de Farmacología; Universidad de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela. 2Complexo Hospitalario Universitario de Santiago, Santiago de Compostela Introducción La activación plaquetaria y la formación del trombo juegan un papel fundamental en el síndrome coronario agudo (SCA), principal causa de muerte en Europa. El SCA es una enfermedad crónica que se desarrolla durante la vida del individuo a causa de la lenta acumulación de placa de ateroma en las arterias (aterosclerosis). La placa de ateroma se va endureciendo poco a poco encerrando en su interior un núcleo lipídico rodeado SRUXQDFDSDGHQVD\¿EURVDTXHSXHGHGHELOLWDUVH debido a una serie de razones patológicas y llegar a romperse dando lugar a la formación de un coágulo. Si este coágulo llega a bloquear las arterias coURQDULDVSXHGHUHGXFLURLQFOXVRLPSHGLUHOÀXMRGH sangre al corazón (isquemia). Debido a esta falta de oxígeno en el corazón el paciente, dependiendo de la gravedad, puede sufrir desde dolor al hacer ejercicio (angina estable [AE]) hasta una situación aguda como una angina inestable (AI) o un infarto de miocardio (IM). Las plaquetas juegan un papel fundamental en la patogénesis de la aterosclerosis y el SCA [1]. De hecho, la mayoría de las terapias existentes para tratar esta enfermedad interrumpen la activación plaquetaria. Dado que las plaquetas carecen de núcleo, la proteómica es una herramienta fundamental para su estudio. Por todo ello, el estudio del proteoma plaquetario en el contexto del evento agudo podría ayudar a descubrir biomarcadores o dianas terapéuticas que contribuyan a un mejor tratamiento/diagnóstico de la enfermedad. Ese ha sido el objetivo del presente trabajo. Métodos Basándonos en nuestra experiencia en proteómica de plaquetas [2-5], hemos utilizado la 2-DE para comparar el proteoma de 18 pacientes con síndrome coronario agudo sin elevación del segmento ST en el electrocardiograma (SCASEST) frente al de un grupo control constituido por 10 individuos con cardiopatía isquémica crónica estable. La toma de muestra de los pacientes con SCASEST se hizo en tres puntos: al ingreso (menos de 24 horas desde el inicio del evento agudo), a los 5 días y a los 6 meses. Los grupos se cotejaron de manera que no hubiese GLIHUHQFLDVVLJQL¿FDWLYDVHQHGDGVH[R\WUDWDPLHQtos. Las plaquetas se procesaron en menos de dos horas tras la extracción sanguínea. Tras extraer las proteínas, éstas se separaron mediante electroforesis bidimensional (2-DE). La primera dimensión fue en tiras de gradiente inmovilizado de pH (4-7, 24 cm). Se escogió esa franja de pI porque análisis anteriores que hemos llevado a cabo han demostrado que la mayor parte de las proteínas plaquetarias detectables mediante 2-DE se encuentran en dicha región del proteoma [2]. La segunda dimensión fue en geles del 10% de poliacrilamida. Los geles fueron teñidos con SYPRO Ruby, y escaneados en un Typhoon 9410 (GE Healthcare). Las imágenes fueron analizadas utilizando el software Ludesi REDFIN (Suecia). Resultados En cada gel se detectaron más de 2300 spots. Tras el análisis diferencial, se detectaron 55 spots correspondientes a proteínas que variaban entre los grupos SCASEST y control (p<0.05 y variaciones GHLQWHQVLGDG!)LJXUD/DVSURWHtQDVLGHQWL¿cadas mediante espectrometría de masas (MALDITOF/TOF), correspondían a 30 genes diferentes. Los resultados fueron validados mediante western blot. /DPD\RUtDGHODVSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVSHUWHQHFHQ a 3 grupos funcionales: señalización, citoesqueleto y ruta de secreción/vesículas. Esto concuerda con la idea de que existe una mayor activación plaquetaria en pacientes con SCASEST y fue respaldado por la disminución del número de diferencias en el día 5 tras el ingreso (26 spots diferentes) y a los 6 meses 36 (2 spots diferentes). Algunas de las proteínas identi¿FDGDVHVWiQLQYROXFUDGDVHQODUXWDGHVHxDOL]DFLyQ GHODLQWHJULQDĮ,,EȕTXHHVXQRGHORVSULQFLSDOHV responsables del proceso de activación plaquetaria. Es el caso de ILK, Src y talin. En la mayoría de los FDVRVODVGLIHUHQFLDVVHGHELHURQDPRGL¿FDFLRQHV post-traduccionales. También se detectó una menor presencia de proteínas secretadas en pacientes SCASEST lo que podría deberse al proceso de secreción que sufren las plaquetas tras activarse. Se observó como la tendencia era que estas últimas proteínas estuviesen en mayor cantidad en el plasma pobre en plaquetas de los pacientes SCASEST. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Agradecimientos AG es investigador Ramón y Cajal del Dpto de Farmacología de la Universidad de Santiago de Compostela; AFP es becario FPI del mismo deparWDPHQWR/RVDXWRUHVDJUDGHFHQOD¿QDQFLDFLyQGHO Ministerio de Ciencia e Innovación de España (ref. SAF2007-61773), la Consellería de Educación de la Xunta de Galicia y la Fundación de Investigación Médica Mutua Madrileña. Bibliografía [1] Lindemann S, Krämer B, Seizer P y Gawaz 03ODWHOHWVLQÀDPPDWLRQDQGDWKHURVFOHURVLV Journal of thrombosis and haemostasis 2007;5 Suppl 1:203-11. [2] García A, Prabhakar S, Brock CJ, et al. Extensive analysis of the human platelet proteome by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics 2004;4:656-68. [3] García A, Prabhakar S, Hughan SC, et al. Differential proteome analysis of TRAPactivated platelets: involvement of DOK-2 and phosphorylation of RGS proteins. Blood 2004;103:2088-95. [4] García A, Senis YA, Antrobus R, et al. A global proteomics approach identifies novel phosphorylated signaling proteins in GPVI-activated platelets: involvement of G6f, a novel platelet Grb2-binding membrane adapter. Proteomics 2006;6:5332-43. [5] Senis YA, Antrobus R, Severin S, Parguiña AF, 5RVD , =LW]PDQQ 1 :DWVRQ 63 \ *DUFtD$ Proteomic analysis of integrin alphaIIbbeta3 outside-in signaling reveals Src-kinase-independent phosphorylation of Dok-1 and Dok-3 leading to SHIP-1 interactions. Journal of thrombosis and haemostasis 2009;7:1718-26. Figura 1. Imagen representativa del proteoma de plaquetas resaltando los 55 spots que varían entre pacientes SCASEST y controles crónicos. Conclusión Se ha empleado satisfactoriamente la proteómica GHSODTXHWDVEDVDGDHQ'(SDUDLGHQWL¿FDUSURteínas –provenientes de 30 genes diferentes– que varían entre pacientes SCASEST y controles crónicos. En próximos estudios investigaremos el papel de las SURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVHQODSDWR¿VLRORJtDGHO6&$\ exploraremos su uso potencial como biomarcadores para el tratamiento y/o prognosis de la enfermedad. 37 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Análisis de la expresión diferencial de proteínas en el suero de ratones C57BL/6 VLOYHVWUHVUHVSHFWRDUDWRQHV&%/GH¿FLHQWHVSDUD&'XWLOL]DQGRXQDFROHFFLyQFRPELQDWRULDGHKH[DSpSWLGRVProteoMiner\HOHFWURIRUHVLV' Antonio Rosal, Sonia García-Rodríguez, Esther Zumaquero, Pilar Navarro, Mercedes Zubiaur, Jaime Sancho Departamento de Biología Celular e Inmunología, Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC, Armilla (Granada) Introducción La tecnología asociada al ProteoMiner permite reducir el rango dinámico del proteoma sérico aumentando la concentración de las proteínas poco abundantes y diminuyendo simultáneamente la concentración de las proteínas más abundantes, consiguiéndose una mayor diversidad de especies proteicas. Una desventaja es que en su formato tradicional se necesita partir de una concentración de proteínas relativamente grande, impidiendo su utilización cuando el material de partida es escaso. En este estudio se ha utilizado esta técnica en combinación con la separación de proteínas por electroforesis en JHOHV'y'HLGHQWL¿FDFLyQSRUHVSHFWURPHWUtD de masas, para el análisis de la expresión diferencial de proteínas en sueros de ratones B6 silvestres HQFRPSDUDFLyQFRQUDWRQHVGH¿FLHQWHVSDUD&' (CD38ko) a partir de volúmenes de sangre relativamente pequeños (100-200 µl). Material y métodos El kit ProteoMiner de pequeña capacidad para análisis por geles 2-D (Bio-Rad) fue utilizado siguiendo las instrucciones del fabricante. Las proteínas eluidas de las columnas de hexapéptidos se separaron en geles 1-D (30 µg) o 2-D (50 µg). Para la separación en geles 2-D se utilizó el sistema Protean IEF (Bio-Rad) en la primera dimensión y el sistema CRITERION (Bio-Rad) en la segunda (1). Para la primera dimensión se compararon dos soluciones diferentes: Solución I (7M Urea, 2 M Thiourea, 1% ASB-14, 40 mM Tris, 2 mM TBP y 0.2% Anfolitos) o Solución II (8 M Urea, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 2 mM TBP y 0.2% Anfolitos). Los geles se tiñeron con 6<3525XE\/DLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVSRU MS o MS/MS se realizó de forma idéntica a la de nuestro trabajo previo [1]. El análisis diferencial se realizó utilizando el software PDQuest Advanced versión 8.0.1. Resultados A partir de volúmenes relativamente de suero relativamente pequeños (200 µl o 10 mg de proteína total) se obtenía un rendimiento de alrededor del FRQVX¿FLHQWHFDQWLGDGGHSURWHtQDSDUDDQiOLsis posteriores por 2-D tradicional o 2-D DIGE (la presencia de Urea y CHAPS en el buffer de eluido permite la utilización de la técnica 2-D DIGE si previamente se ajusta el pH a 8.0-8.5 con 1 M Tris). (OSHU¿OGHEDQGDVREWHQLGDVHQJHOHV'RHOGH spots en geles 2-D de los eluidos del ProteoMiner eran claramente diferentes del de los sueros sin fraccionar o de las proteínas no unidas a las columnas, aunque proteínas mayoritarias como albúmina o las inmunoglobulinas eran todavía detectables. La solución II es superior a la solución I en cuanto al número, la resolución y la calidad de los spots REWHQLGRVDVtFRPRVXSRVWHULRULGHQWL¿FDFLyQSRU HVSHFWURPHWUtDGHPDVDV6HLGHQWL¿FDURQSURWHtQDV séricas que están en un rango de concentración que va desde µg/L hasta g/L, lo que demuestra que esta tecnología permite detectar proteínas presentes en un amplio rango dinámico de concentración. Conclusiones La utilización del ProteoMiner en combinación FRQJHOHV'WLQFLyQFRQ6<3525XE\HLGHQWL¿cación de las proteínas por MS y posterior secuenFLDFLyQGHSpSWLGRVHVSHFt¿FRVSRU0606SHUPLWH LGHQWL¿FDU XQ PD\RU Q~PHUR GH SURWHtQDV SRFR abundantes, pero reteniendo una representación de todas las proteínas de partida en sueros de ratón. 38 La utilización de volúmenes reducidos de suero o plasma (100-200 µl) no es un impedimento para un análisis diferencial de expresión por técnicas 2-D DIGE, SELDI-TOF o LC-MS. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Referencias [1] Pavon EJ, Munoz P, Lario A, Longobardo V, Carrascal M, Abián J, et al. Proteomic analysis of plasma from patients with systemic lupus erythematosus: increased presence of haptoglobin alpha2 polypeptide chains over the alpha1 isoforms. Proteomics 2006; 6: 282-92. Developing MRM Assays for Peptide Quantitation: The MIDASTMZRUNÀRZDQG QtrapTM technology Antonio Serna Sanz Applied Biosystems ,Q WKH ¿HOG RI SURWHRPLFV PRVW RI WKH LQIRUmation needed on biological samples of interest extends beyond just the identity of the protein. 2QFH WKH SURWHLQ LGHQWL¿FDWLRQ LV PDGH IURP D variety of MS and orthogonal experiments, a more in-depth study is necessary to characterize isoIRUPVVLWHVRISRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQRU even sites of cleavage after activation or secretion. Additionally, constructing methods to determine WKHSUHVHQFHRIDVSHFL¿FSURWHLQRUSHSWLGHLQD complex mixture is of greater importance as the ¿HOGRIELRPDUNHUGLVFRYHU\DQGYDOLGDWLRQJURZV Robust and sensitive techniques for this targeted discovery and characterization of peptides and proteins are necessary. The information known about the sample, such as the protein sequence or a hypothesized postWUDQVODWLRQDO PRGL¿FDWLRQ DOORZV PRUH VSHFL¿F questions to be addressed. Normal information dependent acquisition techniques will not always detect the components of interest if they are of low abundance, or are poorly amenable to MS analysis. A more hypothesis-driven acquisition approach is TM often more effective such as the MIDAS worNÀRZ)LJXUHDQG7KHXWLOLW\DQGSRZHURIWKLV approach is explored here. Figure 1. Schematic of the Multiple Reaction Monitoring (MRM) scan for high selectivity and sensitivity. Q1 is set to transmit only the parent m/z of the peptide , the collision energy is optimized to produce a diagnostic charged fragment of this peptide in Q2, and Q3 is set to transmit this diagnostic fragment only. Because of the short dwell times required (10-50 ms) and the ability to change rapidly between MRM transitions, many components (transitions) in a mixture can be monitored simultaneously in a single LC/MS/MS run. 39 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 TM 1. Key Features of the MIDAS WorNÀRZRQWKH475$3TM and 5500 Q TRAPTM Systems ([WUHPHO\KLJKVHOHFWLYLW\DQGVHQVLWLYLW\IRU detecting peptides in complex mixtures. is detected by MRM, an Enhanced Resolution (ER) scan can be performed to obtain accurate charge and m/z information, and then MS/MS is performed. In many cases the detection of an MRM transition can EHVXI¿FLHQWIRUFRQ¿UPDWLRQEXWWKH0606GDWD can provide additional validation of identity. +LJKVHQVLWLYLW\DQGKLJKTXDOLW\0606IRU FRQ¿UPDWLRQRISHSWLGHVHTXHQFH 0XOWLSOH 5HDFWLRQ 0RQLWRULQJ 050 FDQ provide quantitative information between samples. Figure 2: Creating a reliable MRM-based method for peptide quantitation is an iterative procedure that takes input from various sources. Choosing which peptides, and then which fragment ions, can be based on either 1 previously acquired MS/MS data or from 2 non-MS based techniques and peptide fragmentation prediction. The next step is to 3 create an LQVWUXPHQW VSHFL¿F PHWKRG 050WULJJHUHG 0606 PHWKRG RWKHUZLVHNQRZQDVD0,'$6:RUNÀRZPHWKRGDQGWKHQXVH this method to 4 acquire data. The selected MRM transitions are then 5 evaluated for their suitability for quantitative measurements (i.e.signal/noise, intensity, etc.) and the MS/MS is evaOXDWHGIRUKRZZHOOLWFRQ¿UPVWKHSHSWLGH,'7KLVSURFHVVLV 6 repeated until 7 a set of MRM transitions are generated that reliably identify the peptides and can be used for quantitation. TM 2. The MIDAS :RUNÀRZ Typically in an information dependent acquisition (IDA), peaks are selected from full scan MS data, and are then used for dependent MS/MS experiments. The MRM scan can also be used as surYH\ VFDQ ZKLFK HQDEOHV WKH XVHU WR LQÀXHQFH WKH choice of precursor ion selection for MS/MS. In combination with ab initio prediction of theoretiFDOIUDJPHQWVDQGPRGL¿FDWLRQVRILQWHUHVW050 driven IDA provides all of the advantages of MRM sensitivity, S/N gains, and high selectivity, with full VFDQ 0606 GDWD IRU FRQ¿UPDWLRQ DQG HYHQ GDtabase searching. Figure 3 highlights the general schema utilized in these experiments. Since each MRM transition is rapid, many of these can be combined in a single survey scan spanning hundreds of SRWHQWLDO SHSWLGHV DQG PRGL¿FDWLRQV$IWHU D SHDN )LJXUH. MRM Initiated Detection and Sequencing using TM the MIDAS :RUNÀRZ7KHVHQVLWLYLW\DQGVSHFL¿FLW\RIDQ MRM scan can be used as a survey scan for Information 'HSHQGHQW$FTXLVLWLRQ,'$WRµGLJGHHSHU¶LQWRDELRORgical sample. The MRM scan detects the peptide at high VHQVLWLYLW\DQGWULJJHUVDIXOOVFDQ0606IRUFRQ¿UPDWLRQ of peptide identity. TM 3. Applications of the MIDAS :RUNÀRZ 7DUJHWLQJORZOHYHOSKRVSKRU\ODWLRQVLWHVRQ DSURWHLQRINQRZQVHTXHQFHWRLGHQWLI\RUFRQ¿UP PRGL¿FDWLRQORFDWLRQ 9DOLGDWLQJZHDNSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQVE\VSHFL¿FDOO\REWDLQLQJPRUH0606RQDGGLWLRQDOSHSWLdes for that protein 'HWHFWLRQ RI ORZ OHYHO SURWHLQV LQ FRPSOH[ mixtures 4XDQWLWDWLRQRISURWHLQVSHSWLGHVZLWKDFFRPSDQ\LQJ0606IRULGHQWLW\FRQ¿UPDWLRQ Conclusions The unique hybrid nature of the triple quadrupoles linear ion traps 4000 Q TRAP® and 5500 Q TRAP® systems allow for targeted powerful worNÀRZV&RPELQLQJWKHVSHFL¿FLW\DQGVHQVLWLYLW\RI Multiple Reaction Monitoring (MRM) with the high quality MS/MS allows for the targeted discovery of SHSWLGHVDQGSRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQV*RRG MS/MS can be obtained on peptides at extremely low amounts on column (1 amol), easily track. 40 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Intelligent Use of Retention Time for Higher Order Multiple Reaction Monitoring Multiplexing – Scheduled MRM™ Algorithm Antonio Serna Sanz Applied Biosystems The utility of Multiple Reaction Monitoring (MRM) on triple quadrupole based MS systems for biomarker verification/validation studies is currently an active area of investigation, driven by the well known sensitivity and selectivity attributes of this type of MS approach. As more extensive protein panels need to be monitored in a targeted way across multiple samples, higher MRM multiplexing is becoming essential for throughput. The challenges of assay development and running these large scale studies are becoming better understood, the need for rapid assay development, the need for higher multiplexing and the need for more robust assays are some of the key challenges. In this work, the unique combination of triple quadrupole and ion trapping capabilities of the hybrid triple quadrupole - linear ion trap mass spectrometer (QTRAP® System) has been utilized to create 100s RIKLJKTXDOLW\VSHFL¿F050WUDQVLWLRQVIRUPXOWLSOH peptides to many plasma proteins. Iterative analysis SURYLGHGUDSLGUH¿QHPHQWRI050SDUDPHWHUVZLthout requiring synthetic peptides. Intelligent use of retention time using new acquisition software enables many more MRM transitions to be included in a single acquisition method, while maintaining good peak area reproducibility. The analytical reproducibility of the MRM method developed was found to be extremely high, even in plasma, with the majority of peptides being measured with %CV<10. Obesidómica: caracterización del secretoma del tejido adiposo de diferentes localizaciones anatómicas Arturo Roca-Rivada1,2,3; Jana Alonso 4; Omar Al-Massadi1,2,3; Luisa María Seoane1,2, Felipe Casanueva1,2,3, María Pardo1,2 1 Ciber Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición; 2Laboratorio de Endocrinología Molecular y Celular, Complexo Hospitalario Universitario de Santiago (CHUS/SERGAS); 3 Departamento de Medicina (Universidade de Santiago de Compostela); 4 Laboratorio de proteómica, Instituto de Investigaciones Biómédicas (CHUS/SERGAS) En los últimos años el tejido adiposo ha pasado de considerarse un órgano inerte con función exclusiva de almacén y movilización de ácidos grasos a FDOL¿FDUVHFRPRHOyUJDQRHQGRFULQRPiVJUDQGH\ dinámico del cuerpo. Desde el descubrimiento de la leptina como principal hormona reguladora secretada por el tejido adiposo, han ido surgiendo más moléculas llamadas adipokinas, implicadas en diferentes aspectos de la regulación del metabolismo. Sin embargo, las adipokinas descubiertas hasta ahora no llegan a explicar convincentemente los complejos mecanismos reguladores de la homeostasis energética ni el desarrollo de los procesos asociados a la obesidad u otros desórdenes alimentarios. Bajo 41 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 este contexto es necesaria la búsqueda de nuevas señales secretadas por este órgano para una mejor comprensión de su funcionamiento [1]. del secretoma de grasa visceral, 87 de subcutánea y 91 de gonadal. Hace tan solo unos pocos años que se empezó a aplicar las técnicas proteómicas al estudio del tejido DGLSRVRVLQHPEDUJRGHELGRDGLYHUVDVGL¿FXOWDGHV técnicas innatas a la naturaleza de este tejido, se ha avanzado poco comparado con estudios similares para otro tipo de tejidos. Los estudios sobre la secreción del tejido adiposo son recientes y escasos y hasta la fecha no se ha realizado un estudio comparativo entre los secretomas de los distintos tipos de depósitos grasos [1]. Objetivos 1. Optimización y puesta a punto de las técnicas de proteómica para aplicar al estudio de tejido adiposo procedente de distintos depósitos grasos; 2. Realización de un mapa de referencia de la secreción de tejido adiposo visceral, subcutáneo y JRQDGDO,GHQWL¿FDFLyQ\FDUDFWHUL]DFLyQGHSURWHtQDV VHFUHWDGDV HVSHFt¿FDV GH FDGD WHMLGR JUDVR 4. Estudio diferencial de los secretomas de los tres GHSyVLWRVJUDVRVHQGLIHUHQWHVHVWDGRV¿VLROyJLFRV y nutricionales (ad libitum, ejercicio, anorexia y REHVLGDG 9DOLGDFLyQ \ HVWXGLR ¿VLROyJLFR GH SURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVGHLQWHUpV Métodos Se ha usado como modelo experimental ratas macho Sprague Dawley en condiciones ad libitum para la realización de los mapas de referencia. Los explantes de tejido adiposo se incubaron in vitro y los secretomas resultantes se concentraron y precipitaron para ser sometidos a electroforesis bidimensional y espectrometría de masas (MALDI-TOF/ 72)/DVSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVVHKDQFDUDFWHUL]DGR\FODVL¿FDGRVHJ~QODEDVHGHGDWRV8QL3URW\ el software del servidor SecretomeP 2.0 atendiendo a la presencia/ausencia de péptido señal (SignalP) o su adherencia a una ruta de secreción no clásica. El estudio de expresión diferencial se está realizando con el software Ludesi REDFIN 3, Sweden. Resultados Hemos completado los tres primeros objetivos H LGHQWL¿FDGR XQ WRWDO GH SURWHtQDV GLIHUHQWHV Figura 1. Proteínas comunes secretadas por los tres depósitos grasos. Localización en el secretoma de grasa visceral El 58% de las proteínas de grasa visceral correspondieron a proteínas secretadas, el 54% en subcutánea y el 45% en gonadal (Tabla 1 y 2). Se han detectado adipokinas clásicas como la adiponectina y el retinol-binding protein 4, así como proteínas todavía no asociadas a este tejido que están siendo validadas. Conclusiones El análisis de los secretomas de tejido adiposo muestra patrones de secreción diferente dependiendo de la localización anatómica en condiciones ad libitum (Tabla 2). También se muestra la utilidad de OD SURWHyPLFD SDUD OD LGHQWL¿FDFLyQ GH DGLSRNLQDV ya conocidas implicadas en diversos procesos metabólicos, así como de proteínas con funciones no tan conocidas en este tejido. El siguiente paso será hacer un estudio diferencial bajo diferentes condiciones ¿VLROyJLFDV 42 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Tabla1. &ODVL¿FDFLyQGHODVSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVSRU0$/',72)72)GHORVWHMLGRVDGLSRVRVYLVFHUDOVXEFXWiQHR\ gonadal según los criterios: Proteínas totales, tipo de secreción y proteínas comunes entre los tres depósitos grasos. 3URWHtQDVLGHQWL¿FDGDVWRWDOHV Visceral Subcutánea Gonadal 91 Proteínas secretadas totales 109 47 49 SignalP Ruta de secreción no clásica Proteínas comunes 27 Proteínas secretadas comunes 15 Tabla 2. 3URWHtQDVVHFUHWDGDVFRPXQHVDORVWUHVGHSyVLWRVJUDVRV'HODVSURWHtQDVVHFUHWDGDVHLGHQWL¿FDGDVSRU MALDI-TOF/TOF sólo 15 son comunes a los tres tipos de depósitos grasos. Nº Spot Secretome P2.0 Nombre Proteína Nº Acceso 1 SignalP N'DJOXFRVHUHJXODWHGSURWHLQ *53B5$7 2 SignalP Serum albumin $/%8B5$7 SignalP Calreticulin &$/5B5$7 4 Alpha-enolase (12$B5$7 5 Gamma-enolase (12*B5$7 6 SignalP Guanine deaminase *8$'B5$7 7 0.512 Actin, gamma-enteric smooth muscle $&7+B5$7 SignalP Cathepsin D &$7'B5$7 9 SignalP 3URWHLQGLVXO¿GHLVRPHUDVH 3',$B5$7 10 0.575 L-lactate dehydrogenase A chain /'+$B5$7 11 0.797 Fatty acid-binding protein, adipocyte )$%3B5$7 12 SignalP Transthyretin 77+<B5$7 Thioredoxin 7+,2B5$7 14 Ubiquitin 8%,4B&5,*5 15 SignalP Serotransferrin 75)(B5$7 Agradecimientos Referencias CIBERobn (ISCIII), FIS (ISCIII), Merk-Serono y Fundación MM. A.R. está contratado por el programa Lucas Labrada (Xunta de Galicia); L.M.S. y M.P. son investigadoras del SNS Miguel Servet (SERGAS/ISCIII). [1] Breitling R. Robust signaling networks of the adipose secretome. Trends in Endocrinol Metab 2009; 20: 1-7. 43 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Top-Down proteomic analysis of CSF proteins from ALS patients Claudio Diema1, Alex Campos2, Núria Omeñaca1, Eliandre de Oliveira2, Joan Guinovart3, Jacques Borg4, Marta Vilaseca1 1 Mass Spectrometry Core Facility, 3 Metabolic engineering and diabetes therapy, Institute for Research in Biomedicine, Barcelona, Spain. 23URWHRPLF3ODWIRUP6FLHQWL¿F7HFKQLFDO6HUYLFHV%DUFHORQD6FLHQFH3DUN Spain. 4Medical Faculty Jacques Lisfranc, Jean Monnet University, Saint-Étienne, France Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a form of motor neuron disease. ALS is a progressive, fatal, neurodegenerative disease caused by the degeneration of motor neurons, the nerve cells in the central nervous system that control voluntary muscle movement. Diagnosis is achieved with clinical evaluation, as well as electromyography and neuroimaging. However, a VLJQL¿FDQW QXPEHU RI SDWLHQWV DUH PLVGLDJQRVHG RU diagnosed after a long delay. Therefore, it is crucial WR ¿QG SRWHQWLDO ELRPDUNHUV WR LPSURYH HDUO\ DQG reliable diagnosis. Using a Bottom-Up analysis and LVREDULF TXDQWL¿FDWLRQ RI FHUHEURVSLQDO ÀXLG &6) IURP$/6SDWLHQWVZHUHFHQWO\LGHQWL¿HGDSDQHORI differentially expressed proteins (Borg et. al, submitted). In the present study we applied Top-Down proWHRPLFVWRH[DPLQHPRGL¿FDWLRQVRIWKHVHSURWHLQVLQ &6)VDPSOHV3RVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQV370 and various isoforms of targeted proteins from control and sporadic ALS (SALS) were characterized. ALS has largely unknown pathogenesis that typically result in death within a few years from diagnosis [1]. There are currently no effective therapies for ALS. Clinical diagnosis usually takes several months to complete and the long delay between symptom onset and diagnosis, limits the possibilities for effective intervention and clinical trials [2]. The establishment of protein biomarkers for ALS may aid an earlier diagnosis, facilitating the search for effective therapeutic interventions and monitoring GUXJHI¿FDF\GXULQJFOLQLFDOWULDOV Our goal was to identify by Top-Down proteomics PTMs and isoform variants of targeted CSF proteins in ALS patients and controls, with the aim of using them DVDGLDJQRVLVWRRO:HIRFXVHGRQSURWHLQVZKLFKZHUH found differentially expressed in our previous studies of CSF from ALS patients (Borg et. al, submitted). In order to achieve this goal, the following workÀRZ ZDV DSSOLHG )LJXUH &6) SURWHLQ VDPSOHV were precipitated with acetonitrile [3] and submit- ted to liquid chromatography- mass spectrometry (LC-MS) analysis. In detail, Top-Down analysis was performed by online LC-nanoESI-MS coupling on a /74)78OWUD7KHUPR6FLHQWL¿FZLWKVLPXOWDQHRXV fraction collection using the Triversa Nanomate (AdYLRQ%LR6FLHQFHV$%LR6XLWHS3KHQ\O:DWHUV 10 µm RPC 2.0 x 75 mm column with a 5-80% ACN gradient over 60 min (100 µl/min) was used for intact protein separations. A 1/250 part from the column eluent was injected directly to the mass spectrometer through the Triversa Nanomate using nanoESI chip technology (on line LC-nanoESI-MS, dynamic Top-Down) and the rest of the eluent was fraction collected in a multi-well plate through the same Nanomate. According to data obtained by dynamic 7RS'RZQWKHVSHFL¿FUHWHQWLRQWLPHVRIP]LRQV RILQWHUHVWZHUHYLVXDOL]HGDIWHUZDUGVWKHVHVSHFL¿F fractions containing ions of interest were infused into the MS from the multi-well plate and analyzed by static Top-Down. Protein fragments were obtained by applying CID or ECD and/or IRMPD on selected intact proteins ions according to our interest of idenWL¿FDWLRQ370VWXGLHV From 500 to 1000 microscan averaging was necessary to increase signal to noise ratio (S/N) and obtain informative fragment spectra from infused fractions. Obtained data was processed E\3URVLJKW3&7KHUPR6FLHQWL¿F In this work, we focused mainly in 4 proteins named apolipoprotein A1, cystatin C, ȕ-microglobulin and ȕ-microglobulin short isoform. A truncated isoform of apolipoprotein A1 (Apo A1) was observed in both control and SALS samples. An isoform of -128 a.m.u of this truncated Apo A1 form was also detected in both samples and fragment analysis was consistent with K-10 deletion (natural variant; K missing in Marburg/ Munster 2 isoform). Short and major isoforms of ȕPLFURJOREXOLQ ZHUH HQFRXQWHUHG 6HYHUDO IUDJPHQWV LQGLFDWHG D PRGL¿FDWLRQ RI UHVLGXH DW SR- 44 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figure 1. :RUNÀRZDSSOLHGIRULGHQWL¿FDWLRQDQGFKDUDFWHUL]DWLRQRISRWHQWLDOELRPDUNHVIRU$/6 sition 22 (pyroglutamic acid formed from Gln), a glycosylation at Ser4 or Ser2 and a phosphorylation in the short isoform. Moreover, further analysis of cystatin C protein showed a truncated isoform, an oxidation of the Met14 and a phosphorylation. Table 1 summarized PTMs characterized by Top-Down. Protein samples collected in multi-well plate at retention times of interest were pooled and digested ZLWKVSHFL¿FHQ]\PH7KHVHSHSWLGHVZHUHDQDO\]HG DSSO\LQJQDQR/&0606DQGWKHLGHQWL¿HGSURWHLQV FRQ¿UPHGWKHUHVXOWVREWDLQHGE\7RS'RZQ The isoform variants and PTMs detected in this work, showed the potential of Top-Down applied in ELRPDUNHU¿HOG1HYHUWKHOHVVWKHVHUHVXOWVPXVWEH validated in order to use them as a diagnosis tool for ALS using and independent methodology. Acknowledgements: The authors would like to acknowledge Michaela Scigelova and Vlad ZabrousNRYIURP7KHUPR6FLHQWL¿FIRUWKHLUDVVLVWDQFH:H thank Mark Baumert and Kees Vlak from Advion Biosciences for technical support and advice. Table 1. Summary of the PTMs characterized by Top-Down methodology. Protein ret. times Intact mass** Apo A1 31.2-31.7 30758.93 28061.47 ß-microglobulin ß-microglobulin 24.8-25.2 27933.43 28061.40 28224.44 28384.48 27933.43 28061.40 28386.63 PTMs t, -128.09, missing K107 or term Q truncated Apo A1(t) t, +162.9, glycation 13871.84 13928.86 13752.83 13871.82 13928.84 11721.78 11721.78 -17.02, pyro-Glu from Q 11801.76 11883.84 11801.76 -17, +79.96 phosphorylation -17, +162.05, Glc at S2/4 13334.48 13350.56 13413.51 13334.48 13350.56 13413.51 truncated cystatin C (t) t, +15.99, M(O) t, +79.96, phosphorylation 13705.91 21.2-21.9 11741.02 (short isoform) cystatin C Major isoform detected control ALS 23.5-24.5 15789.08 13334.56 45 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 References [1] Rowland L.P., Shneider N.A. Amyotrophic lateral sclerosis. N. Engl. J. Med, 2001; 344:1688– 1700. [2] Ryberg H and Bowser R. Protein biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Expert Review of Proteomics, 2008: 5: 249-262. [3] Abdi F, Quinn JF, Jankovic J et al. Detection of biomarkers with a multiplex quantitative proWHRPLFSODWIRUPLQFHUHEURVSLQDOÀXLGRISDWLHQWV with neurodegenerative disorders. J Alzheimers Dis. 2006; 9:293-348. Optimum method designed for 2D-DIGE of arterial intima and media isolated by laser microdissection Fernando de la Cuesta1, Gloria Álvarez-Llamas1, Irene Zubiri1, Aroa Sanz-Maroto1, Alicia Donado2, Luis Rodríguez-Padial4, Ángel García-Pinto2, María González-Barderas*5, Fernando Vivanco1,6 1 Department of Immunology. Fundación Jiménez Díaz, Madrid, Spain. 2Cardiac Surgery Unit. Hospital Gregorio Marañon, Madrid, Spain. 3Department of Pathology. Hospital Virgen de la Salud, Toledo, Spain. 4 Department of Cardiology. Hospital Virgen de la Salud, Toledo, Spain. 5Department of Vascular Physiopathology. Hospital Nacional de Paraplejicos, SESCAM, Toledo, Spain. 6Department of Biochemistry and Molecular Biology I, Universidad Complutense, Madrid, Spain. Introduction Tissue proteomic studies on atherosclerosis have traditionally focused on whole artery extracts from biopsy or necropsy origin. Arterial intima and media layers are both involved in atherosclerotic development. In the present work, we describe an optimum method which employs the combination of Laser Microdissection and Pressure Catapulting (LMPC) and 2D-DIGE saturation labelling to investigate the human intima and media subproteomes isolated from atherosclerotic (coronary and aorta) or non-atherosclerotic (preatherosclerotic coronary) arteries. Methods Coronary biopsies from patients undergoing bypass surgery and coronary and aorta necropsies were immediately washed in saline and freezed embedded with OCT. Intima and media were isolated by LMPC with a Microbeam System (PALM Microlaser). Several methods for staining (hematoxilin, cresyl violet), protein extraction and DIGE labelling were tested in order to achieve the better protocol for 2-DE analysis of human arterial layers. First of all, a spin column chromatographic step with Protein Desalting Spin Columns (Pierce) was assayed in order to minimize negative effects from remaining stain. In addition, different lysis buffers were WHVWHGWRDVVXUHHI¿FLHQWH[WUDFWLRQRIDUWHULDOOD\HUV proteome, which is problematic due to highly acidic P\R¿ODPHQWSURWHLQVDQGSUHVHQFHRIFDOFLXP Results Concerning staining methods, both hematoxilin and cresyl violet were found to negatively affect protein extraction and IEF. A chromatographic spin column step prior to saturation DIGE labelling improved substantially 2-DE gels, permitting the use of both stains for human arterial layers proteomic analysis. Ethanol solved cresyl violet minimizes proteases action and facilitates visualization of arterial tissue. For this reasons this stain was chosen for further analysis. Optimal DIGE labelling conditions were set at 1nmol TCEP and 2nmol Dye, so that free dye deleterious effects were minimized. The addition of SDS, and in a higher extend DTT, on lysis EXIIHUVLJQL¿FDQWO\LQFUHDVHGSURWHLQVROXELOL]DWLRQ 46 particularly on high molecular weight proteins as visualized on 2-DE gels. Finally, LMPC method was checked by LC-MS/MS to assure correct layers LVRODWLRQDQGSURWHLQVZHUHLGHQWL¿HGIURPLQ solution digested preatherosclerotic coronary intima 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 and media extracts, respectively. Although some proteins are common between layers, due to similar FHOOW\SHVSUHVHQWGLIIHUHQWLDOSURWHLQVDUHVSHFL¿F of contractile phenotype of VSMCs in the media and proliferative in the intima. ,GHQWL¿FDFLyQGHSpSWLGRVHVSHFt¿FRVGHFiQFHUFRORUUHFWDOPHGLDQWHHOXVRGH librerías de fagos T7 impresas en microarrays Ingrid Babel1, Rodrigo Barderas1, Victor Moreno2, Ivan Cristobo1, Gabriel Capellá2, Ignacio Casal1 1 Laboratorio de proteómica funcional. Centro de Investigaciones Biológicas (CIB) Madrid. 2 Instituto Catalán de Oncología (ICO) Barcelona El cáncer colorrectal (CCR) es el cáncer con mayor mortalidad en España por su tardía diagnosis. $FWXDOPHQWH OD KHUUDPLHQWD GH FODVL¿FDFLyQ GHO &&5FODVL¿FDFLyQGH'XNHVVHEDVDHQREVHUYDciones histopatológicas como pueden ser la invasión de la capa muscular intestinal, los nódulos linfáticos adyacentes o la progresión metastática. Aunque se han realizado diversos estudios genómicos usando microarrays de DNA no se ha conseguido obtener XQDPHMRUFODVL¿FDFLyQ>@/DLGHQWL¿FDFLyQGH proteínas que puedan revelar diferencias en los estadios de diferenciación neoplásica sería muy importante para el conocimiento de la enfermedad, un mejor diagnostico del CCR y para el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas. Aunque se han idenWL¿FDGR PXFKDV SURWHtQDV FRPR GLIHUHQFLDOPHQWH expresadas en CCR utilizando diferentes técnicas proteómicas [3] hasta ahora se han descrito muy SRFDVFRPRPDUFDGRUHVH¿FLHQWHVGH&&5 Los autoanticuerpos presentes en el suero de pacientes con cáncer son biomarcadores indicativos GHODHQIHUPHGDGSRUTXHODVSURWHtQDVPRGL¿FDGDV antes o durante la formación del tumor pueden inducir una respuesta inmune una vez liberadas [4-6]. Así, la caracterización de la respuesta inmune en pacientes con cáncer constituye una nueva alternaWLYDSDUDODLGHQWL¿FDFLyQGHELRPDUFDGRUHVHVSHFt¿FRVGH&&5~WLOHVSDUDVXGLDJQRVLVWHPSUDQD En este estudio, hemos usado una estrategia proteómica alternativa a los microarrays de proteinas recombinantes basada en el uso de microarrays de IDJRV SDUD LGHQWL¿FDU DXWRDQWLFXHUSRV DVRFLDGRV D CCR. Se construyeron cuatro librerías de fagos que contenían cDNA de tejido de pacientes con CCR, que fueron cribadas con sueros de pacientes con &&5SDUDLGHQWL¿FDUDTXHOORVSpSWLGRVGHVSOHJDGRV HQODVXSHU¿FLHGHORVIDJRVUHFRQRFLGRVSRUDXWRDQWLFXHUSRV HVSHFt¿FRV GH &&5 6H LPSULPLHURQ XQ total de 1536 fagos T7 en soportes de nitrocelulosa y tras su cribado con 15 sueros normales y 15 tumoUDOHVVHLGHQWL¿FDURQIDJRVLQPXQRJpQLFRVTXH diferenciaban entre pacientes con CCR e individuos sanos. El punto de corte del False Discovery Rate se ajustó a 0.22. De los fagos que mostraron mayor reactividad en pacientes que en sueros control, únicamente 55 fagos presentaron una secuencia única. /DLQPXQRUHDFWLYLGDGVHYHUL¿FyPHGLDQWH(/,SA utilizando 5 fagos elegidos por su homología con una proteína conocida. Dichos 5 Fagos contenían secuencias homólogas a MST1, SLC33A1, SREBF2, SULF1 y GTF2i. MST1 se describió como una proteína reactiva a autoanticuerpos de pacientes con CCR en nuestro estudio previo realizado con microarrays de proteínas humanas [7]. Por otra parte, en un análisis de expresión diferencial de genes SULF1 se observó sobreexpresada en CCR [8]. Mediante ensayo de ELISA utilizando una colección de 96 sueros, 50 de pacientes con cáncer colorrectal y 46 de individuos sanos, se obtuvieron curvas de ROC (Receiver Operating Characteristic) con áreas debajo de la curva entre 0.57 y 0.63. Sin embargo, su poder discriminatorio aumentó hasta XQDHVSHFL¿FLGDG\VHQVLELOLGDGGH\ 47 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 respectivamente, con un área debajo de la curva de 0.81 tras realizar diferentes combinaciones de marcadores. Además, el uso de la proteína completa 067DXPHQWDEDODHVSHFL¿FLGDGKDVWDXQ (área debajo de la curva de 0.86). Un estudio de competición entre MST1 y el fago correspondiente preincubando el suero con la proteína recombinante redujo la unión de las IgG al fago MST1 hasta un 40%, indicando que el péptido desplegado en la suSHU¿FLHGHOIDJRHVXQHStWRSRLPPXQRGRPLQDQWHGH la proteína completa. Por otra parte, mediante western blot se determinó que la presencia de autoanticuerpos correlacionaba con una mayor expresión de las proteínas en líneas celulares de cáncer de colon y de muestras tumorales. (Q UHVXPHQ HQ HVWH WUDEDMR KHPRV YHUL¿FDGR un panel de péptidos desplegados en fagos que responden a autoanticuerpos de pacientes con CCR y que poseen capacidad diagnóstica de la enfermedad. Finalmente, se han encontrado las mismas proteínas reactivas a autoanticuerpos en diversas estrategias SURWHyPLFDV OR TXH FRQ¿UPD OD FRQYHQLHQFLD GHO despliegue de péptidos en Fagos T7 para la idenWL¿FDFLyQ GH ELRPDUFDGRUHV ~WLOHV HQ FOtQLFD SDUD diagnosis y tratamiento de cáncer colorrectal. Referencias [1] Birkenkamp-Demtroder K, Christensen LL, Olesen SH, Frederiksen CM, Laiho P, Aaltonen LA, Laurberg S, Sørensen FB, Hagemann R, ØRntoft TF. Gene expression in colorectal cancer. Cancer Res 2002; 62: 4352-63. [2] Zou TT, Selaru FM, Xu Y, Shustova V, Yin J, 0RUL< 6KLEDWD ' 6DWR ):DQJ 6 2ODUX$ Deacu E, Liu TC, Abraham JM, Meltzer SJ. Application of cDNA microarrays to generate a molecular taxonomy capable of distinguishing between colon cancer and normal colon. Oncogene 2002; 21: 4855-62. [3] Barderas R, Babel I and Casal J.I Colorectal cancer proteomics, molecular characterization and biomarker discovery. Proteomics Clin. App 2009; 4: 1-20. [4] Anderson KS, LaBaer J. The sentinel within: exploiting the immune system for cancer biomarkers. J Proteome Res 2005; 4: 1123-33. [5] Chapman C, Murray A, Chakrabarti J, Thorpe $:RROVWRQ&6DKLQ8%DUQHV$5REHUWVRQ J. Autoantibodies in breast cancer: their use as an aid to early diagnosis. Ann Oncol. 2007; 18: 868-73. [6] Soussi T p53 Antibodies in the sera of patients with various types of cancer: a review. Cancer Res 2000; 60: 1777-88. [7] Babel I, Barderas R, Díaz-Uriarte R, MartínezTorrecuadrada JL, Sánchez-Carbayo M, Casal JI. ,GHQWL¿FDWLRQRIWXPRUDVVRFLDWHGDXWRDQWLJHQV for the diagnosis of colorectal cancer in serum using high density protein microarrays. Mol Cell Proteomics 2009; 8: 2382-95. [8] Madoz-Gúrpide J, López-Serra P, MartínezTorrecuadrada JL, Sánchez L, Lombardía L, Casal JI Proteomics-based validation of genomic data: applications in colorectal cancer diagnosis. Mol Cell Proteomics 2006; 5: 1471-83. Agradecimientos Rodrigo Barderas, PhD, tiene un contrato postdoctoral de perfeccionamiento del FIS. Este trabajo se ha realizado gracias al Programa de Biotecnología del Ministerio de Educación y Ciencia BIO2006-07689. 48 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 2D Blue native SDS-PAGE analysis of multiprotein complexes of human erythrocyte membrane Irene Zubiri1, Gloria Álvarez-Llamas1, Fernando de la Cuesta1, María González-Barderas2, Fernando Vivanco1,3 1 Department of Immunology, Fundación Jiménez Díaz,Madrid, Spain.2Department of Vascular Pathophysiology. Hospital Nacional de Paraplejicos, Toledo, Spain.3 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Universidad Complutense Madrid Introduction Results Patients with chronic kidney disease in haemodialysis present low quality erythrocytes, showing KLJKHU ULJLGLW\ :H K\SRWKHVL]H WKDW PHPEUDQH VWUXFWXUHPD\SOD\DUROHLQWKHÀH[LELOLW\RIHU\WURcytes. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) is an electrophoretic technique for high resolution separation of membrane protein complexes in the mass range of 10KDa to 10MDa. Here we describe a methodology to perform BNPAGE of erythrocyte membrane complexes followed by a second dimension of tricine-SDS page for isolating and identifying individual proteins forming these complexes. Membrane proteins complexes solubilization was carried out by testing two different detergents (digitonin and Triton X-100) at various concentrations (0.1-10% and 0.5-2 %, respectively). Solubilization was always performed for 1 h. 4% Digitonin UHVXOWHGWREHWKHEHVWRSWLRQLQWHUPVRI¿UVWGLPHQsion resolution, as it was the lowest detergent concentration at which the highest number of distinct bands can be observed without disturbance from the detergent in excess. Prior to the second dimension, protein complexes disruption into individual proteins was optimized by treating the strips with SDS/ ҟPHUFDSWRHWKDQRO VROXWLRQ WHVWHG DW YDULRXV FRPSRVLWLRQV 6'6 ҟPHUFDSWRHWKDQRO 12% SDS treatment for 1h prior to load the strip on the second dimension provided a higher number of protein spots detected; however, further increase of SDS amount negatively affected resolution. 1% ȕPHUFDSWRHWKDQRO ZDV XVHG DV LWV YDULDWLRQ GLG QRWVKRZDQ\FKDQJHV,GHQWL¿FDWLRQRIHU\WKURF\WH membrane protein complexes isolated and analyzed by 2D-BN-PAGE is being carried out by mass spectrometry. Methods Erythrocytes were isolated from plasma after maturation, washed in 5mM Na2HPO4 pH 8, 1mM EDTA and 0.9% NaCl and lysed in 5mM Na2HPO4 pH 8, 1mM EDTA and 1mM PMSF. Membrane pellets were frozen at -80º C in 50 mM imidazole / HCl and 10% glycerol (pH 7) or immediately analyzed. For BN-PAGE, samples were centrifuged and pellets were solubilized in 50 mM sodium chloride, 50 mM imidazole, 2 mM 6- aminohexanoic acid, 1mM EDTA (pH 7) and the appropriate detergent. After centrifugation, 5 µl of 5% glycerol and Coomassie G-250 in a detergent/dye ratio of 8:1 were added to the supernatant. Membrane complexes were run in 4-13% acrylamide gradient gels. The second dimension was run in 10% tricine-SDS/PAGE and a silver VWDLQLQJ SURWRFRO ZLWK PRGL¿FDWLRQV ZDV XVHG IRU tricine gels [1, 2]. References >@ :LWWLJ,%UDXQ+36FKDXPOJJHU+%OXHQDtive PAGE. Nature protocols 2006; 1:418–428. [2] Hermann Schägger. Tricine- SDS-PAGE. Nature protocols 2006; 1:16-22. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 49 5HJXODWLRQ RI HSLWKHOLDOPHVHQFK\PDO WUDQVLWLRQ LQ FRORQ FDQFHU E\ Į GLK\GUR[\YLWDPLQ'DSURWHRPLFVDSSURDFK Iván Cristobo1, María Jesús Larriba2, Vivian De los Ríos3, Ingrid Babel1, Rodrigo Barderas1, Alberto Muñoz2, José Ignacio Casal1 1 Functional Proteomics Laboratory, Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de InvestigacioQHV&LHQWt¿FDV0DGULG2 Department of Cancer Biology, Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto 6ROV´&RQVHMR6XSHULRUGH,QYHVWLJDFLRQHV&LHQWt¿FDV8QLYHUVLGDG$XWyQRPDGH0DGULG0DGULG 3 Proteomics and Genomics Facility, Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones &LHQWt¿FDV0DGULG Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a typical feature of cells undergoing proliferation and it is a fundamental process in the early stages of carcinoma invasion and metastasis [1-3]. It is a process characterized by loss of cell adhesion, repression of E-cadherin expression, and increased cell mobility (Figure 1). >Į2+'@DQGLWVDQDORJVDVSUHYHQWLYHDQG WKHUDSHXWLFDQWLFDQFHUDJHQWV>@Į2+' GUDVWLFDOO\DOWHUVWKHJHQHH[SUHVVLRQSUR¿OHRIPDQ\ cell types, inhibiting the proliferation and promoting the differentiation to a normal adhesive epithelial phenotype of human colon cancer cells [6]. In this study we have investigated the regulaWLRQ DQG ELRORJLFDO DFWLYLW\ RI Į2+' LQ (07 RI FRORQ FDQFHU FHOOV :H SUHVHQW HYLGHQFH of the direct regulation of a number of proteins by Į2+'LQFRORQFDQFHUFHOOV 6:$'+ FRORQ FDQFHU FHOOV ZHUH WUHDWHG ZLWK Į2+' IRU DQG KRXUV 1XFOHDU extracts of treated and non-treated cells were used by triplicate for a proteomic analysis. Proteins were labeled with CyDye Fluor for their subsequent separation by 2D-DIGE. Comparative analysis of protein expression patterns was performed with Progenesis 6DPH6SRWVDQG/XGHVL5HG¿QVRIWZDUH'LIIHUHQWLDOO\H[SUHVVHGSURWHLQVZHUHLGHQWL¿HGE\PDVVVSHFtrometry (MS) MALDI-TOF/TOF and subsequently validated by western-blotting. Figure 1. Epithelial-mesenchymal transition. During EMT epithelial cells lose polarity and cell-cell contacts, become migratory, and divide at a faster rate. The cells can intravasate into lymph or blood vessels, allowing their passive transport to distant organs. There is an increasing interest in the active viWDPLQ ' PHWDEROLWH ĮGLK\GUR[\YLWDPLQ ' An average of 1600 spots was detected on 2DDIGE gels. A total of 31 and 19 spots were found to be differentially expressed at 8 hours with Ludesi and Progenesis software (p <0.05; fold-change >1.2), respectively; and a total of 84 and 71 spots at 48 hours (p <0.05; fold-change >1.3). A 36% of overlapping in spot detection was found between the 2 software. By MS and MS/MS were XQHTXLYRFDOO\LGHQWL¿HGDQGSURWHLQVIURP treatment at 8 and 48 hours, respectively. These proteins were mainly involved in DNA and RNA regulation, affecting cell morphology, cell assembly, cell organization as well as cellular repair. A 50 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 tofori G. A causal role for E-cadherin in the transition from adenoma to carcinoma. Nature 1998; 392: 190-193. number of these proteins were further validated by ZHVWHUQEORWWLQJFRQ¿UPLQJSUHYLRXVUHVXOWV In summary, we have investigated the regulation DQGELRORJLFDODFWLYLW\RIĮ2+'LQ(07RI colon cancer cells. Through the use of proteomics WRROVZHKDYHLGHQWL¿HGQXPHURXVSURWHLQVZKRVH H[SUHVVLRQOHYHOVZHUHDOWHUHGZLWKĮ2+' treatment, and some of them have been further validated. Our results show evidence of the direct role RIĮ2+'WUHDWPHQWLQ(07LQFRORQFDQFHU through the transcriptional regulation of a number of genes mainly related to cell morphology, cell assembly, cell organization as well as cellular repair. >@ 9OHPLQFN[.9DNDHW/-U0DUHHO0)LHUV: van Roy F. Genetic manipulation of E-cadherin expression by epithelial tumor cells reveals an invasion suppressor role. Cell 1991; 66: 107-119. [4] Deeb KK, Trump DL, Johnson CS. Vitamin D signalling pathways in cancer: potential for anticancer therapeutics. Nat Rev Cancer 2007; 7: 684-700. [5] Lappe JM, Travers-Gustafson D, Davies KM, Recker RR, Heaney RP. Vitamin D and calcium supplementation reduces cancer risk: results of a randomized trial. Am J Clin Nutr 2007; 85: 1586-1591. [6] Palmer HG, Gonzalez-Sancho JM, Espada J, Berciano MT, Puig I, Baulida J, et al. Vitamin D(3) promotes the differentiation of colon carcinoma cells by the induction of E-cadherin and the inhibition of beta-catenin signaling. J Cell Biol 2001; 154: 369-387. References [1] Peinado H, Olmeda D, Cano A. Snail, Zeb and bHLH factors in tumour progression: an alliance against the epithelial phenotype? Nat Rev Cancer 2007; 7: 415-428. >@ 3HUO$.:LOJHQEXV3'DKO86HPE+&KULV- &RPSUHKHQVLYHSURWHRPLFDQDO\VLVRIKXPDQHQGRPHWULDOÀXLGDVSLUDWH Juan Casado-Vela1†, Eva Rodriguez-Suarez1†, Ibon Iloro1†, Amagoia Ametzazurra2, Nere Alkorta1, Juan Antonio García-Velasco3, Roberto Matorras 4,5, Begoña Prieto4,5, Sandra González5, Daniel Nagore2, Laureano Simón2, Felix Elortza1* 1 Proteomics Unit, CIC bioGUNE, CIBERehd, ProteoRed, Technology Park of Bizkaia, Derio, Spain, 2Proteomika S.L.; Technology Park of Bizkaia. Derio, Spain. 3Instituto Valenciano de Infertilidad, Madrid, Spain. 4 Hospital de Cruces, Barakaldo, Spain. 5Instituto Valenciano de Infertilidad, Bilbao, Spain Abstract 7KHHQGRPHWULDOÀXLGLVDQRQLQYDVLYHVDPSOH which contains numerous secreted proteins repreVHQWDWLYH RI HQGRPHWULDO IXQFWLRQ :H VKRZ KHUH IRUWKH¿UVWWLPHDQLQGHSWKDQDO\VLVRIWKHSURWHLQ content of the EFA using proteomic techniques [1]. To achieve this objective, three different but complementary strategies were used. First, in solution digestion followed by reverse phase high-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS); second, protein separation by denaturing one dimensional elec- trophoresis (SDS-PAGE) followed by HPLC-MS/ MS analysis. Finally, two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) followed by MALDI-TOF/TOF analysis. The combination of the WKUHH VWUDWHJLHV OHG WR WKH VXFFHVVIXO LGHQWL¿FDWLRQ of 803 different proteins. An extensive description RIWKHHQGRPHWULDOÀXLGSURWHRPHZLOOKHOSSURYLGH the basis for a better understanding of a number of diseases and processes, including endometriosis, HQGRPHWULDO FDQFHU DQG HPEU\R LPSODQWDWLRQ :H believe that the thorough catalogue of proteins presented here can serve as a valuable reference for the study of embryo implantation and for future biomar- 51 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figure 1. 6FKHPDWLFYLHZRIWKHWKUHHVWUDWHJLHV$%DQG&IROORZHGIRUWKHDQDO\VLVRIHQGRPHWULDOÀXLGDVSLUDWH ker discovery involved in pathologic alterations of endometrial function. Communication 7KH HQGRPHWULDO ÀXLG LV D FRPSOH[ ELRORJLFDO ÀXLG ZKLFK LV LQ GLUHFW FRQWDFW ZLWK WKH HQGRPHtrial cavity and contains a multitude of proteins and proteolytic enzymes secreted from the endometrium. Currently the diagnosis of endometrial diseases such as endometriosis is achieved by invasive methods that often include laparoscopic surgery XQGHU JHQHUDO DQDHVWKHVLD 7KH HQGRPHWULDO ÀXLG can be collected by aspiration in a painless manner using non-invasive methods. Interest in the protein content of endometrial secretions has gained much momentum in recent years and has been suggested to play a key role in the embryo implantation process. Therefore, differential proteomics of the enGRPHWULDOÀXLGDVSLUDWHSURWHRPHFRXOGJLYHDQHZ insight to understand the mechanisms involved in the onset of endometrial pathologies and the process of embryo implantation [2]. :LWKWKHDLPRIDFKLHYLQJDWKRURXJKGHVFULSWLRQRIWKHSURWHRPHRIWKHHQGRPHWULDOÀXLGDVSLUD- te we used three different methodological strategies (A, B and C) that combine chromatographic and gel separation methods, as depicted in Figure 1. The integrated proteomic approaches used here led, IRUWKH¿UVWWLPHWRDWKRURXJKLGHQWL¿FDWLRQRIWKH catalogue of proteins present in EFA. Figure 2. Venn diagram comparing the number of proteins LGHQWL¿HG DIWHU WKH DQDO\VLV RI HQGRPHWULDO ÀXLG DVSLUDWH with the three different strategies (A, B and C). 52 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 embryo implantation Protein description Endometriosis / e ctopic endometrium endometrial cancer / vulvar cancer Table 1. 3URWHLQV LGHQWL¿HG LQ HQGRPHWULDO ÀXLG DVSLUDWH ()$ LQYROYHG LQ HQGRPHWULDO DOWHUDWLRQV RU LQ HPEU\R implantation. Matrix metalloproteinase 9 X Kyama et al. Fertil. Steril. , 89, 301-310. Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase X Kyama et al. Fertil. Steril. , 89, 301-310. Annexin A1 X Chun-yan et al. Chin. Med. J. . 121, 927-931. Ametzazurra et al. Human Repr. 2009, 24, (4), 954-965 X X Lenhard et al. Clin. Chem. Lab. Med. 2009, 537-542. Mol et al. Fertil Steril. , 70, 101–1108 Moore et al. Ultrasound Obstet Gynecol. 2002, 20, 630-634. Gupta et al. 2006, 13, 126-134. X Li et al. Mol. Cell. Proteomics. 7, 1810-1823. Mucin 16 / CA125 Cyclophilin A/ peptidyl-prolyl cistrans isomerase A ,QWHUOHXNLQ X X references Luo et al. Reprod. Immunol. 2006, 72, 108-117. 3\UXYDWHNLQDVH00 X De Souza et al. Mol. Cell. Proteomics. 2007, 6, 1170-1182. De Souza et al. Proteomics. 2005, 5, 270-281. De Souza et al. J. Proteome Res. , 7, 3525-3534 Alpha 1-antitrypsin/ Alpha-1 protease inhibitor/ Serpin 1 X DeSouza et al. Mol. Cell. Proteomics. 2007, 6, 1170-1182. DeSouza et al. Proteomics. 2005, 5, 270-281. +HÀHUet al. Int. J. Cancer. 1999, 83, 167-170. Fatty acid-binding protein X Li et al. Int. J. Cancer. , 123, 2377-2383. Vimentin +HDWVKRFNSURWHLQ X ten Have et al. Proteomics Clin. Appl.. 2007, 1, 1243-1251. Vitamin D binding protein X Ferrero et al. J. Soc. Gynecol. Investig. 2005. 12, 272-277 Carbonic anhydrase 1 X Zhang et al. Fertil. Steril. 2006, 86, 274-282 +HDWVKRFNSURWHLQ Annexin A2 Peroxiredoxin 2 Apolipoprotein A1 X Fowler et al. Proteomics. 2006, 7, 130-142. Mucin 1 3URWHLQ6$ Apolipoprotein A-1 Alpha 1-antitrypsin X X Achache et al. Hum. Reprod. Update. 2006, 12, 731-746. Ferrero et al. JPR. 2007, 6, 3402-3411 53 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Moesin Beta-actin Tubulin beta chain F-actin capping protein subunit beta WD repeat protein 1 +HDWVKRFNSURWHLQEHWD Rho GDP-dissociation inhibitor 1 and 2 VLJPDDQGJDPPD Glycodelin Beta-2-glycoprotein 1 Sialic acid synthase Alcohol dehydrogenase [NADP+] Glutathione transferase omega-1 5LERVHSKRVSKDWHS\URSKRVSKRNLnase II 3RO\U&ELQGLQJSURWHLQ Ferritin heavy chain X The three different strategies followed for EFA DQDO\VLV $ % DQG & OHG WR WKH LGHQWL¿FDWLRQ RI 391, 489 and 191 proteins, respectively (Figure 2). Combining the three strategies, we successfully LGHQWL¿HG SURWHLQV7R FRQFOXGH WKH PRVW UHOHYDQW SURWHLQV LGHQWL¿HG LQ ()$ DQG LQYROYHG LQ endometrial alterations or in embryo implantation according to the literature are shown in Table 1. References [1] Ametzazurra et al. Human Repr. 2009, 24, 4, 954-965 Ametzazurra, A., Alkorta, N., Garcia-Velasco, J. A., Matorras, R., Prieto, B., Gonzalez, S., Nagore, D., Simon, L., and Elortza, F. Comprehensive SURWHRPLFDQDO\VLVRIKXPDQHQGRPHWULDOÀXLG aspirate. J Proteome Res 2009; 8: 4622-32. [2] Boomsma, C. M., Kavelaars, A., Eijkemans, M. J., Amarouchi, K., Teklenburg, G., Gutknecht, D., Fauser, B. J., Heijnen, C. J., and Macklon, N. 6&\WRNLQHSUR¿OLQJLQHQGRPHWULDOVHFUHWLRQV a non-invasive window on endometrial receptivity. Reprod.Biomed.Online. 2009; 18: 85-94. Casado-Vela, J., Rodríguez-Suárez, E., Iloro, I., ,GHQWL¿FDWLRQRI%LRPDUNHUVLQ&RORUHFWDO&DQFHUSUHSRVWFKHPRWKHUDS\ E\ 1XFOHLF$FLGV 3URJUDPPDEOH 3URWHLQ 0LFURDUUD\V 1$33$ L),6+ DQG SNPs approaches María González1, Raquel Bartolomé1, Jose María Sayagues1, María González1, Ana Laura Moro1, Elena Andrada1, Sahar Sibani2, Josh LaBaer2, Jacinto García3, Alberto Orfao1, Manuel Fuentes1,2 1 Centro de Investigación del Cáncer. Universidad de Salamanca-CSIC. Salamanca. Spain. 2Harvard Institute of Proteomics. Harvard Medical School. Boston. USA. 3Departamento Cirugía. Hospital Clínico Universitario. Salamanca. Spain Biomarkers, particularly those with strong positive and negative predictive value, have many potential uses in the diagnosis and treatment of cancer, including monitoring treatment success, indicating disease progression and detecting early disease. 2QHSRWHQWLDOO\SRZHUIXODSSURDFKWR¿QGLQJELR- markers is to exploit patients’ own immune systems, which produce humoral responses to cancer antigens released by their tumors due to alterations in protein expression, mutation, degradation, or localization. Antibodies to tumor antigens have been detected as early as several years before the clinical 54 DSSHDUDQFH RI FDQFHU$OWKRXJK WKH VSHFL¿FLW\ IRU these responses is high, typically only 5-20% of patients demonstrate a response to any given antigen, which has limited the usefulness of single antigen responses as biomarkers. The recent development of protein microarrays may offer an ideal tool for screening for immune response to tumor antigens. These arrays offer the advantage that hundreds to thousands of different proteins can be printed and screened simultaneously and only require a few microliters of serum per assay. Prof. LaBaer’s group (Harvard Institute of Proteomics) has developed a novel method for producing protein microarrays called nucleic acid programmable protein arrays (NAPPA) that avoids the need to express and purify the proteins by substituting the printing of cDNAs on the arrays, which are then 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 transcribed and translated in situ as needed at the time of the assay. NAPPA has been used successfully to map the pairwise protein interactions of the human DNA replication complex. Here, we propose adapting the NAPPA protein microarray technology IRUXVHLQWKHUDSLGDQGHI¿FLHQWVFUHHQLQJRIVHUD from cancer patients for antibodies to 1000 known and potential tumor antigens in a multiplex format in order to better characterize the immune response to known tumor antigens, identify new informative tumor antigens and evaluate the value of using patterns of tumor antigen immune responses as biomarkers in Colorectal Cancer. For the validation of the possible biomarkers found in 20 different patients SUHSRVWFKHPRWKHUDS\FXUUHQWO\ZHDUHXVLQJ iFISH and SNPs approaches with the main goal to correlate genomics and functional proteomics. Detection of Prostate Cancer by Urine Proteomics Marina Rigau1, Núria Colome3, Juan Morote2, Mª Carme Mir2, Carlos Ballesteros2, Marta Garcia1, Miguel Abal1, Francesc Canals3, Jaume Reventós1, Andreas Doll1 1 Unitat de Recerca Biomèdica, Institut de Recerca. 2Servei d’Urologia. 3Laboratori de Proteòmica, Institut de Recerca. Hospital Vall d’Hebron, Barcelona Introduction Objective 3URVWDWHVSHFL¿FDQWLJHQ36$VHUXPPHDVXUHment in combination with a digital rectal examination (DRE) and transrectal ultrasound-guided biopsy (TURS) is currently the gold standard for prostate cancer (PCa) screening in Europe [1]. Nevertheless, 36$DQG'5(ODFNVLJQL¿FDQWVSHFL¿FLW\DQGELRSV\ lacks ideal sensitivity (12-30% false negatives) [2, 3]. Therefore additional biomarkers are needed to supplement or potentially replace the currently used diagnostic techniques. As the secreted products from both, normal prostate epithelial cells as well as PCa cells, can be detected in the urine of men, their use as DSUR[LPDOERG\ÀXLGWRGHWHFW3&DLVYHU\DWWUDFWLYH since they could be the best compromise between a minimal invasive technique accepted by a wider range of the male population and the possibility to obtain enough cells for a correct diagnosis [4, 5]. :HVRXJKWWRGHWHUPLQHDSURWHRPLFSUR¿OHLQ urine able to distinguish between the presence and absence of PCa. 0DWHULDO0HWKRGV :H XVHG D FRPELQDWLRQ RI SURWHRPLF WHFKQROogies in aged matched post-Digital Rectal Exam (DRE) urine supernatants specimens to identify differentially expressed proteins in patients with PCa. )LUVWO\ ZH GHSOHWHG KLVWRORJLFDO FRQ¿UPHG 3&D urine samples and 9 control samples (age-matched patients with the typical background of benign prosWDWHKLSHUSODV\%3+DWURSK\DQGFKURQLFLQÀDPmation) using ProteoMiner (BioRad), a novel depletion technique that reduces the level of the most abundant species, while strongly concentrating the more dilute and rare ones. Then, Two-dimensional 55 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figure 1. 3URWHLQ LGHQWL¿FDWLRQ E\ SURWHRPLF FRPSDUDWLYH DQDO\VLV $ 3URWHR0LQHU GHSOHWLRQ WHFKQLTXH RYHUYLHZ % 2D-DIGE experiment design, comparison of 9 urine PCa samples against 9 urine control samples. (C) Example of a representive gel of the DIGE experiment. (D) Example of up-expressed spot in PCa samples. (E) IPA network interaction RIRYHUH[SUHVVHGSURWHLQVSRWVUHG¿JXUHVDQGXQGHUH[SUHVVHGSURWHLQVSRWVJUHHQ¿JXUHV)050WUDQVLWLRQVRID WU\SWLFSHSWLGHGHULYHGIURPRQHRIWKHFDQGLGDWHELRPDUNHUSURWHLQV*050EDVHGDEVROXWHTXDQWL¿FDWLRQRIDSHSWLGH abundance using a labeled synthetic peptide as internal standard. gel-based proteomic approach (2D-DIGE) coupled with matrix assisted laser desorption/ionization tiPHRIÀLJKWPDVVVSHFWURPHWU\0$/',72)06 and database mining experiment were performed to identify novel biomarkers of PCa in urine. Finally, we validated the candiadate biomarkers using Multiple Reaction Monitoring (MRM)-based assays, conducted by Liquid chromatography in conjunction with triple quadrupole mass spectrometry (LC-MS/ MS) in a bigger cohort of urine samples. Results :HLGHQWL¿HGDSURWHRPLFSUR¿OHRISRWHQtial biomarkers (16 down and 10 up-expressed) for the detection of PCa in urine. Ingenuity pathways analysis (IPA) showed that the majority of these proteins are secreted components of several ZHOONQRZQIXQFWLRQDORIFDQFHUDQGLQÀDPPDWLRQ QHWZRUNV OLNH 1)Ʉ% 3'*)%ȕ DQG 36$ :H performed MRM-based assays for 15 candidate biomarkers to quantify these in a sample set of 50 urine supernatants (Figure 1). Conclusions These data demonstrate the ability of proteomic analyses to reveal novel biomarkers for PCa in urine, an important step forward in advancing accurate diagnosis which is currently the bottleneck for the ability to cure patients from PCa. MRM is emerging as a technology that ideally complements the discovery capabilities of shotgun strategies by LWV XQLTXH SRWHQWLDO IRU UHOLDEOH TXDQWL¿FDWLRQ RI analytes of low abundance in complex mixtures, such urine samples[6]. These biomarkers could be used to develop a a simple diagnostic test (probably similar to the ELISA, either multiplex or strips, reactive to the 4-5 molecules most representative of WKHGLIIHUHQWLDOSUR¿OHWREHXVHGLQWKHKRVSLWDODQG outpatient routines. References >@ &DWDORQD:-6PLWK'65DWOLII7/'RGGV .0HWDO0HDVXUHPHQWRISURVWDWHVSHFL¿F antigen in serum as a screening test for prostate cancer. N Engl J Med 1991; 324: 1156-1161. 56 [2] [3] [4] 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Cervera Deval, J., Morales Olaya, F. J., Jornet Fayos, J., Gonzalez Anon, M., [Diagnostic value of the second prostate biopsies in males of risk. 6WXG\ VWUDWL¿HG E\ YDOXH RI 36$@$FWDV 8URO Esp 2004; 28: 666-671. Raber, M., Scattoni, V., Salonia, A., Consonni, P., Rigatti, P., [Repeated ultrasound-guided transrectal prostate biopsy in patients with negative histologic test]. Arch Ital Urol Androl 2000; 72: 197-199. Okamoto, A., Yamamoto, H., Imai, A., Hatakeyama, S., et al., Protein profiling of post-prostatic massage urine specimens by surface-enhanced laser desorption/ionization WLPHRIÀLJKWPDVVVSHFWURPHWU\WRGLVFULPLQDte between prostate cancer and benign lesions. Oncol Rep 2009; 21: 73-79. [5] M’Koma, A. E., Blum, D. L., Norris, J. L., Koyama, T., et al., Detection of pre-neoplastic and QHRSODVWLFSURVWDWHGLVHDVHE\0$/',SUR¿OLQJ of urine. Biochem Biophys Res Commun 2007; 353: 829-834. [6] Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R., Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Mol Syst Biol 2008; 4: 222. NanoLC/mass spectrometry-based proteomic analysis of serum and synovial ÀXLGVDPSOHVIURPRVWHRDUWKULWLVSDWLHQWV Patricia Fernández-Puente, Jesús Mateos, Carolina Fernández-Costa, Cristina Ruiz-Romero, Francisco J Blanco Osteoarticular and Aging Research Lab, Nodo Asociado de Proteo-Red. INIBIC-Hospitalario Universitario A Coruña, Xubias 84, 15006 - A Coruña, SPAIN Introduction Osteoarthritis (OA) is the most common rheumatic pathology, characterized mainly by cartilage degradation [1]. Despite its high prevalence, the diagnosis methods currently available are limited and lacked of sensitivity. Therefore, there is a considerable interest pointed in the characterization of QHZVSHFL¿F2$ELRPDUNHUVLQELRORJLFDOÀXLGV,Q this work we set up a nLC-MALDI-MS method for OA biomarker search in complex mixtures, with the aim of obtaining a standardized protocol for serum DQGV\QRYLDOÀXLG6)SURWHLQSUR¿OLQJ Methods a) Sample preparation and immunodepletion: Serum and SF samples were obtained from OA patients and control donors. Prior to protein depletion, SF was treated with hyaluronidase. The 20 most abun- dant proteins were removed from crude serum and SF using the Immunodepletion column ProteoPrep® 20 (Figure 1), according to manufacturer’s instructions (Sigma Aldrich). Depletion of abundant proteins was checked by SDS-PAGE separation of the proteins and LGHQWL¿FDWLRQ LQ D 0$/',72)72) V\VWHP (ABI). For both serum and SF depleted samples, protein concentration was determined using a nanoDrop LQVWUXPHQW)LVKHU7KHUPR6FLHQWL¿F86$ b) Pre-fractioning of the samples: For serum samples, digestion of the depleted fractions was done with trypsin, and the peptides obtained were fractionated by strong cation exchange (SCX) liquid chromatography in a HP 1200 system (Agilent), using a PolySulfoethyl column (PolyLC). SF proteins were separated by SDS-PAGE, using 10% acrylamide gels. The gel lanes were divided into 12 sections, excised and proteins were in-gel digested with trypsin following standard procedures. 57 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 WUDQVSRUW SURFHVVHV )LJXUH $Q HI¿FLHQW depletion of the 20 most abundant proteins was veUL¿HGDVRQO\RIWKHVHSURWHLQVFRXOGEHLGHQWL¿HG in the samples. Nevertheless, still a number of other typically abundant serum proteins such as complement proteins and apolipoproteins were found. Figure 1. &KURPDWRJUDPRIWKHDI¿QLW\GHSOHWLRQRIWKH most abundant proteins from human plasma. Inset shows a 6'63$*(RIWKHGLIIHUHQWIUDFWLRQV6HUXPÀRZWKURXJK fraction (low abundant proteins); 2. Serum bound fraction (high-abundant proteins); 3. Untreated serum. c) NanoLC-MS/MS analysis: The serum and SF peptide fractions were desalted using PorosR2 home-made columns (ABI). Each dried fraction was re-dissolved and injected on a precolumn (PepMap100), and peptides were desalted and loaded to D&FROXPQ,QWHJUD¿W&3URWHRSHS,,1HZ Objetive, USA) to perform the separation. Fractions were collected from the NanoLC, mixed with matrix and spotted onto a MALDI plate using a MALDI Spotter/Micro-Fraction Collector (SunChrom). MS spectra were acquired for each fraction in a 4800 MALDI-TOF/TOF instrument (ABI). d) 3URWHLQ ,GHQWL¿FDWLRQ DQG 'DWDEDVH 6HDUFK: 3URWHLQLGHQWL¿FDWLRQZDVFDUULHGRXWXVLQJWKH3URWHLQ3LORWVRIWZDUHY$%,2QO\SURWHLQVLGHQWL¿HG ZLWKDWOHDVWFRQ¿GHQFHRUD3URW6FRUHRI were reported. A Global False discovery Rate (FDR) of 1% was calculated independently with PSPEP sotware. SwissProt database was used to determine the SXWDWLYHFHOOXODUIXQFWLRQRIWKHLGHQWL¿HGSURWHLQV Results :H KDYH VWDQGDUGL]HG WZR DOWHUQDWLYH SURWRcols for the proteomic analysis of human biological ÀXLGV RQH HPSOR\LQJ OLTXLG FKURPDWRJUDSK\ DQG the other SDS-PAGE as pre-fractionation method. 8VLQJWKH¿UVWDSSURDFKZHZHUHDEOHWRLGHQtify 105 different proteins in human serum from OA patients. These proteins are involved mainly in the immune response (33%), proteolysis (22%) and Figure 2. )XQFWLRQDOFODVVL¿FDWLRQRISURWHLQVLGHQWL¿HGLQ (A) serum and (B) SF from OA patients. %\ WKH VHFRQG DSSURDFK ZH LGHQWL¿HG GLfferent proteins in SF samples from OA donors. As expected, many of these (76%) were also found in serum. Some of those had been previously suggested as putative OA biomarkers, such as Gelsolin, Fibronectin, Clusterin or Serum Amyloid P protein. As happened with serum, the most abundant functional JURXSRISURWHLQVLGHQWL¿HGLQ6)ZDVLQYROYHGLQ the immune response (Figure 2), but we also found in this case many proteins related with metabolism, transport, cellular proliferation and signalling. Interestingly, we found in the group of 21 proteins VSHFL¿FDOO\ LGHQWL¿HG LQ 6) D QXPEHU RI SURWHLQV that are directly involved in cartilage extracellular matrix (ECM) synthesis, that are listed in Table 1. Conclusions :H KDYH VWDQGDUGL]HG WZR DSSURDFKHV IRU WKH LGHQWL¿FDWLRQRISURWHLQVLQKXPDQELRORJLFDOÀXLGV after depletion of the 20 most abundant proteins of plasma. These procedures have allowed us to desFULEHWKHSURWHLQSUR¿OHVRIVHUXPDQG6)IURP2$ SDWLHQWV'HVSLWHWKHKLJKVLPLODULWLHVRIERWKSUR¿OHVZHIRXQGPRUHMRLQWVSHFL¿FSURWHLQVLQ6)2XU data point out the usefulness of these approaches for OA biomarker discovery, although further studies HPSOR\LQJVWDEOHLVRWRSHODEHOOLQJZLOOSUR¿WIURP TXDQWL¿FDWLRQ RI WKH SRWHQWLDO PDUNHUV WKDW KDYH EHHQLGHQWL¿HGLQWKLVZRUN References [1] Blanco FJ. Catabolic events in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage 1999; 7:308-9. 58 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Table 1. 3URWHLQVLGHQWL¿HGVSHFL¿FDOO\LQ6)IURP2$SDWLHQWVWKDWDUHGLUHFWO\LQYROYHGLQFDUWLODJH(&0V\QWKHVLV Acc. No.|Abbr. Name Cellular role P01033|TIMP1 Metalloproteinase inhibitor 1 Prevents ECM degradation P16112|PGCA Aggrecan core protein ECM component P49747|COMP Cartilage oligomeric matrix protein ECM component Q15113|PCOC1 Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 Collagen synthesis Q92954|PRG4 Proteoglycan-4 ECM component Q9H9S5|FKRP Fukutin-related protein Glycoprotein synthesis Q9NQ79|CRAC1 Cartilage acidic protein 1 Cartilage component )XQFWLRQDO3URWHRPLFV%HDGV±EDVHGDUUD\V\VWHPIRU%LRPDUNHU'LVFRYHU\ Raquel Bartolomé1, María González-González1, Jose M. Sayagües1, Fridtjof Lund-Johansen2, Alberto Orfao1, Manuel Fuentes1 1 Centro de Investigación del Cáncer. Universidad de Salamanca-CSIC. Spain. 2Immunology Institute. University of Oslo. Norway. Despite the immense progress in Molecular Biology and Genetics, only a small fraction of the proteome is understood at biochemical level. Currently, a development of new methodological strategies in high-throughput format is needed for applications in Proteomics, such as Biomarker and Drug Discovery studies. These new methodologies must be able to analyze simultaneously hundreds or thousands of proteins in order to evaluate functionality, stability, interactions, relative abundance, post-transduction PRGL¿FDWLRQVHWF Our group has developed a microspheres array (Bead-based Array System, BBAS) that allow the simultaneous analysis of numerous sera and intracellular proteins. The method consist of having different populations of spheres, colored by surface- laEHOLQJZLWKGLIIHUHQWÀXRUHVFHQFHG\HVDQGFRXSOHG with different antibodies against target proteins. A wide range of available dyes could potentially be used to generate complex color codes that are analy]HGE\VWDQGDUGÀRZF\WRPHWUHV In the experimental process a lysate of B cells is fractioned by size exclusion chromatography (FPLC) and incubated with a 1300 populations array. Each population has a code of dyes and is VSHFL¿FIRUDSDUWLFXODUWDUJHWSURWHLQ7KHODEHOLQJ of these target proteins with phycoerythrin (PE) DOORZVWKHGHWHFWLRQE\ÀRZF\WRPHWU\ This methodology is capable of giving information about the amount of protein present in each fraction, in addition to protein state (soluble, membrane protein, monomeric vs multimeric, phosphorylated, coupled with other proteins in functional complexes …). 59 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Anticuerpos a la carta combinando expresión in vitro de proteínas, tecnología de despliegue en fagos y arrays de anticuerpos Rodrigo Barderas, Ingrid Babel, Iván Cristobo, José Ignacio Casal Laboratorio de Proteómica Funcional. Centro de Investigaciones Biológicas, c/ Ramiro de Maeztu, 9 28040 Madrid Los anticuerpos constituyen una importante herramienta para determinar la compartimentalización celular y la función de sus proteínas diana y para el análisis de interacciones proteína-proteína. Actualmente, los anticuerpos se utilizan para el diagnóstico de enfermedades mediante inmunoensayos como ELISA, arrays de anticuerpos,… y, para el tratamiento de enfermedades, como por ejemplo el anti-HER2 (Herceptin) en cáncer de mama. De hecho, los anticuerpos constituyen aproximadamente el 50% de los medicamentos aprobados por la FDA y la EMEA. El objetivo de este trabajo consistió en el desarrollo de un nuevo método de obtención de anticuerpos in vitro utilizando solo 5 µg de proteína mediante la combinación de diferentes técnicas pro- Figura 1. (VTXHPDGHH[SUHVLyQSXUL¿FDFLyQ\VHOHFFLyQGHDQWLFXHUSRVDODFDUWD/DVSURWHtQDVVHH[SUHVDURQLQYLWUR \SXUL¿FDURQXVDQGREROLWDVPDJQpWLFDV'\QDEHDGV7$/21$OWHUQDWLYDPHQWHODVSURWHtQDVVHHOX\HURQ\GLDOL]DURQ frente a PBS para su marcaje con AlexaFluor 647 o, se utilizaron para la selección de anticuerpos recombinantes usando las librerías de scFvs humanas Mehta I y II. 60 WHyPLFDVH[SUHVLyQ\ SXUL¿FDFLyQGHSURWHtQDV LQ vitro, selección utilizando Despliegue en Fagos y, ¿QDOPHQWH LGHQWL¿FDFLyQ GH DQWLFXHUSRV UHFRPELnantes mediante el cribaje de array de anticuerpos con la proteína marcada con AlexaFluor 647. La aplicación de esta metodología nos ha permitido obtener anticuerpos monoclonales humanos recombinantes (scFvs) frente a cuatro proteínas -tiorredoxina, GFP, p53 y STK4- de diferente masa molecular (10-70 kDa), siendo p53 y STK4 proteínas difíciles de expresar. El proceso de expresión, SXUL¿FDFLyQ\VHOHFFLyQGHORVDQWLFXHUSRVDSDUHFH resumido en la Figura 1. El procedimiento completo incluye diferentes pasos. El primer paso consiste en la expresión de las proteínas in vitro utilizando YHFWRUHVFRGL¿FDQWHVSDUDODVSURWHtQDVFRPRIXHQWH de DNA y un sistema de expresión in vitro (Roche) que permite realizar la transcripción y la traducción HQXQVRORSDVR/DSXUL¿FDFLyQDKRPRJHQHLGDGGH las proteínas se realizó utilizando bolitas magnéticas Talon, mediante el Tag de Histidinas que incorporan las proteínas en su extremo C-terminal. El segundo paso consistió en la selección de los anticuerpos monoclonales recombinantes, que se realiza en solución utilizando las proteínas unidas a las bolitas magnéticas y la librería de anticuerpos humanos Mehta I y II [1-3]. En total, se realizaron 4 rondas de selección y se picaron 200 colonias individuales procedentes de la 3ª y 4ª ronda de selección de anticuerpos frente a cada proteína. Así, se testaron 400 clones indiviGXDOHV\FORQHVHQWRWDOSDUDLGHQWL¿FDUVF)YV frente a cada proteína. Finalmente, el tercer paso FRQVLVWLy HQ OD LGHQWL¿FDFLyQ GH ODV VF)YV HVSHFt¿FDVGHFDGDSURWHtQDTXHVHUHDOL]yLPSULPLHQGR arrays de nitrocelulosa con los 1600 clones diferentes usando un robot de impresión Omnigrid. La selección de los clones positivos se realizó cribando los arrays de anticuerpos impresos en nitrocelulosa con las proteínas expresadas in vitro marcadas con HOÀXRUyIRUR$OH[D)OXRU)LQDOPHQWHODVVF)YV LGHQWL¿FDGDVVHWHVWDURQSRU(/,6$LQPXQRGHWHFFLyQHQPHPEUDQDHLQPXQRÀXRUHVFHQFLD Creemos que esta nueva metodología para obtener anticuerpos monoclonales humanos recombinantes por combinación de la expresión in vitro de proteínas, el uso de librerías de anticuerpos humanos desplegados en fagos y microarrays de anticuerpos 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 scFvs podría convertirse fácilmente en un sistema de alto rendimiento para obtener anticuerpos monoclonales frente a cualquier antígeno. El proceso completo requiere solo 5µg de proteínas, solucionando el cuello de botella habitual para la obtención de anticuerpos, dado que se necesitan grandes cantidades de proteína para la inmunización de animales \SDUDHOFULEDMHHLGHQWL¿FDFLyQGHORVDQWLFXHUSRV HVSHFt¿FRVGHFDGDSURWHtQD(OQXHYRSURFHGLPLHQto descrito nos permitió obtener anticuerpos frente a las cuatro proteínas utilizadas en el estudio STK4, p53, GFP y tiorredoxina que presentaban funcionalidad tras su impresión en arrays de nitrocelulosa DUUD\VGHDQWLFXHUSRV\HQ(/,6$LQPXQRÀXRUHVcencia e inmunodetección en membrana. En resumen, esta nueva aproximación podría ser usada para la obtención de anticuerpos humanos de DOWDD¿QLGDG~WLOHVHQGLDJQRVLVGHSDWRORJtDV±GDGD su funcionalidad en arrays de anticuerpos– e incluso FRQ¿QHVWHUDSpXWLFRVVLHODQWtJHQRXVDGRHQODVHOHFción de los anticuerpos fuese una diana terapéutica. Agradecimientos Rodrigo Barderas, PhD, tiene un Contrato Postdoctoral de Perfeccionamiento del FIS. Este trabajo se ha realizado gracias al Programa de Biotecnología del Ministerio de Educación y Ciencia BIO2006-07689. Referencias >@ 6XL-/L:0XUDNDPL$7DPLQ$:RQJ6. Moore MJ, et al., Potent neutralization of severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus by a human Mab to S1 protein that blocks receptor association. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101:2536-2541. [2] Barderas R, Desmet J, Timmerman P, Meloen 5 &DVDO -,$I¿QLW\ PDWXUDWLRQ RI DQWLERGLHV assisted by in silico modeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105:9029-9034. [3] Barderas R, Shochat S, Timmerman P, Hollestelle MJ, Martínez-Torrecuadrada JL, Höppener -:HWDO'HVLJQLQJDQWLERGLHVIRUWKHLQKLELWLRQ of gastrin activity in tumoral cell lines. Int J Cancer 2008;122:2351-2359. 61 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 9DOLGDWLRQRI3(')DVDSRWHQWLDOELRPDUNHUIRU16&/& Sonia Blanco-Prieto1, Nuria Sánchez-Otero1, Ana M. Rodríguez-Piñeiro1, M. Isabel Botana-Rial2, Francisco J. Rodríguez-Berrocal1, María Páez de la Cadena1* 1 Dpto. Bioquímica, Universidad de Vigo, As Lagoas Marcosende s/n 36310 Vigo (Spain). Neumología, CHUVI, Vigo (Spain) ,QWKHVHDUFKIRUPRUHHI¿FLHQWELRPDUNHUVIRU non-small cell lung cancer (NSCLC) we combined prefractionation techniques and protein separation by differential in-gel electrophoresis (2D-DIGE), to TXDQWLI\SURWHLQFKDQJHVEHWZHHQELRORJLFDOÀXLGV (serum and pleural effusion) from NSCLC subjects and benign controls (pneumonia and tuberculosis individuals, respectively). Pigment epithelium-derived factor (PEDF) was WKHVROHSURWHLQLGHQWL¿HGLQERWKÀXLGVDVGLIIHUHQtially expressed in NSCLC patients. PEDF is a 50 kDa secreted glycoprotein that exhibits a duality with regards to apoptosis and survival [1]. PEDF has been reported to be present in serum at a concentration of 5 µg/mL [2], corroborating a relative success in mining down the proteome. It could be concluded that although immnunodepletion of KLJKDEXQGDQFHVSHFLHVLPSURYHVSURWHLQSUR¿OLQJ and several relevant proteins were revealed, most RI WKH SURWHLQV LGHQWL¿HG VWLOO FRUUHVSRQG WR PRderate and highly abundant ones. Two arguments PD\EHH[SRVHG¿UVWWKHLPSRVVLELOLW\RIFRYHULQJ the dynamic range of plasma and plasma-derived ÀXLGV DQG VHFRQG WKH JDS EHWZHHQ WKH EURDGHU linearity of DIGE in comparison with the reached LQ 06 LGHQWL¿FDWLRQ DV PDQ\ RI WKH XQLGHQWL¿HG spots corresponded to the less intense. Our study revealed one PEDF spot altered in serum with an average fold increase of 1.4 in NSCLC samples, while in the case of pleural effusion there were two altered forms showing changes of 1.5 and 2 fold increase in lung cancer patients. The next step after discovering a potential bioPDUNHULVWKHFRQ¿UPDWLRQRIWKHYDULDWLRQREVHUYHG on 2D gels; thus, immunodetection of PEDF was FDUULHGRXWLQ'EORWV:KHQJRIGHSOHWHGSURtein were resolved results were contradictory: in the case of serum (Figure 1) the tendency was an elevated expression in NSCLC though levels were overlapped between cancer and benign control samples, 2 Servicio de whereas in pleural effusion (Figure 2) the pattern was opposed as the manifested by DIGE analysis. This discrepancy could be explained considering the superior sensitivity of antibody reactions and the great enrichment in PEDF levels achieved after preIUDFWLRQDWLRQWKDWZRXOGPDVNWKHVLJQL¿FDQWGLIIHrences found by DIGE methodology. Another reason might be the existence of more PEDF isoforms not distinguishable by 1D separation. Figure 1. 1D immunodetection of PEDF on serum depleted samples.,PPXQRTXDQWL¿FDWLRQRI3(')LQJHOVUHVROYLQJ 10 µg of protein (B) was not consistent between cancer and control subjects, when dilution of the samples was perforPHG$3(')OHYHOVSURYHGWREHVLJQL¿FDQWO\LQFUHDVHGLQ NSCLC. Lanes 1, 3, 5, 7: NSCLC samples, lanes 2, 4 ,6, 8: pneumonia samples. LC: lung cancer; B: benign. These two hypothesis were tested. First, 1DEORWVZHUHUHSHDWHGGLOXWLQJWKHVDPSOHV¿Qding in serum the same pattern initially obtained in 2D gels: a 1.5 fold increase in PEDF expression in cancer patients (p = 0.043) (Figure 1). For pleural effusion (Figure 2), although a slight overall increase was seen in NSCLC, the pattern was not repetitive. To assess if there were variations in other PEDF isoforms not visualized on DIGE gels the molecule ZDV VSHFL¿FDOO\ LPPXQRGHWHFWHG LQ 'EORWV )RU ERWKÀXLGVDZLGHSOHWKRUDRILVRIRUPVZDVPDQLfested with more than 12 spots detected (Figure 3), 62 which expanded about 1 pH unit. This variability DJUHHVZLWKWKHREVHUYHGE\>@IRUSXUL¿HGKXPDQ 3(')DQGLVFDXVHGE\SRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDtions. In serum all the isoforms observed displayed a higher intensity in NSCLC, while for pleural effusion a mixed pattern was generated with an average 1.3 fold increase in NSCLC. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Literature concerning PEDF expression on lung cancer is not conclusive, with a described reduction at the transcript level in lung tissues compared to normal specimens [3]. However, when protein OHYHOZDVH[DPLQDWHGWKHSUR¿OHZDVUHYHUVHGIRU adenocarcinoma type, the one we analised, with 18/33 specimens overexpressing PEDF. The overall increase showed by our work could be a response of PEDF anti-angiogenic capability to counteract VEGF induced vasopermeability. $¿QDOVWHSLQWKHSDWKZD\RIGLVFRYHULQJELRmarkers is to corroborate this discrimination by feasible and highly sensitive methods (commonly ELISAs) that could be implemented in the clinical setting. This requires that the differential expression observed in fractionated proteomes should hold a parallel comparison on crude samples, regarding different histological types. Figure 2. 1D immunodetection of PEDF on depleted pleural effusions. Blotting of 10 µg of protein (B) displayed a tendency to increased PEDF levels on benign samples, while repetition on diluted fractions partially reverse this pattern, although no statistically differences were achieved. Lanes 1, 3, 5, 7: NSCLC samples, lanes 2, 4 ,6, 8: tuberculosis samples. MPE: malignant pleural effusion; BPE: benign pleural effusion. )LJXUH 2D immunodetection of PEDF. Both in depleted serum (left) and pleural effusion (right) several PEDF isoIRUPVFRXOGEHGHWHFWHG,PPXQRTXDQWL¿FDWLRQUHYHDOHGGLIIHrent variations between benign- and malignant-origin samples, though most of the spots showed increased values in tumorGHULYHGÀXLGV/&OXQJFDQFHU%EHQLJQ03(PDOLJQDQW pleural effusion; BPE: benign pleural effusion; Normal Qty: normalized quantity (by total density in each blot). References [1] Fernandez-Garcia NI, Volpert OV, Jimenez B. Pigment epithelium-derived factor as a multifunctional antitumor factor. J Mol Med 2007;85:15-22. [2] Petersen SV, Valnickova Z, Enghild JJ. Pigmentepithelium-derived factor (PEDF) occurs at a physiologically relevant concentration in human EORRG SXUL¿FDWLRQ DQG FKDUDFWHUL]DWLRQ %LRchem J 2003;374:199-206. >@ =KDQJ/&KHQ-.H<0DQVHO5(-LDQJ:* Expression of pigment epithelial derived factor is reduced in non-small cell lung cancer and is linked to clinical outcome. Int J Mol Med 2006;17:937-44. 63 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Utilización de ProteoMiner para el análisis proteómico de muestras de líquido VLQRYLDO/6GHSDFLHQWHVFRQRVWHRDUWULWLV Sonia García-Rodriguez1, María Dulce Pérez-Mezcua1, Antonio Rosal-Vela1, Victoria Longobardo2, Antonio Larios2, Pilar Navarro1, Raquel Largo3, Gabriel Herrero-Beaumont3, Jaime Sancho1, Mercedes Zubiaur1 1 Departamento de Biología Celular e Inmunología, Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra (IPBL-N), CSIC, Granada. 2Servicio de Proteómica, IPBL-N, CSIC, Granada. 3Servicio de Reumatología, Fundación Jiménez-Díaz, Madrid Introducción ProteoMiner o Combinatorial Peptide Ligand Libraries (CPLL) [1] actualmente están compuestas de una gran variedad de hexapéptidos sintetizados, que actúan de ligandos para las proteínas de las muestras. Y están siendo actualizadas como herramientas de gran utilidad para el mapeo de proteomas de distintos organismos. Esta herramienta permite el objetivo de reducir del rango dinámico de concentraciones en diversos tipos de muestras, como plasma y suero, disminuyendo la concentración de las proteínas más abundantes y el enriquecimiento en proteínas menos abundantes, de cara a una LGHQWL¿FDFLyQGHHVWDV~OWLPDVFRPRSDVRSUHYLRD un posterior análisis proteómico [2]. Proteínas menos abundantes en las muestras biológicas son pote cialmente de gran interés para el estudio de nuevo biomarcadores de enfermedad. El ProteoMiner que se ha utilizado en este trabajo es el distribuido por BioRad y se basa en una librería de hexapéptidos inmovilizados en una matriz en forma de bolitas y en XQVRSRWHFURPDWRJUi¿FR/DOLEUHUtDFRQWLHQHJUDQ variedad de hexapéptidos sintetizados, que actúan de ligandos para las proteínas de las muestras. Material y Métodos Se ha utilizado el ProteoMiner con el objetivo GHLGHQWL¿FDUQXHYDVSURWHtQDVHQ/6GHSDFLHQWHV con Osteoartritis. Las muestras se trataron con hialuronidasa (10 U/ml LS, 1h, agitación, 500 rpm, 37 ºC, en Thermomix-Eppendorf, centrifugación 100g, 5 min., 4ºC) [3]. 10 mg de muestra se trataron con ProteoMiner. La recuperación de proteínas observadas fue inferior al 1/50 del material inicial. 50 µg de muestra de LS tratado con hialuronidasa y 50 µg muestra eluida tras el ProteoMiner se sepa- raron en un mismo gel 1-D, NOVEX (Invitrogen), 4-12%, 10 pocillos, buffer MES. Los geles se tiñeURQFRQ6<3525XE\aKUV7$VH¿MDURQHQ 10% de metanol/7% de ácido acético, 60 min. TªA y se lavaron con agua bidestilada y se escanearon en un Typhoon. Resultados El análisis de imagen de los geles en el Typhoon indicó que a igual concentración de proteínas, las muestras eluidas después del ProteoMiner presentaron una disminución de proteínas más abundantes cómo albúmina e inmunoglobulinas y se observa también una mejor distribución de proteínas, principalmente de masa molecular <50 kDa bien separadas que no se observaban en las muestras no tratadas. Como primera aproximación se ha realizado OD LGHQWL¿FDFLyQ GH GLVWLQWDV SURWHtQDV SRU KXHOOD peptídica, mediante MALDI-TOF. Las bandas de los geles se picaron mediante un picador automático (3 - 4 spots/banda/pocillo). Las proteínas se reducen, alcalinizan, se pasan a una placa de 96 pocillos y se procede a la digestión con tripsina. Los péptidos se eluyeron mediante centrifugación usando de 5-10 ȝO DO YY$&1 DFHWRQLWULOR \ YY (O análisis se espectros se analiza por MASCOT en 1&%,QU\6ZLV3URW6ZLVV3URWSVFRUHGH 6HLGHQWL¿FDURQSRU06SURWHtQDVGLIHUHQWHV en un total de 3 líquidos sinoviales de las cuales 19 aparecían exclusivamente en los eluidos del ProteoMiner y 29 preferentemente y/o exclusivamente en los LS no procesados, siendo éstas representantes de las proteínas más abundantes: albúmina sérica, alfa-2-macroglobulina, alfa-1-antitripsina, haptoglobina, etc. Por el contrario 15 de las 19 proteínas TXHVHLGHQWL¿FDURQH[FOXVLYDPHQWHHQORVHOXLGRV del ProteoMiner tenían masas moleculares de 10-30 64 kDa, siendo 3 de ellas fragmentos de proteínas más grandes, posiblemente productos de degradación. Conclusiones En este primer abordaje se ha demostrado que HO3URWHR0LQHUHVXQDKHUUDPLHQWDPX\H¿FD]SDUD conseguir el enriquecimiento en proteínas menos abundantes en líquidos sinoviales de pacientes con RVWHRDUWULWLV LGHQWL¿FiQGRVH QXHYDV SURWHtQDV TXH SXHGHQ WHQHU UHODFLyQ FRQ SURFHVRV LQÀDPDWRULRV latentes o menos obvios que en otras patologías articulares como la artritis reumatoide. Agradecimientos Ministerio Sanidad y Consumo-ISCIII-FIS, Proyecto: FIS06/1502 (M.Z.). CSIC; Proyecto: PI-200820I216 (M.Z.). Junta de Andalucía (J.A.), Consejería Innovación Ciencia y Empresa y Consejería Educación y Ciencia. Proyecto: PC08-CTS- 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 04046 (J.S. y M.Z.). Ministerio Educación y Ciencia (MEC)-Ministerio Ciencia e Innovación (MICINN) Proyecto: SAF-2008-03685 (J.S. y M.Z.). CSICBeca JAE Intro a M.D.P.-M. Referencias [1] Righetti PG y Boschetti E. The ProteoMiner and the FortyNiners: searching for gold nuggets in the proteomic arena. Mass Spectrom Rev 2008; 27: 596-608. [2] Boschetti E y Righetti P G. The ProteoMiner in the proteomic arena: a non-depleting tool for discovering low-abundance species. J Proteomics 2008; 71: 255-264. [3] Herrero-Beaumont G, Guerrero R, SanchezPernaute O, Acebes, C, et al. Cartilage and bone ELRORJLFDO PDUNHUV LQ WKH V\QRYLDO ÀXLG RI RVteoarthritic patients after hyaluronan injections in the knee. Clin Chim Acta 2001; 308: 107-115. Estudio de la Estenosis Aórtica Valvular desde un punto de vista proteómico Tatiana Martin-Rojas1, Félix Gil-Dones1, Luis F. López-Almodovar2, Fernando de la Cuesta3, Gloria Álvarez-Llamas3, Fernando Vivanco3, Luis R. Padial4, María G. Barderas1,5 1 Laboratorio Fisiopatología Vascular, Hospital Nacional de Parapléjicos, SESCAM, Toledo, 2Unidad de Cirugía Cardiaca, Hospital Virgen de la Salud, SESCAM, Toledo, 3Departamento de Inmunología, Fundación Jiménez Díaz, Madrid,, 4Unidad de Cardiología, Hospital Virgen de la Salud, SESCAM, Toledo, 5Unidad de Proteómica, Hospital Nacional de Parapléjicos, SESCAM, Toledo En la actualidad diversos autores han señalado que la estenosis aórtica degenerativa comparte los mismos factores de riesgo que la enfermedad coronaria. Además, de compartir características histológicas con las placas ateroscleróticas, lo cual sugiere TXHODFDOFL¿FDFLyQGHODYiOYXODDyUWLFDHVXQSURFHVR FUyQLFR LQÀDPDWRULR VLPLODU D OD DWHURVFOHURsis. La existencia de datos discordantes con esta teoría hace necesario el estudio de esta patología mediante la aplicación de nuevas técnicas proteómicas (2D-DIGE, LC-MS/MS, etc), con el objetivo de conseguir nuevos datos que puedan contribuir a la comprensión de los procesos implicados en esta SDWRORJtDMXQWRFRQODLGHQWL¿FDFLyQGHQXHYRVELRmarcadores pronóstico, diagnóstico y terapéuticos. La estenosis aórtica (EA) degenerativa es una enfermedad de elevada prevalencia en los países desarrollados y es la responsable del mayor número de reemplazos valvulares aórticos. En la actualidad, diversos autores han señalado que comparte los mismos factores de riesgo que la aterosclerosis1. Por ello, parece esencial profundizar en el conocimiento de la patogenia de la EA degenerativa como paso previo para establecer medidas de prevención de dicha enfermedad. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 65 En la actualidad, el estudio de proteínas individuales, aún siendo esencial, ha sido desplazado por las estrategias proteómicas que permiten el análisis global de las proteínas de una muestra2. Las nuevas tecnologías (MALDI-TOF/TOF, LC-MS, DIGE, MS-IMAGIN…) caracterizan miles de espeFLHVPROHFXODUHVHQFDGDDQiOLVLV\JHQHUDQSHU¿OHV FRQMXQWRV TXH UHÀHMDQ OD VLWXDFLyQ JHQHUDO GH XQD muestra 3. Debido a que las proteínas que componen las válvulas aórticas son esenciales para el correcto IXQFLRQDPLHQWRGHHVWDVVXLGHQWL¿FDFLyQ\FDUDFWHrización mediante herramientas proteómicas es vital SDUDFRQRFHUPiVVREUHOD¿VLRORJtDGHODYiOYXOD aórtica y las posibles patologías de ésta. Tras la aprobación de la realización del estudio por el Comité Ético del Hospital Virgen de la Salud (SESCAM, Toledo) y solicitar el correspondiente consentimiento informado se incluyeron en el estudio pacientes (n=8) que fueron ingresados en la Unidad de Cirugía del mismo hospital y que fueron sometidos a cirugía de reemplazo valvular aórtico. Como controles se utilizaron válvulas aórtias sanas (n=8) procedentes de necropsias realizadas en el Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Virgen de la Salud (Toledo). Las válvulas fueron homogeniezadas en tampón de extracción4, centrifugadas y el sobrenadante obtenido correspondiente al extracto proteico se cuanWL¿Fy FXDQWL¿FDGR VLJXLHQGR HO PpWRGR %UDGIRUG Lowry. Posteriormente se llevó a cabo el análisis proteómico mediante electroforesis bidimensional diferencial (2D-DIGE). Las proteínas fueron marcadas siguiendo las instrucciones de la casa comercial (GE.Healthcare). Se llevó a cabo la primera \ VHJXQGD GLPHQVLyQ \ ¿QDOPHQWH ODV LPiJHQHV de los geles se capturaron mediante el escáner de ÀXRUHVFHQFLD 7\SKRRQ *(+HDOWKFDUH (O análisis de las imágenes se realizó con el programa DeCyder v6.5 (GE.Healthcare) que detectó 51 manchas proteicas diferencialmente expresadas con p< 0.05 entre válvulas aórtica sin estenosis y válvulas aórticas con estenosis. Estas manchas proteicas fueron recortadas de los geles, teñidos previamente con tinción plata, digeridas con tripsina y analizadas con el espectrómetro de masas 4800 Plus MALDI-TOF/ TOF Analyzer (Applied Biosystems), seguido de una búsqueda de datos. Las 51 manchas proteicas correspondían a 18 proteínas diferentes (Tabla 1), TXH VH FODVL¿FDURQ DWHQGLHQGR D VX IXQFLyQ \ VH YDOLGDURQPHGLDQWH:%H,+& Figura 1. (A) Gel 2-DE con las proteínas de diferencia entre EA y controles. (B) Validaciones de algunas de las proteínas diferencialmente expresadas realizadas mediante Inmunohistoquímica (izquierda) y Western-blot (derecha). C)&ODVL¿FDFLyQSRU*UXSRV)XQFLRQDOHV de las proteínas LGHQWL¿FDGDVXVDQGR'(\0$/',72)72)FRPELQDdo con LC-MS/MS. Tabla 1. 3URWHtQDV LGHQWL¿FDGDV SRU HVSHFWURPHWUtD GH masas (MALDI TOF/TOF) mostrando diferentes niveles de expresión diferencial entre válvulas aórticas sanas y válvulas aórticas con estenosis, analizadas mediante DeCyder software v 6.5 con p< 0.05. 66 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Agradecimientos Beca Esteve de la Sociedad Española de Cardiología. Instituto de Salud Carlos III (FIS PI070537), Fondo de Investigación Sanitaria de Castilla la Mancha (FISCAM, PI2008/08), Fondo de Investigación Sanitaria de Castilla la Mancha (FISCAM, PI2008/28), Redes Temáticas de Investigación Cooperativa (RD06/0014/1015). Referencias [1] Butany J, Collins MJ, Demellawy DE et al. MorSKRORJLFDODQGFOLQLFDO¿QGLQJVLQVXUJLFDOO\ excised native aortic valves. Can J Cardiol 2005; 21:747-55. [2] Odile Carrette, Pierre R Burkhard, Jean-Charles 6DQFKH]'HQLV)+RFKVWUDVVHU6WDWHRIWKH art two-dimensional gel electrophoresis: a key tool of proteomics research. Nature Protocols 1, - 812 - 823 (2006). [3] F. Vivanco, L.R Padial, V. M. darde, F de la Cuesta, G. Alvarez-Llamas, N. Diaz-Prieto, et al. Proteomic biomarkers of atherosclerosis. Biomarkers Insights 2008:3, 101-113. [4] Tatiana Martín-Rojas, Félix Gil Dones, Luis F. López-Almodovar, Rocío Juárez-Tosina, Fernando de la Cuesta, Gloria Álvarez-Llamas, Sergio Alonso-Orgaz, Fernando Vivanco, Luis Rodríguez-Padial, y María G. Barderas. Obtención de un protocolo óptimo para el análisis proteómico de válvulas aórticas humanas sanas y estenóticas. Rev Esp Cardiol. 2010;63. Metabolic labelling of primary culture human cartilage cells to analyze the effect RI,QWHUOHXNLQȕLQWKHH[WUDFHOOXODUPDWUL[PHWDEROLVP Valentina Calamia, Beatriz Rocha, Patricia Fernández, Jesús Mateos, Cristina Ruiz-Romero, Francisco J. Blanco Osteoarticular and Aging Research Lab, Nodo Asociado de Proteo-Red. INIBIC-Hospitalario Universitario A Coruña, Xubias 84, 15006 - A Coruña, SPAIN Introduction ,QWHUOHXNLQȕ ,/ȕ LV D SURLQÀDPPDWRU\ cytokine that acts as an arthritic mediator with the capacity to drive the key pathways typically associated with osteoarthritis (OA) pathogenesis. This degenerative joint disease, characterized by articular cartilage degradation, involve in its initial stages an increased cellular proliferation and synthesis of matrix proteins, proteinases, growth facWRUV F\WRNLQHV DQG RWKHU LQÀDPPDWRU\ PHGLDWRUV by cartilage cells. Therefore, research has focused on the chondrocyte (the unique cell type of cartilage) as the cellular mediator of OA pathogenesis. Chondrocytes of OA patients, as well as synovial FHOOV SURGXFH LQFUHDVHG OHYHOV RI LQÀDPPDWRU\ F\WRNLQHVVXFKDV,/ȕ>@7KLVF\WRNLQHVKLIWV the biology of the chondrocytes towards articular cartilage degradation by increasing the expression of matrix metalloproteinases while inhibiting the expression of genes encoding essential components of the cartilage extra cellular matrix (ECM). :HKDYHUHFHQWO\XVHG'(WHFKQRORJ\WRGHVcribe the intracellular proteome of normal and OA human chondrocytes [2-3]. In the present work, we have standardized the stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC) technique on primary culture human articular chondrocytes, DQGKDYHDSSOLHGIRUWKH¿UVWWLPHWKLVVWUDWHJ\IRU studying the chondrocyte extracellular matrix metabolism in basal conditions and under the effect of WKHSURLQÀDPPDWRU\F\WRNLQH,/ȕ Methods Cartilage obtained from patients undergoing joint replacement was provided by the Tissue Bank at 67 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 CHU A Coruña. The study was approved by the local Ethics Committee. Chondrocytes released from cartilage by enzymatic digestion were recovered DQGSODWHGDWORZGHQVLW\LQ6,/$&'0(0)OH[ (Invitrogen) supplemented with antibiotics, glucose and 10% FBS. In the case of light media, standard L-lysine (146 mg/L) and L-arginine (28 mg/L) were used, while in the heavy media isotope-labelled L-lysine (13C6), and isotope-labelled L-arginine (13C6,15N4) were used. Titration assays were performed to minimize the problematic conversion of heavy Arg to Pro in chondrocyte cell culture. Cell proliferation and cell viability was tested by cell count and Trypan Blue dye exclusion. Real-time PCR analyses were carried out to verify the expression of Collagen II, a typical marker of chondrocyte cells, under the conditions of study. Chondrocytes were used at week 2-3 in primary culture (P1), after making them quiescent by incubation in a medium containing 0% FBS for 24h. Cells were then washed thoroughly and incubated in serum-free medium with ,/ȕ DW QJP/ IRU 48 hours. Then, conditioned media were collected DQGWKHLUSURWHLQVZHUHFRQFHQWUDWHGDQGTXDQWL¿HG (Figure 1). Figure 1. ([SHULPHQWDOZRUNÀRZIRUWKHGLIIHUHQWLDOVHFUHWRme analysis of chondrocytes by SILAC and nanoLC-MS/MS. Heavy and light samples were mixed 1:1, and 4 ȝJ RI HDFK PL[HG VDPSOH ZHUH LQVROXWLRQ UHGXced, alkylated and digested with trypsin. Peptide PL[WXUHVZHUHGHVDOWHGDQG¿OWHUHGWKURXJKD& microcolumn, and column eluates were subjected to nano-LC-MS analysis using a Tempo nanoLC equipped with a C18 column, and a 4800 MALDITOF/TOF mass spectrometer (Applied Biosystems). 7KHLGHQWL¿FDWLRQDQGTXDQWL¿FDWLRQRISURWHLQVZDV carried out with Protein Pilot software. Results Chondrocytes are responsible of the synthesis of cartilage ECM components, but in primary culWXUHWHQGHDVLO\WRGHGLIIHUHQWLDWHLQWR¿EUREODVWV A method for obtaining a complete labelling of the proteins avoiding the cellular de-differentiation KDV EHHQ GHYHORSHG :H KDYH PLQLPL]HG WKH$UJ concentration in order to render it metabolically unfavourable as a precursor for Pro synthesis, and YHUL¿HGWKDWWKHVHUHVWULFWHGFRQGLWLRQVGRQRWFRPpromise cell proliferation, viability and expression of chondrocyte markers such as Collagen II, which is a proline-rich protein. Collection and proteomic analysis of the proteins secreted by the chondrocytes allowed the LGHQWL¿FDWLRQRIDQXPEHURISURWHLQVWKDWKDGEHHQ previously related with OA pathogenesis, such as matrix metalloproteinases and cathepsins. InteresWLQJO\PRVWRIWKHSURWHLQVLGHQWL¿HGDUHFDUWLODJH ECM components (27%) (Figure 2), clearly showing the usefulness of secretome analysis for the study of (&0PHWDEROLVP:HFRXOGDOVR¿QGDKLJKQXPEHU of growth factors, matrix remodelling proteins and cytokines (6 of them that are known to be involved LQWKHLQÀDPPDWRU\UHVSRQVHWKDWDUHVHFUHWHGE\ ,/ȕWUHDWHGFKRQGURF\WHVLQGLFDWHGWKRVHFHOOXODU SDWKZD\VWKDWDUHLQGXFHGE\WKLVSURLQÀDPPDWRU\ cytokine in cartilage cells. Figure 2. )XQFWLRQDOFODVVL¿FDWLRQRIWKHSURWHLQVLGHQWL¿HG in this work. Conclusions :HKDYHVWDQGDUGL]HGWKH6,/$&WHFKQLTXHIRU the proteomic analysis of human primary cartilage cells, and we have applied this technology for stuG\LQJ WKH HIIHFW RI WKH SURLQÀDPPDWRU\ F\WRNLQH ,/ȕ D NH\ PROHFXOH LQ WKH 2$ SURFHVV RQ WKH chondrocyte secretome. The obtained information will increase knowledge about OA pathogenesis, and already points out a number of possible markers of the disease. 68 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 articular chondrocytes: a novel tool for the study of osteoarthritis and other rheumatic diseases. Proteomics. 2005;5(12):3048-59. References >@ [2] %ORP$%YDQGHU.UDDQ30YDQGHQ%HUJ:% Cytokine targeting in osteoarthritis. Curr Drug Targets. 2007;8(2):283-92. Ruiz-Romero C, Lopez-Armada MJ, Blanco FJ. Proteomic characterization of human normal [3] Ruiz-Romero C, Carreira V, Rego I, Remeseiro S, Lopez-Armada MJ, Blanco FJ. Proteomic analysis of human osteoarthritic chondrocytes reveals protein changes in stress and glycolysis. Proteomics. 2008;8(3):495-507. ,GHQWL¿FDWLRQRIGLIIHUHQWLDOSURWHLQVLQOLYHUFHOOVXSRQGHSOHWLRQRISURKLELWLQ Virginia Sánchez-Quiles, Enrique Santamaría, Laura Sesma, Fernando J. Corrales Division of Hepatology and Gene Therapy, Proteomics Unit. Centre for Applied Medical Research (CIMA), University of Navarra. 31008, Pamplona, Spain Introduction Prohibitin (Phb) is a multifunctional protein participating in a plethora of essential cellular functions, such as cell signalling, apoptosis, survival and proliferation, playing a central role in the maintenance of liver homeostasis through the regulation of central proteins involved in these processes by means of protein-protein interaction mechanisms. ,QWKHOLYHUGH¿FLHQWSURKLELWLQDFWLYLW\SDUWLFLSDWHV in the progression of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and obesity, according to mechanisms that still must be elucidated. Phb1 plays an essential role in hepatic functions such as inhibition of cell proliferation [1, 2] and response to anti-cancer [3] or carcinogenic agents [4]. Down-regulation of Phb1 is an early event in the development of NASH and hepatocellular carcinoma (HCC) in experimental mouse models and humans [5]. All these data suggest that Phb1 may play a prominent role in the progression of HCC. Materials and Methods Phb1 expression was silenced in the human +&& FHOO OLQH 3/&35) XVLQJ VSHFL¿F VL51$V (siGL, control cells; siPHB, treated cells). Phb1 levels were analysed by immunodetection assay. $SRSWRVLVZDVTXDQWL¿HGZLWKWKH&HOO'HDWK'HWHFtion Kit (Roche). Cell proliferation was estimated by cell counting and with the Cell Proliferation Reagent :675RFKH,QRUGHUWRH[SORUHWKHPROHFXODU mechanisms involved in the response of PLC cells to impaired Phb1 activity we used a combination of DIGE and mass spectrometry analyses. To increase WKHHI¿FLHQF\RIWKHSURFHVVF\WRVROLFDQGPLFURsomal subcellular fractions were isolated (Qproteome Cell Compartment Kit, from Qiagen). Enriched cytosolic and microsomal fractions from siGL and siPHB cells were compared by DIGE analysis. DiIIHUHQWLDOVSRWVGHWHFWHGDQGTXDQWL¿HGE\'H&\GHU ZHUHLGHQWL¿HGE\QDQR/&(6,0606472) Results Phb1 levels were reduced by 80% upon siRNA VLOHQFLQJ$SRSWRVLVZDVTXDQWL¿HGDQGDEVRUEDQFH was 3-fold increased in siPHB cells indicating the SURDSRSWRWLFHIIHFWRI3KEGH¿FLHQF\)LJXUH' In addition, Phb silencing severely compromised the capacity of PLC cells to proliferate in a semisolid substrate, an inherent property of transformed cells that is related with their metastatic capacity (Figure 1C). Both cell counting and formazan production UHYHDOHGDVLJQL¿FDQWUHGXFWLRQRIWKHSUROLIHUDWLRQ rate of siPHB cells when compared with the control siGL cells (Figure 1A and B). DeCyder analysis of DIGE of cytosolic and microsomal fractions found 76 and 25 spots diffe- 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 rentially represented (T test < 0.05) in siPHB with respect to siGL cells. MS/MS analysis allowed WKHLGHQWL¿FDWLRQRIDQGXQLTXHSURWHLQVLQ the cytosolic and microsomal fractions respectively (Table 1). 69 E\ :HVWHUQ EORW ¿JXUH % LQ VL3+% FHOOV VXJgest ER stress that, in turn, might participate in the apoptotic response of PLC cells to Phb1 silencing. In agreement to this hypothesis, we found increased CHOP levels, PARP cleavage and activation of caspase 12 and downstream caspase 7 (Figure 2A). ER stress might result from proteasome malfunction leading to the accumulation of miss-folded polypeptide chains in the cell. Phb1 silencing induced downregulation of proteasome activator complex subunit DQGVWDWKPLQDVYHUL¿HGE\:HVWHUQEORW)LJXUH 2B) suggesting impairment of proteasome activity. 'H¿FLHQWSURWHDVRPHDFWLYLW\ZDVHYLGHQFHGE\WKH accumulation of ubiquitinated proteins upon Phb silencing (Figure 2B). Figure 1. Cell growth and survival upon Phb1 silencing. Conclusions Phb1 silencing in human hepatoma cell line PLC/PRF5 leads to an increase of apoptotic rate and an impaired cell proliferation. Down-regulation of &DOUHWLFXOLQ(5SDQG(UOLQIXUWKHUFRQ¿UPHG Figure 2. Molecular targets mediating the cellular response WR3KEGH¿FLHQF\ Table 1,GHQWL¿FDWLRQRISURWHLQVFRUUHVSRQGLQJWRWKHGLIIHUHQWLDOVSRWVDVVLJQHGE\VL*/YHUVXVVL3+%'(JHOLPDJH analysis. 70 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 hepatoma Huh-7 cells. Cancer Lett 2009; 282: 48-54. References [1] McClung JK, Danner DB, Stewart DA, Smith JR, Schneider EL, Lumpkin CK, et al. Isolation of a cDNA that hybrid selects antiproliferative mRNA from rat liver. Biochem Biophys Res Commun 1989; 164: 1316-1322. >@ 6XQ40LDR0-LD;*XR::DQJ/<DR=et al. Subproteomic analysis of the mitochondrial proteins in rats 24 h after partial hepatectomy. J Cell Biochem 2008; 105: 176-184. [3] Yoo DR, Jang YH, Jeon YK, Kim JY, Jeon :&KRL<-et al3URWHRPLFLGHQWL¿FDWLRQRI anti-cancer proteins in luteolin-treated human [4] Leonard JF, Courcol M, Mariet C, Charbonnier A, Boitier E, Duchesne M, et al. Proteomic FKDUDFWHUL]DWLRQRIWKHHIIHFWVRIFOR¿EUDWHRQ protein expression in rat liver. Proteomics 2006; 6: 1915-1933. [5] Santamaria E, Avila MA, Latasa MU, Rubio A, Martin-Duce A, Lu SC, et al. Functional proteomics of nonalcoholic steatohepatitis: mitochondrial proteins as targets of S-adenosylmethionine. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100: 3065-3070. Introduction to Lucid Proteomics System, a new solution for peptide and protein SUR¿OLQJDQGLGHQWL¿FDWLRQFRPELQLQJ5HWHQWDWH&KURPDWRJUDSK\WR0$/', TOF and TOF/TOF Mass Spectrometry Francesco Tortorella Lucid Sales Manager Europe, Bio-Rad Laboratories Bio-Rad Laboratories The Lucid Proteomics System provides a novel means for top-down proteomic analysis of complex biological samples by combining the separation power of SELDI ProteinChip arrays with high-resolution MALDI-TOF and MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. 7KHVSHFL¿FLW\RIWKH3URWHLQ&KLSDUUD\VXUIDFHV permits sample cleanup directly on the arrays, making the process compatible with crude biological samples (such as neat urine) and harsh elution buffer components (salts, urea, etc.) that are not normally compatible with MS analysis. 6HYHUDOH[DPSOHVRISXUL¿FDWLRQVWUDWHJLHVDQG LGHQWL¿FDWLRQVZLOOEHGHVFULEHG 71 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 02',),&$&,21(632675$'8&&,21$/(6 Coordinadores: Marina Gay, Montserrat Carrascal, Antonio Martínez-Ruiz y Pablo Martínez-Acedo Liquid chromatography—electron transfer dissociation and ion mobility studies on a QTOF mass spectrometer Keith Compson,James Langridge, Jeffery Brown, Steven Pringle, Iain Campuzano, Richard Chapman :DWHUV&RUSRUDWLRQ:\WKHQVKDZH0DQFKHVWHU8. ETD (Electron Transfer Dissociation) is a MS/ MS technique in which precursor cations are reacted with radical reagent anions to induce fragmentation. Electron transfer from anion to cation, promotes fast and randomised dissociation compared to collision induced dissociation (CID) and hence ETD product ion spectra contain predominantly “c” and “z” type ions and post translational moGL¿FDWLRQVRIWHQUHPDLQLQWDFWSURYLGLQJYDOXDEOH sequence information. Here we show how ETD can be implemented DQG SHUIRUPHG RQ D K\EULG 4,0672) :DWHUV Synapt) where a supply of reagent from a sealed ampule is delivered to the intermediate pressure region of the nano ESI source and a high voltage discharge pin was added to the ion source to generate the reagent anions. Analyte cations were generated using the standard nanospray source via infusion or nanoACQUITY UPLC system. For ETD, the ion source polarity and the quadrupole set mass were sequentially switched to deliver anions and cations LQWRWKH75$3WUDYHOOLQJZDYH7:$9(LRQJXLGH where they reacted to form ETD product ions. Product ions were optionally separated by ion mobility LQWKH,067:$9(LRQJXLGHRUZHUHDFFHOHUDWHG LQWR WKH 75$16)(5 7:$9( LRQ JXLGH WR FDXVH 2nd generation collision induced dissociation (CID) ions prior to mass analysis in the TOF. Bovine serum albumin (BSA) tryptic peptides (250fm and 50fm) were separated by nanoAcquity UPLC and a selection of triply charged precursor masses were subsequently selected to generate LC-ETD spectra. Data were acquired at 1 spectra/ second and the fragment ions were database searched with all spectra matching to BSA with high probability. High quality data was observed at the 50fm injection level, with ETD data acquired at 1 spectra/second. Cleavage was observed at almost every amide bond in the peptide backbone, yielding easy-to-interpret sequence ladders of c and z-ions. This coupled with the inherent mass measurement accuracy and resolution of the oa-TOF mass analyser makes the data easily amenable to de novo sequencing. The signal intensity of the fragment ions seemed to diminish with decreasing m/z, as previously reported. In addition to the ETD experiments the mass spectrometer can acquire alternate scans in CID, and as such data will be compared and contrasted between ETD and CID on a variety of peptides produced and separated by nanoscale chromatography. 72 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Strategies for proteomic analysis of blood glycated proteins María Ramírez-Boo1, Feliciano Priego-Capote2, Alexander Scherl1, Jean-Charles Sanchez1 1 Biomedical Proteomics Research Group, Dpt. of Structural Biology and Bioinformatics, University Medical Center, Geneva, Switzerland. 2 Dpto. de Química Analítica, Universidad de Córdoba, Spain. $PRQJSRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQV370V of proteins, non-enzymatic glycation is one of the less frequently studied in proteomics. Glycated proteins are formed by a non-enzymatic reaction between reducing carbohydrates (e.g., glucose, fructose, ribose or derivatives such as ascorbic acid) with amino groups located in N-terminal position or in lysine and arginine residues (Figure 1) [1]. Analytical guidelines required to succeed in the characterization of glycated proteins at qualitative levels have been UHFHQWO\SURSRVHG>@,WLQYROYHVWKHLGHQWL¿FDWLRQ of glycated proteins as well as the elucidation of sugar attachment sites. Nevertheless, there is a demand for quantitative proteomic strategies that could be potentially applied for glycation assessment. One of WKHDUHDVWKDWFRXOGEHQH¿WIURPWKHVHVWUDWHJLHVLV WKHFOLQLFDO¿HOGGXHWRWKHFUXFLDOUROHRIJOXFRVHDV an energy source in humans, being the main circulating sugar and, thus, the most relevant molecule in terms of protein glycation. In fact, there are clinical evidences relating glycation and pathological conditions associated to hyperglycaemia such as diabetes mellitus, renal failure or aging [5-7]. Figure 1. Scheme of the glycation process (Maillard reaction). A set of innovative approaches for analysis of glycated proteins is here presented by application to blood samples [8]. Qualitative analysis was carried out by tandem mass spectrometry (MS) after enGRSURWHLQDVH *OX& GLJHVWLRQ DQG ERURQDWH DI¿QLW\ chromatography (BAC) for isolation of glycated peptides. For this purpose, two MS operational modes were used: HCD-MS2 and CID-MS3 by neutral loss scan (monitoring two selective neutral losses typical RISHSWLGHVPRGL¿HGE\JOXFRVHDWWDFKPHQW and 84.04 Da). Quantitative analysis was based on the labelling of proteins with 13C6-glucose incubation in order to evaluate the native glycated proteins labelled with 12C6-glucose. As glycation is chemo-selective, it is exclusively occurring in potential targets for in vivo PRGL¿FDWLRQV7KLVDSSURDFKQDPHG*O\FDWLRQ,VRWRpic Labelling (GIL), enabled to differentiate glycated peptides labelled with both isotopic forms resulting from enzymatic digestion by MS (6 Da mass shift per glycation site) as shown in Figure 2. :LWK WZR GLIIHUHQW SXUSRVHV WKLV VWUDWHJ\ KDV been applied to human plasma and lysates from 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 73 Figure 2. %RWWRPXSSURWHRPLFVZRUNÀRZVXVHGIRUTXDQWLWDWLYHDQDO\VLVRIJO\FDWHGSURWHLQVVKRZLQJWKHODEHOOLQJZLWK light and heavy glucose. 74 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 HU\WKURF\WHV7KH¿UVWRQHZDVEDVHGRQWKHFKDUDFterization of the native glycated proteome, incubating the clinical samples with 13C6-glucose prior to DQDO\VLVZLWKWKHFRQYHQWLRQDOSURWHRPLFVZRUNÀRZ exposed above. Fifty glycated proteins with identi¿FDWLRQRIVXJDUDWWDFKPHQWSRVLWLRQVZHUHGHtected in the analysis of human plasma. Concerning UHGEORRGFHOOVJO\FDWHGSURWHLQVZLWKLGHQWL¿FDtion of 54 glycation sites were detected without any protein pre-fractionation step. These proteins are representative targets to compare between samples with different glycaemic states and monitor the glycaemic control. The second task was focused on the assessment of glucose stimuli at different concentrations (0, 5, 10, 30 and 50 mM glucose) in human SODVPD)RUWKLVSXUSRVH¿YHSODVPDDOLTXRWVZHUH independently incubated with 0, 5, 10, 30 and 50mM 12 C6-glucose for 24 h and, subsequently mixed with a plasma aliquot incubated with 30mM 13C6-glucose for 24 h. Proteomic analysis of these pools has revealed additional information about the biological effect of different hyperglycemia conditions and the kinetic of glycation. ¿OLQJRIQRQHQ]\PDWLFDOO\JO\FDWHGSURWHLQVLQ human plasma and erythrocyte membranes. J. Proteome Res. 2008; 7, 2025-2032. [3] Zhang, Q., Petyuk, V. A., Schepmoes, A. A., Orton, D. J., Monroe, M. E., Feng, Y., Smith, R. D., Metz, T. O. Analysis of non-enzymatically glycated peptides: neutral-loss-triggered MS3 versus multi-stage activation of tandem mass spectrometry. Rap. Comm. Mass Spectrom. 2008; 22, 3027-3034. [4] Zhang, Q., Ames, J. M., Smith, R. D., Baynes, -:0HW]72$SHUVSHFWLYHRQWKH0DLOODUG reaction and the analysis of protein glycation by mass spectrometry: probing the pathogenesis of chronic disease. J. Proteome Res. 2009; 8, 754-769. >@ %D\QHV-:7KHUROHRI$*(VLQDJLQJFDXsation or correlation. Exp. Gerontol. 2001; 36, 1527-1537. [6] Brownlee, M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 2001; 14, 813-820. [7] Hipkiss, A. R. Accumulation of altered proteins and ageing: causes and effects. Exper. Gerontol. 2006; 41, 464-473. [8] Priego-Capote F., Scherl$0OOHU0:DULGHO P., Lisacek F., Jean-Charles Sanchez J-C. Glycation Isotopic Labelling (GIL) with 13C-reducing Sugars for Quantitative Analysis of Glycated Proteins in Human Plasma MCP, 2009, in press. References [1] Maillard, L. C. Action des acides amines sur le sucres: formation des mélanoidines per voie méthodique. C. R. Acad. Sci. 1912; 154, 66-68. [2] Zhang, Q., Tang, N., Schepmoes, A. A., Phillips, L. S., Smith, R. D., Metz, T. O. Proteomic pro- 75 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 HPLC-FosfoChip una nueva tecnología para el análisis selectivo de fosfopéptidos mediante LC/MS Isidro Masana1. Reinout Raijmakers2, Shabaz Mohammed2, Albert Heck2, Dayin Lin3 1 Agilent Technologies–Barcelona. 2Biomolecular Mass Spectrometry and Proteomics Group, Bijvoet Center and Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences –Utrecht–Netherlands. 3Agilent Technologies :DOGEURQQ*HUPDQ\ La fosforilación de proteínas es uno de los más LPSRUWDQWHVPHFDQLVPRVGHPRGL¿FDFLyQSRVWWUDGXFcional (PTM) para regular la función de las proteínas en las células. Miles de procesos biológicos, incluyendo la proliferación, migración y apoptosis celular, implican pasos de fosforilación. Uno de los principales HVIXHU]RVHQSURWHyPLFDYDGLULJLGRDODLGHQWL¿FDFLyQ y comprensión de los fosfoproteomas en las células. El enriquecimiento selectivo de péptidos y proteínas fosforiladas es necesario para conseguir una mejor cobertura del fosfoproteoma. El enfoque QHFHVDULRVFUHDQUHWRVHQFXDQWRDVX¿DELOLGDGURbustez y reproducibilidad. La automatización de las etapas de enriquecimiento y de separación analítica, son la mejor manera de conseguir una buena reproducibilidad, inyección a inyección y entre distintos ODERUDWRULRV(OQXHYRFKLSPLFURÀXtGLFR3KRVSKRchip es un HPLC-Chip reutilizable diseñado para enriquecimiento y análisis fosfopeptídico [1-2] que SHUPLWHODDXWRPDWL]DFLyQGHHVHÀXMRGHWUDEDMR El chip consiste en una multicapa de poliimida laminada que contiene una zona de enriquecimien- Figura 1. Diseño del FosfoChip: (A). El FosfoChip incorpora una columna de enriquecimiento encapsulada con: RP-TiO2-RP. (B). Posición de carga para enriquecimiento de péptidos. (C). Etapa de separación de péptidos a través de columna analítica. basado en dióxido de titanio es un método particularmente robusto y automatizable con una gran D¿QLGDGSRUORVIRVIRSpSWLGRV1RREVWDQWHODVP~Otiples micro-válvulas, conexiones y micro-capilares to con partículas de dióxido de titanio (TiO2), ÀDQTXHDGD D DPERV ODGRV SRU PDWHULDO GH IDVH reversa C18 (ver Figura 1). La zona de enriquecimiento está conectada a la columna de separación 76 de fase reversa que acaba en una punta integrada de nanoelectrospray. A través del “Chip-cube” (la interfase al MS del HPLC-Chip), una micro-válvula conecta direcWDPHQWHHOQDQRFURPDWyJUDIRFRQODVXSHU¿FLHGHO chip. Ello crea un sello de alta presión y cero volumen muerto, y permite la automatización de la carga de muestras, desalinización, elución desde la SUHFROXPQDGHHQULTXHFLPLHQWR\VHSDUDFLyQ¿QDO en la columna analítica mediante un gradiente de la concentración de solvente orgánico del eluyente. El FosfoChip se complementa con un kit de reactivos para el análisis de fosfopéptidos en cualquier sistema HPLC-Chip/MS (Agilent QTOF/QqQ/TOF/Q). El kit incluye una mezcla acondicionadora y un estándar para saturar todos los potenciales puntos de adsorción de fosfopéptidos del HPLC. El conjunto de columna de enriquecimiento empaquetada con RP1-TiO2-RP2, permite en un sólo experimento la retención y análisis por separado de péptidos fosforilados y no fosforilados. El chip puede operar en dos modos diferentes, según interesen o no los péptidos no fosforilados. En el primer modo, cuando sólo interesan fosfopéptidos, la gran mayoría de los péptidos se atraparán inicialmente en RP1. La elución posterior de péptidos con solvente orgánico los arrastrará hasta la fase TiO2, donde sólo se retendrán los fosfopéptidos, desechándose los péptidos no fosforilados (no retenidos). En la 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 siguiente etapa, los fosfopéptidos se desorben del TiO2 con un tampón de elución básico, atrapándose en RP2. Finalmente, se realiza un gradiente para separar los fosfopéptidos en la columna analítica. En el modo dual (fosforilados y no fosforilados), previamente a la separación de los fosfopéptidos, se lleva a cabo un gradiente de elución de los péptidos retenidos en RP1 dirigiéndolos a la columna analítica para separar los péptidos no fosforilados (los fosforilados permanecen retenidos en el TiO2). Finalmente en un segundo gradiente se realiza la separación de los péptidos fosforilados (previa elución de estos de la columna de TiO2 a la RP2 como se indicaba en el párrafo anterior). Parte experimental Un lisado de proteínas de células de osteosarcoma U2OS humano se redujo, alquiló y se digirió con tripsina. Los péptidos resultantes se fraccionaron por cromaWRJUDItD6&;\ȝJGHODIUDFFLyQTXHWHyULFDPHQWH contenía la mayoría de péptidos ionizados con 1 sola carga neta (conocida por contener la mayoría de fosfopéptidos), se analizó con un Agilent HPLC-Chip/MS conectado a un Q-TOF Agilent-6520 y se compararon los resultados obtenidos mediante el FosfoChip y un HPLC-Chip standard mediante MS/MS automático. El 90% de la señal total se encontró en el ³ÀRZWKURXJK´ )LJXUD OD IUDFFLyQ QR UHWHQLGD Figura 2. Comparación análisis de fosfopéptidos fracción SCX de péptidos mono-cargados de osteosarcoma U2OS humano: (A) con HPLC-Chip estándar. (B) FosfoChip:fracción no retenida en TiO2 (C) FosfoChip: Fracción retenida en TiO2 IRVIRSpWLGRV'1~PHURGHIRVIRSpSWLGRV~QLFRVLGHQWL¿FDGRVFRQ6SHFWUXP0LOO 77 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 en TiO2. El análisis de la fracción retenida en TiO2, con el motor Spectrum Mill y la base de datos huPDQD ,3, SHUPLWLy OD LGHQWL¿FDFLyQ GH IRVfopéptidos. En contraste, sólo 11 fosfopéptidos se LGHQWL¿FDURQ FXDQGR OD PLVPD PXHVWUD VH DQDOL]y con el HPLC-Chip estándar. Como era de esperar, los componentes mayoritarios no fosforilados, enPDVFDUDURQ OD LGHQWL¿FDFLyQ GH ORV IRVIRSpSWLGRV en muestras en las que no se realizó el paso de enriquecimiento/ separación en TiO2. Ello es debido a la falta de tiempo para adquirir en un pico croPDWRJUi¿FR ORV HVSHFWURV GH 0606 GH SpSWLGRV minoritarios (como los fosforilados), cuando estos coeluyen con diversos péptidos mayoritarios y se trabaja en Auto-MS/MS. Referencias [1] Mohammed S, et al. Chip-Based Enrichment and NanoLC/MS/MS Analysis of Phosphopeptides IURP:KROH/\VDWHV-3URWHRPH5HV 1565-71. [2] Raijmakers R, Mohammed S, J.R Heck A. Lin D., Masana I., HPLC-FosfoChip: análisis selectivo de Fosfopéptidos por LC/MS. Lifescienceslab 2009; 5 :30-35. ,GHQWL¿FDWLRQRIDQHZSKRVSKRU\ODWLRQVLWHLQ()WUDQVFULSWLRQIDFWRU Nerea Osinalde1, Miren Josu Omaetxebarria1, Kerman Aloria2, Ana M. Zubiaga3, Asier Fullaondo3, Jesus M. Arizmendi1 1 Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of the Basque Country, Leioa, Spain. Proteomics Core Facility-SGIker (ProteoRed), University of the Basque Country, Leioa, Spain. 3 Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, Leioa, Spain. 2 The E2F transcription factor family (E2F1-8) is required for the regulation of a number of genes involved in several essential cellular processes. It is for that reason that the activity of E2Fs must be carefully controlled. Reversible phosphorylation is one of the main regulatory mechanisms controlling the activity of proteins that has also been described for E2Fs. Several phosphorylation events have already been described for E2F1 but WKHRQHVGHVFULEHGVRIDUDUHLQVXI¿FLHQWWRFRPpletely understand how this transcription factor is regulated. In order to identify new phosphorylation sites, E2F1 was immunoprecipitated and following protease mediated digestion was loaded onto TiO2 microcolumns. The enriched fractions were analyzed by LC-MS/MS. This methodology allowed the LGHQWL¿FDWLRQRIDQHZ()SKRVSKRU\ODWLRQVLWH not described to date. Introduction E2Fs (E2F1-8) play a central role in cell cycle progression, DNA damage repair, apoptosis, cell differentiation and development. Each of this family members are known to regulate more than one cellular process depending on the stimuli they are subjected to. For instance, E2F1-dependent transcription is essential for cell proliferation but depending on the cellular context can also trigger cell death. That is why E2F-dependent transcription needs to be tightly regulated. Transcriptional activity of each E2F is modulated at various levels. Not only protein-protein interaction and subcellular localization but also SRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQVVXFKDVDFHW\ODWLRQ and phosphorylation have been proven to regulate DQGGHWHUPLQHWKHVSHFL¿FUROHVRI ()V )RU LQVtance, it is known that the DNA binding capacity 78 of E2F1 is reduced when Ser375 is phosphorylated [1] while phosphorylation of Ser31 and Ser364 following DNA damage has been reported to stabilize E2F1 itself and also promote its apoptotic pathway [2]. However it cannot be ruled out the possibility to ¿QGPRUHSKRVSKRU\ODWLRQHYHQWVLQ() To gain a better understanding of how E2F1 is regulated, we looked for new phosphorylation events it may suffer. Immunoprecipitation of E2F1 followed by LC-MS/MS analysis of TiO2 enriched SKRVSKRSHSWLGHV)LJXUHOHGWRWKHLGHQWL¿FDWLRQ of a novel phosphorylation site for E2F1. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 +'06PDVVVSHFWURPHWHU:DWHUVLQWHUIDFHGWRD 1DQR$FTXLW\83/&6\VWHP:DWHUV7KHVDPSOH was loaded onto a Symmetry 300 C18 precolumn. The precolumn was connected to a BEH130 C18 coOXPQ:DWHUV0DVFRWVHDUFKHQJLQHhttp://www. matrixscience.com ZDV XVHG IRU SURWHLQ LGHQWL¿cation. Bioinformatics: Phosphorylation site- and motif-prediction tools were used. Netphos 2.0 [4] and Phosida [5] were used for the prediction of putative phosphorylation sites in E2F1. Additionally, Phosida was used for kinase prediction of putative phosphorylation sites. http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ and http://www.phosida.com/ Results and discussion $ QHZ SKRVSKRU\ODWLRQ VLWH ZDV LGHQWL¿HG IRU E2F1. Manual validation of the spectra allowed the assignment of the phosphorylation to residue Ser307 (Figure 2). Figure 1. Strategy for the analysis of phosphorylation in E2F1. E2F1 was immunoprecipitated, protease-digested and the resulting peptides were enriched by TiO2 and analyzed by LC-MS/MS. Materials and methods Immunoprecipitation of E2F1 transcription factor: A cell extract from 293T cells overexpressing E2F1 was incubated with an antibody against E2F1. After washing, proteins were eluted with 0.1M glycine pH 2.5 at 25ºC O/N. Samples were neutralized with 1.5M TrisHCl pH 8.8. In-solution digestion of the immnoprecipitated fractions: Protein eluates were reduced with dithiothreitol, alkylated with iodoacetamide and digested O/N at 25ºC with GluC. Titanium Dioxide (TiO2) enrichment of phosphorylated peptides: Preparation and use of TiO2 microcolumns for phosphopeptide enrichment was performed essentially as previously described by Larsen et al., 2005 [3]. LC-MS/MS: Titanium enriched fractions were analyzed in a SYNAPT Figure 2. 0606VSHFWUDRIWKHLGHQWL¿HGSKRVSKRSHSWLGH for E2F1 transcription factor. Among the four possible phosphorylable residues for the phosphopeptide 301ETVGGISPGKTPSQE315, it was possible to assign the phosphorylation site to residue Ser307. Bioinformatic analysis was also performed to predict possible phosphorylation sites in E2F1. According to NetPhos 2.0 predictor, the phosphorylaWLRQSUHGLFWHGVFRUHIRUWKHLGHQWL¿HGVLWHLQ() is 0.997, which reinforces our result. Moreover, phosphorylation database Phosida predicted that the kinase involved in the phosphorylation of Ser307 would be CDK2. It has already been described that E2F1 can form a stable complex with cyclinA/CDK2 and that CDK2 can phosphorylate E2F1 regulating this way its DNA-binding activity [1]. $FNQRZOHGJHPHQWV N.O. is a recipient of University of the Basque Country fellowship for PhD studies. This work has 79 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 been funded by Etortek and Saiotek grants from the Industry Department of the Basque Government. Proteomics Core Facility-SGIker is supported by UPV/EHU, MICINN, GV/EJ, ESF and ProteoRed agencies. [1] Peeper DS, Keblusek P, Helin K, Toebes M, Van der Eb AJ and Zantema A. Phosphorylation of a VSHFL¿FFGNVLWHLQ()DIIHWVLWVHOHFWURSKRUHtic mobility and promotes pRB-binding in vitro. Oncogene 1995;10:39–48. >@ /LQ:&/LQ)7DQG1HYLQV-56HOHFWLYHLQduction of E2F1 in response to DNA damage, mediated by ATM-dependent phosphorylation. Genes Dev 2001;15:1833-44. [3] Larsen MR, Thingholm TE, Jensen ON, Roepstorff P and Jørgensen TJ. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics 2005;4:873-86. [4] Blom N, Gammeltoft S and Brunak S. Sequence and structure-based prediciton of eukaryotic protein phosphorylation sites. J Mol Biol 1999;294:1351-62. [5] Gnad F, Ren S, Cox J, Olsen JV, Macek B, Oroshi M and Mann M. PHOSIDA (phosphorylation site database): management, structural and evolutionary investigation, and prediction of phosphosites Genome Biology 2007;8:R250. (VWDEOHFLPLHQWRGHXQÀXMRGHWUDEDMRHIHFWLYRHQODFDUDFWHUL]DFLyQFXDOLWDWLYD y cuantitativa del fosfoproteoma David Ovelleiro, Montserrat Carrascal, Joaquin Abian /3&6,&8$%,,%%&6,&(GL¿FLR0&DPSXV8$%%HOODWHUUD%DUFHORQD6SDLQ La determinación de puntos de fosforilación en proteínas es una de las áreas de la proteómica con mayor interés en la actualidad. Los últimos avances HQODLQVWUXPHQWDFLyQ\HQODVWpFQLFDVGHSXUL¿FDFLyQ están permitiendo la detección de formas fosforiladas de péptidos a muy bajas concentraciones y con gran ¿DELOLGDG/DFDUDFWHUL]DFLyQGHOGHQRPLQDGRIRVIRproteoma hace posible la obtención de instantáneas del estado de fosforilación de un determinado orgaQLVPR\VXFXDQWL¿FDFLyQHQGLIHUHQWHVHVWDGRV1R obstante, debido a las utilización de métodos de enULTXHFLPLHQWR\DORVEDUULGRVHVSHFt¿FRVXWLOL]DGRV en el análisis por espectrometría de masas, el análisis de los datos generados aumenta sensiblemente en complejidad respecto a otros análisis proteómicos clásicos. Es por tanto necesario el establecimiento de XQÀXMRGHWUDEDMRHVSHFt¿FRSDUDIRVIRSURWHyPLFD con objeto de responder a las diversas necesidades que las técnicas involucradas requieren. 1. Peculiaridades de los datos obtenidos en ODLGHQWL¿FDFLyQGHIRVIRSpSWLGRV En el analisis de fosfopéptidos mediante técnicas de shotgun proteomics deben tenerse en cuenta las siguientes consideraciones: /DHYDOXDFLyQGHODFRQ¿DQ]DHQODLGHQWL¿FDción de fosfoproteínas en base al número de SpSWLGRV LGHQWL¿FDGRV QR VLHPSUH HV SRVLEOH dado que en las etapas de enriquecimiento gran parte de los péptidos no fosforilados se eliminan. La información analítica reportada debe por tanto tener en cuenta todas las proteínas a las que apuntan estos péptidos únicos, tanto a efectos cualitativos como cuantitativos. (O Q~PHUR GH PRGL¿FDFLRQHV D WHQHU HQ FXHQWD GXUDQWH OD LGHQWL¿FDFLyQ GH ORV HVSHFWURV GH IUDJPHQWDFLyQ DO PHQRV PRGL¿FDFLRQHV YDriables para S/T/Y en MS2, y dos más para S/T en MS3) y las características espectrales de los fosfopéptidos (pérdida preponderante del grupo fosfato) facilitan la aparición de falsos positivos. La utilización de bases de datos señuelo nos permite obtener una estimación de la proporcion de falsos positivos en el conjunto de fosfopéptidos validados (FDR o False Discovery Rate) [4, 5]. 8Q HOHPHQWR FODYH HQ OD DVLJQDFLyQ GH SXQWRVGHIRVIRULODFLyQHVODFRUUHFWDLGHQWL¿FDFLyQ GHODPLQRiFLGRPRGL¿FDGRFXDQGRH[LVWDPiV de una alternativa posible. En estos casos, los buscadores en base de datos como SEQUEST, 80 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 3KHQ\[ X 2066$ VXHOHQ WHQHU GL¿FXOWDGHV para distinguir entre las distintos posiciones de fosforilación y pueden dar lugar a asignaciones incorrectas. Por este motivo son precisos análiVLVDGLFLRQDOHVHVSHFt¿FRVFRQREMHWRGHYDOLGDU estas asignaciones o corregirlas. Entre los métodos descritos para estos análisis [6,7], uno de los más populares es la puntuación Ascore. FLyQ\FXDQWL¿FDFLyQGHIRVIRSpSWLGRVDVtFRPRHO almacenamiento de la información obtenida en cada paso en un único formato de almacenamiento llamado ³SKRV¿OH´. Dicho formato de almacenamiento permite una fácil conversión a formatos usables por el investigador (ie. Excel) o la exportación de la información a una base de datos como Lymphos [10]. Referencias 2. Formatos para el almacenamiento de información [1] Nesvizhskii A. I. and Aebersold, R.. Interpretation of Shotgun Proteomic Data. The Protein Inference Problem. Mol. Cell Proteomics 2005; 4:1419-1440. >@ :LONLQV05$SSHO5'9DQ(\N-(HW al., Guidelines for the next 10 years of proteomics. Proteomics 2006; 6: 1, 4-8. [3] Reiter L, Claassen M, Schrimpf , S.P., et al. ProWHLQLGHQWL¿FDWLRQIDOVHGLVFRYHU\UDWHVIRUYHU\ large proteomics datasets generated by tandem mass spectrometry. Mol. Cell Proteomics 2009. [4] Elias, J.E. and Gygi, S.P. Target-decoy search VWUDWHJ\IRULQFUHDVHGFRQ¿GHQFHLQODUJHVFDOH SURWHLQ LGHQWL¿FDWLRQV E\ PDVV VSHFWURPHWU\ Nat. Methods 2007; 4: 207-214. [5] Xiuxia Du.et al. Linear Discriminant AnalysisBased Estimation of the False Discovery Rate IRU3KRVSKRSHSWLGH,GHQWL¿FDWLRQV-3URWHRPH Res. 2008 ; 7 : 2195-2203. [6] Beausoleil, S. A., Villen, J., Gerber, S. A., et al. A probability-based approach for high-throughput protein phosphorylation analysis and site localization. Nat. Biotechnol. 2006; 24: 1285-1292. [7] Ruttenberg, B.E., Pisitkun, T., Knepper, M.A. and Hoffert, J.D. PhosphoScore: An OpenSource Phosphorylation Site Assignment Tool for MSn Data. J. Proteome Res. 2008; 7: 30543059. [8] Orchard S, Jones P, Taylor C, et al. Proteomic data exchange and storage: the need for common standards and public repositories. Methods Mol Biol. 2007; 367: 261-70. [9] Carrascal, M., Ovelleiro, D., Casas, V. et al. Phosphorylation Analysis of Primary Human T Lymphocytes Using Sequential IMAC and Titanium Oxide Enrichment. J. Proteome Res. 2008; 7: 5167–5176. [10] Ovelleiro D, Carrascal M, Casas V and Abian J. LymPHOS: design of a phosphosite database of primary human T cells. Proteomics 2009; 9: 3741-51. Figura 1. ,QIRUPDFLyQ JHQHUDGD HQ HO ÀXMR GH WUDEDMR \ contenida en el archivo de almacenamiento phosFile. El formato estándard más utilizado para almacenar la información analítica en proteómica es el XML. Uno de los estándares más recientes de archivo XML para el almacenamiento de datos analíticos es el mzIdentML [8]. Sin embargo, la complejidad y diversidad de la información recopilada en un experimento proteómico hacen que estos estándares sean KR\ SRU KR\ LQVX¿FLHQWHV SRU OR TXH HV QHFHVDULR evaluar otras alternativas de almacenamiento. Por otra parte, es también importante establecer un procedimiento para la incorporación de la información experimental utilizando diferentes MIAPE asociadas al experimento, teniendo especial importancia aquí el modelo MIASPPE [9] (“Minimum Information About Sample Preparation for a Phosphoproteomics Experiment”). En la Figura 1 se presenta el esquema JHQHUDOGHOÀXMRGHWUDEDMRXWLOL]DGRHQODLGHQWL¿FD- 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 81 $SUR[LPDFLRQHVPHWRGROyJLFDVSDUDHOHVWXGLRGHOHVWDGRUHGR[WLROGLVXOIXUR de proteínas en muestras vegetales Sira Echevarría-Zomeño1, Per Hägglund2 P, Birte Svensson2, Ana María Maldonado Alconada1, Jesús V. Jorrín Novo1 1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Grupo de Bioquímica y Proteómica Vegetal y Agrícola, Universidad de Córdoba, España. 2 Department of Systems Biology, Technical University of Denmark, Lyngby, Denmark Resumen Para el estudio del estado redox (tiol-disulfuro) de las proteínas, se utilizan técnicas de bioquímica clásica y de proteómica, incluidas aquellas de segunda generación (DIGE, ICAT), basadas en el marcaje HVSHFt¿FRGHUHVWRVGHFLVWHtQD'LFKDVWpFQLFDVGH proteómica se han empezado a usar en el estudio de los mecanismos que median procesos de desarrollo y respuesta a estreses en humanos, mamíferos, organismos modelo tales como Escherichia coli, y en menor medida en plantas. Sin embargo, su potencial dista mucho de ser totalmente explotado. El objetivo de este trabajo es el de optimizar el uso de las técnicas DIGE e ICAT para el estudio del proteoma redox, utilizando Arabidopsis thaliana como sistema modelo. La aplicación de estas técnicas ha puesto de mani¿HVWR VX XWLOLGDG SDUD OD FDUDFWHUL]DFLyQ GHO HVWDGR redox de las proteínas, pero también a demostrado la importancia de incluir en los experimentos controles adecuados para cada paso del protocolo. Se conoce como proteoma redox al conjunto de proteínas susceptibles de cambiar su estado de oxidorreducción en respuesta a algún estímulo. Estas modi¿FDFLRQHVTXHDIHFWDQSULQFLSDOPHQWHDORVUHVLGXRV de cisteína, pueden ser irreversibles (como la oxidación a ácido cisteico), lo que conlleva la pérdida de actividad biológica, o reversibles, en los que el grupo tiol se puede oxidar a puente disulfuro (cisteína-cisWHtQD'LFKDVPRGL¿FDFLRQHVUHYHUVLEOHVFRQVWLWX\HQ mecanismos de regulación de la actividad, vida media y patrón de interacción de la proteína [1-4]. En un experimento típico dirigido a la caracterización del proteoma redox, se utilizan técnicas basadas HQJHO\FURPDWRJUi¿FDVHLQFOX\HQHWDSDVGHLH[tracción proteica, ii) marcaje de tioles libres mediante agentes tiol-reactivos (iodoacetamida, maleimida, glutatión) unidos a algún tipo de elemento marcador, FRPRELRWLQDRVXVFRQMXJDGRVDQWtJHQRVRÀXRURFURPRVPRQREURPRELPDQHÀXRUHVFHtQDLLLSXUL¿FDFLyQRVHSDUDFLyQSRUFURPDWRJUDItDRHOHFWURIRUHVLV \ LY FXDQWL¿FDFLyQ H LGHQWL¿FDFLyQ PHGLDQWH análisis de imagen y espectrometría de masas. Las técnicas de proteómica cuantitativa de segunGDJHQHUDFLyQTXHLPSOLFDQHOPDUFDMHHVSHFt¿FRGH restos de cisteína, tales como DIGE o ICAT, se han empezado a utilizar en estudios del estado redox de proteínas en diversos sistemas como mamíferos [5], bacterias [6] y en menor medida, en plantas [7]. Para caracterizar el estado redox de las proteínas en Arabidopsis thaliana, en nuestro grupo se están optimizando las técnicas redox-DIGE y oxICAT. Estas técnicas se basan en el marcaje diferencial de los residuos oxidados y los reducidos. En nuestro caso, este marcaje se llevó a cabo en la misma muestra, en lugar de en GRVPXHVWUDVGLIHUHQWHV(OÀXMRGHWUDEDMRVHJXLGRVH detalla en la Figura 1. La preparación de la muestra se llevó a cabo a pH ácido, lo que evita intercambios tiol-disulfuro y oxidaciones espontáneas, que se dan a pHs 7-9 [8]. Para poder utilizar los dos agentes en el mismo tubo de ensayo, fue necesario eliminar el exceso de reactivo en cada paso del proceso. En el experimento, se incluyeron controles en los que las muestras se redujeron completamente desde el principio, de manera que sólo uno de los reactivos marcadores debería detectarse en los resultados. La aplicación de ambas técnica puso de maQL¿HVWRODXWLOLGDGGHODVPLVPDVSDUDGLVFULPLQDU entre residuos oxidados y reducidos. Sin embargo, a la vista de los resultados de los controles con PXHVWUDV UHGXFLGDV QR PRVWUDGRV OD H¿FLHQFLD del proceso de marcaje es menor de la esperada, demostrando que la inclusión de este tipo de controles es de gran importancia para evaluar la validez del experimento y corregir el error generado por el marcaje residual. 82 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figura 1. Esquema de las técnicas redox-ICAT (A) y redox-DIGE (B). Tras la extracción proteica, los marcajes se realizaron con ambos agentes en el mismo tubo de ensayo. Referencias [1] Forman HJ y Torres M. Redox signaling in macrophages. Mol Aspects Med 2001;22:189216. [2] Klatt P y Lamas S. Regulation of protein function by S-glutathiolation in response to oxidative and nitrosative stress. Eur J Biochem 2000;267:4928-44. [3] [4] Bonetto V y Ghezzi P, 7KLROGLVXO¿GHR[LGRUHGXFtion of protein cysteines: old methods revisited for proteomics en Redox Proteomics: from protein PRGL¿FDWLRQVWRFHOOXODUG\VIXQFWLRQDQGGLVHDVHV (editores: Dalle-Donne Isabella, Scaloni Andrea \%XWWHU¿HOG'$OODQ-2+1:,/(<6216 LTD.(2ª), Hoboken, New Jersey 2006, p. 976. Bardwell JC. Building bridges: disulphide bond formation in the cell. Mol Microbiol 1994;14:199-205. [5] Hurd TR, Prime TA, Harbour ME, Lilley KS y Murphy MP. Detection of reactive oxygen species-sensitive thiol proteins by redox difference gel electrophoresis: implications for mitochondrial redox signaling. J Biol Chem 2007;282:22040-51. [6] Leichert LI, Gehrke F, Gudiseva HV, Blackwell 7 ,OEHUW 0 :DONHU$. HW DO 4XDQWLI\LQJ changes in the thiol redox proteome upon oxidative stress in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105:8197-202. [7] Hagglund P, Bunkenborg J, Maeda K y Svensson %,GHQWL¿FDWLRQRIWKLRUHGR[LQGLVXO¿GHWDUJHWV using a quantitative proteomics approach based RQLVRWRSHFRGHGDI¿QLW\WDJV-3URWHRPH5HV 2008;7:5270-6. >@ &UHLJKWRQ7('LVXO¿GHERQGIRUPDWLRQLQSURteins. Methods Enzymol 1984;107:305-29. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 83 Deciphering the S-Nitrosylome of Arabidopsis thaliana during the defense response Ana M. Maldonado-Alconada1, Sira Echevarría-Zomeño1, Christian Lindermayr2, Jörg Durner2, Jesús V. Jorrín-Novo1 1 Agricultural and Plant Biochemistry and Proteomics Research Group, Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, University of Cordoba, Spain. 2Institute of Biochemical Plant Pathology, Helmholtz Zentrum München - German Research Center for Environmental Health, D-85764 Neuherberg, Germany The biological effects of nitric oxide (NO) are mainly mediated through S-nitrosylation of cysteine WKLROV:HKDYHXVHGWKHELRWLQVZLWFKPHWKRGFRPbined with mass spectrometry analysis to identify targets of S-nitrosylation in Arabidopsis thaliana cell suspension cultures and leaves challenged with the pathogenic bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato. The NO targets belong to different functional categories, and include proteins previously LGHQWL¿HGLQSODQWVDQGPDPPDOVDVZHOODVQRYHO targets. Our data support the idea that NO orchestrates the whole plant physiology through covalent PRGL¿FDWLRQRISURWHLQV One of the earliest events occurring in plants following pathogen infection is a strong oxidative burst and increases in the NO level being the correct intracellular balance between these molecules crucial for the establishment of resistance [1, 2]. The reversible covalent binding of NO to a speci¿F F\VWHLQH UHVLGXH 6QLWURV\ODWLRQ LV WKH PDLQ mechanism by which NO exerts its function and VHYHUDO FDQGLGDWHV KDYH EHHQ LGHQWL¿HG LQ SODQWV [3, 4]. In order to uncover the role of this type of PRGL¿FDWLRQGXULQJEDVDOUHVLVWDQFHWKH¿UVWOLQHRI active defense in plants) and R-mediated resistance DVWURQJIRUPRIUDFHVSHFL¿FUHVLVWDQFHZHDLP to identify S-nitrosylated proteins in Arabidopsis plants and cell extracts challenged with virulent Pst and avirulent Pst avrRpt2. Protein extracts were subjected to the biotin switch method converting S-nitrosylated Cys to biotinylated Cys [3]. Extracts (10 mg for protein SXUL¿FDWLRQDQGµg for detection of biotinylated SURWHLQVZHUH¿UVWLQFXEDWHGZLWKP0PHWK\O methanethionsulfonate (MMTS) and 2.5% SDS for blocking free cys residues. Treatment with GSNO (500 µM) was used to generate S-nitrosothiols in vitro and the treatment with the reducing agent DTT (20mM) was performed as a control that the labelling observed corresponds to originally S-nitrosylated proteins. Biotinylated proteins were visualized by immunoblotting using anti-biotin antibody and ZHUHSXUL¿HGE\DI¿QLW\FKURPDWRJUDSK\RQDQHXtravidin matrix, and bound proteins were eluated with 100 mM β-mercaptoethanol. For protein idenWL¿FDWLRQWKHSXUL¿HGSURWHLQVZHUHWU\SVLQGLJHVWHG and subjected to LC/MS/MS analysis using a Surveyor/MicroAS HPLC system in tandem with an /74 PDVV VSHFWURPHWHU 7KHUPR)LVKHU 6FLHQWL¿F USA). The MS/MS spectra obtained were analysed using the Bioworks 3.2 software (ThermoFisher 6FLHQWL¿F86$DQGWKH6(48(67VHDUFKHQJLQH (Thermo, MA), against a non-redundant NCBI and MSDB databases and their reverse, allowing for vaULDEOHF\VWHLQHPRGL¿FDWLRQE\β-mercaptoethanol and organism restriction to Arabidopsis. The FDR value was adjusted to 1% taking as a reference the Xcorr values obtained from the search using the reverse database (DCn >0.1). The results obtained indicate more intense labeling following P. syringae infection, especially those from PstavrRpt2- treated samples. In addition more 6QLWURV\ODWHG SURWHLQV ZHUH SXUL¿HG IURP OHDYHV or cells challenged with P.syringae compared to control and non-treated samples. This indicates that leaves and cells undergoing a defense reaction contain higher levels of S-nitrosothiols, which is consistent with the increased NO production during the incompatible interaction [2]. 7KH12WDUJHWSURWHLQVLGHQWL¿HGFRYHUEDsically any process of cellular physiology and include cytoskeleton proteins (11%), enzymes involved 84 in carbon and nitrogen mobilization (41%), pathogen- and stress-related proteins (10%), enzymes of the antioxidant defense system (6%) and signaling and regulating proteins (14%). The majority of the NO targets were not exclusive to a given treatment, which is in agreement with the dynamic nature of S-nitrosylation, and suggests that the right balance between both redox states are needed for the correct function of the protein. Comparison of S-nitrosylation targets in animal V\VWHPV > @ ZLWK WKH SURWHLQV LGHQWL¿HG LQ WKLV work and in previous studies in plants [4] reveals common targets between animals and plants. About RIWKHSURWHLQVLGHQWL¿HGKHUHUHSUHVHQWQRYHO potential targets for S-nitrosylation, while others KDYHEHHQLGHQWL¿HGLQSUHYLRXVVWXGLHVLQDQLPDOV and plant systems. These results provide clues on the possible NO targets during basal and R-mediated resistance, and VXJJHVWWKDW12VSHFL¿FPRGL¿FDWLRQRIWKHVHHQzymes allows the coordinated modulation of redox signalling and orchestrates the outcome of compaWLEOH DQG LQFRPSDWLEOH LQWHUDFWLRQV :KLOH ZH DUH planning to identify the cys residues involved and SHUIRUP PXWDWLRQDO VWXGLHV ZLWK SXUL¿HG SURWHLQV and transgenic of selected candidates, we have conducted infection experiments with Arabidopsis loss-of-function insertion mutants for redox- and defense-related genes. The differential behaviour of these mutants from wild-type control plants in both, compatible and incompatible interactions, and the monitoring of the progress of disease symptoms provide evidence that these mutants are compromised in the activation of basal and R-mediated defense responses. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 $FNQRZOHGJHPHQWV 7KLV ZRUN ZDV FDUULHG RXW ZLWK ¿QDQFLDO VXpport from the Spanish “Ministerio de Educación \&LHQFLD´3URMHFW%,2:HWKDQN,Qmaculada Redondo for her technical assistance.The MS analysis was conducted at the Proteomics Unit (SCAI) at Cordoba University. SEZ is supported by a by a grant from the the Spanish “Ministerio de Educación y Ciencia”. References [1] Durner J and Klessig DF. Nitric oxide as a signal in plants. Curr Opin Plant Biol. 1999; 2: 36974. [2] Delledonne M, Zeier J, Marocco A and Lamb C. Signal interactions between nitric oxide and reactive oxygen intermediates in the plant hypersensitive disease resistance response. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98: 13454-9. [3] Lindermayr C, Saalbach G and Durner J. ProWHRPLFLGHQWL¿FDWLRQRIVQLWURV\ODWHGSURWHLQV in Arabidopsis. Plant Physiol 2005; 137: 921930. [4] Lindermayr C and Durner J. S-Nitrosylation in plants: pattern and function. J Proteomics. 2009; 73:1-9. [5] Hao G, Derakhshan B, Shi L, Campagne F and Gross SS. SNOSID, a proteomic method for LGHQWL¿FDWLRQRIF\VWHLQH6QLWURV\ODWLRQVLWHVLQ complex protein mixtures. ProcNatl Acad Sci U S A. 2006; 103: 1012-1017. [6] Martínez-Ruiz A and Lamas S. Detection and proteomic identification of S-nitrosylated proteins in endothelial cells. Arch. Biochem. Biophys. 2004; 423: 192–199. 85 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Caracterización de S-glutationilación de proteínas a nivel de proteoma. 'L¿FXOWDGHV Esperanza Morato López1, Sira Echevarría Zomeño2, Anabel Marina Ramírez1 1 Servicio de Proteómica. C.B.M. “Severo Ochoa”. CSIC-UAM 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Córdoba La S-glutationilación no solo es una respuesta celular al estrés oxidativo, también es un mecanismo para la regulación postraduccional dinámica de proteínas reguladoras, estructurales y metabólicas. Estudios recientes han demostrado su implicación en la regulación de la señalización y rutas metabólicas de sistemas celulares [1, 2]. Por todo ello se están desarrollando métodos analíticos y proteómicos que permitan la caracterización de estas modi¿FDFLRQHVGRQGHODSULQFLSDOOLPLWDFLyQDQLYHOGH espectrometría de masas que hemos encontrado en nuestro laboratorio es la “calidad” de los espectros de fragmentación MS/MS. Recibimos en nuestro laboratorio unas muestras para la caracterización de glutationilaciones. (OREMHWLYRGHOWUDEDMRHUDODLGHQWL¿FDFLyQGHVLWLRV de glutationilación de proteínas en el proteoma de Arabidopsis thaliana tras la infección con la cepa no virulenta de Pseudomonas syringae. Disponíamos del proteoma no infectado (NI), del proteoma incubado 4 h con un placebo (MgCl) y del proteoma infectado 4 h con la cepa de P. syringae. De cada proteoma disponíamos de tres condiciones: sin agente reductor, tratada con glutatión (GSH) y tratada con glutatión disulfuro (GSSH). Comenzamos el trabajo con las tres condiciones de la muestra NI, para lo cual confeccionamos tres geles SDS-PAGE, UHVSHFWLYDPHQWH FRQ HO ¿Q GH GLJHULU OD PXHVWUD en gel concentrador y, de esta manera, limpiar el proteoma [3] (el tampón de muestra no contenía beta-mercaptoetanol ni DTT). Los péptidos obtenidos tras las digestiones se analizaron mediante LC-MS empleando un espectrómetro de masas LTQ 7KHUPR)LVKHU6FLHQWL¿F3DUDODLGHQWL¿FDFLyQGH péptidos se empleó el software SEQUEST (Thermo )LVKHU 6FLHQWL¿F LQFOX\HQGR OD JOXWDWLRQLODFLyQ FRPRPRGL¿FDFLyQYDULDEOH Al analizar los resultados observamos un alto Q~PHURGHJOXWDWLRQLODFLRQHVLGHQWL¿FDGDVWDQWRHQ la muestra NI como en la NI+GSH. El número de SpSWLGRV LGHQWL¿FDGRV FRQ XQ ;FRUU ! IXH PX\ similar (aproximadamente 200), así como fueron similares los valores de este parámetro entre los péptidos de ambas muestras. Analizamos de modo manual los espectros MS/MS con mejores puntuaFLRQHVVLQFRQ¿UPDUQLQJXQDJOXWDWLRQLODFLyQHQOD muestra NI, pero demostrando S-glutationilación para la muestra NI+GSH. Las conclusiones preliminares de estos resultados son que este abordaje no SHUPLWHOD³DXWRPDWL]DFLyQ´HQODLGHQWL¿FDFLyQGH glutationilaciones en proteomas ya que no es posible establecer un punto de corte, puesto que espectros con el mismo valor de Xcorr pueden ser asignados FRPR LGHQWL¿FDFLRQHV FRUUHFWDV R LQFRUUHFWDV (O estudio en profundidad de los espectros MS/MS da una explicación a este hecho y es la “idiosincrasia” GH ORV PLVPRV SDUD HVWH WLSR GH PRGL¿FDFLyQ /D gran mayoría son especies M+3H+, probablemente debido a que en el glutatión el enlace entre el aspártico y la cisteína es tal que queda expuesto un nuevo extremo -NH2 susceptible de protonación. Esto acompleja el patrón de fragmentación a la par que, en péptidos grandes, se pierde la zona alta del espectro (m/z > 2000). Son espectros con un alto nivel de “background” cuando los valores de Xcorr no son > 4, y se asemejan mucho a espectros de “contaminantes”. Este hecho hace que un espectro con mal aspecto que no se corresponda con el péptido candidato tenga la misma puntuación, en ocasiones, que el que si se corresponde. Dentro del “background” podemos encontrar fragmentos procedentes del glutatión [4] como pérdida del glutámico, de todo el glutatión o de parte del mismo, pero no todos los fragmentos del espectro se pueden asignar a este patrón extra de fragmentación. En consecuencia, las puntuaciones obtenidas empleando SEQUEST son, mayoritariamente, bajos, aún en las asignaciones correctas, lo que hace muy difícil establecer un criterio de calidad que es LPSUHVFLQGLEOH SDUD HO HVWXGLR GH PRGL¿FDFLRQHV 86 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 a gran escala. El examen manual de los espectros sería impensable, solo factible cuando estudiamos PRGL¿FDFLRQHVSDUDXQDSURWHtQD~QLFD Quizás, un mayor conocimiento del mecanismo de fragmentación de estos péptidos pueda dar lugar D XQD PHMRUD HQ OD LGHQWL¿FDFLyQ FRUUHFWD GH ORV mismos y, de esta forma, hacer posible el estudio de HVWDPRGL¿FDFLyQDQLYHOGHSURWHRPD regulatory device from bacteria to humans”. Trends in Biochemical Sciences 2008; 34, 2:85-96. [3] Bonzon-Kulichenko E, Pérez-Hernández D, Núñez E, Martínez-Acedo P, Navarro P, Trevisan-Herraz M, Ramos MC, Sierra S, MartínezMartínez S, Ruiz-Meana M, Miró-Casas E, García-Dorado D, Redondo JM, Burgos JS, Vázquez J. “A robust method for quantitative high-throughput analysis of proteomes by 18O labeling”. Mol Cell Proteomics, 2009 (en revisión). >@ %RUJHV &5 *HGGHV 7- :DWVRQ -7 .XKQ D.M. “Dopamine biosynthesis is regulated by S-glutathionylation. Potential mechanism of tyrosine hydroxylase inhibition under oxidative stress”. J Biol Chem 2002; 277:48295-48302. Referencias [1] Dalle-Donne I, Rossi R, Giustarini D, Colombo R, Milzani A. “S-glutathionylation in protein UHGR[ UHJXODWLRQ´ )UHH 5DGLFDO %LRORJ\ Medicine 2007; 43:883-898. [2] Dalle-Donne I, Rossi R, Colombo G, Giustarini D, Milzani A. “Protein S-glutathionylation: a La inhibición de la síntesis de óxido nítrico durante la colestasis inducida experimentalmente reduce la lesión hepatocelular al facilitar la homeostasis de nitrosotioles Laura M. López-Sánchez1, Fernando J. Corrales2, Montserrat Barcos3, Isabel Espejo3, Juan R. Muñoz-Castañeda1, Antonio Rodríguez-Ariza1 1 Hospital Universitario Reina Sofía. Unidad de Investigación, IMIBIC, Córdoba, 2Universidad de Navarra, Hepatology and Gene Therapy Unit, Pamplona, 3Hospital Universitario Reina Sofía. Servicio de Análisis Clínicos, Córdoba Introducción Las intervenciones que faciliten el metabolismo del óxido nítrico (NO) en etapas colestásicas tempranas pueden ayudar a mantener el estado redox de las proteínas hepáticas. Además, escasos estudios han explorado la participación de la S-nitrosilación de proteínas y el metabolismo de nitrosotioles (SNO) en la lesión hepatocelular por colestasis. Metodología 6HGLYLGLHURQUDWDVPDFKR:LVWDUJHQ 4 grupos (n=10): operación simulada (OS), ligadura del conducto biliar (BDL), y ratas BDL tratadas con el inhibidor de síntesis de NO S-metilisotiourea (SMT, 25 mg/Kg) o con ácido tauroursodeoxicólico (TUDCA, 50 mg/Kg). La función hepática y NO plasmático se analizaron mediante ensayos bioquímicos. La proliferación ductular se determinó en cortes teñidos con hematoxilina-eosina y se con¿UPy FRQ LQPXQRWLQFLyQ HVSHFt¿FD FLWRTXHUDWLQD GHFRODQJLRFLWRVPDGXURV/D¿EURVLVKHSiWLFD se determinó mediante tinción con tricrómico de Masson. Se analizó la expresión de la bomba exportadora de productos conjugados (Mrp2), afectada en diversos modelos experimentales de colestasis, mediante western blot, y la de iNOS y la enziPDQLWURVRJOXWDWLyQUHGXFWDVD*6125FRGL¿FDGD por el gen ADH5 en humanos) por RT-PCR. Las SURWHtQDV6QLWURVLODGDVVHGHWHFWDURQ\SXUL¿FDURQ con el método “biotin-switch”, una aproximación 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 metodológica que permite el marcado selectivo de las nitrosoproteínas con biotina, en el que los tioles libres se bloquean con metil metanotiosulfonato, a continuación los SNO son reducidos selectivamente FRQ DVFRUEDWR \ ¿QDOPHQWH ORV WLROHV QXHYDPHQWH formados reaccionan con HPDP-biotina. Las proteínas biotiniladas se detectaron mediante un antiFXHUSRDQWLELRWLQDRSXUL¿FDURQXWLOL]DQGRHVWUHSWDYLGLQD\VHLGHQWL¿FDURQSRUDQiOLVLVSURWHyPLFR con HPLC acoplado a ESI-MS/MS. Resultados Figura 1. Marcadores séricos de función hepática en ratas BDL. 87 Después de 7 días, el inhibidor de iNOS fue mucho mas efectivo que TUDCA en reducir la lesión hepatocelular, con una disminución de enzimas hepáticas y de bilirrubina circulantes (Figura 1) y XQJUDGRVLJQL¿FDWLYDPHQWHPHQRUGHSUROLIHUDFLyQ GXFWXODU\¿EURVLVSHULSRUWDO>@$PERVWUDWDPLHQtos recuperaron los niveles basales del transportador canalicular Mrp2 cuya expresión se inhibe durante la colestasis (Figura 2), pero sólo el tratamiento FRQ607GLVPLQX\yVLJQL¿FDWLYDPHQWHORVHOHYDGRV niveles plasmáticos de NO y de proteínas hepáticas S-nitrosiladas en las ratas BDL (Figuras 3 y 4). La expresión de GSNOR hepática, que regula la homeostasis de SNO y los niveles de proteínas S-nitrosiladas, mostró un acusado descenso en ratas BDL, que se recuperó tras el tratamiento con SMT, pero no FRQ78'&$)LJXUD6HLGHQWL¿FDURQSURWHtnas hepáticas que se encontraban S-nitrosiladas en ratas BDL (Tabla 1), incluyendo enzimas mitocondriales que participan en la síntesis de ATP y el metabolismo de ácidos grasos, dos procesos que se ven alterados en colestasis. Además, dos de las proteínas LGHQWL¿FDGDVIXHURQOD6DGHQRVLOPHWLRQLQDVLQWHWDsa (también llamada metionina adenosiltransferasa, MAT), y la betaína-homocisteina S-metiltransferasa (BHMT), dos importantes enzimas implicadas en el ciclo de la metionina cuya alteración es frecuentemente observada en procesos colestásicos. )LJXUDProducción de NO y expresión del gen Nos2 en ratas BDL. Figura 2. Expresión de la proteína Mrp2 en ratas BDL. Figura 4. Detección de proteínas S-nitrosiladas en ratas BDL. *Lisado hepático incubado in vitro con GSNO. 88 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Tabla 1. 3URWHtQDV6QLWURVLODGDVLGHQWL¿FDGDVPHGLDQWH/&0606HQOLVDGRVGHKtJDGRVGHUDWDV%'/ Nombre de la proteína Proteínas del citoesqueleto ĮDFWLQD Número de Número acceso NCBI de péptidos Cobertura de VHFXHQFLD Localización P62738 1 10 Cit P04691 1 4 Cit S-adenosil metionina sintetasa tipo 1 P13444 1 6 Cit Aldehido deshidrogenasa, microsomal P30839 2 5 RE $73VLQWDVDVXEXQLGDGĮ P15999 1 2 Mit Betaina-homocisteina S-metil-transferasa 2 Q68FT5 1 4 Cit Carbamoil-fosfato sintasa 1 P07756 13 20 Mit Carboxilesterasa 3 precursor P16303 3 7 RE Dihidroxiacetona quinasa Q4KLZ6 2 6 RE 10-formiltetrahidrofolato deshidrogenasa P28037 2 3 Cit Fructosa-bifosfato aldolasa B P00884 3 11 Cit Glutamato deshidrogenasa 1 P10860 1 5 Mit Hidroximetilglutaril-CoA sintasa P22791 3 17 Mit 3-cetoacil-CoA tiolasa P13437 1 8 Mit L-lactato deshidrogenasa, cadena A P04642 1 6 Cit Acido graso CoA ligasa, cadena larga 1 P18163 2 9 Mit Malato deshidrogenasa P04636 1 21 Mit Piruvato carboxilasa mitocondrial precursor P52873 2 6 Mit P34058 1 6 Cit PDI P04785 2 9 RE Riboforina 1 P07153 2 7 RE Glutatión S-transferasa Mu 1 P04905 2 28 Cit Glutatión S-transferasa Mu 2 P08010 3 22 Cit P62632 1 4 Cit P02770 3 12 Sec 7XEXOLQDFDGHQDȕ$ Enzimas metabólicas Chaperonas moleculares +63ȕ (Q]LPDVGHGHWR[L¿FDFLyQ Proteínas de señalización )DFWRUGHHORQJDFLyQĮ Otras Albúmina de suero, precursor 89 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figura 5. Actividad GSNOR hepática y expresión del gen Adh5 en ratas BDL. Conclusiones Referencias 1XHVWURV UHVXOWDGRV DSR\DQ HO EHQH¿FLR WHUDpéutico de inhibir la síntesis de NO, en un contexto colestásico, al facilitar la homeostasis de nitrosotioles. y proporcionan dianas de S-nitrosilación que posibilitarán el desarrollo de nuevas terapias en dolencias colestásicas. [1] Agradecimientos Financiado por FIS PI 07/0159 López-Sánchez LM, Corrales FJ, Barcos M, Espejo I, Muñoz-Castañeda JR, Rodríguez-Ariza A. Inhibition of nitric oxide synthesis during induced cholestasis ameliorates hepatocellular injury by facilitating S-nitrosothiol homeostasis. Lab Invest. 2009 Oct 5. DOI: 10.1038/ labinvest.2009.104. 90 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 'HVDUUROORGHPHWRGRORJtDVSDUDODGHWHFFLyQGHPRGL¿FDFLRQHVSRVWUDGXFFLRQDOHV HQFLVWHtQDV6QLWURVLODFLyQ\R[LGDFLyQPHGLDQWHDSUR[LPDFLRQHVSURWHyPLFDV EDVDGDVHQPDUFDMHÀXRUHVFHQWH\HOHFWURIRUHVLVELGLPHQVLRQDO Daniel Tello, Rubén Fernández-Rodríguez, Antonio Martínez-Ruíz Hospital Universitario de La Princesa, Madrid, España Las especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS) pueden jugar un papel fundamental en mecanismos de señalización celular en diversos SURFHVRV ¿VLRSDWROyJLFRV (QWUH ORV PHFDQLVPRV moleculares por los que actúan, van cobrando imSRUWDQFLD YDULRV WLSRV GH PRGL¿FDFLyQ UHYHUVLEOH en cisteínas entre ellas la nitrosilación, tiolación y formación de ácido sulfénico, además de la formaFLyQGHSXHQWHVGLVXOIXURHVSHFt¿FRV'HELGRDHOOR en los últimos años se ha puesto gran interés en la aplicación de diferentes métodos proteómicos para ODGHWHFFLyQHLGHQWL¿FDFLyQGHHVWDVPRGL¿FDFLRQHV postraduccionales “nitroxidativas”. El método de “biotin switch” abrió paso a la LGHQWL¿FDFLyQ SURWHyPLFD GH SURWHtQDV 6QLWURVLODGDV\VHKDPRGL¿FDGRGHVSXpVSDUDGHWHFWDURWUDV PRGL¿FDFLRQHVHQFLVWHtQDV'LFKRPpWRGRVHEDVD HQ OD VXVWLWXFLyQ GH OD PRGL¿FDFLyQ QLWURVRWLRO R cisteína oxidada) por biotina, previa reducción esSHFt¿FD GHO WLRO R[LGDGR DVFRUEDWR HQ HO FDVR GH nitrosotioles y DTT en el caso de cisteínas oxidadas). Una evolución del clásico “biotin switch” es el GHQRPLQDGR³ÀXRUHVFHQFHVZLWFK´HQHOFXDOVHKD VXVWLWXLGRODELRWLQDSRUXQÀXRUyIRURFRQFDSDFLGDG para reaccionar con tioles libres. +HPRVGHVDUUROODGRXQPpWRGRGH³ÀXRUHVFHQFH VZLWFK´FRQPDOHLPLGDÀXRUHVFHtQDFRPRPDUFDdor, y empleando electroforesis bidimensionales, SDUDODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDV6QLWURVLODGDVOR TXHQRVKDSHUPLWLGRLGHQWL¿FDUSURWHtQDVVHQVLEOHV a nitrosocisteína (CysSNO) en células endoteliales y denotar la importancia de la ruta de la tiorredoxina reductasa en la eliminación de nitrosotioles en maFUyIDJRVDFWLYDGRV>@(QHVWHFDVRODLGHQWL¿FDFLyQ se ha conseguido correlacionando el aumento en la VHxDO FRUUHVSRQGLHQWH D OD ÀXRUHVFHtQD FRQ HO SDtrón de proteína total marcada con un reactivo que detecta proteína total en solución neutra (Lucy-565), de forma que pudiéramos obtener ambos patrones ÀXRUHVFHQWHVGHIRUPDVLPXOWiQHDHQHOPLVPRJHO Este tipo de metodología proteómica la estamos DSOLFDQGRDODGHWHFFLyQHLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVFRQFLVWHtQDVR[LGDGDVHQODUHVSXHVWD¿VLROyJLFD a hipoxia en diversos sistemas celulares. Se ha susWLWXLGRHOPDUFDGRUÀXRUHVFHQWHPDOHLPLGDÀXRUHVceína por Bodipy-FL, el cual presenta carga neta neutra, con lo que se elimina el desplazamiento en la migración de las proteínas en el isoelectroenfoque. Para observar diferencias pequeñas entre diferentes condiciones estamos aplicado una metodología baVDGDHQGRVÀXRUyIRURV/DVPXHVWUDVVHPDUFDQFRQ Bodipy-FL o Bodipy-TMR y se cargan en el mismo gel bidimensional. Sin embargo, el análisis detallado de los resultados en ambos esquemas, para relacionarlos con el patrón de proteína total, requiere de un cambio en los protocolos de análisis respecto a los paquetes de software preparados para los esquemas habitualmente utilizados. Referencias [1] Tello D, Tarín C, Ahicart P, Bretón-Romero R, /DPDV 6 0DUWtQH]5XL]$$ ³ÀXRUHVFHQFH switch” technique increases the sensitivity RI SURWHRPLF GHWHFWLRQ DQG LGHQWL¿FDWLRQ RI S-nitrosylated proteins. Proteomics 2009; in press. Published online with DOI 10.1002/ pmic.200900070. 91 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 $QDO\VLVRIUHYHUVLEOHDQGLUUHYHUVLEOHSURWHLQPRGL¿FDWLRQVXSRQR[LGDWLYHVWUHVV in Schizosaccharomyces pombe by proteomic approaches Sarela García-Santamarina, Susanna Boronat, Elena Hidalgo Departament de Ciències Experimentals i de la Salut. Universitat Pompeu Fabra Reactive oxygen species (ROS) (H2O2, OH·, O2-.) generated as a consequence of the oxygen metabolism in aerobic organisms, have important roles in cell signalling. However, if they reach concentrations beyond homeostatic levels they generate a situation of oxidative stress where damages to cellular components are produced. In the case of H2O2, even physiological levels may produce a chronic low level of stress, which progressively drives the cell into the aging process. In order to understand the consequences of an oxidative stress situation in the cell, it is important to unravel which are the primarily biological targets of ROS and which are the consequences of such reactivity. Here we report the study of different tySHVRIPRGL¿FDWLRQVWKDW526SURGXFHLQSURWHLQVLQ Schizzosacharomyces pombe, under exogenous oxidative stress, by adding H2O2 to the culture media, and also under endogenous oxidative stress, using mutant strains defective for ROS scavengers. By 1D electrophoresis, we observe that reverVLEOH GLVXO¿GH ERQG IRUPDWLRQ LV LQFUHDVHG XSRQ both stresses, and in the case of H2O2 treatment, the kinetics correlates with oxidative activation of the S. pombe H2O2VHQVRU3DS:HDOVRVKRZKRZ shifting the growth of the mutant strains from an anaerobic condition to an aerobic one results in differential irreversible carbonylation of proteins. :HDUHH[WHQGLQJWKHVHVWXGLHVWRWKHSURWHRPHOHYHO WRLGHQWLI\WKHWDUJHWSURWHLQVRIERWKVWUHVVHV:H KDYH HVWDEOLVKHG D PRGL¿FDWLRQ RI WKH ,&$7 SURWRFROWRTXDQWLI\WKHH[WHQWRIUHYHUVLEOHPRGL¿HG cysteines. In addition, we have established a 2D electrophoresis approach to identify targets of carERQ\O PRGL¿FDWLRQV SURGXFHG E\ R[LGDWLYH VWUHVV This would allow us to study the consequences of LUUHYHUVLEOHDQGUHYHUVLEOHSURWHLQPRGL¿FDWLRQVDQG their biological relevance after situations of intrinsic and extrinsic oxidative stresses. La lipoproteína lipasa de rata se nitra in vivo en respuesta a la administración de lipopolisacárido Albert Casanovas1, Montserrat Carrascal2, Joaquín Abián2, Miquel Llobera1, M. Dolores LópezTejero1 1 Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona, Barcelona, España. 2CSIC/UAB Proteomics Laboratory, IIBB-CSIC-IDIBAPS, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, España. La lipoproteína lipasa (LPL) juega un papel central en el metabolismo lipídico hidrolizando los triacilgliceroles (TAG) plasmáticos. Una de las respuestas metabólicas características a la infección es la hipertrigliceridemia, que es consecuencia, al menos en parte, de la disminución de la actividad LPL de los tejidos. La administración de lipopolisacárido (LPS) provoca una inhibición de la actividad LPL tisular a nivel postranscripcional [1,2] y un aumento de la producción de óxido nítrico (NO). Estudios anteriores han propuesto una relación causa/efecto entre el aumento de la síntesis de NO y la disminución de actividad LPL tisular [2] aunque no se ha determinado si esta interacción es directa o está 92 mediada por otros factores. En este trabajo hemos estudiado la potencial nitración in vivo de la LPL en respuesta a la administración de LPS en rata. La administración de LPS produce un aumento de los TAG circulantes, de la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible, de la producción de NO y una disminución generalizada de la actividad LPL en tejidos. De manera preliminar evaluamos la sensibilidad de la LPL a la nitración, tratando in vitro LPL bovina con peroxinitrito, una especie reactiva del QLWUyJHQR516/DQLWUDFLyQGHWLURVLQDVVHKDGH¿nido como un marcador de la interacción de proteínas con RNS. Así, la nitración de la LPL bovina tratada con peroxinitrito se determinó mediante Western blot DQWLQLWURWLURVLQD \ PHGLDQWH OD LGHQWL¿FDFLyQ SRU espectrometría de masas en tándem (MS/MS) de VHFXHQFLDVHVSHFt¿FDVGHOD/3/TXHFRQWHQtDQWLURsinas nitradas. Para la localización de nitrotirosinas mediante espectrometría de masas se compararon tres estrategias distintas de fragmentación MS/MS: (1) MS/MS dependiente de datos de los péptidos más abundantes, (2) MS/MS dependiente de datos de SpSWLGRVSUHVHQWHVHQXQDOLVWDGHLRQHVSUHGH¿QLGD y (3) MS/MS secuencial siguiendo una lista de iones SUHGH¿QLGD)LJXUD 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 alta para este modo de barrido. Este análisis permitió detectar 8 residuos nitrados in vitro en la LPL bovina (Figura 1). El alto grado de homología entre la LPL bovina y la de rata permitieron el uso de los espectros MS/MS de péptidos nitrados de la LPL bovina como espectros de referencia para el análisis de una potencial nitración in vivo de la LPL de rata en respuesta a la administración de LPS. Para el estudio de la LPL GHUDWDPHGLDQWHKHUUDPLHQWDVSURWHyPLFDVSXUL¿FDmos parcialmente la enzima a partir de homogenado GHFRUD]yQPHGLDQWHFURPDWRJUDItDGHD¿QLGDGDKHparina-Sepharose y resolvimos isoformas de pI de la LPL mediante electroforesis en 2 dimensiones, como describimos en trabajos anteriores [3]. Las isoformas de pI de la LPL se recortaron del gel, se digirieron con tripsina y los péptidos obtenidos se analizaron mediante MS/MS secuencial siguiendo una lista de LRQHVSUHGH¿QLGD)LJXUD(VWHDQiOLVLVOOHYyDOD LGHQWL¿FDFLyQGHWUHVUHVLGXRVGHWLURVLQDQLWUDGRVin vivo (en las posiciones 94, 164 y 316) en la LPL de corazón de rata tratada con LPS (Figura 1). (VWHHVWXGLRHVHOSULPHURHQLGHQWL¿FDUUHVLGXRV nitrados en la LPL, tanto in vivo como in vitro, y demuestra que la LPL es una diana de las RNS en el contexto de la endotoxemia [4]. Así, estos resultados sugieren que la nitración puede constituir un mecanismo nuevo de regulación de la actividad LPL tisular y abren las puertas a futuros estudios dirigidos DODQiOLVLVGHHVWDPRGL¿FDFLyQHQRWUDVVLWXDFLRQHV en las que se ha propuesto que la LPL puede estar regulada por NO. Referencias Figura 1. Alineación de las secuencias de la LPL bovina y de rata y localización de las tirosinas nitradas detectadas. En la secuencia se indican las tirosinas nitradas detectadas HQOD/3/ERYLQDSXQWDVGHÀHFKDQHJUDV\HQOD/3/GH UDWDSXQWDVGHÀHFKDEODQFDVXWLOL]DQGRXQDHVWUDWHJLDGH fragmentación MS/MS secuencial sobre un listado de iones SUHGH¿QLGR(QJULVVHLQGLFDODPi[LPDFREHUWXUDHVSHUDble con el listado de iones barridos, mientras que la cobertura detectada experimentalmente se muestra en negrita. El péptido señal se indica en cursiva. Los aminoácidos están numerados empezando por el extremo N-terminal de la proteína madura. LPLb, LPL bovina; LPLr, LPL de rata. La primera estrategia de fragmentación ofreció la máxima cobertura de secuencia, mientras que el tercer método permitió detectar un mayor número de tirosinas nitradas, mostrando una sensibilidad más [1] Gouni I, Oka K, Etienne J y Chan L. Endotoxininduced hypertriglyceridemia is mediated by suppression of lipoprotein lipase at a post-transcriptional level. J Lipid Res 1993;34:139-46. [2] Picard F, Kapur S, Perreault M, Marette A y Deshaies Y. Nitric oxide mediates endotoxininduced hypertriglyceridemia through its action on skeletal muscle lipoprotein lipase. FASEB J 2001;15:1828-30. [3] Casanovas A, Carrascal M, Abián J, López-Tejero MD y Llobera M. Discovery of lipoprotein lipase pI isoforms and contributions to their characterization. J Proteomics 2009;72:1031-9. [4] Casanovas A, Carrascal M, Abián J, LópezTejero MD y Llobera M. Lipoprotein lipase is nitrated in vivo after lipopolysaccharide challenge. Free Radic Biol Med 2009;47:1553-60. 93 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Application of iTRAQ reagents to relatively quantify the reversible redox state of cysteines Brian McDonagh, C. Alicia Padilla, J. Antonio Bárcena Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Córdoba, Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), Spain The dynamic nature of the proteome ensures that the cell is able to respond to environmental, genetic, biochemical and pathological perturbations. How the proteome responds to these stimuli is of considerable interest as it can relate to the cells stress response and can take the form of post-translational PRGL¿FDWLRQV DQG LQWHUSURWHLQ LQWHUDFWLRQV ZLWK subsequent effects on translation and transcription. Improvements in mass spectrometry has lead to the development of a number of techniques to quantify the abundance of proteins within any given sample, WKHVH LQFOXGH LVRWRSH FRGHG DI¿QLW\ WDJV ,&$7 stable isotope labelling of amino acids in cell culture (SILAC) isobaric tags for relative and absolute TXDQWL¿FDWLRQ L75$4 +RZHYHU PHDVXULQJ WKH relative quantity of a protein between two samples does not tell us anything about the functional state of the protein itself, this is especially important in reference to redox proteins that contain thiol switches and are susceptible to activation or inactivaWLRQ:HKDYHXVHGWKHUHGR[VHQVLWLYH\HDVWHQ]\PH alcohol dehydrogenase, which has a decrease in the number of free thiols and loss of activity in response to oxidative stress. This protein contains two cysteine containing tryptic peptides that are amenable to 06DQDO\VLV:HKDYHDSSOLHGL75$4WHFKQRORJ\ to these peptides to relatively quantify the reversible redox state of cysteine peptides both in a control and test state, in a single analysis. 94 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 4. PROTEÓMICA CUANTITATIVA Coordinadores: Miren J. Omaetxebarría y Eva Rodríguez-Suárez Soluciones a Retos Analíticos en Proteómica Cuantitativa y Validación de Biomarcadores Isidro Masana Agilent Technologies – Barcelona /DFXDQWL¿FDFLyQGHSpSWLGRV\SURWHtQDVHVWiDGquiriendo cada vez una mayor importancia en proteómica. A medida que se van descubriendo potenciales FDQGLGDWRVDELRPDUFDGRUHVVXFRQ¿UPDFLyQ\YDOLGDción -cada vez más- requiere herramientas analíticas FDSDFHVGHFXDQWL¿FDUGHFHQDVFHQWHQDVGHSpSWLGRV concretos, en un gran número de muestras con muy elevada sensibilidad y reducido tiempo de análisis. La nano-cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas con la tecnología de triple cuadrupolo (nano-LC/MS-QQQ) en su modalidad de MRM (“Multiple Reaction Monitoring”) proporciona hoy en día la mayor sensibilidad, robutez y selectividad SDUDODFXDQWL¿FDFLyQGH³FRPSXHVWRVGLDQD´³WDUJHW compounds”) en muestras complejas. La modalidad MRM también ofrece una alta precisión y un tiempo GHFLFORPX\UiSLGRSDUDSRGHUFXDQWL¿FDUKDVWDXQRV pocos miles de péptidos en un solo análisis. Todo ello la convierte en la tecnología ideal para aplicaciones cuantitativas y especialmente para la validación de marcadores biológicos con alto rendimiento. Retos analíticos: elevada sensibilidad Comparando equipos de igual gama, los QqQ en MRM son capaces de proporcionar sensibilidades del orden de 20 veces mejores que otros sistemas de MS/ MS que siempre proporcionan el espectro completo. &RQ4T4VHSXHGHQOOHJDUDFXDQWL¿FDUGHVGHQLYHOHV muy bajos de atomoles con buena repetibilidad (Figura 1). Su mayor sensibilidad se debe a: 1º La total focalización de la detección por MRM en sólo los iones precursores y producto de interés (estos se irán programando en el tiempo). 2º Al efectuar MS/MS en el espacio, la sensibilidad del proceso de detección en un QqQ no se ve reducida por la coelución con otros péptidos mayoritarios. Con respecto a sistemas basados HQUHDOL]DU0606HQHOWLHPSRFRQ¿QDPLHQWR atrapado temporal de los iones en un espacio), los QqQ proporcionan una mayor y más robusta sensibilidad - menos “entorno dependiente”pues ésta sólo se ve afectada por cambios en la respuesta debida a interacciones en el proceso de ionización de péptidos coeluyentes. En sistemas EDVDGRVHQHOFRQ¿QDPLHQWRGHLRQHVDGHPiV es habitual perder sensibilidad en la detección de péptidos minoritarios cuando éstos coeluyen con otros de mayoritarios o contaminantes del sistema; éstos generan una saturación de cargas en el espacio de atrapado de los iones que reduce la sensibilidad (por reducción en el tiempo de acumulación o cambio en la m/z medida). 'HVGHHOSXQWRGHYLVWDFURPDWRJUi¿FRORVVLVtemas basados en nano-cromatografía (como p.e. el sistema HPLC-Chip/MS) [1] serán los que mayor sensibilidad proporcionen. Una buena cromatografía será también importante para minimizar las posibles supresiones en la ionización, y reducir así efectos adversos de la matriz de la muestra o coeluciones con péptidos mayoritarios. Otra posibilidad es la de utilizar sistemas de preconcentración selectiva del tipo de péptidos de interés; destaca el nuevo HPLC/ Fosfo-Chip [2-3] que incluye una precolumna de óxido de titanio y permite automatizar la preconcentración selectiva de los péptidos fosforilados y su análisis por separado del resto de péptidos no fosforilados (que suelen estar presentes a concentraciones mucho más elevadas). 95 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figura 1. &XDQWL¿FDFLyQ FRQ 7ULSOH &XDGUXSROR GH DPRO D IPRO GH SHUR[LGDVD HQ VXHUR KXPDQR MRM péptido ALELFR2+ (480.3 Î 630.4). Desde el punto de vista de preparación de muesWUDVXDGHFXDGDVLPSOL¿FDFLyQD\XGDDPHMRUDUPX\ considerablemente la sensibilidad. Eliminar proteínas mayoritarias [4], fraccionar las proteínas o péptidos por pI (Offgel Electroforesis) [5], por cromatografía (mRP-C18, SCX,..) o con los tradicionales geles son herramientas todas ellas muy útiles. Eliminar las 14 proteínas mayoritarias~94% proteína total (Hu-14 Column) y luego fraccionar la fracción de proteínas minoritarias por pI con un sistema de Offgel Electroforesis, que permite recoger directamente la muestra en solución líquida (compatible con LC/MS) con elevada resolución (hasta 0,1 unidades pI), es muy útil para separar isoformas y facilitar el estudio de PRGL¿FDFLRQHVSRVWWUDGXFFLRQDOHV QDQRÀXMRORVEDVDGRVHQGLYLVLyQGHÀXMRVXHOHQVHU los que proporcionan volúmenes de retardo del gradiente más pequeños (en algunos sólo unos pocos centenares de nL) y permiten análisis más rápidos. Otro punto a considerar es la rapidez del detecWRU3DUDXQDEXHQDFXDQWL¿FDFLyQVHUHTXHULUiQXQRV 10-15 puntos de medida a lo largo del pico (mínimo HQIXQFLyQGHODQFKRGHOSLFRFURPDWRJUi¿FR\GHOQGHSpSWLGRVFRHOX\HQWHVDFXDQWL¿FDUVH SRGUiGH¿QLUHOWLHPSRPi[LPRGHPRQLWRUL]DFLyQ de cada transición. Los QqQ más rápidos permiten medir hasta +200 transiciones MRM distintas por segundo, unas 20 veces más rápido que el resto de sistemas MS/MS que, a lo sumo, suelen llegar a 10 MS/MS por segundo y limitan el nº de péptidos FRHOX\HQWHVTXHVHSXHGHQFXDQWL¿FDU Retos Analíticos: Rapidez La elevada variabilidad de los sistemas biológicos conlleva tener que evaluar un elevado nº de individuos de cada una de las poblaciones sujetas a estudio, que exigirá el uso de métodos optimizados SDUDXQDQiOLVLVUiSLGRUREXVWR\FRQVX¿FLHQWHVHQsibilidad de los péptidos de interés. Para ello conviene disponer de sistemas de nano-cromatografía rápidos; capaces de proporcionar un mínimo volumen de retardo del gradiente, para evitar que el cambio de composición del eluyente tarde mucho tiempo (5-10min) en llegar a columna y retrase todo el cromatograma (primeros péptidos eluyendo al cabo de 10-15min). De los diversos tipos de sistemas de Referencias [1] Fortier M, Bonneil E, Goodley P, Thibault P. ,QWHJUDWHG0LFURÀXLGLF'HYLFHIRU0DVV6SHFtrometry-Based Proteomics and Its Application to Biomarker Discovery Programs. Anal. Chem. 2005; 77: 1631-1640. >@ 0RKDPPHG6.UDLF]HN.3LQNVH0:/HPHHU S, Benschop JJ, Heck AJ. Chip-Based Enrichment and NanoLC-MS/MS Analysis of PhosSKRSHSWLGHV IURP :KROH /\VDWHV - 3URWHRPH Res. 2008; 7(4): 1565-71. [3] Raijmakers R, Mohammed S, J.R Heck A. 96 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Lin D., Masana I., HPLC-FosfoChip: análisis selectivo de Fosfopéptidos por LC/MS. Lifescienceslab 2009; 5 :30-35. [4] Björhall K, Miliotis T, Davidsson P. Comparison of different depletion strategies for improved resolution in proteomic analysis of human serum. Proteomics 2005; 5: 307–317. [5] Hubner N.C., Ren S., Mann M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics 2008; 8(23-24):4862-72. [6] Kandasamy K, Pandey A, Molina H. Evaluation of Several MS/MS Search Algorithms for ETD Experiments. Anal. Chem. 2009: 81 (17): 7170–7180. /XFHV\VRPEUDVGHODFXDQWL¿FDFLyQFRQL75$4 María Luz Valero, Virginia Rejas, Manuel Mateo Sánchez del Pino Laboratorio de Proteómica. Centro de Investigación Príncipe Felipe. Avda. Autopista del Saler 16. 46012 Valencia /D FXDQWL¿FDFLyQ GH ODV GLIHUHQFLDV HQWUH GRV RPiVHVWDGRV¿VLROyJLFRVGHXQVLVWHPDELROyJLFR es una de las tareas más importantes y difíciles en proteómica. En los últimos años se están desaUUROODQGRPpWRGRVGHFXDQWL¿FDFLyQEDVDGRVHQOD espectrometría de masas como complemento a las técnicas más clásicas basadas en 2D PAGE. Los métodos más populares utilizan marcajes isotópicos diferenciales siendo uno de los más utilizados el sistema iTRAQ (Applied Biosystems). Para obtener la máxima información de un experimento iTRAQ es fundamental un adecuado diseño del mismo. Según el problema biológico que queramos abordar será necesario utilizar un número de replicas ELROyJLFDVVX¿FLHQWHSDUDGLVFHUQLUODVYDULDFLRQHVLQtrínsecas a la muestra [1; 2] de las debidas al problema biológico en estudio. En el caso de experimentos complejos con elevado número de réplicas que impliquen varios experimentos iTRAQ será necesario introducir en todos los experimentos un estándar interno que permita posteriormente un análisis global de todas las muestras presentes en el estudio. Preparación de la muestra Una vez se dispone de un diseño experimental claro el primer paso es la preparación de las muestras. En nuestra experiencia es mejor partir de la mayor cantidad de proteína recomendada para evitar problemas debidos al exceso de reactivos, como la formación de precipitados y la obturación de los VLVWHPDVFURPDWRJUi¿FRV Una vez elegidas y disponibles las muestras a analizar hemos de ponerlas en un medio adecuado para el análisis. En general, la precipitación es el método más usado en este paso. Para la elección del medio para redisolver las proteínas hay que tener en cuenta que sea compatible con los tratamientos de reducción, alquilación y digestión. Además, para el marcaje posterior ha de evitarse la presencia de aminos reactivos en el medio y de otros posibles QXFOHy¿ORVFRPRWLROHV&RQHVWDVUHVWULFFLRQHVHQ ocasiones es difícil disolver la muestra, siendo necesaria una puesta a punto para cada tipo de extracto proteico. Tras disolver la muestra es necesario reali]DUXQDFXDQWL¿FDFLyQ¿DEOHGHODFDQWLGDGWRWDOGH proteína presente en cada muestra. Marcaje y separación de los péptidos Las muestras marcadas diferencialmente se combinan y se elimina el exceso de reactivos y compuestos que podrían potencialmente interferir con la cromatografía líquida o el análisis de MSMS de los péptidos. En la mayoría de aplicaciones es necesario prefraccionar la mezcla de péptidos ya que las muestras suelen ser demasiado complejas para un único análisis LCMSMS. 97 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Hay diferentes métodos de separación de péptidos que pueden aplicarse en este punto. La elección de uno u otro dependerá del tipo de péptidos que queramos separar y de la disponibilidad de equipos. En el laboratorio habitualmente realizamos cromatografía C18RP a pH básico [3; 4], cromatografía SCX y, más recientemente, también mediante IEF [5] en gradientes de pH inmovilizados (3-10NL, 7 cm, GE). En todos los casos se prefraccionan de 200 a 400 µg de péptidos y suele ser necesario una tratamiento posterior de limpieza y/o concentración antes del análisis por LCMSMS. Fragmentación de los péptidos Para el análisis por MSMS de los péptidos marcados es necesario ajustar los parámetros respecto a los que utilizaríamos para los péptidos no marcados. En el caso de los espectrómetros de masas QTOF de ABI (QStar) este ajuste es muy sencillo, y consiste en incrementar los valores de intercept de la ecuación |CE|0=(slope)*(m/z)+(intercept) usada para calcular la energía de colisión para cada ión. El incremento es mayor para los péptidos derivatizados con iTRAQ 4 plex que con iTRAQ 8plex. Con otro tipo de espectrómetros de masas su puesta a punto es más compleja [6]. Análisis de resultados Con los péptidos analizados se ha de proceder DODLGHQWL¿FDFLyQ\FXDQWL¿FDFLyQGHODVSURWHtQDV presentes en las muestras. El hecho de que ambas determinaciones se realicen simultáneamente supone una gran ventaja respecto a los sistemas de FXDQWL¿FDFLyQEDVDGRVHQODVHSDUDFLyQGHODVSURWHtQDVHQJHO/DLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVVHKDFH de manera convencional indicando simplemente la PRGL¿FDFLyQTXtPLFDXWLOL]DGD (O KHFKR GH TXH OD FXDQWL¿FDFLyQ VH UHDOLFH D nivel de MSMS hace que las relaciones S/N sean mejores. En este punto cabe destacar que según el instrumento utilizado en el análisis el rango lineal para la determinación de estas áreas será diferente. 3DUDODFXDQWL¿FDFLyQVHXWLOL]DQWRGRVORVHVSHFWURV DVLJQDGRVDSpSWLGRVFRQXQDFRQ¿GHQFLDDGHFXDGD y en los que haya sido posible medir las áreas de los iones reporteros con bajo error. 3RURWURODGRDOUHDOL]DUODFXDQWL¿FDFLyQKDGH tenerse en cuenta que se ha podido introducir un error experimental diferente en la manipulación de cada muestra, así como la pureza de los distintos reactivos usados. Ha de comprobarse también que QR VH KDQ XWLOL]DGR SDUD FXDQWL¿FDU SpSWLGRV TXH pertenezcan a varias proteínas (isoformas) o cuya asignación sea dudosa. Si todo esto se realiza adecuadamente la técnica nos permitirá disponer de un elevado número de SURWHtQDV FXDQWL¿FDGDV HQ XQ SHULRGR GH WLHPSR razonable. Referencias >@ $QGHUVRQ 1/ $QGHUVRQ 1* 7KH KXPDQ plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics 2002; 1: 845-67. [2] Molloy MP, Brzezinski EE, Hang J, McDowell 079DQ%RJHOHQ5$2YHUFRPLQJWHFKQLFDO variation and biological variation in quantitative proteomics. Proteomics 2003; 3: 1912-9. >@ 'RZHOO-$+H\GHQ:9/L/5DWQHXURSHStidomics by LC-MS/MS and MALDI-FTMS: Enhanced dissection and extraction techniques coupled with 2D RP-RP HPLC. Journal of proteome research 2006; 5: 3368-75. [4] Tenorio-Laranga J, Valero ML, Mannisto PT, 6DQFKH] GHO 3LQR 0 *DUFLD+RUVPDQ -$ Combination of snap freezing, differential pH two-dimensional reverse-phase high-performance liquid chromatography, and iTRAQ technology for the peptidomic analysis of the effect of prolyl oligopeptidase inhibition in the rat brain. Analytical biochemistry 2009; 393: 80-7 [5] Cargile BJ, Sevinsky JR, Essader AS, SteSKHQVRQ-/-U%XQG\-/,PPRELOL]HGS+ JUDGLHQWLVRHOHFWULFIRFXVLQJDVD¿UVWGLPHQVLRQ separation in shotgun proteomics. J Biomol Tech 2005; 16: 181-9. [6] Bantscheff M, Boesche M, Eberhard D, MatthieVRQ76ZHHWPDQ*.XVWHU%5REXVWDQGVHQVLWLYHL75$4TXDQWL¿FDWLRQRQDQ/742UELWUDS mass spectrometer. Mol Cell Proteomics 2008; 7: 1702-13. 98 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 iTRAQ-based quantitative analysis of protein mixtures with large fold change and dynamic range Juan Casado-Vela1, María José Martínez-Esteso2, Eva Rodriguez1, Eva Borrás3, Felix Elortza1, Roque Bru-Martínez2 1 Proteomics Platform. CIC bioGUNE, CIBERehd, ProteoRed. Technology Park of Bizkaia, Building 800. Derio, Spain. 2Grupo de Proteómica y Genómica Funcional de Plantas. Departamento de Agroquímica y Bioquímica. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante. Spain. 3Servicio Proteómica. Universidad Pompeu Fabra. Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona. Dr Aiguader 88. 08003 Barcelona, Spain Quantitation of changes in protein abundance is key to discovering novel biomarkers. Currently, reverse phase liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) can be used to quantify changes in protein expression levels. Nevertheless, quantitative analysis of protein mixtures by HPLC-MS/MS is still hampered by the wide range of protein expression levels, the high dynamic range of protein concentrations and the lack of reliable quantitation algorithms. In this context, we describe two different samples (4-protmix and 8-protmix) suitable for relative protein quantitation using isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation (iTRAQ). Using the 4-protmix, relative protein changes of up to 24-fold were measured. The 8-protmix allowed the quantitation of the relative protein changes in a mixture of proteins within the range of two orders of magnitude in concentration and 10-fold differences in relative abundance. Figure 1. Schematic view of the preparation of the 4-protmix. The two reference samples proposed here (4-protmix and 8-protmix) cover a wide range of protein fold changes and protein concentrations, respectively, which can be used to optimize the settings used during acquisition with different mass spectrometers and to test the performance of different quantitation algorithms used for iTRAQ experiments. Three technical replicates corresponding to 800 fmol of 4-protmix and 8-protmix were analyzed by HPLC-MS/MS using two platforms, a ChipLC coupled to a 6530 Q-ToF (Agilent Technologies) and a 1200 nano-HPLC (Agilent Technologies) coupled to DQ/742UELWUDS7KHUPR)LVKHU6FLHQWL¿F$VDUHsult, the analysis of the 4-protmix and the 8-protmix OHGWRWKHVXFFHVVIXOLGHQWL¿FDWLRQDQGTXDQWLWDWLRQRI all proteins in the samples (Tables 1 and 2). Figure 2. Schematic view of the preparation of the 8-protmix. As shown here, we were able to detect up to 24-fold changes in protein ratios. The standard deYLDWLRQıZDVW\SLFDOO\ORZHUWKDQEXWUDQJHG IURP ı WR ı 7KH KLJKHVW ı FRUUHsponded to the highest protein fold change in our samples (24-fold). 99 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Table 1. 4-protmix iTRAQ protein relative quantitation. A: ChipLC coupled to a 6530 Q-ToF and analysed using MASCOT. B: 1200 nanoHPLC coupled to LTQ Orbitrap and analysed using Proteome Discover. Table 2. 8-protmix iTRAQ protein relative quantitation measured with LTQ Orbitrap and analysed using Proteome Discover. In conclusion, we described two different samples suitable for iTRAQ analysis that can be used to assess the performance of different mass spectrometers and quantitation algorithms. A considerable part of the proteome of a typical biological sample falls within the fold change and dynamic range windows of these two samples. Evaluation of MSEEDVHGSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQPHWKRGV Kerman Aloria1, Miren Josu Omaetxebarria2, Mikel Azkargorta2*, Johannes P. C. Vissers4, Asier Fullaondo5, Jesus M. Arizmendi1,2 1 Proteomics Core Facility-SGIker (ProteoRed). University of the Basque Country. Leioa, Spain. 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology. University of the Basque Country. Leioa, Spain. 3 Proteomics Core Facility. CIC bioGUNE. Derio, Spain. 4 :DWHUV&RUSRUDWLRQ0DQFKHVWHU8QLWHG.LQJGRP5 Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology. University of the Basque Country. Leioa, Spain * Current address: Proteomics Core Facility. CIC bioGUNE. Derio, Spain /&06 EDVHG SURWHLQ TXDQWL¿FDWLRQ PHWKRGV have recently gained popularity as powerful technologies capable of addressing protein expression analysis in complex samples. As an alternative to isotope labeling methodologies, which are samplenumber and sample-type dependant and require special labeling chemistries, label-free approaches afford greater experimental design and less sample 100 manipulation. A relatively new label-free approach based on MSE or data independent acquisition mode was applied in this study [1, 2]. Unlike the traditional LC-MS/MS strategy, no precursor ion selection and fragmentation is applied and the acquisition method is based on alternating the collision energy of sequential scans applied to the gas cell between low and elevated states (Figure 1). MSE based acquisition collects information on all the isotopes of all charge-states of the eluting peptide precursor across the chromatographic peak width. MSE provides accurate mass data for precursor and product ions ZKLFK DUH XVHG IRU SURWHLQ LGHQWL¿FDWLRQ DQG DOVR precursor ion intensity measurement for relative SURWHLQ TXDQWL¿FDWLRQ )XUWKHUPRUH DEVROXWH SURtein amount can be estimated by comparing the top three ionising peptides of each protein with a known amount of an internal standard [3]. In this study we evaluated the utility of estimated absolute quanti¿FDWLRQ DQG FRPSDUDWLYH DQDO\VLV RI LRQ FXUUHQWV IRUWKHSXUSRVHRIUHODWLYHSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQRQ data acquired using the data independent acquisition method. Our results indicate that MSE based labelIUHH TXDQWL¿FDWLRQ LV D UREXVW DQG D UHSURGXFLEOH DSSURDFKIRUUHODWLYHSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQLQFRPplex samples. Two mixtures (ECOLI_1 and ECOLI_2) of digested ADH1_YEAST, PGYM_RABIT, ENO1_ <($67DQG$/%8B%29,1SURWHLQV:DWHUV&RUporation) were prepared at a relative molar ratio for each protein of 1:1, 1:0.5, 1:2 and 1:8 respectively and spiked into a digested E. coli cytosolic protein PL[WXUH :DWHUV &RUSRUDWLRQ 'DWD LQGHSHQGHQW acquisition analyses were performed with a nanoAcquity UPLC system interfaced to a SYNAPT +'06 :DWHUV &RUSRUDWLRQ PDVV VSHFWURPHWHU and samples were run in quintuplicate. Data were SURFHVVHG VHDUFKHG DQG TXDQWL¿HG ERWK DEVROXWH and relative, with a beta release of ProteinLynx GlobalSERVER v2.4 software. Absolute protein quanWL¿FDWLRQ ZDV FRQGXFWHG ZLWK D VWDQGDUG SURWHLQ added to the sample (ADH_YEAST) and its amount SURYLGHG WR WKH LGHQWL¿FDWLRQ VRIWZDUH$EVROXWH protein values were used to express relative quanti¿FDWLRQUHVXOWVEHWZHHQGLIIHUHQWVDPSOHV7KHUHODWLYHTXDQWL¿FDWLRQVRIWZDUHSHUIRUPVDFRPSDULVRQ between different samples based on deconvoluted peptide intensities and probabilistic relative protein TXDQWL¿FDWLRQLVVXEVHTXHQWO\FDOFXODWHG In this analysis a total of 525 different proteins ZHUHLGHQWL¿HGSURWHLQ)'5 LQ(&2/,B 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 and 428 in ECOLI_2 samples. 257 proteins in (&2/,BDQGLQ(&2/,BZHUHLGHQWL¿HGLQ RU PRUH UHSOLFDWHV RI WKHP ZHUH LGHQWL¿HG in both samples (Figure 2. A, B) and therefore, reODWLYHO\TXDQWL¿HG%RWKTXDQWL¿FDWLRQDSSURDFKHV comparative analysis of estimated absolute amount and ion current (probability) based, accurately determined the relative protein ratio of the eukaryotic proteins spiked into an E. coli protein matrix (taEOH:HDOVRXVHGWKLVDSSURDFKIRUWKHUHODWLYH TXDQWL¿FDWLRQRIWRWDOSURWHLQH[WUDFWVIURP:7DQG E2F2-/- T lymphocytes. 736 proteins were idenWL¿HG DQG ZHUH FRQVLGHUHG IRU TXDQWL¿FDWLRQ purposes. Obtained results indicate that both quanWL¿FDWLRQDSSURDFKHVHTXDOO\GHWHUPLQHSURWHLQH[pression trends although numerical ratios can vary due to differential handling of protein isoforms and differences in statistical analyses (data not shown). Overall we can conclude that label-free LC-MSE type of analysis has proven to be a robust and reproGXFLEOHDSSURDFKIRUUHODWLYHSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQ in complex samples. Furthermore, relative quanti¿FDWLRQEDVHGRQHVWLPDWHGDEVROXWHTXDQWL¿FDWLRQ and on ion current comparison consistently measured protein expression ratios. Table 1. Expected and experimental ratios obtained for ALBU_BOVIN, ENO1_YEAST and PGYM_RABIT proteins. Expected ratio Ratio based on absolute TXDQWL¿FDWLRQ Ratio based on comparative ion current albu_ bovin 8.0 6.95 7.61 eno1_ yeast 2.0 1.91 2.04 pgym_ rabit 0.5 0.54 0.55 Protein Figure 1. Schematic of MSE mode of analysis ¿JXUHIURP Waters Corporation). 101 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 This work was supported by grants from the Basque Government Department of Industry (Etortek and Saiotek to J.M.A.). Proteomics Core Facility-SGIker is supported by UPV/EHU, MICINN, GV/EJ, ESF and ProteoRed agencies. Figure 2. *UDSKLFDOUHSUHVHQWDWLRQRILGHQWL¿HGSURWHLQV. A. 1XPEHURISURWHLQVLGHQWL¿HGLQ(&2/,BDQG(&2/,BSHU number of replicates. B. Venn diagram of overlapping proteins LGHQWL¿HGLQRUPRUHUHSOLFDWHVLQ(&2/,BDQG(&2/,B [1] Silva JC, Denny R, Dorschel CA, Gorenstein MV, Kass IJ, Li GZ, et al. Quantitative proteomic analysis by accurate mass retention time pairs. Anal Chem 2005;77:2187-200. [2] Li GZ, Vissers JP, Silva JC, Golick D, Gorenstein MV and Geromanos SJ. Database searching and accounting of multiplexed precursor and product ion spectra from the data independent analysis of simple and complex peptide mixtures. Proteomics 2009;9:1696-719. [3] Silva JC, Gorenstein MV, Li GZ, Vissers JP and *HURPDQRV6-$EVROXWHTXDQWL¿FDWLRQRISURteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition. Mol Cell Proteomics 2006;5: 144-56. Desarrollo de un Modelo Estadístico Universal para Proteómica Cuantitativa Mediante Marcaje Isotópico Estable Marco Trevisan-Herraz1, Pedro Navarro1, Elena Bonzon-Kulichenko1, Pablo Martínez-Acedo1, Daniel Pérez-Hernández1, Estefanía Núñez1, María Luisa Hernáez2, Enrique Calvo4, Montserrat Carrascal3, Marina Gay3, Inmaculada Jorge1, Dolores Gutiérrez2, Joaquín Abian3, Concha Gil2, Juan Miguel Redondo4 , Jesús Vázquez1 1 Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica, Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” (CSICUAM), Madrid (CBMSO). 2Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid (UCM). 3Laboratorio de Proteómica, Instituto de Investigaciones Biomédicas de Barcelona (IIBBCSIC) (IDIBAPS). 4Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, Madrid (CNIC) Aunque en la actualidad existen diferentes métodos de marcaje isotópico para la realización de estudios de proteómica cuantitativa, los modelos estadísticos para el tratamiento de los datos obtenidos están todavía muy poco desarrollados. La mayoría de los modelos asumen distribuciones normales de los datos y la existencia de varianzas homogéneas, que no se han demostrado en la práctica. En el laboratorio de J. Vázquez hemos desarrollado recientemente un nuevo modelo estadístico jerárquico de efectos aleatorios para el análisis de los datos de expresión diferencial obtenidos por marcaje con 18 O/16O y espectrometría de masas de trampa iónica lineal [1]. La validez de este modelo, que considera por separado las fuentes de error debidas a la manipulación de la muestra, la preparación de los SpSWLGRV\ODFXDQWL¿FDFLyQSRUHOHVSHFWUyPHWURGH masas, ha sido demostrada en experimentos masivos de hipótesis nula [1] y ha sido validada en varios modelos biológicos de diferente naturaleza [2]. En el presente trabajo hemos abordado un proyecto cooperativo a gran escala entre varios grupos de investigación con el objetivo de extrapolar dicho modelo estadístico, de forma general, a los métodos de marcaje isotópico más comunes (SILAC y iTRAQ), y a otros espectrómetros de masas. 102 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figura 1. Descripción del software que conforma la plataforma QuiXoT. Como modelo biológico se ha empleado un único cultivo celular de Saccharomyces cerevisiae, control (muestra A), marcado con aminoácidos SILAC (A*) o tratado con H2O2 (B) (UCM), y se han realizado experimentos comparativos a gran escala A vs B y A vs A mediante 18O/16O y iTRAQ, y A* vs B y A* vs A mediante SILAC. Las muestras se digirieron en el CBM utilizando un nuevo método de gel concentrante [2] y los péptidos resultantes se marcaron y separaron en 24 fracciones mediante la técnica Off-gel [2]. Las fracciones fueron analizadas usando un LTQ (CBM, IDIBAPS) en modo convencional o PQD, un LTQ-Orbitrap (CNIC) y un MALDI-TOF-TOF (UCM). Cada uno de los H[SHULPHQWRV SHUPLWLy OD FXDQWL¿FDFLyQ GH HQWUH \ SpSWLGRV /D H¿FLHQFLD GH PDUFDMH por 18O se determinó usando el método cinético [3]. Los resultados de los experimentos de hipótesis nula se utilizaron para el modelado de los pesos estadísticos y para el análisis de normalidad de las poblaciones a los diferentes niveles, según describimos previamente [1]. Nuestros resultados demuestran que el modelo estadístico jerárquico es válido, de forma universal, para todos los tipos de marcaje y todos los espectrómetros de masas utilizados, obteniéndose distribuciones que superan los test de normalidad a nivel de medida, a nivel de péptido y a nivel de proteína. El modelo global ha sido implementado en la plataforma informática QuiXoT, en la que se han desarrollado interfaces para la entrada de datos obtenidos por los diferentes motores de búsqueda, equipos y métodos de marcaje (Figura 1). El análisis de los datos arroja unas varianzas a nivel de péptido que son consistentemente semejantes para todos los métodos de marcaje posdigestión, mientras que en el caso de SILAC la varianza es prácticamente nula. Por otra parte, la varianza a nivel de medida en modo MS (SILAC, 18 O) es algo menor en el Orbitrap en relación con el LTQ, aumentando considerablemente en el modo PQD-MS/MS (iTRAQ) en el LTQ. Finalmente la varianza a nivel de proteína es muy baja y similar en todos los casos. Estos resultados demuestran la coherencia del modelo y establecen por primera vez un marco de referencia estadístico común para comparar las prestaciones relativas de los diferentes equipos y métodos de marcaje. Este modelo, por RWUDSDUWHGHYXHOYHLQIRUPDFLyQVREUHOD¿DELOLGDG de los cambios de expresión obtenidos y ofrece un 103 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 estricto control sobre las posibles fuentes de error del experimento. El desarrollo de un modelo estadístico de validez universal y de una plataforma informática común permite por primera vez el análisis sistemático y la GHWHFFLyQ GH FDPELRV GH H[SUHVLyQ VLJQL¿FDWLYRV de forma semiautomática en cualquier experimento de expresión diferencial a escala masiva mediante técnicas de marcaje isotópico estable. References [1] Jorge I, Navarro P, Martinez-Acedo P, Nunez E, Serrano H, Alfranca A, et al. Statistical model to analyze quantitative proteomics data obtained by 18O/16O labeling and linear ion trap mass spectrometry: application to the study of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis in endothelial cells Mol Cell Proteomics 2009;8:1130-49. [2] Bonzón-Kulichenko E, Pérez-Hernández D, Martínez-Acedo P, Núñez E, Navarro P, Trevisan-Herraz M, et al. A robust method for quantitative high-throughput analysis of proteomes by 18O labeling Mol Cell Proteomics 2009;En revisión. [3] Ramos-Fernández A, López-Ferrer D y Vázquez J. Improved method for differential expression proteomics using trypsin-catalyzed 18O labeling ZLWKDFRUUHFWLRQIRUODEHOLQJHI¿FLHQF\0RO&HOO Proteomics 2007;6:1274-86. /DEHOIUHH4XDQWLWDWLYH$SSURDFKHVLQ&6)%LRPDUNHU'LVFRYHU\ Alex Campos1, Jacques Borg2, Claudio Diema3, Marta Vilaseca3, Eliande Oliveira1 1 Proteomics Platform, Barcelona Science Park, Barcelona, Spain. 2Neurochemistry Lab, Faculty of Medicine, Saint Etienne, France. 3Mass Spectrometry Core Facility, Institute for Research in Biomedicine, Barcelona, Spain Mass Spectrometry (MS) has emerged as one of the most promising core technologies for discovery of diagnostic, prognostic and therapeutic protein biomarkers. Despite its rapid technological developments, MS-based assays have also raised major concerns regarding its reproducibility, sensibility and throughput, and hence its potential application in the clinical and regulatory settings. To address these concerns, we explore relevant quality assurance benchmarks for MS-based quantitative CSF ELRPDUNHUGLVFRYHU\:HDUJXHWKDWWKHURDGWRDUHSURGXFLEOHDQGVXI¿FLHQWO\UREXVWELRPDUNHUGHYHlopment technology entails the understanding of the limits of each process, including sample handling, instrument setup, and bioinformatics tools. Despite the increasing clinical interest in bioÀXLGVDVVRXUFHIRUELRPDUNHUGLVFRYHU\LWVGLVWLQFWLYHQDWXUHLPSDUWVVLJQL¿FDQWFKDOOHQJHVIRUFXUUHQW proteomics technologies. The immense dynamic range of human plasma proteins, which spans 10 to 12 orders of magnitude, poses a major limiting facWRUIRULQGHSWKSURWHRPLFVSUR¿OLQJ7RRYHUFRPH this problem, enrichment techniques and orthogonal fractionation strategies are routinely applied in proteomics studies prior to MS analysis. Biomarkers of “interest” could be enriched with the selection of a biological material that is in close proximity with the disease source. In this regard, the cerebrospinal ÀXLG&6)LVDWUHDVXUHWURYHIRUELRPDUNHUGLVFRvery in neurological diseases. Because of its direct contact with the brain’s extracellular space, CSF is a valuable reporter of processes that occur in the central nervous system. Although CSF shares some RIWKHSURWHLQFRQWHQWRIEORRGWKHERQD¿GHORFDOO\ produced brain’s proteins are found in higher concentration in the CSF compared to blood [1]. Platforms combining removal of high abundance proteins using multi-component immunodepletion systems (IDS) followed by multidimensional protein/peptide fractionation are currently the mainstay of unbiased proteomic biomarker discovery. At the present, a number of commercial IDS are available for highly selective removal of most abundant human plasma proteins. To the best 104 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figure 1. Distribution of the APEX values (left side) for the CSF proteome following depletion with IgY-HSA or IgY-14, and no depletion (y-axis on log scale). Pie charts (right side) depict the CSF protein content in context of their abundance. (HSA, KXPDQVHUXPDOEXPLQ&FRPSOHPHQW&67&\VWDWLQ&/$0$/DPLQLQĮDQG0$&)0LFURWXEXOLQDFWLQ Figure 2. AMT quality control metrics. (A) 2D display of the CSF AMT database. (B) 3D perspective plot of the peptide matches between IgY14-depleted sample and the AMT database (axis: mass and retention time error). (C) Heatmap of similarity score between LC-MS features of IgY14-depleted sample and AMT database. Best alignment is found using a dynamic programming algorithm that determines the transformation function with maximum likelihood. of our knowledge, all commercial IDS have been devised to deplete plasma (or serum) samples and LWVSHUIRUPDQFHLQRWKHUELRÀXLGVKDVQRWEHHQHYDluated yet. To address this problem, we carried out CSF depletion (in triplicate) using either Sigma’s Seppro systems designed to immunodeplete HSA (IgY-HSA) or the 14 most abundant proteins (IgY /DEHOIUHH FRPSXWDWLRQDOO\ PRGL¿HG VSHFWUDO counting method for Absolute Protein EXpression (APEX) measurements was used to assess the deple- ted and undepleted samples in the context of protein content stoichiometry and achieved dynamic range (Figure 1). Our results show that IDS originally devised to deplete blood’s most abundant proteins are GH¿FLHQWLQGHSOHWHWKHPRVWDEXQGDQW&6)SURWHLQV :HWKHUHIRUHSURSRVHDOLVWRIWDUJHWSURWHLQPRVW abundant) to be depleted in CSF for downstream 06SUR¿OLQJ)LJXUH±WRSSLHFKDUW The advent of a new generation of robust MS instruments with very high resolution and mass ac- 105 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 curacy has inspired the development of new quantitative approaches [2]. In particular, label free hybrid identity/pattern-based approaches have gained SRSXODULW\LQWKHELRPDUNHUGHYHORSPHQW¿HOG>@ Such approaches use pattern recognition algorithms to ex post facto assign the identity of LC-MS peaks against databases of peptide sequence, mass, and retention time built from multiple experiments. Here we employ the accurate mass and time (AMT) strategy to identify and quantify peptides/proteins from unfractionated CSF samples using msInspect plaWIRUP>@2XUDQDO\VLVZRUNÀRZH[WHQGVDQGFRPELQHV H[LVWLQJ RSHQVRXUFH SODWIRUPV IRU /&í06 067UDQV3URWHRPLF3LSHOLQHDQG/&í06PV,QVpect) data analysis. A peptide accurate mass and LC elution time AMT database was initially generated using MS/MS following extensive multidimensional LC separations to provide the basis for subsequent SHSWLGHLGHQWL¿FDWLRQV2XU&6)$07GDWDEDVHFRQtains >2,000 entries from a total number of ~7,500 LGHQWL¿HGSHSWLGHVZKLFKWUDQVODWHVLQWRFRQ¿- GHQW&6)SURWHLQLGHQWL¿FDWLRQV)LJXUH,QFRQclusion, hybrid identity/pattern-based approaches are amenable for high throughput quantitative proteome analyses in biomarker discovery pipelines. References [1] Zougman, A et al. Integrated Analysis of the Cerebrospinal Fluid Peptidome and Proteome. J Proteome Res 2007; 7: 386-399. [2] Mueller, LK et al. An Assessment of Software Solutions for the Analysis of Mass Spectrometry Based Quantitative Proteomics Data. J Proteome Res 2008; 7: 51-61. [3] Jaffe, J et al. PEPPeR, a Platform for Experimental Proteomic Pattern Recognition. Mol Cell Proteomics 2006; 5:1927-1941. [4] May, D et al. A Platform for Accurate Mass and Time Analyses of Mass Spectrometry Data. J Proteome Res 2007; 6: 2685-2694. A comparison of quantitative proteomics methodologies on a differential experiment on test samples Joan Josep Bech-Serra, Núria Colomé, Marta Monge, Francesc Canals Laboratori de Proteòmica, Programa de Recerca en Oncologia Mèdica. Institut de Recerca. Hospital Vall d’Hebron, Barcelona 7KH¿HOGRISURWHRPLFVLQFOXGHVDZLGHQXPEHU of technologies aimed to the analysis of large number of proteins, representing ideally the entire proteome, in the same experiment. In its early stages , mass spectrometry-based proteomics was successfully used to the qualitative characterization of complex mixtures of proteins, leaving the quantitative aspects in a secondary role, essentially because of the lack of suitable technologies for quantitative analysis of such complex mixtures. However, in the last years, a wide number of strategies have been developed LQRUGHUWRJLYHWRWKHSURWHRPLFV¿HOGUREXVWWRROV to obtain reliable quantitative data. Those strategies include both 2D-gel based and non-based methodoORJLHV,QWKH¿UVWJURXS'',*(PHWKRGRORJ\LV EDVHGRQWKHODEHOLQJZLWKGLIIHUHQWÀXRURFKURPHV enabling the simultaneous separation of different samples in the same 2D-gel, which allows to over- come reproducibility problems inherent to the 2D procedure and internal standardization of spot volume measurements, providing a robust quantitative comparison technique. Alternatively, a number of gel-free quantitative techniques can be used. Some of them are based on non-isobaric isotope labeling, such as ICAT, ICPL or SILAC labeling methodologies, the quantitative data being obtained from the from the MS data, by integrating extracted ion chromatograms of the heavy-light peptide pair masses. A second group which includes iTRAQ or TMT reagents is based on isobaric labeling that introduce different reporter fragments in the derivatized peptides. Quantitative data is in this case obtained at the MS-MS level, from the relative intensities of the reporter fragment ions. Finally, a third group of label-free methods uses different approaches for quantitative comparison of LC-MS data. 106 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 In order to evaluate and compare the performance of different quantitative proteomics methods, we have prepared a set of two test samples to be compared quantitatively. The samples consist on a matrix of cytoplasmatic E. Coli proteins, of medium complexity (around 100 proteins), to which four standard mammalian proteins have been spiked in different amounts, ranging from the fmol to the pmol level per microgram of total protein.. The ratios of the spiked proteins between the two samples have been chosen to range form 1.5:1 to 5:1. This should result in a more comprehensive quantitative information, since all tryptic peptides will be derivatized at the N-terminus. The weakness of this strategy is that digestion of the two samples has to be run independently, which can introduce technical bias. To minimize the problem of a possible imbalance, both labeling schemes are run in parallel on sample aliquots. This way the balance correction derived from the protein level labeling experiment can be used to normalize the data from the second experiment. These samples have been analyzed by different methodologies (Figure 1): ICPL labeled samples have been analyzed in four independent LC-MS runs in order to assess reproducibility. - 2D-DIGE, using four technical replicas of each sample on a 4 2D-gel experiment. - Labeling with ICPL reagents at the protein level, followed by tryptic digestion and analysis by LC-MS. This is the standard procedure for this methodology, but has the drawback that only lysine FRQWDLQLQJ SHSWLGHV ZKLFK KDYH EHHQ PRGL¿HG E\ the reagent can be used for quantitation. This results RIWHQLQDODUJHSDUWRIWKHLGHQWL¿HGSURWHLQVODFNLQJ quantitative information. - Labeling with ICPL at peptide level. In order to overcome this problem, we have explored an alternative procedure introducing the ICPL labeling step after tryptic digestion of the protein mixtures. - iTRAQ Labeling. The samples have been analyzed using an 8-plex iTRAQ reagent, using four different reporter masses for each of the samples, and analyzed by LC-MALDI. - Label-free quantitation. Four LC-MS runs of a tryptic digest of each sample have used to quantitatively compare the two samples using Progenesis LCMS software for alignment and statistical analysis of the LC-MS maps. The results of all the quantitative proteomics methods used have been evaluated in terms of accuracy and reproducibility, and their performance and robustness is discussed. Figure 1. 6FKHPHRIWKHPHWKRGVFRPSDUHGIRUWKHUHODWLYHTXDQWL¿FDWLRQRIWZRWHVWVDPSOHV 107 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Triple Quadrupole Mass Spectromery-Based Peptide Assays Using Intelligent 650L650 Reiko Kiyonami1, Alan Schoen1, Amol Prakash1, Huy Nguyen1, Scott Peterman1, Vlad Zabrouskov1, Andreas Huhmer1, Sarah Robinson1, Martin Hornshaw1, Madalina Oppermann 1, Nathalie Selevsek2, Bruno Domon2 1 7KHUPR)LVKHU6FLHQWL¿F2 ETH Zurich, Switzerland Introduction The commonly used SRM technique provides sensitive and precise quantitative results by monitoring one or several primary SRM transitions per targeted compound. Recently this technique was H[WHQGHGWRVLPXOWDQHRXVO\FRQ¿UPWKHLGHQWLW\DQG quantify multiple compounds in one HPLC/MS run by monitoring eight or more SRM transitions per compound. The bottleneck of this approach is that only a limited number of compounds can be targeted in one run because of the time required to monitor each transition. The newly developed instrument FRQWUROVRIWZDUHFDQXVHWKHVSHFL¿FLW\RIDVPDOO subset of SRM transitions to simultaneously quanWLI\DQGLQWHOOLJHQWO\WULJJHUWKHIXOOOLVWIRUFRQ¿Umation, thereby allowing the analysis of up to 1000 compounds in a single LC-MS run. Experimental A triple quadrupole mass spectrometer equipped with a nanoLC pump and a nanospray source was used. The intelligent SRM method utilizes SRM VSHFL¿FLW\LQWZRZD\V7KH¿UVWLVFRPSRXQGVSHFL¿FTXDQWL¿FDWLRQXVLQJDWLPHEDVHG650DFTXLsition, which monitors several primary transitions for each compound. The second is a data dependent SRM acquisition, which monitors both those primary and additional secondary transitions and is triggered only when the intensities of all primary 650WUDQVLWLRQVVLPXOWDQHRXVO\H[FHHGWKHGH¿QHG intensity threshold. For large scale screening experiments, the dynamic exclusion was used to trigger secondary acquisition only once for each peak for SURYLGLQJ VXI¿FLHQW VWUXFWXUDO LQIRUPDWLRQ WR FRQ¿UPWKHFRPSRXQG¶VLGHQWLW\ZLWKRXWSHUWXUELQJWKH TXDQWL¿FDWLRQREWDLQHGZLWKWKHSULPDU\650OLVW Results and discussion The technique was applied to quantify preciVHO\ DQG FRQ¿UP LGHQWLW\ RI SHSWLGHV LQ FRPSOH[ biological samples, including yeast cell lysates, and pesticides in orange oil. By monitoring multiple transitions, it is possible to use very low intensity thresholds to accurately trigger the data dependent SRM scan. The trigger is the leading edge of the LC peak and relatively independent of the LC peak intensity. Using known LC peak widths, the strongest intensity point to obtain the data dependant scan is easily anticipated. Instead of a full product ion scan, high quality SRM spectra monitor eight or more transitions at that point. The resulting eight spectra are assembled into a pseudo full scan MS/MS spectra that can be used for con¿UPLQJ WKH LGHQWLW\ RI WKH SHSWLGHV E\ PDWFKLQJ them to reference spectra stored in a library. Using a constant cycle time allows enough points across the peaks from the primary SRM scans for precise TXDQWL¿FDWLRQ:LWKWKLVDSSURDFKWKHLQVWUXPHQW LVDEOHWRFRQ¿UPDQGTXDQWLI\PRVWWDUJHWHGSHStides in the low attomol range. 108 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 5. PROTEÓMICA MICROBIANA Y DE PARÁSITOS Coordinadores: Aída Pitarch, Antonio Marcilla, Ana Oleaga y Manuel Rodríguez 5.1 Aspectos generales Problemas en el análisis proteómico de muestras procedentes de organismos ‘raros’ María Luz Valero1, Javier Ortiz2, Esther Dionís1, Laura Cantero1, Manuel Mateo Sánchez del Pino1 1 Laboratorio de Proteómica. Centro de Investigación Príncipe Felipe. Avda. Autopista del Saler 16. 46012 Valencia. 2SCSIE. Universitat de Valencia /RVPpWRGRVDFWXDOHVGHLGHQWL¿FDFLyQGHSURteínas se basan generalmente en la comparación de la información de MS (o MS/MS) obtenida con la información de secuencias de proteínas que existe en diferentes bases de datos. Aunque algunas bases de datos incluyen un elevado número de proteínas, como por ejemplo NCBI con aproximadamente 8500000 secuencias, no todos los organismos están representados por igual. Así, en NCBI existen 508911 proteínas humanas y el número decae drásticamente hasta 110313 para rata, un organismo ampliamente utilizado en experimentación. Y el número es mucho menor para otros organismos de alto interés como parásitos (54542 entradas para Trematoda), vegetales (13955 para Citrus) o especies marinas de alto interés económico (2353 entradas para Clavicipitaceae). En muchos casos es necesario recurrir a la secuenciación de novo que requiere de espectros de MS/MS de gran calidad y es costosa en cantidad de muestra y tiempo de análisis, por lo que su aplicabilidad es limitada. Aún así existen algunas estrategias que pueden aplicarse en el caso de disponer sólo de información de MS y MS/MS parcial. En algunos casos pueden utilizarse herramientas químicas para la mejora de los espectros de MS/MS. Mientras que en otros las herramientas son bioinformáticas, y nos permitirán obtener más información de las diferentes bases de datos existentes. 5.2 Proteómica de Microorganismos A) Proteómica de Bacterias Preparación de extractos proteicos bacterianos para el análisis de glicoproteínas PHGLDQWHJHOHVELGLPHQVLRQDOHV\FURPDWRJUDItDVGHD¿QLGDG Alfonso Olaya, Lidia Gómez-Gascón, Manuel J. Rodríguez-Ortega Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Veterinaria, Universidad de Córdoba Resumen Las glicoproteínas bacterianas, por sus funciones y localización, son potenciales dianas para vacu- nas. Sin embargo, su estudio mediante electroforesis ELGLPHQVLRQDO \ FURPDWRJUDItDV GH D¿QLGDG ELHQ mediante la química de la hidrazida y del ácido aminofenilborónico o bien mediante reconocimien- 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 WRSRUOHFWLQDVSUHVHQWDQXQDVHULHGHGL¿FXOWDGHV como la presencia de ADN o azúcares libres en la muestra respectivamente. Para intentar solventarlas nos centramos en la optimización del proceso de obtención de extractos proteicos totales, tanto en cuanto a calidad como a rapidez. La glicosilación bacteriana es un proceso recientemente descrito y del cual todavía existen muchas incógnitas. Todas las glicoproteínas procarióticas descritas, en función de su localización, pueden claVL¿FDUVH HQ FLQFR JUDQGHV WLSRV GH SDUHG FHOXODU DVRFLDGDVDPHPEUDQDDVRFLDGDVDOSLORRÀDJHOR glicoproteínas secretadas y exoenzimas, y celulares (cuya localización en la célula no está muy clara y se cree que, más bien, son contaminaciones citoplasmáticas) [1]. Esto, junto con sus funciones [1], que poQHQGHPDQL¿HVWRFRQWDFWRFRQHOKRVSHGDGRUHQHO proceso de infección, convierte a las estas moléculas en potenciales dianas para vacunas, nuestro principal objetivo para estirpes del género Streptococcus. Dos de las aproximaciones que se están llevando a cabo son la electroforesis bidimensional (2-DE) en geles de poliacrilamida y las cromatografías de D¿QLGDGEDVDGDVHQODTXtPLFDGHODKLGUD]LGDODGHO iFLGRDPLQRIHQLOERUyQLFR\HQODDOWDHVSHFL¿FLGDG hacia las glicoproteínas que exhiben las lectinas [2]. Los principales problemas que nos encontramos en la 2-DE tienen que ver con el enfoque de las proteínas debido a la presencia de ADN, que provoca desenfoque horizontal y vertical de las proteínas, y la propia naturaleza altamente hidrofóbica de las glicoproteínas asociadas a membranas. En cuanto a las cromatografías nos encontramos con el problema por contaminación con azúcares libres que LQWHU¿HUHQHQODD¿QLGDGGHODVJOLFRSURWHtQDVSRU la hidrazida y el ácido aminofenilborónico. En base a estos problemas hemos de conseguir una preparaFLyQGHODPXHVWUDH¿FLHQWHHQFXDQWRDOUHQGLPLHQWR de obtención de proteínas, pureza, medio en las que se encuentren éstas y rapidez. Para optimizar el método de extracción de proteínas totales hemos probado una serie de protocolos, con variaciones desde sus fuentes originales para adaptarlos a nuestros organismos. Tras cultivar las bacterias se resuspenden en distintos tampones para romper por ultrasonidos (10 ciclos de 20 segundos) tras tratamiento con mutanolisina (150 U/ ml, a 37ºC, O/N) debido al grosor de la pared celular de los estreptococos. La presencia de ADN en las muestras se comprueba mediante electroforesis en 109 gel de agarosa al 1% y espectrofotometría, y la de azúcares libres mediante la reacción de Fehling y el método de la antrona. 1) Rotura en presencia de tampón de rehidratación de 2-DE (Urea 7M, Tiourea 2M, Tritón X-100 &+$36'77P0/DH¿FLHQFLD de rotura y rendimiento de obtención de proteínas es grande. Sin embargo, al no poder descartarse la fracción en la que se ha incubado con mutanolisina (y que contiene proteínas de unión a pared, liberadas por la acción de la enzima), el tampón se diluye. Otros inconvenientes son que las proteínas resuspendidas en este tampón no pueden ser tratadas enzimáticamente en solución y permanecen los azúcares y el ADN. Para eliminar los contaminantes anteriores debe cambiarse de tampón mediante, por ejemplo, precipitación de proteínas, con la consecuente SpUGLGD GH SURWHtQDV 8OWUD¿OWUDU SDUD GLDOL]DU es imposible al formarse cristales de urea en la membrana, que la obstruyen y da lugar a una gran pérdida de proteínas. 2) Rotura en tampón Tris 50 mM pH 8 tras trataPLHQWRFRQPXWDQROLVLQD/DH¿FLHQFLDGHURWXUD y obtención de proteínas es menor. Sin embargo presenta una serie de ventajas con respecto al anterior tampón, como que las muestras se obtienen en un tampón más apto para las croPDWRJUDItDVGHD¿QLGDG\GHSHQGLHQGRGHOSURtocolo en concreto, también para la 2-DE. 2A) Precipitación con Tricloroacético [3]. Da lugar a un rendimiento en la recuperación de proteína total bajo. 2B) Rotura a pH 10 e incubación con Benzonasa [3] a pH 8, 500 U/ml a 37ºC, 1,5 h. Se elimina el ADN por completo pero no ORVD]~FDUHV6LQHPEDUJRVHSXHGHXOWUD¿OWUDU fácilmente. 2C) Incubación con espermina [4] 5 mM tras subir el pH de la muestra a 10 antes de la rotura y añadir 20 mM de EDTA. En estas condiciones la ratio proteína recuperada/ADN en las muestras es muy bueno. Sin embargo, al tratarse de una molécula cargada, la 2-DE se ve comprometida y, aunque el efecto que tendría sobre los distintos análisis glicoproteicos no se ha ensayado aún, este hecho obliga a cambiar GH WDPSyQ PHGLDQWH SRU HMHPSOR XOWUD¿OWUDción. 2D) Incubación con DNAasa I (4 µg/ml) y RNAasa (4 µg/ml) [5] a 37ºC, 1,5 h. Con estas concentraciones se sigue observando restos de ADN, siendo además necesario un paso de OLPSLH]DGHD]~FDUHV(3XUL¿FDFLyQGHSURWHt- 110 nas con Fenol/Cloroformo/Alcohol Isoamílico (25:24:1 v/v/v) [3]. La cantidad de proteínas recuperadas es baja. 5RWXUDFRQ75,5HDJHQW6LJPD/DH¿FLHQFLDGH rotura es buena, sin embargo, la cantidad de proteínas recuperadas tras seguir el protocolo es baja. Para aumentar la resolución y el enfoque de las proteínas en 2-DE se están ensayando, en los extractos totales potencialmente más idóneos para nuestro estudio, el detergente ASB-14, el DeStreak y el método de cargado de las tiras de IPG mediante “cup loading”. Agradecimientos (VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHOSUR\HFWR SAF2008-00733 del Ministerio de Ciencia e Innovación, Gobierno de España. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Referencias [1] Raj K. Upreti Manoj K., y V. Shankar. Bacterial glycoproteins: Functions, biosíntesis and applications. Proteomics 2003; 3: 363-379. [2] Balanova L., Hernychova L., Bilkova Z. Bioanalytical tools for the discovery of eukaryotic glycoproteins applied to the análisis of bacterial glycoproteins. Expert Rev. Proteomics 2009; 6(1), 75-85. >@ $QWRQLROL3%DFKL$)DVROL(5LJKHWWL3(I¿cient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map análisis. Journal of Chromatography A, 1216 2009; 3606-3612. >@ &KRH:\0LGGHOEHUJ$6HOHFWLYH3UHFLSLWDtion of DNA by Spermine during the Chemical Extraction of Insoluble Cytoplasmic Protein. Biotechnol. Prog. 2001; 17: 1107-1113. >@ (QFKHYD9*KDUELD6:DLW5%HJXP6\ Shah H. Comparison of extraction procedures for proteome analysis of Streptococcus pneumoniae and a basic reference map. Proteomics 2006; 6: 3306–3317. Métodos de enriquecimiento de glicoproteínas bacterianas para su posterior análisis y caracterización mediante espectrometría de masas Lidia Gómez-Gascón, Alfonso Olaya, Manuel J. Rodríguez-Ortega Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Veterinaria. Universidad de Córdoba Resumen 8QDGHODVIRUPDVPiVFRPXQHVGHPRGL¿FDFLRnes postraduccionales de proteínas es la glicosilación. Se estima que más del 50% de las proteínas conocidas, así como el 80% de las proteínas de membrana, están glicosiladas. En contra de lo que se creía, se ha demostrado que los procariotas también poseen glicoproteínas. Las glicoproteínas bacterianas parecen HVWDUDVRFLDGDVDODVXSHU¿FLHGHOPLFURRUJDQLVPR Este hecho sugiere por tanto que están implicadas en la interacción de la bacteria con el hospedador y por tanto puede existir una relación directa con la capacidad patógena del microorganismo. El objeto de este estudio consiste en desarrollar una metodología, PHGLDQWHGLYHUVDVFURPDWRJUDItDVGHD¿QLGDGSDUDHO HQULTXHFLPLHQWR\SXUL¿FDFLyQGHJOLFRSURWHtQDVGH bacterias del género Streptococcus. En contra de lo que estaba establecido hasta hace unos años, recientemente se ha demostrado que los procariotas producen glicoproteínas [1]. Estas SDUHFHQ HVWDU DVRFLDGDV D OD VXSHU¿FLH GHO PLFURorganismo, lo que sugiere que están implicadas en la interacción con el hospedador y por tanto, con la capacidad patógena del microorganismo. Hay dos tipos de glicosilación en procariotas: N-glicosilación, en la cual los glicanos están unidos a un residuo de asparagina, y O-glicosilación, en la cual está unido a un residuo de serina, treonina o tirosina [1,2]. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Para el enriquecimiento de glicoproteínas, los métodos que hemos utilizado se basan en cromaWRJUDItDV GH D¿QLGDG XVDQGR OHFWLQDV DVt FRPR OD química de la hidrazida y del ácido aminofenilborónico [1,3]. /DVOHFWLQDVVRQSURWHtQDVTXHVHXQHQHVSHFt¿camente a motivos oligosacarídicos, reconociendo cada una a un subgrupo de especies de glicanos. Para asegurar el reconocimiento del mayor número de glicoproteínas, se está poniendo a punto una batería de lectinas: Canavalia ensiformis lectin (ConA), que reconoce principalmente residuos deĮPDQRVD\ĮJOXFRVDUlex europaeus lectin 8($ UHFRQRFH UHVLGXRV GH Į/IXFRVD Triticum vulgaris lectin :*$ UHFRQRFH grupos Nacetilglucosamina (GlcNAc) y ácido siálico; Arachis hypogaea lectin $+ UHFRQRFH ȕJDO! galNAc; y Bandeiraea simplivifolia lectin (BC-1) UHFRQRFHĮJDODFWRVD\ĮJDO1$F Los extractos proteicos se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%, y posWHULRUPHQWHVHWUDQV¿ULHURQDPHPEUDQDVGHQLWURFHlulosa, las cuales se bloquearon con gelatina al 3%, se hibridaron con cada una de las cinco lectinas, se incubaron con estreptavidina-HRP y se revelaron mediante quimioluminiscencia. [1,2,4]. Resultados preliminares han indicado hasta ahora que tanto la ConA como la AH son las lectinas que reconocen un mayor número de glicoproteínas ya que revelan un mayor número de bandas a partir de extractos totales (Figura 1). 111 zona. Para ello se está poniendo a punto una cromatografía con una resina de hidrazida (Bio-Rad). En primer lugar las muestras se oxidan con peryodato sódico, y después la muestra se hace pasar por la resina para permitir la formación de los enlaces hidrazona. El resto de proteínas no glicosiladas se eliminan mediante lavados. Posteriormente las glicoproteínas se digieren con tripsina y se recogen mediante lavados los péptidos generados, que corresponden a las proteínas glicosiladas, quedando los glicopéptidos unidos a la resina. Los N-glicopéptidos pueden recuperarse de la resina digiriendo con la glicosilasa PNGasa F, ya que esta enzima corta el sitio de unión del glicano a la asparagina. Para OLEHUDUORV2JOLFRSpSWLGRVVHUHDOL]DȕHOLPLQDFLyQ con dimetilamina al 26%, que convierte las serinas y treoninas glicosiladas en alanina y ácido 2-aminobutírico respectivamente [1-2-3,6]. Tras hacer pasar la tripsina por la resina para digerir las proteínas retenidas y analizar los péptidos mediante nano-LC/MS/ 06 VH LGHQWL¿FDURQ PXFKDV SURWHtQDV FLWRSODVPiWLFDV en principio no esperadas. Figura 2. Gel teñido con Coomassie de proteínas obtenidas WUDVSXUL¿FDUFRQiF$PLQRIHQLOERUyQLFRH[WUDFWRVWRWDOHV de Streptococcus pneumoniae. Calles de izquierda a dereFKDHOXLGRÀRZWKURXJKH[WUDFWRWRWDO Figura 1. Blotting con lectinas de extractos totales de Streptococcus pneumoniae. Calles de izquierda a derecha: ConA, A.H., WGA, UEA-I, BC-I. El segundo método de enriquecimiento está basado en la química de la hidrazida [6], mediante la cual dicho grupo funcional reacciona con los grupos cis-diol de los residuos de azúcares, previamente oxidados a aldehídos, para formar un enlace hidra- El tercer método consistió en la cromatografía GH D¿QLGDG XVDQGR OD TXtPLFD GHO iFLGR DPLQRIHnilborónico, que forma enlaces covalentes con los grupos cis-diol de residuos de glucosa, manosa y galactosa en condiciones de alcalinidad, dando lugar a diésteres, siendo estos enlaces reversibles en condiciones ácidas. Se usó como tampón de unión a la resina taurina 50 mM /NaOH, pH 8.7 + 20 mM MgCl2, y de elución igual al anterior pero con 50 mM Tris/HCl, pH 7.5 [1, 2, 5]. El eluido se separó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% (Figura 2), y las bandas se analizaron por 0$/',72)06LGHQWL¿FiQGRVH~QLFDPHQWHSURteínas citoplasmáticas. Además, el eluido se digirió 112 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 en solución con tripsina y se analizó mediante ESIMS/MS, dando también como resultado principalmente proteínas citoplasmáticas. Agradecimientos [3] Greis K. et al. Selective Detection and Site$QDO\VLVRI2*OF1DF0RGL¿HG*O\FRSHSWLGHV by B-Elimination and Tandem Electrospray Mass Spectrometry. Analytical Biochemistry 1996; 234: 38-49. >@ .DML+HWDO/HFWLQDI¿QLW\FDSWXUHLVRWRSH coded tagging and mass spectometry to identify N-linked glycoproteins. Nature biotechnology 2003; v.21, n.6. >@ 0R]DQR$ HW DO %RURQLF DFLGOHFWLQ DI¿QLW\ chromatography.1.Simultaneous glycoprotein binding with selective or combined elution. Anal Bioanal Chem. 2007; 389: 2097-2102. >@ =KDQJ+HWDO,GHQWL¿FDWLRQDQGTXDQWL¿FDFLRQ of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectomrtry. Nature biotechnology. 2003; v. 21, n. 6. (VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHOSUR\HFWR SAF2008-00733 del Ministerio de Ciencia e Innovación, Gobierno de España. Referencia [1] [2] Balonova L., et al. Bioanalytical tools for the discovery of eukaryotic glycoproteins applied to the analysis of bacterial glycoproteins. Expert Rev. Proteomics 2009; 6 (1): 75-85. Capote F.P. y Sanchez J.C.. Strategies for proteomic amalysis of non-enzymatically glycated proWHLQV:LOH\LQWHU6FLHQFH'2, mas.20187. Análisis de la enterotoxina A de Staphylococcus aureus en leche por ionización mediante desorción por láser asistida por matriz, acoplada a espectrometría de PDVDVGHWLHPSRGHYXHOR0$/',72) Isabel Sospedra, Carla Soler, Jose Miguel Soriano, Jordi Mañes Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Ciencias de la Alimentación, Toxicología y Medicina Legal. Facultad de Farmacia. Universitat de València Resumen Las bacterias del género Staphylococcus son microorganismos de amplia distribución, causantes de numerosas intoxicaciones alimentarias debido, en gran medida, a su capacidad de producir enterotoxinas. La enterotoxina del serotipo A es la que con más frecuencia aparece en los brotes de intoxicación alimentaria. En el presente trabajo se desarrolla una técnica de análisis de muestras de leche por MALDI-TOF para la detección de la enterotoxina $HVWD¿ORFyFLFD(VWHPpWRGRSUHVHQWDFRPRYHQtajas sobre las técnicas actualmente utilizadas su JUDQHVSHFL¿FLGDG\HOHYDGDUDSLGH]/RVUHVXOWDGRV obtenidos mostraron la efectividad de la extracción utilizada demostrando la utilidad del método de análisis utilizado. Staphylococcus aureus es una bacteria patógena, de amplia distribución en la naturaleza, asociada a infecciones generalizadas y brotes alimentarios [1]. $OJXQDVHVSHFLHVGHHVWD¿ORFRFRVVRQSURGXFWRUDV de una familia de proteínas no glicosiladas de bajo peso molecular (Mr 22-31.000) conocidas como enterotoxinasHVWD¿ORFyFLFDV6(V Estas enterotoxinas son causa de intoxicaciones alimentarias por la ingesta de productos contaminados, principalmente de origen cárnico y lácteo [2-3] destacándose la enterotoxina A [4], que es la que con mayor frecuencia se asocia a brotes de intoxicación alimentaria y que es extremadamente potente. 113 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 El presente trabajo pretende detectar la presencia de enterotoxina A en muestras de leche utilizando un método de extracción rápido y sencillo y detección por MALDI TOF. 6HXWLOL]ySDWUyQGHHQWHURWR[LQD$SDUDIRUWL¿car a dos niveles diferentes 1 ml de leche procedente de supermercados locales. La extracción de la enterotoxina se llevó a cabo por precipitación de las caseínas de la leche con diclorometano (DCM)/H2O 5% ácido acético y centrifugación (6000 rpm). Las proteínas contenidas en el sobrenadante se separaron por electroforesis 1D-SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 10% y se tiñeron con azul de Coomassie. Las zonas del gel que contenían la enterotoxina (2530KD) se cortaron y fueron sometidas a digestión WUtSWLFDFRQOD¿QDOLGDGGHREWHQHUORVIUDJPHQWRV peptídicos correspondientes a la enterotoxina A. La digestión en gel se realizó siguiendo una adaptación de protocolos estandarizados [5] con PRGL¿FDFLRQHVPHQRUHV3RVWHULRUPHQWHVHSUHSDUDron las muestras en MTP AnchorChip (BrukerDaltonics), mediante la técnica de doble gota seca (depósito de matriz y evaporación de la misma; depósito de la muestra y evaporación de la misma), utilizando ¶/GHiFLGRĮFLDQRKLGUR[\FLQDPLFRFRPR matriz, preparado a saturación en una mezcla de DFHWRQLWULORiFLGRWULÀXRURDFpWLFR¶DO (TA 0’1%) y diluido 1:2 en TA 0’1%. Las muestras (0’5 µL) fueron analizadas en un Espectrómetro de 0DVDVGHWLSR0$/',72)5HÀH[,9GH%UXNHU 'DOWRQLFV /D LGHQWL¿FDFLyQ GH ODV SURWHtQDV VH realizó utilizando el motor de búsqueda MASCOT (Matrixscience, UK). Figura 1. Imagen del aislamiento de la enterotoxina A de las proteínas del suero de la leche en gel de poliacrilamida teñido con azul de Comassie. /D)LJXUDPXHVWUDODH¿FDFLDGHOPpWRGRGHH[tracción junto con la separación por electroforesis en gel para aislar la enterotoxina de la matriz láctea. Los resultados obtenidos tras la digestión tríptica Tabla 1. 6HFXHQFLDVSHSWtGLFDVLGHQWL¿FDGDVSRU0$/',72)WUDVODGLJHVWLyQWUtSWLFDGHHQWHURWR[LQD$GH6WDSK\ORFRFcus aureus. Rango de péptidos [M + H]+calculada [M + H]+observada Secuencia de péptidos 16-27 1229.65 1230.67 SELQGTALGNLK 28-35 1119.51 1120.55 QIYYYNEK 42-55 1741.87 1742.92 ESHDQFLQHTILFK 56-74 2305.02 2306.10 *))7'+6:<1'//9')'6. 104-118 1650.71 1651.76 TACMYGGVTLHDNNR 124-134 1281.73 1282.75 .93,1/:/'*. 125-134 1153.64 1154.69 93,1/:/'*. 135-144 1127.61 1128.65 QNTVPLETVK 148-160 1512.81 1513.84 KNVTVQELDLQAR 149-160 1384.72 1385.75 NVTVQELDLQAR 167-178 1433.64 1434.66 YNLYNSDVFDGK 218-233 1912.88 1913.94 TINSENMHIDIYLYTS 114 de las bandas del gel y el análisis de los péptidos por MALDI-TOF aparecen en la Figura 2, donde se muestran los fragmentos de enterotoxina A procedentes de la leche junto con el espectro obtenido del patrón. En la muestra de leche sólo aparecen 8 GHORVIUDJPHQWRVLGHQWL¿FDGRVHQHOSDWUyQSHUR HVWRVVRQVX¿FLHQWHVSDUDFRQ¿UPDUODSUHVHQFLDGH enterotoxina A (Tabla1). Con el método propuesto VH FRQVLJXH XQD EXHQD SXUL¿FDFLyQ \ DLVODPLHQWR GH OD HQWHURWR[LQD$ DVt FRPR XQD LGHQWL¿FDFLyQ precisa de su presencia en muestras de leche. Figura 2. Espectros de masas MALDI-TOF de las digestiones con tripsina. (A) Espectro correspondiente a patrón de WR[LQDHVWD¿ORFyFLFD$%(VSHFWURFRUUHVSRQGLHQWHDOD enterotoxina A aislada de la muestra de leche. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Agradecimientos Los autores agradecen a la Conselleria de Sanitat el soporte de esta investigación. Generalitat Valenciana (072/2009). Referencias [1] Pesavento, G., Ducci, B., Comodo, N., Nostro, $/$QWLPLFURELDOUHVLVWDQFHSUR¿OHRIStaphylococcus aureus isolated from raw meat: a research for methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Food Control .2007; 18: 196-200. >@ &KLDQJ</LDR:)DQ&3DL:&KLRX C., Tsen, H. PCR detection of Staphylococcal enterotoxins (SEs) N, O, P, Q, R, U, and survey of SE types in Staphylococcus aureus isolates from food-poisoning cases in Taiwan. Int. J. Food Microbiol. 2008; 121: 66-73. [3] Ikeda, T., Tamate, N., Yamaguchi, K., Makin S. Mass Outbreak of Food Poisoning Disease Caused by Small Amounts of Staphylococcal Enterotoxins A and H. Appl. Environ. Microbiol., 2005; 71:2793-2795. >@ 'LQJHV02UZLQ36FKOLHYHUW3([RWR[LQV of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev. 2000; 13: 16-34. >@ $QGUHM6KHYFKHQNR0DWWKLDV:LOP2OH9RUP and Matthias Mann Mass, Spectrometric Sequencing of Proteins from Silver-Stained Polyacrylamide Gels, Anal. Chem. 1996; 68: 850-858. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 115 Comparación de dos técnicas proteómicas aplicadas al análisis de las proteínas de membrana de Mycoplasma genitalium Noemí Párraga-Niño1, Núria Colomé2, Francesc Canals2, Jaume Piñol1, Josep Antoni Pérez Pons1, Enrique Querol1, Mario Ferrer-Navarro3 1 Laboratorio de Biología Molecular, Instituto de Biotecnología y Biomedicina, Universidad Autónoma de Barcelona (IBB-UAB). 2Instituto de Investigación del Hospital Universitario Vall d’Hebrón. 3Laboratorio de Biología Computacional y Proteómica, Instituto de Biotecnología y Biomedicina, Universidad Autónoma de Barcelona (IBB-UAB) Los micoplasmas representan uno de los sistemas biológicos más simples descritos hasta el momento y son un buen ejemplo de célula mínima autoreplicativa. Este género se caracteriza por la ausencia de pared celular y por presentar un genoma de reducido tamaño. Las infecciones causadas por Micoplasmas suelen estar asociadas al sistema urogenital y al tracto respiratorio, provocando en muchos casos infecciones crónicas. Mycoplasma genitalium, el microorganismo de estudio en este trabajo, infecta el sistema urogenital humano provocando cervicitis en mujeres y uretritis en hombres. Es sabido que en muchos microorganismos patógenos la patogenicidad reside en proteínas expuestas en la membrana. (Q XQ HVWXGLR SUHYLR VH GH¿QLy HO SHU¿O SURWHLFR de Mycoplasma genitalium mediante 2DE. Uno de los principales problemas de la electroforesis bidimensional es la baja representación de proteínas de PHPEUDQD&RQHOREMHWLYRGHLGHQWL¿FDUSURWHtQDV de membrana de M. genitalium se han aplicado dos metodologías proteómicas diferentes con su posterior comparación. Las metodologías utilizadas en este estudio han sido el fraccionamiento de las proteínas hidrofóbicas en Tritón X-114 y posterior 2DE, y el PDUFDMH HVSHFt¿FR GH ODV UHJLRQHV H[SXHVWDV HQ OD membrana con biotina, su captura con estreptavidina LQPRYLOL]DGD\ODSRVWHULRULGHQWL¿FDFLyQPHGLDQWH LC-MS/MS. La aplicación de estas técnicas ha perPLWLGRQRVyORLGHQWL¿FDUSURWHtQDVGHPHPEUDQDGH este microorganismo sino también comparar ambos métodos para poder discutir las ventajas e inconvenientes de cada uno de ellos. 116 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Comparative proteomic analysis of collection and clinical-isolate strains of Stenotrophomonas maltophilia Mario Ferrer-Navarro1, Elias Mongiardini1, Gerard Torrent1, Raquel Planell1, Ana Calderón3, Teresa Falgueras,3 Isidre Gibert,1 Xavier Daura1,2 1 Institut de Biotecnologia i de Biomedicina (IBB), Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), E-08193 Cerdanyola del Vallès (Barcelona). 2Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), E-08010 Barcelona. 3Hospital Municipal de Badalona, Badalona Serveis Assistencials, E-08911 Badalona (Barcelona) Stenotrophomonas maltophilia is a Gram-negative pathogen with emerging nosocomial incidence [1]. It has been associated with several clinical syndromes, primarily in relation to the opportunistic infection of immunocompromised patients. Although not an inherently virulent pathogen, its ability to colonise respiratory-tract epithelial cells and medical-device surfaces makes it a ready coloniser of hospital settings. Antibiotic treatment of S. maltophilia is greatly hampered by extensive drug resistance [2]. Besides PRUH VSHFL¿F UHVLVWDQFH PHFKDQLVPV LWV FDSDFLW\ WR IRUP ELR¿OPV FRQIHUV WKH EDFWHULXP DGGLWLRQDO protection in front of the immune system, antibiotics and disinfectants [3]. The genomes of two different strains have been recently sequenced and compared [4] but no expression-pattern studies have been performed yet. In this communication, we present a comparative proteome analysis of four strains with different infective capacities, ATCC 13637 and the new clinical isolates M30, UV74 and E77. 0DWHULDOV0HWKRGV centrifuged. DIGE labeling: Samples were labeled as follows: Clinical strains with Cy3 (green), ATCC 13637 strain with Cy5 (red) and the internal standard with Cy2 (Blue). 50 µg of each sample were mixed and the resulting 150 µg were loaded onto the IPG strips. 2-D Gel Electrophoresis: The IPG strips were 24cm long and the pH range was from 3 to 10 lineal and 4 to 7. The sample was loaded with the cup-loading system. The second dimension was performed in 12.5% polyacrylamide gels. Gels were performed in triplicate for statistical analysis. Image analysis: Images were acquired immediately using a Typhoon scanner (GE Healthcare) and the image analysis was carried out with Samespots software (Nonlinear dynamics). In-Gel Tryptic Digestion: After image analysis silver staining of the gels was performed. The selected spots were excised from the acrylamide gel, and immediately destained and digested. MALDI-MS Analysis:ȝORIVDPSOHZDV PL[HG ZLWK ȝO RI +&&$7KLV PL[WXUH ZDV DQDO\]HGZLWKDQ8OWUDÀH[0$/',72)%UXNHU)RU PMF analysis, the MASCOT search engine (Matrix Science) was used with the following parameters: one missed cleavage permission, 50 ppm measurePHQWWROHUDQFHDQGDWOHDVW¿YHPDWFKLQJSHSWLGH masses. In the searches, methionine oxidation and cystein carbamidomethylation were taken into acFRXQWDVYDULDEOHPRGL¿FDWLRQV Bacterial strains and growth Three new S. maltophilia strains were isolated. M30 from a patient with decubitus ulcer. E77 from sputum and UV74 from patient with a vascular ulcer .ATCC 13637 and clinical isolated S. maltophilia strains were cultured in LB media to reach exponential growth. Total protein extract: 20ml of culture were washed with PBS and resuspended in lysis solution (8M urea, 2M thiourea, 2.5% CHAPS, 2% ASB-14, 40mM Tris-HCL pH 8.8, 0.5% IPG). Then, samples were disrupted by sonication and Conclusions A differential expression analysis of the proteomes of newly isolated clinical strains of S. maltophilia and the laboratory strain ATCC 13637 has been performed (Figure 1). Eye-inspection of the gel images readily suggests the existence of substantial differences between the two proteomes under the exSHULPHQWDOFRQGLWLRQV7KHLGHQWL¿FDWLRQRIGLIIHUHQtially expressed proteins in these strains shall provide 117 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 the basis for the interpretation of their phenotypic differences at a biomolecular level, with a special focus on infection and resistance mechanisms. LQIHFWLRQ2WKHULGHQWL¿HGSURWHLQVDUHLQYROYHGLQ protein synthesis (Spot nº 3, 4, 5, 13 and 17) and in amino acid metabolism (spot nº 12, 15 and 20). $FNQRZOHGJHPHQWV AntiPathoGN is supported by funding under the Seventh Research Framework Programme of the European Union (ref. HEALTH-F3-2009-223101). The Authors thank Francesc Canals, from Unitat de Proteòmica of Hospital Vall d’Hebron for his valuable advice on image adquisition. References >@ /RRQH\:-01DULWDDQG.0KOHPDQQ Stenotrophomonas maltophilia: an emerging opportunist human pathogen. The Lancet Infectious Diseases 2009; 9:312. [2] Nicodemo, A. C., and J. I. Paez.. Antimicrobial therapy for Stenotrophomonas maltophilia infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2007; 26:229-37. [3] Doroti de, O.-G., D. A. Monique, R. Mónica, C. G. S. A. Ana, A. Norma, B. M. Marina, and A. G. Jorge. Fimbriae and adherence of Stenotrophomonas maltophilia to epithelial cells and to abiotic surfaces. Cellular Microbiology 2003; 5:625-636. [4] Rocco, F., E. De Gregorio, B. Colonna, and P. P. Di Nocera. Stenotrophomonas maltophilia genomes: A start-up comparison. International Journal of Medical Microbiology In Press, Corrected Proof. Figure 1. DIGE of the M30 and the ATCC 13637 S. maltophilia strains On average, around 1500 spot features were detected on each analytical gel. Statistical analysis of gels allowed the detection of about 300 spots with VLJQL¿FDQWFKDQJHVEHWZHHQWKHFOLQLFDOLVRODWHVDQG $7&&VWUDLQV:HKDYHLGHQWL¿HGGLIIHUHQWLDOO\ expressed proteins. Interestingly, some of these proteins (Spot nº 9, 16 and 21) are involved in the fatty acid metabolism. Moreover, a protein involved in the poliketide sugar unit biosynthesis has also been LGHQWL¿HG 6SRW Q 7KH XSUHJXODWLRQ RI WKHVH proteins in the some of the clinical strains suggests a different membrane lipopolysaccharide composiWLRQ ZKLFK LQ WXUQ FRXOG EH UHODWHG ZLWK ELR¿OP formation and pathogenesis. A number of proteases are upregulated in the clinical strains (Spot nº 2, 14, 22 and 23) that could also be potentially relevant to 118 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 B) Proteómica de Hongos Análisis comparativo del proteoma de una cepa industrial de Saccharomyces cerevisiae en dos condiciones de cultivo Carlos Luna1, Teresa García-Martínez1, Miguel Curto2, Juan Carlos Mauricio1 1 Departamento de Microbiología. 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de &yUGRED&DPSXVGH5DEDQDOHV(GL¿FLR6HYHUR2FKRD La levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de los organismos modelo utilizados en Biología Molecular, y además es un organismo que tiene un gran valor comercial. La mayoría de los estudios sobre proteómica de levadura se ha realizado sobre cepas de laboratorio, y existen pocos datos sobre levaduras de interés industrial. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo anaerobio facultativo. Durante el proceso de fermentación, la levadura se adapta ¿VLROyJLFDPHQWHDGLVWLQWRVHVWUHVHVFRPRVRQHOHvada presión osmótica, agotamiento de la fuente de carbono como la glucosa y la aparición de etanol, que le es tóxico. Durante la fermentación alcohólica, &KHQJ\FRODERUDGRUHV>@KDQLGHQWL¿FDGRHQ]LPDV implicadas en las rutas de las pentosas fosfato, glicolisis, gluconeogénesis, biosíntesis del glicerol y también proteínas de choque térmico. El objetivo de HVWHHVWXGLRKDVLGRFRPSDUDUHOSHU¿OSURWHyPLFR de una levadura industrial en dos medios de cultivo: medio fermentativo con glucosa y medio oxidativo con glicerol y etanol. La levadura Saccharomyces cerevisiae G1, aislada de un vino de la D.O Montilla-Moriles, creció en dos condiciones: en un medio fermentativo, medio completo YPD compuesto por 17% de glucosa, 1% de extracto de levadura, 2% peptona bacteriológica; y en un medio oxidativo formado por 0.67% de YNB, ácido glutámico 10mM, 1% de glicerol y 15% de etanol. Finalizado el experimento, las células de levadura se recogieron por centrifugación a 3.000 x g a 4º C durante 10 minutos. Posteriormente, se realizó una lisis física con bolas de vidrio y una lisis química con 20 ml totales de tampón de extracción compuesto por tampón Tris 100 mM, a pH 8,0, PMSF 1mM, EDTA1 mM, DTT2 mM, y un cóctel de inhibidores de proteasas (Roche). El extracto de proteínas se precipitó con TCA-Acetona-DTT 0.07% durante 24 horas a -20ºC. Se resuspendió en tampón de solubilización (Urea 8M, 2% CHAPS \ '77 P0 /D FXDQWL¿FDFLyQ GH SURWHtQDV VH determinó mediante el método Bradford [2]. IEF2D: Se utilizaron tiras con gradientes de pH inmovilizados (IPG) de 17 cm, de gradiente no lineal 3-10, (Bio-Rad). Se rehidrataron pasivamente durante 2 horas con 500 µg de proteína en 300 µL de tampón de solubilización (Urea 8M; 2% CHAPS; 0,5% tampón IPG 5-8, 3-10, 30 mM DTT, y azul de bromofenol 0.01%) [3]. Las tiras se cargaron en IEF CELL (Bio-Rad) para ser enfocadas por su SXQWRLVRHOpWULFRFRQXQSURJUDPDHVSHFt¿FR/RV geles de poliacrilamida al 13% fueron sometidos a electroforesis en PROTEAN II CELL. Los geles fueron teñidos con azul de coomassie G-250 durante 24 h por el método descrito por Mathesius y colaboradores [4]. Las imágenes fueron adquiridas con un densitómetro GS-800 calibrado y se analizaron con el software PDQuest 8.0.1 (Bio-Rad). Se calcularon los puntos isoelétricos según la distribución de las tiras, y los pesos moleculares según el patrón GHSHVRVREWHQLGRV\UHÀHMDGRVHQORVJHOHVFRQORV marcadores correspondientes. Ciertos spots obtenidos tanto en fermentación como en medio oxidativo están secuenciados mediante MALDI-TOF/TOF en el Centro de Genómica y Proteómica - Unidad de Proteómica - Facultad de Farmacia. Universidad &RPSOXWHQVHGH0DGULG3DUTXH&LHQWt¿FRGH0Ddrid (UCM-PCM). Hemos obtenidos 477±20 spots en geles de fermentación. En el caso geles de medio oxidativo se KDQFXDQWL¿FDGRVSRWVWRWDOHV 6HKDQLGHQWL¿FDGRVSRWVTXHHVWiQSUHsentes tanto en los geles correspondientes al medio de fermentación como en los geles pertenecientes al medio oxidativo, éstos son los spots comunes. Se ha observado que la expresión de los spots en geles de medio oxidativo está mucho menos acen- 119 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 tuada que en los geles de fermentación, así como que el número total de spots expresados es menor que en el caso de fermentación. Se ha comprobado que las proteínas en ambos geles bidimensionales pertenecen fundamentalmente a la glicolisis, gluconeogénesis y biosíntesis de glicerol. Por otro lado, se han encontrado proteínas expresadas en medio oxidativo que no están presentes en medio de fermentación. Estas proteínas se relacionan con el estrés oxidativo y actualmente están siendo estudiadas. La mayoría de las proteíQDVFXDQWL¿FDGDVVHHQFXHQWUDQHQODEDVHGHGDWRV de SwissProt de Saccharomyces cerevisiae (www. expasy.ch/sprot). Agradecimientos (VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHO0LQLVWHULR de Ciencia e Innovación (INIA) proyecto RTA200800056-C02-02 y FEDER. Referencias [1] Cheng JS, Qiao B, Yuan YJ. Comparative proteome analysis of robust Saccharomyces cerevisiae insights into industrial continuous and batch fermentation. Appl Microbiol Biotechnol 2008; 81:327-338. [2] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976;72:248-254. [3] Kolkman A, Slijper M, J.R. Heck A. Development and application of proteomics technologies in Saccharomyces cerevisiae. Trends in Biotechnol 2005; 23:12. >@ 0DWKHVLXV8.HLM]HUV61DWHUD+$:HLQPDQ JJ, Djordjevic MA, Rolfe BG. Establishment of a root proteoma reference map for the model legume Medigaco trunculata using the expressed sequence tag database for peptide mass ¿QJHUSULQWLQJ3URWHRPLFV Estudio proteómico comparativo de células de Saccharomyces cerevisiae libres y bioinmovilizadas Teresa García-Martínez, Juan Carlos Mauricio 'HSDUWDPHQWRGH0LFURELRORJtD8QLYHUVLGDGGH&yUGRED&DPSXVGH5DEDQDOHV(GL¿FLR6HYHUR2FKRD Tradicionalmente, la levadura Saccharomyces cerevisiae se ha usado en alimentación, principalmente por su producción de etanol en bebidas alcohólicas durante miles de años. La avanzada biotecnología de las células inmovilizadas en procesos fermentativos de interés aporta una serie de ventajas técnicas y económicas frente a los sistemas convencionales de células libres [1]. Nuestro grupo de investigación ha puesto a punto un sistema de bioinmovilización que consiste en una co-inmovilización espontánea de un KRQJR¿ODPHQWRVRPenicillium chrysogenum H3) y una levadura (Saccharomyces cerevisiae G1), en ausencia de compuestos químicos de unión y de soporWHVH[WHUQRVPHGLDQWHODFUHDFLyQDUWL¿FLDOPHQWHGH condiciones adecuadas para favorecer una simbiosis [2]. Al inmovilizado creado, que son esferas huecas de ambos microorganismos, lo hemos denominado “biocápsulas de levadura”, y éstas pueden ser aplicadas a diversos procesos fermentativos. El objetivo de este trabajo ha sido realizar un estudio proteómico comparativo entre las células de levadura en forma libre y en forma bioinmovilizada en el medio de formación de las biocápsulas de levadura. Los microorganismos usados en este estudio han sido una cepa de Saccharomyces cerevisiae var. capensis G1, aislada de un vino bajo crianza biológica de la D.O. Montilla-Moriles y un hongo, Penicillium chrysogenum H3, aislado del ambiente. El medio de cultivo y las condiciones en las que se produjo la bioinmovilización fueron: medio YNB que contiene ácido glucónico como fuente de carbono, amonio como fuente de nitrógeno y tamponado a pH 7. Dos matraces Erlenmeyer de 250 mL con 150 mL de medio de formación de biocápsulas se inocularon con 4 x 106 células de G1/mL y un asa de siembra del hongo H3. Se incubaron a 28ºC en un agitador orbital a 200 rpm durante 7 días, formándose durante este 120 tiempo las biocápsulas de levadura. Para el estudio de las células de levadura libres se procedió de la misma PDQHUDVLQODLQRFXODFLyQGHOKRQJR¿ODPHQWRVR/DV células de levadura inmovilizadas se extrajeron del inmovilizado por rotura mecánica y agitación vigorosa en una solución de NaCl 100 mM, posteriormente las células de levadura se separaron de las hifas SRUGRV¿OWUDFLRQHVVXFHVLYDVSULPHURSRUXQ¿OWUR Millipore de 180 µm y después por otro de 30µm). Ambos tipos de células de levadura se recogieron por centrifugación a 3000 x g a 4º C durante 10 minutos. La lisis celular tanto de las células de levadura libres como las procedentes del inmovilizado se realizó en un Vórtex- Genie2 con DTT, bolas de vidrio, y los tampones 1 y 2 necesarios para la extracción de las proteínas. Tampón 1: SDS (5%); TRIS-HCl (0.5 M); pH 7.5 y tampón 2: Thiourea (2 M); urea (7 M); CHAPS (4 %); DTT (1%); Pharmalite 3-10 (2 %) [3]. La precipitación de proteínas se hizo con Tricloroacético (TCA) al 10% diluido en acetona fría. La concentración de proteínas de los extractos celulares se determinó mediante el método descrito por Bradford [4]. Se realizó una electroforesis bidimensional: para la primera dimensión se utilizaron tiras IPG de 17 cm, con gradiente de pH no lineal +N3-10 (Bio-Rad) fueron rehidratadas con 150 µg de proteína en 300 µL de tampón de solubilización. El isoelectroenfoque se llevó a cabo en un PROTEAN IEF CELL (Bio-Rad) a una corriente constante de 50 µA per tira hasta 40 000 Vh. Para la segunda dimensión (SDS-PAGE), las proteínas se separaron en geles al 13% de poliacrilamida en un PROTEAN II CELL. Los geles corrieron a una corriente constante a 60 mA per gel. Los geles preparativos fueron teñidos con CBB G-250 [5] 0HUFN*HUPDQ\/DLGHQWL¿FDFLyQGHODVSURWHtQDV se realizó en la Unidad de Proteómica, de la UCO, miembro de ProteoRed, usando MALDI-TOF para VXLGHQWL¿FDURQHQOD%DVHGH'DWRVGH6ZLVV3URW\ Trembl del Proteoma de Levaduras de S.cerevisiae, (www.expasy.ch/sprot). Los geles se analizaron mediante el programa PD-Quest 8.0.1 (Bio-Rad). Después de 7 días, la levadura libre en el medio de formación de biocápsulas solamente se dividió una vez (una generación), lo que era de esperar puesto que este medio no es fermentativo para la levadura. Sin embargo, la levadura inmovilizada creció algo más, VHJXUDPHQWHDH[SHQVDVGHOKRQJR¿ODPHQWRVR El número de spots encontrados en los geles de las células libres de levadura fue aproximadamente del doble de los observados en los geles de las células de levadura inmovilizadas. Esta gran disminución 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 en el nivel de proteínas de las células inmovilizadas puede ser debido a que la levadura reduzca su sínWHVLVSRUTXHYLYHDH[SHQVDVGHOKRQJR¿ODPHQWRVR en forma de simbiosis. La totalidad de las proteínas FXDQWL¿FDGDV VH HQFXHQWUDQ HQ OD EDVH GH GDWRV GH SwissProt de Saccharomyces cerevisiae y en ambos casos abundan las proteínas de la glicolisis. En células bioinmovilizadas, se observa una disminución de proteínas básicas de bajo peso molecular. En la actualidad, se está continuando con el análisis de proteínas de estos geles en estas dos condiciones ensayadas. En conclusión, el análisis proteómico de ambos geles bidimensionales muestra una disminución importante del número de spots en las células de levaGXUDFRLQPRYLOL]DGDVFRQHOKRQJR¿ODPHQWRVR/D mayor disminución corresponde a proteínas básicas de bajo peso molecular. Agradecimientos (VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHO0LQLVWHULR de Ciencia e Innovación (INIA) proyecto RTA200800056-C02-02 y FEDER. Referencias [1] Kourkoutas Y, Bekatorou A, Banat IM, Marchant R, Koutinas AA. Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages production: a review. Food Microbiol 2004;21:377-397. [2] Peinado RA, Moreno JJ, Villalba JM, González-Reyes JA, Ortega JM, Mauricio JC. Yeast biocapsules: A new immobilization method and their applications. Enz Microb Technol 2006;40:79-84. [3] Khoudoli GA, Porter IM, Blow JJ, Swedlow, R. Optimisation of the two-dimensional gel electrophoresis protocol using the Taguchi approach. Proteome Sci 2004;2:6. [4] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976;72:248-254. >@ 0DWKHVLXV8.HLM]HUV61DWHUD+$:HLQPDQ JJ, Djordjevic MA, Rolfe BG. Establishment of a root proteoma reference map for the model legume Medigaco trunculata using the expressed sequence tag database for peptide mass ¿QJHUSULQWLQJ3URWHRPLFV 121 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 (VWXGLR FRPSDUDWLYR GHO SHUILO SURWHLFR GH FHSDV VLOYHVWUH %< \ PXWDQWHWUNGHSaccharomyces cerevisiae en condiciones de ayuno en K+ Miguel Curto1, Clara Navarrete2, Luis Valledor3, María Luisa Hernández4, José Ramos2, Jesús Jorrín1 1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, 14071 Córdoba, España. Departamento de Microbiología, Universidad de Córdoba, Córdoba, España. 3 Departamento de Biología de 2UJDQLVPRV\6LVWHPDVÈUHDGH¿VLRORJtDYHJHWDO8QLYHUVLGDGGH2YLHGR2YLHGR(VSDxD4Departamento GH 0LFURELRORJtD ,, )DFXOWDG GH IDUPDFLD 8QLYHUVLGDG &RPSOXWHQVH GH 0DGULG 3DUTXH &LHQWt¿FR GH Madrid (UCM-PCM). Madrid, España. 2 Resumen Se ha llevado a cabo el estudio comparativo del proteoma de las cepas silvestre (BY4741) y mutante (trk1,2) de Saccharomyces cerevisiae en condiciones limitantes de K+, utilizando electroforesis bidimensional acoplada a MS. En respuesta al ayuno en K+ se observó un marcado descenso del contenido en proteínas en extractos celulares y del número de spots en geles bidimensionales, tanto en la variedad silvestre como la mutante. Los spots que presentaron diferencias cualitativas o cuantitativas, estadísticaPHQWH VLJQL¿FDWLYDV HQWUH FHSDV VH DQDOL]DURQ SRU espectrometría de masas (MALDI-TOF-TOF). Tras ODLGHQWL¿FDFLyQPHGLDQWHE~VTXHGDHQEDVHGHGDWRV (UniProtKB-SwissProt; limitada a la taxonomía de Saccharomyces cerevisiae (Baker’s yeast)) las proteínas se agruparon de acuerdo a su función. El ayuno en potasio causó una disminución en enzimas del metabolismo energético y del metabolismo de aminoácidos, así como a proteínas de respuesta a estrés. Este trabajo forma parte del proyecto TRANSLUCENT (http://www.translucent-network.org/), cuyo objetivo es analizar los mecanismos implicados en la homeostasis catiónica [1] usando como sistema modelo S. cerevisiae. Mediante una aproximación de proteómica de expresión diferencial basada en electroforesis bidimensional, se ha LQWHQWDGR LGHQWL¿FDU FDPELRV HQ HO FRQWHQLGR HQ proteínas como resultado de la doble mutación en ORVJHQHVTXHFRGL¿FDQSURWHtQDVWUDQVSRUWDGRUDVGH K+ (TRK1 y TRK2) [1], y en condiciones de ayuno en K+. En un trabajo preliminar, el proteoma de las dos cepas (silvestre y doble mutante) se comparó en las fases exponencial y estacionaria de la curva de crecimiento, con concentraciones óptimas (50 mM ClK) de K+ en el medio [2]. Se realizaron extracciones de proteínas [3] y geles bidimensionales (IEF en el rango de pH 5-8; SDS-PAGE 12 %; tinción con &RRPDVVLHFRORLGDO>@GH:7\trk1,2 a 0 (control), 30, 60, 180 y 300 tras la eliminación del K+. Se detecto un descenso progresivo con el tiempo de ayuno tanto en el contenido en proteínas del extracto como en el número de spots resueltos, siendo este efecto más acusado en la cepa mutante que en la silvestre (Figura 1). Se picaron los spots que mostraron diferencias cualitativas o cuantitativas, estadísticamente VLJQL¿FDWLYDVHQWRWDOVHVRPHWLHURQDGLJHVWLyQ tríptica, analizándose los péptidos resultantes por MS (MALDI-TOF-TOF). Tras la búsqueda en bases de datos (UniProtKB-SwissProt; limitada a la taxonomía de Saccharomyces cerevisiae (Baker’s yeast)) XWLOL]DQGRHOVRIWZDUH0$6&27>@VHLGHQWL¿FDURQ 171 proteínas, que se agruparon según su función (Figura 2). El ayuno en potasio causó una disminución en enzimas del metabolismo energético y del metabolismo de aminoácidos, así como a proteínas GHUHVSXHVWDDHVWUpV(QWUHODVSURWHtQDVLGHQWL¿FDdas, las relacionadas con el estrés y/o reacciones de defensa, metabolismo de nucleótidos y transcripción, fueron las que presentaron mayores cambios entre cepas, siendo más abundantes en la cepa silvestre. Agradecimientos Agradecemos el trabajo desarrollado, por la Dra. Hanna Sychrova (Departamento del transporte de PHPEUDQD,QVWLWXWRGH¿VLRORJtD5HSXEOLFD&KHFD Praga), con las cepas de S. cerevisiae usadas en este trabajo. Así como al proyecto “Gene interaction networks and models of cation homeostasis in Saccharomyces cerevisiae –TRANSLUCENT” por ¿QDQFLDUHVWHWUDEDMR 122 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Referencias [1] Rodríguez-Navarro A y Ramos J. Dual system for potassium transport in Saccharomyces cerevisiae. Journal of bacteriology, 1984; 159: 940-45. [2] Curto M, Ramos J, Gutierrez L, Gil C, Jorrin J, Proteome analysis of Saccharomyces cerevisiae wild and potassium transport-affected mutant strains. Joint congreess of the spanish society and the latin american human proteome organization. 2009 ; Pamplona. [3] Damerval C, De Vienne D, Zivy M, Thiellement H. Technical improvements in two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling proteins. Electrophoresis, 1986; 7: 52–54. >@ 0DWKHVLXV8.HLM]HUV*1DWHUD6+$:HLQPDQ JJ, Djordjevic MA, Rolfe BG. Establishment of a root proteome reference map for the model legume Medicago truncatula using the expressed VHTXHQFHWDJGDWDEDVHIRUSHSWLGHPDVV¿QJHUprinting. Proteomics 2001; 1: 1424–40. [5] Perkins DN, Pappin DJC, Creasy DM, Cottrell JS. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis, 1999; 20: 3551-67. Figura 1. A. Contenido en proteínas en extractos de la cepa silvestre y doble mutante a distintos tiempos tras la eliminación de K+ del medio. B. Número de spots resueltos en dichos extractos, en el rango de pH 5-8 y Mr 6-95 KDa. Figura 2. Agrupación funcional de las proteínas afectadas por el ayuno en potasio. A. Cepa silvestre; B. Doble mutante. Datos expresados en porcentaje. 123 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Análisis mediante 2D-DIGE de la interacción con sangre de una cepa de Saccharomyces cerevisiae potencialmente patógena aislada de suplementos dietéticos Carolina Hernández-Haro, Lucía Monteoliva, Gloria Molero, Concha Gil, María Molina Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia (UCM). Plaza Ramón y Cajal s/n, Madrid, Spain. La levadura Saccharomyces cerevisiae es conocida por su papel en la elaboración de pan y de bebidas alcohólicas tales como el vino, la cerveza o la sidra. Además, esta levadura es también consumida en forma de suplementos dietéticos y de probióticos lo que implica el consumo de las células GH OHYDGXUD YLYDV /RV HIHFWRV EHQH¿FLRVRV HQ HO hospedador derivados de este consumo son conocidos; sin embargo, no se han estudiado los posibles efectos indeseables, sin duda debido a que S. cerevisiae se ha considerado siempre un microorganismo seguro para uso alimentario. En los últimos años, la bibliografía clínica muestra que la incidencia de infecciones causadas por S. cerevisiae ha aumentaGRGHPDQHUDVLJQL¿FDWLYDHQSDFLHQWHVLQPXQRGHprimidos [1], por lo que actualmente S. cerevisiae se incluye en el grupo de “patógenos oportunistas emergentes” [2-3]. Para estudiar la posible relación entre la ingesta de células vivas de S. cerevisiae, a través del consumo de suplementos dietéticos y probióticos, y las infecciones en humanos, se probó la virulencia de diferentes cepas en modelo murino de infección sistémica observándose un 50% de muerte de ratones con una de las cepas, por lo que se planteó el análisis de los posibles rasgos de virulencia asociados a estos S. cerevisiae patógenos [4]. El REMHWLYRGHHVWHWUDEDMRHVODLGHQWL¿FDFLyQGHSURteínas potencialmente implicadas en la virulencia, para lo cual se ha realizado un estudio comparativo de la expresión diferencial mediante el sistema 2DDIGE de proteínas de extractos citoplasmáticos de una cepa procedente de dichos suplementos dietéticos caracterizada como virulenta y una cepa de laboratorio avirulenta. Las muestras se obtuvieron tras la interacción de las células de levadura con sangre humana a distintos tiempos (0, 1.5 y 3 horas) a 37ºC y en condiciones semiaeróbicas. Se utilizó la sangre humana debido a que la diseminación de la levadura en el torrente sanguíneo constituye una etapa esencial para el desarrollo de infección sistémica. Los extractos de proteína de tres réplicas biológicas VHPDUFDURQFRQORVÀXRURFURPRV&\R&\\HO estándar interno con Cy2 y se separaron en 9 geles TXHWUDVODGHWHFFLyQGHÀXRUHVFHQFLDVHDQDOL]DURQ con el módulo BVA (Biological Variation Analysis) del software DeCyder. Se realizaron comparaciones entre cepas y entre tiempos de interacción con sangre mediante análisis 2-ANOVA detectándose: 43 manchas proteicas de expresión diferencial al comparar los distintos tiempos (2-ANOVA-condición WLHPSR GHODVFXDOHVVHKDQLGHQWL¿FDGR 25, 391 manchas proteicas al comparar las 2 cepas (2-ANOVA-condición cepa < = 0.05) de las cuales VH KDQ LGHQWL¿FDGR \ PDQFKDV SURWHLFDV DO comparar las distintas cepas en los distintos tiempos (2-ANOVA-interacción < = 0.05) de las cuales se KDQ LGHQWL¿FDGR (QWUH HVWDV SURWHtQDV VH HQcuentran proteínas metabólicas, chaperonas y ATP sintasas. Además, podemos destacar que entre las SURWHtQDVGHH[SUHVLyQGLIHUHQFLDOLGHQWL¿FDGDVWDPbién se encuentran proteínas de la sangre. Esto podría ser debido a una fuerte unión de estas proteínas DODVOHYDGXUDV$FWXDOPHQWHVHHVWiQLGHQWL¿FDQGR el resto de las proteínas de expresión diferencial. Carolina Hernández Haro es becaria FPI del 0,&,11(OWUDEDMRHVWi¿QDQFLDGRSRUHOSUR\HFWR AGL2006-12710-C02-02/ALI de la DGICYT del MEC. Proyecto coordinado con el grupo de investigación de las Dras. Amparo Querol y Mª Teresa Fernández-Espinar del IATA (Valencia). Referencias [1] Enache-Angoulvant A y Hennequin C. Invasive Saccharomyces infection: a comprehensive review. Clin Infect Dis 2005;41:1559-68. [2] Murphy A y Kavanagh K. Emergence of Saccharomyces cerevisiae as a human pathogen, Implications for biotechnology. Enz Microbial Technol 1999;25:551-7. [3] Muñoz P, Bouza E, Cuenca-Estrella M, Eiros J M, Pérez M J, Sánchez-Somolinos M et al. Saccharomyces cerevisiae fungemia: an emerging infectious 124 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 disease. Clin Infect Dis 2005;40:1625-34. [4] De Llanos R, Querol A, Permán J, Gobernado M y Fernández-Espinar M T. Food and probiotic strains from Saccharomyces cerevisiae species as a possible origin of systemic infection. Int J Food Microbiol 2006;110:286-90. Análisis comparativo de diferentes aproximaciones para el estudio del proteoma de Saccharomyces cerevisiae Dolores Gutiérrez1, Mª Luisa Hernaéz1, Montserrat Martínez-Gomariz1, María Posada1, Concha Gil2 1 2 8QLGDGGH3URWHyPLFD8QLYHUVLGDG&RPSOXWHQVHGH0DGULG3DUTXH&LHQWt¿FRGH0DGULG8&03&0 Departamento de Microbiología II. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid En los últimos años el gran desarrollo de los espectrómetros de masas y las técnicas de fraccionamiento de péptidos y proteínas ha permitido el estudio de muestras complejas de proteínas. A pesar de ello aún estamos lejos de conseguir el análisis completo de proteomas o subproteomas. Saccharomyces cerevisiae es un organismo modelo desde el inicio en proteómica, para estimar la capacidad real de una tecnología dada en el estudio profundo de un proteoma. Además, cuando esta levadura esta creciendo en fase logarítmica hay evidencias de que más de 4500 proteínas son expresadas en un amplio rango dinámico, desde 100 copias por célula para aquellas proteínas menos abundantes hasta millones de copias por célula para las proteínas más abundantes. En la actualidad, se ha cubierto más del 50% de su proteoma, aplicando diferentes combinaciones de fraccionamiento y diferentes equipamientos de espectrometría de masas [1] La electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D-PAGE) ha demostrado ampliamente su utilidad en la capacidad de separación de proteínas aportando gran información acerca del contenido proteico celular [2]. Sin embargo, presenta algunas desventajas importantes, como la limitada cantidad de muestra que se puede cargar en el gel, y la inadecuada resolución de proteínas hidrofóbicas o de elevado peso molecular. AlterQDWLYDPHQWH ODV WpFQLFDV FURPDWRJUi¿FDV SDUD OD separación de péptidos y proteínas permiten reducir la complejidad de la muestra y aumentar el número GHSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDV La técnica de separación mediante isoelectroenfoque en solución resuelve proteínas o péptidos en función de su punto isoeléctrico (pI). Las fracciones resultantes están en solución lo que permite acoplarlas a un segundo paso de fraccionamiento como cromatografía líquida y su posterior análisis por espectrometría de masas en tandem (MS/MS). Esta metodología parece altamente efectiva y reproduciEOHVLHQGRLQFOXVRFRPSDWLEOHFRQODFXDQWL¿FDFLyQ de proteínas por marcaje con iTRAQ [3]. En este trabajo hemos diseñado cuatro aproximaciones proteómicas diferentes en los que se combinan diversas técnicas de fraccionamiento y análisis por espectrometría de masas para comparar la capacidad de las distintas estrategias para la caracterización del proteoma de esta levadura (Figura 1). Los experimentos se detallan a caontinuación: Experimento 1: Proteínas intactas son separadas mediante isoelectroenfoque, utilizando tiras de 12 cm con un rango de PH de 3-10 con una resolución de 0.6, seguido de digestión tríptica de cada fracción y nano-RP-HPLC acoplada on-line a ESI-MS/MS (LTQ) y off-line a MALDI-MS/MS (4800 MALDI72)72)GH$SSOLHG%LRV\VWHPVSDUDODLGHQWL¿FDción de proteínas. Experimento 2: Digestión tríptica del extracto proteico seguido de separación de los péptidos según pI mediante Off-Gel usando las mismas tiras que para la separación de proteínas. Las diferentes fracciones se separaron mediante RP-HPLC acoplado a MS/MS de la misma manera que en el experimento 1. Experimento 3: Digestión de proteínas seguida de cromatografía bidimensional off-line (SCX y nano-RP-HPLC) acopladas a espectrometría 125 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figura 1. Esquema de trabajo de los cuatro experimentos de masas en tandem en la misma forma que los experimentos anteriores. Experimento 4: Separación de proteínas mediante SDS-PAGE. Se corta el gel en 12 bandas, cada una de éstas se digiere por separado y los péptidos extraídos se analizan mediante nanoRP-HPLC y espectrometría de masas en tandem como se ha detallado anteriormente. /D ¿QDOLGDG GH HVWH HVWXGLR HV FRPSDUDU HO efecto de las cuatro estrategias en relación a la LGHQWL¿FDFLyQ GHO SURWHRPD GH S. cerevisiae y analizar la capacidad de las distintas técnicas de fraccionamiento para detectar proteínas de baja abundancia. Este estudio nos facilitará información para decidir cuál es la aproximación de elección, con la tecnología que disponemos, para el análisis de mezclas complejas. Agradecimientos El análisis proteómico se ha realizado en la Unidad de Proteómica de la UCM-PCM, miembro de Proteored. Referencias [1] de Godoy LM, Olsen JV, de Souza GA, Li G, Mortensen P y Mann M. Status of complete proteome analysis by mass spectrometry: SILAC labeled yeast as a model system. Genome Biol 2006;7:R50. [2] Perrot M, Moes S, Massoni A, Jenoe P y Boucherie H. Yeast proteome map (last update). Proteomics 2009;9:4669-73. [3] Chenau J, Michelland S, Sidibe J y Seve M. Peptides OFFGEL electrophoresis: a suitable pre-analytical step for complex eukaryotic samples fractionation compatible with quantitative iTRAQ labeling. Proteome Sci 2008;6:9. 126 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Applying proteomic technologies to dissect molecular aspect of phytopathogenic fungi, a Botrytis cinerea approach Francisco Javier Fernández-Acero, Carlos Garrido, María Carbú, Victoria E. González-Rodríguez, Jesús Manuel Cantoral Laboratory of Microbiology, Marine and Environmental Sciences Faculty, University of Cádiz, Pol. Río San Pedro s/n, Puerto Real, 11510, Cádiz, Spain Abstract Two dimensional gel electrophoresis (2-DE) plus mass spectrometry (MS) have been widely used to study the proteome of a good number of tissues, plants, animals or microorganisms. However, few of them have been carried out to study the proteome of phytopathogenic fungi. These organisms are responsible of several plant diseases in different crops around the world, causing very important economic losses to the farmers. There are several reasons to explain the lack of proteomic studies describing fungal plant pathogen proteomes. The main aim of this work is to tackle the strategies to overcome these SUREOHPVLHE\WKHPRGL¿FDWLRQRISURWHLQH[WUDFtion protocols, or using microbiology techniques to decrease the analytical variability. Main text Fungal plant pathogens are one of the main responsible of farmer losses. By way of example, the annual consumption of fungicides against phytopathogenic fungus Botrytis cinerea (Botrycides) moves about 10% of global fungicide market, which would mean 540 million per year [1]. Moreover, the losses increase with the value of agricultural losses, quanWL¿HGEHWZHHQDQGPLOOLRQ(XURVSHU\HDU The losses caused by B. cinerea in French vineyards are between 15% and 40% per year, depending on weather conditions. In Holland, B. cinerea produces DORVVLQÀRZHUFURSVDQGLQ6SDLQ in the strawberry crops. Annual average expenditure on fungicides against Botrytis, is around 3 million Euros in tomato crops, 2 million in strawberry and 3 million in grapewine crops (BASF, personal communication). The genus Botrytis is an ascomycetes ¿ODPHQWRXVIXQJXVZKLFKLQFOXGHVDODUJHQXPEHU of pathogenic species capable of infecting a variety of crops. Some species are able to infect a single crop, such as B. tulipae, B. squamosa or B. fabae, pathogen to tulips, bean and onions respectively. However, B. cinerea is able to attack more than 200 species, including tomatoes, strawberries and grapes, three of the most important crops in Andalusia. 7KLVIXQJXVKDVJUHDWÀH[LELOLW\SUHIHUDEO\LVDEOH to attack fruit (grapes, strawberries, tomatoes, etc.), ÀRZHUVEXWDOVRLVDEOHWRDWWDFNVWHPVOHDYHVDQG seeds. Moreover, it is also capable to attack many different plants (grapevine, tomato, Arabidopsis, roses, etc.), in different organs of the same plant (fruits, leaves, petals and other structures of the same plant). Furthermore, the disease may appear directly “in planta” or during storage and distribution of fruits. These data show the relevance of this pathogen that is being currently considered as a model organism in all those experimental approaches to the study of plant-pathogen interaction. The fact that there are only few reports on the proteome of phytopathogenic fungi is mainly due WRSUREOHPVVXFKDVWKHGLI¿FXOW\LQREWDLQLQJIXQgal protein extracts or the lack of available fungal protein databases [2]. An effective protein extraction is a key step for obtaining a good resolution avoiding streaking in the 2-DE gels. It will allow us to remove contaminants (i. e. nucleid acid, salts, lipids, pigments) which may disturb the proteins focusing. However, it is especially relevant when WKH ELRORJLFDO VRXUFH LV D ¿ODPHQWRXV IXQJXV GXH to its richness in cell wall polysaccharides, and the mechanical resistance of the fungal cell wall. This problem has been overcome by using phenol based protocol [3]. On the other hand, the amount of genomic resources is increasing continuously, and DERXWIXQJDOJHQRPHSURMHFWVDUHEHLQJ¿QLVKHG (Broad Institute, MIT, Harvard). This information is FUXFLDOWRJHWVLJQL¿FDQWQXPEHURISRVLWLYHSURWHLQ LGHQWL¿FDWLRQKLWV,QVSLWHRIWKHVHSUREOHPVVHHPWR be overcame, there are still some points that become 127 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 FULWLFDODSURWHRPLFDSSURDFKWR¿ODPHQWRXVIXQJDO proteome. In spite of other aspects, we are especiaOO\LQWHUHVWHGLQWZRPDMRU¿HOGVLWRGHFUHDVHWKH levels of variability founded in these studies, and (ii) WRLQFUHDVHWKHEHQH¿WREWDLQHGIURPWKHODUJHOLVWRI LGHQWL¿HGSURWHLQV Calculations of analytical and biological variability are directed to quantify the variations associated with the 2-DE experiments and differences in the level of protein expression between independent replicates [4]. The averages of analytical and biologiFDOFRHI¿FLHQWVRIYDULDQFHDUHXVHGWREHFDOFXODWHG [5]. Only those changes consistently present in all the extract replicates, whose quantitative differences are higher than the corresponding biological and analytical variance, should be considered [2]. In spite of the levels obtained in fungal approaches are similar to the obtained variability in plant or microRUJDQLVPVWXGLHV>@:HKDGXVHGPRQRFRQLGLDO isolates in attempt to decrease these levels, but the UHVXOWV UHPDLQ KLJK 2Q WKH RWKHU KDQG WKH ¿QDO results obtained in a proteomic approach use to be DODUJHOLVWRILGHQWL¿HGSURWHLQV7KHUROHRIHDFK protein is also discussed for its biological relevance, or used “in further studies”. This information is very important and interesting, but if we apply our own and particular “optics”, we assume the risk of information losses in other parallel biological process. As an interesting tool is the website PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships; ZZZSDQWKHUGERUJ WKDW DOORZV WKH FODVVL¿FDWLRQ RILGHQWL¿HGSURWHLQVLQGLIIHUHQWFDWHJRULHVDFFRUding to (i) its biological process or (ii) its molecular function, based on Gene Ontology. This information PD\KLJKOLJKWVRPHLQIRUPDWLRQZKLFKLVGLI¿FXOWWR extract directly from a protein list. In this sense, an algorithm to elucidate the drug target-likeness of a protein has been published [7]. This work could improve the development of new therapeutic targets to ¿JKWDJDLQVWVHYHUDOGLVHDVHV8QIRUWXQDWHO\DWWKLV moment is not feasible to develop similar approach to analyse new candidates for fungicide design (personal communication). References [1] UIPP, Union des Industries de la Proteccion des Plantes, Boulogne 2002. [2] Fernández-Acero FJ, Carbú M, Garrido C, Vallejo I and Cantoral JM. Proteomic Advances in Phytopathogenic Fungi. Curr Proteomics 2007;4:79-88. [3] Fernández-Acero FJ, Colby T, Harzen A, Cantoral JM and Schmidt J. Proteomic analysis of the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea during cellulose degradation. Proteomics 2009;9:2892-902. [4] Fernández-Acero FJ, Carbú M, Garrido C, Collado IG, et al. Screening Study of Potential Lead Compounds for Natural Product-based Fungicides Against Phytophthora Species. J. Phytopathol 2006;154:616-21. [5] Jorge I, Navarro RM, Lenz C, Ariza D, et al. The Holm Oak leaf proteome: Analytical and biological variability in the protein expression OHYHODVVHVVHGE\'(DQG3URWHLQLGHQWL¿FDWLRQ tandem mass spectrometry de novo sequencing and sequence similarity searching. Proteomics 2005;5:222–34. [6] Fernández-Acero FJ, Jorge I., Calvo E, Vallejo I, et al. Proteomic analysis of phytopathogenic fungus Botrytis cinerea as a potential tool for identifying pathogenicity factors, therapeutic targets and for basic research. Arch of Microbiol 2007;187:207–15. >@ +XDQ;+DQJ<DQJ;0LQJ=KL/:HL:HWDO Learning the drug target-likeness of a protein. Proteomics, 2007;7:4255-63. 128 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Gel-based proteomic analysis of Botrytis cinerea. The simplest 1-DE reveals differences in virulence-related protein abundance among strains Raquel González-Fernández, Inmaculada Redondo, Jesús V. Jorrín-Novo Agricultural and Plant Biochemistry and Proteomics Research Group, Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, University of Córdoba, Spain Botrytis cinereaLVDSK\WRSDWKRJHQLF¿ODPHQWRXV fungus, which infects more than 200 plant species [1], FDXVLQJVLJQL¿FDQW\LHOGORVVHVLQDQXPEHURIFURSV There are a number of isolates of B. cinerea that differ LQWKHLUYLUXOHQFHDJDLQVWVSHFL¿FFURSV>@,QWKHODVW few years, B. cinerea has been adopted as an important model system in molecular phytopathology fungi studies [1]. In the post-genomics era, Proteomics has became in a powerful tool which can contribute to understand biology, infection strategies, and lyfe cycle of this fungus, to identify virulence factors, and, on the bases of them, to develop crop protection strategies. Up to date only a few proteomics studies have been published on this organism [3-7]. In this work, we present a preliminary gel-based proteomic analysis of mycelium extracts from six different strains of B. cinerea:HXVHGDVVWDUWLQJSRLQWRQHGLPHQVLRQDO HOHFWURSKRUHVLV'(DQGSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQE\ MALDI-TOF/TOF. This work is part of an European research project (BOTBANK EUI2008-03686) within Plant-KBBE, intended at develop a collection of mutants of B. cinerea and validate the creation of this library with the characterization of the mutant lines whose infectious cycle is affected. B. cinerea strains used were B05.10 (from Prof. Dr. Paul Tudzynski lab, Münster, Germany), CECT 2100, 2850, 2996 and 20518 (from Spanish Type Culture Collection) and BOLC (provided by Dr. Angel Villegas from IAS, Córdoba, Spain, and isolated from lentil infected plants). Three independent (biological) UHSOLFDWHVHDFKRQHFRUUHVSRQGLQJWRP/ÀDFNV FRQWDLQLQJP/RIPRGL¿HG&]DSHN'R[PLQLPDO medium (2% w/v sucrose, 0.3% w/v NaNO3, 0.1% w/v K2HPO4, 0.05% w/v KCl, 0.05% w/v MgSO4·7H2O, pH 5.0) were inoculated with mycelium taken from solid cultures grown on cellophane membrane with potato dextrose agar. The cultures were grown for 6 days at 21ºC with agitation (120 rpm) in darkness. 0\FHOLD ZHUH KDUYHVWHG E\ ¿OWUDWLRQ 7KH SURWHLQ precipitation method used was TCA/acetone-phenol/ methanol for recalcitrant tissues described in [8]. Fifteen µg of protein were subjected to SDS-PAGE [9], using the Criterion System (Bio-Rad) with precast Criterion Stain Free Gels, Tris-HCl, 4-20% linear gradient (Bio-Rad). The protein band pattern was analyzed using the Image Lab software (Bio-Rad). The bands were cutted out and digested with trypsin. The MS of tryptic peptides was analyzed in a 4800 Proteomics Figure 1. SDS-PAGE of mycelium protein extracts of six different strains of B. cinerea.,GHQWL¿HGSURWHLQVDUHLQGLFDWHGE\ DUURZV81XQLGHQWL¿HGSURWHLQ 129 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Analyzer MALDI–TOF/TOF mass spectrometer (Applied Biosystems). The 3 most abundant peptide ions were subjected to MS/MS analysis. A PMF search and a combined search (+MS/MS) were performed in nrNCBI database of proteins using MASCOT. )LJXUHVKRZVWKHSURWHLQSUR¿OHRIWKHP\Felium extract from the six strains studied (B05.10, 2100, 2850, 2996, 20518 and BOLC). There were VLJQL¿FDWLYHTXDOLWDWLYHDQGTXDQWLWDWLYHGLIIHUHQFHV LQWKHSURWHLQSUR¿OHDPRQJVWUDLQV6HYHUDOSURWHLQV ZHUHLGHQWL¿HGE\0$/',72)72)0606DQDOysis (Figure 1). Some of them have been reported to be involved in pathogenicity in B. cinerea or in other phytopathogenic fungi, such as malate dehydrogenase [5], woronin body major protein [10], peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPI) [11] and PIC5 protein [12], or implicated in fungal growth and differentiation, such as nucleoside diphosphate kinase [13]. The abundance of these proteins was different among isolated (Figure 1). :RUNLVQRZLQSURJUHVVLQGLIIHUHQWGLUHFWLRQV i) analysis of spores and culture media in wild-type strains; ii) analysis of mutants, obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (ATMT) and affected in infectious cycle; and iii) use of 2-DE, and LC-based proteomic approaches. thogenic fungus Botrytis cinerea during cellulose degradation. Proteomics 2009;9:2892-902. [4] Fernandez-Acero FJ, Jorge I, Calvo E, Vallejo I, Carbu M, Camafeita E, Garrido C, Lopez JA, Jorrin J y Cantoral JM. Proteomic analysis of phytopathogenic fungus Botrytis cinerea as a potential tool for identifying pathogenicity factors, therapeutic targets and for basic research. Arch Microbiol 2007;187:207-15. [5] Fernandez-Acero FJ, Jorge I, Calvo E, Vallejo I, Carbu M, Camafeita E, Lopez JA, Cantoral JM y Jorrin J. Two-dimensional electrophoresis protein SUR¿OH RI WKH SK\WRSDWKRJHQLF IXQJXV Botrytis cinerea. Proteomics 2006;6S1:S88-96. [6] Shah P, Atwood JA, Orlando R, El Mubarek H, Podila GK y Davis MR. Comparative proteomic analysis of Botrytis cinerea secretome. J Proteome Res 2009;8:1123-30. [7] Shah P, Gutierrez-Sanchez G, Orlando R y Bergmann C. A proteomic study of pectin-degrading enzymes secreted by Botrytis cinerea grown in liquid culture. Proteomics 2009;9:3126-35. >@ :DQJ:9LJQDQL56FDOL0\&UHVWL0$XQLversal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis. Electrophoresis 2006;27:2782-6. [9] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;227:680-5. [10] Soundararajan S, Jedd G, Li X, Ramos-Pamplona 0&KXD1+\1DTYL1,:RURQLQERG\IXQFWLRQ in Magnaporthe griseaLVHVVHQWLDOIRUHI¿FLHQW pathogenesis and for survival during nitrogen starvation stress. Plant Cell 2004;16:1564-74. [11] Viaud M, Brunet-Simon A, Brygoo Y, Pradier JM y Levis C. Cyclophilin A and calcineurin functions investigated by gene inactivation, cyclosporin A inhibition and cDNA arrays approaches in the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea. Mol Microbiol 2003;50:1451-65. [12] Gioti A, Simon A, Le Pecheur P, Giraud C, Pradier JM, Viaud M y Levis C. Expression SUR¿OLQJ RI Botrytis cinerea JHQHV LGHQWL¿HV three patterns of up-regulation in planta and an FKBP12 protein affecting pathogenicity. J Mol Biol 2006;358:372-86. [13] Lin X, Momany C y Momany M. SwoHp, a nucleoside diphosphate kinase, is essential in Aspergillus nidulans. Eukaryot Cell 2003;2:1169-77. $FNQRZOHGJHPHQWV This work was supported by the Spanish “Ministerio de Ciencia e Innovación” (BOTBANK Proyect: EUI2008-03686), the “Junta de Andalucía” and the “Universidad de Córdoba” (AGR 164). Thanks to Consuelo Gómez from SCAI (Córdoba, 6SDLQIRUSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQ References >@ (ODG< :LOOLDPVRQ % 7XG]\QVNL 3 \ 'HOHQ N. Botrytis: biology, pathology and control. Springer, 2004. [2] Choquer M, Fournier E, Kunz C, Levis C, Pradier J.M, Simon A y Viaud M. Botrytis cinerea virulence factors: new insights into a necrotrophic and polyphageous pathogen. FEMS Microbiology Letters 2007;277:1-10. [3] Fernandez-Acero FJ, Colby T, Harzen A, Cantoral JM y Schmidt J. Proteomic analysis of the phytopa- 130 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Proteomic approach to Botrytis cinerea survival structures Victoria E. González-Rodríguez, Carlos Garrido, Maria Carbú, Jesús Manuel Cantoral, Francisco Javier Fernández-Acero Laboratory of Microbiology, Marine and Environmental Sciences Faculty, University of Cádiz, Pol. Río San Pedro s/n, Puerto Real, 11510, Cádiz, Spain Abstract The ascomycete Botrytis cinerea is a phytopathogenic fungus infecting a high number of crops, causing VLJQL¿FDQW \LHOG ORVVHV LQ WKHVH FURSV LQ$QGDOXVLD (Spain). In the last few years, B. cinerea has been adopted as an important model system in molecular phytopathology. Several approaches have been applied to this fungus to unravel its mechanisms of infection. These studies have revealed the complexity and wide variety of infection strategies used by B. cinerea. This study presents an initial approach to characterize the proteins content of two principal structures of resistance: conidia and sclerotia, which constitutes the princiSDOLQRFXOXPRIWKHIXQJXVLQWKH¿HOGV$IWHU'( the majority of the spots were found from 5 to 8 of pI values, presenting a Mr from 14 to 105 kDa. After SURWHLQLGHQWL¿FDWLRQZLOOEHGRQHRXUPDLQDLPLVWR ¿QGWKRVHSURWHLQVLQYROYHGLQSULPDU\SODQWOHVLRQ sclerotia. Both, conidia and sclerotia, were homogenized by using FastPrep Instrument (Q-BIOgene, Valencia, USA), 12 cycles of 30 second and 6.0 of speed. Protein extraction was developed following Fernandez-Acero et al [2]. Protein concentration was determined by using the RC-DC Protein Assay (Bio-Rad). 2-DE was developed following Fernandez-Acero et al [2] using Immobilized pH gradient (IPG) strips (Bio-Rad, 7 cm,) 3-10 or 5-8 linear pH gradient (Figure 1). Main text Botrytis cinerea Pers. Fr. is a phytopathogenic DVFRP\FHWHWKDWFDXVHVVLJQL¿FDQW\LHOGORVVHVLQD substantial number of crops. In the last years, many research advances regarding the infection process developed by this pathogen have been made. Lately, SURWHRPLFVWHFKQRORJLHVKDYHDOORZHGWKHHI¿FLHQW FKDUDFWHUL]DWLRQDQGLGHQWL¿FDWLRQRIDODUJHQXPber of proteins from B. cinerea [1-3]. However, a special interest is focused in those proteins involved in the initial steps of plant infection process due to these proteins are excellent candidates for fungicide design or targets to design diagnosis techniques. Conidial suspensions (1 x 108 cond/mL) were obtained from 15 days B. cinerea 2100 (Spanish type culture collection) malt agar plates following Carbu et al [4]. Sclerotia were obtained from B. cinerea strain 992.1-89 (University of Cádiz culture collection) maintained during 30 days in malt agar, at 22ºC to obtain a stock of well maturated Figure 1. '(JHOIURPWKH¿UVWSURWHRPLFDSSURDFKWRFRQLdia (left) and sclerotium (right), showing the protein separaWLRQLQ,3*XSDQGGHGH¿QLWLYH,3*GRZQ Obtained proteins from ungerminated conidial suspension showed that most of the stained spots were allocated between pI 5 and 8. The distribution of the spots attending to its molecular weight (Mr) was found from 14.7 to 105.7 kDa. Those spots presented in all the three replicates were used to calculate the analytical variability of the experiment. One hundred and eight spots were used obtaining % CV average of 42.05 %, which is similar to our previous experiments. Two dimensional gels from Sclerotia present more diverse content. In spite that both structures show similar pI distribution, the molecular weight was between 3.1 to 158.8 kDa, showing a wider distribution. The obtained % CV 131 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 result was 44.61% by using 205 protein spots. This UHSRUWVKRZVWKH¿UVWSURWHRPLFDSSURDFKWRB. cinerea conidial germination, representing its initial step. Moreover, our initial results with sclerotia seem to coincide with the previous studies with Sclerotinia sclerotiorum [5] presenting a mayor protein with 3436 kDa and 3 isoforms with a pI of 6.2, 6 and 5.8. Our gels show 6 isoforms with a Mr about 41 kDa, and a pI of 5.23, 5.51, 5.65, 5.81, 5.94 and 6.19 as a mayor component. In spite of the observed differences and waiting the results from MALDI TOF/ TOF, we assume that our protein is the same, a Ssp1 protein involved in sclerotia development. [2] Fernández-Acero FJ, Colby T, Harzen A, Cantoral JM, Schmidt J. Proteomic analysis of the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea during cellulose degradation. Proteomics 2009;9:2892-902. [3] Fernández-Acero FJ, Jorge I, Calvo E, Vallejo I, et al. Proteomic analysis of phytopathogenic fungus Botrytis cinerea as a potential tool for identifying pathogenicity factors, therapeutic targets and for basic research. Arch Microbiol 2007;187:207–15. [4] Carbú M, Fernández-Acero FJ, Garrido C, Rebordinos L, et al. Estudio de la competitividad de Botrytis cinerea en viñedos del marco vitivinñicola de Jerez. Tecnología del Vino 2004;34-8. References [5] Russo GM, Van Etten JL. Synthesis and locaOL]DWLRQ RI D GHYHORSPHQWVSHFL¿F SURWHLQ LQ sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum. J Bacteriol 1985;163:696-703. [1] Fernández-Acero FJ, Jorge I, Calvo E, Vallejo I, et al. Two-dimensional electrophoresis protein SUR¿OHRIWKHSK\WRSDWKRJHQLFIXQJXVBotrytis cinerea. Proteomics 2006;6:S88-96. 3HU¿OVHUROyJLFRGHODUHVSXHVWDGHDQWLFXHUSRVIUHQWHDOLQPXQRPDGHCandida en el pronóstico de las candidiasis invasivas Aida Pitarch, César Nombela, Concha Gil Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid Las candidiasis invasivas son infecciones de notable morbilidad y mortalidad, en pacientes severamente inmunocomprometidos y enfermos críticos [1]. El hallazgo de nuevos biomarcadores de pronóstico para estas infecciones oportunistas puede suponer un nuevo camino para tomar decisiones terapéuticas más precisas e individualizadas que podrían a su vez mejorar la evolución clínica de estos pacientes. Para esta búsqueda, pueden ser útiles técnicas globales de alto rendimiento tales como la inmunoproteómica clásica o el análisis del proteoma serológico (SERPA) [2]. Diferentes estrategias SERPA (basadas en electroforesis bidimensional seguida de “western-blotting” y espectrometría de masas) han permitido el descubrimiento de varios biomarcadores clínicos y dianas terapéuticas para estas micosis oportunistas [2-5]. &RQHO¿QGHLGHQWL¿FDU\YDOLGDUXQQXHYRPptodo de pronóstico para las candidiasis invasivas, se combinó la tecnología SERPA con análisis bioinformáticos para examinar, en un estadio precoz de LQIHFFLyQORVSHU¿OHVVHUROyJLFRVGHODUHVSXHVWDGH anticuerpos frente al inmunoma de Candida en 45 pacientes con candidiasis invasivas que tuvieron un desenlace fatal o favorable. Análisis de conglomerados jerárquicos bidimensionales y del componente principal de los patrones de reactividad de anticuerpos séricos frente a 31 proteínas inmunogénicas de Candida separaron con precisión pacientes con estas micosis oportunistas en dos grupos con pronósticos diferentes (aquellos que sobrevivieron de los que fallecieron durante el proceso infeccioso). Estos subgrupos fueron inGHSHQGLHQWHV GH ODV FDUDFWHUtVWLFDV GHPRJUi¿FDV 132 y clínicas de la población de estudio. Análisis supervisados con validaciones cruzadas permitieron LGHQWL¿FDU XQ SDQHO GH FLQFR DQWLFXHUSRV FRPR OD mejor combinación para predecir el pronóstico de ODVFDQGLGLDVLVLQYDVLYDV6XUREXVWH]VHFRQ¿UPy en otro grupo de pacientes con estas micosis oportunistas. Este panel permitió determinar, en un estadio precoz de infección, el riesgo de un pronóstico fatal en pacientes con estas infecciones invasivas, así FRPRGH¿QLUJUXSRVGHSDFLHQWHVHQDOWRULHJRTXH SXHGH EHQH¿FLDUVH GH WHUDSLD DQWLI~QJLFD 0RGHlos de regresión logística indicaron que este panel proporcionaba un poder discriminatorio adicional sobre factores de pronóstico conocidos para estas infecciones invasivas. (VWRV UHVXOWDGRV SRQHQ GH PDQL¿HVWR TXH VH puede predecir el pronóstico en pacientes con candidiasis invasivas mediante la evaluación de un número relativamente pequeño de biomarcadores. Si VH FRQ¿UPD HQ HVWXGLRV GH FRKRUWHV SURVSHFWLYRV multicéntricos, éstos serán de enorme utilidad para WRPDUGHFLVLRQHVWHUDSpXWLFDVPiVHVSHFL¿FDVHLQdividualizadas. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 cia y Tecnología (proyecto BIO-2009-07654) por las D\XGDV¿QDQFLHUDVUHFLELGDV Referencias [1] Pfaller MA y Diekema DJ. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin Microbiol Rev 2007;20:133-63. [2] Pitarch A, Nombela C y Gil C, The Candida immunome as a mine for clinical biomarker development for invasive candidiasis: From biomarker discovery to assay validation en Pathogenic Fungi: Insights in Molecular Biology (editores: San-Blas G. y Calderone R.A.), CaisWHU$FDGHPLF3UHVV:\PRQGKDP8.SS 103-42. [3] Pitarch A, Jiménez A, Nombela C y Gil C. Serological proteome analysis to identify systemic candidiasis patients in the intensive care unit: Analytical, diagnostic and prognostic validation of anti-Candida enolase antibodies on quantitative clinical platforms. Proteomics Clin Appl 2008;2:596-618. [4] Pitarch A, Jiménez A, Nombela C y Gil C. Decoding serological response to Candida cell wall immunome into novel diagnostic, prognostic, and therapeutic candidates for systemic candidiasis by proteomic and bioinformatic analyses. Mol Cell Proteomics 2006;5:79-96. [5] Pitarch A, Abian J, Carrascal M, Sánchez M, 1RPEHOD&\*LO&3URWHRPLFVEDVHGLGHQWL¿cation of novel Candida albicans antigens for diagnosis of systemic candidiasis in patients with underlying hematological malignancies. Proteomics 2004;4:3084-106. Agradecimientos Los autores expresan su más sincero agradeciPLHQWRDOD&iWHGUD([WUDRUGLQDULD0HUFN6KDUS Dohme (MSD) en Genómica y Proteómica, a la Red Española para la Investigación en Enfermedades Infecciosas (REIPI) del Ministerio de Salud y Consumo e Instituto de Salud Carlos III – FEDER (proyecto RD06/0008/1027), a la Comunidad de Madrid (proyecto S-SAL-0246/2006 DEREMICROBIANA-CM), y a la Comisión Interministerial de Cien- 133 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 $QiOLVLVSURWHyPLFRGHODPDWUL]H[WUDFHOXODU0(GHELRSHOtFXODVIRUPDGDVSRU mutantes del hongo Candida albicansSDUDJHQHVTXHFRGL¿FDQSURWHtQDVTXHFRQtienen el dominio CFEM rico en cisteína y genes implicados en glicosilación Rosario Blanes1, Ana M. Pérez1, Amelia Murgui2, Manuel Casanova1, Ángel Domínguez3, José P. Martínez1 1 Departamento de Microbiología y Ecologia, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Farmacia, Universitat de València/Estudi General (UVEG), Valencia, e 3Instituto de Microbiología Bioquímica, Universidad de Salamanca, Salamanca (España) Introducción Candida albicans es un hongo patógeno oportunista capaz de producir graves infecciones sistémicas en indivíduos inmunocomprometidos. Entre los DWULEXWRVELROyJLFRVTXHOHFRQ¿HUHQDC. albicans su potencial patogénico, la capacidad de formar biopelículas parece jugar un papel esencial. Las biopelículas son comunidades celulares altamente organizadas con una compleja estructura tridimensional, adheridas a un sustrato sólido (biológico o no biológico), en la que las células se encuentran embebidas en una matriz exocelular (ME) formada por polisacáridos, proteínas y otros componentes minoritarios. La ME juega un papel crítico en el mantenimiento de la integridad estructural de las biopelículas y en la protección de las células frente a factores externos adversos como el sistema inmunitario y/o el tratamiento con antimicrobianos [1]. Por lo tanto, un mejor conocimiento a nivel molecular y funcional de los constituyentes mayoritarios de la ME podría ser esencial en el desarrollo de nuevas estrategias para el diagnóstico, prevención y control de las candidiasis [2]. La formación de biopelículas es un proceso biológico muy complejo durante el cual las células fúngicas deben establecer múltiples interacciones con el entorno ambiental. En este contexto, se ha descrito la presencia en C. albicans de una familia de proteínas que contienen un dominio formado por 8 cisteínas, denominado CFEM (common in several fungal extracellular membrane proteins), y TXH SXHGHQ DFWXDU FRPR UHFHSWRUHV GH VXSHU¿FLH en transducción de señales, y como moléculas de adhesión en las interacciones huésped-parásito [3]. Nuestro grupo dispone de una colección de cepas FRQPXWDFLRQHVHQJHQHVTXHFRGL¿FDODVtQWHVLVGH proteínas de la familia CFEM, en concreto los genes PGA10 (también designado como RBT51 y HPB1) y WAP1, que forman biopelículas muy frágiles y con poca capacidad de adherencia al sustrato (Figura 1) frente a lo observado en la cepa parental CAI4URA3 (Fig. 1) [4]. Por otro lado, dado que los resultados descritos en la bibliografía [5] indican que el componente mayoritario presente en la ME de las biopelículas formadas por C. albicans son carbohidratos, también se consideró interesante determinar la capacidad de formar biopelículas de mutantes de HVWHKRQJRGH¿FLHQWHVHQJOLFRVLODFLyQ(QFRQFUHto se estudiaron mutantes para los genes MNN9 y ALG5, que al igual que en el caso anterior formaron biopelículas muy frágiles y con poca capacidad de adherencia al sustrato (Figura 1). Figura 1. Aspecto macroscópico de las biopelículas formadas por las diferentes cepas de C. albicans analizadas. Material y métodos Biopelículas de 48 h formadas por las cepas de C. albicans analizadas fueron tratadas con etanol al 60% durante 60 min. Los extractos etanólicos resulWDQWHV IXHURQ FRQFHQWUDGRV PHGLDQWH OLR¿OL]DFLyQ valorándose su concentración proteica mediante el método de Bradford [6]. Seguidamente se determinó el patrón polipeptídico asociado a cada extracto mediante electroforesis bidimensional en geles de 134 poliacrilamida del 12% (en la segunda dimensión). /RVSHU¿OHVSURWHLFRVVHPXHVWUDQHQOD)LJXUD 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 análisis proteómico por espectrometría de masas (MALDI/MALDI-TOF). Referencias Figura 2. Análisis mediante electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida de los extractos obtenidos por tratamiento con etanol al 60% de las biopelículas formadas por las diferentes cepas de C. albicans estudiadas y que se muestran en la Fig. 1. [1] Branda SS, Vik S, Friedman L y Kolter R. Bio¿OPV WKH PDWUL[ UHYLVLWHG 7UHQGV 0LFURELRO 2005;13:20-6. [2] Thomas DP, Viudes A, Monteagudo C, Lazzell AL, Saville SP, López-Ribot JL. A proteomicEDVHGDSSURDFKIRUWKHLGHQWL¿FDWLRQRICandida albicans protein components present in a subunit vaccine that protects against disseminated candidiasis. Proteomics 2006;6:6033-41. [3] Kulkarni RD, Kelkar HS, Dean RA. An eightcysteine-containing CFEM domain unique to a group of fungal membrane proteins. Trends Biochem Sci 2003;28:118-21. [4] Pérez A, Pedrós B, Murgui A, Casanova M, /ySH]5LERW-/0DUWtQH]-3%LR¿OPIRUPDWLRQ by Candida albicans mutants for genes coding fungal proteins exhibiting the eight-cysteinecontaining CFEM domain. FEMS Yeast Res 2006;6:1074-84. [5] Baillie GS y Douglas LJ. Matrix polymers of CandidaELR¿OPVDQGWKHLUSRVVLEOHUROHLQELR¿OPUHVLVWDQFHWRDQWLIXQJDODJHQWV-$QWLPLFURE Chemother 2000;46:397-403. [6] Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976;72:248-54. Resultados y Conclusiones El análisis comparativo de los diferentes extracWRV KD SXHVWR SXVR GH PDQL¿HVWR OD H[LVWHQFLD GH diferencias cualitativas y cuantitativas en los respecWLYRVSHU¿OHVSURWHLFRV)LJXUDGHWHFWiQGRVHHVpecies que se expresan diferencial y/o mayoritariamente en la ME de la cepa parental (CAI4-URA3) o de las cepas mutantes para los genes PGA10, WAP1, MNN9 y ALG5. La identidad de estos polipéptidos está siendo investigada en estos momentos mediante 135 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Expresión diferencial de proteínas del citoesqueleto del macrófago tras la interacción con Candida albicans: Problemas en la normalización de las muestras Jose Antonio Reales-Calderón1, Mª Luisa Hernaez2, Mª Dolores Gutiérrez2, Gloria Molero1, Concha Gil1,2 1 Departamento de Microbiología II. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid. 2Unidad GH3URWHyPLFD8QLYHUVLGDG&RPSOXWHQVHGH0DGULG3DUTXH&LHQWt¿FRGH0DGULG8&03&0 Abstract El estudio del citoesqueleto de macrófagos murinos en la interacción con Candida albicans resulta de gran interés por los importantes cambios que ocurren en una célula fagocítica tras entrar en contacto con un “cuerpo extraño”. La fagocitosis conlleva alteraciones en el citoesqueleto de actina, tubulina y miosina y de las proteínas que se asocian a ellas $US &RURQLQD :$63 :$9(« (VWXGLRV previos basados en la obtención de subproteomas de macrófagos utilizando una extracción secuencial y analizados mediante 2D-DIGE, nos ha permitido observar un gran número de proteínas en la fracción enriquecida en citoesqueleto que aumentan su expresión tras interaccionar con C. albicans. Sin HPEDUJRVyORSURWHtQDVSXGLHURQVHULGHQWL¿FDGDV &RQREMHWRGHLGHQWL¿FDUXQPD\RUQ~PHURGHSURteínas hemos puesto a punto un método más especí¿FRSDUDODH[WUDFFLyQ de proteínas de citoesqueleto. Utilizando esta estrategia nos hemos encontrado con que se produce un aumento considerable en la cantidad de proteína tras la interacción en comparación FRQHOFRQWUROGL¿FXOWDQGRODQRUPDOL]DFLyQGHODV muestras a analizar. fracción por cromatografía líquida, aumentando el Q~PHURGHSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDV\UHYHODQGRTXH en la muestra extraída con el kit había muy pocas proteínas propias de citoesqueleto. Obtención de las muestras de citoesqueleto Utilizando protocolos de extracción más espeFt¿FRVSDUDSURWHtQDVGHFLWRHVTXHOHWRHOHJLPRVHO GHVFULWRSRU)XQFKDO>@OLJHUDPHQWHPRGL¿FDGR'Lcho método se basa en la utilización independiente de dos tampones con diferente concentración de sales: un tampón con alto contenido en sales (High-salt), FRQHOFXDOVHH[WUDHODIUDFFLyQHQULTXHFLGDHQ¿ODmentos intermedios de citoesqueleto; y otro de bajo contenido en sales (Low-salt), con el que se extraen IXQGDPHQWDOPHQWH¿ODPHQWRVLQWHUPHGLRVWXEXOLQDV actinas y proteínas asociadas al citoesqueleto. El análisis preliminar de las muestras por croPDWRJUDItDOtTXLGDSXVRGHPDQL¿HVWRXQHQULTXHFLmiento muy importante en proteínas de citoesqueleto con respecto a la fracción extraída con el kit. Extracción de las muestras de iTRAQ Resultados Previos Estudios previos de nuestro laboratorio de las proteínas presentes en diferentes subproteomas obtenidos por extracción secuencial con el kit ProteoExtract® Subcellular Proteome Extraction Kit de Calbiochem y analizadas por DIGE, mostraron muchas proteínas con expresión diferencial en la fracción enriquecida en citoesqueleto. Sin embarJR SRFDV SURWHtQDV SXGLHURQ VHU LGHQWL¿FDGDV SRU encontrarse en muy baja concentración (RealesCalderón J. A.; Martínez-Solano L.; Molero G.; Gil C.; resultados no publicados). Se analizó esta Se realizó la extracción de proteínas de citoesqueleto con estos dos tampones, partiendo de un número constante de macrófagos, y realizamos 3 UpSOLFDV ELROyJLFDV$O FXDQWL¿FDU REVHUYDPRV XQ aumento considerable (150%) de la cantidad de proteína de citoesqueleto en las muestras extraídas con el tampón High-salt procedentes de macrófagos que habían interaccionado con C. albicans con respecto a los macrófagos control. Dichas diferencias en la cantidad de proteína no se producían en las muestras extraídas con el tampón Low-salt, como se puede observar en la Figura 1. 136 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Vamos a comenzar el análisis de las muestras extraídas con el tampón Low-salt, el cual no plantea problemas de concentración y después se procederá al análisis de las muestras extraídas con el tampón High-salt, donde hay un aumento del 150% de las proteínas tras la interacción con la levadura. Figura 1. Geles monodimensionales teñidos con Coomasie Coloidal de muestras enriquecidas en proteínas de citoesqueleto. Izquierda: Tampón High-salt; Derecha: Tampón Low-Salt. Cnt: Macrófagos control; Int: Macrófagos tras la interacción con C. albicans. Para realizar el iTRAQ habría que igualar la concentración de las muestras antes de marcar. Si lo hiciéramos con las muestras extraídas con el tampón High Salt, estararíamos aumentando las concentraciones de las proteínas de la muestra de los macrófagos control, alterando los resultados de la FRPSDUDFLyQ&RQHOREMHWRGHFXDQWL¿FDUHVWDH[presión diferencial tan importante, hemos decidido igualar en el número de células de partida en todos ORVFDVRV\UHVXVSHQGHUHQHOPLVPRYROXPHQ¿QDO antes de marcar con iTRAQ. Agradecimientos Los autores expresan su agradecimiento a la Comisión Internacional de Ciencia y Tecnología SUR\HFWR %,2 SRU ODV D\XGDV ¿QDQcieras recibidas. Referencias [1] Funchal C, de Almeida LM, Oliveira Loureiro S, Vivian L, de Lima Pelaez P, Dall Bello Pessutto F, et al. In vitro phosphorylation of cytoskeletal proteins from cerebral cortex of rats. Brain research 2003;11:111-8. 3URWHyPLFDGH3DUiVLWRV 3UREOHPiWLFDHQODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVGHSDUiVLWRV Javier Sotillo1, Ana Pérez García1, María Trelis1, Dolores Bernal2, Carla Muñoz-Antolí1, José Guillermo Esteban1, Rafael Toledo1, Antonio Marcilla1 1 2 Departamento de Biología Celular y Parasitología, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de València El principal problema al que se enfrentan los investigadores que trabajan en proteómica parasitaria es la falta de genomas completos de los parásitos estudiados. Tan solo se encuentran disponibles los de Schistosoma mansoni y Schistosoma japonicum, [1,2], además de numerosas entradas de DNA depositadas en bases de datos. El hecho de que existan tantas entradas de Schistosoma en bases de GDWRVGHSURWHtQDVKDSRVLELOLWDGRODLGHQWL¿FDFLyQ de numerosas proteínas de otros trematodos como los echinostomátidos [3]. Sin embargo, no siempre pueden usarse bases de datos de otros parásitos para ODLGHQWL¿FDFLyQGHELGRDODIDOWDGHKRPRORJtDHQWUH proteínas. Ha de tratarse de proteínas conservadas que mantengan una cierta homología entre diferentes géneros de parásitos. Además, en el caso de SchistosomaFDVLODPLWDGGHSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDV de sus transcriptomas no tienen función conocida o VRQLQFOXVRHVSHFLHHVSHFt¿FDV>@ En el caso de Echinostoma, no sólo no se tiene el transcriptoma entero, sino que existen muy pocas 137 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 ESTs. Tan solo existe una biblioteca de ESTs disponible para Echinostoma parensei. Además, esta biblioteca puede considerarse muy pobre con 358 secuencias depositadas si la comparamos con otros trematodos como Fasciola hepatica o Schistosoma haematobium (con más de 15000 ESTs cada uno). &XDQGRVHLQWHQWDLGHQWL¿FDUHOSURWHRPDGHE. caproni, sólo un pequeño porcentaje de las moléculas anali]DGDVVRQLGHQWL¿FDGDVFRUUHFWDPHQWH)LJXUD Otra de las limitaciones con la que se encuentran los investigadores que trabajan en proteómica nostomátidos como la enolasa, la GST, la GAPDH, la aldolasa o la Hsp-70 [3,6]. Sin embargo, sigue siendo de vital importancia el dedicar tiempo y esfuerzo en la secuenciación de nuevas EST o de genomas completos de paráVLWRV TXH D\XGHQ D OD LGHQWL¿FDFLyQ GH SURWHtQDV y que puedan ser de utilidad en la investigación con otros parásitos del mismo orden. Además de la secuenciación genómica, también las herramientas bioinformáticas podrían contribuir al progreso en proteómica parasitaria. Figura 1. 3RUFHQWDMHVGHLGHQWL¿FDFLyQSRU3URWHLQ3LORWGHSURWHtQDVGH(FKLQRVWRPDFDSURQL. Debido a la poca información ~WLOHQODVEDVHVGHGDWRVVyORVHORJUDLGHQWL¿FDUHOGHWRGRVORVSpSWLGRVFXDQGRVHXVDXQFXWRII! parasitaria es la escasez de material parasitario. Los estudios de proteínas se encuentran limitados por la sensibilidad de la espectometría de masas, y, en última instancia, dependen en gran medida de la cantidad y calidad de material disponible. Debido a la costosa obtención de materiales procedentes GHOSDUiVLWRVHKDFHPX\GLItFLOODLGHQWL¿FDFLyQGH proteínas parasitarias. Para la mayoría de parásitos (incluido Echinostoma) es muy difícil su cultivo in vitro, y se depende únicamente de su obtención a SDUWLUGHKRVSHGDGRUHVGH¿QLWLYRV$GHPiVFRPR la mayoría tienen ciclos complejos donde intervienen varios hospedadores intermediarios, además GHO KRVSHGDGRU GH¿QLWLYR SRFRV LQYHVWLJDGRUHV pueden disponer del ciclo completo en su laboratorio, habiéndose de conformar con las muestras que les llegan de otros laboratorios, hospitales o pacientes aislados. Una de las posibles soluciones que pueden ayuGDU HQ OD LGHQWL¿FDFLyQGH SURWHtQDV HV XVDU DQWLcuerpos heterólogos en diferentes técnicas como la de western-blot. Gracias a la mayor sensibilidad de esta técnica respecto de las tinciones de geles, se minimiza la limitación por falta de material en la LGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDV$XQTXHHVWDWpFQLFDVyOR se pueda usar con proteínas altamente conservadas y pueda ser una técnica muy cara en algunos casos (si se emplean diferentes anticuerpos comerciales), KDVHUYLGRSDUDLGHQWL¿FDUPXFKDVSURWHtQDVGHHFKL- Agradecimientos (O SUHVHQWH HVWXGLR IXH ¿QDQFLDGR SRU HO SURyecto CGL-2005-0231/BOS del Ministerio de Educación y Ciencia (España) y FEDER (EU), los proyectos GV07/006, GVPRE/2008/049 y PROMETEO/2009/081 de la Conselleria d’Educació de la Generalitat Valenciana. Este trabajo ha sido llevado a cabo mientras el primer autor (J.S.) era EHQH¿FLDULRGHXQDEHFDSUHGRFWRUDOGHO0LQLVWHULR de Educación y Ciencia (Spain) y el segundo autor de las becas BC06-284 y BC08-098 de la Universitat de València. Referencias [1] Berriman M, Haas BJ, LoVerde PT, :LOson RA, Dillon GP et al. The genome of the blood fluke Schistosoma mansoni. Nature 2009;460:352-8. [2] Schistosoma japonicum Genome Sequencing and Functional Analysis Consortium, Zhou Y, Zheng H, Liu F, +X:, :DQJ=4, Gang L, Ren S. The Schistosoma japonicum genome reveals features of host-parasite interplay. Nature 2009;460:345-51. [3] Sotillo J, Valero L, Sánchez del Pino MM, Fried B, Esteban JG, Marcilla A, Toledo R. ,GHQWL¿FDWLRQRIDQWLJHQLFSURWHLQVIURPEchi- 138 [4] 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 nostoma caproni (Trematoda) recognized by Mouse immunoglobulins M, A and G using an immunoproteomic approach. Parasite Immunol 2008;30:271-79. >@ :LOVRQ5$$VKWRQ3'%UDVFKL6'LOORQ*3 Berriman M, Ivens A. “Oming” in on schistosomes: prospects and limitations for postgenomics. Trends Parasitol 2003;23:14-20. Verjovski-Almeida S, DeMarco R, Martins EAL, Guimaraes PEM, Ojopi EPB et al. Transcriptome analysis of the acoelomate human parasite Schistosoma mansoni. Nat Genet 2003;35:148-57. [6] Bernal D, Carpena I, Espert A, De la Rubia JE, (VWHEDQ-*7ROHGR50DUFLOOD$,GHQWL¿FDWLRQ of proteins in excretory/secretory extracts of Echinostoma friedi (Trematoda) from chronic and acute infections. Proteomics 2006;9:2835-43. Las técnicas de proteómica aplicadas al estudio de las relaciones parásito/ KRVSHGDGRUHQODGLUR¿ODULRVLVDQLPDO\KXPDQD Javier González-Miguel1, Rodrigo Morchón-García1, Ana Oleaga2, Mar Siles-Lucas2, Ricardo Pérez-Sánchez2, Fernando Simón1 1 Laboratorio de Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Salamanca. 2Laboratorio de Parasitología, IRNA Salamanca (CSIC) Resumen En el presente trabajo se emplean técnicas de electroforesis 2D, western blot y espectrometría de masas para analizar la existencia de una base molecular en las relaciones que 'LOR¿UDOLDLPPLWLV establece con sus diferentes hospedadores. Se han idenWL¿FDGRVLPLOLWXGHV\GLIHUHQFLDVHQODVPROpFXODV parasitarias que parecen jugar un papel fundamental en dichas relaciones, en cada hospedador. 'LUR¿ODULDLPPLWLV es el agente causante de la GLUR¿ODULRVLV FDUGLRSXOPRQDU FDQLQD \ IHOLQD \ GH OD GLUR¿ODULRVLV SXOPRQDU KXPDQD 7DQWR HO GHVDrrollo del parásito, como las implicaciones clínicas, son diferentes en cada uno de sus 3 hospedadores. En el perro los vermes adultos de D. immitis pueden vivir durante más de 7 años produciendo PLFUR¿ODULDV\ODHQIHUPHGDGWLHQHJHQHUDOPHQWH un desarrollo crónico. En el gato los adultos viven solamente 2 años y las infecciones son siempre DPLFUR¿ODUpPLFDV/DSDWRORJtDWLHQHXQFXUVRLPprevisible y habitualmente agudo. En el hombre, D. immitis no alcanza el estado adulto. En algunas ocasiones, vermes preadultos se alojan en una rama de la arteria pulmonar, donde embolizan y causan un nódulo pulmonar benigno que puede confundirse con cáncer en radiología. La comprensión de las UHODFLRQHVSDUiVLWRKRVSHGDGRUHQODGLUR¿ODULRVLV precisa de datos sobre las moléculas del parásito y el papel que desempeñan, tanto en el estímulo de los mecanismos patológicos e inmunes, como de los mecanismos de supervivencia. Las técnicas de proteómica son una herramienta muy útil para idenWL¿FDU GLFKDV PROpFXODV \ DQDOL]DU VXV IXQFLRQHV En el presente trabajo, el proteoma de D. immitis y los inmunomas obtenidos en cada hospedador, se relacionan los datos biológicos y clínicos de la enfermedad en cada uno de ellos. Se utilizó un extracto antigénico soluble de vermes adultos de D. immitis (DiSB). El proteoma de D. immitis fue obtenido mediante electroforesis 2D del extracto DiSB. Las proteínas se tiñeron con QLWUDWRGHSODWDRVHWUDQV¿ULHURQDPHPEUDQDVGH nitrocelulosa para la realización del western blot 2D, en las que se incubaron con pools de sueros de los diferentes hospedadores infectados y de controles sanos. Los spots que contenían proteínas inmunógenas, se escindieron manualmente de los geles 2D y fueron enviadas al Servicio de Proteómica del &1,& SDUD VX FRUUHVSRQGLHQWH LGHQWL¿FDFLyQ SRU espectrometría de masas [1]. 139 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Tras la electroforesis 2D, el extracto DiSB resolvió más de 400 spots, la mayor parte con pIs entre 5 y 8, y con un amplio intervalo de PMs (10-170 kDa). Los western blot 2D revelaron, en los casos de análisis con sueros de perros, gatos y humanos con GLUR¿ODULRVLV XQ WRWDO GH \ spots de D. immitisGHORVFXDOHV\IXHURQLGHQWL¿FDdos y se correspondieron con 19, 32 y 23 proteínas, respectivamente. A continuación, se determinó la función molecular y el proceso biológico en el que están LPSOLFDGDVODVSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVVHJ~QODVEDVHV de datos Gen Ontology y Swiss-Prot/UniProt. La mayor parte de las proteínas inmunógenas LGHQWL¿FDGDVSHUWHQHFtDQDWUHVJUXSRVIXQFLRQDOHV (Figura 1), que son fundamentales en las relaciones SDUiVLWRKRVSHGDGRUHQODGLUR¿ODULRVLVSURWHtQDVGH choque térmico (Hsps), enzimas del metabolismo energético y enzimas redox. Como se observa en la tabla 1, dentro de las Hsps y las enzimas redox, los gatos reconocen más proteínas que los humanos, y estos últimos a su vez, más que el hospedador canino. Por otra parte, desde el punto de vista del metabolismo energético, la ruta glicolítica del parásito es ampliamente inhibida por los tres hospedadores, no obstante, D. immitis es un fermentador homoláctico y la principal enzima de la glicolisis anaerobia, la lactato deshidrogenasa, es tan solo bloqueada por gatos y humanos. Figura 1. Procesos biológicos en los que están implicadas las proteínas inmunógenas del extracto DiSB reconocidas por perros, gatos y humanos. Datos expresados como porcentaje del total de proteínas reconocidas por cada hospedador. Los grupos funcionales discutidos en el presente trabajo se hallan recuadrados. Estos resultados sugieren que las diferencias biológicas y clínicas existentes entre los diferentes Tabla 1. Proteínas inmunógenas del extracto DiSB reconocidas por perros, gatos y humanos en los grupos funcionales de proteínas de choque térmico, enzimas del metabolismo energético y enzimas redox. Función Proteínas de choque térmico Proteína Perros Gatos Humanos Hsp 70 X X X X X X X sHsp Proteína OV25-1 sHsp p27 Enzimas del metabolismo energético Enzimas redox X Enolasa Fructosa-bisfosfato aldolasa X X X X X X GAPDH Triosa-fosfato isomerasa Fosfoglicerato mutasa X X X X X X X X X Fosfoglicerato quinasa Glucosa-fosfato isomerasa Lactato deshidrogenasa X X X X X X Fumarasa X X Aldo/queto oxidorreductasa Tiorredoxina peroxidasa Precursor de Glutatión peroxidasa Glutatión transferasa X X X X X Hipotética oxidorreductasa FAD dep. Precursor de transglutaminasa Disulfuro isomerasa X X X X X X 140 hospedadores de D. immitis tienen una base molecular. El acortamiento del ciclo vital de los vermes de D. immitis en el gato y el humano, con respecto a lo que ocurre en el perro, podría relacionarse con una mayor capacidad para bloquear con anticuerpos, algunas proteínas fundamentales implicadas en los mecanismos de generación de energía y de evasión de la respuesta inmune por parte del parásito. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Referencias [1] Oleaga A, Pérez-Sánchez R, Pagés E, Marcos$W[XWHJL&6LPyQ),GHQWL¿FDWLRQRILPPXQRreactive proteins from the dog heartworm (Diro¿ODULDLPPLWLVGLIIHUHQWLDOO\UHFRJQL]HGE\WKH sera from dogs with patent or occult infections. Mol Biochem Parasitol 2009;166:134-141. ,GHQWL¿FDFLyQ GH SURWHtQDV GH Neospora caninum implicadas en procesos de invasión y virulencia Virginia Marugán-Hernández1, Javier Regidor-Cerrillo1, Gema Álvarez-García1, Fiona Tomley2, Adriana Aguado-Martínez1, Mercedes Gómez-Bautista1, Luís Miguel Ortega-Mora1 1 SALUVET. Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid.2Division of Microbiology. Institute for Animal Health. Reino Unido La neosporosis bovina es una de las principales causas de fallo reproductivo en el ganado bovino a nivel mundial [1]. Neospora caninum, agente etiológico de esta enfermedad, es un protozoo intracelular obligado perteneciente al phylum Apicomplexa y reODFLRQDGR¿ORJHQpWLFDPHQWHFRQToxoplasma gondii. ([LVWH XQD GLYHUVLGDG LQWUDHVSHFt¿FD GHPRVWUDGD entre aislados de N. caninum desde el punto de vista genético [2] y fenotípico (patogenicidad in vivo, tasas de crecimiento e invasión in vitro) (RegidorCerrillo y col., manuscrito enviado). Por otra parte, en la invasión de la célula hospedadora están implicadas tres tipos de organelas secretoras, micronemas, roptrias y gránulos densos. En concreto, las roptrias han sido descritas como factores de virulencia en T. gondii [3]. Se ha idenWL¿FDGRXQJUDQQ~PHURGHSURWHtQDVGHURSWULDVHQ T. gondii mientras que en N. caninum únicamente NcROP2 ha sido caracterizada [4]. Por todo ello, el objetivo del presente estudio fue UHDOL]DUXQDQiOLVLVGLIHUHQFLDOGHORVSHU¿OHVGHH[presión proteica entre distintos aislados de N. caninum para dilucidar los mecanismos implicados en la virulencia del parásito. Por otro lado, se procedió a la LGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVURSWULDVSRWHQFLDOPHQWHUHlacionadas con los procesos de invasión y virulencia. Los extractos proteicos empleados fueron obtenidos a partir de taquizoítos -fase de replicación rápida- mantenidos en cultivos celulares de células 0$5&\SRVWHULRUPHQWHSXUL¿FDGRVPHGLDQWH columnas desaladoras PD-10. OBJETIVO 1: La técnica DIGE fue empleada en el estudio comparativo de expresión proteica diferencial de aislados que presentaron diferencias de patogenicidad: dos aislados virulentos (Nc-Liv y Nc-Spain7) y uno naturalmente atenuado (NcSpain1H). Se realizaron seis réplicas de geles y que fueron analizadas con el software DeCyder v6.0. Las manchas proteicas con una abundancia relativa mayor o menor que 1,3 con una p < 0,05 (t de Student) fueron consideradas diferencialmente expresadas. Algunas de estas manchas fueron escindidas del gel para su posterior análisis por MALDI-TOF. 2%-(7,923DUDODLGHQWL¿FDFLyQGHODVSURWHtnas de roptrias se obtuvieron fracciones enriquecidas en organelas secretoras a partir de los taquizoítos de Nc-Liv mediante fraccionamiento subcelular. Sobre las fracciones enriquecidas en roptrias se llevó a cabo ODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVORFDOL]DGDVHQXQUDQJR de peso molecular de 37 a 250 kDa, mediante nanocromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en trampa iónica LQT linear. 141 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 En ambos estudios proteómicos se empleó el algoritmo MASCOT frente a las bases de datos del NCBI nr y ToxoDB v5.1 para llevar a cabo las idenWL¿FDFLRQHVSURWHLFDV y en la invasión. Además, se observó una mayor abundancia de la proteína de membrana NcPDI, y de aquellas de organelas como NcMIC1, NcROP8 y NcNTPasa en aquellos aislados más virulentos, todas ellas relacionadas con los mecanismos de invasión y proliferación. Resultados y conclusiones OBJETIVO 2: A partir de las fracciones subcelulares enriquecidas en roptrias se obtuvo un amplio Q~PHURGHLGHQWL¿FDFLRQHV7DEOD$OJXQDVGHODV nuevas proteínas, denominadas “ROP”, presentaron homólogos en T. gondii, si bien no siempre estaban situadas en el mismo locus. Por otra parte, la aparición de una serie de kinasas y fosfatasas indica la existencia de posibles factores de virulencia, y OD LGHQWL¿FDFLyQ GH SURWHtQDV ³521´ LQGLFDUtD OD existencia de la “unión móvil” durante el proceso de invasión, tal como ocurre en T. gondii. OBJETIVO 1: Un total de 124 manchas proteicas mostraron una expresión diferencial. Nueve al comparar Nc-Liv y Nc-Spain1H, 50 al hacerlo con Nc-Liv y Nc-Spain 7 y 65 entre Nc-Spain7 y Nc-Spain1H. A partir de ellas se consiguió la idenWL¿FDFLyQGHPDQFKDVFRUUHVSRQGLHQWHVDSURteínas que se detallan en la Tabla 1. Entre ellas, se observaron variaciones en algunas isoformas de las proteínas actina y miosina dependientes del aislado, implicadas ambas en la motilidad del parásito Tabla 1. Proteínas de roptrias de N. caninum. Proteína pI/Mr N'D Teórico Identidad Nº péptidos Secuencia 1$FFHVR Abundancia Función NTPase 5,56/69,6 34 21 NCLIV 145870 NcSp7>NcSp1H* 1F/LY1F6S+ Captación de purinasvirulencia aspartyl-tRNA synthetase 5,95/62,8 48 13 NCLIV 082700 NcSp7>NcSp1H 1F/LY1F6S+ Síntesis de proteínas microneme-associated protein (NcMIC1) 4,79/50,1 46 18 gi 17226315 NcSp7>NcSp1H 1F/LY1F6S+ Invasión elongation factor 2 5,93/94 38 29 NCLIV 081030 NcSp7>NcSp1H 1F/LY1F6S+ Síntesis de proteínas glucose-6-phosphate dehydrogenase 8,59/112,6 21 17 NCLIV 010690 NcSp7>NcSp1H 1F/LY1F6S+ Metabolismo ROP8 6,29/43,2 66 23 NCLIV 000700 NcSp7>NcSp1H 1F/LY1F6S+ Invasiónproliferación myosin light chain 4,55/24,9 46 18 NCLIV 000030 NcSp7<NcSp1H NcLiv=NcSp1H Invasiónmotilidad glycine hydroxymethyltransferase 6,26/55,2 43 10 NCLIV 123730 NcSp7<NcSp1H NcLiv=NcSp1H Metabolismo SURWHLQGLVXO¿GH isomerase 5,18/53,2 62 26 NCLIV 051400 NcSp7>NcSp1H NcLiv>NcSp1H Plegamiento de proteínas actin 5,05/42,6 72 24 NCLIV 020800 NcSp7<NcSp1H NcLiv<NcSp1H Invasiónmotilidad 6-phosphogluconate dehydrogenase 6,28/55,2 45 24 NCLIV 140400 NcSp7>NcSp1H NcLiv=NcSp1H Metabolismo porin 8,87/31,5 48 14 NCLIV 090640 NcSp7<NcSp1H NcLiv=NcSp1H Transporte transmembrana * >LQGLFDXQLQFUHPHQWRVLJQL¿FDWLYRHQODDEXQGDQFLDGHODSURWHtQDHQWUHORVDLVODGRVGHQRWDODWHQGHQFLDGH LQFUHPHQWRHQODH[SUHVLyQS! & Resultados mostrados por la isoforma mayoritaria. 142 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 (VWHHVWXGLRKDSHUPLWLGRLGHQWL¿FDUXQDVHULHGH proteínas potencialmente implicadas en procesos de invasión y virulencia. Estas proteínas podrían cons- tituir un nuevo arsenal de dianas terapéuticas e inmuQRSUR¿OiFWLFDVIUHQWHDODLQIHFFLyQSRUN. caninum. Tabla 2. 3URWHtQDVLGHQWL¿FDGDVH[SUHVDGDVGHIRUPDGLIHUHQFLDOHQWUHDLVODGRVGH1FDQLQXP Proteína de N. caninum Homólogo en T. gondii Mismo locus Identidad 3RVLWLYRV surface protein rhoptry rhoptry 1 SI 65.9 28 38 ROP8 ROP8 NO 348 43 64 rhoptry antigen rhoptry protein 5 SI 213 53 67 surface protein rhoptry rhoptry protein 5 SI 282 51 63 rhoptry antigen rhoptry 1 NO 70.5 29 38 Rhoptry neck protein 4 rhoptry neck protein 4 SI 902 65 78 rhoptry neck protein 2 SI 2209 72 81 rhoptry neck protein 3 SI 3262 78 88 hypothetical protein rhoptry neck protein 8 SI 4298 82 91 hypothetical protein protein kinase SI 758 80 89 conserved hypothetical protein hypothetical protein acid phosphatase acid phosphatase SI 741 88 92 mitogen-activated protein kinase-related Protein kinase domain protein NO 99 27 46 Subtilisin-like serine protease subtilisin-like protein TgSUB1 SI 373 62 73 subtilase family serine protease, subtilisin SI 1123 57 67 serine/threonine protein phosphatase, serine/threonine protein phosphatase SI 2265 69 82 Subtilisin-like serine protease subtilisin-like serine protease SI 1193 100 100 Agradecimientos Agradecemos a Rick Oakes y Vanesa Navarro su excelente apoyo técnico. El trabajo proteómico ha sido realizado por el Servicio de Proteómica UCM-PCM, miembro de la red ProteoRed. VMH HVWi¿QDQFLDGDSRUXQDD\XGD)3,GHO0,&,11(O SUHVHQWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHOSUR\HFWR AGL 2007-60132/GAN. Referencias [1] Dubey, J. P., Schares, G., Ortega-Mora, L. M., Epidemiology and control of neosporosis and Neospora caninum. Clin. Microbiol. Rev. 2007; 20: 323-367. [2] Regidor-Cerrillo, J., Pedraza-Diaz, S., GomezBautista, M., Ortega-Mora, L. M., Multilocus microsatellite analysis reveals extensive genetic diversity in Neospora caninum. J. Parasitol. 2006; 92:517-524. [3] Saeij, J. P., Boyle, J. P., Coller, S., Taylor, S. et al., Polymorphic secreted kinases are key virulence factors in toxoplasmosis. Science 2006; 314:1780-1783. [4] Debache, K., Guionaud, C., Alaeddine, F., Mevissen, M., Hemphill, A., Vaccination of mice with recombinant NcROP2 antigen reduces mortality and cerebral infection in mice infected with Neospora caninum tachyzoites. Int. J. Parasitol. 2008; 38: 1455-1463. 143 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 $SOLFDFLyQ GH HFXDOL]DGRUHV GH SURWHtQDV SDUD OD LGHQWL¿FDFLyQ GH DQWtJHQRV minoritarios de la saliva de Ornithodoros moubata Ricardo Pérez-Sánchez, Ana Oleaga, Mar Siles-Lucas, Verónica Díaz-Martín, Eduardo de la Torre Escudero, Ana Hernández-González, Raúl Manzano-Román Laboratorio de Parasitología Animal. IRNASA. CSIC. Salamanca Resumen El extracto salival (SGE) de la garrapata Ornithodoros moubata contiene una proteína antigénica (Om44) de interés para el desarrollo de una vacuna anti-O. moubata. Om44 es minoritaria en el SGE, ORTXHGL¿FXOWDVXGHWHFFLyQHLGHQWL¿FDFLyQ(OWUDtamiento del SGE con un ecualizador de proteinas permite concentrar a Om44 hasta niveles perfectamente detectables en geles 2D teñidos con plata e LGHQWL¿FDU D ODV SURWHtQDV SUHVHQWHV HQ HO VSRW FRrrespondiente, aunque para ello haya que recurrir a la secuenciación de novo por estar O. moubata muy poco secuenciada. Ornithodoros moubataHVXQDUJiVLGRHQGy¿OR africano que se refugia en el interior de las madrigueras de los animales salvajes, de las pocilgas domésticas e incluso de las viviendas humanas. vestigación de vacunas antigarrapata como método alternativo de control. En trabajos anteriores nuestro equipo inició el desarrollo de una vacuna anti-O. moubata inmunizando cerdos con un extracto proteico de glándulas salivales (SGE) de este argásido. El SGE indujo una respuesta inmunitaria capaz de reducir hasta en un 70% las tasas de alimentación y reproducción del argásido. El antígeno inductor de esta respuesta es una proteína de 44 kDa (Om44) que se une a la molécula P-selectina del hospedador, lo que previsiblemente bloquea las respuestas hemostáticas mediadas por la P-selectina y permite a la garrapata completar la ingesta de sangre [1]. Consecuentemente, nuestro siguiente objetivo IXH OD LGHQWL¿FDFLyQ GH 2P FRPR SDVR SUHYLR para su clonación y obtención en forma recombi- Figura 1. SGE sin ecualizar separado en geles 2D (12% acrilamida, pH 3-10) teñidos con plata (A) y Sypro rubi (B). Western blot con suero de cerdo vacunado con SGE (C). Sus principales hospedadores son los facoceros, los cerdos y las personas, a los que puede transmitir graves enfermedades como la Peste porcina africana y la Fiebre recurrente humana. La eliminación de esta garrapata del medio sinantrópico puede facilitar el control de las citadas enfermedades. Los inconvenientes del uso de acaricidas en la lucha contra las garrapatas han favorecido la in- QDQWH$ERUGDPRVGLFKDLGHQWL¿FDFLyQPHGLDQWHXQD estrategia proteómica clásica: separación del SGE en geles 2D, localización del spot correspondiente a Om44 y análisis del mismo por espectrometría de masas. Esta estrategia se enfrentó con dos problemas. El primero es que Om44 es minoritaria en el SGE y, aunque su spot sí se detecta en western blot 2D usando sueros de cerdos vacunados, no es 144 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 visible en geles 2D teñidos con plata o con Sypro Rubi (Figura 1). Para solucionar este problema, el SGE se trató con un equalizador de proteínas [2] utilizando el kit ProteoMiner Protein Enrichment (Bio-Rad). El SGE ecualizado se resolvió en geles 2D y se analizó en western blot 2D, lo que permitió localizar y cortar el spot correspondiente a la Om44 (44 kDa, pI 6,8), claramente visible ahora en geles 2D teñidos con plata (Figura 2). Solucionado el primer problema, el segundo al que nos enfrentamos fue que O. moubata está aun muy poco secuenciado, como ocurre en general con RWUDVJDUUDSDWDV>@(VWRGL¿FXOWDODLGHQWL¿FDFLyQ por comparación de huellas peptídicas y espectros de fragmentación, obligándonos a recurrir a la secuenciación de novo de péptidos trípsicos de Om44. El inconveniente de la secuenciación de novo es que es caro y sus resultados no siempre garantizan la LGHQWL¿FDFLyQ>@/DYHQWDMDHVTXHODVVHFXHQFLDV peptídicas de novo pueden utilizarse como base para el diseño de oligonucleótidos con los cuales abordar ODDPSOL¿FDFLyQ\FORQDMHGHOF'1$FRGL¿FDQWHGH Om44 sin conocer a priori la identidad de la pro- teína. Los resultados de la secuenciación de novo de los péptidos procedentes del spot de la Om44 VH PXHVWUDQ HQ OD WDEOD 6H KDQ LGHQWL¿FDGR proteínas, lo cual plantea un nuevo problema: ¿cuál de ellas es la proteína Om44?. Teniendo en cuenta parámetros proteómicos, como el score, pI y peso molecular, y biológicos, como su localización citoplasmática, pensamos que enolasa o actina pueden VHU 2P (O UHVWR GH ODV SURWHtQDV LGHQWL¿FDGDV quizá sean contaminaciones, aunque no podemos descartar que algunas de ellas tengan un homólogo en O. moubata con un peso molecular y pI compatibles con los del spot analizado. Figura 2. SGE equalizado separado en geles 2D (12% acrilamida, pH 5-8) teñidos con plata (A). Western blot con suero de cerdo vacunado con SGE (B). Tabla 1. 3URWHtQDVLGHQWL¿FDGDVSRUVHFXHQFLDFLyQGHQRYRDSDUWLUGHOVSRWFRUUHVSRQGLHQWHD2P Numero de acceso Proteína Péptido Score pI / MW teóricos Función P06733 Enolasa. Homo sapiens 239 175,5 6.73 / 47024 Glucólisis, Fibrinolisis 4/*: Actina. Ornithodoros moubata 217 5.29 / 41793 Estructural P25705 $73VLQWKDVHVXEXQLWĮPLWRcondrial precursor. H. sapiens 520 P09867 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1. Bos taurus 56 B7Q349 Elongation factor-1. Ixodes scapularis P15252 VVIGMDVAASEFFR252 20 AGFAGDDAPR29 LCYVALDFEQEMATAASSSSLEK239 94,6 1 EIVTNFLAGFEA531 80,8 9.16 / 59750 Síntesis de ATP GFGFVTYATVEEVDAAMNAR75 55,1 9.27 / 34196 Procesamiento y transporte de RNA 111 NMITGTSQADCAVLIVAAGTGEFEAGISK129 52,6 9.13 / 50753 Biosíntesis de proteínas 1 Elongation factor Hevea brasiliensis 43 SGPLQPGVDIIEGPVK58 50,4 P81605 1 43 ENAGEDPGLAR53 50,2 P0ACT0 1 HTH-type transcriptional regulator acrR. Escherichia coli Dermcidin. Homo sapiens 5.04 / 14721 6.09 / 11283 5.66 / 24766 42,8 AQLGVQAFADALLIIPK449 42,0 6.24 / 58024 Chaperona Plegamiento de proteínas AEMIELNDR107 40,9 5.16 / 52844 Estructural. Filamentos citoesqueleto 40,3 9.65 / 23283 Biosíntesis de proteínas Chaperone containing T-complex protein 1 subunit z. Homo sapiens 433 P24789 Vimentin-1/2 Xenopus laevis 99 1 1 Posibles contaminantes Regulación de la trancripción RAAIIMR168 P40227 Translation initiation factor IF-3. Mycoplasma pulmonis Antimicrobiano. 162 1 Q98QV2 Alérgeno 141 ELGIDTLNR149 145 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Agradecimientos [2] Righetti PG, Bochetti E, Lomas L y Citterio A. Protein Equalizer Technology: The quest for a democratic proteome. Proteomics 2006;6:3980-92 [3] Francischetti IMB, Sá-Nunes A, Mans BJ, Santos, IM y Ribeiro JMC. The role of saliva in tick feeding. Front Biosci 2009;14:2051-88 [4] Oleaga A, Escudero-Población A, Camafeita E y Pérez-Sánchez R. A proteomic approach to WKHLGHQWL¿FDWLRQRIVDOLYDU\SURWHLQVIURPWKH argasid ticks Ornithodoros moubata and Ornithodoros erraticus. Insect Biochem Mol Biol 2007;37:1149-59. 7UDEDMR ¿QDQFLDGR SRU OD -XQWD GH &DVWLOOD \ León (CSI07A08). Referencias [1] García-Varas S, Manzano-Román R, FernádezSoto F, Encinas-Grandes A, Oleaga A y Pérez6iQFKH] 5 3XUL¿FDWLRQ DQG FKDUDFWHUL]DWLRQ of a P-selectin binding molecule from the salivary glands of Ornithodoros moubata that induces protective anti-tick immune responses in pigs. Int J Parasitol 2009, doi:10.1016/j. ijpara.2009.08.011 ,GHQWL¿FDFLyQSURWHyPLFD\DQiOLVLVELRLQIRUPiWLFRGHSURWHtQDVVHFUHWDGDVSRU el protozoo parásito Trypanosoma cruziSHUWHQHFLHQWHVDODIDPLOLD0$63Mucin associated Surface Proteins Luis Miguel De Pablos ,Gloria González, Víctor Seco Hidalgo, Isabel María Díaz Lozano, Antonio Osuna Instituto Biotecnología. Universidad de Granada. Grupo de Parasitología Bioquímica y Molecular Resumen El agente causal de la tripanosomiasis o enfermedad de Chagas es el protozoo parásito Trypanosoma cruzi. Dicho parásito es un organismo intracelular obligado que utiliza una enorme cantidad de tipos celulares para multiplicarse. Durante el proceso de entrada e invasión celular, T. cruzi secreta una serie de proteínas encargadas del reconocimiento de la célula hospedadora y la posterior entrada del protozoo en ella. (QHOSUHVHQWHWUDEDMRVHGHVFULEHODLGHQWL¿FDFLyQ de dos proteínas pertenecientes a la familia MASP (Mucin Associated Surface Protein) secretadas tras dos horas de interacción célula-parásito. Las secuencias de estas proteínas poseen las características básicas de la familia MASP con dos regiones hidrofóbicas en los extremos N- y C- terminal y una región central en el cual existen sitios para la N-glicosilación. Tras mapear epítopos de tipo MHC-I en las secuencias encontramos varias regiones en las proteínas que podrían compor- tarse potencialmente como posibles lugares que estimularan la generación de una respuesta inmune celular frente a T. cruzi. Como conclusión, consideramos que ODVSURWHtQDV0$63LGHQWL¿FDGDVSXHGHQVHUSRWHQciales antígenos inmunógenos y posibles herramientas diagnósticas para evaluar una respuesta humoral frente a éstas durante el transcurso de la enfermedad. Trypanosoma cruzi HV XQ SURWR]RR ÀDJHODGR perteneciente al Orden Kinetoplástida y agente etiológico de la tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas, estimándose en unos 16-18 millones las personas infectadas principalmente en Centro y Sudamérica [1, 2]. La familia MASP (Mucin Associated Surface Protein) descrita por primera vez tras el desarrollo y posterior publicación de los datos del genoma de T. cruzi, constituye una extensa familia génica que representa el 6% del genoma del parásito aproximadamente [3]. Las MASPs, pueden mosWUDUPRGL¿FDFLRQHVSRVWWUDGXFFLRQDOHVVLPLODUHVD las de las mucinas, describiéndose como proteínas N-glicosiladas [4]. Las aproximaciones proteómi- 146 cas realizadas, muestran como la expresión de las MASPs es pequeña en comparación con el número de genes encontrados. Si bien no se conocen los mecanismos que han permitido la expansión de la familia de las MASPs en T. cruzi, la presión inmune pudiera constituir la fuerza inductora que ha provocado la amplia presencia de genes masp en el genoma del trypanosomatidos. Se estudió el medio de interacción célula-parásito, incubándose durante dos horas la fase trypomastigota metacíclica de T. cruzi con células Vero HQPRQRFDSD8QDYH]SXUL¿FDGRHOPHGLRVHVHOHFcionaron diferentes bandas en geles de SDS-PAGE XQLGLPHQVLRQDOHV SDUD VX SRVWHULRU LGHQWL¿FDFLyQ mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF y MALDI-TOF-TOF) y análisis mediante trampa iónica de los péptidos fragmentados. 8QD YH] LGHQWL¿FDGDV ODV VHFXHQFLDV PHGLDQWH los motores de búsqueda Mascot y proteome discover, estas se analizaron en busca de motivos estructurales mediante el paquete de software bioinformático de ExPASy (http://www.expasy.ch/tools/). Además se realizó un mapeo de epítopos para éstas, utilizando los programas BIMAS y SYFPEITHI. 7UDV HO DQiOLVLV SURWHyPLFR LGHQWL¿FDPRV GRV nuevas proteínas pertenecientes a la familia MASP de T. cruzi. Estas proteínas poseen pesos moleculares de 52 kDa y 5 kDa, siendo secretadas durante el proceso de invasión celular por parte del parásito. Tras la búsqueda de motivos estructurales encontramos que existían dos regiones N- y C- terminal altamente hidrofóbicas, un lugar para N-Glicosilación y en el caso de la proteína de 52 kDa un lugar de unión a ATP/GTP (P-loop). Estas proteínas poseen potenciales epítopos de clase MHC-I principalmente en los extremos de las secuencias coincidiendo con las regiones más hidrofóbicas de éstas. Los epítopos se sitúan en las 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 posiciones conservadas para esta familia, generándose un panel de péptidos potencialmente positivos para ser expuestos por moléculas MHC-I. La obtención en el medio de interacción célulaparásito de dos miembros pertenecientes a la familia MASP indica que proteínas pertenecientes a esta familia son capaces de secretarse y de poseer una posible implicación en la entrada del parásito en la célula hospedadora. Además los epítopo encontrados demuestra como estas secuencias están potencialmente implicadas en la generación de una respuesta inmune celular frente al parásito. Por tanto, la familia MASP será en un futuro objeto de nuestros estudios tanto como posible diana terapéutica como herramientas diagnósticas debido a su clara exposición al sistema inmunitario durante una infección por T. cruzi. Referencias >@ :RUOG+HDOWK2UJDQL]DWLRQ&RQWURORI&KDJDV disease 2002; 905: 1-109. [2] Tarleton RL, Reithinger R, Urbina JA, Kitron U. y Gürtler RE. The Challenges of Chagas Disease-Grim Outlook or Glimmer of Hope? PloS Med 2007; 4: 1852-1857. [3] El-Sayed NM, Myler PJ, Bartholomeu DC, Nilsson D, Aggarwal G, Tran AN, Ghedin E E, :RUWKH\$'HOFKHU$/\%ODQGLQ*7KHJHnome sequence of Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease. Science 2005; 309: 409–415. [4] Bartholomeu, DC, Cerqueira GC, Lea AA, daRoFKD:'3DLV)%0DFHGR&'MLNHQJ$7H[HLUD SMR y El-Sayed NM. Genomic organization DQGH[SUHVVLRQSUR¿OHRIWKHPXFLQDVVRFLDWHG surface protein (masp) family of the human pathogen Trypanosoma cruzi. Nucleic Acids Res 2009; 1–11. 147 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 ([SHULPHQWDOWKHRUHWLFVWXG\RISHSWLGH¿QJHUSULQWVLQLeishmania parasites M. Auxiliadora Dea-Ayuela1, Riccardo Concu2, Lazaro G. Perez-Montoto3, Eugenio Uriarte3, Francisco Bolás-Fernández4, Florencia Ubeira2, Humberto González-Díaz2 1 Faculty of Experimental and Health Sciences, Department of Chemistry, Biochemistry and Molecular Biology, Cardenal Herrera University, 46113, Moncada, Valencia, Spain. 2Faculty of Pharmacy, Department of Microbiology and Parasitology, 3Faculty of Pharmacy, Department of Organic Chemistry University of Santiago de Compostela, 15782 Santiago de Compostela, Spain. 4Faculty of Pharmacy, Department of Parasitology, Complutense University, 28040, Madrid, Spain Abstract The number of protein and peptide structures parasites, their hosts, and other organisms, released to Protein Data Bank (PDB) and Gen Bank without functional annotation has increased. Using Proteomics tools such as MASCOT, we can perform function annotation of these proteins if we have Mass Spectra (MS) outcomes and there are in databases known template proteins with known function and high similarity scores if not these methods may not succeed. Consequently, there is a high demand for Quantitative Structure-Activity Relationships (QSAR) equations to predict these functions from SURWHLQ ' VWUXFWXUH DQGRU VHTXHQFH :H WUDLQHG and validated a new 3D-QSAR equation based on a 0DUNRY&KDLQ0RGHO0&0WKDWFODVVL¿HVSURWHLQ by their possible mechanism of action according WR(Q]\PH&ODVVL¿FDWLRQ(&QXPEHU[1] using a LeishmaniaSHSWLGHPDVV¿QJHUSULQWVPRGHO7KH methodology proposed here is essentially new, and enables prediction of all EC classes with a single equation without the need for an equation for each class or nonlinear models with multiple outputs. In addition, the model may be used to predict whether one peptide presents a positive or negative contribution of the activity of the same EC class. Materials and methods Stationary promastigotes proteins of the Leishmania infantum strain LEM75 were analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) employing an immobilized linear pH 4-7 gradient for isoelectric focusing. Proteins were visualized by silver stain and spots of interest were excised from preparative 2D gels, and then analyzed by MALDI-TOF and/or MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. [2] In order to predict protein function we used WKH(OHFWURVWDWLFNDQG+,173RWHQWLDOVȝN7KHVH values were used as inputs to construct the QSAR model. The average general potentials depend on the absolute probabilities pk(j) and the total potential with which the amino acid j-th interact with the rest of amino acids. All calculations were carried out with our in-house software MARCH-INSIDE [3]. Results The model predicts EC for 106 out of 151 (70.2%) oxidoreductases, 178/178 (100%) transferases, 223/223 (100%) hydrolases, 64/85 (75.3%) lyases, 74/74 (100%) isomerases and 100/100 (100%) ligases, as well as 745/811 (91.9%) non-enzymes. :HDOVRJLYHDQH[DPSOHLOOXVWUDWLQJWKHVWXG\3HStide Mass Fingerprints (PMFs) of new protein sequences of parasites proteins when traditional alignment search procedures fail. First, we obtained the 2D-Electrophoresis (2DE) localization of the spot for a new protein from Leishmania infantum :H also give MALDI TOF MS characterization and results of MS MASCOT search and detected that all templates with possible enzyme or any other action have low similarity score and/or unknown function. Then, we decided to carry out prediction with our 46$50&0PRGHORIWKHFRQWULEXWLRQWRVSHFL¿F enzyme action of 29 peptides found in the PMF of the new query protein. As the QSAR bases on 3D information, we had to predict previously possible 3D structures of these peptides using Molecular Dynamic (MD) methods. Some of the more interesting peptides were predicted with positive contribution WRVRPHVSHFL¿FHQ]\PHDFWLRQVZKLFKFRLQFLGHG ZLWKDGGLWLRQDO%/$67DOLJQPHQW¿QGLQJV 148 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Conclusion References This combined strategy may be used to identify and predict peptides of proteins from parasite and/ or their hosts when classic proteomics tools fails; which may be of interest in drug or vaccine develoSPHQWDQGRUGUXJWDUJHWLGHQWL¿FDWLRQ [1] C.o.B. Nomenclature, Enzyme Nomenclature. [2] Dea-Ayuela MA, Rama-Iñiguez S, Bolás-Fernández F. Proteomic analysis of antigens from Leishmania infantum promastigotes. Proteomics 2006;6:4187-94. [3] González-Díaz H, González-Díaz Y, Santana L, Ubeira FM, Uriarte E. Proteomics, networks and connectivity indices. Proteomics 2008;8:750-78. 149 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 6. PROTEÓMICA VEGETAL Y ANIMAL Coordinadores: Luis Valledor y Federico Valverde Ubiquitinación de proteínas nucleares en la señalización del ayuno de fosfato en plantas Marina Trigueros, Mónica Rojas-Triana, Maria Luisa Irigoyen, Javier Paz-Ares, Vicente Rubio Departamento de Genética Molecular de Plantas. Centro Nacional de Biotecnología-CSIC. Campus de la UAM. Cantoblanco. Madrid (O SpSWLGR XELTXLWLQD 8E HV XQ PRGL¿FDGRU postraduccional implicado en prácticamente todos los aspectos de la biología celular de los eucariotas [1]. La ubiquitinación, mediada por enzimas E3 8EOLJDVDHVSHFt¿FDVIXQFLRQDJHQHUDOPHQWHFRPR una señal de marcaje de proteínas para su posterior degradación vía el proteosoma. Sin embargo, la Ub también está implicada en la regulación de la función de proteínas a través de cambios en su capacidad para interaccionar con otras proteínas o sustratos, control de su localización subcelular o de VXVXVFHSWLELOLGDGSDUDVHUGLDQDGHRWUDVPRGL¿FDciones postraduccionales [1]. En plantas, la Ub está asociada a diversos procesos de señalización y respuesta a estrés, incluyendo el ayuno de fosfato [2]. Este último es un nutriente esencial para el desarrollo de cualquier organismo. La implicación de la Ub en el control de la homeostasis de Pi se basa en parte en la caracterización del gen PHO2 de Arabidopsis. Este gen controla la distribución de Pi entre la raíz y la parte aérea de la planta [3]. La proteína PHO2 es similar a enzimas con actividad E2/E3 Ub ligasa, aunque su función bioquímica y sus posibles proteínas diana se descoQRFHQ3RURWUDSDUWHQXHVWURJUXSRKDLGHQWL¿FDGR 5 E3 Ub ligasas nucleares cuya expresión depende del aporte de Pi al medio y que afectan a la expresión de genes de respuesta al ayuno de Pi. Estos resultados sugieren que la señalización del ayuno de Pi en plantas implica el control de la acumulación de proteínas reguladoras mediado por la ruta de ubiquitinación y degradación por el proteosoma (UPS). 3URSRQHPRVGRVHVWUDWHJLDVFRQHO¿QGHHYDOXDUHO papel regulador de la ruta UPS en la regulación de la respuesta a dicho estrés; una dirigida, analizando el efecto que tiene la sobreexpresión de las 5 (8EOLJDVDVLGHQWL¿FDGDVHQHOSURWHRPDQXFOHDU bajo distintos aportes de Pi. La otra, mas genérica, WUDWDQGR GH LGHQWL¿FDU SURWHtQDV UHJXODGRUDV FX\D acumulación dependa de la concentración de Pi en el medio y de la presencia/ausencia de inhibidores del proteosoma. Durante el desarrollo de este congreso se mostrarán nuestros avances más recientes siguiendo ambas aproximaciones. Referencias [1] Ulrich H. Mutual interactions between the SUMO and ubiquitin systems: a plea of no contest. Trends Cell Biol. 2005;15: 525-532. [2] Downes B. And Vierstra R.D. Post-translational regulation in plants employing a diverse set of polypeptide tags. Biochem. Soc. Trans. 2005;33: 393-399. >@ %DUL 5 3DQW %' 6WLWW 0 \ 6FKHLEOH :5 PHO2, MicroRNA399, and PHR1 Define a Phosphate-Signaling Pathway in Plants. Plant Physiol. 2006;141: 988-999. 150 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Proteome profile analysis of Medicago truncatula leaves in response to Uromyces striatus Mª Ángeles Castillejo1, Jesús V. Jorrín2, Diego Rubiales1 1 2 Departamento de Agronomía y Mejora, IAS (CSIC), Córdoba. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, ETSIAM, Universidad de Córdoba Summary The two-dimensional electrophoresis (2-DE) OHDISURWHLQSUR¿OHRIIRXU0HGLFDJRWUXQFDWXODJHnotypes displaying different phenotypes in response to rust (Uromyces striatus) inoculation has been studied. Quantitative as well as qualitative differences were observed between non-inoculated and inoculated plants. Differential spots were analyzed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry and a total of SURWHLQVZHUHLGHQWL¿HGEHORQJLQJWRWKHIXQFWLRnal category of metabolism with a high proportion being photosynthetic and stress-related proteins. Introduction Alfalfa rust (U. striatus) is an important disease of worldwide distribution, being particularly damaging in alfalfa (Medicago sativa) grown for seed SURGXFWLRQ>@:HKDYHFKRVHQM. truncatula as a more tractable biological system to study the proteomic response to rust. Genotypes were selected based on its differential responses to U. striatus infection [1, 2]: A17, susceptible; Grc.098 showing posthaustorial resistance; F11.008 and Paraggio showing pre-haustorial resistance. Leaf proteins from non-inoculated and rust inoculated M. truncatula plants were extracted and resolved by 2-DE, and the differential spots were analyzed by mass spectrometry. Methodology M. truncatula seedlings were inoculated when the third trifoliate leaf was completely expanded. Leaves were collected 48 hours post inoculation (hpi) for microscopic observations [1]. For proteomics analyses, inoculated and non-inoculated plants were sampled 24 and 48 hpi. Proteins from leaf tissue were TCA/acetone extracted [3] and resolved by 2-DE. Gels were silver and SyproRuby stained and the images were analysed with the PD-Quest software (BioRad). Those spots that showed statisWLFDOO\VLJQL¿FDQWGLIIHUHQFHVSLQLQWHQVLW\ were considered for further analysis. Differential spots were excised from gels and digested with tripsin. Peptide fragments from digested proteins were then subjected to mass spectrometry. A PMF (peptiGHPDVV¿QJHUSULQWLQJVHDUFKZDVSHUIRUPHGRYHU non-redundant MSDB database using the MASCOTsearch engine. Results and Discussion Differences in rust responses among genotypes were evident 48 hpi (table 1). Of the appressoria successfully formed on a stoma, less were able to penetrate the stoma and form a substomatal vesicle (SV) on F11.008 and Paraggio than on the other genotypes. Differences were also found in the rate of KDXVWRULDIRUPDWLRQZKLFKZDVVLJQL¿FDQWO\ORZHU in F11.008 and Paraggio genotypes. However units associated with host cell necrosis was markedly higher in Grc.098. Of a total of 37 differential spot SURWHLQVEHWZHHQWUHDWPHQWVZHUHLGHQWL¿HGDIWHU 0$/',72)72)DQGGDWDEDVHVHDUFK:HIRXQG an increase of stress-related proteins in pre-haustoULDOJHQRW\SHVWDEOH¿JXUHDQGWZRSURWHLQVEHlonging to other functional categories (glycine-rich RNA binding protein and malate dehydrogenase) which have been involved in transcriptional regulation by different effectors related to plant defense UHVSRQVHV>@:HFRQFOXGHWKDWWKHH[SUHVVLRQRI proteins was different in relation to susceptibility/ resistance of the genotypes studied at early stage of the infection and the clear increase of stress-related proteins only in the genotypes with pre-haustorial resistance makes us suspect that these proteins may be involved in the stop of parasite development before forming haustoria. 151 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Table 2. ,GHQWL¿HGSURWHLQVWKDWFKDQJHGLQUHVSRQVHWR8VWULDWXVLQRFXODWLRQ a Molecular function Metabolism Medicago truncatula genotypes AI *UF ) Paraggio RuBisCO small FKDLQ>Ĺ@ RuBisCO small FKDLQ>Ļ@ RuBisCO small subunit (4) >Ļ@ 0DODWHGHK\GURJHQDVH>Ĺ@ RuBisCO large VXEXQLW>Ļ@ RuBisCO activase >Ĺ@ Ferredoxin-NADP UHGXFWDVH>Ĺ@ Nucleic acid binding/ Transcription Glycine-rich RNA ELQGLQJSURWHLQ>Ĺ@ Elongation factor Tu, chloroplast SUHFXUVRU>Ļ@ Glycine-rich RNA binding SURWHLQ>Ĺ@ Ascorbate peroxidase >Ĺ@ Defense and stress-related Glutathione peroxidise [new] *OXWDWKLRQHWUDQVIHUDVH>Ĺ@ ,QSDUHQWKHVHVLQGLFDWHQXPEHURIWLPHVWKLVSURWHLQKDVEHHQLGHQWL¿HG>Ĺ@LQGLFDWHLQFUHDVHDQG>Ļ@GHFUHDVHLQ intensity of protein. a $FNQRZOHGJPHQWV The authors thanks to European Union Grain Legumes Integrated Project, Spanish project AGL2008-01239/AGR and Andalusian project P07$*5IRU¿QDQFLDOVXSSRUW References Figure 1. 2DE image gel of M. truncatula leaves proteome. $UURZVLQGLFDWHVLGHQWL¿HGSURWHLQV$3;DVFRUEDWHSHUR[Ldase), EF-Tu (elongation factor Tu), FR (ferredoxin-NADP reductase), GP (glutathione peroxidise), GRP (glycine-rich RNA binding protein), GST (glutathione transferase), MA (malate dehydrogenase), RUB (RubisCo), RUBa (RubisCo activasa). [1] Rubiales D and Moral A. Mechanisms of resistance against alfalfa rust (Uromyces striatus) in Medicago truncatula. Eur J Plant Pathol 2004; 110:239-243. [2] Kemen E, Hahn M, Mendgen K and Struck C. Different resistance mechanisms of Medicago truncatula ecotypes against the rust fungus Uromyces striatus. Phytopathology 2005; 95:153-157. [3] Damerval C, de Vienne D, Zivy M and Thiellement H. Technical improvements in twodimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling proteins. Electrophoresis 1986;7:52-54. [4] Maurino VG, Saigo M, Andreo CS and Drincovich MF. Non-photosynthetic ‘malic enzyme’ from maize: a constituvely expressed enzyme that responds to plant defence inducers. Plant Mol Biol 2001; 45:409–420. [5] Amey RC, Schleicher T, Slinn J, Lewis M, Macdonald H, et al. Proteomic analysis of a compatible interaction between Pisum sativum (pea) and the downy mildew pathogen Peronospora viciae. Eur J Plant Pathol 2008; 122:41-55. Table 1. Microscopical analysis of the early development of U. striatus on M. truncatula x Appr. penetrated forming SV (%) Number of haustoria/ colony Colonies whit necrosis A17 75.0 a 1.8 a 0b Grc.098 76.1 a 1.5 a 51 a F11.008 42.3 b 1.0 b 0 b Paraggio 31.8 b 0.03 c 0b Genotypes x Values with letters in common in each column are not sigQL¿FDQWO\GLIIHUHQWS/6'WHVW 152 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Análisis proteómico del desarrollo sexual mediado por anteridiógeno en el JDPHWR¿WRGHOKHOHFKRBlechnum spicant Virginia Menéndez, Luis Valledor, Angeles Revilla, Helena Fernández Area de Fisiología Vegetal, Departamento B.O.S. Facultad de Biología. Universidad de Oviedo Los helechos actuales son un legado genético de gran valor. Se trata de plantas vasculares con una organización primitiva cuyo ciclo vital consta de una fase gametofítica (haploide) y otra esporofítica (diploide), que se hallan separadas en el espacio y en HOWLHPSR/DIRUPDFLyQGHOHVSRUR¿WRVHSURGXFHHQ HOVHQRGHXQJDPHWR¿WRTXHHVXQDHVWUXFWXUDPRUfológicamente muy sencilla y también muy vulnerable a factores ambientales. La reproducción sexual en este conjunto de especies implica la formación de órganos sexuales femeninos (arquegonios) y masculinos (anteridios) en distintas secuencias cronológicas. Una de estas secuencias implica la formación inicial de órganos femeninos seguida de la formación de los órganos masculinos que es controlada por la presencia de un sistema anteridiógeno. Este sistema inductor se ha relacionado tradicionalmente con las giberelinas [1], aunque en Blechnum spicant aún no se conoce su naturaleza química exacta [2-4]. (QDXVHQFLDGHHVWDVVXVWDQFLDVHOJDPHWR¿WRHVKHUmafrodita (Ceratopteris) o femenino (Blechnum), y éste, una vez alcanzada la madurez, producirá y secretará activamente anteridiógeno que actuará sobre ORV JDPHWR¿WRV HQ GHVDUUROOR LQGXFLHQGR HQ HOORV la masculinidad. Este mecanismo está destinado a evitar la autofecundación. (OJDPHWy¿WRGHOKHOHFKRTXHDSHQDVFRQVWDGH una única capa de células y no presenta interacciones con el tejido esporofítico, se presenta como un sistema experimental ideal para profundizar en el estudio de procesos del desarrollo sexual en plantas. En este trabajo, se han empleado por primera vez técnicas proteómicas para estudiar la expresión GLIHUHQFLDOGHSURWHtQDVHQWUHJDPHWR¿WRVTXHVHKDQ desarrollado en presencia y en ausencia de sustancias con acción anteridiógena. En primer lugar se extrajeron anteridiógenos de FXOWLYRVGHJDPHWR¿WRVDGXOWRVVLJXLHQGRHOPpWRGR de Yamauchi [5], y posteriormente se añadieron a medio de cultivo MS para generar un sistema de in- ducción de masculinidad. A este medio se añadieron JDPHWR¿WRV GH GtDV GH HGDG \ WUDV XQ SHULRGR de cultivo de 20 dias, se caracterizaron (estado de desarrollo, órganos sexuales) y se compararon con JDPHWy¿WRVGHOPLVPRRULJHQFXOWLYDGRVHQPHGLR de cultivo sin anteridiógeno (Control). $PERVWLSRVGHJDPHWR¿WRVVHWULWXUDURQHQQLtrógeno líquido (50 mg de peso seco por muestra) y ODSURWHtQDVHSXUL¿FyPHGLDQWHH[WUDFFLyQIHQyOLFD seguida de precipitación en acetato de amonio en metanol descrito por Carpentier [6]. La concentración de proteínas se midió por medio de Bradford y las muestras se almacenaron a -80ºC hasta que se realizó el isoelectroenfoque. Para ello se utilizaron 10 tiras de 24 cm con un rango de pH 3-10 no lineal, que fueron rehidratadas todas a la vez de forma pasiva con 550 µg de proteína en 450 µL de tampón de solubilización. El isoelectroenfoque se realizó siguiendo las recomendaciones del fabricante (GE Healthcare). Una vez terminado el enfoque las tiras fueron equilibradas posteriormente almacenadas a -80ºC. La segunda dimensión SDS-PAGE se llevó a cabo en geles de poliacrilamida al 13%. Posteriormente se tiñeron con azul de Coomassie coloidal G-250 durante 20 horas (3 veces) siguiendo el protocolo de Mathesius et al. [7]. Las imágenes de los geles se adquirieron con un densitómetro y se analizaron con software PDQuest 8 (Biorad). Tras una revisión manual, se contabilizaron 581 spots bien resueltos. Solo se consideraron spots que aparecieran en al menos 3 de los 5 geles. Se asignaron valores perdidos empleando el algoritmo KNN aplicado de forma secuencial (R environment). Posteriormente se normalizó la intensidad de los spots y, para reducir la dependencia de la media y la varianza, se realizó una transformación logarítmica. Tras aplicar XQDSUXHEDWFRQĮ VHGH¿QLHURQVSRWV como diferencialmente expresados. 153 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Se aplicó un análisis de componendes principales a todos los spots, permitiendo el PC2 la separación de las muestras en dos grupos. Teniendo en cuenta los análisis uni y multivariables se seleccionaron para su LGHQWL¿FDFLyQDTXHOORVORVVSRWVTXHPRVWUDURQXQ p-valor más bajo en el caso de la prueba T, y aquellos FRQFRH¿FLHQWHVGHFRUUHODFLyQPD\RUHVGHSDUD los componentes principales 1-3. /DLGHQWL¿FDFLyQGHORVVSRWVGLIHUHQFLDOHVSHUmitió describir por primera vez en helechos las rutas metabolicas cuya expresión varía en relación con el desarrollo sexual dependiente de la acción del anteridiógeno. and gender in the gametophyte of Blechnum spicant L. Plant Cell Tiss Org 2006; 86:47-53. [4] Menéndez V, Revilla MA, Bernard P, Gotor V, and Fernández H (2006) Gibberellins and antheridiogen on sex in Blechnum spicant L. Plant Cell Rep 25:1104-1110. [5] Yamauchi T, Oyama N, Yamane H, Murofushi N, Schraudolf H, Pour M, Furber M, Mander /,GHQWL¿FDWLRQRI$QWKHULGLRJHQVLQLygodium circinatum and Lygodium flexuosum. Plant Physiol 1996; 111:741-5. >@ &DUSHQWLHU6&:LWWHUV(/DXNHQV.'HFNHUV3 Swennen R and Panis B. Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues: An evaluation of different methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis. Proteomics 2005; 5:2497-507. >@ 0DWKHVLXV8.HLM]HUV*1DWHUD6+$:HLQman JJ, et al. Establishment of root proteome reference map for the model legume Medicago trunculata using the expressed sequence tag dataEDVHIRUSHSWLGHPDVV¿QJHUSULQWLQJ3URWHRPLFV 2001; 1:1424-40. Referencias [1] Yamane H. Fern antheridiogens. Int Rev Cytol 1998; 184:1-32. [2] Fernández H, Bertrand AM, Sierra MI, SánchezTamés R. An apolar GA-like compound responsible for antheridiogen in Blechnum spicant. Plant Growth Regul 1999; 28:143-4. [3] Menéndez V, Revilla MA, Fernández H. Growth Proteome regulation and epigenetic code during Pinus radiata needle maturation Luis Valledor1, Maria Jesus Cañal1, Christof Lenz3, Roberto Rodríguez1, Jesús Jorrín3 1 Plant Physiology. I.U.B.A. University of Oviedo.C/ Cat. Rodrigo Uria s/n, E-33071 Oviedo, Spain. 2Applied Biosystems Deutschland, Frankfurter Strasse 129-B, Darmstadt, Germany. 3Biochemistry and Molecular Biology. University of Córdoba. Campus de Rabanales. E-14071 Córdoba, Spain Needle differentiation is a very complex process which leads to the formation of a mature photosynthetic organ. This fact implies important changes in protein accumulation and gene expression which must be regulated, amongst others, by epigenetic PHFKDQLVPV :H KDYH FRPSDUHG VRPH HSLJHQHWLF PRGL¿FDWLRQV'1$PHWK\ODWLRQ+LVWRQH+.3m, Histone H3K93m and acetylated Histone H4) present in immature (1 month old) and mature (12 month old) Pinus radiata needles (Figure 1a), determining DWLVVXHVSHFL¿F'1$PHWK\ODWLRQ)LJXUHEDQG the differential expression levels of histone epigenetic marks, being the levels of acetylated Histone H4 and Histone H3K43m, associated to gene expression, higher in immature needles whereas the Histone H3K93m was only found in mature needles (Figure 1c). This could be explained by the fact that chromatin needs to be altered and restructured during the differentiation to regulate gene expression [1]. To determinate which genes and proteins showed as differential during needle development 154 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figure 1. a) Mature (top) and immature (bottom) needle fascicles. b) Immunodetection of 5-mdC. In 3D view the intensity RIHDFKÀXRUHVFHQFHSRLQWLVUHSUHVHQWHGODUJHUYHUWLFDOEDUVLQGLFDWHKLJKHUÀXRUHVFHQFHLQWHQVLW\F5HSUHVHQWDWLYHEORWV VKRZLQJWKHTXDQWL¿FDWLRQRI$F++.3m and H3K93m on protein extracts from immature (I) and mature (M) scions. The left lane corresponds to Coomassie stained MW standards. we have also characterized and compared proteome and transcriptome of immature and mature needles. Immature needles are characterized by a low tissue differentiation and high morphogenetic capability whereas mature needles are a specialized photosynthetic organ, which do not show morphogenetic FDSDELOLWLHV'(SUR¿OHVGHWHUPLQHGIROORZLQJD previously described protocol [2], showed variations in the relative abundance of 280 spots from a total of 856 that were studied whereas transcriptomic analyses (substractive library building and determination of differential expression by macroarray and real time PCR) resulted in the description of 176 differentially expressed genes in immature and mature needles. The joint analysis of proteomic and transcriptomic data that was performed provided a broad overview of differentially expressed genes and proteins associated with needle maturation. Some spots and genes related to photosynthesis and oxidative phosphorylation were overexpressed in mature needles. On the other hand immature needles were characterized by the overexpression of biosynthesis-, cell division- and differentiation-related proteins [3]. A joint data analysis of proteomic and transcriptomic results provided a broader view over differentially expressed pathways associated with needle maturation. Energy metabolism pathways, with photosynthetic and oxidative phosphorylation related proteins and genes, were overexpressed in mature needles. Amino acid metabolism, transcription and translation pathways were overexpressed in immature needles. Interestingly, stress related proteins and defense mechanisms were characteristic of immature tissues, a fact that may be linked to the trees’ need to defend the needles in young stages or the higher growth rate and morphogenetic competence exhibited by this tissue [3]. From these functional groups we have selected ¿YH JHQHV UHODWHG WR SKRWRV\QWKHVLV RBCA), regulation of gene expression (MSI1, CSDP2), leaf elongation (CYP78A7) and stress (SHM4) to further LQYHVWLJDWHLWVVSHFL¿F'1$PHWK\ODWLRQ$OORIWKHVHJHQHVVKRZHGGLIIHUHQWLDOKLVWRQHPRGL¿FDWLRQV detected by Chromatin Immunoprecipitation, furthermore CYP78A7 and CSDP2 showed a sequence ULFKLQ&S*LQLWVSURPRWHUDQG¿UVWH[RQ6SHFL¿F DNA methylation patterns related to tissue differentiation were found for CSDP2>@7KLVLVWKH¿UVW GHVFULSWLRQ RI D VSHFL¿F JHQH UHJXODWLRQ EDVHG RQ epigenetic mechanisms in conifers. 155 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figure 2. Master gel combining spots of B1 and B12 protein extracts (a). Three sections of the 2-DE gels showing two representative B1 and B12 gels (b). Red and green arrows up and down accumulated spots, respectively, while black arrows point spots only detected in one kind of protein extract. )LJXUHCSDP2 showed a differential methylation pattern of cytosines. The callus tissue, without any methylated cytosines, showed the highest expression level of this gene and the higher proportion of AcH4 and H3K43m (all epigenetic marks associated with gene expression). One of these marks, H3K43m, was lost in mature needles, the tissue which showed the lowest expression level. (Valledor et al., in preparation) R, Cañal MJ, Jorrin J. The 2-DE proteome of Pinus radiata needle tissue: analytical, biological YDULDELOLW\DQGSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQ-3URWHRPH Res 2008; 7: 2616-31. References [1] [2] Valledor L, Meijon M, Hasbún R, Cañal MJ, Rodriguez R. Variations in DNA methylation, acetylated histone H4, and methylated histone H3 during Pinus radiata needle maturation in relation to the loss of in vitro organogenic capability. J Plant Physiol 2009; available on line (DOI 10.1016/j.jplph.2009.09.018). Valledor L, Castillejo MA, Lenz C, Rodríguez [3] Valledor L, Jorrín JV, Rodríguez JL, Lenz C, Rodriguez R, Cañal MJ. Combined Proteomic DQG7UDQVFULSWRPLFDQDO\VLVLGHQWL¿HVGLIIHUHQtially expressed pathways associated to Pinus radiata needle maturation. Mol Cell Proteomics, under review. 156 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 (VWXGLRGHODUHVSXHVWDDOHVWUpVKtGULFRHQGRVSREODFLRQHVGHHQFLQDQuercus ilex subsp. ballota 'HVI 6DPS PHGLDQWH XQD DSUR[LPDFLyQ GH SURWHyPLFD comparativa basada en electroforesis bidimensional José Valero Galván1, Rafael Mª Navarro Cerrillo2, Ma Cristina Romero Rodríguez1, David Ariza2, Jesús Jorrín Novo1 1 Grupo de Bioquímica, Proteómica Vegetal y Agrícola. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Córdoba, España. 2 Departamento de Ingeniería Forestal. ETSIAM, Universidad de Córdoba. Córdoba, España Resumen La encina (Quercus ilex subsp. ballota) es una de las especies forestales más importantes del Bosque Mediterráneo, siendo ampliamente utilizada en programas de conservación forestal, reforestación y otras practicas silvícolas. El éxito de dichas prácticas depende, en gran medida, de la supervivencia de las plántulas, siendo el estrés por sequía la principal causa de mortalidad tras el transplante. Es por ello que la selección de “individuos plus” con tolerancia a estrés hídrico es de gran importancia. Los mecanismos de respuesta a estrés en encina y su variabilidad poblacional han sido muy poco estudiados. En el presente trabajo se ha evaluado, mediante una aproximación de proteómica comparativa basada en geles bidimensionales, la respuesta diferencial de dos poblaciones de encina a la sequía. Aunque dicha aproximación revela diferencias en la intensidad de manchas entre tratamientos, no lo hace entre poblaciones, sin que, por otro lado, hayamos podido asociar las diferencias observadas al carácter más o menos tolerante de la población utilizada. Ello puede ser debido a la intensidad y duración del HVWUpVDODVGL¿FXOWDGHVGHOVLVWHPDH[SHULPHQWDOR limitaciones de la técnica. Nuestro grupo de investigación esta trabajando en un proyecto de investigación (Variabilidad, catalogación, respuesta a estreses y propagación clonal de encina (Q. ilex), DECOVA, AGL2009-12243C02-02), dirigido, entre otros objetivos, a estudiar la respuesta de la encina a estrés producido por sequía utilizando una aproximación multidisciplinar, proteómica incluida [1, 2]. La proteómica en especies IRUHVWDOHVQRHVIiFLOGHELGRDVXGL¿FXOWDGFRPR sistema experimental (variabilidad genética alta, ciclo de vida largo, ausencia de entradas en bases de datos de DNA genómico, ESTs o proteínas). No REVWDQWHVXHVWXGLRHVWDMXVWL¿FDGRGDGDODLPSRU- Figura 1. A) Imagen de hojas y raíz de plantas de las dos poblaciones utilizadas a los 28 días del tratamiento de sequía. SSA (población almeriense), GSE (población sevillana). B) Gel 2-DE representativo de extractos de hoja de encina. La imagen corresponde a una muestra de la población SSA a los 28 días del tratamiento de sequía. En la tabla se indican las proteínas LGHQWL¿FDGDVFRUUHVSRQGLHQWHVDPDQFKDVGLIHUHQFLDOHVHQWUHWUDWDPLHQWRV 157 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 tancia económica y medioambiental de la especie, componente principal de la “dehesa” y el Bosque Mediterráneo. Mediante una aproximación de proteómica de expresión diferencial basada en electroforesis bidimensional se han analizados cambios HQHOSHU¿OSURWHLFRGHGRVSREODFLRQHVGHHQFLQD [Almería (SSA) y Sevilla (GSE)] [3] sometidas a HVWUpVKtGULFRPHGLDQWHULHJRGH¿FLWDULRGtDV Previamente se caracterizó la respuesta de las dos poblaciones mediante parámetros de crecimiento, potencial hídrico, humedad relativa en raíz y hojas, \H¿FLHQFLDIRWRVLQWpWLFDUHVXOWDGRVQRSXEOLFDGRV A tenor de los resultados obtenidos se concluyó que la población SSA fue más tolerante, mientras que la población GSE fue la más susceptible (Figura 1A). Estos resultados son similares a los obtenidos en plántulas de encina sometidas a diferentes niveles de estés hídrico [1, 2] y a otras especies forestales como el caso del genero Populus [5], sin que hasta la fecha, y en especies forestales, se haya concluido de forma contundente la base molecular de la respuesta a estrés, y si las consecuencias del estrés. [1] Jorge I, Navarro-Cerrillo RM, Lenz C, Ariza D, Jorrín J, Variation in the holm oak leaf proteome at different plant developmental stages, between provenances and in response to drought stress. Proteomics, 2006; 6: S207–14. Las proteínas de hoja (300 mg) de plantas de un año de crecimiento (control, plantas regadas cada tres días; tratamiento de sequía, plantas no regadas a los 28 días) fueron extraídas usando el protocolo de precipitación TCA-FENOL [4]. Las condiciones de electroforesis, tinción, análisis de los geles y esWDGtVWLFRHLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVVHUHDOL]DURQ como lo indica Maldonado et al. [4]. [2] Echevarría-Zomeño S, Ariza D, Jorge I, Lenzc C, Campo A, Jorrín J, Navarro-Cerrillo, RM. &KDQJHVLQWKHSURWHLQSUR¿OHRIQuercus ilex leaves in response to drought tress and in response to drought stress and recovery. J. Plant Physiol.2009; 166:233–245. [3] Valero GJ, Navarro-Cerrillo RM, Gómez CA, Ariza D, Jorrín J. Population variability and mother tree selection in holm oak (Quercus ilex L. subsp. ballota [Desf.] Samp.) based on acorn morphometry and analysis by near inIUDUHGUHÀHFWDQFHVSHFWURVFRS\1,56 (Submited). [4] Maldonado AM, Echevarria-Zomeno S, JeanBaptiste S, Hernandez M, Jorrin-Novo JV. Evaluation of three different protocols of protein extraction for Arabidopsis thaliana leaf proteome analysis by two-dimensional electrophoresis. J. Proteomics, 2008; 71:461–72. [5] Bonhomme L, Monclus R, Vincent D, Carpin S, Claverol S, Lomenech MA, Labas V, Plomion C, Brignolas F, Morabito D. Genetic variation and drought response in two Populus euramericana genotypes through 2-DE proteomic analysis RIOHDYHVIURP¿HOGDQGJODVVKRXVHFXOWLYDWHG plants. Phytochemistry, 2009; 70: 988–1002. Después de la tinción de los geles y análisis de las imágenes se detectaron alrededor de 350-370 manchas. Tras el análisis estadístico se concluyo que existían 40 manchas diferenciales entre tratamientos y tan solo 4 entre poblaciones (muestras control). Dado el carácter de especie huérfana de enFLQDHOSRUFHQWDMHGHLGHQWL¿FDFLyQIXHEDMRPHQRV del 50 % de las manchas diferenciales. En general, se observó como consecuencia del tratamiento de sequía un descenso en la intensidad de manchas correspondientes a proteínas fotosintéticas, fosfoglicerato-quinasa (glicólisis), peroxiredoxinas (estrés oxidativo) y una glucanasa (proteína de defensa frente a patógenos) (Figura 1B). Por el contrario se observó un aumento de intensidad de la glutamina sintetasa y la s-adenosil-metionina sintetasa. No se HQFRQWUDURQGLIHUHQFLDVHVWDGtVWLFDPHQWHVLJQL¿FDtivas entre las dos poblaciones analizadas, tanto en controles como en tratamiento de sequía. Referencias 158 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Desarrollo y optimización del proceso de extracción de proteínas y electroforesis bidimensional en fruta de hueso Esther Giraldo Ramos1, Amelia Díaz Méndez1, Alfredo Garcia Sánchez2 1 Departamento de Vegetales II. Instituto Tecnológico Agroalimentario (INTAEX) 2 Centro de Investigación “Finca La Orden-Valdesequera” La fruta de hueso es muy inestable y se deteriora muy rápido a temperatura ambiente. El almacenamiento a bajas temperaturas para prolongar su vida puede afectar negativamente a la calidad de la fruta, GHELGRDOGHVDUUROORGHGHVRUGHQHV¿VLROyJLFRVFRnocidos como daños por frió (DF) [1]. La incidencia de estos daños es mayor en unas variedades que en otras [2], por lo tanto su severidad parece tener un componente genético [3]. Conocer los procesos moleculares puede permitir diseñar procedimientos para inducir resistencia o disminuir la sensibilidad al DF. El estudio de la proteomica comparativa es cada vez más atractivo en la biología de plantas dada las amplias bases de datos de secuencia genómicas y EST que proporcionan grandes oportunidades SDUD LGHQWL¿FDU SURWHtQDV /D HOHFWURIRUHVLV ELGLmensional (2D) constituye actualmente el método PiVH¿FLHQWHSDUDODVHSDUDFLyQGHSURWHtQDV\DTXH permite separar cientos, incluso miles de proteínas en un solo experimento. En este trabajo se presenta la optimización de la extracción y separación de proteínas mediante geles bidimensionales a partir del problemático tejido de la fruta. Las proteínas fueron extraídas de la pulpa del melocotón y la nectarina mediante un método ya descrito [4] con ligeUDVPRGL¿FDFLRQHV3DUWLPRVGHJUDPRVGHSROYR de pulpa de melocotón o nectarina, pulverizados en mortero con nitrógeno liquido, resuspendidos en 10 ml de tampón de extracción (100 mM TRIS pH 8.8, 5 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 Mm PMSF y 30% de sacarosa), más fenol saturado en TRIS (pH 8.8) en proporción 1:1 (v/v), mezclamos vigorosamente y se dejó reposar las muestras durante 10 minutos a 4ºC antes de centrifugar (10.000g; 15 minutos; 4ºC), se recuperó la fase fenólica se añadió 1:5 (v/v) volúmenes de Acetato Amónico 100 mM en metanol y se dejó a -20ºC toda la noche. También se probó en este paso el empleo de ácido tricloroacético (ATC) en lugar de Acetato Amónico, sin embargo los resultados fueron decepcionantes. Tras la precipitación, las muestras fueron centrifugadas (10.000g; 15 minutos; 4ºC), y el precipitado lavado 2 veces con acetona fría, y se dejó secar al aire para eliminar los restos de acetona. Finalmente el precipitado de proteínas se resuspendió en tampón de rehidratación (7 M Urea, 2 M thiurea, 4% CHAPS, 2% Pharmalyte, 40 mM DTT). Debido a la baja calidad de los geles, causados por la presencia de sales y contaminantes no proteínicos, se decidió el empleo del PlusOne 2-D Clean-Up kit. El precipitado limpio fue disuelto en tampón (7M Urea, 4% (p/v) CHAPS, 1% (v/v) tampón de inmobilización gradiente de pH 3-11 (GE Healthcare), 0,037 DTT y 0,002% (p/v) azul de bromofenol, conteniendo una tableta de Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche) por cada 10 ml de tampón). La concentración de proteínas extraídas fue determinado utilizando el PlusOne Quant Kit (GE Healthcare). En el Isoelectroenfoque, se utilizarón 150 mg de proteínas/ geles teñidos con plata y 300 mg/ geles teñidos con azul de Coomassie para la rehidratación pasiva de tiras de isoelectroenfoque (IEF) de 13 cm con pH 3-11 “no lineal” (al menos 12 horas). Tras la rehidratación se procedió al IEF a 100, 200, 500 y 1000 V durante 1 hora cada uno, un paso de gradiente hasta 8000 V durante 2:30 horas y 8000 V durante 1 hora en un Ettan IPGphor Manifold (GE Healthcare) a 20ºC y con una corriente máxima de 50 uA/gel. A continuación las tiras fueron incubadas 30 minutos en Tampón de equilibrado (0,075 M Tris, 6 M urea, 29.3% (v/v) glicerol, 2% (p/v) SDS y 0,002% (p/v) azul de bromofenol), los primeros 15 minutos con 0,065 M DTT y la segunda incubación con iodoacetamida (0,135 M). La electroforesis SDS PAGE se realizó en geles (20x20 cm) de poliacrilamida 12,5% (p/v) utilizando tampones >@D:SRUJHO\&GXUDQWHWRGDODQRFKH Los geles fueron teñidos mediante las tinciones de plata, (silver-stain GE Healthcare) y azul Coomassie (GE Healthcare). Los geles obtenidos fueron escáneados y calibrados con el software labscan 6 (GH Healthcare) (Figuras 1 y 2). La mayoría de los protocolos de extracción incluyen un paso de 159 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 precipitación con ATC para incrementar la concentración de proteínas y ayudar a la eliminación de contaminantes [6], sin embargo en ciertas ocasiones, como es nuestro caso, provoca una co-extracción de contaminantes, este es el principal problema de los tejidos de fruta carnoso, que presentan un alto nivel tanto de polisacaridos de pared celular como de pectinas [7]. Una alternativa ya descrita [8] y adoptada por nuestro grupo en el protocolo de extracción fue solubilizar las proteínas con fenol y precipitar con acetato amónico. En este caso se consiguió una alta calidad y cantidad de extracción de proteínas libres de contaminantes. Ya que el fenol ofrece una mayor estabilidad proteica al minimizar la proteolisis durante la extracción [9]. Por otro lado el melocotón y la nectarina presentaron un comportamiento similar en la extracción de proteínas. La electroforesis 2D es actualmente el método de elección para los estuGLRV GH FRPSDUDFLyQ GH SHU¿OHV SURWHLFRV \D TXH se trata de una técnica muy resolutiva empleada frecuentemente en los análisis proteómicos, que permite la generación de datos fácilmente evaluables, así como su comparación cuantitativa [10]. Bibliografía [1] [2] Lill RE, O´Donoghue EM y King GA. Postharvest physiology of peach and nectarines. Horticultural Reviews 1989;11:413-452. Lurie S y Crisosto CH. Chilling injury in Figura 1. Gel teñido con Coomassie peach and nectarine. Postharvest Biol. Technol. 2005;37:195-208. [3] Ogundiwin EA, Peace CP y Gradziel TM. Molecular genetic dissection of chilling injury in peach fruit. Acta Horticulturae 2007;738:633-638. [4] Renaut J, Lutts S, Hoffmann L, et al. Responses of poplar to chilling temperatures: Proteomic and physiological aspects. Plant Biol. 2004;6:81-90. [5] Laemmli UK. Cleavage Of Structural Proteins During Assembly Of Head Of BacteriophageT4. Nature 1970;227:680. [6] Santoni V, Bellini C y Caboche M. Use Of 2-Dimensional Protein-Pattern Analysis For The Characterization Of Arabidopsis-Thaliana Mutants. Planta 1994;192:557-566. [7] Saravanan RS y Rose JKC. A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues. Proteomics 2004;4:2522-2532. >@ +XUNPDQ:-\7DQDND&.6ROXELOL]DWLRQ2I Plant Membrane-Proteins For Analysis By TwoDimensional Gel-Electrophoresis. Plant Physiol. 1986;81:802-806. [9] Schuster AM y Davies E. Ribonucleic-Acid And Protein-Metabolism In Pea Epicotyls .1. The Aging Process. Plant Physiol. 1983;73:809-816. [10] Rabilloud T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics 2002;2:3-10. Figura 2. Gel teñido con Plata 160 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Comparative proteomic analysis of Arabidopsis wild-type, mutants, and Fa WRKY1WUDQVJHQLFSODQWVWRFKDUDFWHUL]HWKHIXQFWLRQRIWKHVWUDZEHUU\Fragaria x ananassa)D:5.<SURWHLQDQGLWV$UDELGRSVLVKRPRORJ$W:5.<WZR positive regulators of resistance Alba Ruíz-Ramos1, Francisco Amil-Ruíz1, Juan Muñoz-Blanco1,3, José Luis Caballero1,3, Ana M. Maldonado Alconada2 1 Plant Biotechnology Research Group and 2Agricultural and Plant Biochemistry and Proteomics Research Group, Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, University of Cordoba,, and 3Andalusian Institute of Biotechnology, Spain :5.<IDFWRUVDUHFHQWUDOSOD\HUVRUFKHVWUDWLQJ WKHHI¿FLHQWDFWLYDWLRQRISODQWGHIHQVHUHVSRQVHV :HKDYHJHQHUDWHG$UDELGRSVLVSODQWVRYHUH[SUHVVLQJWKHVWUDZEHUU\)D:5.<JHQHWKDWH[KLELW enhanced resistance to pathogen infection, and used a proteomic approach to identify differentially accumulated proteins when compared to the FRUUHVSRQGLQJ:7DQGPXWDQW$Wwrky75 parental OLQHV 7KH LGHQWL¿FDWLRQ RI WKH SURWHLQV VKRZLQJ VLJQL¿FDQWGLIIHUHQFHVZLOOJLYHXVVRPHFOXHVRQ the signaling networks in which these two factors might be involved. Plant resistance involves the reprogramming of host cells which relies on major changes in gene H[SUHVVLRQ7KHLGHQWL¿FDWLRQRIWKHPROHFXODUPHchanisms that translate recognition of pathogens into appropriate transcriptional outputs resulting in resistance is a valuable tool in directing programs aimed at generating resistant varieties [1]. Nevertheless, relevant crops of agronomical interest usually contain FRPSOH[JHQRPHVPDNLQJGLI¿FXOWPROHFXODUVWXGLHV This is the case of the interaction between strawberry (Fragaria x ananassa), an important agronomical fruit crop, and Colletotrichum acutatum, a pathogen which infection causes severe yield losses. In a previous work we used the molecular resources of the model plant Arabidopsis for studying this plant-pathogen interaction, and characterize Fa WRKY1WKH¿UVWPHPEHURIWKH:5.<IDPLO\RI WUDQVFULSWLRQDO UHJXODWRUV LGHQWL¿HG LQ VWUDZEHUU\ >@:5.<IDFWRUVDUHFHQWUDOSOD\HUVRISODQWSK\siology and orchestrate the defense transcriptome IRUHI¿FLHQWDFWLYDWLRQRIWKHSODQWGHIHQVHUHVSRQVH against a range of biotic and abiotic stresses [3]. In strawberry, Fa WRKY1 gene is modulated du- ring fruit ripening and strongly up-regulated following Colletotrichum infection, and treatments with defense-related hormones. :H GHPRQVWUDWHG WKDW )D:5.< DQG LWV$UDELGRSVLV KRPRORJ$W :5.<DFWDVSRVLWLYHUHJXODWRUVGXULQJWKHDFWLYDWLRQRIEDVDOWKH¿UVWOLQHRIDFWLYHGHIHQVHLQ plants) and R-mediated resistance (a strong form of UDFHVSHFL¿FUHVLVWDQFHLQ$UDELGRSVLV$Wwrky75 T-DNA insertion mutants were more susceptible to virulent and avirulent isolates of the pathogenic bacteria Pseudomonas syringae, while overexpression of Fa WRKY1 in At wrky75 mutant and wildtype reverts the enhanced susceptible phenotype of the mutant, and even increases resistance. The resistance phenotype of these transgenic plants was uncoupled to the expression of the tipical PATHOGENESIS RELATED (PR) signalling pathway associated with resistance, suggesting differences in the way of action between both factors in order to activate the defense response. In order to investigate the mode of action of $W:5.< DQG )D:5.< DQG WR LGHQWLI\ WKH targets of these factors we are using a differential expression proteomics strategy, consisting in 2- DE combined with MS [4]. Here we present the proteomic analysis carried RXWWRFRPSDUHWKHOHDISURWHLQSUR¿OHRIWUDQVJHQLF Arabidopsis plants overexpressing Fa WRKY1 and WKHFRUUHVSRQGLQJ:7DQGPXWDQW$Wwrky75 parental lines to identify proteome alterations due to the expression of this strawberry gene under normal physiological conditions. This constitutes a previous and neccesary step for further comparisons of these lines, that exhibit enhanced resistance and 161 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 susceptibility, in response to pathogen infection or hormone treatment. 7KHLGHQWL¿FDWLRQRIWKHSURWHLQVVKRZLQJVLJQL¿FDQWGLIIHUHQFHVEHWZHHQWKHFAWRKY1 overexpressing lines and their controls (mutant and wild type plants) will give us some clues on the signalling networks in which these two factors might be involved, in addition to defense-related signaling. $FNQRZOHGJHPHQWV This work was supported by grants PROFIT 010000-2001-100, 2002-81, 2003-32 and 2004-2 from MCYT, Proyecto de Excelencia P07-AGR02482 and grants to Grupo CVI278 from Junta de Andalucía, Spain. Alba Ruíz-Ramos y Francisco Amil-Ruíz thank the Junta de Andalucía, Spain for their predoctoral grants. References [1] Jones JDG and Dangl JL. The plant immune system. Nature 2006; 444: 323–329. [2] Encinas-Villarejo S, Maldonado AM, AmilRuiz F, Berta De Los Santos F, Romero F, Pliego-Alfaro F, et al. Evidence for a positive regulatory role of strawberry (Fragaria x ananassa )D :5.< DQG $UDELGRSVLV $W :5.<SURWHLQVLQUHVLVWDQFH-([S%RWDQ\ 2009; 60: 3043-65. >@ (XOJHP76RPVVLFK,(1HWZRUNVRI:5.< transcription factors in defence signaling. Current Opinion in Plant Biology 2007;10: 366-371. [4] Jorrín J, Maldonado AM and Castillejo MA. Plant proteome analysis: a 2006 update. Proteomics 2007; 7: 2947–2962. 162 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 El estudio comparativo, proteómico y transcriptómico, de la respuesta a azúcares en Arabidosis thaliana PXHVWUDXQDUHODFLyQHQWUHHOPHWDEROLVPR\HOGHVDUUROORÀRUDO Marina Ribeiro-Pedro, Fatima Ezzahra Said, María Teresa Ruiz, José María Romero, Federico Valverde Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis. CSIC-Universidad de Sevilla. Av. Américo Vespucio, 49. 41092 Sevilla, Spain El desarrollo vegetal está bajo el control de complejos programas genéticos que permiten generar múltiples respuestas a cambios ambientales. La transcriptómica y la proteómica han surgido como potentes herramientas para profundizar en el conocimiento de los mecanismos regulatorios que los controlan. En particular, la proteómica vegetal, es un campo de investigación emergente ya que, al LGHQWL¿FDU \ FXDQWL¿FDU ODV SURWHtQDV SUHVHQWHV HQ determinadas condiciones, proporciona información funcional sobre los mecanismos moleculares básicos. En nuestro laboratorio estudiamos los cambios que ocurren en el proteoma nuclear de A. thaliana en UHVSXHVWDDOVXPLQLVWURGHD]~FDUHV+HPRVLGHQWL¿cados varias proteínas posiblemente implicadas en esta señalización incluidos factores de transcripción, como FRIGIDA, y otras proteínas señalizadoras. reguladora y moduladora de los azúcares es conocida desde hace tiempo. Sin embargo, se sabe poco sobre su mecanismo molecular, es decir, qué factores de transcripción y proteínas reguladoras intervienen en esta respuesta. Para responder a esta incógnita hemos diseñado y optimizado un protocoORGHSURWHyPLFDQXFOHDUTXHQRVSHUPLWDLGHQWL¿FDU proteínas implicadas en la respuesta a azúcares. Más recientemente, y con objeto de profundizar en el conocimiento de dicho mecanismo, hemos iniciado un acercamiento transcriptómico mediante la utilización de microarrays y estudios más detallados GHORVWUDQVFULWRVTXHFRGL¿FDQSURWHtQDVSRWHQFLDOmente implicadas en la regulación por azúcares. De la comparación de ambas aproximaciones podremos sacar datos que ayuden a comprender la respuesta a azúcares. Las complejas interacciones moleculares que subyacen los procesos de desarrollo vegetal pueden abordarse en la actualidad mediante un conjunto YDULDGRGHWpFQLFDVPDVLYDVTXHSHUPLWHQLGHQWL¿FDU las moléculas biológicamente más relevantes [1]. Entre ellas, la transcriptómica permite el análisis global de la expresión del genoma en determinadas FRQGLFLRQHV ¿VLROyJLFDV PLHQWUDV TXH OD SURWHyPLFDSHUPLWHLGHQWL¿FDU\FXDQWL¿FDUODVSURWHtQDV involucradas [1, 2]. Dado que, por una parte, son las proteínas los componentes directos de las cascadas de señalización y rutas bioquímicas, y que no existe correspondencia directa entre gen-proteína, la proteómica vegetal emerge como la mejor herramienta SDUD UHÀHMDU OD FRPSOHMLGDG \ GLQDPLVPR GH ORV sistemas vegetales. Proteómica. (QQXHVWURSURWRFRORSXUL¿FDPRV núcleos de A. thaliana var. Col-0 cultivadas en medio MS (control) y medio MS suplementado con 3% (p/v) de sacarosa, extrayendo las proteínas nucleares con sulfato de amónio/deoxicolato en condiciones nativas. Luego se eliminan los contaminantes por ¿OWUDFLyQHQJHOHQXQDFROXPQDGH6HSKDGH[\VH enriquecen las muestras en potenciales factores de WUDQVFULSFLyQ PHGLDQWH FURPDWRJUDItD GH D¿QLGDG en una matriz de heparín-sulfato. En condiciones desnaturalizantes se extraen las proteínas con fenol y luego se precipitan con una mezcla de acetato de DPRQLR\PHWDQRO(QORVSDVRVFURPDWRJUi¿FRVVH HPSOHy HO VLVWHPD b.7$)3/& /DV IUDFFLRQHV proteicas se sometieron a una electroforesis bidimensional: isoelectroenfoque en strip5HDG\6WULS IPG y separación en SDS-PAGE en geles Criterion XT Bis-Tris (Bio-Rad). Los geles fueron teñidos con SYPRO Ruby, nitrato de plata o Coomassie coloidal. Las proteínas de interés fueron analizadas mediante espectrometría de masas MALDI-TOF e LGHQWL¿FDGDV FRQ HO SURJUDPD 0$6&27 3DUD ORV Las plantas son organismos sésiles y responden D FDPELRV GHO DPELHQWH PRGL¿FDQGR VXV FDUDFWHUtVWLFDV ¿VLFRTXtPLFDV >@ (Q QXHVWUR ODERUDWRULR estamos interesados en estudiar los cambios a nivel molecular que ocurren en el núcleo de A. thaliana en respuesta al suministro de azúcares. La función 163 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 análisis de Western blot se utilizaron anticuerpos esSHFt¿FRVJHQHUDGRVHQHOODERUDWRULRRDQWLFXHUSRV control de casas comerciales. Transcriptómica. 3DUDHODQiOLVLVGHORVSHU¿OHV de expresión en presencia de azúcares se extrajo RNA total de plántulas de A.thaliana var. Col-0 cultivadas en medio MS o MS con sacarosa mediante HOPpWRGRGHO7UL]RO\VHSXUL¿FDURQHQFROXPQDV “RNeasy” (Qiagen). Se hibridaron 3 muestras biológicas de cada condición experimental en “GeneChips” de Affymetrix (Unidad de Genómica, CNB) y los datos se analizaron mediante LiMMA con el software FIESTA (http://bioinfogp.cnb.csic.es). Los resultados fueron posteriormente analizados con los programas disponibles en red en el “Bio-array Resource” (http://bar.utoronto.ca). En función de los resultados obtenidos se procedió al análisis, mediante QPCR, de los genes de interés. Figura 1. Comparación funcional, entre transcriptómica y proteómica, de la respuesta a sacarosa. $&ODVL¿FDFLyQIXQFLRQDO de los genes cuya expresión se altera (represión FDR<-2 ó LQGXFFLyQ)'5!HQSUHVHQFLDGHVDFDURVD%&ODVL¿FDFLyQ funcional de las proteínas cuya producción (incremento ó disminuición) se altera en presencia de sacarosa. Una vez desarrollado y utilizado el protocolo de forma rutinaria, hemos iniciado la optimización de los pasos más críticos. Asimismo, hemos comparado varios métodos de extracción de proteínas nucleares, entre ellos la extracción en presencia de 6M guanidina, en condiciones de alta sal y con fenol. Los Tabla 1. ,GHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVHQHVWHHVWXGLR Category Protein Carbon metabolism RNA and DNA metabolism Cell cycle Folding Unknown ATG number CPC ATMYB3R4 GLP3 TF2 ARAC7 T3F24.4 F5F19.6 JR1 T204.11 Regulation of timing of transition from vegetative to reproductive phase Transcription factor activity Transcription factor Response to cold MyB-like transcription factor GTP-binding protein implicated in signal transduction F-Box related protein Signalling Signalling Signalling 3XWDWLYH5,1*]LQF¿QJHUSURWHLQ Signalling at3g53410 ESM1 TGG1 TGG2 PYK10 SAD1 MSH2 TPLATE PBP1 Sugar related protein Sugar related protein Sugar-related protein Hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds mRNA splicing, export, and degradation. Damaged DNA reparation Cytokinesis protein targeted to the cell plate Protein folding at3g14210 at5g26000 at5g25980 at3g09260 at5g48870 at3g18524 at3g01780 at3g16420 RNA-binding Unknown at3g24255 JAL22 Unknown at2g39310 FRI Signalling, gene regulation Description resultados obtenidos demuestran que se obtiene una PD\RUH¿FLHQFLDPHGLDQWHODH[WUDFFLyQFRQJXDQLdina que con los otros métodos por separado, mientras que la utilización secuencial de ambos (alta sal y fenolización) es comparable a la extracción con el caotropo. A titulo de comparación hemos aplicado varios métodos de tinción de geles, entre los que la at4g00650 at2g46410 at5g11510 at5g20630 at1g05055 at4g28950 at1g47350 at1g52000 at3g16470 at3g16450 tinción con coomassie coloidal nos ha proporcionado la mejor resolución y compatibilidad con los análisis de espectrometría de masas. Del total de proteínas LGHQWL¿FDGDVKDVWDHOPRPHQWRKHPRVDQDOL]DGRODV que presentaban expresión diferencial en presencia o ausencia de sacarosa y se muestran en la Tabla 1 en base a su función. Se observa que el grupo más 164 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figura 2. Estudio de los niveles de expresión de FRIGIDA y detección de la proteína en plántulas de A. thaliana, en respuesta a sacarosa. A) Análisis, por QPCR, de los niveles de transcripto de FRIGIDA en plántulas (Wt col y Sf2 col) crecidas en medio MS y medio MS suplementado con 3% de sacarosa. B) Análisis, mediante Western blot, de la presencia de FRIGIDA en extractos nucleares y citosólicos de plántulas Wt col y Sf2 col crecidas en las mismas condiciones de ensayo. Cabe mencionar que FRIGIDA se detecta exclusivamente en las fracciones nucleares (banda de 57 Kda aprox.) y que en presencia de sacarosa parece aumentar su producción. La banda de 20 Kda corresponde a la Histona H3, utilizada como control de la integridad y pureza de las fracciones. Referencias [1] Hochholdinger F, Sauer M, Dembinsky D, Hoecker N, Muthreich N, Saleem M, Liu Y.Proteomic dissection of plant development. Proteomics 2006; 6:4076-4083. representado corresponde a proteínas implicadas en mecanismos de señalización y regulación de la expresión génica, como es el caso de FRIGIDA cuya expresión parece aumentar en presencia de sacarosa. Una situación similar puede comprobarse a nivel GHOSHU¿OGHH[SUHVLyQ)LJXUDE6LQHPEDUJR\ en el caso particular de FRIGIDA, no parece existir una relación directa entre gen-proteína ya que, en presencia de sacarosa, una mayor producción de SURWHtQD)LJXUDEQRSDUHFHUHÀHMDUVHDQLYHOGHO correspondiente transcrito (Figura 2a). Mediante el uso combinado de estas herramientas (Proteómica y Transcriptómica) hemos mostrado que podemos aumentar la comprensión de los mecanismos biológicos, ya que permite la integración y la intersección de la información transcripcional, traduccional y post-traduccional. [2] Chen S y Harmon AC. Advances in plant proteomics. Proteomics 2006; 6:5504-5516. [3] Casal, JJ. Fankhauser C, Coupland G, Blázquez MA. Signalling for developmental plasticity. Trends in Plant Science 2004; 9 (6):309-314. $ ',*( SURWHRPLF DQDO\VLV RI ZKHDW ÀDJ OHDI WUHDWHG ZLWK 7(55$625% foliar, a free amino acid-based biostimulator María José Martinez-Esteso1, Mayte Vilella-Antón1, Susana Sellés-Marchart2, Anna Botta-Català3, Rafael Piñol-Dastis3, Roque Bru-Martinez1 1 Grupo de Proteómica y Genómica Funcional de Plantas. Dpto. Agroquímica y Bioquímica, IMEM Ramon Margalef, Universidad de Alicante; 2Unidad de Genómica y Proteómica, SSTTI, Universidad de Alicante; 3 Departamento I+D Fisiología Vegetal, BIOIBERICA, S.A. Abstract In this work, we have undertaken a proteomic approach using DIGE in order to explore molecular mechanisms potentially involved in the biostimulating effect of Terra-Sorb® foliar on wheat applied at ÀDJOHDIVWDJH3URWHLQVLGHQWL¿HGXSDQGGRZQUHJXODted suggest an improvement of wheat productivity by a combination of an enhanced CO2¿[DWLRQDPRUHDFWLYH protein synthesis and a decrease of oxidative stress. 165 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Table 1. 3URWHLQVGHUHJXODWHGLQZKHDWÀDJOHDIWUHDWHGZLWK7HUUD6RUE)ROLDU1RUPDOLVHGVSRWVYROXPHVIRU&21752/ and TREATED samples. Protein Information Ref. Spot Protein Description Norm. Vol. Accession No. CONTROL Terra-Sorb 73 EF-Tu Chl-1 translational elongation factor Tu 125540125 1 1,412 10 EF-Tu Chl-2 14 EF-Tu Chl-3 translational elongation factor Tu translational elongation factor Tu 125540125 125540125 1 1 1,371 1,301 18 RUBISCO LBP-B-1 RuBisCO large subunit-binding protein subunit beta, chloroplast 2493650 1 1,256 122 RUBISCO LBP-B-2 RuBisCO large subunit-binding protein subunit beta, chloroplast 2493650 1 1,231 30 RUBISCO LBP-B-3 RuBisCO large subunit-binding protein subunit beta, chloroplast 2493650 1 1,176 8 RUBISCO LBP-A-1 RuBisCO large subunit-binding protein subunit alpha, chloroplast precursor 134102 1 1,4 12 RUBISCO LBP-A-2 RuBisCO large subunit-binding protein subunit alpha, chloroplast precursor 134102 1 1,328 11 RUBISCO LBP-A-3 RuBisCO large subunit-binding protein subunit alpha, chloroplast precursor 134102 1 1,284 56 RUBISCO-L (fragmento?)-1 RuBisCO large subunit. Ribulose bisphosphate carboxylase large chain, N-terminal domain. 548677 1 1,825 62 RUBISCO-L (fragmento?)-2 RuBisCO large subunit. Ribulose bisphosphate carboxylase large chain, N-terminal domain. 548677 1 1,611 5 RUBISCO A-1 RuBisCO activase A chloroplast precursor 12643756 1 1,43 9 RUBISCO A-2 RuBisCO activase A chloroplast precursor 12643756 1 1,413 89 RUBISCO A-3 RuBisCO activase A chloroplast precursor 12643756 1 1,274 RUBISCO A-A (Precursor?) RuBisCO activase A chloroplast precursor 12643756 1 1,184 40 PRK-1 Phosphoribulokinase, chloroplast precursor 125580 1 1,087 46 PRK-2 Phosphoribulokinase, chloroplast precursor 125580 1 1,037 71 HSP90 Heat schock protein 90kDa 556673 1 1,47 33 EF-G Chl Elongation factor G, chloroplast precursor (EF-G) 125549171 1 1,113 36 EF-G Chl Elongation factor G, chloroplast precursor (EF-G) 125549171 1 1,108 32 PGM phosphoglycerate mutase 32400802 1 -1,264 34 GA3PDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 15222111 1 -1,27 29 ATP-CF1-A ATP synthase CF1 alpha subunit 14017569 1 -1,273 22 pEF-G Chl putative Elongation factor G, chloroplast precursor (EF-G). Fragmento? 125549171 1 -1,289 170 131 Cu/Zn SOD Cu/Zn superoxide dismutase 1568639 1 -1,34 13 Cu/Zn SOD Cu/Zn superoxide dismutase 1568639 1 -1,476 166 Communication Proteomics has been shown as successful approach to analyze the response of plants to external VWLPXOXV>@:HSHUIRUPHGDSURWHRPLFDSSURDFK in order to study the effects of Terra-Sorb ® foliar RQZKHDWOHDYHVDWWKHÀDJOHDIVWDJH%%&+ 7HUUD6RUEIROLDUD/ĮDPLQRDFLGEDVHGSURduct from enzymatic hydrolysis with a high ratio of free-to-total amino acids, was applied two and three days following foliar by spraying treatment. Flag leaf samples were taken from independent control (C) and treated plots (T). A quantitative DIGE approach was used to compare the proteomes of T vs C plants in four biological replicates. After SameSpots v3.0 gel analysis, 37 deregulated spots were selected out of 918 detected, with an ANOVA p<0.05. As shown in table 1, 26 protein spots encoded by 12 different genes were successfuOO\LGHQWL¿HGE\Q/&0606LQD;&7SOXV,7PDVV spectrometer (Agilent) (SpectrumMill Proteomics :RUNEHQFKDVVHDUFKHQJLQH1&%,QUDVGDWDEDVH )RXU VSRWV LGHQWL¿HG DV 58%,6&2 DFWLYDVH$ chloroplast precursor (RBA) were up-regulated by treatment with Terra-Sorb ® foliar. This enzyme produces ATP-dependent conformational changes in RUBISCO, making the inactivated enzyme to re-enter the catalytic cycle. Phosphoribulokinase has been detected with a slight increase in abundance, which LVFRQVLVWHQWZLWKDQHQKDQFHPHQWRIFDUERQ¿[DWLRQ In addition, RUBISCO large subunit-binding protein subunits alpha and beta (RUBISCO LBP A and B), that assists RUBISCO folding, have been found upregulated in treated leaves. These results together suggest that Terra-Sorb ® foliar promotes RUBISCO DFWLYLW\DQGWKXVHQKDQFHGFDUERQ¿[DWLRQ 7KUHHXSUHJXODWHGVSRWVLGHQWL¿HGDVFKORURSODVW elongation factors Tu (EF-Tu Chl), G (EF-G Chl) and heat shock protein 90 (HSP-90) indicate a potentially enhanced protein synthesis and folding to produce functional proteins upon Terra-Sorb ® foliar treatment. Plants invest an important amount of the photosynthetic energy in biosynthesis of amino acids, thus the application of exogenous amino acids via foliar may give rise to an enhancement of protein synthesis. Among those down-regulated spots four proWHLQVKDYHEHHQLGHQWL¿HGFKORURSODVW$73DVHDOSKD subunit, phosphoglyceromutase (PGM), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GA3PDH) and Cu/Zn superoxide dismutase (Cu/Zn SOD). There is 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 DVOLJKWGHFUHDVHRIWKHWKUHH¿UVWSURWHLQVFRQVLVWHQW with a decrease in consumption of the product of photosynthesis 3-phosphoglycerate for catabolism, thus this product might be accumulated in a reservoir as a sugar. The decrease of a superoxide dismutase VSHFL¿FIRUVFDYHQJLQJRIWKHVXSHUR[LGHJHQHUDWHG by photooxidation of O2 in PS-I (Cu/Zn SOD) is consistent with a lower oxidative stress state. According to results, the three major molecular effects found of spraying wheat with Terra-Sorb ® IROLDURQWKHÀDJOHDISURWHRPHVXSSRUWWKHSK\VLRlogical effects described upon treatment of other crops with Terra-Sorb ® foliar foliar such as increase of plant photosynthetic activity and chlorophyll content, promotion of rapid recovery from stress and improvement of nutrient absorption [2]. Figure 1. 2D reference gel image showing the location of selected spots down- regulated (upwards arrowhead) and up-regulated. $FNQRZOHGJHPHQWV The technical support and helpful discussions of Ramón Sánchez Pérez and Cándido Marín Garrido are very acknowledged. The DIGE and protein idenWL¿FDWLRQ DQDO\VLV ZHUH FDUULHG RXW DW 6HUYLFLR GH Proteómica de la Universidad de Alicante, a PROTEORED member (www.proteored.org). This work was supported by Bioibérica, S.A. References [1] Martínez-Esteso MJ, Sellés-Marchart S, VeraUrbina JC, Pedreño MA, Bru-Martinez R. J. Proteomics 2009 ;73 (2): 331-341. >@ *RUGRQ /. 'DQLHO 3. 7KRPDV /: 3ODQW Growth Regulation Society of America 2005; 33 (4): 134-141. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 167 High-throughput biological and functional analisys of interactions among tetraspanin associated proteins in T Limphocytes using second generation proteomics techniques Daniel Pérez-Hernández1&2, Elena Bonzón-Kulichenko1, Pablo Martínez-Acedo1, Pedro J. Navarro1, Estefanía Núñez1, Marco Trevisan-Herraz1, María Yáñez-Mo2, Mónica Sala-Valdés2, Mª Ángeles Ursa2, Francisco Sánchez-Madrid2, JesúsVázquez1 1 Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica, CBMSO. 2Hospital Universitario La Princesa y Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares CNIC The tetraspanin superfamily of transmembrane proteins is clustered in compact structural groups forming specialized membrane microdomains (Tetraspanin Enriched Microdomains, TEM or TERM). Through heterolog and homolog interactions, tetraspanins regulate signalling processes mediated by cellular adhesion molecules, growth factor receptors and costimulatory proteins. The presence in TERMs of Major Histocompatibility Complex (MHC) I and II molecules also suggest that tetraspanins partici- pate in antigen presentation. Furthermore, they participate as viral correceptors in certain situations and are involved viral growth in infected cells [1]. In spite of the growing interest for these proteins, the cytosolic interactions by which tetraspanins are involved in various receptor activation pathways, their cytoskeleton anchorage and in general the protein ligands that interact with these proteins are poorly known. In this work we have made a systematic analy- Figure 1. Systems Biology analysis of the proteins that interact with the peptide baits belonging to CD81, ICAM-1 and EWI-2. Proteins with the same molecular or biological function are clustered. The same colour belongs to the same bait or the same combination of the three peptide baits. Links between proteins are previously validated by IPA. 168 sis of interacting partners of different proteins that are presented in TERMs [2]. This was accomplished by “pull-down” techniques and high-throughput protein LGHQWL¿FDWLRQRIWKHFDSWXUHGOLJDQGVE\PDVVVSHFtrometry. For this end, synthetic biotinylated peptides spanning the C-terminal cytoplasmic end of these proteins were incubated with extracts from lymphoblast cell models, and then captured using Streptavidin-sepharose microbeads. Proteins interacting with the peptide baits were subjected to digestion and the resulting peptides systematically analyzed by HPLC-linear ion trap MS/MS mass spectrometry. Proteins from more WKDQ SXOOGRZQ DQDO\VLV FODVVL¿HG LQ GLIIHUHQW H[SHULPHQWV ZHUH DXWRPDWLFDOO\ LGHQWL¿HG IURP WKH 0606VSHFWUDLQDKXPDQGDWDEDVH:HLGHQWL¿HG PRUHWKDQKXPDQSURWHLQV¿OWHULQJZLWKS5DWLR software developed by our group with an error rate of SURWHLQLGHQWL¿FDWLRQQHYHUVXSHULRUWR>@ :HGHYHORSHGDUREXVWVWDWLVWLFDOFULWHULRQEDVHG RQWKHQXPEHURISHSWLGHVRIHDFKSURWHLQLGHQWL¿HG in all the partners in the same pull down experiPHQWS:HDOVRFRQ¿UPHGWKHLQWHUDFWLRQV EHWZHHQ WKH LGHQWL¿HG SURWHLQV DQG WKH EDLWV FRQsidering the reproducibility in all the experiments. 0RUHWKDQVSHFL¿FLQWHUDFWLRQVZHUHGLIIHUHQtially clustered revealing strong relationships among groups of peptide baits. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 or IPA) (Figure 1). Interacting proteins from different baits were found to share biological functionality, and the groups of interactions showed a strong functional and biological relationship among them. This information suggests that proteins which link the citosolic domains of tetraspanins form a coherent network of interactions with their functional role between T lymphocytes and vascular endothelium in the processes of diapedesis. References [1] Hemler ME. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005;6:801-11. [2] Barreiro O, Yáñez-Mó M, Sala-Valdés M, Sánchez-Madrid F. Endothelial tetraspanin microdoPDLQVUHJXODWHOHXNRF\WH¿UPDGKHVLRQGXULQJ extravasation. Blood. 2005; 105:2852-61. [3] Martínez de Bartolomé S., Navarro P., MartínMaroto F., Vazquez J., López-Ferrer D., RamosFernández A.,et al. Properties of Average Score Distributions of SEQUEST The Probability 5DWLR0HWKRG0ROHFXODU&HOOXODU3URWHRPLFV 2008; 7:1135-1145. [4] Navarro P, Vázquez J. $UH¿QHGPHWKRGWRFDOFXODWHIDOVHGLVFRYHU\UDWHVIRUSHSWLGHLGHQWL¿cation using decoy databases. J Proteome Res. 2009;8:1792-6. The validated proteins have been analyzed using System Biology tools (Ingenuity Pathways Analysis Use of ProteoMiner in Veterinary Research Anna Marco, Gemma Rovira, Anna Bassols Departament de Bioquímica i Biologia Molecular. Facultat de Veterinària. Universitat Autònoma de Barcelona. 08193 Cerdanyola del Vallès One of the main applications of serum proteoPLFV LV WKH LGHQWL¿FDWLRQ RI QHZ ELRPDUNHUV IRU animal disease or animal production. However, potential obstacles to these studies are the poor perforPDQFH RI DI¿QLW\ VHUXP GHSOHWLRQ PHWKRGV EDVHG on human antigens when using animal samples. In WKHSUHVHQWVWXG\ZHKDYHDQDO\]HGWKHHI¿FLHQF\ and reproducibility of the ProteoMiner® beads with bovine and porcine serum samples. :KHQORRNLQJIRUELRPDUNHUVVHUXPLVSRWHQtially the most valuable biological sample, because it contains thousands of different proteins and peptides and it is the most easily accessible, noninvasive, and widely collected sample [1]. Unfortunately, its content is dominated by a handful of high-abundant proteins, with their estimated concentration exceeding the low-abundant proteins highly by 10 orders of magnitude [2]. This large dynamic range exceeds 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 the analytical capabilities of traditional proteomic methods, making the detection of lower abundance serum proteins extremely challenging. In particular, most potential biomarkers are among those lowabundance proteins, secreted into the bloodstream by tissues or cells because of the disease process. To detect these low-abundance proteins using currently available technologies, it is advisable to UHPRYHWKHPRVWDEXQGDQWSURWHLQV¿UVW0DQ\VWUDtegies have been developed for the removal of albumin and other high-abundance proteins; however WKH\KDYHDKLJKVSHFL¿FLW\IRUKXPDQRUODERUDWRU\ animal proteins [3]. Recently, a new method for capturing low-abundance proteins has been commercially available, which is known under the trade name of ProteoMiner® and it is based on the use of a combinatorial peptide binding library, which DI¿QLW\FDSWXUHV DQG DPSOL¿HV WKH ORZDEXQGDQFH proteome [4]. Proteomics constitutes an interesting approach to veterinary medicine and animal production. In this sense, porcine and bovine livestock are the most interesting species due to their economical interest. Surprisingly, there are very few applications of serum proteomics to veterinary science. The ProteoMiner technology, since it is not based on an immunological approach, should be species independent, and thus of potential application to samples of veterinary interest. The objective of the present work was to analyze WKHHI¿FLHQF\DQGUHSURGXFLELOLW\RIWKH3URWHR0LQHU system with bovine and porcine serum samples. Blood was collected from the coccygeal vein in Holstein cows and from the cava vein in Duroc x /DQGUDFH[/DUJH:KLWHSLJVLQDYDFXWDLQHUWXEH with no added chemicals. Serum samples were treated with the ProteoMiner beads (Bio-Rad, Hercules, CA, USA); a relationship 1:10 (mg protein:µl resin) was used to optimize the yield of the procedure. First dimension was performed on pH 3-10, 24 cm Immobiline DryStrips (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) under reducing and denaturing conditions. Then, strips were reduced and alkilated with equilibration buffer (50mM Tris-HCl pH 8.8, 6M urea, 30% (v/v) glycerol, 2% (w/v) SDS and bromophenol blue) and 1% (w/v) DTT or 2.5% (w/v) IAA, respectively. The second dimension was performed with home-made 12% polyacrylamide gels. Protein staining was performed with silver, following the Berkelman and 169 Stendstedt protocol [5]. Gels were scanned with the Image Scanner III (GE Healthcare). After treatment with the ProteoMiner system, a substantial enrichment of the low-abundance proteins was achieved and new spots were detected, whereas albumin and the light and heavy chains of immunoglobulins were less represented (Figure 1). 7KHVHUHDJHQWVDUHEDVHGRQWKHDI¿QLW\ELQGLQJRI all kind of proteins and thus they intend to capture and amplify the low-abundance proteome. Figure 1. Two-dimensional electrophoresis of bovine and porcine serum after treatment with the ProteoMiner beads: a) control, non-depleted serum; b) bound fraction (“enriched” serum). Reproducibility is necessary for accurate downstream analysis. To assess this characteristic in the 3URWHR0LQHU V\VWHP ¿YH WHFKQLFDO VHUXP UHSOLFDtes from cow and pig were prepared from aliquots of the same sample and run on a one dimensional SRO\DFU\ODPLGHJHOXVLQJȝJSURWHLQSHU lane. Gels were stained with silver and scanned as described above. Densitometry was performed ZLWKWKH0XOWL*DXJHVRIWZDUH)XML¿OP$VVHHQ in Figure 2, the ProteoMiner system presents good reproducibility. Figure 2. Reproducibility analysis of the enriched lowabundance proteome achieved with the ProteoMiner beads on bovine and porcine samples. Densitometry of the bound fraction (“enriched” serum) obtained from one-dimensional SDS-PAGE gels is shown. These results clearly demonstrate that the ProteoMiner system is useful for bovine and porcine VHUXPVDPSOHV:KLOHWKLVLVQRWDGHSOHWLRQPHWKRG 170 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 to remove high abundance proteins, like others used IRUKXPDQELRPDUNHULGHQWL¿FDWLRQWKH3URWHR0LQHU treatment will decrease the amount of these highabundance proteins. This kind of strategies should widen the number of applications in serum animal proteomics. This work was funded by grant AGL200602364/GAN from the Spanish “Ministerio de EduFDFLyQ\&LHQFLD´3DUWRIWKHIXQGLQJZDV¿QDQFHG by the FEDER program from the European Union. :HWKDQN0V$QQD9LODOWDIRUKHUH[FHOOHQWWHFKQLcal assistance. sional separation coupled with mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics 2002; 1, 947-955. [2] Anderson NL and Anderson NG. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. Proteomics 2002; 1, 845-867. [3] Echan LA, Tang HY, Ali-Khan N, Lee K and 6SHLFKHU ': 'HSOHWLRQ RI PXOWLSOH KLJK DEXQGDQFHSURWHLQVLPSURYHVSURWHLQSUR¿OLQJ capacities of human serum and plasma. Proteomics 2005; 5, 3292-3303. [4] Boschetti E and Righetti PG. The ProteoMiner in the proteomic arena: A non-depleting tool for discovering low-abundance species. J. Proteomics 2008; 71, 255-264. [5] Berkelman T and Stenstedt T. 2-D Electrophoresis. Principles and methods. Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden. 1998. References [1] Adkins JN, Varnum SM, Auberry KJ, Moore RJ, Angell NH, Smith RD et al. Toward a human blood serum proteome: analysis by multidimen- La Proteómica como vía para determinar el origen animal de los productos cárnicos Miguel Ángel Sentandreu1, Paul D. Fraser2, Enrique Sentandreu1, Leticia Mora1, Peter M. Bramley2 1 Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), P.O. Box 73, 46100 Burjassot, Valencia. España. 2 Center for Systems and Synthetic Biology, School of Biological Sciences, Royal Holloway, 8QLYHUVLW\RI/RQGRQ(JKDP7:(;5HLQR8QLGR Resumen En el presente trabajo se describe el desarrollo de un método para detectar la presencia de carne de pollo en mezclas de carne haciendo uso de la tecnología proteómica. Es un método simple y robusto que incluye una etapa de extracción de proteínas musculares, enriquecimiento de la proteína diana mediante isoelectroenfoque, digestión con tripsina de la misma y análisis de un péptido ELRPDUFDGRU HVSHFt¿FRV GH OD HVSHFLH DYLDU PHdiante LC-ESI-MS/MS. Esta metodología ha permitido detectar la presencia de un 0,5 % de carne de pollo contaminando carne de cerdo. Además de su sencillez, el método presenta la ventaja de poder aplicarse indistintamente al análisis de carne fresca y cocinada, representando una alternativa interesante a los métodos que se están empleando actualmente para el control del origen animal de los productos cárnicos. Texto principal Los principales casos de adulteración en productos cárnicos se relacionan con la sustitución de carne de elevada calidad por carne de un menor coste con REMHWR GH SRGHU REWHQHU XQ EHQH¿FLR HFRQyPLFR adicional. Para poder controlar el fraude que supone esta forma de proceder es necesario disponer de métodos de análisis robustos, sensibles y precisos. De entre las tecnologías más empleadas hasta el momento para este propósito hay que destacar los inmunoensayos y los análisis de ADN. A pesar del 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 gran avance que ha supuesto la introducción y el desarrollo de estas técnicas, existen importantes limitaciones cuando éstas se aplican al análisis de productos cárnicos procesados ya que las agresivas condiciones empleadas durante el procesado de la FDUQHSXHGHQLQÀXLUQHJDWLYDPHQWHHQHOUHFRQRFLmiento de las proteínas diana o del ADN [1]. Los recientes avances en las técnicas de espectrometría de masas aplicadas al campo de la proteómica constituyen una alternativa interesante a través de la LGHQWL¿FDFLyQGHSpSWLGRVELRPDUFDGRUHVHVSHFt¿FRV de cada especie animal. En el presente trabajo se ha VHOHFFLRQDGRXQSpSWLGRELRPDUFDGRUHVSHFt¿FRGH la especie aviar para poder detectar esta carne en cualquier tipo de mezcla de carne tanto fresca como cocinada. Para ello, un gramo de distintas mezclas de carne de pollo se homogeneizaron con 10 mL de tampón Tris, pH 8,0, centrifugándose a continuación durante 20 min a 10000 rpm. Se recogió el precipitado obtenido y se solubilizó en el tampón Tris pH 8.0 conteniendo 6M de urea y 1 M de thiourea. Se tomo el volumen necesario de este extracto para fraccionar 2,5 mg de proteínas totales por isoelectroenfoque en el intervalo de pH 4-7 empleando un fraccionador OFFGEL 3100 (Agilent). De la fracción donde se localizó la cadena ligera de mosina 3 se tomaron 20 µL para realizar una digestión con tripsina. Después GH OD GLJHVWLyQ VH DMXVWy HO YROXPHQ¿QDO GH FDGD muestra a 30 µL, analizando los péptidos contenidos Figura 1. Resumen esquemático del método desarrollado para detectar cuantitativamente la presencia de la carne de pollo en las distintas mezclas de carne. 171 en este extracto mediante LC-ESI-MS/MS (Thermo (OHFWUyQ &RUS /D LGHQWL¿FDFLyQ GH SpSWLGRV VH realizó a partir de los espectros MS/MS empleando MASCOT como algoritmo y la base de datos de SURWHtQDV 1&%,QU /D FXDQWL¿FDFLyQ GHO SpSWLGR seleccionado como biomarcador de la especie aviar en distintas mezclas de carne conteniendo diferentes porcentajes de carne de pollo se realizó mediante la adición de 5 picomoles del péptido seleccionado marcado con isótopos estables 13C6/15N (Técnica $48$/DLQWHJUDFLyQGHORVSLFRVFURPDWRJUi¿cos correspondientes tanto al péptido nativo como al péptido pesado se realizó manualmente. La cantidad de péptido nativo en cada muestra se determinó por comparación de las áreas de cada pico. El método que se ha desarrollado en el presente trabajo se esquematiza en la Figura 1. Las proteínas de los distintos extractos de carne se fraccionaron mediante isoelectroenfoque en medio líquido. En OD )LJXUD VH SXHGH REVHUYDU HO SHU¿O GH SURWHtnas obtenido en SDS-PAGE para las fracciones OFFGEL correspondientes a los valores de pH más ácidos. Como se puede apreciar, las fracciones 3 y 4 contienen una sola banda de proteína, correspondiente a la cadena ligera de miosina 3 (MLC3). (VWRFRQ¿UPDHOXVRGHOLVRHOHFWURHQIRTXHHQPHGLR líquido como vía adecuada para el enriquecimiento de MLC3 como proteína diana para la posterior hidrólisis con tripsina y generación de péptidos po- Figura 2. SDS-PAGE al 12 % correspondiente a las nueve primeras fracciones obtenidas después de separar las proteínas de una mezcla de carne (1 % de pollo en carne de cerdo) con el fraccionador de proteínas en solución OFFGEL 3100 de Agilent. El isoelectroenfoque se realizó en el intervalo de pH 4-7. Se indica la posición en el gel de la cadena ligera de miosina 3 (MLC3). 172 tenciales biomarcadores de cada especie animal. El presente trabajo se ha centrado en la selección de un péptido biomarcador para detectar la presencia de pollo en mezclas de carne. Como criterios de selección se tuvo en cuenta que el péptido elegido IXHUD HVSHFt¿FR GH OD HVSHFLH DYLDU DVt FRPR TXH su detección fuera posible aun en aquellos casos en los que la carne de pollo esté presente en bajas cantidades en el producto. De este modo, se llevó a cabo el protocolo de trabajo de la Figura 1 empleando una mezcla de carne conteniendo un 1% de pollo en carne de cerdo. Después de realizar la hidrólisis con tripsina de las fracciones OFFGEL 3 y 4 (Figura 2), el análisis mediante LC-ESI-MS/MS GHORVSpSWLGRVJHQHUDGRVSHUPLWLyODLGHQWL¿FDFLyQ GHO SpSWLGR ELRPDUFDGRU H VSHFt¿FR GH OD HVSHFLH aviar 37ALGQNPTNAEINK49 procedente de MLC3. /D FXDQWL¿FDFLyQ GH HVWH SpSWLGR HQ PH]FODV GH carne conteniendo distintos porcentajes de carne de pollo (0, 0,5, 1, 2, 5 y 10 %) se realizó mediante la adición de su homólogo marcado con isótopos 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 estables (+7 Da) al extracto enriquecido en MLC3 después del fraccionamiento en OFFGEL (Figura 1). De este modo se obtuvo una buena correlación lineal (R2 = 0,9921) entre el porcentaje de carne de pollo añadido a la mezcla y la cantidad del péptido biomarcador seleccionado, determinada por LCESI-MS/MS. El método desarrollado en el presente WUDEDMRHVSUHFLVR\VHQVLEOHDGHPiVGHVHU¿DEOHHQ el análisis de alimentos sometidos a un tratamiento térmico elevado. Los resultados obtenidos permiten D¿UPDUTXHODDSUR[LPDFLyQSURWHyPLFDSXHGHVHU una alternativa de interés a los métodos empleados actualmente para resolver el problema de la determinación de las especies cárnicas. Referencias >@ :RROIH 0 3ULPURVH 6 )RRG IRUHQVLFV XVLQJ DNA technology to combat misdescription and fraud. Trends in Biotechnology 2004; 22 (5): 222-6. Péptidos inhibidores de la Enzima Convertidora de Angiotensina I generados en la digestión in vitro de la carne de cerdo Elizabeth Escudero1, Miguel Angel Sentandreu1, Keizo Arihara2, Fidel Toldrá1 1 Instituto de agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC). 2Faculty of Animal Science, School of Veterinary Medicine and Animal Sciences, Kitasato University Resumen El objetivo principal de este trabajo se ha centrado en la generación de péptidos inhibidores de la Enzima Convertidora de Angiotensina I (ECA) después de la digestión de carne de cerdo mediante la acción secuencial de pepsina y pancreatina, simulando las condiciones del sistema digestivo. El hidrolizado fue analizado directamente mediante nanoLC-ESI-MS/MS, estudiando seguidamente las secuencias obtenidas a partir de los espectros MS/ 06/RVUHVXOWDGRVREWHQLGRVSRQHQGHPDQL¿HVWR el potencial de las proteínas de la carne de cerdo como fuente de péptidos antihipertensivos después de la digestión gastrointestinal. Estudios recientes han demostrado el potencial de la carne de cerdo al generar péptidos biologicamente activos con capacidad para regular numerosos procesos en el organismo [1], lo que otorga a la carne un valor añadido. En trabajos anteriores se han descrito péptidos con acción antioxidante, antimicrobiana o antihipertensiva por ejemplo [2]. La acción antihipertensiva ejercida por algunos péptidos es debida a su capacidad para inhibir la actividad ECA. En el presente estudio, se ha investigado la posibleactividad inhibidora de la ECA de los péptidos generados en la digestión de las proteinas del músculo esquelético del cerdo por acción de las enzimas gastrointestinales. El proceso de digestión fue simulado in vitro usando pepsina y pancreatina 173 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 de manera secuencial. El hidrolizado obtenido fue posteriormente analizado mediante nanoLC-ESIMS/MS utilizando un sistema Ultimate nano-LC acoplado a una fuente de iones nanoelectrospray y un espectrómetro de masas cuadrupolo-tiempo de vuelo (Q-TOF) QSTAR XL. Todos los espectros MS/MS fueron interpretados utilizando los algoritmos MASCOT y Paragon. De este modo se lograron LGHQWL¿FDUXQDEXHQDSDUWHGHORVSpSWLGRVSUHVHQWHV en el hidrolizado; sin embargo, sólo aquellos con los requerimientos de tamaño y estructura adecuados para ser potenciales inhibidores de la ECA fueron sintetizados. La actividad inhibidora de la ECA de los péptidos sintetizados se realizó según el método desarrollado por Sentandreu y Toldrá [3]. /RV SpSWLGRV TXH VH LGHQWL¿FDURQ HQ HO KLGURlizado y fueron posteriormente sintetizados para conocer su capacidad de inhibir la actividad ECA se muestran en la Tabla 1. A modo de ejemplo, en la Figura 1 se muestra el espectro de MS/MS correspondiente al péptido KAPVA. Este pentapéptido mostró la mayor inhibición de la actividad ECA con un valor de IC50 de 46.56 µM. KAPVA contiene una alanina en posición Cterminal. Éste amino ácido parece desempeñar un papel importante en su unión con la ECA [4]. La presencia de prolina en la antepenúltima posición del extremo C-terminal también parece promover la unión del péptido con la enzima [5]. Por su parte, el péptido PTPVP también mostró una notable inhibición de la ECA, con un valor de IC50 de 256.41 µM. Éste péptido contiene un residuo de prolina en último y antepenúltimo lugar (Tabla 1). El resto de secuencias ensayadas mostraron moderada inhibición de la ECA. Se sabe que los péptidos de pequeño tamaño presentan una mayor facilidad para ser absorbidos en el tracto intestinal que los péptidos grandes [6]. Además, los péptidos que contienen prolina son generalmente más resistentes a la digestión enzimática [7]. En consecuencia, cabe esperar que los pentapéptidos KAPVA y PTPVP que mostraron una notable inhibición de la ECA y que además contienen residuos de prolina en sus secuencias, puedan mostrar una actividad antihipertensiva in vivo [8]. Los resultados obtenidos sugieren que ODGLJHVWLyQ¿VLROyJLFDGHODVSURWHtQDVGHODFDUQH de cerdo puede promover la generación de péptidos bioactivos, apoyando la idea de que la carne de cerdo puede ser una buena fuente de constituyentes saludables. No obstante, son necesarios estudios in YLYR SDUD GHPRVWUDU VL ORV SpSWLGRV LGHQWL¿FDGRV pueden ejercer una acción antihipertensiva real. Agradecimientos Figura 1. Espectro MS/MS del ion 527.321+ obtenido del análisis del hidrolizado de cerdo mediante nanoLC-ESI-MS/ MS. Se muestran los iones y y b encontrados por MASCOT (resaltados en negrita). Damos las gracias al Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF) Proteomics core facility (miembro de Proteored), y en especial a Luz Valero, por su valiosa contribución en el análisis de espectrometría de masas. 174 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Tabla 1. ,GHQWL¿FDFLyQGHSpSWLGRVSUHVHQWHVHQHOKLGUROL]DGRGHSURWHtQDVPHGLDQWHQDQR/&(6,0606REWHQLGRSRU digestión enzimática de la carne de la carne de cerdo. La actividad inhibidora in vitro de la ECA está expresada como IC50 (concentración de péptido necesaria para inhibir el 50% de la actividad ECA original). tiempo de retención masa calc masa obs secuencia 25,2 28,54 31,6 35,43 36,01 36,89 47,18 59,06 60,35 64,87 589,29 445,26 526,31 509,28 519,27 526,32 650,32 569,34 603,35 569,34 589,96 446,26 527,32 511,33 520,28 527,32 651,33 570,35 604,36 570,36 MMVPI IGGSI KAPVA PTPVP YPGIA NIIPA MYPGIA VIPEL INDPF VLPEI proteína origen de cerdo (NCBI accesion no. ) cytocromo P450 3A46 (NP001128296) beta-actina (ABI29185) titina (XP001925902) titina (XP001925902) beta-actina (ABI29185) GAPDHb (ABI29187) beta-actina (ABI29185) GAPDH (ABI29187) GAPDH (ABI29187) titina (XP001925902) posición 394-398 343-347 4784-4788 4216-4220 308-312 203-207 307-312 218-222 31-35 4316-4320 IC50 (µM) >1000 n.aa 46,56 256,41 n.a >1000 641,02 799,24 n.a >1000 Actividad inhibidora de la ECA no encontrada. bGliceraldehido 3-fosfato dehidrogenasa a Referencias [1] Arihara, K. Functional properties of bioactive peptides derived from meat proteins. Advanced Technologies for Meat Processin. CRC Press (Boca Raton) 2006; 245-246. [2] Yamamoto, N.; Ejiri, M.; Mizuno, S. Biogenic peptides and their potential use. Curr. Pharm. Design 2003; 9 (16): 1345-1355. >@ 6HQWDQGUHX 0$ 7ROGUD )$ ÀXRUHVFHQFH based protocol for quantifying angiotensin-I converting enzyme activity. Nature Protocols 2006; 1 (5): 2423-2327. >@ 0DMXPGHU.:X-$QJLRWHQVLQ,&RQYHUWLQJ Enzyme Inhibitory Peptides from Simulated in Vitro Gastrointestinal Digestion of Cooked Eggs. Journal of Agricultural and. Food Chemistry 2009; 57 (2): 471-477. >@ 5RKUEDFK06:LOOLDPV(%5ROVWDG5 $3XUL¿FDWLRQDQG6XEVWUDWH6SHFL¿FLW\RI%Rvine Angiotensin-Converting Enzyme. Journal of Biological. Chemistry 1981; 256 (1): 225230. [6] Hara, H.; Funabiki, R.; Iwata, M.; Yamazaki, K. I. Portal Absorption of Small Peptides in Rats Under Unrestrained Conditions. Journal of Nutrition 1984; 114 (6): 1122-1129. >@ .LP6%HUWZKLVWOH:.LP<:3HSWLGH hydrolyses on the brush border and soluble fractions of small intestinal mucosa of rat and man. Journal of Clinical Investigation 1972; 51: 1419-1430. [8] Nakashima, Y.; Arihara, K.; Sasaki, A.; Mio, H.; Ishikawa, S.; Itoh, M. Antihypertensive activities of peptides derived from porcine skeletal muscle myosin in spontaneously hypertensive rats. Journal of Food Science 2002; 67 (1): 434-437. 175 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Péptidos derivados de la troponina T generados en jamón curado Leticia Mora, Miguel Angel Sentandreu, Fidel Toldrá Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Apartado de correos 73, 46100, Burjassot, Valencia, España Resumen /DWURSRQLQD7HVXQDSURWHtQDPLR¿EULODUSUHsente en el músculo estriado con importantes funciones estructurales y reguladoras. Esta proteína se degrada fácilmente durante el condicionamiento post-mortem de la carne aunque todavía se desconocen los detalles de su degradación y la secuencia de los péptidos generados en procesos más largos como el curado del jamón. La degradación de la troponina T (TnT) se ha correlacionado positivamente con el ablandamiento post-mortem de la carne [1], relacionándola también FRQODFDOLGDG¿QDOGHODPLVPD>@/RVFDPELRV que sufren las proteínas musculares durante el procesado del jamón curado han sido ampliamente estudiados, observándose cambios en proteínas estructurales como la TnT [4]. La hidrólisis observada en las proteínas estructurales ayudan a entender como VHJHQHUDODWH[WXUD\HOÀDYRUWtSLFRHQHOMDPyQ FXUDGR (Q HVWH WUDEDMR KD VLGR SRVLEOH LGHQWL¿FDU cuatro péptidos generados a partir de la proteolisis de la TnT durante el curado del jamón haciendo uso de la tecnología proteómica. Se tomaron 50 g de músculo Biceps femoris de una pieza de jamón curado para realizar una extracción y posterior desproteinización, obteniendo un extracto de péptidos. Parte del extracto obtenido (5 mL) se fraccionó por medio de cromatografía de exclusión molecular en una columna Sephadex G-25. Las fracciones correspondientes a un mayor tamaño molecular se concentraron e inyectaron en un sistema de cromatografía líquida de alta resolución equipado con una columna Symmetry C18 (250 x 4.6 mm) y un colector de fracciones automático. Las fracciones obtenidas después de esta cromatografía se analizaron posteriormente en un espectrómetro de masas MALDI-TOF/TOF empleando el ácido α-ciano-4-hidroxicinámico como matriz. La inter- pretación de los espectros se realizó utilizando el algoritmo MASCOT y la base de datos NCBInr. De los resultados obtenidos se evidencia la intensa degradación proteica que tiene lugar durante la elaboración de jamón curado. La Figura 1 muestra el espectro de masas MALDI-TOF de la fracción eluida a una concentración del 20% de acetonitrilo en la cromatografía de fase reversa. El espectro de masas muestra las masas moleculares de los iones monocargados ([M + H]+) 2811.42, 2690.42, \ORVFXDOHVVHLGHQWL¿FDURQFRPR los péptidos 1, 2, 3, y 4. En la Tabla 1 se muestran las secuencias de los cuatro fragmentos de TnT idenWL¿FDGRVDSDUWLUGHORVHVSHFWURV0606REWHQLGRV por espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF a partir de las fracciones de jamón curado. Figura 1. Espectro de masas MALDI-TOF obtenido a partir de la fracción eluída al 20% de acetonitrilo en cromatografía de fase-reversa. Las calpaínas (EC 3.4.22.17) participan en la proteolisis del músculo post-mortem principalmente durante la primera etapa del proceso de curado debido a su baja estabilidad en presencia de elevadas concentraciones de sal y pH ácidos, tal como ocurre en las etapas posteriores del curado. De acuerdo con los resultados obtenidos por algunos autores tras incubar TnT de músculo esquelético de conejo bajo condiciones de baja temperatura y alta fuerza iónica [5], la enzima µ-calpaina podría ser la responsable del sitio de corte Leu81-Met82, correspondiente al 176 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Table 1. 6HFXHQFLDVGHORVIUDJPHQWRVGH7Q7LGHQWL¿FDGRVQMDPyQFXUDGRXWLOL]DQGRHVSHFWURPHWUtDGHPDVDV0$/', TOF/TOF. Péptido Masa observada (Da) 1 2912.48 2 2811.42 3 2643.37 4 2515.27 Residuo en P1 56 L T 59 P 60 K 57 57 H[WUHPR &WHUPLQDO GH ORV SpSWLGRV LGHQWL¿FDGRV en el presente estudio (Tabla 1). Sin embargo, aunTXH HVWRV DXWRUHV WDPELpQ LGHQWL¿FDURQ HO VLWLR GH corte Thr57-Ala58, no podemos asegurar que esta enzima sea la responsable del extremo N-terminal del péptido 2, ya que este mismo péptido también KDVLGRLGHQWL¿FDGRFRQXQDWKUHRQLQDDGLFLRQDOHQ el extremo N-terminal (péptido 1, Tabla 1), lo que sugiere una posible acción de las aminopeptidasas en la generación de este sitio de corte. El efecto de la m-calpaína en músculo de cerdo ha sido también HVWXGLDGR LQ YLWUR > @ FRQ¿UPDQGR HO VLWLR GH corte Thr57-Ala58. (VWH HVWXGLR SRQH GH PDQL¿HVWR OD UHOHYDQFLD que pueden tener las calpaínas en la hidrólisis de la TnT durante el curado del jamón. De hecho, parte GH ORV UHVXOWDGRV REWHQLGRV FRQ¿UPDQ DOJXQRV GH ORV VLWLRV GH FRUWH SUHYLDPHQWH LGHQWL¿FDGRV SRU otros autores. Secuencia Identificada TAPKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL 81 APKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL 60 81 KIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL 61 81 IPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL 58 Referencias >@ 2OVRQ'*3DUULVK)&'D\WRQ:5*ROO D. E. Effect of Postmortem Storage and Calcium $FWLYDWHG)DFWRURQ0\R¿EULOODU3URWHLQVRI%R- Residuo en P'1 82 M 82 M 82 M 82 M vine Skeletal-Muscle. Journal of Food Science 1977;42: 117-124. [2] Laville, E.; Sayd, T.; Sante-Lhoutellier, V.; Morzel, M.; Labas, R.; Franck, M.; Chambon, C.; Monin, G. Characterisation of PSE zones in semimembranosus pig muscle. Meat Science 2005; 70: 167-172. [3] Hwang, I. H.; Park, B. Y.; Kim, J. H.; Cho, S. H.; Lee, J. M. Assessment of postmortem proteolysis by gel-based proteome analysis and its relationship to meat quality traits in pig longissimus. Meat Science 2005;69: 79-91. [4] Toldrá, F.; Rico, E.; Flores, J. Cathepsin B, D, H and L Activities in the Processing of DryCured Ham. Journal of the Science of Food and Agriculture 1993; 62: 157-161. >@ +XJKHV0&*HDU\6'UDQV¿HOG(0FSweeney, P. L. H.; O’Neill, E. E. Characterization of peptides released from rabbit skeletal muscle troponin-T by mu-calpain under conditions of low temperature and high ionic strength. Meat Science 2001; 59: 61-69. [6] Kitamura, S. I.; Muroya, S.; Tanabe, S.; Okumura, T.; Chikuni, K.; Nishimura, T. Mechanism of production of troponin T fragments during postmortem aging of porcine muscle. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2005; 53: 4178-4181. [7]. Muroya, S.; Kitamura, S.; Tanabe, S.; Nishimura, T.; Nakajima, I.; Chikuni, K. N-terminal amino acid sequences of troponin T fragments, including 30 kDa one, produced during postmortem aging of bovine longissimus muscle. Meat Science 2004; 67: 19-24. Agradecimientos Beca FPU del Ministerio de Educación y Ciencia (España), beca AGL2007-65379-C02-01/ALI del Ministerio de Educación y Ciencia (España) y FEDER. Especialmente al Servicio de Proteómica del Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF) por su contribución al análisis por MALDI-TOF/TOF. 81 177 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Instrucciones a los autores http://www.cbm.uam.es/seprot/ Envío de los manuscritos: Mediante correo electrónico [email protected] ProteómicaHVODUHYLVWDR¿FLDOGHOD6RFLHGDG(VSDxRODGH3URWHyPLFD6XSHULRGLFLGDGVHUiVHPHVWUDOHQHro-febrero y julio-septiembre) y será publicada por el Servicio de Publicaciones de la Universidad de Córdoba. Esta revista publicará artículos originales y comuQLFDFLRQHVEUHYHVGHFRQWHQLGRFLHQWt¿FRRWpFQLFR así como artículos de revisión, tutoriales y opiniones, notas, resúmenes de tesis doctorales o comentarios sobre cualquier aspecto relacionado con la proteómica. Incluirá información sobre nuestra Sociedad y sobre los socios, grupos e instituciones que la componen. El idioma será el castellano, aunque se admitirán contribuciones en otras lenguas, preferentemente el inglés. Aunque Proteómica se distribuirá preferentemente en España y Latinoamérica, pretende tener un carácter internacional, extendiendo su distribución a otros países. Esta revista se envía, sin coste alguno, a los socios de la SEProt, a Unidades y Servicios que trabajen en este campo, y a instituciones y organizaciones públicas o privadas vinculadas a la sociedad o con actividad relevante en el campo de la proteómica. Existirá una versión impresa, editada por el Servicio de Publicaciones de la UCO, y una versión “on-line” que aparecerá en la página web de la SEProt y de la Universidad de Córdoba. Todas las contribuciones serán revisadas por el comité editorial, y su formato deberá ajustarse a las instrucciones que se adjuntan. Los artículos originales, las comunicaciones breves, las revisiones y los WXWRULDOHVVHUiQHYDOXDGRVFLHQWt¿FDPHQWHSRUXQRR dos revisores elegidos por el comité editorial. Todas ODVFRQWULEXFLRQHVUHÀHMDQODRSLQLyQGHVXVDXWRUHV y no necesariamente la opinión del Comité Editorial ni de la Junta Directiva de la SEProt. Los manuscritos se enviarán por correo electrónico, a la dirección [email protected] Los artículos originales, las revisiones y los tutoriales deberán ir acompañados de una carta de presentación del trabajo (cover letter) y tendrán una extensión máxima de 15 páginas A4; las comunicaciones breves también deberán incluir una carta de presentación y tendrán una extensión máxima de 8 páginas A4. Los resúmenes de las Tesis Doctorales pretenden ser una forma de comunicar el trabajo realizado durante el periodo doctoral, a la vez que os ayudará a daros a conocer, por lo que el resumen debe de ir acompañaGRGHXQDSHTXHxDUHVHxDELEOLRJUi¿FDGHOJUXSRGH investigación. La extensión no debe de ser superior a 4 páginas. El resto de las contribuciones tendrá una extensión máxima de 4 páginas. Para el cálculo de la extensión se tendrán en cuenta, además del WH[WRODV¿JXUDVODVWDEODVODVLOXVWUDFLRQHV\ODV referencias. No se considera la publicación en color en la versión impresa, por lo que las ilustraciones, IRWRJUDItDV\JUi¿FRVDSDUHFHUiQHQEODQFR\QHJUR Deberán enviarse, en archivos separados, por una SDUWHHOWH[WR\ODVWDEODVSUHIHUHQWHPHQWHHQ:RUG \ SRU RWUD ODV ¿JXUDV HQ IRUPDWR SGI D GSLGHUHVROXFLyQ\DOWDPDxRGHLPSUHVLyQ¿QDO /RV DXWRUHV GHEHUiQ YHUL¿FDU TXH ORV GHWDOOHV GH ODV¿JXUDVVHLPSULPHQDSDUWLUGHORV¿FKHURVFRQ la calidad requerida y que el texto que incluyan las ¿JXUDVVHDOHJLEOHDOWDPDxRGHUHSURGXFFLyQ¿QDO /DVWDEODV\OH\HQGDVGH¿JXUDVGHEHQLUDO¿QDOGHO texto. El texto debe ajustarse al siguiente formato: letra Times New Roman, tamaño 12, doble espacio, SiJLQDV\OtQHDVQXPHUDGDVMXVWL¿FDFLyQWRWDO Los artículos originales deben tener las siguientes secciones: Portada. Incluirá el título, la lista de autores QRPEUH\DSHOOLGRV\VX¿OLDFLyQ\ORVGDWRV completos del autor con el que se mantendrá la FRUUHVSRQGHQFLD/D¿OLDFLyQGHORVDXWRUHVHQ el caso de que exista más de una, se indicará mediante un símbolo en formato superíndice detrás del nombre de cada autor. Resumen (máximo de 250 palabras) y palabras clave (máximo de 6, separadas por comas). Introducción. Deberá evitarse una revisión dePDVLDGR H[WHQVD GHO WHPD \ GHEHUi MXVWL¿FDU adecuadamente el contenido del trabajo. 178 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Materiales y métodos. Esta sección deberá ser breve, limitándose a describir los procedimientos que sean novedosos y referenciando aquellos ya GHVFULWRV/DVGHVFULSFLRQHVWHQGUiQHOVX¿FLHQWH detalle para permitir la repetición de los experimentos. [4] Kyte J. Mechanism in Protein Chemistry, Garland Publishing, Inc., 1995. [5] Castillejo MA. Análisis de los cambios de expresión producidos por un inhibidor de quinasas en células endoteliales. Tesis Doctoral, Universidad de Córdoba, 2005. Resultados. Con objeto de facilitar la edición de los manuscritos VHKDSUHSDUDGRXQ¿FKHURGHHVWLORSDUDHOSURJUDPD EndNote denominado Proteomica.ens, accesible desde QXHVWUDSiJLQDZHE3DUDSRGHUXVDUHVWH¿FKHURKD\ que colocarlo en el subdirectorio Styles del EndNote. Discusión. Los Resultados y la Discusión podrán agruparse en una única sección. Referencias. Agradecimientos. Las abreviaturas se incluirán como nota al pié de página la primera vez que aparezcan en el texto. Como norma general, no deben incluírse abreviaturas ni en el título ni en el resumen. (OVLVWHPDGHFLWDVELEOLRJUi¿FDV\UHIHUHQFLDV a partir del número 3 de la revista, será un formato basado en la revista Journal of Proteomics. Las referencias se citarán en el texto mediante números entre corchetes cuadrados de acuerdo a su orden de citación: cita simple[1], cita de varias referencias[2-4], cita de referencias alternadas[1, 3-5]. Todas las referencias deben ser numeradas de forma consecutiva. Las referencias a trabajos que no hayan sido publicados no se incluirán en la sección de Referencias; dichos trabajos deberán citarse, en el texto y entre paréntesis de acuerdo al siguiente formato: (Corrales F, Jorrín J, resultados no publicados), (Corrales F, Jorrín J, manuscrito enviado), (Jorrín J, Corrales F, comunicación personal). Las publicaciones serán citadas en la sección de Referencias según su orden de aparición y de acuerdo a los siguientes ejemplos: >@ 6WRUH\-'\7LEVKLUDQL56WDWLVWLFDOVLJQL¿FDQFH for genomewide studies. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:9440-5. [2] Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics 2002;1:376-86. >@ 6WXOWV-7+HQ]HO:-:RQJ6&\:DWDQDEH& ,GHQWL¿FDWLRQRI(OHFWUREORWWHG3URWHLQVE\3HStide Mass Searching of a Sequence Database en Mass Spectrometry in the Biological Sciences (editores: Burlingame A.L. y Carr S.A.), Humana Press, Totowa, New Jersey 1996, pp. 151-70. /DVWDEODV\¿JXUDVOOHYDUiQQXPHUDFLyQDUiELFD y se citarán en el texto en el siguiente formato: taEOD¿JXUD/DVWDEODVGHEHUiQOOHYDUXQWtWXOR\ podrán incluir notas a pie de tabla, que se referirán al contenido de la tabla usando símbolos en formato VXSHUtQGLFH 7RGDV ODV ¿JXUDV GHEHUiQ OOHYDU XQD leyenda conteniendo un titulo lo más representativo SRVLEOHGHOFRQWHQLGRGHOD¿JXUDHQQHJULWD\XQ texto explicativo lo más conciso posible; la descripFLyQGHWDOODGDRODLQWHUSUHWDFLyQGHOD¿JXUDHQVX caso, deberá hacerse en el texto del manuscrito. Las comunicaciones breves deben ajustarse al mismo formato que los artículos originales, y contendrán un resumen (máximo 250 palabras), una lista de palabras clave (máximo de 6, separadas por comas), una única sección conteniendo el texto principal, y las referencias y agradecimientos, además de las WDEODV\¿JXUDV(OWH[WRSULQFLSDOGHEHUiLQWURGXFLU adecuadamente el tema, explicar la metodología utilizada, y comentar y discutir los resultados. Los artículos de revisión y los tutoriales tendrán un formato libre pero deberán incluír un Resumen (máximo 250 palabras) y una lista de palabras clave (máximo de 6, separadas por comas). El resto de las contribuciones tendrá un formato libre. Todas las contribuciones deberán respetar el formato de ORVDUWtFXORVRULJLQDOHVHQFXDQWRDWDEODV¿JXUDV abreviaturas y referencias. Los resúmenes de las Tesis Doctorales incluirán los siguientes apartados: título de la tesis, autor, GLUHFWRUHV \ D¿OLDFLyQ IHFKD \ OXJDU GH OHFWXUD dirección web donde se puede consultar la tesis completa, si existe, resumen del trabajo (este apartado puede organizarse según el criterio del autor), XQD¿JXUDRHVTXHPDTXHLOXVWUHORVGDWRVDSRUWDGRV en la tesis, bibliografía, reseña del grupo de investigación en el que se ha realizado el trabajo (máximo 200 palabras). Se puede incluir una foto del grupo.