Javier Andrés Bravo Vivallo - Tesis

Transcripción

Universidad de Chile
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
EFECTO DEL ANTIDEPRESIVO DESIPRAMINA SOBRE MARCADORES
HIPOCAMPALES ASOCIADOS A LA RESILIENCIA CELULAR.
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado
Académico de Doctor en Bioquímica
Por:
Javier Andrés Bravo Vivallo
Directores de Tesis
Dra. Jenny Lucy Fiedler Temer
Dr. Hernán Lara Peñaloza
Santiago, Chile
2007
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Financiamiento:
Esta tesis de doctorado se realizó en el Laboratorio de Neurobioquímica, Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad
de Chile y contó con el financiamiento de los siguientes proyectos y becas:
Proyecto FONDECYT Nº 1040937
Investigador responsable: Dra. Jenny L. Fiedler T.
Proyecto FONDECYT-Cooperación Internacional Nº 7040157
Investigador responsable: Dra. Jenny L. Fiedler T.
Beca de ayuda para la realización de tesis del Departamento Postgrado y Postítulo de la
Universidad de Chile: Beca PG/86/2004 y PG/65/2005
Investigador responsable: Javier A. Bravo V.
Beca CONICYT Nº 102240 (2002-2006)
Beca CONICYT de asistencia a congresos en el extranjero
Otorgada a Javier A. Bravo V. para la asistencia a la Society for Neuroscience, 35th Annual
Meeting, 12 al 16 de Noviembre de 2005, Washington, DC. EE UU.
Beca AECI para asistencia a congresos en el extranjero
Otorgada a Javier A. Bravo V. para la asistencia a las Jornadas Iberoamericanas sobre
Investigación y Evaluación de Nuevos Medicamentos con Propiedades Ansiolíticas,
Antidepresivas y Neuroprotectoras, 30 de Agosto al 3 de Septiembre de 2004, Centro de
Formación de la Cooperación Española, Cartagena de Indias. Colombia.
Beca PABMB para asistencia a congresos en el extranjero
Otorgada a Javier A. Bravo V. para la asistencia a la Panamerican Association for Biochemistry
and Molecular Biology (PABMB), 10th Congress, 3 al 6 de Diciembre de 2005, Pinamar,
Provincia de Buenos Aires. Argentina.
ii
Publicaciones y presentaciones a congresos:
Manuscrito enviado a publicación:

Bravo JA, Díaz-Veliz G, Mora S, Arancibia S, Ulloa JL; Castañeda P; Lara HE, Fiedler JL
“Differential effects of chronic restraint stress and desipramine on proteins involved
in hippocampal neuroprotection”. Neuropsychopharmacology.
Presentaciones a congresos nacionales:

Bravo JA, Díaz-Veliz G, Mora S, Arancibia S, Lara HE, Fiedler JL. “Desipramine but
not Haloperidol prevents the stress induced depression-like behaviours in rats, and a
reduction in hippocampal TGF-β1 mRNA expression” 2do Congreso de la Sociedad
Chilena de Neurociencia, 27 al 29 de Septiembre de 2006, Hotel Villa el Descanso, Curicó,
VII Región. Chile.
Bravo JA, Andrés S, Mora S, Díaz-Véliz G, Arancibia S, Lara HE, Fiedler J. “Los Niveles
de ERK1/2-P, CREB-P y BCL-2 se Encuentran Aumentados en Hipocampo de
Animales Sometidos a un Modelo de Depresión”. 1er Congreso de la Sociedad Chilena
de Neurociencia, 1 al 2 de Diciembre de 2005, Club de Campo del Colegio Médico, Lo
Barnechea, Santiago. Chile
Bravo JA, Andrés S, Araneda K, Araya D, Rojas P, Sapag A, Castañeda P, Ulloa JL, Parra
C, Rojas R, Arancibia S, Araya V, Díaz-Veliz G, Mora S, Herrera L, Silva H, Fritsch R,
Rojas G, Lara HE, Fiedler JL. “Estrés, Glucocorticoides y Depresión”. XVI Reunión
Anual de la Sociedad Chilena de Reproducción y Desarrollo, 12 al 14 de Agosto de 2005,
Conferenece Town, Reñaca, V Región. Chile.
Fiedler JF, Andrés S, Araya D, Araneda K, Rojas P, Castañeda P, Bravo JA, Cárdenas SP,
Parra C, Greiner M, Morales P, Sapag A, Lara HE. “Glucocorticoides y Plasticidad
Neuronal: Implicancia en Depresión Mayor”. XXVI Reunión Anual de la Sociedad de
Farmacología de Chile, 3 al 5 de Octubre de 2004, Hotel Termas de Quinamávida, Colbún,
VII región. Chile.
Bravo JA, Díaz-Veliz G, Mora S, Lara HE, Fiedler JF. “Cambios en la Expresión
Hipocampal de tgf-β1 Inducida por Desipramina en un Modelo Animal de
Depresión”. XXVI Reunión Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile, 3 al 5 de
Octubre de 2004, Hotel Termas de Quinamávida, Colbún, VII región. Chile.
Presentaciones a congresos internacionales:

Bravo JA, Mora S, Díaz-Veliz G, Arancibia S, Lara HE, Fiedler JL. “Hippocampal
Changes in TGF-b1 mRNA do not Correlate with Levels of ERK1/2 and CREB in an
Animal Model of Depression” Panamerican Association for Biochemistry and Molecular
Biology (PABMB), 10th Congress, 3 al 6 de Diciembre de 2005, Pinamar, Provincia de
Buenos Aires. Argentina.
iii

Bravo JA, Díaz-Veliz G, Mora S, Arancibia S, Lara HE, Fiedler JL. “Expression of tgf-β1
Related to Changes in CREB-P and BDNF mRNA Levels in the CA3 Hippocampal
Layer of Rats Subjected to a Model of Depression”. Society for Neuroscience, 35th
Annual Meeting, 12 al 16 de Noviembre de 2005, Washington, DC. EE UU.
Bravo JA, Díaz-Veliz, Mora S, Dorfman M, Lara HE, Fiedler JL. “Changes in TGF-β1
mRNA expresión in the hippocampus of rats subjected to an animal model of
depresion”. Jornadas Iberoamericanas sobre Investigación y Evaluación de Nuevos
Medicamentos con Propiedades Ansiolíticas, Antidepresivas y Neuroprotectoras, 30 de
Agosto al 3 de Septiembre de 2004, Centro de Formación de la Cooperación Española,
Cartagena de Indias. Colombia.
iv
Agradecimientos:

A mis directores, Dra. Jenny Fiedler por haberme guiado, apoyado y ayudado a
crecer profesionalmente durante todo este tiempo. A ella un ¡Muchas Gracias! de
todo corazón. También al Dr. Hernán Lara por su ayuda y apoyo. A ambos ¡Gracias
por su paciencia!, y por permitir quedarme en el laboratorio todos estos años. La
verdad ha sido un segundo hogar para mi.
A Marcelita, mi amiga, compañera y esposa. Su cariño y amor han sido un pilar
fundamental para poder realizar esta tesis. Además, ella hizo un gran aporte a este
trabajo: estar a mi lado durante todo este tiempo. ¡Muchísimas Gracias!
A mi Familia, el apoyo y cariño de mis Padres, Hermanos, Sobrinos y Abuelos ha
sido muy importantes para poder seguir adelante. Gracias por todo.
A los profesores Sergio Mora y Gabriela Díaz-Veliz, quienes no solo me ayudaron, y
además me enseñaron el poder del estudio del comportamiento animal, si no que
también han sido muy grandes amigos.
A Ximena Campos por su apoyo y amistad durante todo este tiempo.
A Patricia Castañeda, no solo por su ayuda en esos fines de semana en que había que
venir a trabajar, si no que también por su compañía y su amistad.
A todos los otros miembros del laboratorio de Neurobioquímica: Sergio, Paulina,
Patricia, Romina, Coto, Karina, Claudio, Mauricio, Pablo, Ramón, Alfonso, Monika.
A todos ellos, ¡Muchas Gracias! por su apoyo.
A Gabriel, por su capacidad de aguantar todo lo que le ensuciamos y hacemos rabiar,
disgustos que quedan atrás al momento de compartir en los paseos, donde realmente
muestra el aprecio hacia la gente con quien trabaja.
A Miguel Copaja, Raul Vivar y Francisca Mateluna del laboratorio de
Farmacoquímica, por toda su ayuda.
A mis profesores, por haberme entregado una visión del mundo desde la perspectiva
de la ciencia, y por aguantarme todos estos años.
A mis amigos y compañeros de curso post grado Paola Rocco y Abel Vázquez.
A todos quienes trabajan en el Quinto Piso.
Y a todo el mundo que ha hecho de mí una mejor persona.
¡Gracias A Todos!
v
Tabla de contenidos:
Portada
Financiamiento
Publicaciones y presentaciones a congresos
Agradecimientos
Tabla de contenidos
Índice de figuras
Índice de tablas
Abreviaturas
Resumen
Summary
I. Introducción
1. Trastornos del ánimo
1.1. La depresión mayor
1.2. Vías neuronales involucradas en la etiología de la depresión
1.2.1. Antidepresivos y sus probables mecanismos de acción
1.3. Otras perspectivas en el estudio de la depresión
1.3.1. Estrés y adaptabilidad del individuo
1.3.2. Glucocorticoides y el eje Hipotalamo-Hipofisis-Suprarrenal (HHS)
1.3.3. Efectos de los glucocorticoides en otras estructuras del sistema
nervioso central
1.3.4. Acción de los glucocorticoides sobre el hipocampo
1.4. Mecanismos que mantienen la resiliencia celular en el hipocampo
1.4.1. Participación de la proteína de unión al elemento de respuesta de
AMPc (CREB)
1.4.2. Participación de factores neurotróficos en la acción de antidepresivos
1.4.3. Participación de proteínas asociadas a neuroprotección en la acción de
antidepresivos
1.4.4. Participación de otros factores de crecimiento asociados a la
neuroprotección
II. Hipótesis
III. Objetivo general
IV. Materiales y métodos
1. Animales y Tratamientos
1.1. Estrés crónico por restricción de movimiento
1.2. Tratamientos farmacológicos
2. Pruebas conductuales
2.1. Prueba de preferencia a una solución de sacarosa al 1% como agua de
bebida
2.2. Adquisición de respuestas condicionadas y fallas en la respuesta a nuevos
paradigmas de estrés
2.3. Prueba de natación forzada
3. Preparación de tejidos
4. Determinación de los niveles séricos de corticosterona
5. Determinación del contenido de catecolaminas de la médula suprarrenal
5.1. Adsorción de catecolaminas en alúmina
5.2. Fase movil
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5.3. Detección
6. Hibridación in situ
6.1 Marcaje de oligonucleótidos para la hibridación in situ BDNF y TGF-β1
6.2. Marcaje del ARN complementario usado para la hibridación in situ de
Bcl-2
6.3. Protocolo de hibridación in situ
6.4. Análisis de la hibridación in situ
7. Determinaciones inmunohistoquímicas
7.1. Análisis de la detección inmunohistoquímica
8. Análisis por inmunowestern blot
8.1. Inmunowestern Blot
9. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA
9.1. Estudio de la sensibilidad del receptor α2 en cortes de hipocampo
9.1.1. Evaluación de la bioactividad de TGF-β1
9.1.2. Desdiferenciación de fibroblastos a miofibroblastos
9.1.3. Tinción con cristal violeta
10. Análisis estadístico
V. Resultados
1. Determinar si el estrés crónico por restricción de movimiento induce
características similares a la depresión, y si este efecto es prevenido por la
administración crónica de DMI
1.1. Determinación de parámetros fisiológicos luego del estrés crónico por
restricción de movimiento
1.1.1. Variaciones en el peso corporal
1.1.2. Tamaño de las glándulas suprarrenales y contenido de catecolaminas
1.1.3. Niveles de corticosterona
1.2. Cambios conductuales inducidos por estrés crónico y su modificación por la
administración de DMI
1.2.1. Adquisición de respuestas condicionadas y capacidad de responder a
nuevos estímulos nocivos
1.2.2. Prueba de natación forzada
1.2.3. Preferencia por una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida
2. Analizar en un modelo animal de depresión, cambios en los niveles de
marcadores asociados a la resiliencia celular en hipocampo de rata
2.1. Determinar los efectos del estrés crónico y el tratamiento con DMI sobre
ERK1/2, CREB, BCL-2, BDNF y TGF-β1, como marcadores asociados a la
resiliencia celular
2.1.1. Determinación por inmunowestern blot de ERK1/2
2.1.2. Determinación por inmunowestern blot de CREB
2.1.3. Determinación por inmunohistoquímica de P-CREB
2.1.4. Determinación de cambios en el ARNm de BCL-2 por hibridación in
situ
2.1.5. Determinación por inmunowestern blot de BCL-2
2.1.6. Determinación por inmunohistoquímica de BCL-2
2.1.7. Determinación de cambios en el ARNm de BDNF por hibridación in
situ
2.1.8. Determinación de cambios en el ARNm de TGF-β1 por hibridación in
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situ
3. Cambios en la sensibilidad del receptor α2 adrenérgico inducidos por estrés
crónico
3.1. Efecto de la depolarización con K+ 25mM y dependencia de Ca2+ en la
liberación 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA
3.2. Efecto de la depolarización con K+ 25mM y en la liberación de 3H desde
cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA en presencia de
Yohimbina y Clonidina
3.3. Relación entre las áreas bajo la curva de la liberación fraccional de cada
condición experimental
3.4 Efecto de Yohimbina, Clonidina y TGF-β1 en la liberación 3H desde cortes
de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA
3.4.1. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo de ratas control sin
estresar recientemente cargados con 3H-NA, y efecto de Yohimbina,
Clonidina y TGF-β1
3.4.2. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados recientemente
con 3H-NA, de ratas control sin estresar tratadas crónicamente con
Desipramina. Efecto de Yohimbina, Clonidina y TGF-β1
con 3H-NA, de ratas estresadas crónicamente, y efecto de Yohimbina,
Clonidina y TGF-β1
con 3H-NA, de ratas estresadas crónicamente tratadas con Desipramina, y
efecto de Yohimbina, Clonidina y TGF-β1
3.5. Bioactividad de TGF-β1. Desdiferenciación de fibroblastos a
miofibroblastos
VI. Conclusiones
VII. Discusión
1. Respuestas fisiológicas asociadas al estrés crónico
2. Efecto del estrés crónico por restricción de movimiento en conductas similares a
la depresión y efectos de la Desipramina
2.1. El tratamiento con DMI mejora la adquisición de respuestas condicionadas
en animales estresados
2.2. El estrés crónico genera una condición de desesperanza aprendida: prueba
de natación forzada
2.3. Los animales estresados tienen una reducida preferencia por una solución
azucarada como agua de bebida
3. La Desipramina indujo cambios en marcadores asociados a la resiliencia celular
y neuroplasticidad en el hipocampo
3.1. El estrés crónico aumenta el grado de fosforilación de las ERK1/2
3.2. CREB es modulado de manera diferente a la activación de ERK1/2 en las
condiciones de estrés crónico y tratamiento con DMI
3.3. BCL-2 cambia su expresión en condiciones donde la resiliencia celular se
ve mas afectada
3.4. El ARNm total de BDNF se reduce por efecto del estrés crónico y la
Desipramina previene este efecto solo en la región CA3 del hipocampo
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3.5. Participación de otros factores de crecimiento en la resiliencia celular:
participación del TGF-β
3.6. El tratamiento con HAL no previene los efectos del estrés crónico
4. Estrés crónico, actividad del receptor α2 presináptico y efecto de la DMI
4.1. El tratamiento crónico con DMI a animales sin estresar cambia la
sensibilidad del receptor α2 presináptico
4.2. El TGF-β1 es capaz de afectar el eflujo de 3H de cortes de hipocampo
recientemente cargados con 3H-NA
VIII. Proyecciones
IX. Referencias
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ix
Índice de figuras:
Figura 1. El hipocampo de rata. Anatomía del hipocampo
Figura 2. Esquema de mecanismos relacionados con la resiliencia celular
Figura 3. Estructura de la Desipramina
Figura 4. Esquema del protocolo de liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente
cargados con 3H-NA
Figura 5. El estrés crónico reduce la ganancia de peso corporal
Figura 6. El estrés crónico y el tratamiento con DMI alteran la adquisición de respuestas
condicionadas, y los problemas en evitar estímulos nocivos
Figura 7. El estrés aumenta la inmovilidad en la prueba de natación forzada
Figura 8. El estrés crónico reduce la preferencia por una solución de sacarosa al 1%
Figura 9. El estrés crónico y el tratamiento con DMI inducen cambios hipocampales en
ERK1/2 total y su grado de fosforilación
Figura 10. El estrés crónico aumenta los niveles hipocampales de CREB y P-CREB
Figura 11. Microfotografías representativas de la inmuohistoquímica de P-CREB en diferentes
regiones hipocampales
Figura 12. Análisis la inmunoreactividad relativa de P-CREB en las diferentes áreas
hipocampales
Figura 13. Hibridación in situ para BCL-2 en hipocampo de rata
Figura 14. El estrés reduce los niveles hipocampales del ARNm de BCL-2, efecto que no es
prevenido por la DMI
Figura 15. El estrés induce un aumento en los niveles hipocampales de BCL-2
Figura 16. Microfotografías representativas de la inmunohistoquímica de BCL-2 en diferentes
regiones del hipocampo
Figura 17. Efecto del estrés crónico y del tratamiento con DMI en la inmunoreactividad
relativa de BCL-2 en el hipocampo de rata
Figura 18. Hibridación in situ para BDNF en hipocampo de rata
Figura 19. El estrés crónico reduce los niveles hipocampales del ARNm de BDNF, efecto que
solo es prevenido por DMI en la región CA3
Figura 20. Hibridación in situ para TGF-β1 en hipocampo de rata
Figura 21. El estrés crónico reduce los niveles del ARNm de TGF-β1 en todo el hipocampo,
efecto que se previene por la DMI
Figura 22. Liberación de 3H desde cortez de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA,
estimulada por depolarización con K+ 25mM en presencia y ausencia de Ca2+.
Figura 23. Efectos de la Yoh 5µM y Clo 5µM en la liberación de 3H desde cortes de
hipocampo recientemente cargados con 3H-NA por depolarización con K+ 25mM
Figura 24. La liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA
depende de Ca2+, y es sensible a agonistas y antagonistas del receptor α2
Figura 25. Liberación de 3H desde hipocampo de animales control sin estresar, recientemente
cargados con 3H-NA
Figura 26. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados con 3H-NA, de animales
control tratados crónicamente con DMI
estresados crónicamente
estresados crónicamente tratados con DMI
Figura 29. Razones E2/E1 de ensayos de liberación de 3H en animales control sin estresar,
control tratados con DMI, estresados crónicamente, y estresados tratados con DMI
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Figura 30. Efecto de TGF-β1 en un cultivo de fibroblastos neonatales cardiacos
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Índice de tablas:
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Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos de ADN de hebra simple y de ARN
complementario para las hibridaciones in situ de BDNF, BCL-2 y TGF-β1
Tabla 2. Anticuerpos utilizados en inmunohistoquímica
Tabla 3. Resumen de las condiciones de determinación para las distintas proteínas
por la técnica de Inmunowestern Blot.
Tabla 4. Tamaño de la glándula suprarrenal y contenido de noradrenalina (NA) y
adrenalina (A) en la medula de la glándula
Tabla 5. Niveles séricos de corticosterona (CORT)
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xii
Abreviaturas:
3
H:
H-NA:
5-HT:
ACTH:
APA:
AVP:
Anti-digoxigenina-AP:
ARC:
ARNc:
ARNm:
B:
BCIP:
BDNF:
bFGF:
BSA:
CA:
CAs:
Clo:
COMT:
CONTROL+DMI:
CONTROL+HAL:
CONTROL+SAL:
CORT:
CPM:
CRE:
CREB:
CRH:
CRHR1:
DEX:
DHBA:
DM:
DMI:
DSM-IV:
3
DTT:
E:
EDTA:
FBS:
FCN:
FE:
GABA:
GABAB:
GAP-43:
GCs:
GD:
Tritio
Noradrenalina Tritiada
Serotnina
Hormona Adrenocorticotrofina
Asociación Norteamericana de Psiquiatría
Argininavasopresina
Anticuerpo Antidigoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina
Adquisición de respuestas condicionadas
Ácido Ribonucléico complementario
Ácido Ribonucléico mensajero
Basal
5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil Fosfato
Neurotrofina derivada de cerebro
Factor básico de crecimiento de fibroblastos
Albúmina sérica de bovino
Cuerno de Amon
Catecolaminas
Clonidina
Catecol-O-Metil Transferasa
Animal Control sin estresar tratado con DMI 10mg/kg ip.
Animal Control sin estresar tratado con HAL 50µg/kg sc.
Animal Control sin estresar inyectado con NaCl 0,9% ip.
Corticosterona
Cuentas por minuto
Elemento de respuesta a proteína CREB
Proteína de unión a elementos de respuesta a AMPc
Hormona liberadora de corticotrofina
Receptor 1 de la hormona liberadora de corticotrofina
Dexametasona
Dihidrobencil-amina
Depresión Mayor
Desipramina
Manual estadístico y diagnóstico 4ta edición, de la Asociación
Norteamericana de Psiquiatría
Ditiotreitol
Estímulo
Ácido di-etilentetraacético
Suero bovino fetal
Fibroblastos cardiacos de neonato
Falla en el Escape
Ácido gamaaminobutírico
Receptor B del ácido gamaaminobutírico
Proteína asociada al crecimiento de 43kDa
Glucocorticoides
Giro Dentado
xiii
GR:
Receptor a Glucocorticoides
HAL:
Haloperidol
HHS:
Eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal
HIS:
Hibridación in situ
HPLC:
Cromatografía líquida de alta resolución
i.p.:
Intraperitoneal
IHQ:
Inmunohistoquímica
IL-1:
Interleuquina tipo 1
IL-10:
IL-6:
InfGD:
Capa infrapiramidal del giro dentado
Kir:
Canal de K+ de rectificación de corriente hacia dentro de la célula
KRBH:
Solución de Krebs-Ringer tamponada con bicarbonato y HEPES
L:
Lavado
MAO:
Monoamino oxidasa
MKPs:
Fosfatasa de proteínas MAPK
NA:
Noradrenalina
NBT:
Azul de nitrotetrazolio
NET:
Transportador de noradrenalina
NF-κB:
Factor nuclear κB
NGS:
Suero normal de cabra
NMDA:
Ácido N-metil-D-aspártico
PCA:
Ácido perclórico
P-CREB:
Proteína de unión a elementos de respuesta a AMPc fosforilada
PE:
Postestímulo
PKA:
Proteína quinasa activada por AMPc
PKC:
Proteína quinasa dependiente de Ca2+
PVN:
Núcleo paraventricular del hipotalamo
RESTRICCIÓN+DMI: Animal estresado crónicamente tratado con DMI 10mg/kg ip.
RESTRICCIÓN+HAL: Animal estresado crónicamente tratado con HAL 50µg/kg sc.
RESTRICCIÓN+SAL: Animal estresado crónicamente inyectado con NaCl 0,9% ip.
RT-PCR:
Reacción en cadena de la polimerasa asociada a transcripción reversa
Ser 133:
Serina en la posición 133 de la proteína CREB
SERT:
Transportador de serotonina
SNC:
Sistema nervioso central
SSC:
Solución tamponada de citrato sódico y cloruro sódico
SupGD:
Capa suprapiramidal del giro dentado
TBS:
Solución tamponada de Tris y NaCl
TE:
Solución tamponada de Tris y EDTA
TGF-β1:
Factor de crecimiento transformante tipo β1
TNFα:
Factor de necrosis tumoral tipo α
TrkB:
Receptor a BDNF
V3:
Receptor a Argininavasopresina tipo 3
Yoh:
Yohimbina
ERK:
Quinasa regulada extracelularmente
xiv
Resumen:
La depresión mayor es uno de los desórdenes del ánimo más comunes. Aunque no se conoce la
etiología de la depresión, se ha establecido que esta condición podría producirse como
consecuencia de la interacción de los genes y el ambiente. Además, se ha propuesto que en
episodios depresivos existe una deficiencia de la neurotransmisión serotoninérgica y/o
noradrenérgica en el sistema nervioso central (SNC). De acuerdo con esto, los tratamientos
farmacológicos para esta patología aumentan la biodisponibilidad de serotonina (5-HT) o
noradrenalina (NA), a través del bloqueo de su recaptura por los terminales nerviosos en
distintas estructuras del SNC. El aumento en 5-HT o NA ocurre rápidamente, sin embargo, los
pacientes que se encuentran bajo tratamiento con antidepresivos perciben una mejoría sólo tras
varias semanas. Por otra parte, los eventos estresantes a lo largo de la vida inician una serie de
respuestas fisiológicas que subsecuentemente pueden transformarse en patológicas. Esta última
evidencia sugiere la participación de los mecanismos de respuesta al estrés en los desórdenes
depresivos.
La respuesta al estrés se encuentra bajo el control del eje Hipotálamo-Hipófisis-Suprarrenal
(HHS), el cual regula la secreción de Glucocorticoides (GCs). Alrededor del 50% de los
pacientes depresivos poseen niveles elevados de GCs. La depresión afecta ciertas regiones del
SNC, como el hipocampo, una estructura que posee receptores a GCs (GRs) y que está
relacionada con procesos de memoria y aprendizaje. Se ha demostrado que la activación
persistente de los GRs reduce la neuroplasticidad hipocampal, y además afecta la capacidad
celular para sobrellevar condiciones adversas (reducción en la resiliencia celular). Por el
contrario, los antidepresivos son capaces de incrementar la expresión hipocampal de genes
neuroprotectores, que se sabe modulan la resiliencia celular y la neuroplasticidad. Además, los
antidepresivos mejoran la capacidad de regulación por retroalimentación que ejercen los GCs
sobre el eje HHS, disminuyendo de esta forma los niveles de GCs. De acuerdo con esto, si el
estrés crónico afecta la función del eje HHS, aumentando los niveles de GCs, afectando de esta
manera la función hipocampal a través de una disminución en la resiliencia celular, y si estos
efectos inducen características similares a la depresión, es posible postular la siguientes
hipótesis: i) En animales de experimentación, el estrés crónico por restricción de movimiento
xv
induce conductas similares a la depresión, efecto que es prevenido por el antidepresivo
Desipramina; y ii) El antidepresivo promueve cambios en marcadores de resiliencia celular al
interior del hipocampo, como ERK1/2, CREB y BCL-2, y además induce cambios en factores
tróficos como BDNF y TGF-β1.
Para estudiar esta hipótesis, ratas macho Sprague- Dawley fueron sometidas a 2,5h diarias de
estrés por restricción de movimiento durante 14 días. Estos animales fueron inyectados
crónicamente con una solución salina, Desipramina (DMI) 10mg/kg, i.p., o Haloperidol (HAL)
50µg/kg s.c. Este último fármaco corresponde a un antipsicótico que se utilizó para evaluar si los
efectos de DMI sobre la conducta correspondían a aquellos reportados para antidepresivos y no a
acciones diferentes.
El estrés crónico por restricción de movimiento redujo la ganancia de peso, efecto que no fue
prevenido por el tratamiento con DMI ni con HAL. De igual forma, el estrés crónico indujo
mayores niveles de GCs, efecto que fue parcialmente prevenido por el tratamiento con DMI pero
no por el HAL. Con respecto a los efectos del estrés sobre la conducta, los animales estresados
crónicamente mostraron conductas similares a la depresión, incluyendo 1) reducción de la
preferencia por una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida, lo cual asemeja una
conducta de anhedonia; 2) reducción en la adquisición de respuestas condicionadas, lo cual se
relaciona con deficiencias en las capacidades cognitivas; 3) falla en el escape en la prueba de
evitación activa y 4) aumento en la inmovilidad en la prueba de natación forzada,
comportamientos que son indicativos de desesperanza aprendida. Estas conductas fueron
prevenidas de manera específica por el tratamiento crónico con DMI pero no con HAL. Estos
cambios sugieren que el estrés crónico afecta el SNC, y por lo tanto se estudiaron a continuación
cambios en marcadores de resiliencia celular en el hipocampo.
Estudios de inmunoblot en extractos de proteínas hipocampales revelaron que el estrés
incrementó los niveles de P-ERK1/2 y P-CREB. La administración de DMI previno el
incremento en P-ERK1/2 inducido por el estrés, pero no el de P-CREB. La evaluación por
inmunohistoquímica mostró que, mientras el estrés no modificó los niveles de P-CREB en el
área CA y el giro dentado (GD) del hipocampo, estos niveles sí se encontraron aumentados
luego del tratamiento sólo con DMI a animales estresados. El HAL redujo la inmunoreactividad
xvi
relativa de P-CREB en cada subárea del hipocampo, independiente de la condición de estrés.
Además, la DMI no previno la reducción de los niveles de ARNm de BCL-2 asociada al estrés
en el hipocampo. Sin embargo, los análisis de inmunoblot mostró un aumento en los niveles de
proteína de BCL-2 sólo en los animales estresados, efecto que fue prevenido por DMI. Con
respecto al ARNm de BDNF, hubo una reducción del transcrito total de BDNF por efecto del
estrés, efecto que fue prevenido por DMI, pero no por HAL, solamente en el área CA3. El estrés
también disminuyó los niveles de ARNm de TGF-β1 en todas las subáreas hipocampales, efecto
que fue completamente prevenido por el tratamiento con DMI, pero no con HAL.
Estos resultados sugieren una compleja relación entre el comportamiento, fosforilación de
ERK1/2 y CREB, la expresión de BCL-2 y BDNF. Además, esta es la primera vez que se
demuestra que la expresión del ARNm de TGF-β1 se disminuye por el estrés, y que este efecto
es prevenido por DMI. Estos datos sugieren que dentro de las acciones de DMI se podría incluir
la inducción de TGF-β1, para promover cambios que favorezcan la resiliencia celular, o para
mejorar la neurotransmisión de NA en el hipocampo. Se ha descrito que algunas citoquinas
modulan la liberación de NA en el hipocampo, probablemente a través de efectos sobre el
receptor inhibitorio presináptico α2. Por lo tanto, se evaluaron los efectos del estrés y el
tratamiento con DMI sobre la actividad inhibitoria de α2, así como el efecto de TGF-β1 sobre el
eflujo de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA.
El tratamiento crónico con DMI a los animales sin estresar redujo el efecto del antagonista
α2Yohimbina (Yoh), y produjo que el eflujo de 3H desde cortes de hipocampo se volviera
insensible al agonista α2 Clonidina (Clo), cuando fueron estimuladas con K+ 25mM. Además, el
estrés crónico redujo el efecto de Yoh, sin embargo, se observó un aumento en el efecto de Clo
sobre la liberación hipocampal de 3H. Un patrón similar se observó en animales sometidos a
restricción de movimiento y tratados con DMI. Estos datos sugieren que el estrés crónico y el
tratamiento crónico con DMI inducen cambios diferenciales en la sensibilidad presináptica de
α2, probablemente como resultado de una interacción compleja entre más de un sistema de
neurotransmisores (por ejemplo, glutamato y GABA), sobre el eflujo de 3H desde cortes de
hipocampo cargados con 3H-NA. Más aún, TGF-β1 afecta este eflujo de 3H. En animales control
sin estresar, TGF-β1 disminuyó la el eflujo de 3H, pero en ratas control tratadas con DMI, y en
xvii
animales estresados con o sin tratamiento con DMI, el TGF-β1 aumentó el eflujo de 3H. Estos
efectos no pueden ser relacionados directamente con una modulación de la actividad α2
presináptica, como se ha sugerido para otras citoquinas, más aún, es probable que TGF-β1
module sus efectos modificando la conductancia de iones como Ca2+ y/o K+.
Los resultados presentados sugieren que la DMI modula la expresión de ciertos marcadores
relacionados con la resiliencia celular, tal como TGF-β1, y también afecta la excitabilidad de las
células al interior del hipocampo, siendo el ultimo efecto un importante mediador en la acción
antidepresiva de DMI.
xviii
Summary:
EFFECT OF THE ANTIDEPRESSANT DESIPRAMINE ON HIPPOCAMPAL MARKERS
RELATED TO CELLULAR RESILIENCE.
Major depression is one of the most common forms of mood disorders. Although there is no
specific aetiology underlying depression, it has been established that this condition could be a
consequence of genes and environment interactions. Also, it has been proposed that in a
depressive episode there is impairment of serotoninergic and/or noradrenergic neurotransmission
within the central nervous system (CNS). Accordingly, pharmacological treatments for this
disorder improve serotonin (5-HT) or noradrenaline (NA) bioavailability through a blockade in
their reuptake from neuron terminals in CNS structures. The increase in 5-HT or NA occurs
rapidly, but patients under antidepressant treatment perceive improvements only after several
weeks. On the other hand, stressful events throughout life trigger a series of physiological
responses that can become pathologic afterwards. The latter evidence suggest the participation
the stress response mechanisms in depressive disorders.
Stress response is under control of the Hypothalamus-Hypophysis-Adrenal gland (HHA) axis,
which regulates Glucocorticoid (GC) secretion. About 50% of depressed patients show increased
levels of GCs. These hormones affect certain regions of the CNS, such as the hippocampus, a
structure which has GCs receptors (GR) and is related with processes of memory and learning. It
has been shown that persistent activation of hippocampal GRs reduces hippocampal
neuroplasticity, and also affects cellular ability to withstand aversive conditions (reduced cellular
resilience). Conversely, antidepressants are able to increase the expression of hippocampal
neuroprotective genes, also known to modulate neuroplasticity. In addition, antidepressants
improve the feedback regulation of the HHA axis by GCs, thus reducing GCs levels.
Accordingly, if chronic stress affects HHA axis function, increasing GCs levels, thus affecting
hippocampal function through a reduction in cellular resilience, and these effects induce
depression-like characteristics, the following hypothesis can be stated: In experimental animals,
chronic motion restraint stress induces depression-like behaviours, an effect prevented by the
xix
antidepressant Desipramine. The antidepressant promotes changes in cellular resilience
markers within the hippocampus, such as ERK1/2, CREB and BCL-2, and also induces changes
in trophic factors such as BDNF and TGF-β1.
To study this hypothesis, male Sprague-Dawley rats were subjected to 2.5h of daily restraint
stress during 14 days. These animals were chronically injected with either saline, 10 mg/kg
Desipramine (DMI), i.p, and 50µg/kg Haloperidol (HAL) sc. This latter antipsychotic was
introduced to evaluate if the effects of DMI on behaviour match those of an antidepressant and
not to a different action.
Chronic restraint stress reduced the weight gain, an effect that was not prevented by DMI or
HAL treatment. As well, chronic stress induced higher GCs levels, an effect also not prevented
by DMI or HAL treatment. As for the effects of stress on behaviour, chronically restrained
animals showed depression-like behaviours including 1) reduction in the preference for a 1%
sucrose solution as drinking water, which resembles anhedonic behaviour; 2) reduced acquisition
of conditioned responses, which relates to impairments in cognitive abilities; 3) escape deficit in
the active avoidance test and 4) increased immobility in the forced swim test, behaviours
indicating learned helplessness. These behaviours were specifically prevented by chronic DMI
but not by HAL treatment. These changes suggest that chronic stress affects the CNS, therefore
changes in cellular resilience markers were studied within the hippocampus.
Immunoblot from hippocampal protein extracts revealed that stress increased P-ERK1/2 and
P-CREB levels. DMI administration prevented the restraint-induced increase in P-ERK1/2 but
not in P-CREB levels. Whereas P-CREB, evaluated by immunohistochemistry, was not modified
by restraint in the hippocampal CA and dentate gyrus (DG), it was increased in after DMI
treatment on stressed animals. HAL reduced P-CREB relative immunoreactivity in every
hippocampal subfield, in each experimental condition. Also, DMI did not prevent the restraint
associated reduction in BCL 2 mRNA in hippocampus. However, immunoblot analysis showed
an increase in BCL-2 protein levels only in restrained animals, an effect prevented by DMI
treatment but not by HAL. As to BDNF mRNA, it was reduced by restraint, an effect only
prevented by DMI in the CA3 area, but not by HAL. Stress also reduced the mRNA levels of
xx
TGF-β1 in every hippocampal subfield, an effect completely prevented by DMI treatment and
not by HAL.
These results suggest a complex relationship between behaviour, ERK1/2, CREB activation, and
expression of BCL 2 and BDNF. Also, this is the first demonstration that TGF-β1 mRNA
expression is reduced by stress and prevented by DMI treatment. These data suggest that DMI
action could include the induction of TGF-β1, to promote changes towards an improvement in
cellular resilience within the hippocampus, or to improve NA neurotransmission within the
hippocampus. It has been described that cytokines modulate NA release from the hippocampus,
probably affecting the presynaptic α2 inhibitory receptor. Therefore the effects of stress and DMI
treatment on α2 inhibitory activity were evaluated, as well as the effect of TGF-β1 on NA
release.
Chronic DMI treatment in unstressed animals reduced the effect of α2 antagonist Yohimibine
(Yoh), and made the 3H efflux from hipocampal slices recently loaded with 3H-NA insensitive to
α2 agonist Clonidine (Clo) when stimulated by depolarization with K+ 25mM. Also, chronic
stress reduced the effect of Yoh, however an increase in the effect of Clo on 3H efflux was
observed. A similar pattern was seen in restrained animals treated with DMI. This data suggests
that chronic stress and chronic DMI treatment induce differential changes in presynaptic α2
sensitivity, probably as a result of a complex interaction of more than one neurotransmitter
system (for instance, glutamate and GABA), on 3H release from hippocampal slices loaded with
3
H-NA. Furthermore, TGF-β1 affects 3H efflux. In control unstressed animals TGF-β1 reduced
3
H efflux, but in control rats treated with DMI, and stressed animals with or without DMI
treatment, TGF-β1 increased 3H effluxes. These effects cannot be related directly to a
modulation on presynaptic α2 activity, as suggested for other cytokines, moreover, it is likely
that TGF-β1 modulates this effect by affecting ion conductance, probably Ca2+ and/or K+.
These data suggest that DMI modulates the expression of certain markers related to cellular
resilience, such as TGF-β1, and also affects cells excitability within the hippocampus, being the
latter effect an important mediator in the antidepressant action of DMI.
xxi
I. Introducción:
Según la organización mundial de la salud, la definición de salud corresponde a un estado de
completo bienestar físico, mental y social, y no meramente la ausencia de enfermedad (WHO,
2006). Con respecto a la salud mental, esta misma organización estima que cerca de 450
millones de personas sufren actualmente de alguna patología neurológica, mental o del
comportamiento, haciendo de este tipo de enfermedades un problema común a nivel mundial
(WHO, 2006).
1. Trastornos del ánimo:
Los trastornos del ánimo, son enfermedades mentales que involucran varios aspectos
psicológicos como también físicos del individuo. No son lo mismo que los sentimientos
pasajeros de tristeza, si no que son una condición patológica de la cual el paciente no se puede
despojar o eliminar en forma voluntaria (NIMH, 2002). Este tipo de patologías interfieren con la
calidad de vida del individuo, y también afecta a quienes le rodean (NIMH, 2002).
1.1. La depresión mayor:
Existen varios tipos de trastornos del ánimo, siendo la depresión mayor (DM) uno de los
desordenes más comunes. Su característica principal es una alteración en el humor de quien
sufre este trastorno (APA, 1999). La DM es una psicopatología que afecta la manera de sentirse,
pensar y actuar del individuo (APA, 1999), pudiendo ser a menudo una amenaza para la vida de
quienes la sufren, principalmente por el riesgo al suicidio (Nestler, E.J., y cols., 2002). Es tal el
impacto que puede tener la depresión, que se estima que para el año 2020, la DM será una de las
mayores causas de discapacidad a nivel mundial (Lecrubier, Y., 2001, Murray, C.J.L., y cols.,
1996, Nestler, E.J., y cols., 2002). Para el diagnóstico de la depresión el psicoterapeuta busca
signos como ánimo deprimido, irritabilidad, baja autoestima, sentimientos de desamparo y
culpabilidad, capacidad disminuida de concentrarse y pensar, apetito disminuido o aumentado,
que trae como consecuencia pérdida o ganancia de peso, insomnio o hipersomnia, fatiga o
agitación aumentada, perdida de interés por estímulos placenteros (sexo, comida, interacciones
sociales, etc.), pensamientos recurrentes sobre la muerte y el suicidio. El diagnostico de la DM,
1
de acuerdo al Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales 4ta edición
(DSM-IV) (APA, 1999) se efectúa cuando el paciente presenta 5 o más criterios diagnósticos
(incluyendo el estado de ánimo depresivo y la perdida de interés o capacidad para el placer,
también llamada anhedonia) y cuando éstos persisten por un período de más de 2 semanas,
alterando la interacción social y ocupacional del individuo (APA, 1999)
Hasta la fecha no se ha identificado una etiología específica para explicar el origen de la
depresión (Fava, M., y cols., 2000, Nestler, E.J., y cols., 2002); sin embargo se han logrado
establecer algunos posibles factores de riesgos que se asocian esta psicopatología como:
i) genético, determinado a través de estudios en familias y en gemelos (Shih, R.A., y cols.,
2004); ii) eventos estresantes a lo largo de la vida, que pueden desencadenar una serie de
respuestas fisiológicas, que a lo largo del tiempo se vuelven patológicas, permitiendo explicar
ciertos fenómenos clínicos observados en pacientes (Fava, M., y cols., 2000, Nestler, E.J., y
cols., 2002). De esta forma, se puede decir que el origen de la depresión en un individuo ocurre
por una interacción entre genes y ambiente, siendo esto último en función de la perspectiva del
entorno donde éste se desarrolle.
1.2. Vías neuronales involucradas en la etiología de la depresión:
Existe diversa evidencia farmacológica y neuroquímica que ha permitido establecer algunas
hipótesis con respecto al tipo de disfunción que ocurre a nivel del sistema nervioso central
(SNC). La administración de reserpina, fármaco que interfiere con el almacenamiento vesicular
de neurotransmisores como serotonina (5-HT) y noradrenalina (NA) (Hoffman, B., y cols., 2001,
Sachar, E.J., 1991), disminuyendo el almacenamiento de estos neurotransmisores y promoviendo
la degradación de estos por enzimas como la monoaminooxidasa (MAO), genera depresión en
pacientes (Pletscher, A., y cols., 1956, Sachar, E.J., 1991). Este hallazgo tiene su paralelo en
estudios en animales, en que la administración de reserpina produce algunas caracteristicas
similares a la depresión (Rojas-Corrales, M.O., y cols., 2004, Sachar, E.J., 1991). En este mismo
sentido, la administración de inhibidores de la MAO a animales tratados con reserpina previene
los efectos de este último fármaco en el comportamiento (Sachar, E.J., 1991). Otro hallazgo en
relación a lo observado con los inhibidores de la MAO en el comportamiento de animales y su
acción en pacientes, se descubrió gracias a compuestos tricíclicos capaces de aumentar la
2
biodisponibilidad de estos neurotransmisores bloqueando su recaptura desde el espacio sináptico
(Baldessarini, R., 2001, Sachar, E.J., 1991, Warsh, J., y cols., 1998) lo que sugiere la
participación de la 5-HT y la NA en los trastornos del ánimo. En apoyo a estas observaciones, la
administración de precursores de la síntesis de estos neurotransmisores, mejoran los efectos
terapéuticos de los inhibidores de la MAO. Además, existe evidencia basada en estudios sobre
los metabolitos de la 5-HT y la NA en el líquido encéfalo-raquideo, donde se han observado una
reducción importante de estos en pacientes depresivos (Sachar, E.J., 1991). Es así que se ha
sugerido que la depresión se debe a una reducción en el disponibilidad de 5-HT y NA
(Baldessarini, R., y cols., 2001, Warsh, J., y cols., 1998). Las neuronas serotoninérgicas tienen
sus cuerpos celulares en los núcleos del Rafe, ubicados en la línea media del tallo cerebral, y se
proyectan profusamente hacia el hipotálamo, corteza y sistema límibico, incluyendo al
hipocampo (Ganong, W., 1996a). Entre algunas de las acciones relacionadas a la 5-HT, se le
atribuyen la generación de algunas de las respuestas a estrés a través de sus proyecciones hacia
la amígdala, que le permite al individuo evaluar el entorno adverso al que se ve expuesto
(Graeff, F.G., y cols., 1996). Las proyecciones serotoninérgicas que llegan a la región
periventricular y materia gris periacueductal, están involucradas en la respuesta de flight or fight
(escape o pelea), que se refiere al tipo de respuesta frente una situación de estrés, es decir, huir
de la situación estrés (o estresor), o enfrentar directamente a esta situación (Graeff, F.G., y cols.,
1996). En cambio en el hipocampo, la liberación de 5-HT promueve la desconexión entre
eventos aversivos y procesos psicológicos, haciendo que el individuo pueda llevar una vida
normal a pesar de estar en un entorno adverso (Graeff, F.G., y cols., 1996), es decir, se ha
asociado a una resistencia al estrés. En este sentido, la depresión aparece cuando hay una
alteración en la neurotransmisión serotoninérgica, lo que disminuye la capacidad del individuo
para enfrentar un entorno desfavorable (Graeff, F.G., y cols., 1996). Por otro lado, las neuronas
noradrenérgicas tienen sus cuerpos celulares ubicados en el Locus Ceruleus, ubicados en la
protuberancia y el bulbo raquideo, desde donde proyectan sus axones (eferencias) hacia el
hipotálamo, el tálamo, el sistema límbico y la corteza (Kiernan, J., 2000). Las proyecciones
noradrenérgicas provenientes del Locus Ceruleus, se han relacionado con el estado de alerta del
animal, puesto que estas neurona solo están activas en el animal despierto y de hecho participan
en el despertar (arousal) del animal (Berridge, C.W., y cols., 2003, Kiernan, J., 2000). Además
es importante para el ingreso y el procesamiento de la información sensorial (Berridge, C.W., y
cols., 2003), lo que le permite evaluar su entorno o su situación para generar la respuesta
3
adecuada. Además, existe una interacción entre NA y 5-HT. Es así que la liberación de NA
afecta la de la 5-HT, debido a que las neuronas serotoninérgicas presentan receptores α2
presinápticos en sus terminales, cuya activación inhibe la liberación de 5-HT en los terminales
neuronales proyectados desde el Rafe (Graeff, F.G., y cols., 1996, Vizi, E.S., y cols., 1998). Esta
condición sugiere un nivel de regulación muy importante en lo que se refiere a conductas
relacionadas a aprendizaje, respuestas a estrés y la relación con el entorno. Es decir, conductas
que en el humano pueden entenderse como la interacción social del individuo y con su ambiente.
Estas conductas están alteradas en la DM, y por lo tanto las estrategias farmacológicas se han
enfocado a aumentar la disponibilidad de estos neurotransmisores.
1.2.1. Antidepresivos y sus probables mecanismos de acción:
Una de las estrategias para aumentar la disponibilidad de NA y/o 5-HT, se relaciona con la
inhibición de las enzimas que degradan a los neurotransmisores (inhibidores de la MAO), sin
embargo este tipo de fármacos son usados cada vez con menos frecuencia (Sachar, E.J., 1991),
principalmente por la amplia gama de efectos secundarios que producen este tipo de fármacos
(Baldessarini, R., 2001, Warsh, J., y cols., 1998). Otra estrategia implica la inhibición de los
transportadores de NA y 5-HT al terminal presináptico, lo que permite aumentar la
disponibilidad de neurotransmisores en el espacio sináptico (Baldessarini, R., y cols., 2001,
Sachar, E.J., 1991, Warsh, J., y cols., 1998). El bloqueo de los transportadores de NA (NET) y
de 5-HT (SERT) por antidepresivos, puede ser específica para cada neurotransmisor, o bien con
acción dual (actuando sobre NET y SERT en forma simultánea). Este efecto a nivel de los
transportadores ocurre rápidamente (Warsh, J., y cols., 1998), sin embargo el paciente observa
mejorías después de semanas o incluso meses con el tratamiento antidepresivo (Baldessarini, R.,
y cols., 2001, Warsh, J., y cols., 1998), lo que sugiere que estos fármacos en un inicio son
capaces de aumentar la disponibilidad de neurotransmisores, sin embargo este mecanismo no es
capaz por sí solo de revertir las características asociadas a la depresión. Es probable que estos
cambios en la disponibilidad de NA y/o 5-HT permitan iniciar una serie de eventos, que a largo
plazo son capaces de otorgar un efecto beneficioso al paciente con depresión (Baldessarini, R., y
cols., 2001, Warsh, J., y cols., 1998), y que no necesariamente impliquen cambios en los niveles
de NA y/o 5-HT en el SNC. Es así que se han planteado algunas nuevas hipótesis acerca del
mecanismo de acción de los antidepresivos, en las que se incluyen cambios en la sensibilidad o
4
cantidad de los autorreceptores relacionados a las vías específicas de NA y 5-HT (Warsh, J., y
cols., 1998). Por ejemplo, un aumento en la disponibilidad de 5-HT en el espacio sináptico, por
un bloqueo del SERT, puede actuar sobre los autoreceptores somato-dendríticos del tipo 5-HT1A,
capaces de disminuir la frecuencia de descarga, y lo por lo tanto disminuir la liberación de 5-HT
(Baldessarini, R., y cols., 2001). La activación persistente de la 5-HT sobre el receptor 5-HT1A,
debida al bloqueo del mecanismo de recaptura, puede desensibilizar al autoreceptor inhibitorio,
disminuyendo el efecto inhibitorio de este en la liberación de 5-HT, mejorando así la
neurotransmisión serotoninérgica (Baldessarini, R., y cols., 2001, Warsh, J., y cols., 1998). En el
caso de los inhibidores de la recaptación de NA, se ha sugerido un efecto similar a lo descrito
para la 5-HT. Un aumento en la disponibilidad de NA por efecto del bloqueo del NET, puede en
el tiempo desensibilizar al autoreceptor presinaptico α2, cuya activación inhibe la liberación de
NA desde el terminal presináptico, lo que favorece un aumento en la liberación de NA,
mejorando los efectos que promueven un aumento en la disponibilidad de NA (Baldessarini, R.,
y cols., 2001, Warsh, J., y cols., 1998). Además, y como ya se mencionó anteriormente, las
neuronas serotoninérgicas también presentan al receptor α2 inhibitorio en sus terminales, por lo
que el tratamiento crónico con un antidepresivo inhibidor de la recaptación de NA aumenta la
disponibilidad de NA, el cual promueve así una disminución del tono inhibitorio del receptor α2
en las mismas neuronas noradrenérgicas como también en las serotoninérgicas (Baldessarini, R.,
2001, Glavin, G.B., 1985, Graeff, F.G., y cols., 1996, Warsh, J., y cols., 1998). Sin embargo, esta
hipótesis implica que el tratamiento crónico con antidepresivos, que aumenta la disponibilidad
de NA y/o 5-HT en el espacio sináptico por bloqueo de sus transportadores presinápticos, y la
concomitante desensibilización de los mecanismos inhibitorios (receptores, 5-HT1A y/o α2)
(Warsh, J., y cols., 1998), también pueden desensibilizar o regular hacia abajo a los otros
receptores noradrenérgicos y/o serotoninérgicos, postsinápticos y presinápticos, por lo que a
través de esta hipótesis es difícil explicar cómo es que los antidepresivos ejercen su efecto
(Warsh, J., y cols., 1998). Es por esto que se han planteado otras hipótesis, en que los
antidepresivos, además de modular la disponibilidad de monoaminas, van a favorecer cambios
en cascadas de señalización intracelular (D'Sa, C., y cols., 2002, Duman, R.S., 2002, Duman,
R.S., y cols., 1989, Stone, E.A., y cols., 1986), principalmente para compensar la internalización
de receptores postsinapticos (D'Sa, C., y cols., 2002), y que en el largo plazo generarían cambios
en la expresión génica, lo que tendría efectos a nivel de la neuroplasticidad y/o neuroprotección
(factores asociados a la resiliencia celular), explicando en parte largo periodo de tiempo que
5
tardan estos agentes farmacológicos para ejercer efecto (Duman, R.S., 2002, Nestler, E.J., y
cols., 2002, Vaidya, V.A., y cols., 2001).
1.3. Otras perspectivas en el estudio de la depresión:
Recientemente se ha observado que en pacientes con DM hay una reducción en el volumen de
ciertas regiones discretas del cerebro como corteza y amígdala, debido a un menor número y/o
tamaño de glias y neuronas (Rajkowska, G., 2000a, b, Rajkowska, G., y cols., 1999). También se
ha planteado que estos déficit corresponden a alteraciones del desarrollo que puedan otorgar
vulnerabilidad a episodios anormales del estado de ánimo, o bien que corresponden a cambios
compensatorios a otros estados patológicos o quizas son producto episodios depresivos
recurrentes (Manji, H.K., y cols., 2001a). La reducción en el número de glias en estas áreas
llama la atención por el papel fundamental que ellas juegan en regular los niveles de otros
neurotransmisores en el espacio sináptico, como el glutamato, y en la liberación de factores
tróficos que participan en el desarrollo y mantención de redes formadas por neuronas y glias
(Coyle, J.T., y cols., 2000). Toda esta evidencia ha llevado a postular que la depresión esta
asociada a cambios en la viabilidad y mecanismos que permiten la citoprotección celular
(resiliencia celular) (Manji, H.K., y cols., 2001a).
1.3.1. Estrés y adaptabilidad del individuo:
En relación a los cambios de la resiliencia celular a nivel del SNC, el efecto que puede tener el
entorno del individuo sobre estos factores resulta de mucho interés. Las respuestas fisiológicas
generadas por situaciones externas, que el individuo no puede controlar o que resultan ser una
amenaza para la sobrevida (situaciones de estrés) (Tsigos, C., y cols., 2002), permiten la
adaptabilidad al medio, pudiendo incluso favorecer mecanismos de memoria y aprendizaje, por
lo que se puede afirmar que la exposición al estrés en cortos periodos puede ser incluso
beneficioso para el individuo (McEwen, B.S., y cols., 1995). Por el contrario, si estos
mecanismos fisiológicos son sostenidos en el tiempo, como resultado de una prolongada
exposición a la situación de estrés (estrés crónico), los efectos en el individuo dejan de ser
beneficiosos y se tornan patológicos (McEwen, B.S., y cols., 1995). Es así que dentro de los
efectores de la respuesta fisiológica al estrés, como los corticosteroides, hormonas producidas en
6
la corteza de las glándulas suprarrenales, juegan un papel muy importante en el desarrollo de los
efectos patológicos del estrés (McEwen, B.S., y cols., 1995). Uno de los factores de riesgo para
el desarrollo de la depresión es el estrés crónico, y éste, a su vez, puede causar cambios
importantes en la fisiología del individuo, alterando la resiliencia celular a nivel del SNC, es
decir la capacidad que tienen las células de adaptarse a condiciones adversas, y por lo tanto
explicar en parte una posible causa de la depresión.
1.3.2. Glucocorticoides y el eje Hipotalamo-Hipofisis-Suprarrenal (HHS):
Las respuestas de estrés de un individuo son moduladas por la actividad del eje HipotalamoHipofisis-Suprarrenal (HHS), que permite la regulación de la secreción de los glucocorticoides
(GCs). Los GCs son hormonas esteroidales que se secretan desde la corteza adrenal, proceso que
es regulado por una secuencia de eventos que se inician con la secreción de la hormona
liberadora de corticotrofina (CRH) a nivel hipotalámico. La secreción de CRH está regulada por
diversas vías neuronales que se originan en centros superiores del cerebro y que proyectan al
hipotálamo (Rhoades, R., y cols., 1996). La CRH llega a la hipófisis por vía portal induciendo la
liberación de la hormona adrenocorticotrófica (ACTH). A su vez la ACTH, liberada al torrente
sanguíneo, estimula la secreción de los GCs desde la corteza adrenal. La ACTH es el principal
regulador de la secreción de estos esteroides (Ganong, W., 1996b). A su vez, los GCs ejercen un
control inhibitorio del ACTH a nivel hipofisiario disminuyendo tanto la síntesis como la
liberación (Nestler, E.J., y cols., 2002), efecto que es proporcional a la concentración de GCs
(Ganong, W., 1996b). También, otra forma que tienen los GCs de inhibir la liberación de ACTH
hipofisiario es disminuyendo la síntesis y liberación de CRH a nivel hipotalámico (Ganong, W.,
1996b, Nestler, E.J., y cols., 2002, Rhoades, R., y cols., 1996). Los GCs realizan múltiples
funciones, como: mantener la glicemia, modular respuestas inmunes e inflamatorias y participar
en los mecanismos de adaptación a situaciones de emergencia o en estados de alerta, entre otras
(Scully, J.L., y cols., 1995). A su vez los corticoides que se liberan a la circulación pueden
atravesar la barrera hematoencefálica y actuar sobre el SNC, siendo un blanco importante el
hipocampo el cual se vincula a procesos de memoria espacial y aprendizaje (McEwen, B.S.,
1999).
7
La secreción de GCs por la glándula adrenal ocurre en forma circadiana o episódica. La primera
involucra cambios periódicos durante las 24 h; mientras que la segunda involucra un aumento de
la secreción en respuesta a estímulos específicos denominados estados de alerta. Lo anterior,
indica que la liberación de los corticoides durante el ciclo circadiano a su vez es afectada por
impulsos desde centros del SNC que regulan la liberación hipotalámica de CRH (McEwen, B.S.,
1987, 1994, 1999, McEwen, B.S., y cols., 1995, Nestler, E.J., y cols., 2002, Sapolsky, R.M.,
1996a).
Se ha observado que el 50% de los individuos con enfermedad de Cushing, y que por lo tanto
tienen niveles séricos muy elevados de GCs, sufren de depresión, sugiriendo un papel importante
de los GCs en etiología de la depresión (Sonino, N., y cols., 1998). Además, aproximadamente el
50% de los pacientes con DM presentan una secreción aumentada de cortisol (Parker, K.J., y
cols., 2003), lo que sugiere la participación del eje HHS en los trastornos depresivos mayores
(Gold, P.W., y cols., 2002, Holsboer, F., 2001, Manji, H.K., y cols., 2001a, McQuade, R., y cols.,
2000, Nestler, E.J., y cols., 2002). Esta falla en la regulación puede ocurrir por una regulación
hacia abajo de los receptores a glucocorticoides (GR), ya que se ha descrito que la función de
GR está disminuida en células periféricas de individuos depresivos mayores (Pariante, C.M.,
2004). Pero también esta alteración en la regulación del eje HHS puede ser una consecuencia de
una falla en los receptores a CRH (Budziszewska, B., y cols., 2002, Holsboer, F., 1999). Esta
última situación se podría deber a que ante niveles sostenidos de GCs, como los que se presentan
en respuesta a episodios de estrés crónico, se generaría esta regulación hacia abajo de los GR,
haciendo que se pierda la señalización inhibitoria de los GCs sobre la producción de CRH, por lo
tanto, habría un aumento en la producción de CRH que no es regulado por la retroalimentación
negativa que normalmente ejercen los GCs (Holsboer, F., 1999, 2000, 2001, Holsboer, F., y
cols., 1986). Este aumento en los niveles de CRH puede tener efecto en los receptores a este
neuropéptido. Se ha observado que el receptor a CRH tipo 1 (CRHR1) es susceptible a
desensibilización por una prolongada exposición a CRH en neuronas corticotrofas (Holsboer, F.,
1999), condición que también afecta el correcto funcionamiento del eje HHS. Estas fallas en la
actividad de este eje neuroendocrino han permitido plantear ciertas pruebas de funcionalidad,
que permiten determinar la actividad de este eje, pruebas que además han entregado más
evidencia sobre la participación del eje HHS en el desarrollo de la depresión. Esta prueba clínica
determina de qué manera cambian los niveles de ACTH y cortisol en presencia dexametasona
8
(DEX), un agonista para el receptor a GCs (GR) y también como cambian los mismos
parámetros por efecto de la CRH (Holsboer, F., y cols., 1986, Holsboer, F., y cols., 1984,
Holsboer, F., y cols., 1987, Ising, M., y cols., 2005, von Bardeleben, U., y cols., 1985). La
prueba combinada de supresión de la secreción de GCs con DEX y CRH (DEX/CRH), evalúa de
qué manera está afectada la secreción de ACTH a nivel hipofisiario, ya que la DEX no es capaz
de atravesar la barrera hemato-encefálica (Uhr, M., y cols., 2002). En segundo lugar evalúa la
secreción de ACTH por efecto del CRH, ya que hay pacientes depresivos con mayores niveles
de GCs plasmáticos que no son capaces de secretar ACTH en presencia de CRH, probablemente
debido a la desensibilización del receptor a CRH como causa de una exposición crónica al factor
liberador (Holsboer, F., y cols., 1984, Ising, M., y cols., 2005, Nestler, E.J., y cols., 2002, von
Bardeleben, U., y cols., 1985). En pacientes con DM, se observa una resistencia a la supresión de
la secreción de cortisol por DEX indicando una alteración del eje HHS a nivel hipofisiario
(Holsboer, F., 2001), y una disminuida secreción de ACTH en presencia de CRH (Holsboer, F.,
y cols., 1984, Ising, M., y cols., 2005, von Bardeleben, U., y cols., 1985). Más aún, este ensayo
ha demostrado ser de utilidad para el seguimiento del tratamiento antidepresivo, ya que después
de la terapia estos pacientes presentan una normalización de la actividad del eje HHS y además
logran mantener niveles de cortisol normales. Asimismo, pacientes que una vez terminado el
tratamiento no logran normalizar su secreción de cortisol, tendrían una mayor probabilidad de
recaer (Holsboer, F., 2001, Ising, M., y cols., 2005).
1.3.3. Efectos de los glucocorticoides en otras estructuras del sistema nervioso central:
Los GCs tienen una serie de blancos fisiológicos en el SNC, incluyendo las vías serotoninérgicas
y noradrenérgicas. Entre los efectos de los GCs sobre la neurotransmisión de 5-HT, destaca la
capacidad de modular la actividad inhibitoria del receptor somato-dendrítico 5-HT1A (Bellido, I.,
y cols., 2004, Czyrak, A., y cols., 2002, Laaris, N., y cols., 1995, Martire, M., y cols., 1989). Los
GCs aumentan la afinidad de receptor 5-HT1A por agonistas (Bellido, I., y cols., 2004). De esta
forma, aumenta la actividad inhibitoria de 5-HT1A sobre las neuronas del Rafe, disminuyendo la
liberación de 5-HT, alterando así la correcta neurotransmisión serotoninérgica, que en parte
explicarían los cambios conductuales observados en la DM (Bellido, I., y cols., 2004, Czyrak,
A., y cols., 2002, Laaris, N., y cols., 1995, Martire, M., y cols., 1989). También, los GCs son
capaces de afectar la neurotransmisión noradrenérgica (Duman, R.S., y cols., 1989, McEwen,
9
B.S., 1987, Stone, E.A., y cols., 1986), aumentando la actividad de este sistema de
neurotransmisión (McEwen, B.S., 1987), favoreciendo los estados de alerta del individuo, y
favoreciendo cambios en el establecimiento o consolidación de la memoria a largo plazo
(Roozendaal, B., y cols., 2004). El aumento en la actividad del sistema noradrenérgico, como
consecuencia de niveles elevados de GCs por estrés crónico, también tiene consecuencias a nivel
del autoreceptor inhibitorio presináptico α2 (Tjurmina, O.A., y cols., 1999), ya que a mayor
disponibilidad de NA, este autorreceptor se desensibiliza o regula hacia abajo, aumentando así la
liberación de NA (Corrodi, H., y cols., 1968, Tjurmina, O.A., y cols., 1999). Este aumento en la
liberación de NA, causado por aumento en los niveles de GCs y la consecuente desensibilización
del autorreceptor α2, sugiere que también se podrían desensibilizar los otros receptores a NA (α
y β), afectando así la funcionalidad de la neurotransmisión noradrenérgica (Meyer, H., y cols.,
2000). Este efecto, generaría una reducción en la capacidad de estar alerta en el individuo,
similar a una condición de desesperanza (incapacidad de responder a nuevos estímulos adversos
(Glavin, G.B., 1985)), y una disminución de consolidación de memoria que también se vería
afectada (Roozendaal, B., y cols., 2004). Estas condiciones ocurren en pacientes depresivos, y
están descritas como signos de depresión por los manuales diagnósticos (APA, 1999).
1.3.4. Acción de los glucocorticoides sobre el hipocampo:
El hipocampo está formado por un grupo de estructuras cerebrales localizadas en la parte más
profunda del cerebro. Esta comprende cuatro áreas (Fig. 1): i) el giro dentado (GD) formada
fundamentalmente por neuronas granulares que se disponen en forma de V, encerrando una zona
polimórfica denominada Hilus que se caracteriza por la presencia de interneuronas, glias y
células troncales indiferenciadas, ii) el hipocampo propiamente tal (Cuerno de Ammon) el cual
se divide en cuatro subáreas formadas por neuronas piramidales CA1, CA2, CA3 y una capa más
difusa CA4, iii) el complejo subicular y iv) la corteza entorrina la cual recibe información de un
gran espectro de modalidades sensoriales y de áreas de asociación multimodal. La información
fluye desde la corteza entorrina hacia el GD a través de la vía perforante (Amaral, D., y cols.,
1995). Las neuronas granulares del GD proyectan a través de sus fibras musgosas hacia las
dendritas del área CA3 del hipocampo. Las neuronas piramidales de CA3 envían colaterales
hacia el área CA1 generando la principal fuente de ingreso de información en esta región. El
subículo recibe información de CA1 y la proyecta nuevamente hacia la corteza entorrina antes de
10
regresar a las mismas áreas sensoriales que se activaron por el estimulo inicial. El circuito
establecido en el hipocampo es principalmente excitatorio asociado a neurotransmisión
glutamatérgica (Kandel, E.R., y cols., 1991). El hipocampo al formar parte del sistema límbico,
controla las respuestas emocionales frente a perturbaciones del medio ambiente, es también una
estructura involucrada en procesos de memoria y aprendizaje, que se ve afectada por variaciones
en los niveles de GCs (Kandel, E.R., y cols., 1991). Además, el hipocampo se caracteriza por su
plasticidad sináptica asociada tanto a cambios bioquímicos como morfológicos que le permiten
un remodelamiento de la función sináptica, permitiendo los procesos de memoria espacial y
aprendizaje. Aunque en esta estructura el principal sistema de neurotransmisión es
glutamatérgico, también hay participación de sistemas colinérgicos, serotoninérgicos y
noradrenérgicos que permiten regular la funcionalidad de esta estructura (Vizi, E.S., y cols.,
1998).
Los esteroides adrenales, actúan modulando la fisiología del hipocampo y provee además de un
modelo para estudiar las consecuencias neurobiológicas de estas hormonas. Los corticoides
normalmente controlan la neurogénesis, arborización dendrítica y la expresión de diferentes
receptores a neurotransmisores (McEwen, B.S., 1994, 1996, 1999). Es así que en la depresión
mayor asociada a hipercortisolemia, probablemente se verán afectadas tanto la resiliencia celular
del hipocampo, y algunas de las funciones reguladas por esta estructura (Holsboer, F., 2001,
Manji, H.K., y cols., 2001a, McQuade, R., y cols., 2000, Nestler, E.J., y cols., 2002, Sapolsky,
R.M., 2001).
11
A
B
Figura 1. El hipocampo de rata. Anatomía del hipocampo. A) Corte coronal de hipocampo de rata.
Destacan las áreas como el GD, giro dentado con sus porciones, suprapiramidal (SupGD) e infrapiramidal
(InfGD) y la región del, Cuerno de Ammon (CA1-4) formada por el stratum piramidalis (sp). Sobre la
capa piramidal del CA se encuentra el stratum oriens (so) y bajo el sp se encuentra el stratum radiatum
(sr). El stratum lucidum (sl)se encuentra próxima a CA3 y el stratum lacunosum moleculare (sml) esta
dispuesto sobre SupGD (Amaral, D., y cols., 1995). B) Esquema de vías aferentes del hipocampo. (Las
flechas indican la dirección de los potenciales de acción. La vía perforante proviene de la corteza
entorrinal y establece conexiones excitadoras con las células granulares del GD. Las células granulares
envían axones denominados fibras musgosas que conectan con las células piramidales del área CA3 del
hipocampo. Las células piramidales de CA3 se proyectan a las células piramidales de CA1 por medio de la
vía colateral de Schaffer (Kandel, E.R., y cols., 1991)
Diversos estudios en humanos y animales han demostrado que el alza sostenida de corticoides
logradas por estrés, induce una pérdida de las habilidades cognitivas, atrofia de las neuronas
piramidales del hipocampo (McEwen, B.S., 1999, Sapolsky, R.M., 1996b, Yehuda, R., 1997) y
una reducción en el número de neuronas y glias en regiones discretas del cerebro (Sapolsky,
R.M., 2000). Más aún, el estrés recurrente y presumiblemente episodios repetidos de depresión
asociados a niveles más elevados de cortisol, podrían disminuir el umbral para producir muerte o
atrofia celular en respuesta a una variedad de eventos fisiológicos (envejecimiento) o patológicos
(Sapolsky, R.M., 2000). Toda esta evidencia sugiere que en la depresión mayor hay un deterioro
en la plasticidad neuronal y resiliencia celular que estaría asociada al aumento en los niveles
circulantes de GCs.
12
1.4. Mecanismos que mantienen la resiliencia celular en el hipocampo:
De las hipótesis propuestas para el mecanismo de acción de los antidepresivos, se puede inferir
que durante el tratamiento, estos fármacos inducirían modificaciones en algunas proteínas
encargadas de la señalización intracelular, lo que a largo plazo conduciría a cambios en la
expresión génica, y de esta forma se explicaría el período de tiempo que debe transcurrir antes
de observar los efectos de los fármacos en pacientes con depresión (Fig. 2). Con esta propuesta,
se ha sugerido que la depresión es una condición patológica en la que hay una reducción en la
resiliencia celular (Castren, E., 2005), y que los antidepresivos son capaces de prevenir y/o
revertir esta última, favoreciendo procesos de neuroprotección y/o neuroplasticidad a nivel del
SNC, y en particular dentro del hipocampo (Fig. 2).
13
Figura 2. Esquema de mecanismos relacionados con la resiliencia celular. En este esquema se muestra
que el estrés es capaz de promover cambios que reducen la resiliencia celular (aumentar los GCs, aumento
en los niveles de Glutamato y disminución en BDNF). Los antidepresivos pueden prevenir los efectos del
estrés, ya sea disminuyendo los niveles de GCs y promoviendo un aumento en la expresión de BDNF.
Esta figura está adaptada de Castren y cols 2005 (Castren, E., 2005).
1.4.1. Participación de la proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc (CREB):
Se ha demostrado que el tratamiento crónico con antidepresivos aumenta la proliferación celular
en el hipocampo de animales de experimentación (Malberg, J.E., y cols., 2003, Santarelli, L., y
cols., 2003). Otros estudios han señalado que el tratamiento crónico con antidepresivos también
causa un aumento en la actividad de ciertos factores de transcripción (Nibuya, M., y cols., 1996),
lo que sugiere que dentro de los mecanismos de acción de estos fármacos se pueden incluir
cambios en la expresión de genes relacionados con la plasticidad sináptica (Duman, R.S., 2002).
14
De hecho, los antidepresivos tales como Sertralina y Fluoxetina (inhibidores específicos de la
recaptación de 5-HT), y Desipramina y Mianserina (inhibidores de la recaptación de NA)
aumentan la expresión y la actividad de la proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc
(CREB) (Czeh, B., y cols., 2001, Nakagawa, S., y cols., 2002, Nibuya, M., y cols., 1996, Tardito,
D., y cols., 2006, Thome, J., y cols., 2000, Vaidya, V.A., y cols., 2001). Este factor de
transcripción, presente principalmente en el núcleo, se activa luego de ser fosforilado en el
residuo de Ser133 de su estructura primaria (Tardito, D., y cols., 2006). Consistente con esta
idea, la sobre-expresión de CREB en el hipocampo de rata ejerce acciones antidepresivas desde
el punto de vista conductual (Chen, A.C., y cols., 2001). Hay que destacar que la actividad de
CREB es regulada fundamentalmente por tres vías de señalización intracelular, que incluyen la
vía dependiente de proteína quinasa A (PKA) activada por aumentos en el AMPc, la vía
dependiente de Ca+2 y la vía dependiente de la proteína Ras (Curtis, J., y cols., 1999), las cuales
están presentes en la neuronas. Además, se ha demostrado en linfocitos una relación directa entre
individuos que responden a la terapia con antidepresivos con un aumento en los niveles de
CREB-activo (fosforilado) (Koch, J.M., y cols., 2002).
1.4.2. Participación de factores neurotróficos en la acción de antidepresivos:
Es posible entonces que el aumento en la actividad de CREB contribuya a la acción de los
antidepresivos al actuar sobre diversos genes blanco. Uno de estos genes controlados por CREB
en las neuronas corresponde a la neurotrofina derivada de cerebro (BDNF) (Finkbeiner, S., y
cols., 1997, Nibuya, M., y cols., 1995, Russo-Neustadt, A., y cols., 1999). Este factor trófico
pertenece a la familia de las neurotrofinas, y participa en el desarrollo del SNC, sobrevida
neuronal y plasticidad sináptica en el sistema nervioso adulto (Bayas, A., y cols., 2002, Vaidya,
V.A., y cols., 2001, Xu, H., y cols., 2003). Además se ha demostrado que el BDNF participa en
la inducción de la potenciación a largo plazo y además facilita la liberación de varios
neurotransmisores (Ying, S.W., y cols., 2002).
El BDNF es un gen complejo que presenta cinco exones, donde el exón V codifica para la
proteína y posee dos sitios de poliadenilación alternativos. Cada uno de los primeros cuatro
exones tiene una región promotora hacia el extremo 5’, y una región dadora de splicing hacia el
extremo 3’, que permiten unirse al exon V contiene la región aceptora de splicing en su extremo
15
5’. Así, a través de estas características se pueden generar diferentes transcritos mediante
splicings alternativos, siendo el transcrito que contiene al exon III el de mayor expresión en el
hipocampo (Shieh, P.B., y cols., 1998). Esto último es importante, considerando que es en este
exon donde se encuentra el elemento de respuesta a AMPc (CRE), el cual es regulado por el
factor transcripcional CREB (Aliaga, E., y cols., 1999). El BDNF promueve la activación de la
vía ERK1/2-MAPK a través de su receptor TrkB. Esta activación tiene por consecuencia la
activación de la quinasa Rsk, que puede fosforilar y activar a CREB. Esto último permite que el
BDNF a través de ERK1/2-MAPK promueva su propia activación.
En animales de experimentación, el estrés por inmovilización induce una reducción en el BDNF
hippocampal (Smith, M.A., y cols., 1995, Tapia-Arancibia, L., y cols., 2004), efecto que es
remedado por los GCs (Schaaf, M.J., y cols., 1998). Esta disminución afectaría de manera
importante la plasticidad estructural del hipocampo. Por el contrario, los antidepresivos son
capaces de aumentar la expresión de BDNF a nivel hipocampal, (Nibuya, M., y cols., 1995,
Nibuya, M., y cols., 1996), sugiriendo la participación de este factor trófico en el mecanismo de
acción de los antidepresivos. Además, la inyección aguda e intrahipocampal de BDNF tiene
efectos antidepresivos a nivel conductual (Shirayama, Y., y cols., 2002), posiblemente activando
a CREB a través de la vía ERK1/2-MAPK asociada al receptor TrkB, y de esta forma
reduciendo la atrofia o daño neuronal causada por estrés.
1.4.3: Participación de proteínas asociadas a neuroprotección en la acción de antidepresivos:
La inducción de BDNF por antidepresivos puede tener consecuencias en la expresión de otros
factores de crecimiento o proteínas involucradas con la resiliencia celular a nivel del hipocampo.
Una de estas proteínas es BCL-2, una proteína antiapoptótica cuya expresión también puede ser
modulada por CREB fosforilado (P-CREB) (Finkbeiner, S., 2000). Además la expresión de
BCL-2 puede ser modulada por Amitriptilina y Venlafaxina (Xu, H., y cols., 2003), como
también por cambios en los niveles de GCs. En relación a esto último, la remoción quirurgica de
las glándulas suprarrenales (adrenalectomía) causa un aumento en la expresión de BCL-2, lo que
sugiere que los GCs ejercen un tono represor en la expresión hipocampal de esta proteína
(Andres, S., y cols., 2006, Cardenas, S.P., y cols., 2002, Greiner, M., y cols., 2001)
16
De esta manera, un aumento en los niveles de GCs por efecto de una exposición prolongada a un
evento causante de estrés, sería de capaz de generar cambios a nivel de la resiliencia celular en el
hipocampo, disminuyendo los niveles de BDNF y BCL-2, reduciendo la capacidad de
adaptabilidad a condiciones adversas, y finalmente generando los cambios conductuales
observados en pacientes con depresión. En resumen los antidepresivos inducen la activación de
vías transduccionales, que activan a factores transcripcionales asociados con la resiliencia celular
en el hipocampo.
1.4.4. Participación de otros factores de crecimiento asociados a la neuroprotección:
Los efectos de los antidepresivos sobre los niveles de CREB, BDNF y BCL-2 sugieren que estos
fármacos modulan la expresión de genes en el SNC para ejercer su efecto y así mejorar la
condición del paciente. Considerando esto, no se puede descartar la posibilidad de que otros
factores de crecimiento puedan estar involucrados en la acción de los antidepresivos.
Se ha demostrado que el estrés agudo por restricción de movimiento o la administración aguda
de GCs, reducen la expresión del ARNm de factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF)
en el hipocampo de rata (Molteni, R., y cols., 2001), y también la expresión de bFGF se puede
inducir por la acción de los antidepresivos Desipramina y Fluoxetina, tanto en corteza como en
el hipocampo (Mallei, A., y cols., 2002). El bFGF está involucrado en procesos de plasticidad
neuronal en el hippocampo (Mallei, A., y cols., 2002, Molteni, R., y cols., 2001), como por
ejemplo entregando soporte trófico a neuronas maduras y estimular la neurogénesis (Molteni, R.,
y cols., 2001). Otro tipo de factores que también se pueden relacionar a cambios en la resiliencia
celular son la citoquinas inmunomoduladoras (Rothwell, N.J., 1999). Estos péptidos han sido
implicados en la depresión (Dantzer, R., y cols., 2002, Myint, A.M., y cols., 2005, O'Brien, S.M.,
y cols., 2004), principalmente porque su expresión puede ser regulada por variaciones en los
niveles de GCs; también algunas de las citoquinas proinflamatorias, como TNF-α, IL-1 y IL-6,
modulan la actividad del eje HHS, aumentado los niveles de CRH; y los antidepresivos son
capaces de inducir la expresión de citoquinas antinflamatorias tales como IL-10 (Myint, A.M., y
cols., 2005, O'Brien, S.M., y cols., 2004).
17
Además el tratamiento crónico con el antidepresivo Desipramina disminuye la expresión de
TNF-α en el Locus Ceruleus, cambio que afecta la actividad del receptor α2 noradrenérgico
(Ignatowski, T.A., y cols., 1997, Reynolds, J.L., y cols., 2004b, 2005b). Se ha observado que el
TNF-α actúa como un inhibidor de la liberación de NA en el hipocampo de animales control,
mientras que el tratamiento crónico con Desipramina cambia el efecto del TNF-α de inhibidor a
potenciador de la liberación de NA (Ignatowski, T.A., y cols., 1997, Nickola, T.J., y cols., 2001,
Reynolds, J.L., y cols., 2004a, Reynolds, J.L., y cols., 2005a, Reynolds, J.L., y cols., 2004b,
2005b, Schmidt, P., y cols., 2001). Este fenómeno permitiría a un antidepresivo inhibidor de la
recaptura de NA, como la Desipramina, promover una desensibilización del receptor α2 o bien
cambiar su capacidad inhibitoria a potenciadota (Reynolds, J.L., y cols., 2005a), aumentando la
liberación de NA y ejerciendo así su efecto antidepresivo. Además, dado que el tratamiento
crónico con Desipramina disminuye los niveles de TNF-α, y la presencia de esta citoquina
potencia la liberación de NA desde el hipocampo, sugiere que la Desipramina promueve
cambios en la liberación de NA no sólo a nivel de aumentar la disponibilidad de NA, si no que
también a través de cambios en la expresión de factores que puedan afectar al correcto
funcionamiento del sistema de neurotransmisión noradrenérgcio (Reynolds, J.L., y cols., 2005a,
Reynolds, J.L., y cols., 2005b).
Las citoquinas son expresadas en el SNC (Myint, A.M., y cols., 2005) y dentro de estos factores
expresados aquí encontramos al Factor de Crecimiento Transformante β1 (TGF-β1), que además
de tener propiedades antiinflamatorias al antagonizatr los efectos de TNF-α, también se le
atribuyen una serie de propiedades neuroprotectoras en el hipocampo (Bezchlibnyk, Y.B., y
cols., 2001, Bottner, M., y cols., 2000, Bravo, J.A., y cols., 2006, Henrich-Noack, P., y cols.,
1996, Kim, E.S., y cols., 1998, Lehrmann, E., y cols., 1995, Myint, A.M., y cols., 2005, Nichols,
N.R., y cols., 2005, Nichols, N.R., y cols., 1991, Prehn, J.H., y cols., 1994, Ren, R.F., y cols.,
1997, Unsicker, K., y cols., 1991, Zhu, Y., y cols., 2001b, Zhu, Y., y cols., 2002). Los TGF-βs
son factores de crecimiento multifuncionales, que permiten la migración de algunos tipos
celulares durante el desarrollo temprano del SNC y periférico, regulan la respuesta mediada por
células gliales, y dan cuenta de la diferenciación neuronal, entre otras funciones (Bottner, M., y
cols., 2000)
18
En modelos animales donde se observan situaciones de muerte neuronal inducida por
deaferentación, hipoxia, isquemia y adrenalectomia, existe un aumento en la expresión del
TGF-β1 (Bravo, J.A., y cols., 2006, Bye, N., y cols., 1998, Lehrmann, E., y cols., 1995, Nichols,
N.R., y cols., 2005, Nichols, N.R., y cols., 1991, Prehn, J.H., y cols., 1994). Incluso, animales
knock out para TGF-β1, aunque resulta ser un genotipo letal, presentan un mayor número de
células con morfología apoptótica en la corteza, caudado putamen y cerebelo (Brionne, T.C., y
cols., 2003), lo que sugiere que esta citoquina además de ser importante para el desarrollo del
animal, tiene efectos neuroprotectores importantes en el SNC. En particular en el hipocampo,
esta citoquina ejerce neuroprotección en respuesta a una amplia variedad de estímulos nocivos
como por ejemplo en respuesta a lesiones, como trauma, infecciones y presencia del péptido βamielioide (Hopkins, S.J., y cols., 1995, Zhao, B., y cols., 1998). Se ha descrito que TGF-β1
puede activar la cascada de transducción mediada por ERK1/2-MAPK y Rsk1 (proteína quinasa
activada por MAPK) en el SNC (Zhu, Y., y cols., 2002), lo que corresponde a una ruta
alternativa a la clásica vía de transducción mediada por las proteínas SMADS (Visser, J.A., y
cols., 1998). Además, TGF-β1 es capaz de inducir BCL-2 en cultivo primario de neuronas
hipocampales (Prehn, J.H., y cols., 1994), efecto que quizás también es mediado por la
activación de CREB. Además, la sobre-expresión de TGF-β1 se relaciona con la fosforilación de
la proteína pro-apoptotica Bad en SNC (Zhu, Y., y cols., 2002). Esta proteína al fosforilarse es
secuestrada en el citosol por la chaperona 14-3-3 impidiendo su acción apoptótica (Tzivion, G., y
cols., 2002). Más aún, TGF-β1 inhibe la apoptosis en cultivo de neuronas hipocampales quizás
impidiendo la activación de la caspasa-3 (Zhu, Y., y cols., 2001a).
Estos antecedentes indican que el TGF-β1 tiene un papel importante en la protección neuronal, y
por lo tanto en la resiliencia celular en el hipocampo, condición que aparece afectada en la
depresión. Sin embargo, existe muy poca evidencia que indique la participación de TGF-β1 en la
depresión. Un estudio reciente ha encontrado que en pacientes depresivos los niveles séricos de
TGF-β1 son menores a los observados en individuos sanos (Myint, A.M., y cols., 2005). Además
encontraron que después de 8 semanas de tratamiento con distintos tipos de antidepresivos, los
niveles de séricos de TGF-β1 aumentaron en estos pacientes depresivos (Myint, A.M., y cols.,
2005). Por otro lado, y en otra psicopatología que también está clasificada dentro de los
trastornos del ánimo, como la depresión bipolar, se ha encontrado evidencia que sugiere la
19
participación de este factor de crecimiento. En un estudio postmortem de pacientes con
depresión bipolar, se encontró una reducción del ARNm de TGF-β1 en muestras de la corteza
prefrontal (Bezchlibnyk, Y.B., y cols., 2001), estructura cuyo volumen además está reducido en
pacientes con esta psicopatología (Rajkowska, G., 2002). Este antecedente nuevamente sugiere
la relación entre nivel de TGF-β1 y daño celular. Además, y en apoyo a la posible función de
esta citoquina en la resiliencia celular a nivel hipocampal se ha demostrado que la aplicación
intracerebroventricular de un oligonucleótido de antisentido para el ARNm de TGF-β1 causa un
aumento en la morfología nuclear asociada a apoptosis en la región CA3 de neuronas
piramidales (Bravo, J.A., y cols., 2006). Curiosamente esta región presenta atrofia neuronal
inducido por estrés y en donde se observa además una reducción en los niveles de BDNF
(Schaaf, M.J., y cols., 1998, Smith, M.A., y cols., 1995).
20
En resumen:
i)
En la depresión mayor existe una reducción en la resiliencia celular (Manji, H.K., y
cols., 2001b, Nestler, E.J., y cols., 2002, Sapolsky, R.M., 2001)
ii)
Esta disminución en la resiliencia celular puede ocurrir por una exposición sostenida a
altos niveles de GCs, como por efecto del estrés crónico (McEwen, B.S., 2005, McEwen, B.S., y
cols., 1995, Nestler, E.J., y cols., 2002, Sapolsky, R.M., 1996a, b, 2000, Yehuda, R., 1997)
iii)
Niveles elevados de GCs pueden afectar los sistemas de neurotransmisión
serotoninérgicos y noradrenérgicos (Glavin, G.B., 1985, Graeff, F.G., y cols., 1996), dando
cuenta de los cambios conductuales observados en la depresión
iv)
El estrés crónico, a través de los GCs, y los antidepresivos afectan la neurotransmisión
de NA y 5-HT (Reynolds, J.L., y cols., 2005a, Reynolds, J.L., y cols., 2005b)
v)
Las alteraciones en la neurotransmisión de NA y 5-HT causadas por el estrés crónico,
inducen cambios en la sensibilidad de autoreceptores inhibitorios, como ocurre con el
autorreceptor α2 presináptico (Reynolds, J.L., y cols., 2005a, Reynolds, J.L., y cols., 2005b)
vi)
Los antidepresivos pueden normalizar la actividad del eje HHS (Ising, M., y cols., 2005,
von Bardeleben, U., y cols., 1985), lo que favorecería una mejor funcionalidad de los sistemas
noradrenérgicos y serotoninérgicos
vii)
Los antidepresivos, permiten aumentar la resiliencia celular en estructuras como el
hipocampo (D'Sa, C., y cols., 2002, Nestler, E.J., y cols., 2002), lo que se asocia con una mejora
de la funcionalidad de esta estructura y la conducta del individuo.
21
Estos antecedentes permiten proponer las siguientes hipótesis:
II. Hipótesis:
1. En animales de experimentación, el estrés crónico por restricción de movimiento
induce conductas similares a la depresión, efecto que se previene por la acción del
antidepresivo Desipramina.
2. La Desipramina, promueve cambios en marcadores asociados a la resiliencia celular y
plasticidad neuronal en el hipocampo como ERK1/2, CREB, y BCL-2, y también de
factores tróficos como BDNF y TGF-β1.
22
III. Objetivo general:
Evaluar si el estrés crónico por restricción de movimiento genera conductas similares a la
depresión en animales de experimentación, y si estas conductas pueden ser prevenidas por
acción del tratamiento crónico con el antidepresivo Desipramina.
Determinar si la administración crónica de Desipramina en animales sometidos a estrés crónico
media cambios en la expresión a nivel hipocampal de ERK1/2, CREB, BCL-2, BDNF y
TGF-β1.
Objetivos específicos:
1. Establecer un modelo animal con características similares a la depresión, y evaluar el efecto
del antidepresivo Desipramina en este modelo
1.1. Establecer los efectos del estrés crónico por restricción de movimiento sobre
parámetros fisiológicos asociados a la respuesta a estrés
1.2. Estudiar los efectos del estrés crónico por restricción de movimiento en conductas
similares a la depresión y comparar los efectos de la administración crónica de
Desipramina en animales estresados y sin estresar afecta las respuestas fisiológicas y
la conducta
2. Analizar en un modelo animal de depresión, el grado de expresión de marcadores asociados
a la resiliencia celular en hipocampo de rata
2.1. Determinar los efectos del estrés crónico sobre ERK1/2, CREB, BCL-2, BDNF y
TGF-β1, como marcadores asociados a la resiliencia celular y determinar los efectos
de la Desipramina sobre los niveles de estos
23
3. Determinar si el estrés crónico y el tratamiento crónico con Desipramina modifican la
liberación de noradrenalina en el hipocampo
3.1. Evaluar los efectos de Yohimbina y Clonidina en la liberación de noradrenalina en el
hipocampo de animales estresados y tratados con Desipramina
3.2. Evaluar los efectos de TGF-β1 en la liberación de noradrenalina en el hipocampo de
animales estresados y tratados con Desipramina
24
IV. Materiales y métodos:
1. Animales y Tratamientos:
En todos los experimentos se emplearon ratas macho de la cepa Sprague-Dawley (200 –240 g),
criadas en el bioterio de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de
Chile, en condiciones estandarizadas de ciclo luz–oscuridad de 12 horas, a una temperatura de
22° C y con una humedad de 45 %. Los animales tuvieron alimento estéril y agua filtrada ad
libitum. En este estudio no se consideró la utilización de ratas hembras puesto que éstas
presentan ciclo estral (4 días) donde varían hormonas como el estradiol y la progesterona; las
cuales pueden influir sobre los parámetros que se evaluaron.
Se usó el número mínimo de animales, y todos los procedimientos fueron aprobados por el
Comité de Ética de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de
Chile.
1.1. Estrés crónico por restricción de movimiento:
Para este modelo de estrés, los animales fueron colocados en cilindros de acrílico transparente
(de 80mm de diámetro) durante 2,5h diarias por 14 días continuados. Este aparato limita la
movilidad del animal, pero no lo inmoviliza completamente. Durante este periodo los animales
no tenían acceso a alimento o agua (Magarinos, A.M., y cols., 1995). Cada sesión de estrés se
realizó entre las 9:00am y 12:00pm con el fin de evitar efectos no específicos debido a cambios
circadianos.
1.2. Tratamientos farmacológicos:
Se utilizó el antidepresivo inhibidor de la recaptación de NA Desipramina (DMI) (Sigma, St.
Louis, MO, EE UU) (Fig. 3) a una dosis de 10mg/kg de peso corporal del animal (Frechilla, D.,
y cols., 1998), el cual se inyectó intraperitonealmente (ip). Este fármaco fue disuelto en una
solución de NaCl 0,9%.
25
Figura 3. Estructura de la Desipramina. Este compuesto tricíclico es el metabolito activo de la
imipramina. Este fármaco antidepresivo inhíbe la recaptura de NA, siendo este el mecanismo de acción
propuesto para este antidepresivo (Baldessarini, R., 2001, Sachar, E.J., 1991, Warsh, J., y cols., 1998).
Los animales se clasificaron en los siguientes grupos: (i) animales control sin estresar que fueron
inyectados diariamente con una solución vehículo de NaCl 0,9% (Control+SAL); (ii) animales
estresados crónicamente por 14 días a los que también se inyectó la misma solución salina antes
de cada sesión de restricción de movimiento (Restricción+SAL); (iii) animales no estresados a
los que se les inyectó la DMI 10mg/kg por los 14 días de tratamientos (Control+DMI) y (iv)
animales estresados por restricción de movimiento a los que se les administró el antidepresivo
durante los 14 días (Restricción+DMI).
Además se incluyeron otros dos grupos de animales a los que se les administró el fármaco
antipsicótico Haloperidol (HAL) (Laboratorio Sorenson, Santiago, Chile) en una dosis de
50µg/kg de peso por vía subcutánea (sc) (Díaz-Véliz, G., 1988). Este fármaco actúa a nivel del
SNC como antagonista de los receptores D2 de dopamina (Baldessarini, R., y cols., 2001) y no
tiene efectos antidepresivos descritos. El uso de HAL permite determinar si los efectos del estrés
por restricción de movimiento sólo se previenen por un antidepresivo como la DMI y no por otro
fármaco no relacionado, que en este caso es un antipsicótico. Esta aproximación entrega mayor
validez predictiva al modelo. Los grupos que se incluyeron corresponden a: (i) animales no
estresados inyectados diariamente con HAL 50µg/kg por 14 días (Control+HAL) y (ii) animales
sometidos a restricción de movimiento por 14 días a los que se les inyectó HAL todos los días
(Restricción+HAL).
26
Además de todos los tratamientos y aplicaciones de estrés, los animales fueron manipulados
diariamente para ser pesados. Terminado los tratamientos, los animales fueron evaluados
conductualmente y posteriormente eutanasiados por decapitación.
2. Pruebas conductuales:
Para evaluar si el estrés crónico por restricción de movimiento generó características similares a
la depresión, fue necesario evaluar la conducta de los animales finalizado los 14 días de
tratamientos y/o estrés crónico. Estas conductas incluyen anhedonia, alteraciones en la
adquisición de respuestas condicionadas, que se relaciona con fallas en la capacidad cognitiva, y
desesperanza aprendida.
2.1. Prueba de preferencia a una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida:
Esta prueba permite evaluar el grado de preferencia por una situación placentera para el animal,
como lo es el agua de bebida endulzada con sacarosa al 1%.
Para esta prueba, todos los animales fueron entrenados en un paradigma donde cada individuo
podía elegir una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida. Esto se realizó durante la
semana anterior a los diferentes procedimientos de estrés y tratamientos farmacológicos. En este
período todos los animales se manipularon de la misma forma. El entrenamiento consistió en
colocar diariamente y por 3h a cada animal en una jaula individual, donde se colocaron 2 tubos
con agua de bebida: uno con agua sola y el otro con la solución de sacarosa. Los tubos eran
alternados diariamente y en forma aleatoria, con la finalidad de evitar efectos de habituación por
posición de los tubos (Zurita, A., y cols., 2000). Finalizada la semana de entrenamiento, se
evaluó el porcentaje de preferencia por el agua endulzada en función del volumen total de
líquido consumido.
Una vez iniciado el protocolo de restricción de movimiento y los tratamientos, se evaluó la
preferencia por la bebida endulzada a los 7 y 14 días. Esto se realizó colocando a los animales en
las jaulas individuales y enfrentándolos al mismo paradigma de los tubos de agua de bebida
descrita para la semana de entrenamiento, pero por sólo durante 1h. Terminada la prueba, se
27
evaluó el porcentaje de preferencia por el agua endulzada en función del volumen total de
líquido consumido.
Los cambios en la preferencia por la solución de sacarosa al 1% permitieron evaluar la
predilección de los animales por una actividad placentera, o conducta hedónica. La falta de
preferencia por el agua endulzada refleja una condición de anhedonia, condición que también se
observa en pacientes con depresión mayor (APA, 1999).
2.2. Adquisición de respuestas condicionadas y fallas en la respuesta a nuevos paradigmas de
estrés:
En esta prueba, cada animal fue colocado individualmente en una caja compuesta por dos
unidades modulares de acero inoxidable, entre las cuales hay una compuerta abierta para que el
animal pase de un lado al otro (Two-way shuttle box [Lafayette Instrument Co., Lafayette, IN,
EE UU]). Cada unidad esté equipada con una rejilla de 18 barras en el piso, a través de la cual se
puede aplicar un shock eléctrico de intensidad variable; dos ampolletas de 28V DC y un
generador de tonos audibles (Mallory Sonalert 2.800 Hz, Lafayette Instrument Co., Lafayette,
IN, EE UU). Los shocks eléctricos se administraron con una fuente de poder (Lafayette
Instrument Co., Lafayette, IN, EE UU).
Cada ensayo se inició aplicando un estimulo condicionante (tono) durante 5s seguido de un
descarga eléctrica de 0,2-0,5mA en el piso como estímulo aversivo. La descarga eléctrica se
mantuvo hasta que el animal escapó hacia la otra caja que no está electrificada. Cada animal se
puso a prueba durante 10min, aplicando el sonido seguido del shock cada 30seg, con una
duración máxima del shock de 10s. Luego, el ensayo se realizó durante 30min. Una respuesta de
condicionamiento se define cuando el animal escapó de la caja electrificada a la otra dentro de
los primeros 5seg del sonido (adquisición de respuesta condicionada, ARC). En cambio, si la
rata no escapa a la otra caja durante la aplicación del shock eléctrico, se considera como falla en
el escape (FE) (Mora, S., y cols., 1993).
Esta prueba permitió evaluar de qué manera el estrés por restricción de movimiento es capaz de
modificar la capacidad del animal por adquirir una respuesta condicionada, y en cierta medida
28
evaluar algo de la capacidad de aprendizaje de éste, ya que en pacientes con depresión mayor
hay una disminución en las capacidades cognitivas y de memoria del individuo (APA, 1999)
2.3. Prueba de natación forzada:
Esta prueba se realizó en 2 días: en el primer día (día 13 de cada tratamiento) los animales
fueron colocados durante 15min en un cilindro de acrílico de 20cm de diámetro por 50cm de
alto, que se llena con agua (24ºC-25ºC) hasta 30cm de altura. En el segundo día (día 14 de cada
tratamiento), se evaluaron las conductas de escape que el animal intenta realizar. En esta
determinación, y durante 5min se evaluó la conducta de escape en tres parámetros:
i) escalamiento: el animal trata de subir por las paredes del tubo, ii) natación: el animal nada en
busca de la salida, y por último, la diferencia del tiempo en que el animal no realiza ninguna de
las conductas anteriores se considera como: iii) inmovilidad, donde la rata no hace ningún
esfuerzo por buscar una salida, sólo intenta mantenerse a flote. Para la determinación de la
conducta de inmovilidad, se resta el tiempo en que el animal realizó las otras dos conductas de
escape. Un animal con desesperanza, es decir con incapacidad de responder adecuadamente a
una nueva condición adversa, va a tener menos conductas de escape y va a permanecer más
tiempo inmóvil durante la prueba (Cryan, J.F., y cols., 2002, Cryan, J.F., y cols., 2005). Esta
condición de desesperanza aprendida también puede ser observada en pacientes con depresión
mayor (APA, 1999).
3. Preparación de tejidos:
Luego de 14 días de estrés y tratamientos farmacológicos, y luego de pruebas conductuales, los
animales fueron eutanasiados mediante decapitación. Se disecó el cerebro y fue congelado
rápidamente en isopentano (Riedel-de Haën, Hanover, Alemania) enfriado en nitrógeno líquido
y posteriormente los tejidos fueron almacenados a -80°C (Greiner, M., y cols., 2001). Se
realizaron cortes coronales en crióstato (Microm HM5000, Microm, Walldorf, Alemania) de 10
µm de grosor (Bregma -2,8 a -3,8) (Paxinos, G., y cols., 1982) y colocados alternadamente sobre
porta objetos silanizados y posteriormente almacenados a -80°C hasta ser utilizados en los
experimentos de hibridación in situ (HIS) e inmunohistoquímica (IHQ). También se colectaron
las glándulas suprarrenales las cuales fueron colocadas en tubos plásticos de 1,5mL (Eppendorf,
29
Foster City, CA, EE UU), cuya masa fue determinada previamente. Luego, cada tubo
debidamente identificado, fue pesado con la glándula en su interior para determinar el peso de
cada suprarrenal. A continuación, los tubos se almacenaron a -80ºC para posteriormente
determinar el contenido de catecolaminas de la médula de cada glándula.
4. Determinación de los niveles séricos de corticosterona:
En el momento de la eutanasia se recolectó la sangre en tubos de vidrio sin anticoagulante la
cual fue centrifugada a 4.000 x g durante 15 min y el suero obtenido se almacenó a -20°C hasta
el momento de la determinación de corticosterona.
Los niveles séricos de corticosterona fueron determinados cuantitativamente mediante un ensayo
inmunoenzimático para corticosterona (Correlate-EIATM, Enzyme Immunoassay Kit, Assay
Designs, Inc., Ann Arbor, MI, EE UU). Se procedió a realizar la dilución de los estándares de
hormona (32, 160, 800, 4000, 20000 pg/mL) y de las muestras (1:40) en el tampón
proporcionado por el fabricante. Se colocaron 100 µL de las diluciones en una placa de 96
pocillos la cual estaba previamente recubierta con un anticuerpo (anti cabra Ig G), que reconoce
al anticuerpo que se une específicamente a la corticosterona (preparado en cabra). Sobre ella se
agregó 50 µL de corticosterona conjugada a fosfatasa alcalina que compite con la hormona
presente tanto en las muestras como estándares por la unión al anticuerpo anticorticosterona
presente en la placa. Posteriormente se adicionó a todos los pocillos excepto al que se dejó como
blanco y otro para determinar la unión no específica, 50 µL de un anticuerpo policlonal contra la
corticosterona que reacciona con la hormona libre (conjugada y no conjugada). Luego se incubó
durante 2 h a temperatura ambiente con agitación suave y posterior a 3 lavados con 400 µL del
tampón provisto en el fabricante, se agregó el sustrato de la fosfatasa alcalina
(p-nitrofenilfosfato) el cual genera un producto de color amarillo (p-nitrofenol). Luego de 1 h se
detuvo la reacción mediante la adición de una solución ácida provista por el fabricante. Se
determinó la absorvancia del producto coloreado a 405 nm en un lector de placa (Expert 96,
Asys Hitech, Augendorf, Austria). La lectura de la absorvancia de la curva estándar se usó para
calcular la concentración de corticosterona (CORT) presente en los sueros de los animales.
30
5. Determinación del contenido de catecolaminas de la médula suprarrenal:
La determinación de catecolaminas se realizó en homogenizados de médula suprarrenal de rata.
La médula suprarrenal se extrajo haciendo un pequeño corte por un lado de la glándula, y luego
presionando por el lado contrario a donde se hizo el corte, lo que permite la salida de la médula
por el lado donde se hizo el corte. Este tejido se homogenizó en 1 mL de ácido perclórico (PCA)
0,2 N en un homogenizador vidrio-vidrio. Después se centrifugó por 15 min a 15.000 x g y se
recolectaron 100 µL del sobrenadante para las mediciones de catecolaminas por cromatografía
líquida de alto rendimiento (HPLC).
5.1. Adsorción de catecolaminas en alúmina:
Este procedimiento se realizó antes de pasar las muestras por el cromatógrafo de HPLC.
Corresponde a un procedimiento de concentración de las catecolaminas (CAs). Este tratamiento
se aplica tanto para las muestras como también para las soluciones estándares de CAs con las
que se construye una curva de calibración, donde se interpola el valor obtenido de cada muestra.
Se colocaron 200 µL de cada estándar o 100 µL de muestra en tubos cónicos de 15 mL. Además
a las muestras se les agregó 100 µL de PCA 0,2 N y 20 µl de dihidrobencil-amina (DHBA)
5 mg/mL (Sigma, St. Louis, MO, EE UU) como estándar interno. También, a cada tubo se
agregaron 100 µL de ácido etilendiaminotetraácetico (EDTA) 0,1 M pH 7; 1 mL de H2O
nanopura filtrada; 50 mg de alúmina activada; 1 mL de Tris-HCl 1,5 M-EDTA 2% pH 8,5.
Luego, esta solución se ajustó el pH entre 8,5 y 8,6 con NaOH 5 N (5µL aproximadamente) para
permitir la adsorción de las catecolaminas a la alúmina. Posteriormente se agitó por 15 min,
luego se centrifugó por 5 min a 1.000 x g para sedimentar la alúmina. El liquido se sacó por
aspiración y se lavó la alúmina resuspendiéndola en 5 mL de H2O nanopura fría. Esta operación
se repitió 3 veces. Para los lavados cada tubo se agitó por 10 min. Finalmente la alúmina se secó
introduciendo una tira de papel filtro terminado en punta. Luego de unos minutos, se retiró el
papel. Posteriormente se eluyeron las CAs con 100 µL de PCA 0,2 N. Se agitó vigorosamente
por 1 min y se dejaron reposar las muestras en hielo por otros 5 min. Cada tubo se agitó y luego
se centrifugó por 5 min. Se colectaron los sobrenadantes en tubos rotulados. Esta elusión se
repitió con 100 µL más de PCA 0,2 N.
31
5.2. Fase movil:
Como fase móvil para la cromatografía se usó: NaH2PO4 100 mM, EDTA 1 mM, octil-sulfato
1,7 mM y acetonitrilo (CH3CN) 3,5% v/v ajustado a pH 2,3, con ácido ortofosfórico
concentrado.
5.3. Detección:
Las muestras se analizaron usando cromatografía de HPLC (Waters 600-E Multisolvent, Waters,
Millipore Corporation, Milford, MA, EE UU) acoplado a detección amperométrica (Waters 464
Pulsed ElectrochemicalDetector, Waters, Millipore Corporation, Milford, MA, EE UU)
mantenida a una diferencia de potencial de +650 mV, potencial al cual las CAs se oxidan. Las
catecolaminas se separaron con una columna BAS 250 x 4,6mm MF-6017, Biophase ODS 5µm
(BAS, West Lafayette, IN, EE UU). La sensibilidad del detector amperométrico se varió entre 1,
2 y 5 nA, dependiendo de la cantidad de CAs que tenía cada muestra. Cada cromatograma fue
analizado en un computador el cual está conectado por una interfase al detector del equipo, y que
está equipado con un software que permite la integración del área bajo la curva. Los tiempos de
retención fueron los siguientes: noradrenalina fue 5 min, adrenalina 8 min y DHBA 10 min.
La determinación de CAs se realiza mediante la construcción de una curva de calibración, en que
cada punto de la curva corresponde al valor de área integrada de adrenalina y noradrenalina de
cada estándar, en razón con el valor del área integrada del estándar interno (razones A/DHBA y
NA/DHBA). Luego, y dado que a cada muestra se le agregó una cantidad conocida de DHBA, se
establecen valores de razones de A/DHBA y NA/DHBA de cada muestra, que se interpolan en la
curva de calibración construida (Dorfman, M., y cols., 2003).
6. Hibridación in situ:
Se utilizó la técnica de hibridación in situ (HIS) para determinar niveles relativos de ARNm para
Bcl-2, BDNF y TGF-β1 en las diferentes regiones que componen el hipocampo de forma de
visualizar posibles cambios regionales que se produzcan en los diferentes grupos de
experimentación.
32
6.1 Marcaje de oligonucleótidos para la hibridación in situ BDNF y TGF-β1:
Para detectar los ARNm de BDNF y TGF-β1 se utilizaron oligonucleótidos de ADN de hebra
simple de aproximadamente 40 bases, y cuya secuencia es complementaria a cada transcrito
(Tabla 1). Los oligonucleótidos se marcaron en su extremo 3´-OH mediante la incorporación de
un nucleótido modificado con digoxigenina. Para ello, se procedió a tomar 100 pmol del
oligonucleótido y se mezcló a 4ºC en presencia de 1 µL de Digoxigenina-11-dUTP 25 nM
(Roche Diagnostics GMBH, Mannheim, Alemania), 0,9 µL de dATP 10 mM, 27,2 U de
Transferasa Terminal, 5 µL del tampón de la enzima (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim,
Alemania) y en presencia de CoCl2 20 mM (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim, Alemania)
en un volumen final de 25 µL. La reacción se llevó a cabo a 37ºC durante 30 min y
posteriormente se agregó, en hielo, 1 µL de una solución de detención, que contiene Glicógeno
20 mg/mL (Merck, Darmstadt, Alemania) y EDTA a una concentración final de 8,8 mM a pH 7.
Posteriormente el oligonucleótido se precipitó con 2,5 µL de LiCl 4M y 75 µL de etanol
absoluto frío, durante al menos 1 h a -80ºC. Luego de una centrifugación durante 30 min a
10.000 x g a 4ºC, el precipitado seco se resuspendió en 100 µL de agua destilada, quedando de
esta manera listo para ser empleado en el protocolo de hibridación.
Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos de ADN de hebra simple y de ARN complementario
para las hibridaciones in situ de BDNF, BCL-2 y TGF-β1
Secuencia
BDNF
5’-TATCCTTATGAATCGCCAGCCAATTCTCTTTTTGCTATCCAT-3’
BCL-2
TGF-β1
5’-CACGGATGGCTTCGATGCGCTTCCGTTTCACCAGCTCCAT-3’
Secuencia de
ARNm a la que es
complementaria
651-705 (Genbank
Acc. nº AY176065)
254-792 (Genbank
Acc. nº L14680)
524-563 (Genbank
Acc. nº NM021578)
Cantidad
utilizada
durante la
hibridación
50pmol/mL
50ng/mL
100pmol/mL
33
6.2. Marcaje del ARN complementario usado para la hibridación in situ de Bcl-2:
Para el caso de la detección de ARNm de BCL-2 se utilizó ARN complementario (ARNc) que se
obtiene a partir de un plasmidio pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, EE UU) que fue
generado anteriormente en el laboratorio (Cardenas, S.P., y cols., 2002). Este vector contiene un
fragmento de ADNc de BCL-2 (254-792 pb) generado por RT-PCR, el cuál se cortó con la
enzima de restricción ApaI (Promega, Madison, WI, EE UU). El ARNc se obtuvo incubando
durante 2 h a 37° C el fragmento cortado con la polimerasa Sp6 y el kit de marcaje de
digoxigenina ARN que incorpora un ribonucleótido de UTP modificado con digoxigenina
(Roche, Molecular Biochemicals, Mannhein, Alemania).
6.3. Protocolo de hibridación in situ:
Los cortes de tejido se fijaron durante 45 minutos a 4ºC en p-formaldehído al 4% disuelto en
solución tamponada de NaCl y fosfato (PBS, NaCl 0,14 M; Na2HPO4 10 mM; NH2PO4 1,8 mM;
pH 7,4). Luego de permeabilizar el tejido con proteinasa K 2 µg/mL (Merck, Darmstadt,
Alemania) durante 10 min, los portaobjetos con los tejidos se postfijaron nuevamente en
p-formaldehído al 4% disuelto en PBS, para luego ser deshidratados en una batería de alcoholes
(75%, 90% y 100% etanol en H2O destilada libre de ARNasas) y delipidados con cloroformo
(Merck, Darmstadt, Alemania) por 5 min. Luego los tejidos fueron rehidratados en otra batería
de alcoholes, para realizar la incubación con el oligonucleótido marcado correspondiente a 37ºC
toda la noche. La solución de hibridación que contiene a cada oligonucleótido se preparó con:
solución tamponada de citrato de sodio 0,3 M y NaCl 3 M pH 7,4 concentrada 4 veces (SSC 4x),
solución de Denhart 50x (Ficoll 0,02% [Sigma, St. Louis, MO, EE UU], albúmina sérica bovina
0,02% [Calbiochem Darmstadt, Alemania], polivinilpirrolidona 0,02% [Sigma, St. Louis, MO,
EE UU] en agua libre de ARNasa), formamida 50% (Sigma, St. Louis, MO, EE UU), ADN de
espermio de salmón 18 µg/mL (Sigma, St. Louis, MO, EE UU), t-RNA 10 mg/mL (Sigma, St.
Louis, MO, EE UU) y agua libre de ARNasa. Luego de la hibridación, se realizaron una serie de
lavados con la solución tampón de SSC en diluciones consecutivas: para BCL-2 se lava con SSC
4x, SSC 2x, SSC 1x y SSC 0,5x; para BDNF y TGF-β1 SSC 4x, SSC 2x y SSC 0,5x. Todos
estos lavados se realizan durante 10 min a temperatura ambiente cada uno y sólo el último
lavado se hizo a 40ºC. En el caso de BCL-2, por tratarse de una determinación que usa un ARN
34
complementario al ARNm blanco, se realizó una incubación con ARNasa 20 µg/mL en solución
tampón de Tris HCl 10 mM y EDTA 1 mM en pH 7,4 (solución TE), por 10 min, después del
primer lavado con SSC 4x. Luego, se realizó bloqueo de proteínas en los tejidos, usando un
reactivo de bloqueó al 1 % (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim, Alemania) en solución
tampón de ácido maleíco pH 7,5 durante 30 min. Luego se adicionó el anticuerpo
anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim,
Alemania) diluido 1:500 en tampón ácido maleíco pH 7,5, reactivo de bloqueo 1%, suero fetal
bovino 1%, Triton X-100 0,1% (Merck, Darmstadt, Alemania) a temperatura ambiente durante
2 h. Para el desarrollo de color y visualización de la hibridación, se utilizó como sustrato de la
enzima NBT 330 µg/mL y BCIP 33 µg/mL (Sigma, Saint Louis, Missouri, USA) ambos
disueltos en solución tamponada de revelado (Tris HCl 130mM y MgCl2 50mM, pH 9,5). Los
cortes se dejaron secar al aire y se montaron utilizando Entellan (Merck, Darmstadt, Alemania),
medio de montaje hidrófobo, que permite una adecuada visualización al microscopio.
Para asegurar que la unión de los oligonucleótidos o el ARN complementario fueron específicas,
y para descartar errores en la realización de la técnica, se utilizaron los siguientes controles: un
control negativo que consiste en el reemplazo del oligonucleótido por agua libre de ARNasa o
bien se incubó con el oligonucleótido marcado en presencia de un exceso de 100 veces del
oligonucleótido no marcado.
6.4. Análisis de la hibridación in situ:
Para el análisis semicuantitativo de la señal obtenida en la HIS, se utilizó el software
computacional de análisis de imagen UN-SCAN-IT versión 4.1 para Windows (Silk Scientific
Inc, Orem, UT, EE UU). Se realizaron mediciones de intensidad de coloración capturadas como
píxeles en un área determinada, sustrayendo el ruido de fondo específico para cada área. Esto se
realizó en cada región de interés del hipocampo (CA1, CA3 y ambas capas del Giro Dentado),
por cada uno de los ARNm analizados. Los resultados se expresan como intensidad de pixeles de
la marca especifica. Para cada animal se evaluaron a lo menos cuatro cortes coronales, y los
hipocampos de ambos lados de cada corte. Se obtuvo un valor promedio por animal para y para
cada región del hipocampo. Los resultados corresponden al promedio de 4 animales en las
diferentes condiciones experimentales usadas.
35
7. Determinaciones inmunohistoquímicas:
A través de inmunohistoquímica (IHQ), se realizó la determinación de P-CREB y BCL-2, en las
distintas regiones del hipocampo para poder visualizar posibles cambios entre los diferentes
grupos de experimentales. Los cortes coronales fueron fijados durante 50 min a 4°C en
p-formaldehído 4% disuelto en PBS. Luego el tejido se permeabilizó con Triton X-100 1% en
PBS durante 10 min. Posteriormente se bloquearon las peroxidas endógenas con H2O2 al 1% por
30 min. Además los sitios de unión inespecífica del anticuerpo se bloquearon utilizando suero
normal de cabra (NGS) al 3% en PBS para evitar la unión inespecífica del anticuerpo primario
en el tejido. Luego se procedió a la incubación con los anticuerpos primarios para las diferentes
proteínas de interés en NGS 1% en PBS pH 7,4 durante toda la noche a 4°C. Los tejidos se
lavaron y se llevo a cabo la detección con un método indirecto utilizando el anticuerpo
secundario anti IgG de conejo conjugado con biotina fue incubado a una dilución de 1:200 en
NGS 1% en PBS durante toda la noche a 4°C. Al día siguiente se incubó durante 1 hr con el
complejo peroxidasa estreptavidina a 37°C. Finalmente para el desarrollo de color se utilizó
como sustrato diaminobenzidina (DAB), el cual se caracteriza por dar color marrón (Elite Rabbit
Ig G ABC Vectastain,Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE UU). Las diluciones de los
anticuerpos utilizados se indican en la Tabla 2.
Tabla 2. Anticuerpos utilizados en inmunohistoquímica
Anticuerpo
primario
Anti P-CREB
(Upstate, Charlottesville,
VA EE UU)
Anti-BCL-2
(BD Pharmingen, San
Diego, CA, EE UU)
Dilución de trabajo
(anticuerpo primario)
Tipo de anticuerpo
Dilución del anticuerpo
secundario
1:300
Policlonal
1:200
1:160
Policlonal
1:200
Para la validación de los resultados de la coloración inmunohistoquímica se procedió a la
realización de un control negativo. Para este efecto la muestra se procesó remplazando el
anticuerpo primario por NGS 1% en PBS pH 7.4.
36
7.1. Análisis de la detección inmunohistoquímica:
La intensidad de la marca se cuantificó en cada área del hipocampo con la ayuda del programa
computacional de análisis de imagen Image J (Image Processing and Analysis in Java ver. 1.32j,
Nacional Institutes of Health, EE UU), el cual permite analizar diferencias en la intensidad
visual de color de las células inmunopositivas. Por cada hipocampo se consideraron 50 células
para CA1 y CA3, y 100 células para las capas suprapiramidal e infrapiramidal del Giro Dentado.
De todos los valores así obtenidos, se determinaron los valores maximos y minimos, con los que
se construyeron 4 rangos de frecuencia que permitieron clasificadar células como no teñidas,
levemente teñidas, moderadamente teñidas y fuertemente teñidas. Finalmente se aplicó el
método de H-score que se basa en la sumatoria de la proporción de células que muestran
diferentes grados de reactividad: 0 x porcentaje de células muy débilmente teñidas + 1 x
porcentaje de células levemente teñidas + 2 x porcentaje de células moderadamente marcadas +
3 x porcentaje de células fuertemente teñidas (Douglas-Jones, A.G., y cols., 2001). Este método
entrega un valor en un rango de 0 a 300, donde 0 corresponde a que todas la células estaban muy
débilmente teñidas o no tenían tinción, y 300 corresponde a que todas las células tienen el
máximo grado de tinción (Douglas-Jones, A.G., y cols., 2001).
8. Análisis por inmunowestern blot:
De una serie experimental se obtuvieron los hipocampos, los que fueron homogeneizados en un
homogenizador vidrio-vidrio a 4 ºC en cinco volúmenes de solución tamponada para lisis
(HEPES 10 mM pH 7.9, KCl 10 mM, EGTA 0,1 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 0,5 mM, Na3VO4
0,1 mM, PMSF 0,1 mM, aprotinina 2 µg/ml, leupeptina 2 µg/ml, NaF 0,02 mM,
NaPPi 0,025 mM y Tritón X-100 0,06 %). Luego se centrifugaron a 18.000 x g por 30 min a
4ºC, desechando el precipitado. En el sobrenadante se cuantificaron las proteínas mediante el
método de del ácido Bicinconínico (Sapan, C.V., y cols., 1999), usando BSA (Sigma, St. Louis,
MO, EE UU) como estándar para la curva de calibración. Una vez conocida la concentración de
proteínas, las muestras fueron desnaturadas con una solución de carga tamponada
(Tris HCl 250 mM pH 6,8; SDS 5 %; glicerol 6,7 %v/v; DTT 0,512 mg/mL; azul de bromofenol
13,33 mg/mL). Finalmente, las muestras fueron hervidas por 10 minutos y luego se almacenaron
a -80ºC para su posterior utilización en inmunowestern blot.
37
8.1. Inmunowestern Blot:
Se resolvieron 75 µg de proteínas en un gel de poliacrilamida con SDS (PAGE-SDS al 12%) a
una diferencia de potencial de 80 V en una solución tamponada de Tris 2,5 mM, SDS 0,01%, y
Glicina 19 mM. La electroforesis se realizó hasta que el frente de azul de bromofenol no se
visualizará. Luego se realizó la electrotransferencia de las proteínas a una membrana de
nitrocelulosa de poro 0,2 µm (BioRad, Richmond, CA, EE UU), durante 1 hora 30 minutos a
100 V a 4ºC, en una solución tampomada de glicina 19 mM, y Tris 2.5 mM. Como control de
transferencia se tiñó la membrana con Rojo Ponceau para verificar la carga de proteínas.
Posteriormente se decoloró la membrana con una solución de tamponada de Tris HCl 25 mM,
NaCl 140 mM y KCl 2m M a pH 7,4 (TBS), con Tween-20 al 0,1% (Merck, Darmstadt,
Alemania) (TBS-T 0.1%) o PBS con Tween-20 al 0.1%, dependiendo de la composición de la
solución de bloqueo a utilizar para la determinación de las distintas proteínas (Tabla 3).
Para bloquear las uniones no específicas del anticuerpo, se incubó la membrana con leche
descremada al 3%-5%, disuelta en la solución adecuada para la proteína que se deseaba
determinar. Un vez realizado esto, se incubó con el anticuerpo primario respectivo a la dilución
adecuada, toda lo noche a 4 ºC (Tabla 3).
Al día siguiente se realizaron dos lavados por 5 minutos con una solución de TBS, PBS, o H2O
destilada, de acuerdo al anticuerpo utilizado (Tabla 3), con agitación a temperatura ambiente.
Posteriormente se incubó la membrana con el anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa
(Tabla 3), durante dos horas con agitación a temperatura ambiente. Nuevamente la membrana
fue sometida a dos lavados con una solución de PBS o TBS (Tabla 3) por 5 minutos cada uno,
luego se incubó con el substrato de quimioluminiscencia para peroxidasa por 1 minuto
(Perkin-Elmer, Boston, MA, EE UU) posteriormente la membrana fue expuesta a distintos
tiempos (30 s-30-min) en un film fotográfico (Kodak, Rochester, NY, EE UU).
38
Tabla 3. Resumen de las condiciones de determinación para las distintas proteínas por la
técnica de Inmunowestern Blot.
Anticuerpo
primario
Anti-P-ERK1/2
(Cell Signaling,
Beverly, MA, EEUU)
Anti-ERK1/2
total
(Santa Cruz, Santa
Cruz, EE UU)
Anti-BCL-2
(Santa Cruz, Santa
Cruz, EE UU)
Dilución de
Tipo de
trabajo
(anticuerpo anticuerpo
primario)
Solución de
bloqueo
1:3.000
Policlonal
Leche 3% TBSTBS-T 0.1%
T 0.1%
1 :5.000
1:3.000
Policlonal
Leche 3% PBS-T
TBS-T 0.1%
0.1%
1 :5.000
1:100
Monoclonal
Leche 1% TBS
1X
TBS 1X
1 :3.000
1:1.000
Policlonal
Leche 3%PBS
H2O
destilada
1:3.000
1 :3.000
Policlonal
Anti P-CREB
(Upstate,
Charlottesville, VA
EE UU)
Anti β-Actina
(Sigma, St. Louis, MO,
EE UU)
Dilución del
Solución de
anticuerpo
lavado
secundario
Leche 3%PBS-T
PBS-T 0.1%
0.1%
1 :5.000
Se indica para cada anticuerpo: dilución adecuada, solución tamponada en la que se hizo el bloqueo, y solución con
la que se hicieron los lavados. Los anticuerpos primarios y secundarios respectivos para cada proteína fueron
disueltos en la solución de bloqueo respectiva.
39
9. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA:
De una serie experimental, se extrajeron los hipocampos sobre una placa de petri enfirada con
hielo. Inmediatamente, estos tejidos fueron cortados en secciones de 350 µm en su eje
antero-posterior en un cortador de tejido (The Mickle Laboratory Engineering Co., Gomshall,
Surrey, Inglaterra). Luego, el tejido cortado se traspaso a 5mL de Krebs Ringer tamponado con
bicarbonato y HEPES frio (KRBH: NaCl 110 mM; KCl 5 mM; MgSO4 2 mM; KH2PO4 2 mM;
NaHCO3 15 mM; CaCl2 2,5 mM; glucosa 10mM; HEPES 5 mM; ácido ascórbico 1%; saturada
con una mezcla de CO2 y O2, a pH 7,4.) sacudiendo el vial para separar los tejidos. Luego se
dejó decantar por algunos segundos. Esta solución se cambió repitiendo la operación 3 veces
más. El objetivo fue eliminar todo lo que es proteasas que quedan libres por efecto de los cortes.
De aquí se eligieron 3 a 4cortes de los más íntegros.
Los cortes seleccionados se colocaron en canastillos y se incubaron a 37ºC con 3H-NA 0,01µM
(Actividad especíica: 74,9 Ci/mmol. NEN Research Products, Boston, MA, EE UU) por 30min,
en KRBH. Posteriormente se procedió a lavar el exceso no incorporado por el tejido en 10 mL
de KRBH por 10 min. Se realizaron 4 de estos lavados. Después de los lavados, el canastillo con
los tejidos se pusieron en pocillos con 1mL de KRHB por 0,5min. Esta operación se repitió 3
veces, y corresponde a las tres mediciones de liberación basal del tejido (3 basales de 0,5min). El
pocillo a continuación de los basales correspondió al del estimulo (también de una duración de
0,5min), el cual se hizo aumentando el contenido de mEq de K+ en la solución de KRBH (KCl
25 mM, KRBH+K+). Para esta solución fue necesario hacer un reemplazo isoosmótico, donde se
retiró el mismo numero de mEq de Na+ de la solución, para agregar los mEq de K+ necesarios
para la concentración final de 25mM, y así mantener la osmolaridad (NaCl 90 mM). Terminado
el estimulo, el canastillo con los tejidos se trasladó a pocillos con KRBH normal durante 0,5
min, lo que se repitió 3 veces, con el fin de registrar lo que ocurre posterior al estímulo
(post-estimulo) (Fig. 4).
Terminado el último post-estimulo, los tejidos se lavaron en 10mL de KRBH de manera similar
a como se hizo al inicio después de la incubación con 3H-NA. Esta operación se repitió 3 veces,
para poder realizar un segundo estimulo, con características similares a como se describe mas
arriba (en términos de volúmenes de solución, cantidad de registros, y tiempos). Es en el
40
segundo estímulo donde se cambian las condiciones del medio, agregando fármacos (por
ejemplo: agonistas o antagonistas de receptores que participan en mecanismos de término de la
liberación, o mecanismos de recaptura), o bien, retirando componentes de la solución KRBH,
como el CaCl2, con el fin de determinar si la liberación que se está observando corresponde a
mecanismos dependientes de Ca2+ (De Langen, C.D., y cols., 1980). Finalmente, los tejidos se
homogeneizaron en PCA 0,1 N, para determinar el contenido de 3H, que quedó tras los
estímulos.
De
las
muestras
correspondientes
a
basales,
estímulos,
post-estímulos,
lavados y
homogeneizados, se tomaron 0,6 mL y se llevaron a viales de centelleo, para medir la cantidad
de tritio presente en cada pocillo, por un contador de centelleo (Liquid scintillation analyzer
1600 TR, Packard instrument company, Downers Grove, IL, EE UU). Además se midieron las
cuentas totales, para lo cual se tomaron 50µL de la solución 0,01µM de 3H-NA y se llevan a un
vial de centelleo antes de incubar el tejido y posterior a la incubación, para calcular los valores
de liberación fraccional de 3H.
Figura 4. Esquema del protocolo de liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente
cargados con 3H-NA. En este esquema se indica como se realizó cada ensayo de liberación. Inicialmente,
los cortes de hipocampo se colocaron a incubar con 3H-NA 0,01µM durante 30 min. Posterior a esa
incubación se realizaron 4 lavados de 10 min cada uno (L1, L2, L3 y L4). A continuación se determinó la
liberación basal de 3H (B1, B2, B3), previa al estimulo con K+ 25mM (E), para posteriormente determinar
lo que ocurre con la liberación en un tiempo posterior al estímulo (PE1, PE2 y PE3). Cada una de estas
determinaciones se realizó por 30s. Un segundo estímulo se aplicó a continuación del PE3, pero previo a
eso, los tejidos se lavaron nuevamente 3 veces por 10min cada uno, para luego repetir el esquema descrito
anteriormente. En este segundo estímulo se pueden variar las condiciones de la liberación, ya sea quitando
componentes a la solución tampón (como Ca2+), o bien agregando sustancias que modifiquen el eflujo de
3
H (Yohimbina, Clonidina, TGF-β1, etc).
41
9.1. Estudio de la sensibilidad del receptor α2 en cortes de hipocampo:
Para evaluar como el estrés crónico y el tratamiento con DMI pudieron haber afectado la
actividad del autoreceptor α2, se incluyeron dos agentes farmacológicos durante los estudios de
liberación: i) Yohimbina, un antagonista α2 adrenérgico y ii) Clonidina, un agonista para este
receptor. Ambos fármacos se utilizaron a una concentración de 5µM, y estuvieron presentes en
la solución KRBH de trabajo, desde los lavados previos al segundo estímulo, durante los basales
y el estímulo con K+ 25 mM, y también en los postestímulos.
También se evaluó el efecto que tiene TGF-β1 en el eflujo de de 3H de cortes de hipocampo
recientemente cargados con 3H-NA. Para esto, se agregó TGF-β1 0,4nM (10ng/mL) (Promega,
Madison, WI, EE UU) al medio de incubación desde los basales del segundo estímulo hasta los
postestímulos.
9.1.1. Evaluación de la bioactividad de TGF-β1:
La actividad del TGF-β1 utilizado en los ensayos de liberación se determinó a través de un
bioensayo. Los fibroblastos cardiacos neonatos (FCN) son capaces de transformarse a
miofibroblastos en presencia de TGF-β1 (Soto, C., 2006). Se utilizó el procedimiento descrito
por Soto y cols (Soto, C., 2006). Las ratas se eutanasiaron por decapitación e inmediatamente se
les removió el corazón bajo condiciones de asepsia. De este órgano, se retiraron las aurículas y
los ventrículos se cortaron en pequeños pedazos para facilitar las sucesivas digestiones
posteriores con pancreatina y colagenasa II (Gibco BRL, Carlsbad, CA EE UU). El producto de
las digestiones se sometió a un pre-plaqueo por 2 h a 37ºC en medio de cultivo conteniendo 15%
suero fetal bobino (FBS) (Gibco BRL, Carlsbad, CA EE UU) en frascos para cultivo de plástico.
Por adhesión diferencial al plástico se separaron fibroblastos de cardiomiocitos. Luego de las
2 h, se cambió el medio por DMEM-F12 (Sigma, St. Louis, MO, EE UU) suplementado con
10% FBS. Los fibroblastos se dejaron proliferar hasta confluencia y los cambios de pasaje se
realizaron mediante tripsinización (hasta pasaje 2 como máximo).
42
9.1.2. Desdiferenciación de fibroblastos a miofibroblastos:
Se utilizaron fibroblastos cardiacos neonatos en pasaje 2, los cuales se cultivaron por 84 h. en
medio DMEM-F12 suplementado con TGF-β1 0,2nM (Soto, C., 2006).
9.1.3. Tinción con cristal violeta:
Las células se fijaron sobre la placa de cultivo en frío (4°C) durante 30 min, con
paraformaldehído al 4% en PBS. Transcurrido el tiempo de fijado, las células, se lavaron con
PBS frío, al menos tres veces y teñidas en frío (4°C) durante 30 min, con una solución de cristal
violeta 5 mg/mL preparada en metanol al 20%. Al finalizar el tiempo de tinción se retiró la
solución de cristal violeta y las células se lavaron con agua destilada tres veces. Se dejó secar
para ser observada al microscopio (Soto, C., 2006).
10. Análisis estadístico:
Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad v. 4.0 (GraphPad software Inc., San Diego,
CA, EE UU). Los datos corresponden a valores de media ± error estándar medio (EEM). Cada
comparación se hizo con un test de ANOVA no paramétrico (test de Kurskal-Wallis). Se
consideró una significancia estadística cuando al menos p<0,05.
43
V. Resultados:
1. Determinar si el estrés crónico por restricción de movimiento induce características similares
a la depresión, y si este efecto es prevenido por la administración crónica de DMI:
El estrés agudo es un evento fisiológico frente a los cambios en el entorno que permite el
desarrollo de respuestas adaptativas (McEwen, B.S., y cols., 1995), pudiendo ser estos cambios
favorables para el individuo (McEwen, B.S., y cols., 1995). Sin embargo, el estrés crónico puede
resultar perjudicial, haciendo que esta respuesta se torne patológica (McEwen, B.S., y cols.,
1995, Sapolsky, R.M., 1996b, Yehuda, R., 1997). Estos efectos patológicos del estrés, pueden
ser explicados por los cambios a nivel de la activación del eje HHS, principalmente por un
aumento en los niveles de GCs (McEwen, B.S., y cols., 1995, Sapolsky, R.M., 1996b, Yehuda,
R., 1997). En esta parte de los resultados, se muestra el efecto de 2,5 h de restricción de
movimiento por 14 días continuados y de los tratamientos farmacológicos en distintos
marcadores fisiológicos relacionados a los efectos del estrés.
1.1. Determinación de parámetros fisiológicos luego del estrés crónico por restricción de
movimiento:
1.1.1. Variaciones en el peso corporal:
En la semana anterior al inicio de la restricción de movimiento y de los tratamientos
farmacológicos, los animales ganaron peso en forma similar (barra achurada en Fig. 5 A y B).
Durante este periodo se realizó el entrenamiento para evaluar la condición de anhedonia (ver
más adelante). En esa semana, todos los animales fueron manipulados de la misma manera. Una
vez iniciada la restricción de movimiento por 2,5h/día durante 14 días (barra negra en Fig. 5 A y
B), se observó que los animales estresados tuvieron una disminución en la ganancia de peso en
comparación con el grupo control (Fig. 5 A y B). Esta diferencia empezó a ser significativa
desde el 4 día de tratamiento (p<0,05 Control+SAL vs Restricción+SAL) (Fig. 5 A). Hacia el
final de los 14 días de estrés, los animales sometidos a restricción mostraron una menor ganancia
en el peso corporal de aproximadamente 20% en comparación con los animales no estresados
(p<0,005). El tratamiento antidepresivo, redujo la ganancia de peso corporal tanto en los
animales sometidos a restricción de movimiento tratados con DMI, como los no estresados que
44
también recibieron el antidepresivo, que incluso hacia el final del tratamiento, es inferior a la de
los animales que solamente fueron sometidos a restricción de movimiento (p<0,005
Restricción+SAL vs. Control+DMI y Restricción+DMI) (Fig. 5 A).
Para poder evaluar si la DMI es capaz de prevenir en animales, cambios conductuales similares a
la depresión, se compara el efecto de este antidepresivo con el de otro fármaco, el HAL capaz de
actuar en el SNC pero como antagonista de los receptores D2 (Baldessarini, R., y cols., 2001).
A pesar de que la utilización del HAL es más bien para determinar si los efectos del estrés
crónico son prevenidos por DMI y no por otro fármaco, cuyo mecanismo de acción no se
relaciona con el de un antidepresivo, se observó que el tratamiento crónico con HAL también
produjo un efecto en las ganancias de peso. En esta otra serie experimental, hay una diferencia
entre controles no estresados y animales estresados inyectados con vehículo, desde el día 5 de
tratamientos (Fig 5 B, barra negra) (p<0,05). Hacia el final de los 14 días, los animales
estresados tuvieron una pérdida de peso que también fue de alrededor de un 20% (p<0,005). En
el caso de los animales que recibieron HAL (controles no estresados y animales con restricción
de movimiento), se observó una ganancia de peso menor respecto de los grupos de animales
inyectados sólo con salino (p<0,001 Control+SAL vs. Control+HAL y Restricción+HAL;
p<0,05 Restricción+SAL vs. Control+HAL y Restricción+HAL; diferencias observadas a los 14
días de tratamientos).
45
A
% de ganancia de
peso corporal
100
75
Control+SAL ip.
Control+DMI 10mg/kg ip.
Restricción+SAL ip.
Restricción+DMI 10mg/kg ip.
50
25
0
0
7
14
Días
B
Control+SAL ip.
% de ganancia de
peso corporal
100
75
Control+HAL 50 µg/kg ip.
Restricción+HAL 50 µg/kg ip.
50
25
0
0
7
14
Días
Figura 5. El estrés crónico reduce la ganancia de peso corporal. (A) Serie experimental en que se
incluye () Control+SAL ip (c) Control+DMI ip. (▼) Restricción+SAL ip () Restricción+DMI ip. (B)
Serie experimental en que se incluye () Control+SAL ip (U) Control+HAL sc. (▼) Restricción+SAL ip
(○) Restricción+DMI ip. Los datos están expresados como promedio del % del de peso inicial del animal
± EEM. Una semana antes de iniciarse el protocolo de restricción de movimiento y los tratamientos
farmacológicos (barra achurada) todos los animales se manipularon de forma similar. La barra negra
indica el periodo del protocolo de estrés crónico y los tratamientos farmacológicos. En el día 14 de, hay
diferencias significativas entre Control+SAL y Restricción+SAL para ambas gráficas: (A) p<0,005,
Control+SAL vs. Restricción+SAL; (B) p<0,001, Control+SAL vs. Restricción+SAL (Control+SAL n=4
en cada serie experimental; Control+DMI n=8; Control+HAL n=4; Restricción+SAL n=4 en cada serie
experimental; Restricción+DMI. n=8; Restricción+ HAL. n=4)
46
1.1.2. Tamaño de las glándulas suprarrenales y contenido de catecolaminas:
El modelo de estrés crónico puede generar cambios en el tamaño de las glándulas suprarrenales
(Magarinos, A.M., y cols., 1995), ya que éstas participan en la respuesta a estrés secretando GCs
que se producen en la corteza de la glándula suprarrenal, como también liberando adrenalina (A)
y NA al torrente sanguíneo (Ganong, W., 1996b, Nussey, S., y cols., 2001, Rhoades, R., y cols.,
1996). De esta manera se evaluó el efecto del estrés crónico por restricción de movimiento en el
tamaño de las glándulas suprarrenales y también el contenido de A y NA. Como se observa en la
Tabla 4, no se encontraron variaciones en el tamaño de las glándulas adrenales, y tampoco se
encontraron diferencias en el contenido de A y NA en las médulas de las glándulas suprarrenales
de animales sometidos a diferentes condiciones experimentales.
Tabla 4. Tamaño de la glándula suprarrenal y contenido de noradrenalina (NA) y
adrenalina (A) en la medula de la glándula
mg
mg glándula
µg NA/mg
µg A/mg
glándula/100g
suprarrenal
glándula
glándula
de peso corporal
Control+SAL ip.
n=4
Control+DMI ip.
n=4
Restricción+SAL ip
n=4.
Restricción+DMI ip
n=4
32,31±1,27
9,20±0,34
0,280±0,041
0,569±0,089
28,85±1,07
8,89±0,46
0,281±0,032
0,949±0,059
31,04±1,08
10,56±0,44
0,331±0,068
0,793±0,081
26,41±1,24
9,54±0,97
0,195±0,022
0,968±0,083
Los valores de las masas de las glándulas suprarrenales corresponden al valor de la glándula completa.
Los valores de NA y A están normalizados con respecto al valor de la glándula suprarrenal completa.
Tampoco se encontraron diferencia entre los tamaños de las glándulas adrenales de los animales
tratados con HAL (resultados no mostrados). No se determinaron los contenidos de
catecolaminas de las glándulas de estos animales.
47
1.1.3. Niveles de corticosterona:
El estrés crónico por restricción de movimiento aumentó los niveles de CORT en comparación a
los animales control no estresados (p<0,05) (Tabla 5). El tratamiento crónico con DMI a
animales estresados crónicamente, previene parcialmente el aumento en la CORT sérica,
alcanzando niveles similares a los de animales control. Este efecto no es significativo cuando se
compara con los niveles de hormona de los animales estresados (Tabla 5). Por el contrario, el
tratamiento por 14 días con DMI a animales sin estresar no logró alterar los niveles séricos de
corticosterona (CORT).
El HAL tampoco es capaz de afectar los niveles de CORT en los animales sin estresar, ni
tampoco los de los animales sometidos a estrés crónico, donde se observan valores de hormona
similares a los de las ratas estresadas que solo recibieron una inyección diaria de solución salina
(Tabla 5).
Tabla 5. Niveles séricos de corticosterona (CORT)
CORT µg/dL
Control+SAL ip.
6,36±3,03
Control+DMI ip.
4,34±1,73
Control+HAL sc
4,85±0,86
Restricción+SAL ip
15,30±3,41*
Restricción+DMI ip
8,42±3,99
Restricción+HAL sc
17,63±4,87
Los valores corresponden a media ± EEM. * p<0,05 Control+SAL vs.
Restricción+SAL. Control+SAL ip. n=8; Control+DMI 10mg/kg ip.
n=4; Restricción+SAL ip. n=8; Restricción+DMI 10mg/kg ip. n=4.
Estas determinaciones se realizaron en muestras de suero obtenidas tras la eutanasia, la que se
realizó entre las 17:30 y las 18:30.
48
Estas determinaciones sugieren que el estrés crónico por restricción de movimiento es capaz de
reducir la ganancia de peso (Fig. 5 A y B), que pueden ser consecuencia de cambios en los
niveles de CORT (Tabla 5). Estos cambios reflejan los efectos que tiene el estrés crónico sobre
algunas de las respuestas fisiológicas del animal. Sin embargo, la DMI no fue capaz de prevenir
esta reducción en la ganancia de peso corporal, generando incluso una mayor disminución de
éste. Además, la DMI tampoco logra reducir significativamente los niveles de CORT sérica a
valores similares al control.
1.2. Cambios conductuales inducidos por estrés crónico y su modificación por la administración
de DMI:
Para determinar la acción antidepresiva de la DMI se determinó si el estrés crónico es capaz de
modificar la conducta de los animales, y si estos cambios son prevenidos específicamente por la
DMI, y no por un fármaco antipsicótico como el HAL cuyo mecanismo de acción es diferente al
del antidepresivo.
1.2.1. Adquisición de respuestas condicionadas y capacidad de responder a nuevos estímulos
nocivos:
En la Fig. 6 (A y C) se observa que los animales sometidos a restricción de movimiento no
adquirieron respuestas condicionadas, es decir, no fueron capaces de asociar que después de un
tono audible (estímulo condicionante) viene un shock eléctrico (estímulo no condicionado) del
cual pueden escapar. Esta situación se refleja en que estos animales presentaron un porcentaje
mayor de fallas en el escape que el grupo control sin estresar (Fig. 6 B y D). Esta situación se
previene por la administración de DMI en animales estresados crónicamente (Fig. 6 A y B). Para
determinar si este efecto es específico para la DMI como antidepresivo, en otro grupo de
animales se usó el HAL, antagonista para el receptor D2 de dopamina (Baldessarini, R., y cols.,
2001). Se puede observar que sólo el tratamiento con HAL en los animales sin estresar
(Control+HAL), causa una disminución en la adquisición de respuestas condicionadas (Fig. 6
C), sin embargo su porcentaje de fallas en el escape no es diferente del control con salino (Fig. 6
D), es decir, animales no estresados inyectados con HAL realizan intentos de escape, aunque no
asociados a la señal audible que les sirve de guía para evitar la descarga eléctrica. Este es un
49
efecto descrito para este tipo de fármacos, que en pequeñas dosis pueden deteriorar la capacidad
de evitar activamente un estímulo nocivo a pesar de la señal asociada, pero que de todas maneras
intentan escapar una vez que se aplica la descarga eléctrica (Baldessarini, R., y cols., 2001).
Además se puede observar que el HAL no previene la falla de escape ni la reducción en la
adquisición de respuestas condicionadas en animales sometidos a restricción de movimiento
(Fig. 6 C y D). Los resultados de esta prueba sugieren que la restricción crónica de movimiento
genera una disminución en facultades cognitivas del animal, similar a lo que ocurre en pacientes
depresivos, y que son prevenidas específicamente por la acción del antidepresivo DMI, y no por
el antipsicótico HAL.
50
B
*
*
*
#
#
30
20
*
*
*
10
% Fallas en el Escape
60
0
50
40
30
#
#
#
20
10
.
g
ip
ip
.
g/
k
I1
0m
M
n+
D
ci
ó
tr
ic
es
R
30
*
*
10
sc
.
.
g
µg
/k
H
A
L
50
ón
+
ric
ón
+
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R
es
t
ric
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R
A
L
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50
µg
/k
g
SA
L
ip
sc
.
ip
.
0
+H
0
20
+S
A
L
*
*
C
on
tr
ol
*
*
on
tr
ol
*
*
30
C
20
% Fallas en el Escape
40
C
on
tr
C
ol
on
+S
tr
A
ol
L
+H
ip
A
.
L
50
µg
/k
R
g
es
sc
tr
.
R
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es
ci
tr
ó
n+
ic
ci
SA
ón
L
+H
ip
A
.
L
50
µg
/k
g
sc
.
% Adquisisción de respuestas
condicionada
SA
L
ci
tic
es
R
on
tr
ol
+
C
ic
ci
es
tr
R
D
C
10
ón
+
g/
k
I1
0m
M
D
C
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tr
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g
+S
A
L
g/
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0m
I1
ón
+D
M
ip
.
ip
.
.
g
ip
ip
.
R
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D
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M
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I1
0m
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+S
A
L
g
ip
ip
L
+S
A
C
on
tr
ol
+
C
on
tr
ol
.
0
.
% Adquisisción de respuestas
condicionadas
A
40
Figura 6. El estrés crónico y el tratamiento con DMI alteran la adquisición de respuestas
condicionadas, y los problemas en evitar estímulos nocivos. En esta gráfica se muestra que animales
estresados por 14 días tienen problemas para adquirir respuestas condicionadas en la prueba de Falla de
Escape. (A) Efecto del estrés y del tratamiento con DMI en adquisición de respuestas condicionadas y (B)
Fallas en el escape, para prevenir un estímulo aversivo. (C) Efecto del estrés y del tratamiento con HAL en
adquisición de respuestas condicionadas y (D) Fallas en el escape, para prevenir un estímulo aversivo.
(*p< 0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL; **p<0,01 Control+SAL vs. Restricción+SAL; ***=
p<0,005 Control+SAL vs. Restricción+SAL; ##= p<0,01 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; ###=
p<0,005 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; análisis realizado por ANOVA no paramétrico [KurskalWallis]. Control+SAL n=4 para cada serie experimental; Control+DMI n=8; Control+HAL n=4;
Restricción+SAL n=4 para cada serie experimental; Restricción+DMI. n=8; Restricción+ HAL n=4)
51
1.2.2. Prueba de natación forzada:
En la Fig. 7 A y B, los animales control sin estresar presentaron las dos conductas de escape
(escalamiento y natación), sin predominio de una sobre la otra. En cambio en los animales a los
que sólo se les administró DMI (Fig. 7 A), se puede observar que la conducta de escalamiento es
la que predominó, aunque no alcanzó a ser significativamente mayor si se compara con el grupo
control.
Los animales sometidos a restricción de movimiento presentaron menos tiempo asociado a
conductas de escape (Fig. 7 A y B), aumentando significativamente la conducta de inmovilidad
en relación a los animales control (p<0,05 Restricción+SAL vs. Control+SAL en Fig. 7 A y B),
lo que indica una condición de desesperanza aprendida (estado psicológico que se produce
cuando los acontecimientos son percibidos como incontrolables y que no se puede hacer nada
para cambiarlos (Vinaccia, S., y cols., 2005), condición que se presenta en individuos con DM
(APA, 1999)). Esta condición se previno por la administración crónica de DMI a animales
estresados, lo que se refleja en una disminución en la conducta de inmovilidad (p<0,05
Restricción+SAL vs. Restricción+DMI en Fig. 7 A), y en aumento en la conducta de
escalamiento (p<0,01 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI en Fig. 7 A). Esta prevención no
ocurre con los animales sometidos a restricción de movimiento inyectados crónicamente con
HAL, observándose un predominio de la conducta de inmovilidad. Esto también ocurre en los
animales control sin estresar que reciben este mismo fármaco (Fig. 7 A).
Este resultado sugiere que los animales estresados crónicamente presentan una condición de
desesperanza aprendida, efecto que se previno por la administración de crónica de DMI, pero no
por la acción del HAL.
52
A
Segundos
300
200
*
#
#
*
#
100
0
Escalamiento
Natación
Inmovilidad
B
Control+SAL ip.
Control+HAL 50µg/kg sc
Restricción+HAL 50µg/kg sc
300
Segundos
Control+SAL ip.
Control+DMI 10mg/kg ip
Restricción+DMI 10mg/kg ip
*
*
200
*
100
0
Escalamiento
Natación
Inmovilidad
Figura 7. El estrés aumenta la inmovilidad en la prueba de natación forzada. (A) En esta gráfica se
muestra que en los animales estresados por 14 días, hubo una disminución en las conductas de escape,
aumentando la conducta de inmovilidad durante los 300seg (5min) de la prueba. Esta situación no ocurre
en los animales sometidos a restricción de movimiento que reciben el tratamiento con DMI 10mg/kg ip.
Los animales no estresados que reciben DMI, la conducta de escape que predomina es la de escalamiento,
lo que está de acuerdo con lo descrito para este tipo de antidepresivos, sin embargo este efecto no es
significativo. (B) En esta gráfica se muestra nuevamente una disminución en las conductas de escape,
aumentando la conducta de inmovilidad durante los 300seg (5min) de la prueba. El tratamiento con HAL
animales estresados y no estresados causa un aumento en la inmovilidad. El tratamiento con HAL no
previene la conducta de desesperanza aprendida asociada a la restricción de movimiento. (*= p<0,05
Control+SAL vs. Restricción+SAL; + + p<0,01 Control+SAL vs. Control+DMI; # p<0,05
Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; ## p<0,01 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; análisis
realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kurskal-Wallis). Control+SAL n=8; Control+DMI n=8;
Control+HAL n=4; Restricción+SAL n=8; Restricción+DMI n=8; Restricción+HAL n=4)
53
1.2.3. Preferencia por una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida:
Se evaluó la pérdida de interés por un estimulo placentero o anhedonia, mediante la variación en
el consumo de una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida. En la Fig. 8 A y B se puede
observar que la restricción de movimiento causa una reducción en la preferencia por la solución
de sacarosa 1% a los 7 días (p<0,01 Control+SAL vs. Restricción+SAL en Fig. 8 A y B),
condición que persiste a los 14 días (p<0,005 Control+SAL vs. Restricción+SAL en Fig. 8 A y
B). Esta condición se reconoce como anhedonia, y es una característica importante que se
presenta en pacientes con DM. Esta conducta se previene por la administración crónica de DMI
a animales estresados, tanto a los 7 días (p<0,05 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI) como a
los 14 días de tratamiento (p<0,01 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI). Por el contrario, el
HAL no es capaz de prevenir la anhedonia en animales estresados (Fig. 8 B), siendo los valores
de preferencia por la sacarosa 1% similares a los de los animales estresados que recibieron
salino.
Estos resultados sugieren que la restricción crónica de movimiento hace que los animales
pierdan la preferencia por algún estímulo placentero, similar a una conducta anhedónica, y que
esta conducta se previene específicamente por la acción específica del antidepresivo, y no por el
antipsicótico.
54
A
Porcentaje de preferencia por
sacarosa 1%
125
#
#
Control+SAL ip.
Control+DMI 10mg/kg ip
* *
* *
* *
Control+SAL ip.
Control+HAL 50µg/kg sc
Restricción+HAL 50 µg/kg sc.
#
100
75
*
*
*
*
*
50
25
0
0
B
7
14
Días
Porcentaje de preferencia por
sacarosa 1%
100
*
* *
*
75
50
25
0
0
7
14
Días
Figura 8. El estrés crónico reduce la preferencia por una solución de sacarosa al 1%. (A) En esta
gráfica se señala la condición inicial previa al paradigma de estrés (día 0 de tratamientos y estrés crónico).
Se puede observar que, tanto a los 7 y 14 días de restricción de movimiento, los animales estresados
crónicamente disminuyeron la preferencia por la bebida endulzada, o que indica una condición de
anhedonia. Esto no ocurre en los animales sometidos a restricción de movimiento que reciben el
tratamiento con DMI. (B) En esta gráfica se señala la condición inicial previa al paradigma de estrés (día 0
de tratamientos y estrés crónico). Se puede observar que, tanto a los 7 y 14 días de restricción de
movimiento, los animales estresados crónicamente disminuyeron la preferencia por la bebida endulzada, o
que indica una condición de anhedonia, mientras que los animales a los que se les administró HAL, tanto
controles como estresados crónicamente se comportan como los animales que reciben una inyección de
solución salina. (**= p<0,01 Control+SAL vs. Restricción+SAL; ***= p<0,005 Control+SAL vs.
Restricción+SAL; #= p<0,05 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; ##= p<0,01 Restricción+SAL vs.
Restricción+DMI; análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kurskal-Wallis).
Control+SAL n=8; Control+DMI n=8; Control+HAL n=4; Restricción+SAL n=8; Restricción+DMI n=8;
Restricción+HAL n=4)
55
De esta forma, y de acuerdo a lo que sugieren los resultados de las pruebas conductuales, el
someter a ratas macho de 200 a 240g a 2,5h diarias de restricción de movimiento, durante 14
días continuados, induce la aparición de conductas similares a la depresión, que son prevenidas
específicamente por un antidepresivo como la DMI y no por un antipsicótico como el HAL.
2. Analizar en un modelo animal de depresión, cambios en los niveles de marcadores asociados a
la resiliencia celular en hipocampo de rata:
El estrés crónico causa una serie de alteraciones a nivel conductual, que incluyen alteraciones
cognitivas (fallas en el escape y disminución en la adquisición de respuestas condicionadas),
incapacidad de responder ante nuevas situaciones incontrolables (desesperanza aprendida), y
también anhedonia. Todas estas conductas son prevenidas por el tratamiento con DMI. Estos
cambios y los efectos del antidepresivo sugieren que la restricción de movimiento induce
cambios a nivel del SNC, y que estas alteraciones pueden ser prevenidas por la DMI. Además, la
restricción de movimiento aumenta los niveles de CORT en animales estresados, por lo que es
posible plantear que estos niveles más altos de esta hormona puedan tener efectos nocivos a
nivel de estructuras del SNC, como el hipocampo, que tienen una alta densidad de receptores
para GCs (McEwen, B.S., 1987, 1999, 2005, McEwen, B.S., y cols., 1995, Sapolsky, R.M.,
2000, 2001).
2.1. Determinar los efectos del estrés crónico y el tratamiento con DMI sobre ERK1/2, CREB,
BCL-2, BDNF y TGF-β1, como marcadores asociados a la resiliencia celular:
Dentro de los efectos nocivos que pueden tener el aumento en los niveles de corticosterona, está
la disminución de la resiliencia neuronal a nivel hipocampal (McEwen, B.S., 1999, Sapolsky,
R.M., 1996b, Yehuda, R., 1997). Por lo tanto resulta importante evaluar cómo cambian algunos
marcadores asociados a la neuroprotección en la condición de estrés crónico por restricción de
movimiento, y cómo la DMI tiene efectos a nivel de estos marcadores.
56
2.1.1. Determinación por inmunowestern blot de ERK1/2:
La vía de transducción regulada por las ERK1/2 es activada en el SNC por neurotrofinas y otros
moduladores neuroquímicos, que relacionan a estas proteínas con procesos de sobrevivencia y
plasticidad neuronal (D'Sa, C., y cols., 2002, Einat, H., y cols., 2003, Weeber, E.J., y cols.,
2002). Por este motivo se evaluó de qué manera el estrés crónico afecta los niveles y el grado de
fosforilación de ERK1/2. En la Fig. 9 A, se muestra un immunoblot representativo de estas
proteínas. El análisis densitométrico (Fig. 9 B), indicado como razón de la intensidad de ERK1 o
ERK2 con β-actina, muestra que el estrés induce un aumento en ERK1/β-actina y
ERK2/β-actina respecto a animales controles sin estresar (p<0,05) (Fig. 9 B). Sin embargo, la
administración crónica de DMI no produce cambios en la razones ERK1/β-actina y
ERK2/β-actina en animales estresados. En contraste, se observa que la DMI administrada
crónicamente a animales sin estresar induce un aumento significativo de ERK1/β-actina y
ERK2/β-actina (p<0,05). Este análisis refleja cambios en la cantidad de proteína total para las
diferentes condiciones experimentales, pero no entrega información con respecto a cambios en el
grado de fosforilación de éstas. Por este motivo, se analizaron los niveles de P-ERK1 y P-ERK2.
La Fig. 9 C se muestra que el estrés crónico induce un aumento en P-ERK1/ERK1 y produce una
tendencia similar en P-ERK2/ERK2. Este efecto es prevenido por el tratamiento crónico con
DMI en animales estresados, donde se produjo una disminución significativa en las razones de
P-ERK1/ERK1 y P-ERK2/ERK2 (p<0,05) al compararlas con las razones de animales estresados
(Fig. 9 C). También, este análisis densitométrico muestra una reducción no significativa en la
razón P-ERK1/ERK1, y una disminución significativa de P-ERK2/ERK2 (p<0,05) en animales
control tratados con DMI en comparación con animales controles (Fig. 9 C). No se determinaron
los niveles de ERK1/2 totales o fosforiladas de animales tratados con HAL.
57
A
C
B
*
3
*
2
1
P-ERK1/ERK1
2
Razón P-ERK1-P/ERK1
#
1
g/
0m
M
I1
ci
ó
n+
D
tr
ic
R
es
tr
ic
C
on
ci
ó
R
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ol
kg
L
n+
SA
g/
0m
M
I1
tr
ol
C
on
n+
D
ci
ó
tr
ic
R
es
Razón P-ERK2/ERK2
*
*
1
*
ip
kg
g/
0m
I1
ón
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R
ón
es
t
ric
+D
M
ci
I1
+D
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kg
g/
+S
A
C
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ip
ip
ip
.
L
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kg
g/
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0m
R
ric
es
t
R
on
ci
R
ón
es
t
ric
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M
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I1
ón
0m
g/
0m
I1
+D
M
tr
ol
.
.
ip
kg
+S
A
L
ip
ip
.
L
+S
A
tr
ol
C
on
on
.
0
.
0
#
1
C
Razón ERK2/ β-Actina
P-ERK2/ERK2
2
2
C
ip
.
ip
.
kg
L
+S
A
g/
0m
M
I1
ci
ó
tr
ic
R
es
ip
.
ip
.
L
n+
SA
g/
0m
M
I1
+D
tr
ol
kg
ip
.
kg
ip
.
L
+S
A
tr
ol
C
on
C
on
ERK2/β-ACTINA
4
3
ip
.
0
ip
.
0
*
+D
Razón ERK1/ β-Actina
ERK1/β-ACTINA
4
Figura 9. El estrés crónico y el tratamiento con DMI inducen cambios hipocampales en ERK1/2
total y su grado de fosforilación. Tras 14 días de restricción de movimiento hay un aumento en la
fosforilación de ERK1/2, efecto que es prevenido por DMI. También hay un aumento en la cantidad de
proteínas totales en relación con la β-actina. (A) Inmunoblots representativos de las proteínas estudiadas.
(B) Análisis densitométrico de los inmunoblots de las proteínas totales expresadas como razón con βactina; (C) Análisis densitométrico de los inmunoblots de las proteínas fosforiladas expresadas como
razón con sus proteínas totales; (* p<0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL o vs. Control+DMI; #
p<0,05 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico
(Kurskal-Wallis). Control+SAL n=4; Control+DMI n=4; Restricción+SAL n=4; Restricción+DMI n=4)
58
2.1.2. Determinación por inmunowestern blot de CREB:
La activación de las ERK1/2, puede llevar a la activación por fosforilación de la proteína CREB
(D'Sa, C., y cols., 2002), es por esto que se estudiaron los niveles de CREB total y fosforilado
(P-CREB). En la Fig. 10 A se observa un inmunoblot representativo de las diferentes
condiciones experimentales. El análisis densitométrico reveló que las razones de CREB/β-actina
de los animales control y la de los estresados crónicamente son significativamente diferentes
(p<0,05) (Fig. 10 B). Mientras que CREB/β-actina de animales control tratados con DMI no es
diferente de la de los controles (Fig. 10 B). Nuevamente este análisis solo refleja cambios en las
cantidades totales de CREB en cada condición experimental, y no entrega información sobre el
grado de fosforilación de CREB. El análisis de P-CREB/CREB, reveló que este valor fue
significativamente mayor en animales estresados crónicamente en comparación con animales
control. Este efecto no fue prevenido por los 14 días de tratamiento con DMI a animales
estresados (Fig. 10 C) siendo el valor de la razón de este grupo experimental significativamente
mayor que los animales control (p<0,05). Por el contrario, la razón P-CREB/CREB de animales
no estresados y tratados crónicamente con DMI es similar al de los animales control (Fig. 10 B).
No se determinaron los niveles de CREB total o fosforilado en animales tratados con HAL.
59
A
C
B
CREB/β-ACTINA
P-CREB/CREB
Razón P-CREB/CREB
*
2
1
1
ip
.
ip
.
es
t
ric
g/
kg
0m
I1
ió
n+
D
M
ci
ón
+S
A
g/
kg
L
ip
.
ip
.
0m
I1
tr
ic
c
C
on
tr
ol
+S
A
L
ip
.
on
tr
ol
+D
M
R
R
es
R
es
tr
ic
c
R
es
t
ric
ió
n+
D
M
I1
0m
g/
kg
L
ip
.
g/
kg
0m
I1
ci
ón
+S
A
ip
.
L
on
tr
ol
+D
M
C
on
tr
ol
+S
A
C
*
0
ip
.
0
*
C
Razón CREB/ β-Actina
3
Figura 10. El estrés crónico aumenta los niveles hipocampales de CREB y P-CREB. Tras 14 días de
restricción de movimiento hay un aumento en la fosforilación de CREB, efecto que no es prevenido por
DMI. También hay un aumento en la cantidad de proteína total en relación a la β-actina. (A) Análisis
densitométrico de los inmunoblots de la proteína total expresada como razón con β-actina; (B) análisis
densitométrico de los inmunoblots de la proteína fosforilada expresada como razón con su proteína total;
(C) inmunoblots representativos de CREB, P-CREB, y β-actina (* = p<0,05 Control+SAL vs.
Restricción+SAL o vs. Control+DMI; análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico (KurskalWallis). Control+SAL n=4; Control+DMI n=4; Restricción+SAL n=4; Restricción+DMI n=4;)
60
2.1.3. Determinación por inmunohistoquímica de P-CREB:
Con la finalidad de obtener información mas detallada de las variaciones de P-CREB, se
evaluaron los cambios regionales de esta proteína fosforilada en el hipocampo, a través de
inmunohistoquímica para P-CREB. Para este análisis los resultados se expresaron como una
sumatoria de ponderaciones de las frecuencias relativas de los diferentes grados de intensidad de
la marca de P-CREB (H-score). Este tipo de análisis ha sido empleado por otros autores en el
estudio de otro tipo de marcas histoquímicas dentro del SNC (Forger, N.G., y cols., 1998,
Gonzalez, S.L., y cols., 2004, Thome, J., y cols., 2000). Este análisis se llevó a cabo con una
magnificación de 20x y con la asistencia de un software apropiado (ImageJ, NIH, EE UU).
En la Fig. 11 se muestran microfotografías representativas de las distintas áreas evaluadas: CA1,
CA3, Suprapiramidal e Infrapiramidal del GD (SupGD e InfGD, respectivamente). Se puede
observar que tanto animales control sin estresar, controles tratados con DMI, estresados
inyectados con salino y estresados que recibieron DMI durante los 14 días presentan
inmunoreactividad para P-CREB en todas las áreas evaluadas. Por otra parte los grupos de
animales control sin estresar y estresados que recibieron HAL casi no se observa
inmunoreactividad para P-CREB en el hipocampo, pero se observa inmunoreactividad en otras
áreas del cerebro (resultados no mostrados).
61
62
Figura 11. Microfotografías representativas de la inmuohistoquímica de P-CREB en diferentes regiones hipocampales. Se muestran
microfotografías tomadas a 40x de cada area considerada para el análisis de H-score, de cada condición experimental. La barra en la última
macrofotografía corresponde a 50µm. Todos los ensayos fueron realizados en forma simultánea.
Del análisis por H-score (Fig. 12 A y B) se puede inferir que no existe diferencia en la
inmunoreactividad relativa de P-CREB en las diferentes áreas hipocampales de los animales
control sin estresar (Fig. 12 A y B). El estrés crónico no indujo cambios en la inmunoreactividad
relativa de P-CREB. En cambio, el tratamiento crónico con DMI a animales sin estresar aumentó
la señal de P-CREB solo en la región CA3 (p<0,05), y no en otras áreas (Fig. 12 A). Con
respecto al tratamiento con DMI a animales estresados, se observó un aumento significativo de
la inmunoreactividad relativa de P-CREB en todas las capas neuronales analizadas (p<0,05 para
CA1, SupGD e InfGD, y p,0,01 para CA3), al compararlas con las de animales estresados que
fueron inyectados con una solución salina (Fig. 12 A).
La administración de HAL a animales control sin estresar y al grupo de ratas sometidas a
restricción de movimiento, disminuyó significativamente la inmunoreactividad relativa de
P-CREB en todas las áreas analizadas en ambos grupos experimentales (Fig. 11 y Fig 12 B).
63
A
300
H-score
250
#
200
#
#
#
*
#
150
Control+SAL ip.
100
50
0
CA1
CA3
SupGD
InfGD
B
300
Control+SAL ip.
H-score
250
200
150
100
50
0
+
+
+
*
CA1
#
#
#
+
+
+
+
+
CA3
+
+
+
+
+
Control+HAL 50µg/kg sc.
#
#
#
+
+
+
SupGD
Restricción+HAL 50µg/kg sc.
#
#
+
+
+
InfGD
Figura 12. Análisis la inmunoreactividad relativa de P-CREB en las diferentes áreas hipocampales.
El H-score se determinó al sumar las ponderaciones de las frecuencias relativas: 0 x porcentaje de células
muy débilmente teñidas + 1 x porcentaje de células levemente teñidas + 2 x porcentaje de células
moderadamente marcadas + 3 x porcentaje de células intensamente marcadas. El valor de este puntaje va
de un rango de 0 a 300, donde el valor 0 corresponde a que la muestra tiene principalmente células muy
débilmente teñidas o sin marca y 300 corresponde a que la muestra tiene todas sus células intensamente
teñidas. (A) Muestra el análisis de H-score para una serie de animales en que se incluyó el tratamiento con
DMI. La DMI por 14 días solo incrementó la señal relativa de P-CREB en CA3 de animales controles, y
en todas las regiones de animales estresados (*p<0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL; ≠ p<0,05
Control+SAL vs. Control+DMI). (B) Muestra el análisis de H-score para una serie de animales en que se
incluyó el tratamiento con HAL. En este grupo de animales, el estrés disminuyó la expresión de P-CREB
solo en CA1, y el HAL disminuyó la inmunoreactividad de este tanto en animales controles como en
estresados. (+ p<0,05, ++ p<0,01 y +++ p<0,005 Control+SAL vs. Control+HAL; # p<0,05 y ## p<0,01
Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; && p<0,01 y &&& p<0,005 Restricción+SAL vs.
Restricción+HAL). Análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kurskal-Wallis).
(Control+SAL n=4 para cada serie exprimental; Control+DMI n=4; Control+HAL n=4; Restricción+SAL
n=4 para cada serie experimental; Restricción+DMI n=4; Restricción+HAL n=4).
64
2.1.4. Determinación de cambios en el ARNm de BCL-2 por hibridación in situ:
La proteína P-CREB ejerce su acción citoprotectora al regulando la expresión de algunas
proteínas involucradas con favorecer la resiliencia celular. Una de los blancos regulados por
P-CREB es la proteína antiapoptótica es BCL-2 (D'Sa, C., y cols., 2002), y que además es una
proteína capaz de ser regulada por GCs (Cardenas, S.P., y cols., 2002). Es por esto que se
analizaron los cambios regionales del mRNA esta proteína a través de la técnica de hibridación
in situ (HIS).
En la Fig. 13 corresponde a microfotografías representativas de la HIS de BCL-2, donde se
puede observar que la señal de HIS se encuentra sobre las capas neuronales del hipocampo (CA1
a CA3 y ambas capas del GD). Además se puede observar que la señal del ARNm de BCL-2 en
animales con tratamiento crónico con DMI no es muy diferente a la de animales control.
También hay una aparente reducción de la señal del ARNm de BCL-2 en animales estresados si
se compara con los controles sin estresar, y lo mismo se observa la misma señal en animales
estresados tratados con DMI. También se puede observar que el tratamiento crónico con HAL
tanto a animales controles sin estresar y estresados, reduce de manera importante la señal del
ARNm de BCL-2 en todo el hipocampo.
65
Figura 13. Hibridación in situ para BCL-2 en hipocampo de rata. Se muestran microfotografías
representativas de cada condición experimental, tomadas con una magnificación de 2,5x. La barra negra
representa 500µm. En la primera microfotografía hay un recuadro con un detalle de la señal de hibridación
in situ correspondiente a una zona de la capa SupGD (40x). De cada animal se evaluaron los hipocampos
de ambos hemisferios en 3 a 4 cortes para el análisis densitométrico. Todos los ensayos fueron realizados
en forma simultánea.
66
El análisis densitométrico de estas microfotografías muestra que en animales controles sin
estresar, la intensidad de marca del ARNm de BCL-2 es mayor en ambas capas de GD que en las
regiones CA1 y CA3 (Fig 14 A y B), y entre ambas regiones del Cuerno de Amon, la marca del
ARNm de BCL-2 es levemente mayor en CA3 que en CA1. Este patrón no es alterado cuando
los animales control reciben DMI por 14 días (Fig. 14 A). Sin embargo, el estrés crónico por
restricción de movimiento reduce en todo el hipocampo la señal de HIS para el transcrito de
BCL-2, efecto que no es prevenido por el tratamiento con DMI (Fig. 14 A). El tratamiento con
HAL a animales control sin estresar y ratas estresadas crónicamente, reduce la señal del ARNm
de BCL-2 en todas las regiones del hipocampo.
67
A
25000
Pixels
20000
15000
10000
5000
0
* *
* *
*
**
CA1
CA3
* *
* *
*
* *
*
SupGD
Control+SAL ip.
InfGD
B
25000
Pixels
20000
*
*
*
15000
10000
5000
0
+
+
+
*
*
*
CA1
+
+
+
+
+
+
*
*
*
CA3
+
+
+
+
+
+
Control+SAL ip.
*
*
Restricción+HAL 50 µg/kg sc.
+
+
+
SupGD
+
+
+
+
+
+
InfGD
Figura 14. El estrés reduce los niveles hipocampales del ARNm de BCL-2, efecto que no es
prevenido por la DMI. En estas gráficas se muestra el patrón de expresión del transcrito de BCL-2 en
distintas regiones del hipocampo, obtenido por densitometría. A) Resultados de una serie experimental en
que se incluyó el tratamiento crónico con DMI en animales controles sin estresar y estresados por 14 días.
B) Resultados de una serie experimental en que se incluyó el tratamiento crónico con HAL en animales
controles sin estresar y estresados por 14 días. Los resultados corresponde al valor de la media de
pixels±EEM de un análisis de 3 a 4 cortes por animal (* p<0,05, ** p<0,01 y *** p<0,005 Control+SAL
vs. Restricción+SAL y Control+SAL vs. Restricción+DMI en gráfica A; +++ p<0,005 Control+SAL vs.
Control+HAL y Control+SAL vs. Restricción+HAL. Análisis realizado con el test de ANOVA no
paramétrico (Kurskal-Wallis). Control+SAL n=4 para cada serie exprimental; Control+DMI n=4;
Control+HAL n=4; Restricción+SAL n=4 para cada serie experimental; Restricción+DMI n=4;
Restricción+HAL n=4)
68
2.1.5. Determinación por inmunowestern blot de BCL-2:
Determinados los niveles de ARNm de BCL-2, se evaluó de qué manera la proteína generada
por este transcrito también cambiaba. Como primera aproximación se evaluó por inmunowestern
blot los cambios generados en el hipocampo por el tratamiento con DMI. La Fig. 15 A
corresponde a un inmunoblot representativo de BCL-2. El análisis densitométrico (Fig 15 B)
muestra que en los animales estresados crónicamente hay un aumento significativo en los niveles
de BCL-2 (p<0,05) al compararlo con los niveles de esta proteína en animales control sin
estresar. Este aumento en BCL-2, es prevenido por el tratamiento crónico con DMI en animales
sometidos a restricción de movimiento por 14 días, observándose valores significativamente más
bajos (p<0,05) que los determinados para animales estresados crónicamente y que fueron
inyectados con vehículo. Los niveles de BCL-2 de animales no estresados tratados crónicamente
con DMI no son diferentes de los niveles de los animales control. No se evaluaron los niveles de
BCL-2 en animales tratados con HAL.
69
A
B
Razón BCL-2/β-Actina
7
6
*
5
4
3
2
#
1
C
on
tr
ol
C
+S
on
A
tr
L
ol
ip
+D
.
M
I1
0m
g/
kg
R
es
ip
tr
.
i
cc
R
es
ió
tr
n
+S
ic
ci
A
ón
L
ip
+D
.
M
I1
0m
g/
kg
ip
.
0
Figura 15. El estrés induce un aumento en los niveles hipocampales de BCL-2. Tras 14 días de
restricción de movimiento hay un aumento en BCL-2, efecto que no es prevenido por DMI. A)
Inmunoblots representativos de BCL-2 y β-actina; B) Análisis densitométrico de los inmunoblots de la
proteína total expresada como razón con β-actina (* = p<0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL; # =
p<0,05 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI; análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico
(Kurskal-Wallis). Control+SAL n=4; Control+DMI n=4; Restricción+SAL n=4; Restricción+DMI n=4;)
70
2.1.6. Determinación por inmunohistoquímica de BCL-2:
Para determinar cambios regionales en el hipocampo se realizó una inmunohistoquímica para
BCL-2. Para realizar una evaluación de la variación en la intensidad de la marca se utilizó el
método de H-score, ya que la tinción que se observó en los cuerpos neuronales en el hipocampo,
y fue perinuclear, presentando diferentes niveles de intensidad que permiten realizar este tipo de
análisis. Esta evaluación también se llevó a cabo con una magnificación de 20x y con la
asistencia de un software apropiado (ImageJ, NIH, EE UU).
En la Fig. 16 se muestran microfotografías de la inmunohistoquímica de BCL-2 en diferentes
areas del hipocampo, y de cada condición experimental. En la Fig. 17 se puede observar que no
hay diferencias en la inmunoreactividad relativa entre las diferentes áreas estudiadas. El estrés
crónico por restricción de movimiento, no es capaz de disminuir la inmunoreactividad relativa de
BCL-2 en ninguna de las áreas estudiadas, al compararlas con la señal observada para los
controles sin estresar (Fig. 17 A). Por el contrario, el tratamiento con DMI a animales estresados
disminuye significativamente la inmunoreactividad de BCL-2 en todas las áreas del hipocampo,
efecto similar a lo que observado en animales control sin estresar tratados con DMI. La
administración de HAL a animales control sin estresar y los sometidos a restricción de
movimiento (Fig. 17 B), produjo una reducción significativa de la inmunoreactividad relativa de
BCL-2 en todas las áreas hipocampales estudiadas.
71
72
Figura 16. Microfotografías representativas de la inmunohistoquímica de BCL-2 en diferentes regiones del hipocampo. Se muestran
microfotografías tomadas a 40x de cada area considerada para el análisis de H-score, de cada condición experimental. La barra en la última
macrofotografía corresponde a 50µm. Todos los ensayos fueron realizados en forma simultánea.
A
300
H-score
250
200
150
+
+
+
100
#
#
#
+
+
+
+
+
#
#
+
+
+
#
#
#
+
+
+
+
+
#
#
#
Control+SAL ip.
+
+
+
50
0
CA1
CA3
SupGD
InfGD
B
300
Control+SAL ip.
H-score
250
#
#
#
200
150
100
+
+
+
+
+
+
+
+
#
#
+
+
+
#
#
+
+
+
#
#
+
+
50
0
CA1
CA3
SupGD
InfGD
Figura 17. Efecto del estrés crónico y del tratamiento con DMI en la inmunoreactividad relativa de
BCL-2 en el hipocampo de rata. El H-score se determinó al sumar las ponderaciones de las frecuencias
relativas: 0 x porcentaje de células muy débilmente teñidas + 1 x porcentaje de células levemente teñidas
+ 2 x porcentaje de células moderadamente marcadas + 3 x porcentaje de células intensamente teñidas. El
valor de este puntaje va de un rango de 0 a 300, donde 0 corresponde a que la muestra tiene
principalmente células muy débilmente teñidas o bien sin teñir, y 300 corresponde a que la muestra tiene
todas sus células intensamente teñidas. A) Análisis de H-score para una serie de animales en que se
incluyó el tratamiento con DMI (+ p<0,05, ++ p<0,01 y +++ p<0,005 Control+SAL vs. Control+DMI y
Control+SAL vs. Restricción+DMI; ## p<0,01 y ### p<0,005 Restricción+SAL vs. Restricción+DMI)
Los valores corresponden a la media±EEM del análisis de H-score realizado en 3 a 4 cortes por animal..
(B) Análisis de H-score para una serie de animales en que se incluyó el tratamiento HAL (+ p<0,05, ++
p<0,01 y +++ p<0,005 Control+SAL vs. Control+HAL y vs Restricción+HAL; ## p<0,01 y ### p<0,005
Restricción+SAL vs. Restricción+HAL). Los valores corresponden a la media±EEM del análisis de
H-score realizado en 3 a 4 cortes por animal. En A y en B se comparan los efectos de los fármacos con los
mismos animales Control+SAL y Restricción+SAL. Análisis realizado con el test de ANOVA no
paramétrico (Kurskal-Wallis). Control+SAL n=4; Control+DMI n=4; Control+HAL n=4;
Restricción+SAL n=4; Restricción+DMI n=4; Restricción+HAL n=4)
73
2.1.7. Determinación de cambios en el ARNm de BDNF por hibridación in situ:
El BDNF es un factor neurotrófico que participa en procesos asociados a la resiliencia celular,
dado que esta neurotrofina es capaz de regular la expresión de otras proteínas que promueven la
sobrevida celular (D'Sa, C., y cols., 2002). Además, si la sobrevida neuronal depende de la
actividad de la célula, un aumento en el número de contactos sinápticos favorece a la resiliencia
celular (D'Sa, C., y cols., 2002, Nestler, E.J., y cols., 2002). Este proceso es favorecido por el
BDNF ya que es una neurotrofina asociada a procesos de neuroplasticidad, como por ejemplo
favorecer la arborización dendrítica (D'Sa, C., y cols., 2002, Manji, H.K., y cols., 2001b, Nestler,
E.J., y cols., 2002, Schaaf, M.J., y cols., 1998, Tapia-Arancibia, L., y cols., 2004). También, la
expresión de BDNF puede ser inhibida por GCs (Schaaf, M.J., y cols., 1998, Smith, M.A., y
cols., 1995, Tapia-Arancibia, L., y cols., 2004), y estimulada por antidepresivos (Nibuya, M., y
cols., 1995, Nibuya, M., y cols., 1996), y por CREB (Finkbeiner, S., y cols., 1997, Nibuya, M., y
cols., 1995, Russo-Neustadt, A., y cols., 1999); por lo que se analizaron los efectos de las
distintas condiciones experimentales en la expresión del ARNm de BDNF las diferentes áreas
del hipocampo.
En la Fig. 18, se muestran microfotografías representativas de cada condición experimental, en
donde so observa que la marca de HIS de BDNF se detectó principalmente en las capas
neuronales del hipocampo de rata (CA1, CA3, SupGD e InfGD). Luego de un análisis
densitométrico (Fig. 19 A y B), se puede observar que el estrés crónico por restricción de
movimiento redujo significativamente la señal del ARNm de BDNF en todas las capas
estudiadas del hipocampo (Fig. 19 A y B), observando una reducción significativamente mayor
en la serie de animales en que se incluyó el tratamiento con HAL (Fig. 19 B). Esta reducción
sólo fue prevenida por el tratamiento con DMI en la región CA3 de animales estresados
crónicamente (Fig. 19 A), donde se observa un aumento significativo en la señal de HIS para
BDNF, en comparación con la misma área de animales estresados que fueron inyectados con
salino. En los animales control tratados crónicamente con DMI no se observaron diferencias en
comparación con los animales control inyectados diariamente con vehículo.
En el caso de los animales tratados con HAL, este tratamiento redujo significativamente la señal
del transcrito de BDNF en todo el hipocampo, tanto en animales controles sin estresar como en
74
animales sometidos a estrés crónico por 14 días (Fig. 19 B). No se realizó análisis por
inmunohistoquímica de la proteína BDNF.
75
Figura 18. Hibridación in situ para BDNF en hipocampo de rata. Se muestran microfotografías
76
A
30000
20000
Pixels
*
*
#
*
10000
0
Control+SAL ip.
*
CA1
CA3
SupGD
InfGD
B
30000
*
*
Pixels
20000
10000
0
+
+
+
*
*
CA1
#
#
#
+
+
+
+
+
*
*
CA3
#
+
+
+
+
+
+
*
#
#
#
+
+
+
SupGD
+
+
+
#
#
#
+
+
+
Control+SAL ip.
InfGD
Figura 19. El estrés crónico reduce los niveles hipocampales del ARNm de BDNF, efecto que solo es
prevenido por DMI en la región CA3. En estas gráficas se muestra el patrón de expresión del transcrito
de BDNF en distintas regiones del hipocampo, obtenido por densitometría. A) Resultados de una serie
experimental en que se incluyó el tratamiento crónico con DMI en animales controles sin estresar y
estresados por 14 días (* p<0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL; # p<0,05 Restricción+SAL vs.
Restricción+DMI) Los resultados corresponde al valor de la media de pixels ±EEM de un análisis de 3 a 4
cortes por animal. B) Resultados de una serie experimental en que se incluyó el tratamiento crónico con
HAL en animales controles sin estresar y estresados por 14 días. (* p<0,05 y ** p<0,01 Control+SAL vs.
Restricción+SAL; ++ p<0,01 y +++ p<0,005 Control+SAL vs. Control+HAL y Control+SAL vs.
Restricción+HAL; # p<0,05 y ### p<0,005 Restricción+SAL vs. Restricción+HAL) Los resultados
corresponde al valor de la media de pixels ±EEM de un análisis de 3 a 4 cortes por animal. Análisis
realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kruskal-Wallis). Control+SAL n=4 para cada serie
exprimental; Control+DMI n=4; Control+HAL n=4; Restricción+SAL n=4 para cada serie experimental;
Restricción+DMI n=4; Restricción+HAL n=4)
77
Los análisis realizados por inmunowestern blot y por técnicas histoquímicas indican que tanto el
estrés crónico por restricción de movimiento y el tratamiento crónico con DMI producen
cambios diferentes en la expresión hipocampal de marcadores asociados a la resiliencia celular.
La activación de ERK1/2 ocurre solo por efecto del estrés crónico, y este efecto fue prevenido
por la administración del antidepresivo. Por el contrario, no se observaron los mismos cambios
en P-CREB, donde por inmunowestern blot se observó que el estrés crónico por restricción de
movimiento aumenta los niveles de P-CREB, efecto que no es prevenido por la administración
de DMI. Algo similar ocurre con el análisis histoquímico para P-CREB, en donde el aumento
más significativo se observó en aquellos animales sometidos a restricción de movimiento que
recibieron DMI. También se evaluó el efecto del estrés y de la DMI sobre la expresión de
marcadores asociados a la resiliencia celular, cuya regulación puede ser modulada por P-CREB
y GCs como lo son BCL-2 y BDNF. Se observó que el ARNm de BCL-2 disminuye por estrés
crónico, efecto que no es prevenido por la administración de DMI, sin embargo, en la condición
de estrés los niveles de la proteína BCL-2 son altos a pesar de la reducción de su transcrito. Este
último efecto es prevenido por DMI, lo que sugiere una compleja interacción entre el estrés, la
acción de la DMI y la regulación de la proteína de BCL-2 en el hipocampo de rata. También, el
ARNm de BDNF se reduce en todo el hipocampo por efecto del estrés, disminución que sólo es
prevenida por la DMI en la región CA3 del hipocampo. Todos estos cambios en BCL-2 y BDNF
no son concordantes con los cambios en P-CREB. Además, el tratamiento con HAL pareciera
indicar que a través de la modulación de otro sistema neurotransmisor si existiese una relación
entre los niveles de P-CREB, BCL-2 y BDNF, sin embargo este efecto es observado tanto en
animales controles sin estresar como en ratas sometidas a restricción de movimiento.
2.1.8. Determinación de cambios en el ARNm de TGF-β1 por hibridación in situ:
Se evaluó de qué manera el estrés crónico por restricción de movimiento y el tratamiento con
DMI pueden afectar la expresión del ARNm de TGF-β1 en el hipocampo de rata. En la Fig. 20
se aprecian microfotografías representativas de la HIS para el transcrito de TGF-β1 para las
distintas condiciones experimentales evaluadas. El análisis densitométrico correspondiente
(Fig. 21 A y B), se puede destacar que el ARNm de TGF-β1 disminuye significativamente en
todas las áreas del hipocampo por efecto del estrés crónico (Fig. 21 A y B), comparado con los
respectivos controles sin estresar. Este efecto es completamente prevenido por el tratamiento
78
crónico con DMI a animales sometidos a restricción de movimiento durante 14 días continuados
(Fig. 21 A), donde se puede observar que la señal de HIS para TGF-β1, es similar a la de
animales controles sin estresar y que es significativamente mayor a la de los animales estresados
inyectados sólo con la solución salina (Fig. 21 A). El tratamiento con DMI a animales sin
estresar no produjo cambios en la expresión del transcrito de TGF-β1. Por otra parte, el
tratamiento con HAL a animales estresados crónicamente y a controles sin estresar reduce
significativamente la señal del transcrito de TGF-β1 en todo el hipocampo (Fig. 21 B), no
pudiendo observar algún efecto de prevención de la reducción de esta marca como se observó
para el tratamiento crónico con DMI a animales estresados crónicamente.
79
Figura 20. Hibridación in situ para TGF-β1 en hipocampo de rata. Se muestran microfotografías
80
45000
#
#
#
#
#
Pixels
30000
#
#
*
*
0
*
*
15000
CA1
CA3
SupGD
InfGD
45000
Pixels
30000
15000
0
+
+
+
*
*
*
CA1
Control+SAL ip.
+
+
+
+
*
*
CA3
+
+
+
+
+
*
*
+
+
+
SupGD
+
+
+
*
*
*
+
+
+
Control+SAL ip.
InfGD
Figura 21. El estrés crónico reduce los niveles del ARNm de TGF-β1 en todo el hipocampo, efecto
que se previene por la DMI. En estas gráficas se muestra el patrón de expresión del transcrito de TGF-β1
en distintas regiones del hipocampo, obtenido por densitometría. (A) Resultados de una serie experimental
en que se incluyó el tratamiento crónico con DMI en animales controles sin estresar y estresados por 14
días (* p<0,05 Control+SAL vs. Restricción+SAL; # p<0,05, ## p<0,01 y ### p<0,005 Restricción+SAL
vs. Restricción+DMI) Los resultados corresponde al valor de la media de pixels ±EEM de un análisis de 3
a 4 cortes por animal. (B) Resultados de una serie experimental en que se incluyó el tratamiento crónico
con HAL en animales controles sin estresar y estresados por 14 días. (** p<0,01 y *** p<0,005
Control+SAL vs. Restricción+SAL; + p<0,05, ++ p<0,01 y +++ p<0,005 Control+SAL vs. Control+HAL
y vs. Restricción+HAL) Los resultados corresponde al valor de la media de pixels±EEM de un análisis de
3 a 4 cortes por animal. Análisis realizado con el test de ANOVA no paramétrico (Kurskal-Wallis).
Control+SAL n=4 para cada serie exprimental; Control+DMI n=4; Control+HAL n=4; Restricción+SAL
n=4 para cada serie experimental; Restricción+DMI n=4; Restricción+HAL n=4)
81
A pesar de la buena correlación entre los cambios conductuales observados y los cambios en la
expresión del ARNm de TGF-β1 en el hipocampo, por efecto del estrés y el tratamiento crónico
con DMI, no fue posible realizar un análisis inmunohistoquímico de este factor de crecimiento,
principalmente por que los anticuerpos disponibles (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EE UU y
Chemicon, Temecula, CA, EE UU) no fueron capaces de detectar la señal de la proteína de
TGF-β1.
Resulta interesante como los cambios en el ARNm de TGF-β1 se correlacionan con los cambios
conductuales en los diferentes grupos experimentales: en animales estresados donde el ARNm
de este factor de crecimiento presentó niveles significativamente menores que animales
controles sin estresar, hay una reducción en la capacidad de adquirir respuestas condicionadas,
fallan en escapar de estímulos nocivos, presentan desesperanza aprendida, y tienen una
reducción significativa en la preferencia a una solución endulzada como agua de bebida. Estos
efectos son prevenidos por el tratamiento crónico con DMI, incluyendo la reducción
significativa del transcrito de TGF-β1 a nivel hipocampal, sugiriendo que para el efecto de la
DMI es necesario niveles adecuados de TGF-β1.
Se ha descrito que la DMI es capaz de modular la expresión del ARNm de otras citoquinas como
TNF-α, cuya expresión en el Locus Ceruleus y el hipocampo disminuye por efecto del
tratamiento con DMI por 14 días (Ignatowski, T.A., y cols., 1997, Nickola, T.J., y cols., 2001,
2005b). También, el TNF-α puede alterar la liberación de NA desde el hipocampo. En animales
control inhibe la liberación de NA desde cortes de hipocampo, mientras que en animales no
estresados tratados crónicamente con DMI la liberación de NA en presencia de TNF-α es
potenciada, estos cambios ocurren probablemente modificando la actividad o la sensibilidad del
autoreceptor inhibitorio α2 (Ignatowski, T.A., y cols., 1997, Nickola, T.J., y cols., 2001,
2005b). En contraste, TGF-β1, es una citoquina clásicamente descrita como antiinflamatoria en
el sistema inmune (Cerwenka, A., y cols., 1999, Janeway, C., y cols., 2001), y que por lo tanto
antagoniza los procesos inflamatorios mediados por TNF-α (Janeway, C., y cols., 2001).
También el ARNm de TGF-β1 cambia su expresión hipocampal por efecto del estrés y por el
82
tratamiento crónico con DMI a animales estresados. Es por esto que se buscó establecer de qué
manera el estrés crónico y el tratamiento con DMI afectan la liberación de NA desde el
hipocampo, cómo las diferentes condiciones experimentales afectan la sensibilidad del receptor
α2, y si la presencia de TGF-β1 modifica la liberación de NA así como se ha descrito para
TNF-α.
3. Cambios en la sensibilidad del receptor α2 adrenérgico inducidos por estrés crónico:
Para evaluar la actividad del receptor α2 presináptico se estableció un ensayo de liberación de 3H
en estanco desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA. Para esto, fue
necesario establecer las condiciones para estimular la liberación de 3H al medio de incubación,
evaluar la dependencia de Ca2+ de esta liberación y la concentración de agentes farmacológicos
para evaluar la actividad del autoreceptor α2.
3.1. Efecto de la depolarización con K+ 25mM y dependencia de Ca2+ en la liberación 3H desde
cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA:
En la Fig. 22, se muestra el porcentaje de liberación fraccional de 3H de un ensayo de liberación
hipocampal con dos estímulos sucesivos de depolarización con K+ 25mM (Fig. 22 A), y un
ensayo de liberación en que en el segundo estímulo (E2) no se agregó Ca2+ al medio de
incubación y mas aun se agregó EGTA 1mM (Fig. 22 B). Esta última determinación se realizó
con el fin establecer si la liberación observada corresponde a mecanismos dependientes de Ca2+,
ya que el mecanismo de liberación de neurotransmisores presente en neuronas es dependiente de
éste catión bivalente (De Langen, C.D., y cols., 1980). Como se observa en la Fig. 22 A, el
hipocampo es capaz de liberar 3H en dos estímulos depolarizantes sucesivos. La concentración
de K+ 25mM se determinó en ensayos previos donde se evaluaron concentraciones de 12,5, 25 y
50 mM de K+ en cortes de hipocampo y de corteza, observándose que con la concentración más
baja de K+ no hubo liberación de 3H, mientras que con 50 mM de K+ la liberación fue muy alta,
que probablemente no permitirían observar los efectos de agonistas o antagonistas del receptor
α2 presináptico, por lo que se estableció que 25 mM sería la concentración de trabajo (resultados
no mostrados). En la Fig. 22 B se observa que el Ca2+ es importante para la liberación de 3H, ya
83
que la ausencia de este ion en el medio en conjunto con la presencia de EGTA 1mM como
agente quelador de Ca2+, reducen significativamente la liberación de 3H, lo que sugiere la
participación de mecanismos de liberación dependientes de Ca2+.
84
Figura 22. Liberación de 3H desde cortez de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA,
estimulada por depolarización con K+ 25mM en presencia y ausencia de Ca2+. En las gráficas se
señala con una flecha el inicio de cada estímulo, y la barra negra señala el tiempo en que los tejidos
estuvieron en presencia de un exceso de K+ (30s). También se destaca el área bajo la curva de cada
estímulo menos el valor del promedio de las determinaciones basales A) % de liberación fraccional de 3H
con dos estímulos sucesivos (E1 y E2) de K+ 25mM . B) % de liberación fraccional de 3H donde en el
segundo estímulo (E2) no se agregó Ca2+ y además se agregó EGTA 1mM. La barra gris indica el período
de tiempo en que se realizó el estímulo en ausencia de Ca2+. Todos los ensayos de liberación se realizaron
en presencia de ácido ascórbico al 1% (Animales control sin manipular n=3).
85
3.2. Efecto de la depolarización con K+ 25mM y en la liberación de 3H desde cortes de
hipocampo recientemente cargados con 3H-NA en presencia de Yohimbina y Clonidina:
El utilizar dos estímulos con K+ 25mM permite estudiar el efecto de alguna sustancia o algún
fármaco en la liberación del neurotransmisor. La introducción de estos compuestos se puede
hacer en el segundo estímulo (E2), lo que deja al primer estímulo (E1) como referente de la
liberación de 3H frente a una depolarización con K+. De esta forma se procedió a evaluar el
efecto de agentes farmacológicos capaces de modular la actividad del receptor α2: Yohimbina
(Yoh) que actúa como antagonista del receptor α2, y Clonidina (Clo) que es un agonista de este
mismo receptor.
En la Fig. 23, se puede observar el efecto de Yoh 5µM (Fig. 23 A), y de la Clo 5µM (Fig. 23 B)
en la liberación fraccional de 3H desde cortes de hipocampo de animales controles sin manipular.
Estos fármacos se incluyeron en el medio de incubación desde los 3 lavados de 10min previos a
la liberación en el E2, y se mantuvieron presentes durante los 3,5min que dura el ensayo de
liberación (barra gris Figs. 23 A y B). En la Fig. 23 A, se puede apreciar que la presencia de la
Yoh 5µM, aumenta la liberación de 3H, cuando se compara el E2 con el E1, ya que al estar
bloqueada la señalización del autoreceptor α2, no hay inhibición de la liberación presináptica, y
por lo tanto es posible detectar una mayor cantidad de 3H liberada al medio. Por el contrario, la
presencia de Clo 5µM (Fig. 23 B) disminuye la liberación de 3H, al comparar el E2 con el E1, ya
que al estimular el receptor α2 presináptico, hay una disminución en la liberación de 3H al
medio.
86
Figura 23. Efectos de la Yoh 5µM y Clo 5µM en la liberación de 3H desde cortes de hipocampo
recientemente cargados con 3H-NA por depolarización con K+ 25mM. En las gráficas se señala con
una flecha el inicio de cada estímulo, y la barra negra señala el tiempo en que los tejidos estuvieron en
presencia de un estímulo depolarizante con K+ (30s). También se destaca el área bajo la curva de cada
estímulo menos el valor del promedio de las determinaciones basales A) % de liberación fraccional de 3H
donde en el segundo estímulo (E2) se agregó Yoh 5µM. La barra gris indica el periodo de tiempo en que
se realizó el estímulo en presencia de Yoh . B) % de liberación fraccional de 3H donde en el segundo
estímulo (E2) se agregó Clo 5µM. La barra gris indica el periodo de tiempo en que se realizó el estímulo
en presencia de Clo. Todos los ensayos de liberación se realizaron en presencia de ácido ascórbico al 1%
(Animales control sin manipular n=3).
87
3.3. Relación entre las áreas bajo la curva de la liberación fraccional de cada condición
experimental:
Los valores de las áreas bajo la curva de cada estímulo (E1 y E2), calculados como el área
comprendida por el estímulo y sus correspondientes post-estímulos, menos el valor promedio de
las determinaciones basales, permiten establecer una comparación entre los distintos agentes
farmacológicos y las modificaciones realizadas en el E2. Para esto se calculó una razón entre los
valores de área bajo la curva de E2 y la de E1 (E2/E1). En la Fig. 24 se puede observar que
aunque los dos estímulos de K+ 25mM debieran haber entregado valores similares de áreas bajo
la curva, la razón E2/E1 de estos ensayos es un poco mayor a la unidad, por que en el E2 la
liberación fue levemente mayor que en el E1. La aplicación de Yoh 5µM en el segundo estímulo
produjo un aumento en la liberación de 3H, reflejado en un mayor valor en la razón E2/E1 para
esta condición experimental, lo que es concordante con el efecto de un antagonista del receptor
α2 presináptico. Por el contrario, al utilizar un agonista del receptor α2, como la Clo, se observó
una reducción en la liberación de 3H, que tiene su reflejo en un menor valor en la razón E2/E1
(Fig. 24) en comparación con la de la razón de dos estímulos de K+ 25mM. Finalmente la razón
de E2/E1 del ensayo en el que se removió el Ca2+ en E2, entrega un valor bastante más bajo, que
la razón E2/E1 donde se utilizó Clo 5µM. Este último resultado permite establecer que la
liberación de 3H es dependiente de Ca2+, como en los mecanismos de liberación presentes en
neuronas (De Langen, C.D., y cols., 1980, Forray, M.I., y cols., 1995).
88
2.5
*
Razón E2/E1
2.0
1.5
1.0
*
0.5
*
2+
m
M
/K
+
25
m
M
s/
C
a
5µ
M
lo
n
M
+C
m
25
K
+
25
+
/K
25
m
M
+
K
K
+
25
m
M
/K
+
K
+
25
m
M
25
m
M
/K
+Y
oh
+
m
25
m
M
5µ
M
0.0
Figura 24. La liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA
depende de Ca2+, y es sensible a agonistas y antagonistas del receptor α2. Se muestra el valor de la
razón entre el área bajo curva de E2 y la de E1, en diferentes ensayos de liberación en que se incluyeron
Yoh 5µM, Clo 5 µM y un ensayo en el que se removió el Ca2+ del medio de incubación. Los valores
representan media de las razones E2/E1±EEM. Esta determinación se realizó con 3 animales controles sin
manipulación previa, y para cada animal se realizaron cada una de las determinaciones indicadas en la
gráfica. (*=p<0,05 al compararlos con K+ 25mM/K+ 25mM)
Establecidas las condiciones de la liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados con
3
H-NA, tal como la dependencia de Ca2+, y las concentraciones de Yoh y Clo adecuadas para
observar los efectos descritos para estos fármacos, se evaluó si por efecto del estrés crónico por
restricción de movimiento y del tratamiento crónico con DMI hay cambios en la actividad del
receptor α2 presináptico. Además se estudió si el TGF-β1 agregado al medio de incubación es
capaz de ejercer algún efecto en la liberación de 3H.
89
3.4 Efecto de Yohimbina, Clonidina y TGF-β1 en la liberación 3H desde cortes de hipocampo
recientemente cargados con 3H-NA:
3.4.1. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo de ratas control sin estresar recientemente
cargados con 3H-NA, y efecto de Yohimbina, Clonidina y TGF-β1:
Con el fin de establecer de qué manera el estrés crónico y el tratamiento con DMI afectan la
liberación de NA desde el hipocampo, la sensibilidad del receptor α2, y si la presencia de
TGF-β1 modifica la liberación de NA así como se ha descrito para otras citoquinas, es que se
realizó el ensayo de liberación de 3H en animales control sin estresar, a los que se les manipuló
diariamente, y se les inyectó una solución de salino ip. durante 14 días. En la Fig. 25, se puede
observar el patrón de liberación cuando se aplican dos estímulos con K+ 25mM (Fig. 25 A),
cuando en el E2 se agregó Yoh 5µM (Fig. 25 B), con Clo 5µM en el E2 (Fig. 25 C) y con
TGF-β1 en el medio de incubación del segundo estímulo (Fig. 25 D).
90
Figura 25. Liberación de 3H desde hipocampo de animales control sin estresar, recientemente
cargados con 3H-NA. En cada gráfica se señala con una flecha el inicio de cada estímulo, y la barra negra
señala el tiempo en que los tejidos estuvieron en presencia de un exceso de K+ (30s). También se destaca
el área bajo la curva de cada estímulo menos el valor del promedio de las determinaciones basales, y
además se indica el valor de esta área. (A) Ensayo de liberación con 2 estímulos de K+ 25mM. (B) Ensayo
de liberación con Yoh 5µM en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en
presencia de la Yoh. (C) Ensayo de liberación con Clo 5µM en E2, la barra gris indica el periodo de
tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de la Clo. (D) Ensayo de liberación con TGF-β1
10ng/mL en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de
TGF-β1. (n=4 animales, y por cada animal se realizaron las 4 condiciones diferentes en forma simultanea)
El análisis de las razones de las áreas bajo la curva (Fig. 29 A) mostró que, los dos estímulos de
K+ 25mM son muy similares, entregando un valor de E2/E1 muy cercano a la unidad. También
se observa el efecto significativo de la Yoh y la Clo en la liberación de 3H, siendo el efecto de la
Yoh bastante mayor que el de la Clo para este grupo de animales. El TGF-β1 en el medio de
cultivo, disminuye la liberación de 3H (Fig. 29 A), disminución que es significativa al comparar
el valor de esta razón de este ensayo de liberación con la de los dos estímulos de K+ 25mM.
91
3.4.2. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados recientemente con 3H-NA, de
ratas control sin estresar tratadas crónicamente con Desipramina. Efecto de Yohimbina,
Clonidina y TGF-β1:
A continuación se estudió de qué manera el tratamiento crónico con DMI a animales controles
sin estresar, afecta la actividad del receptor α2 en el hipocampo de rata. En la Fig. 26, se puede
observar el patrón de liberación cuando se hacen dos estímulos con K+ 25mM (Fig. 26 A),
cuando en el E2 se agregó Yoh 5µM (Fig. 26 B), con Clo 5µM en el E2 (Fig. 26 C) y con
TGF-β1 0,4nM en el medio de incubación del segundo estímulo (Fig. 26 D)
92
Figura 26. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados con 3H-NA, de animales control
tratados crónicamente con DMI. En cada gráfica se señala con una flecha el inicio de cada estímulo, y la
barra negra señala el tiempo en que los tejidos estuvieron en presencia de un exceso de K+ (30s). También
se destaca el área bajo la curva de cada estímulo menos el valor del promedio de las determinaciones
basales, y además se indica el valor de esta área. (A) Ensayo de liberación con 2 estímulos de K+ 25mM.
(B) Ensayo de liberación con Yoh 5µM en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes
estuvieron en presencia de la Yoh. (C) Ensayo de liberación con Clo 5µM en E2, la barra gris indica el
periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de la Clo. (D) Ensayo de liberación con
TGF-β1 10ng/mL en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en
presencia de TGF-β1. (n=4 animales, y por cada animal se realizaron las 4 condiciones diferentes en
forma simultanea)
Del análisis de las razones E2/E1 (Fig. 29 B) de cada ensayo de liberación se desprende que, al
igual que en los animales controles sin estresar y sin manipular, los dos estímulos solo con
K+ 25mM tienen áreas bajo la curva similares y que hacen que E2/E1 sea muy similar a la
unidad. También, se observa el efecto de la Yoh 5µM como antagonista α2, entregando un valor
de E2/E1 mayor que la de los estímulos solo con K+ 25mM, sin embargo, este efecto no es tan
grande como el observado en los animales control inyectados con una solución salino
93
(Fig. 29 A). Además se observa que la Clo 5µM en estos animales no tiene mayor efecto al
comparar el valor de E2/E1 con la razón del ensayo hecho solo con depolarización con
K+ 25mM. Por el contrario, TGF-β1 generó un aumento en el eflujo de 3H, que se refleja en una
E2/E1 significativamente mayor que la de los dos estímulos solo con K+ 25mM. Esta situación
es opuesta a la observada para animales control inyectados con vehículo, en donde se observó
que el TGF-β1 0,4nM producía una disminución en el eflujo de 3H.
3.4.3. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados recientemente con 3H-NA, de ratas
estresadas crónicamente, y efecto de Yohimbina, Clonidina y TGF-β1:
Evaluados los efectos de la administración crónica del antidepresivo DMI a animales control sin
estresar, se evaluó el efecto del estrés crónico por restricción de movimiento en la actividad del
receptor α2 hipocampal. En la Fig. 27, se puede observar el patrón de liberación cuando se hacen
dos estímulos con K+ 25mM (Fig. 27 A), cuando en el E2 se agregó Yoh 5µM (Fig. 27 B), con
Clo 5µM en el E2 (Fig. 27 C) y con TGF-β1 en el medio de incubación del segundo estímulo
(Fig. 27 D).
94
Figura 27. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados con 3H-NA, de animales estresados
crónicamente. En cada gráfica se señala con una flecha el inicio de cada estímulo, y la barra negra señala
el tiempo en que los tejidos estuvieron en presencia de un exceso de K+ (30s). También se destaca el área
bajo la curva de cada estímulo menos el valor del promedio de las determinaciones basales, y además se
indica el valor de esta área. (A) Ensayo de liberación con 2 estímulos de K+ 25mM. (B) Ensayo de
liberación con Yoh 5µM en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en
presencia de la Yoh. (C) Ensayo de liberación con Clo 5µM en E2, la barra gris indica el periodo de
tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de la Clo. (D) Ensayo de liberación con TGF-β1
10ng/mL en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de
TGF-β1. (n=4 animales, y por cada animal se realizaron las 4 condiciones diferentes en forma simultanea)
El análisis de las razones de las áreas bajo la curva (Fig. 29 C), reveló que los dos estímulos con
K+ 25mM son de similar magnitud, entregando un valor de E2/E1 muy cercano a la unidad. La
Yoh 5µM tuvo un efecto muy leve sobre el eflujo de 3H, que generó un aumento no significativo
en el valor de E2/E1 en comparación con E2/E1 del ensayo con dos estímulos de K+ 25Mm. Por
el contrario, en estos animales estresados crónicamente, la Clo tuvo un efecto significativo, que
se refleja como una disminución en el valor de E2/E1, en comparación con la misma razón de
los ensayos con solo dos estímulos de K+ 25mM. Además, en este grupo de animales, la
95
presencia de TGF-β1 en el medio de incubación generó un aumento no significativo en el eflujo
de 3H, que genera un valor para E2/E1 mayor que la del ensayo con dos estímulos de K+.
Aunque aquí no hay un aumento significativo, el efecto de TGF-β1 en la liberación de 3H es
similar al observado en animales no estresados inyectados crónicamente con DMI (Fig. 29 B), y
por lo tanto opuesto a lo observado para animales controles sin estresar (Fig. 29 A)
3.4.4. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados recientemente con 3H-NA, de ratas
estresadas crónicamente tratadas con Desipramina, y efecto de Yohimbina, Clonidina y
TGF-β1:
Una vez evaluado el efecto del estrés crónico por restricción de movimiento en la actividad del
receptor α2 adrenérgico en el hipocampo de rata, se estudió el efecto del tratamiento crónico con
DMI a animales estresados durante 14 días continuos. En la Fig. 28, se puede observar el patrón
de liberación cuando se hacen dos estímulos con K+ 25mM (Fig. 28 A), cuando en el E2 se
incluyó Yoh 5µM (Fig. 28 B), con Clo 5µM en el E2 (Fig. 28 C) y con TGF-β1 en el medio de
incubación del segundo estímulo (Fig. 28 D).
96
Figura 28. Liberación de 3H desde cortes de hipocampo cargados con 3H-NA, de animales estresados
crónicamente tratados con DMI. En cada gráfica se señala con una flecha el inicio de cada estímulo, y la
barra negra señala el tiempo en que los tejidos estuvieron en presencia de un exceso de K+ (30s). También
se destaca el área bajo la curva de cada estímulo menos el valor del promedio de las determinaciones
basales, y además se indica el valor de esta área. (A) Ensayo de liberación con 2 estímulos de K+ 25mM.
(B) Ensayo de liberación con Yoh 5µM en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes
estuvieron en presencia de la Yoh. (C) Ensayo de liberación con Clo 5µM en E2, la barra gris indica el
periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en presencia de la Clo. (D) Ensayo de liberación con
TGF-β1 10ng/mL en E2, la barra gris indica el periodo de tiempo en que los cortes estuvieron en
presencia de TGF-β1. (n=4 animales, y por cada animal se realizaron las 4 condiciones diferentes en
forma simultanea)
El análisis de las razones de las áreas bajo la curva (Fig. 29 D) de cada ensayo de liberación
mostró que las magnitudes de los dos estímulos solo con K+ 25mM son similares, al entregar un
valor de E2/E1 muy cercano a la unidad. También es posible observar un efecto de la Yoh 5µM
en función de E2/E1, aunque el valor de esta razón no es significativamente mayor que la E2/E1
del ensayo con sólo dos estímulos con K+ 25mM. Además, también se observa un efecto
significativo de la Clo 5µM en comparación con la E2/E1 de la liberación de 3H-NA con sólo
dos estímulos de K+ 25mM. Finalmente, TGF-β1 0,4nM en el medio de incubación produce un
97
aumento en el eflujo de 3H, lo que se refleja como un aumento significativo de la E2/E1 de este
ensayo en comparación con la razón del ensayo donde soló se realizaron estímulos con K+
25mM. Este efecto es similar a lo observado en animales controles no estresados tratados
crónicamente con DMI (Fig. 29 B), y de alguna manera también es similar a lo que ocurre con
animales sometidos a estrés crónico y que sólo recibieron una inyección diaria de solución salina
(Fig. 29 C), aunque en esta última condición experimental, el aumento causado por la presencia
de TGF-β1 10ng/mL en el medio de incubación no fue significativo.
98
B
A
Control+SAL ip.
3
Razón E2/E1
4.5
4
3
0
β1
TG
F-
lo
+
C
M
25
m
+
/K
m
25
+
25
K
K
+
25
+
K
5µ
M
5µ
M
+
m
25
M
/K
M
m
M
m
25
m
+
M
+
+
25
+
+
K
/K
+
M
/K
25
25
m
m
M
M
m
M
+
/K
+
Yo
h
25
m
Fβ
M
1
M
TG
5µ
lo
C
+
M
25
m
+
M
/K
K
K
K
+
+
25
m
25
m
M
/K
K
+
+
25
25
m
m
M
M
+
/K
+
Yo
h
5µ
25
m
M
M
0
D
C
4
2
1
*
Restricción+DMI ip.
4
3
Razón E2/E1
3
*
2
1
0
*
1
TG
+
M
+
m
M
+
25
25
m
+
+
K
K
25
m
M
/K
+
m
M
/K
Fβ
5µ
M
C
lo
5µ
M
Yo
h
+
M
+
+
K
25
m
M
/K
+
K
25
m
m
M
+
M
/K
25
M
+
/K
+
TG
25
Fβ
m
M
1
M
5µ
lo
C
+
M
25
m
K
+
25
m
+
M
/K
+
K
25
m
+
K
25
m
M
/K
K
+
+
25
25
m
m
M
M
+
/K
+
Yo
h
5µ
25
m
M
M
0
25
Razón E2/E1
*
1
*
*
1
*
2
25
m
Razón E2/E1
5.5
2
Control+DMI ip.
4
*
6.5
Figura 29. Razones E2/E1 de ensayos de liberación de 3H en animales control sin estresar, control
tratados con DMI, estresados crónicamente, y estresados tratados con DMI. Se muestran los valores
de la razones E2/E1, en los diferentes ensayos de liberación en que se incluyeron Yoh 5µM, Clo 5 µM y
TGF-β1 10ng/mL en el medio de incubación. (A) Efecto de Yoh, Clo y TGF-β1 en el eflujo de 3H en
animales Control+SAL. (B) Efecto de Yoh, Clo y TGF-β1 en en el eflujo de 3H en animales Control+DMI
10mg/kg ip. (C) Efecto de Yoh, Clo y TGF-β1 en en el eflujo de 3H en animales Restricción+SAL. (D)
Efecto de Yoh, Clo y TGF-β1 en en el eflujo de 3H en animales Restricción+DMI 10mg/kg ip. Los valores
representan media de las razones E2/E1±EEM. Esta determinación se realizó con 4 animales en cada
condición experimental, y para cada animal se realizaron cada una de las determinaciones indicadas en la
gráfica correspondiente y en forma simultanea. (*=p<0,05 al compararlos con K+ 25mM/K+ 25mM).
99
3.5. Bioactividad de TGF-β1. Desdiferenciación de fibroblastos a miofibroblastos:
Para evaluar si los efectos observados por acción del TGF-β1 sobre la liberación de 3H
corresponden un efecto de esta citoquina, se usó una alícuota del mismo TGF-β1 utilizado en
estos ensayos para transformar el fenotipo de fibroblastos neonatales cardíacos a miofibroblastos
(Soto, C., 2006). Para esto se agregó TGF-β1 0,2nM a un cultivo de fibroblastos. En la Fig. 30,
Se puede observar que los fibroblastos después de 84 h en cultivo, en medio al que se agregó
TGF-β1 0,2nM hay un cambio en la morfología de las células, observando células mas grandes,
de núcleos de mayor tamaño, y que abarcan mayor superficie que los fibroblastos del control
negativo. De acuerdo a la tinción de cristal violeta, estas células transformadas corresponden a
miofibroblastos (Soto, C., 2006), cuya principal función en el miocadio es la reparación tisular
(cicatrización) después de la injuria o daño tisular (Soto, C., 2006). Este efecto en la
transformación de fibroblastos a miofibroblastos confirma que el TGF-β1 utilizado en los
ensayos de liberación tiene efectos en otros sistemas biológicos, y que por lo tanto, los efectos de
esta citoquina observados en la liberación de 3H corresponden a la acción de TGF-β1.
Figura 30. Efecto de TGF-β1 en un cultivo de fibroblastos neonatales cardiacos. En estas
microfotografías se muestra el efecto de TGF-β1 0,2nM sobre un cultivo primario de fibroblastos
neonatales cardiacos. Se observa un cambio importante en la morfología celular por efecto de la citoquina
en el medio de cultivo, lo que indica que los efectos observados en el eflujo de 3H desde cortes de
hipocampo recientemente cargados con 3H-NA tras haber agregado TGF-β1 corresponden a efectos de
este factor de crecimiento. Barra negra representa 100µm. Este ensayo fue realizado por Miguel Copaja,
Raul Vivar y Francisca Mateluna en el laboratorio de Farmacoquímica del Dr. Guillermo Díaz-Araya,
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas. Universidad de Chile.
100
VI. Conclusiones:

El aplicar 2,5h diarias durante 14 días continuados de estrés por restricción de movimiento a
ratas macho induce una reducción en la ganancia del peso corporal y un aumento en los
niveles de GCs, en comparación con animales control sin estresar.

El tratamiento con DMI a animales estresados crónicamente previene parcialmente el
aumento en los niveles séricos de GCs e indujo una mayor reducción en la ganancia del peso
corporal.

El estrés crónico por restricción de movimiento indujo conductas similares a la depresión,
como disminución en la capacidad de adquisición de respuestas condicionadas, fallas en evitar
estímulos adversos, desesperanza aprendida y anhedonia, conductas que fueron prevenidas
específicamente por el antidepresivo DMI.

El tratamiento crónico con DMI a animales control, aumentó los niveles de ERK1/2 total en
hipocampo completo. También se observó un aumento significativo de estas proteínas por
efecto del estrés crónico por restricción de movimiento.

En el hipocampo completo de animales crónicamente estresados se observó un aumento en los
niveles de P-ERK1/2, comparado con los niveles hipocampales de las mismas proteínas en
animales control sin estresar. Este efecto fue prevenido por el tratamiento crónico con DMI a
ratas estresadas.

El estrés crónico aumentó los niveles de CREB total en hipocampo completo, efecto que no
fue alterado por el tratamiento crónico con DMI a animales estresados. Además el estrés
crónico aumentó los niveles de P-CREB en el hipocampo, efecto que tampoco fue prevenido
por el tratamiento con DMI en animales estresados.

No hubo cambios regionales de P-CREB en las distintas áreas del hipocampo por efecto del
estrés crónico. Mientras que el tratamiento con DMI a animales estresados produjo un
aumento de P-CREB en todas las regiones del hipocampo.

Los niveles del ARNm de BCL-2 se redujeron en todo el hipocampo por efecto del estrés
crónico, y esta disminución no es prevenida por el tratamiento crónico con DMI a animales
estresados.

En hipocampo total, el estrés crónico indujo un aumento en los niveles de la proteína BCL-2,
efecto que fue prevenido por el tratamiento con DMI en animales estresados crónicamente.
101

En las diferentes regiones del hipocampo, no se observaron diferencias en la
inmunoreactividad relativa de BCL-2 de animales estresados crónicamente y ratas control sin
estresar, sin embargo, el tratamiento crónico con DMI a ratas control sin estresar, y a animales
estresados, redujo significativamente la inmunoreactividad relativa de BCL-2 en todas las
regiones hipocampales estudiadas.

El estrés por restricción de movimiento, redujo los niveles hipocampales del ARNm de BDNF
en todas las regiones estudiadas del hipocampo. Este efecto fue prevenido por la
administración crónica de DMI a animales estresados, sólo en la región CA3 del hipocampo.

Los niveles del ARNm de TGF-β1 se redujeron en todas las regiones del hipocampo por
efecto del estrés crónico por restricción de movimiento, efecto que fue prevenido por el
tratamiento crónico con DMI a animales estresados en todo el hipocampo.

El tratamiento con HAL no indujo cambios en los niveles séricos de GCs, ni en animales
control sin estresar ni tampoco en animales estresados por restricción de movimiento. Además
indujo una reducción en la ganancia de peso corporal significativamente menor que la
observada para animales estresados crónicamente que no recibieron ningún tratamiento
farmacológico.

Las conductas similares a la depresión generadas por el estrés crónico, no fueron prevenidas
por el tratamiento crónico con HAL.

La administración de crónica de HAL, redujo la inmunoreactividad relativa de P-CREB en
todo el hipocampo, tanto de animales control sin estresar como de ratas sometidas a
restricción de movimiento.

El HAL redujo los niveles del transcrito de BCL-2 en todas las regiones hipocampales de
ratas control sin estresar, y animales sometidos a restricción de movimiento.

.El tratamiento crónico con HAL a animales estresados y no estresados disminuyó la
inmunoreactividad relativa de BCL-2, en todas las áreas del hipocampo.

La administración crónica de HAL redujo los niveles del ARNm de BDNF en todas las
regiones hipocampales de animales control, y estresados crónicamente.

El tratamiento con HAL redujo los niveles del transcrito de esta TGF-β1en todas las áreas
estudiadas del hipocampo de animales control y estresados.

La liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA, de ratas
control es una liberación dependiente de Ca2+ y sensible a los efectos del antagonista del
autoreceptor presináptico α2 Yoh y también del agonista α2 Clo.
102

El tratamiento crónico con DMI a animales control sin estresar, reduce el efecto de la Yoh, en
comparación con animales control sin estresar que reciben sólo una inyección diaria de una
solución salina. También, el tratamiento crónico con DMI induce cambios en la sensibilidad
al agonista α2 Clo, el cual no es capaz de inhibir el eflujo hipocampal de 3H.

El estrés crónico por restricción de movimiento cambia la sensibilidad del autoreceptor α2,
haciendo que este sea sensible sólo a la acción del agonista Clo y no al antagonista Yoh en la
liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA.

En animales estresados crónicamente, y tratados con DMI, se observa la misma sensibilidad a
Clo y Yoh que en animales estresados que sólo recibieron una inyección de vehículo, es decir,
hubo un efecto significativo del agonista α2 Clo, pero no un efecto significativo del
antagonista Yoh.

El TGF-β1 tiene efectos en la liberación 3H desde cortes de hipocampo recientemente
cargados con 3H-NA. En animales control sin estresar, TGF-β1 redujo el eflujo de 3H,
mientras que en animales control tratados crónicamente con DMI, la citoquina potenció la
liberación de 3H.

En ratas estresadas crónicamente, el TGF-β1 potenció la liberación de 3H. Este efecto también
se observó en animales estresados crónicamente y que fueron tratados con DMI.

El TGF-β1 utilizado en los ensayos de liberación de 3H, es capaz de cambiar el fenotipo de
fibroblastos cardiacos a miofibroblastos. De esta manera los efectos de la citoquina en la
liberación de 3H desde cortes de hipocampo recientemente cargados con 3H-NA corresponden
a la acción directa de TGF-β1.
103
VII. Discusión:
Uno de los principales sustratos de la acción de los antidepresivos pertinentes a esta tesis, es la
neurotransmisión noradrenérgica la cual se ha relacionado con procesos de plasticidad sináptica,
potenciación a largo plazo, y formación de memoria. Además se ha demostrado que la NA
induce la expresión de proteínas asociadas a plasticidad neuronal como moléculas de adhesión
celular, factores transcripcionales, cambios en neuritogénesis y diferenciación neuronal
(Laifenfeld, D., y cols., 2005, Laifenfeld, D., y cols., 2002). Se ha descrito que los antidepresivos
administrados en forma aguda ejercen cambios conductuales, y probablemente promueven
cambios rápidos en la expresión de ciertos genes dentro del SNC que puedan explicar estas
conductas (Cryan, J.F., y cols., 2002, Cryan, J.F., y cols., 2005, Duman, C.H., y cols., 2006,
Kodama, M., y cols., 2005). Sin embargo en pacientes con DM, los efectos de los antidepresivos
solo se manifiestan luego de semanas de tratamiento; por lo cual se ha sugerido que estos
fármacos ejercen efectos diferenciales a corto y a largo plazo. Es así que se ha descrito que los
antidepresivos ejercen efectos disímiles sobre la expresión del BDNF, la velocidad de descarga
de neuronas dopaminérgicas y la respuesta al miedo condicionado, dependiendo si la
administración es aguda o crónica (Burghardt, N.S., y cols., 2004, Khundakar, A.A., y cols.,
2006, Rodriguez-Landa, J.F., y cols., 2003). Por lo tanto es importante evaluar el efecto del
tratamiento crónico de un antidepresivo en animales estresados, emulando una condición de
depresión, y en controles de forma de determinar cambios tanto a nivel conductual como a nivel
de marcadores moleculares en estructuras como el hipocampo.
1. Respuestas fisiológicas asociadas al estrés crónico:
Las respuestas fisiológicas generadas por situaciones estresantes, permiten la adaptabilidad del
individuo a su entorno (Tsigos, C., y cols., 2002). Sin embargo, si estas situaciones de estrés
perduran en el tiempo, como en el estrés crónico, la capacidad fisiológica de adaptación del
individuo es sobrepasada (McEwen, B.S., y cols., 1995). Dentro de los efectores de la respuesta
al estrés, están los GCs, hormonas que se han asociado a los efectos patológicos del estrés
(McEwen, B.S., y cols., 1995). El estrés crónico por restricción de movimiento aumentó
significativamente los niveles séricos de GCs, posiblemente como una consecuencia de una
sobre estimulación del eje HHS generada por el estrés, similar a lo que se ha observado en
104
pacientes depresivos (Gold, P.W., y cols., 1995, Holsboer, F., 2001, Holsboer, F., y cols., 1986,
Holsboer, F., y cols., 1982, Holsboer, F., y cols., 1984). El alza en los GCs explicaría la menor
ganancia del peso corporal, apoyado en el hecho de que estas hormonas aumentan el
catabolismo. Se ha indicado que la administración crónica de CORT a ratas, reduce la ganancia
de peso corporal (Johnson, S.A., y cols., 2006). Por el contrario, la administración crónica de
DMI a animales control y estresados, redujo significativamente la ganancia de peso corporal.
Este efecto ya ha sido señalado por otros autores, aunque no se ha explicado el mecanismo por el
cuál esto ocurre (Izumi, J., y cols., 1997, Reynolds, J.L., y cols., 2004a, Reynolds, J.L., y cols.,
2004b, Shen, Y., y cols., 1999). Sin embargo, es factible que la DMI reduzca la ganancia de peso
por acción del fármaco a nivel sistémico, al aumentar los niveles de NA en tejidos. Es así que la
activación de receptores adrenérgicos en el hígado (α1 y β2) y en el músculo esquelético (β2)
incrementa la glicogenolisis (Hoffman, B., y cols., 2001), y a nivel del adipocito (β3) aumenta la
lipólisis (Hoffman, B., y cols., 2001); efectos que, en conjunto podrían explicar los cambios en la
ganancia de peso corporal inducidos por DMI. Hay que destacar que en experimentos similares a
los de esta tesis no se han observado una reducción en la ingesta de alimento (resultados no
mostrados) (Castañeda, P., 2006).
En este trabajo de tesis se observó que por el estrés crónico aumentaron los niveles de GCs,
cambio que no fue acompañado por alteraciones en el tamaño de la médula adrenal y contenido
de catecolaminas, lo que sugiere que no hubo cambios en la activación simpática, a diferencia de
otros modelos de estrés, como el estrés crónico variable, donde estos efectos aún se observan
luego de 21 días de estrés (Magarinos, A.M., y cols., 1995). No obstante, se debe considerar que
tras 14 días de estrés parte de los efectos a nivel simpático podrían haber revertido.
2. Efecto del estrés crónico por restricción de movimiento en conductas similares a la depresión
y efectos de la Desipramina:
El paradigma de estrés crónico, generó en ratas, conductas similares a la depresión, como
reducción en la adquisición de respuestas condicionadas, relacionado con la capacidad cognitiva
del animal; fallas en evitar activamente estímulos aversivos; aumento en la inmovilidad en la
prueba de natación forzada, que refleja una condición de desesperanza aprendida, y una
reducción en la preferencia por una solución azucarada como agua de bebida, que indica una
105
condición de anhedonia. Todas estas conductas son de utilidad clínica para el diagnostico de esta
psicopatología, siendo la anhedonia un síntoma fundamental en la depresión (APA, 1999).
Además estos cambios en conducta fueron prevenidos por un fármaco utilizado en la terapia para
le depresión.
2.1. El tratamiento con DMI mejora la adquisición de respuestas condicionadas en animales
estresados:
Se han señalado una serie de interacciones entre GCs, regulación del eje HHS y señalización por
NA en el SNC. Por ejemplo, las neuronas noradrenérgicas del Locus Ceruleus, proyectan sus
eferencias hacia el hipotálamo (Kiernan, J., 2000) donde participan en la regulación de la
liberación de CRH (Feuvrier, E., y cols., 1998). Hay que destacar que la actividad
noradrenérgica se ha relacionado con estados de alerta del animal (Berridge, C.W., y cols., 2003,
Kiernan, J., 2000), y procesos de consolidación de la memoria (Roozendaal, B., y cols., 2004).
Se ha descrito que en cultivos organotípicos de hipotálamo de rata, la liberación de CRH es
dependiente de NA (Feuvrier, E., y cols., 1998). Este neurotransmisor actuaría a través de
receptores α1 presentes en neuronas CRH, aumentando la liberación de CRH, el cual permite
activar al eje HHS como respuesta al estrés (Feuvrier, E., y cols., 1998), favoreciendo el estado
de alerta. En contraste, en un medio de cultivo libre de esteroides, la estimulación con NA inhibe
la liberación hipotalámica de CRH, efecto que fue prevenido al suplementar al medio con
CORT.(Feuvrier, E., y cols., 1998), sugieriendo que la regulación en la liberación de CRH es
independiente de la acción de los esteroides (Feuvrier, E., y cols., 1998). Estas evidencias
indican que en la retroalimentación negativa ejercida por GCs a nivel hipotalámico también
participa la neurotransmisión noradrenérgica (Feuvrier, E., y cols., 1998). Recientemente se ha
descrito que la activación del receptor β2-adrenérgico potencia la transactivación del GR
aumentando la afinidad de este receptor a su ligando, a través de la vía dependiente de la PI3K
en células HT22 (Schmidt, P., y cols., 2001).
Por otro lado los GCs modulan la función de receptores α y β adrenérgicos, dependiendo de la
concentración y de la duración en la exposición a este tipo de hormonas esteroidales (Duman,
R.S., y cols., 1989, Stone, E.A., y cols., 1986). Lo anterior evidencia una compleja interacción
106
entre la activación del GR y la neurotransmisión noradrenérgica en el SNC, cuya alteración
explicaría la disminuida capacidad cognitiva tras la aplicación del estrés.
La NA es necesaria para establecer la consolidación de la memoria de largo plazo (Roozendaal,
B., y cols., 2004). En ratones heterocigotos para la enzima tirosina hidroxilasa (Th +/-), y que
tienen una reducida neurotransmisión noradrenérgica, presentan una reducida capacidad para
adquirir respuestas condicionadas en la prueba de evitación activa (Kobayashi, K., y cols., 2000).
Consistente con esto, en esta tesis se determinó que el tratamiento con DMI previene las
conductas inducidas por estrés en la prueba de evitación activa. Es posible que este efecto ocurra
por un aumento en la NA permitiendo cambios que permitan el correcto funcionamiento del
sistema noradrenérgico, mejorando la generación de estados de alerta, el procesamiento de la
información sensorial (Berridge, C.W., y cols., 2003), y consolidación de la memoria
(Roozendaal, B., y cols., 2004). Los inhibidores de la recaptura de NA también afectan a la
neurotransmisión serotoninérgica, dado que los terminales nerviosos que se proyectan desde el
Rafe, tienen el receptor presináptico α2 cuya activación persistente permite la desensibilización
de este aumentando la liberación de 5-HT (Baldessarini, R., 2001, Glavin, G.B., 1985, Graeff,
F.G., y cols., 1996, Warsh, J., y cols., 1998). Este efecto mejoraría la respuesta de escape o pelea
(Graeff, F.G., y cols., 1996), y en conjunto optimiza los procesos de consolidación de memoria,
y conductas de escape.
Muchos de los cambios conductuales asociados al estrés se explican por alteraciones en los
niveles de de GCs. Se ha descrito que el tratamiento crónico con CORT a ratas, deteriora las
respuestas de evitación pasiva, ensayo en que los animales no son expuestos a estímulos
condicionantes (Bisagno, V., y cols., 2000). Además, la administración crónica de CORT reduce
los niveles de GR en estructuras del SNC (Bisagno, V., y cols., 2000), lo que sugiere que el
aumento en GCs inducido por el estrés crónico daría cuenta de la alteración en la capacidad de
aprendizaje de forma similar a lo que ocurre en pacientes depresivos (McEwen, B.S., y cols.,
1995).
Se ha descrito que la DMI aumenta la expresión de GR en el hipocampo (Frechilla, D., y cols.,
1998, McEwen, B.S., 2005, Nestler, E.J., y cols., 2002, Okugawa, G., y cols., 1999, Sapolsky,
R.M., 2001, Tsigos, C., y cols., 2002), restaurando y normalizando la retroalimentación negativa
107
del ejej HHS ejercida por los GCs a través de sus receptores (Frechilla, D., y cols., 1998,
Okugawa, G., y cols., 1999). En los animales estresados y tratados con DMI se observó una
disminución, aunque no significativa en comparación con ratas estresadas, de los niveles de GCs
aunque en valores similares a los controles. En la activación del eje HHS participan la CRH y la
arginina-vasopresina (AVP), ambos secretagogos de la ACTH (Dinan, T.G., y cols., 2005, Scott,
L.V., y cols., 1998, 2002). Se ha demostrado que el estrés crónico por inmovilización y el estrés
psicosocial en ratas, reduce la señalización por CRH y un aumenta la de AVP (Dinan, T.G., y
cols., 2005). La relevancia de este cambio está en que los GCs aumentan los niveles del ARNm
del receptor V3 de AVP y el acoplamiento de este receptor a su maquinaria de transducción de
señales (Aguilera, G., y cols., 2000, Dinan, T.G., y cols., 2005, Makino, S., y cols., 1995, Zhou,
J.N., y cols., 1996), sugiriendo que la regulación del eje HHS por AVP en condiciones de estrés
crónico perpetuaría un aumento sostenido en los niveles de GCs (Dinan, T.G., y cols., 2005).
Mas aun, la Fluoxetina, antidepresivo inhibidor de la recaptura de 5-HT, disminuye la liberación
hipotalámica de AVP en ratas sin estresar, mientras que la DMI no produce el mismo efecto
(Altemus, M., y cols., 1992). Es decir, el efecto sobre la liberación del AVP hipotalámico
dependería del tipo de antidepresivo usado.
2.2. El estrés crónico genera una condición de desesperanza aprendida: prueba de natación
forzada:
La prueba de natación forzada en roedores es ampliamente utilizada para evaluar potenciales
efectos agudos y crónicos de agentes antidepresivos (Cryan, J.F., y cols., 2005). En esta tesis se
demostró que el estrés crónico aumenta la conducta de inmovilidad en este ensayo lo que se
considera como una condición de desesperanza aprendida (Johnson, S.A., y cols., 2006, Kelliher,
P., y cols., 2003, Vazquez-Palacios, G., y cols., 2004). Más aún, este efecto se previno por la
administración crónica de DMI el que generó un aumento en la conducta de escalamiento. Este
resultado es concordante con otros estudios que indican que los inhibidores de la recaptura de
NA aumentan específicamente la conducta de escalamiento y no la de natación (Cryan, J.F., y
cols., 2002, Cryan, J.F., y cols., 2005), probablemente a través de mecanismos que impliquen
mejoras en los estados de alerta, procesamiento de la información sensorial, y también en la
respuesta de escape o pelea.
108
2.3. Los animales estresados tienen una reducida preferencia por una solución azucarada como
agua de bebida:
Se ha demostrado que la exposición de ratas o ratones a paradigmas de estrés crónico, causa una
reducción en las respuestas a recompensas, que generalmente son evaluadas como disminuciones
en el consumo o preferencia por una solución de sacarosa como agua de bebida (Bekris, S., y
cols., 2005). Para esta prueba se debe considerar que los animales anticipan el valor nutricional
de la solución endulzada dependiendo de la concentración de sacarosa utilizada, enmascarando
los efectos del estrés sobre la preferencia por la solución endulzada. Por esto, la palatabilidad de
la solución de sacarosa es importante para establecer los efectos del estrés crónico en la
preferencia por la bebida endulzada (Sclafani, A., 2002). Esto último se ve reforzado por el
hecho que al utilizar otro endulzante como la sacarina, no es observan los mismos resultados que
se obtienen si se emplea sacarosa (Bekris, S., y cols., 2005).
La conducta de anhedonia es un síntoma fundamental en el diagnóstico de la depresión en
clínica (APA, 1999), y además sirve como un criterio significativo para indicar que el modelo
animal utilizado en esta tesis tiene validez predictiva, para evidenciar cambios en conducta
inducidos por estrés y antidepresivos. En el presente trabajo, la preferencia por una solución de
sacarosa al 1% como agua de bebida se redujo significativamente a los 7 y 14 días de estrés, lo
que sugiere un comportamiento anhedónico inducido por estrés. Esta condición fue prevenida
por el tratamiento crónico con DMI a animales estresados. En contraste, el tratamiento crónico
con el antidepresivo a animales control sin estresar no mostró efectos en la preferencia por
sacarosa, sugiriendo que la acción de la DMI es específica para la condición de estrés crónico.
El hecho de que el modelo de estrés crónico por restricción de movimiento genere conductas
similares a la depresión y que estas sean prevenidas por un antidepresivo hace de este paradigma
de estrés un modelo animal de depresión que tiene validez predictiva, y además permite estudiar
cambios moleculares asociados a los efectos del estrés y del tratamiento con antidepresivos en
estructuras del SNC.
109
3. La Desipramina indujo cambios en marcadores asociados a la resiliencia celular y
neuroplasticidad en el hipocampo:
Los efectos inmediatos de la mayoría de los antidepresivos han sido bien caracterizados,
mostrando que involucran un aumento en la transmisión sináptica de NA y 5-HT, y cambios en
las cinéticas de los receptores noradrenérgicos y serotoninérgicos (Laifenfeld, D., y cols., 2005).
Sin embargo, solo recientemente se están describiendo las cascadas de señalización que se
activan por el tratamiento con antidepresivos y su posible relación con del efecto terapéutico de
estos fármacos (Laifenfeld, D., y cols., 2005).
Diversos estudios preclínicos han demostrado que diferentes modelos de estrés, agudo y crónico
(inmovilización, restricción de movimiento, estrés psicosocial, etc.), producen cambios
estructurales y funcionales en el cerebro, especialmente en estructuras del sistema límbico como
el hipocampo (Rosenbrock, H., y cols., 2005). Esta estructura participa en la regulación por
retroalimentación negativa de los GCs en el eje HHS (Nestler, E.J., y cols., 2002, Van Eekelen,
J.A., y cols., 1988), haciendo del hipocampo un blanco de acción de estas hormonas (Greiner,
M., y cols., 2001). También se ha mencionado que niveles elevados de GCs pueden afectar la
plasticidad neuronal y la resiliencia celular en el hipocampo. A modo de ejemplo, el estrés
crónico induce una reducción en habilidades cognitivas y una reducción en la arborización
dendrítica en neuronas piramidales de la región CA3 del hipocampo (Brown, E.S., y cols., 1999,
Magarinos, A.M., y cols., 1995, McEwen, B.S., 1999, 2005, Sapolsky, R.M., 1996a, b, Yehuda,
R., 1997). Todos estos cambios pueden relacionarse a modificaciones en la actividad del GR,
alterando la expresión génica de proteínas relacionada a la resiliencia y plasticidad neuronal. Los
cambios funcionales pueden deberse a variaciones en proteínas relacionadas a la plasticidad
sináptica como GAP-43, BDNF y sinaptofisina producida por GCs (Rosenbrock, H., y cols.,
2005). Esta evidencia lleva a establecer la importancia de estudiar los mecanismos moleculares
que subyacen a los diferentes procesos asociados a mantener la resiliencia celular en estructuras
como el hipocampo.
110
3.1. El estrés crónico aumenta el grado de fosforilación de las ERK1/2:
La inyección aguda de antidepresivos induce un aumento en la fosforilación de ERK1/2
(Valjent, E., y cols., 2004), probablemente mediado por la activación de receptores
serotoninérgicos y/o noradrenérgicos. En esta tesis se establecen por primera vez los efectos del
tratamiento crónico con DMI a animales estresados en los niveles hipocampales ERK1/2 y sus
formas fosforiladas. A través de inmunoblot se observó que el estrés crónico aumentó la
fosforilación de ERK1 y ERK2; efecto prevenido por el tratamiento con DMI a animales
estresados. Este resultado es concordante con los cambios conductuales, en el sentido que las
conductas similares a la depresión aparecen solo en animales sometidos a restricción de
movimiento. Este tipo de cambios en la fosforilación de P-ERK1 y P-ERK2 ha sido observado
en otros modelos animales de depresión y en individuos depresivos suicidas (Dwivedi, Y., y
cols., 2001, Einat, H., y cols., 2003, Kodama, M., y cols., 2005). Además, el aumento en
P-ERK1 y P-ERK2 se ha relacionado con conductas de desesperanza aprendida, observado
como una reducción en la inmovilidad en la prueba de natación forzada (Einat, H., y cols., 2003),
lo que sugiere que la activación por fosforilación de ERK1/2, se relaciona con el estado
depresivo, y mas aún, que los antidepresivos actuarían reduciendo o previniendo una mayor
fosforilación de estas proteínas. En este trabajo de tesis, la disminución en la fosforilación de
ERK1/2 puede ser una consecuencia de la acción de la DMI, a través del aumento en los niveles
de NA, que inducirían cambios en la densidad o sensibilidad de receptores noradrenérgicos (por
ejemplo, regulación hacia abajo) y de esta manera produciría cambios en la señalización por
fosforilación de ERK1/2. En este sentido, se encontró que el tratamiento crónico con DMI a
animales control sin estresar disminuyó los niveles de P-ERK2, al comparar con animales
control sin estresar. Hay que destacar que a través de este análisis no es posible establecer la
localización subcelular de estas proteínas, ya que cambios en la localización de estas pudieran
relacionarse con cambios en la actividad y conectividad neuronal en el hipocampo, lo que se
asociaría a los cambios conductuales. Estos resultados sugieren que el tratamiento crónico con
DMI induce cambios en la actividad de las ERK1/2, y en consecuencia cambios en la expresión
de otros genes.
La administración crónica de DMI produce un aumento en la masa de ERK1/2 independiente de
la condición de estrés del animal. Este resultado sugiere que en las vías de señalización
111
moduladas por antidepresivos existirían mecanismos por los cuales se inducen cambios en la
expresión y/o recambio de ERK1/2, que hasta ahora no han sido descritos. Este mecanismo da
cuenta del menor grado de fosforilación observado en el grupo de animales control tratados con
DMI. Además se observa que, a pesar de que por el estrés hay también un aumento en ERK1/2,
existe un aumento en la fosforilación, sugiriendo que por el estrés se activan vías aumentan la
fosforilación de ERK1/2. Además es posible que existan otros mecanismos de compensación,
como por ejemplo la activación de fosfatasas. Se ha descrito que la terapia electroconvulsiva en
ratas, utilizada como tratamiento en depresiones severas que no responden a los antidepresivos
(Altar, C.A., y cols., 2004), aumenta la expresión de fosfatasas de MAPK (MKPs) en el
hipocampo, que puedan estar dando cuenta de un término de la actividad de la señalización
mediada por P-ERK1 y P-ERK2 (Kodama, M., y cols., 2005). Estos efectos de la DMI pudieran
ser consecuencia de la acción directa del antidepresivo, sin mediar el bloqueo en la recaptura de
NA, ya que la DMI es capaz de promover cambios en la actividad de GR en células no
neuronales (fibroblastos de ratón) (Pariante, C.M., y cols., 1997).
3.2. CREB es modulado de manera diferente a la activación de ERK1/2 en las condiciones de
estrés crónico y tratamiento con DMI:
Se ha descrito que los antidepresivos inducen cambios en la actividad de ERK1/2 (Blendy, J.A.,
2006, D'Sa, C., y cols., 2002, Tardito, D., y cols., 2006), PKC (Mann, C.D., y cols., 1995),
quinasas activadas por calcio y quinasas activadas por AMPc (D'Sa, C., y cols., 2002), las cuales
permiten la activacion de factores transcripcionales como el CREB, permitiendo cambios en la
expresión génica como por ejemplo en la expresión de neurotrofinas y sus receptores
(Laifenfeld, D., y cols., 2005).
A través de inmunowestern blot, se observó que el estrés crónico de movimiento indujo un
aumento en P-CREB, como también en CREB total, cambios que se correlacionaron con un
aumento en el grado de fosforilación de las ERK1/2. En contraste a lo observado en P-ERK1/2,
el tratamiento crónico con DMI no previene el auemento en P-CREB. Con este tipo de análisis
es difícil evaluar cambios regionales de P-CREB en el hipocampo, por lo que se determinaron
cambios región-específicos de P-CREB a través de inmunohistoquímica. A través de este
análisis se observó que el estrés no modifica la inmunoreactividad relativa de P-CREB, mientras
112
que la administración crónica de DMI a animales estresados aumenta los niveles de P-CREB en
todas las regiones del hipocampo. En animales control tratados con DMI hubo un aumento
significativo de P-CREB pero solo en la capa CA3 del hipocampo. Estos resultados permiten
sugerir que la DMI es capaz de prevenir los efectos en el comportamiento inducidos por el estrés
crónico, independiente de los cambios en actividad de CREB. En concordancia con estos
resultados, se ha observado que los antidepresivos ejercen su acción, de acuerdo al ensayo de
natación forzada en ratones con una mutación en CREB que reduce su unión al elemento de
respuesta a AMPc (CRE) (Conti, A.C., y cols., 2002). Además, aunque hay muchos trabajos que
indican que el tratamiento con antidepresivos aumenta la fosforilación de CREB en el
hipocampo de animales de experimentación (Czeh, B., y cols., 2001, Nakagawa, S., y cols.,
2002, Nibuya, M., y cols., 1996, Tardito, D., y cols., 2006, Thome, J., y cols., 2000, Vaidya,
V.A., y cols., 2001), se ha descrito que el tratamiento crónico con antidepresivos no cambia los
niveles de P-CREB, y que por algunos procedimientos de estrés habría incluso una reducción
significativa de P-CREB (Laifenfeld, D., y cols., 2005). En este trabajo de tesis, el estrés crónico
no generó cambios en la marca inmunohistoquímica de P-CREB, lo que nuevamente no permite
establecer si hay o no participación de factor transcripcional en los mecanismos de estrés, ya que
estos resultados no concuerdan con los cambios conductuales observados por efecto del estrés.
3.3. BCL-2 cambia su expresión en condiciones donde la resiliencia celular se ve mas afectada:
La proteína BCL-2, tiene una serie de propiedades citoprotectoras (Prehn, J.H., y cols., 1994,
Zhu, Y., y cols., 2002), y cuya expresión en el hipocampo es modulada por GCs, principalmente
en las regiones CA1 y en el GD (Cardenas, S.P., y cols., 2002). El estrés reduce la expresión del
ARNm de BCL-2 en todo el hipocampo, sin embargo esta reducción en el transcrito no se
correlaciona con los cambios en la proteína. Estos resultados sugieren que ante una condición de
estrés, la activación de GR reprimiría de la transcripción del ARNm de BCL-2 y que de alguna
forma se modula la vida media de la proteína.
La expresión de BCL-2 se regula positivamente por P-CREB (Manji, H.K., y cols., 2001b) y
NFκB (Catz, S.D., y cols., 2001), y negativamente por GCs (Cardenas, S.P., y cols., 2002). La
menor expresión de BCL-2 observada en la condición de estrés no se puede explicar por
cambios en el estado de fosforilación de CREB, por lo que es factible que esta represión sea
113
producto de una menor actividad en factores transcripcionales que controlan la expresión de
BCL-2 producto del alza en los GCs. De hecho, estas hormonas reprimen la actividad de NFκB
en células del sistema inmune (Almawi, W.Y., y cols., 2002) factor transcripcional que regula
positivamente la expresión de BCL-2. Mas aun el efecto represor del estrés sobre la expresión
del BCL-2 no puede ser prevenida por el tratamiento con DMI. Se ha determinado que la
administración de clembuterol (Zhu, Y., y cols., 1999), un agonista β2-adrenérgico, induce la
expresión de BCL-2 en el hipocampo a las pocas horas de inyectado probablemente asociado al
aumento en la producción de AMPc y fosforilación de CREB. Sin embargo, por acción de la
DMI es probable que los receptores noradrenérgicos se hayan desensibilizado o bien
internalizado para compensar el aumento de la presencia de su ligando endógeno. Por lo tanto, el
aumento en la neurotransmisión noradrenérgica aguda o crónica induciría cambios diferenciales
en la expresión de BCL-2 en el hipocampo. No obstante, tras el estrés los niveles de proteína son
similares a la condición control en todas las áreas hipocampales, y en homogeneizado total de
hipocampo los niveles de BCL-2 fueron aun mayores que en los animales control. Considerando
estos resultados se puede sugerir que en el hipocampo, se produce un aumento en la vida media
de BCL-2 y/o en la eficiencia de la traducción durante el estrés, y la administración crónica del
DMI previene estos cambios que se traducen en reducción en los niveles de la proteína. Esto
sugiere que los antidepresivos, como la DMI, median su efecto a través de otros mecanismos,
que aun quedan por ser explorados, y que son independientes de cambios en la expresión de
BCL-2.
Hay que destacar que de acuerdo a los estados de fosforilación de ERK1/2 y CREB no se
correlacionan con los observados para BCL-2. Por lo tanto quedan por determinar las rutas
intracelulares por las que se regula la expresión de BCL-2 por el estrés y del tratamiento crónico
con antidepresivos, pudiendo ser este efecto independiente de la acción de la DMI sobre la
neurotransmisión noradrenérgica. De hecho la fluoxetina y la DMI, activan a la PKC (Mann,
C.D., y cols., 1995), efecto que está bien descrito para la DMI (Pepin, M.C., y cols., 1992a,
Pepin, M.C., y cols., 1992b). Además, en condiciones experimentales in vitro la DMI es capaz
de ejercer diferentes efectos en la transcripción de genes mediada por GR, dependiendo de
cambios en la concentración y el tiempo de exposición a dexametasona (Pariante, C.M., y cols.,
1997).
114
3.4. El ARNm total de BDNF se reduce por efecto del estrés crónico y la Desipramina previene
este efecto solo en la región CA3 del hipocampo:
El gen de BDFN es complejo, que tiene cuatro exones con diferentes regiones promotoras,
siendo el exón V que codifica para la proteína de BDNF completa (Aliaga, E., y cols., 1999,
Shieh, P.B., y cols., 1998). Se ha descrito que el transcrito que contiene al exón III y que es el
mas abundante en el hipocampo (Shieh, P.B., y cols., 1998) puede ser regulado por P-CREB
(Aliaga, E., y cols., 1999, Shieh, P.B., y cols., 1998). La disminución en los niveles de esta
neurotrofina se han relacionado con la depresión (Chen, A.C., y cols., 2001); en cambio el
tratamiento crónico con DMI aumenta la expresión de transcritos de BDNF que contienen a los
exones II y III, en cambio la administración aguda produce reducción región-específica en los
diferentes transcritos (Russo-Neustadt, A., y cols., 1999). Además, el BDNF inyectado en forma
aguda intrahipocampalmente ejerce acciones antidepresivas en la prueba de natación forzada
(Shirayama, Y., y cols., 2002). En estructuras límbicas, especialmente en el hipocampo, el
BDNF promueve procesos de arborización dendrítica en neuronas serotoninérgicas dañadas, y
aumenta la densidad de axones serotoninérgicos en la corteza cerebral (Lyons, W.E., y cols.,
1999). Además el estrés agudo de restricción de movimiento reduce la expresión del BDNF,
efecto prevenido por antidepresivos (Nibuya, M., y cols., 1995).
En esta tesis se demostró que el estrés reduce el transcrito de BDNF en todas las regiones
estudiadas del hipocampo; efecto prevenido por la DMI, solo en la región CA3 del hipocampo.
Hay que destacar que el oligonucleótido empleado aquí es complementario con el exon V, y por
lo tanto no es posible observar cambios diferenciales en los otros transcritos de esta neurotrofina.
La región CA3, se afecta por el estrés crónico por restricción de movimiento de 6h/día durante
21 días (Magarinos, A.M., y cols., 1995), reduciendo de manera significativa el largo de
dendritas y el número de puntos de ramificación en neuronas piramidales de esta región del
hipocampo (Magarinos, A.M., y cols., 1995). El tratamiento con antidepresivos previene estos
cambios morfológicos que son perjudiciales para la función hipocampal (Czeh, B., y cols., 2001,
van der Hart, M.G., y cols., 2002); permitiendo sugerir que en la región CA3 la DMI favorece la
funcionalidad de esta región del hipocampo, y por lo tanto la función de toda de esta estructura.
115
Como se menciona para los resultados obtenidos de la expresión de CREB y BCL-2, pareciera
que en este caso tampoco hubiera una corelación entre los cambios del comportamiento, el
efecto de la DMI y los cambios en el ARNm de BDNF.
3.5. Participación de otros factores de crecimiento en la resiliencia celular: participación del
TGF-β:
En este modelo animal que presenta conductas similares a la depresión, hubo diferentes efectos
en la expresión y actividad de los marcadores moleculares asociados a la resiliencia celular en el
hipocampo. Estos marcadores ya han sido relacionados a la depresión y la acción de los
antidepresivos en otros modelos; sin embargo no todos presentaron cambios de acuerdo a lo
observado en los estudios del comportamiento. Aunque esto pareciera contradecir lo descrito por
otros autores, los resultados del presente trabajo sugieren que en las respuestas adaptativas al
estrés crónico y los mecanismos de acción tras el tratamiento crónico con el antidepresivo
existiría la participación de otras estructuras anatómicas del SNC, otros sistemas fisiológicos y
otras rutas de señalización intracelular, que permitan explicar los cambios en el comportamiento.
Por ejemplo, existe evidencia que sugiere que los antidepresivos regulan la actividad del eje
HHS, mejorando la regulación por retroalimentación negativa por parte de los GCs, lo que a su
vez afectaría a varias estructuras del SNC incluyendo al hipocampo.
Recientemente ha habido interés en estudiar proteínas moduladoras del sistema inmune y su
relación con patologías del SNC (Dantzer, R., y cols., 2002, O'Brien, S.M., y cols., 2004). Estos
péptidos han sido involucrados en procesos de neuroplasticidad y/o neuroprotección en el SNC.
En relación a la depresión se ha observado que pacientes que están en tratamientos con
citoquinas, o tienen niveles séricos muy altos de citoquinas pro-inflamatorias, por efecto de
algún proceso infeccioso, presentan algunas conductas similares las de pacientes con depresión
(O'Brien, S.M., y cols., 2004). Adicionalmente, los antidepresivos son capaces de reducir la
razón IFNγ/IL-10 en cultivos de sangre completa de individuos sanos, lo que sugiere una
actividad inmunomodulatoria por parte de los antidepresivos (Maes, M., 2001, Maes, M., y cols.,
1999). Una importante proteína inmunomodulatoria presente en el hipocampo es TGF-β1
(Bravo, J.A., y cols., 2006, Flanders, K.C., y cols., 1995, Henrich-Noack, P., y cols., 1996,
Lehrmann, E., y cols., 1995, Nichols, N.R., y cols., 1991). Esta citoquina ha sido encontrada en
116
altas concentraciones en biopsias de pacientes con enfermedad de Parkinson (Mogi, M., y cols.,
1995), enfermedad de Alzheimer (Flanders, K.C., y cols., 1995) e infarto cerebral (Krupinski, J.,
y cols., 1996). También, la expresión de TGF-β1 se induce en el hipocampo después hipoxia,
isquemia y también tras traumas cerebrales e infecciones, todas condiciones relacionadas con
muerte celular (Henrich-Noack, P., y cols., 1996, Lehrmann, E., y cols., 1995, Nichols, N.R., y
cols., 1991). Estas observaciones han llevado a postular que TGF-β1 es un péptido relacionado
con deterioro neuronal, cuya expresión aumentada en respuesta a daño en el SNC es una
característica común con los factores neurotróficos clásicos. En acuerdo con esto, se ha
demostrado in vivo que TGF-β1 previene la degeneración neuronal inducida por hipoxia o daño
por exitoxicidad, y previene la muerte de neuronas CA1 hipocampales tras estos estímulos
(Henrich-Noack, P., y cols., 1996), lo que apoya un papel neuroprotector de esta citoquina en
SNC adulto. Más aun, TGF-β1 es capaz de inducir la expresión de BDNF y el receptor TrkB en
cultivos primarios de neuronas corticales (Sometani, A., y cols., 2001). También TGF-β1
protege contra la excitotoxicidad inducida por un aumento en la conductancia de Ca2+
dependiente de NMDA, evitando una entrada excesiva de Ca2+ a la célula y probablemente
induciendo la expresión de BCL-2 (Prehn, J.H., y cols., 1994). Además, la expresión de TGF-β1
en el hipocampo es reprimida por GCs, especialmente en el GD (Bravo, J.A., y cols., 2006). Los
resultados del presente trabajo muestran que el estrés crónico en ratas redujo el ARNm de
TGF-β1 en cada área hipocampal estudiada. Este efecto fue completamente prevenido por el
tratamiento con DMI a animales estresados. Este hallazgo permite postular a TGF-β1 como un
buen mediador de la acción de la DMI; aunque queda por determinar si en estos tratamientos
varían los niveles de las citoquina. Estudios recientes muestran que los pacientes depresivos
tienen niveles séricos de TGF-β1 más bajos que los individuos sanos. Estos niveles reducidos de
TGF-β1 se recuperan luego de 8 semanas de tratamiento con distintos antidepresivos (Myint,
A.M., y cols., 2005). Un posible mecanismo que explique el efecto de la DMI sobre TGF-β1
puede ser a través de la activación noradrenérgica, ya que se ha demostrado que la
administración de clembuterol en ratones, aumenta la expresión de TGF-β1 en el hipocampo
(Zhu, Y., y cols., 2001b). Por lo tanto, si DMI aumenta la disponibilidad de NA en el espacio
sináptico, este neurotransmisor actuaría sobre receptores β2 en el hipocampo y de esta forma se
induciría la expresión de TGF-β1 (Zhu, Y., y cols., 2001b). Este efecto que explicaría la acción
de la DMI sobre la expresión del ARNm de TGF-β1 de animales estresados y tratados
117
crónicamente con el antidepresivo, restaurando la citoprotección en el hipocampo, a través de un
aumento en la expresión de esta citoquina. No obstante no fue posible determinar los cambios en
la proteína TGF-β1 con los anticuerpos comercialmente disponibles (Santa Cruz, Santa Cruz,
CA, EE UU. Chemicon, Temecula, CA, EE UU), por lo tanto será necesario determinar si la
inyección intrahipocampal o la sobreexpresión región específica de esta citoquina produce
conductas antidepresivas, tal como se ha demostrado para el BDNF (Shirayama, Y., y cols.,
2002), y si además en esta acción el TGF-β1 señaliza a través de la vía de las SMAD y/o
ERK1/2. En otros trabajos, la activina βA, proteína miembro de la familia del TGF-β1, induce
efectos antidepresivos al ser inyectada en forma aguda en el hipocampo (Dow, A.L., y cols.,
2005). También su expresión en el hipocampo aumenta por terapia electroconvulsiva (Dow,
A.L., y cols., 2005). Sin embargo, no se observaron cambios en activina βA por el tratamiento
crónico con fluoxetina (Dow, A.L., y cols., 2005), aunque los niveles los niveles de SMAD2
fosforilada (P-SMAD2) aumentaron en la corteza prefrontal de ratas tratadas durante 21 días con
fluoxetina o DMI (Dow, A.L., y cols., 2005). Los cambios en P-SMAD2 también podrían ser
consecuencia del aumento del TGF-β1 por la administración de DMI. Esta información sugiere
que si el TGF-β1 estuviera en involucrado en los mecanismos de acción de los antidepresivos, la
vía de señalización intracelular involucraría a otros componentes distintos de la vía
ERK1/2-MAPK, como la vía de activación canónica de TGF-β1 mediada por las proteínas
SMADs, la que no estaría asociada a cambios en BCL-2. Además, la reducción en el ARNm de
BDNF en animales estresados es concomitante con la reducción en el transcrito de TGF-β1. Este
cambio podría estar sugiriendo algún tipo de interrelación entre citoquinas y neurotrofinas sobre
la base de que el TGF-β1 induce la expresión de BDNF y su receptor TrkB en cultivo primario
de neuronas corticales (Sometani, A., y cols., 2001). Esta inerrelación podría dar cuenta de los
cambios observados solo en la región CA3 del hipocampo.
3.6. El tratamiento con HAL no previene los efectos del estrés crónico:
En esta tesis el HAL fue utilizado para evaluar si los efectos de la DMI sobre la conducta y
marcadores de resiliencia y neuroplasticidad eran específicos para este antidepresivo. El HAL es
un antagonista de receptores D2 de dopamina (Baldessarini, R., y cols., 2001), y es utilizado en
el tratamiento de la esquizofrenia y trastornos psicóticos (Baldessarini, R., y cols., 2001). En el
118
hipocampo de rata, se ha descrito la presencia de receptores D2, principalmente hacia la región
mas dorsal del hipocampo (Closse, A., y cols., 1988, Grilli, M., y cols., 1988). La activación del
receptor D2 tiene efectos inhibitorios a través de proteína Gi, inhibiendo a enzimas como
adenilato ciclasa (Baldessarini, R., y cols., 2001), por lo que el HAL al antagonizar a este
receptor podría promover aumentos en los niveles de AMPc en circuitos neuronales regulados
por dopamina, y también en estructuras que presentan al receptor D2 como el hipocampo.
El tratamiento con HAL, redujo la ganancia de peso corporal independiente de las condiciones
de estrés; probablemente por una disminución en la movilidad del animal para alimentarse,
posibilidad no fue explorada durante este trabajo de tesis. En animales control sin estresar se
observó que el HAL redujo la adquisición de respuestas condicionadas sin mediar cambios en la
capacidad de escape de estimulos adversos, efecto que puede deberse a una deteriorada
capacidad motora inducida por este fármaco (Baldessarini, R., y cols., 2001). Esta sugerencia se
ve avalada por el aumento en el tiempo de inmovilidad observado en la prueba de natación
forzada. Esta situación ha sido descrita por otros autores (Aguilar, M.A., y cols., 2004, Reis,
F.L., y cols., 2004), aunque en ambos trabajos la administración del fármaco se realizó solo
minutos antes de la prueba.
Se ha indicado que el sistema dopaminergico a través del receptor D2 aumenta la adquisición de
respuestas condicionadas (Baldessarini, R., y cols., 2001). Por ejemplo, la administración aguda
de un agonista D2, como la apomorfina, es capaz de mejorar la adquisición de respuestas
condicionadas en ratas (Reis, F.L., y cols., 2004), mientras que la aplicación de antagonistas D2,
como el sulpiride o el HAL, disminuyen esta capacidad (Aguilar, M.A., y cols., 2004, Reis, F.L.,
y cols., 2004). Es posible que el HAL haya interrumpido el establecimiento de la asociación
entre la señal audible (estímulo condicionante) y el shock eléctrico (estímulo no condicionante),
ya que la dopamina se ha relacionado con procesos de aprendizaje asociativo (Stark, H., y cols.,
2000, Young, A.M., y cols., 1998), por lo que el HAL puede estar interfiriendo con este tipo de
aprendizaje asociativo.
El tratamiento crónico con HAL no altera la conducta hedonia en animales control, y tampoco
previene los efectos del estrés crónico. Los sistemas de neurotransmisión dopaminérgicos
participan en los mecanismos de recompensa, principalmente en la generación de conductas de
119
“querer algo” (“wanting”) mas que “gustar algo” (“liking”) (Berridge, K.C., 2006, Berridge,
K.C., y cols., 1998), por lo tanto fármacos como el HAL no afectan la conducta de hedonismo en
animales.
A nivel molecular, la administración crónica de HAL redujo significativamente la
inmunoreactividad de P-CREB, el ARNm de BCL-2 y su proteína, el ARNm de BDNF y
también el ARNm de TGF-β1, independiente de la condición de estrés. El efecto sobre BDNF ya
ha sido descrito en otros trabajos (Angelucci, F., y cols., 2004, Bai, O., y cols., 2003, Pillai, A., y
cols., 2006), no habiendo algun mecanismo que explique tal reducción. Mas aun este efecto se
ha asociado con una menor capacidad de aprendizaje espacial, tarea relacionada a la función
hipocampal (Terry, A.V., Jr., y cols., 2003). Es posible que la acción del HAL no necesariamente
corresponda al efecto directo de este fármaco sobre el hipocampo, si no más bien a un efecto
indirecto sobre alguna otra estructura, condición que afecte indirectamente al hipocampo. Esta
explicación podría aplicarse también a CREB, y en consecuencia se afectaría también la
expresión en BDNF y BCL-2. Estos resultados explicar los efectos colaterales del HAL en el
tratamiento de la esquizofrenia, como por ejemplo perdida de la capacidad cognitiva,
disminución en la señalización de vías asociadas a sobrevida neuronal y el aumento en la
apoptosis (Ukai, W., y cols., 2004).
Con respecto al efecto del HAL sobre la expresión del ARNm de TGF-β1, este resultado es la
primera descripción del efecto de este tipo de fármacos en la expresión de esta citoquina a nivel
del SNC. Hasta la fecha, existe solo un trabajo ha reportado los efectos de diferentes fármacos
antipsicóticos en la expresión de citoquinas (Szuster-Ciesielska, A., y cols., 2004). En ese
trabajo, se cultivaron células mononucleares de individuos sanos, las que se estimularon con
fitohemaglutinina en presencia de diferentes fármacos antipsicóticos incluidos el HAL. Tras 72h
de cultivo se observó que la presencia del HAL 1µM produjo un aumento en IL-10 y TGF-β1,
aunque no existe explicación de cómo este fármaco induce a estos mediadores del sistema
inmune (Szuster-Ciesielska, A., y cols., 2004). Por otra parte, la reducción de la señal del ARNm
de TGF-β1 podría deberse a un fenómeno similar al descrito para BDNF. Además, estos
resultados sugieren que TGF-β1 en el hipocampo sería importante para el adecuado desempeño
del animal en tareas que impliquen adquirir respuestas condicionadas, ya que los animales que
120
tienen niveles de ARNm de TGF-β1 reducidos (animales estresados y animales tratados con
HAL) son los que mostraron una capacidad disminuida en la adquisición de respuestas
condicionadas.
4. Estrés crónico, actividad del receptor α2 presináptico y efecto de la DMI:
La activación del receptor noradrenérgico presinaptico α2 inhibe la liberación de diversos
neurotransmisores (De Langen, C.D., y cols., 1979, Meyer, H., y cols., 2000). Por otro lado,
fármacos que inhiben la recaptura de NA regulan hacia abajo los receptores α2, favoreciendo aun
más la disponibilidad de NA en el espacio sináptico, y mejorando así el efecto del antidepresivo
(Warsh, J., y cols., 1998). Diferentes modelos animales de estrés (agudo y crónico) producen un
aumento en la liberación de NA en distintas estructuras del SNC (Corrodi, H., y cols., 1968,
Flugge, G., y cols., 1992, Tjurmina, O.A., y cols., 1999), efectos que se ven acompañados por
una reducción en densidad y sensibilidad del receptor presináptico α2 (Corrodi, H., y cols., 1968,
Flugge, G., y cols., 1992). Se descrito en otros animales de experimentación, como en Tupaia
belengeri, que la inyección aguda de cortisol es capaz de regular hacia abajo al receptor α2 en
distintas regiones del cerebro, mientras que la administración de cortisol en el agua de bebida
por 5 días regula hacia arriba la expresión de este mismo autoreceptor en casi todas las regiones
del cerebro analizadas (Flugge, G., 1999). A pesar del aumento en la liberación de NA que se
induce por el estrés, se logran observar conductas depresivas en los animales; probablemente a
que en el espacio sináptico no se obtienen las concentraciones de NA adecuadas y/o no ocurren
las adaptaciones neuroquímicas que se observan tras el tratamiento crónico con antidepresivos
necesarias para la correcta respuesta del individuo.
Los ensayos de liberación de esta tesis fueron realizados en ausencia de inhibidores de las MAO,
o inhibidores de la catecol-O-metil transferasa (COMT), enzimas que participan en la
terminación de la señalización por catecolaminas. También, hay que considerar que de la
radioactividad de 3H medida se desconoce el porcentaje relacionado a los metabolitos generados
por la actividad de la MAO y de la COMT y a la 3H-NA, por este motivo es que los resultados se
expresan como eflujo de 3H. Sin embargo, los cambios observados por efecto de la ausencia de
Ca2+, y por la presencia de Yoh y Clo en los medios de incubación sugiere que parte del eflujo de
121
3
H corresponde a 3H-NA. Dado que el contenido de NA en el hipocampo es reducido, fue
imposible determinar los efectos agonistas y antagonistas del receptor α2 en la liberación
endogena de este neurotransmisor.
4.1. El tratamiento crónico con DMI a animales sin estresar cambia la sensibilidad del receptor
α2 presináptico:
La liberación de NA en cortes de hipocampo de ratas tratadas crónicamente con DMI no es
potenciada por antagonistas del receptor α2 (idazoxan o Yoh), lo que sugiere una
desensibilización del autoreceptor α2 por el antidepresivo (Nickola, T.J., y cols., 2001, Reynolds,
J.L., y cols., 2005a). Estos resultados concuerdan con los obtenidos en esta tesis, donde la Yoh
potencia el eflujo de 3H inducida por la depolarización por K+ desde cortes de hipocampo de
ratas controles cargados con 3H-NA; efecto que se ve reducido por el tratamiento crónico con
DMI. En apoyo a esta observación, un agonista del receptor α2 como la Clo, no inhibió el eflujo
de 3H. La desensibilización a agonistas α2 por efecto de la administración crónica de DMI ya ha
sido descrita por otros autores (Esteban, S., y cols., 1999). Hay que destacar que el tratamiento
con DMI produce aparentemente cambios en la afinidad del receptor α2 en forma diferencial
para agonistas y antagonistas. Esto puede deberse a que los receptores pueden existir en
diferentes estados conformacionales que puedan dar cuenta de una mayor unión hacia agonistas
y/o antagonistas (Ross, E., y cols., 2001). Por otro lado, se puede considerar que los receptores
pueden coexistir en conformaciones activas e inactivas; y si la forma inactiva es la que
predomina en ausencia de un fármaco, el efecto observado va a ser mínimo. Por otra parte, la
cantidad de efecto observable por acción de un fármaco va a depender de cómo este es capaz de
unirse con mayor afinidad relativa a la forma activa, y además desplazar el equilibrio hacia esta
conformación del receptor (Ross, E., y cols., 2001). Así, considerando las posibles
conformaciones del receptor, sería posible explicar por qué en ciertas condiciones, la activación
de un receptor por el agonista, puede preponderar con respecto a la acción de un antagonista.
En el caso de los animales sometidos a restricción de movimiento, el eflujo de 3H fue en
magnitud mayor a la de los animales control sin estresar. Este resultado es concordante con lo
descrito como efecto del estrés en la liberación de NA en el SNC de rata (Corrodi, H., y cols.,
122
1968, Tjurmina, O.A., y cols., 1999); pudiendo además este efecto ser explicado por la
contribución de los GCs. Un posible mecanismo de acción indirecta de los GCs sobre la
neurotransmisión noradrenérgica podría implicar la participación de otro neurotransmisor capaz
de estimular la liberación de NA en el hipocampo. En este sentido, el glutamato sería un buen
candidato, ya que se ha descrito que este aminoácido puede estimular la liberación de NA a nivel
hipocampal (Vizi, E.S., y cols., 1998). También se sabe que la neurotransmisión glutamatérgica
se ve aumentada por efecto de un aumento sostenido en los niveles de GCs (Gould, E., y cols.,
1999, Sapolsky, R.M., 1996a, 2000). Se ha descrito que la estimulación de receptores α1, y β
adrenérgicos, posiblemente ubicados en los somas de las neuronas piramidales CA1 y CA3 del
hipocampo son capaces de disminuir la liberación de glutamato (Vizi, E.S., y cols., 1998). Así, el
control inhibitorio de los receptores α y β adrenárgicos sobre la liberación del glutamato se
reduciría por una desensibilización de estos receptores noradrenérgicos. Este tipo de regulación
de la liberación de NA por glutamato se ha establecido para otras estructuras del SNC (Forray,
M.I., y cols., 1995). Estos antecedentes sugieren que para que exista una deficiencia en la
neurotransmisión noradrenérgica, no solo deben producirse cambios o alteraciones en los
receptores de este sistema en particular, si no que también la contribución de otros sistemas de
neurotransmisión pudieran estar subyaciendo a la pérdida de la regulación del sistema
noradrenérgico en el SNC.
Por efecto del estrés hubo una desensibilización del autoreceptor α2 solamente evidenciado por
la Yoh; en contraste la Clo aun fue capaz de disminuir el eflujo de 3H, probablemente por el
aumento en la NA en el espacio sináptico. Esto sugiere que existe una mayor afinidad del
receptor α2 por el agonista. Esta proposición se ve avalada por el hecho de que en distintas
regiones del cerebro de individuos depresivos suicidas se ha encontrado un aumento en el
número de sitios de unión para agonistas del receptor α2, y no así para antagonistas α2 (Callado,
L.F., y cols., 1998); sugiriendo que un un desplazamiento del equilibrio hacia las formas activas
del receptor (Ross, E., y cols., 2001). Por otro lado hay que destacar que tanto en animales no
estresados y tratados con DMI y ratas sometidas a estrés crónico, ocurrieron cambios en la
sensibilidad hacia un antagonista (Yoh) y un agonista (Clo) del receptor α2. Las diferencias en
este parámetro pueden deberse a la naturaleza con que ocurre un aumento en la disponibilidad de
NA. En animales control tratados con DMI, es posible considerar un aumento en la
123
disponibilidad de NA por efecto del bloqueo de la recaptura; mientras que en ratas estresadas
habría mayor disponibilidad de NA por efecto del estrés crónico, donde podrían participar la
interacción de otros sistemas (otros neurotransmisores, cambios en el metabolismo, efecto de
hormonas, etc.), que por un lado permitan explicar el aumento en la liberación de NA, y en
segundo lugar expliquen el cambio de conformación del receptor α2 hacia la forma mas afin por
el agonista. De esta forma, en un episodio de estrés con aumento en los niveles de GCs es
posible sugerir cambios en la densidad de receptores α2 presentes en el hipocampo de rata; y
además de la participación de otros sistemas asociados a la respuesta estrés permite modular o
generar algún mecanismo de compensación.
La administración crónica de DMI a animales estresados no produce efectos diferentes a los
observados en las ratas solamente estresadas, sobre el eflujo de 3H, frente a la adición de
agonistas y antagonistas del receptor α2. De esta manera se puede sugerir que el efecto de la
restricción crónica de movimiento, es más importante que la administración de DMI en el eflujo
de 3H, o bien que el efecto de otros componentes de la respuesta de estrés estén enmascarando
los efectos de la DMI en la regulación de la liberación de neurotransmisores moduladas por el
receptor α2.
4.2. El TGF-β1 es capaz de afectar el eflujo de 3H de cortes de hipocampo recientemente
cargados con 3H-NA:
El procedimiento de estrés crónico y el tratamiento crónico con DMI generaron una serie de
cambios en la expresión de marcadores asociados a la resiliencia celular en el hipocampo. Uno
de estos marcadores fue el ARNm de TGF-β1, cuyos niveles se redujeron por acción del estrés
en todo el hipocampo, efecto que fue prevenido por la acción de la DMI. Además estos cambios
en los niveles del ARNm de TGF-β1 fueron concomitantes a los cambios conductuales y a los
cambios en los niveles séricos de GCs en los diferentes grupos de experimentación. Por este
motivo, se evaluó el posible rol neuromodulador del TGF-β1 en la liberación de la NA en el
hipocampo a una concentración de 0,4nM que ha demostrado producir efectos biológicos como
la prevención de la excitotoxicidad del glutamato (Prehn, J.H., y cols., 1994), inducción de la
expresión de BCL-2, BDNF y TrkB en cultivos primario de neuronas (Prehn, J.H., y cols., 1994,
124
Sometani, A., y cols., 2001). Esta proposición se avala por los efectos de otra citoquina como el
TNF-α que modula la liberación hipocampal de NA en animales controles y tratados
crónicamente con DMI (14 días) (Ignatowski, T.A., y cols., 1997, Nickola, T.J., y cols., 2001,
2005b).
Se observó que la presencia del TGF-β1 por periodos cortos (3,5 min) en el medio de
incubación, produjo una inhibición significativa en el eflujo de 3H desde cortes hipocampales de
ratas controles, efecto de similar magnitud a lo observado por la acción de la Clo en este mismo
grupo experimental. Hay que destacar que hasta la fecha no se han reportado estudios sobre la
acción de TGF-β1 en la liberación de neurotransmisores en el SNC, y particularmente en el
hipocampo. El efecto inhibidor de esta citoquina en la liberación de 3H pueda estar mediado por
un efecto rápido sobre los influjos de Ca2+ (Prehn, J.H., y cols., 1994), aunque queda por
determinar el mecanismo por el cual ocurre.
En contraste, el efecto inhibidor del TGF-β1 se transformó en uno potenciador de la liberación
de 3H observado sólo por la administración crónica de DMI y el estrés crónico. Este fenómeno
podría asociarse a cambios en la actividad del receptor a TGF-β1 en función de cambios en la
maquinaria transduccional. Esta acción también puede explicarse en términos de variaciones en
el influjo de Ca2+, probablemente asociado a modificaciones en permeabilidades iónicas que
pueden regular la actividad de canales de Ca2+ regulados por voltaje. En este sentido parecen
jugar un rol importante flujos iónicos que regulan el grado de excitabilidad permitiendo una
regulación en la actividad de canales de Ca2+ dependientes de voltaje. Por ejemplo, los canales
de K+ rectificadores de corrientes de entrada (K+ inward rectifier, Kir), están ampliamente
expresados en el SNC, y modulan la excitabilidad celular favoreciendo la repolarización luego
de un potencial de acción (Chen, L., y cols., 2004, Cohen, N.A., y cols., 1996, Neusch, C., y
cols., 2003, Perillan, P.R., y cols., 2002, Perillan, P.R., y cols., 2000). En el hipocampo se han
detectado estos canales, especialmente de la familia Kir2.0, en neuronas y glias (Stonehouse,
A.H., y cols., 1999). Estos Kir2.0 se regulan por fosforilaciones que alteran la probabilidad de
apertura de dichos canales (Cohen, N.A., y cols., 1996, Perillan, P.R., y cols., 2002, Perillan,
P.R., y cols., 2000). Por ejemplo, el Kir2.3 presente en el hipocampo (Stonehouse, A.H., y cols.,
125
1999), su probabilidad de apertura, disminuye por fosforilación dependiente de PKC-δ (Perillan,
P.R., y cols., 2002, Perillan, P.R., y cols., 2000). En astrocitos en cultivo, TGF-β1 es capaz de
activar la PKC-δ, a través de mecanismos de transducción de señales asociados a su receptor
(Perillan, P.R., y cols., 2002). Este efecto rápido de TGF-β1 puede dar cuenta del mayor eflujo
de 3H inducido por despolarización (Perillan, P.R., y cols., 2002). En este sentido, queda por
explorar si el estrés crónico o los antidepresivos, afectan la actividad de los Kir (Cathala, L., y
cols., 1999, Quignard, J.F., y cols., 2003), particularmente Kir2,3, canal que además puede ser
rápidamente modulado por TGF-β1 (Perillan, P.R., y cols., 2002).
Queda por evaluar si el estrés crónico y/o los GCs afectan la actividad de los Kir en el
hipocampo; puesto que algunos de estos miembros pueden ser afectados por agonistas a GR
como dexametasona (Gallazzini, M., y cols., 2003), o bien por cambios circadianos (Yamashita,
T., y cols., 2003), variando la actividad de estos canales (Cathala, L., y cols., 1999, Quignard,
J.F., y cols., 2003). En este sentido queda por evaluar si los receptores de TGF-β1 modulan la
actividad de PKC-δ, y de esta manera cómo esta activación modula a Kir2.3 en el hipocampo
que establecería un mecanismo de acción presináptico para esta citoquina. También será
importante estudiar si los efectos de TGF-β1 son directos sobre las terminales noradrenérgicas u
otros sistemas, y además sobre las glias.
VIII. Proyecciones:
Los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que el tratamiento crónico con antidepresivos,
como la DMI, ejercen cambios que se observan a largo plazo modificando los niveles de
proteínas asociadas a neuroplasticidad y resiliencia celular. Si bien es cierto que no se evaluaron
cambios por la administración aguda de DMI, será importante evaluar a futuro si las variaciones
en la expresión y niveles de proteínas ocurren en la misma dirección a lo observado tras el
tratamiento crónico. Esto permitirá establecer la dinámica de los cambios plásticos que ocurren a
nivel del SNC y más aún quedará por determinar si estos se requieren para permitir cambios
conductuales apropiados y necesarios para producir la mejoría clínica. Además debido a que el
estrés induce la expresión de BCL-2, proteína con reconocida acción antiapoptótica en el
hipocampo, se deberá determinar si los cambios observados se asocian o no a cambios en
126
procesos de muerte neuronal y si además participan otras proteínas neuroprotectoras cuya
expresión pueda ser modificada por el estrés o antidepresivos como respuestas compensatorias
frente a situaciones que inducen daño neuronal.
Uno de los aspectos relevantes de esta tesis fue el hallazgo de la modificación de la expresión de
TGF-β1 por el estrés, DMI y HAL; sugiriendo que esta citoquina puede ser modulada en forma
diferencial por antidepresivos y antipsicóticos. Queda por precisar si estos cambios ocurren en
otras areas del cerebro, con especial interes en aquellas estructuras que se alteran por la
depresión. También será importante establecer si dichos cambios dependen de la naturaleza del
antidepresivo utilizado. Más aún, para adjudicarle un rol a esta citoquina en los mecanismos de
acción de antidepresivos se deberá probar su acción como molécula antidepresiva en pruebas
conductuales que se validaron en esta tesis como evidencia de depresión animal. Tambien queda
por precisar si la reducción en la expresión de TGF-β1 por el estrés es capaz de inducir deterioro
neuronal en el hipocampo que se pueda asociar a cambios en la capacidad cognitiva trelacionada
a la estructura hipocampal. Además, y dado que TGF-β1 afecta el eflujo de 3H en cortes de
hipocampo cargados con 3H-NA, queda por evaluar si esta citoquina modula la liberación de
neurotransmisores a través de interacciones con el receptor α2 presináptico, de forma similar a lo
descrito para TNF-α. También se deberá evaluar la acción de esta citoquina a nivel de la
excitabilidad neuronal, para explicar los efectos a nivel de la liberación de neurotransmisores
que pudiese estar involucrada en el reestablecimiento de la función hipocampal.
También queda por evaluar cómo este factor de crecimiento altera otras vías de transducción,
que pudieran asociarse al efecto de una acción antidepresiva. De esta forma el efecto
inmunomodulatorio de los antidepresivos a nivel del SNC abre nuevas posibilidades al estudio
de la acción de los antidepresivos, así como también permitiría plantear nuevas estrategias
farmacológicas para el tratamiento de la depresión.
127
IX. Referencias:
Aguilar, M.A., Minarro, J. & Simon, V.M. 2004. "Morphine potentiates the impairing effects of
neuroleptics on two-way active conditioned avoidance response in male mice". Prog
Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 28: 225-237.
Aguilera, G. & Rabadan-Diehl, C. 2000. "Regulation of vasopressin V1b receptors in the anterior pituitary
gland of the rat". Exp Physiol 85 Spec No: 19S-26S.
Aliaga, E., Rage, F., Tapia-Arancibia, L. & Bustos, G. 1999. "Negative regulation of brain-derived
neurotrophic factor mRNA expression by kainic acid in substantia nigra". Brain Res Mol Brain
Res 71: 341-344.
Almawi, W.Y. & Melemedjian, O.K. 2002. "Molecular mechanisms of glucocorticoid antiproliferative
effects: antagonism of transcription factor activity by glucocorticoid receptor". J Leukoc Biol 71:
9-15.
Altar, C.A., Laeng, P., Jurata, L.W., Brockman, J.A., Lemire, A., Bullard, J., Bukhman, Y.V., Young,
T.A., Charles, V. & Palfreyman, M.G. 2004. "Electroconvulsive seizures regulate gene
expression of distinct neurotrophic signaling pathways". J Neurosci 24: 2667-2677.
Altemus, M., Cizza, G. & Gold, P.W. 1992. "Chronic fluoxetine treatment reduces hypothalamic
vasopressin secretion in vitro". Brain Res 593: 311-313.
Amaral, D. & Menno, P. 1995: Hippocampal formation en: The rat nervous system. Paxinos, G. San
Diego.
Andres, S., Cardenas, S., Parra, C., Bravo, J., Greiner, M., Rojas, P., Morales, P., Lara, H. & Fiedler, J.
2006. "Effects of long-term adrenalectomy on apoptosis and neuroprotection in the rat
hippocampus". Endocrine 29: 299-308.
Angelucci, F., Mathe, A.A. & Aloe, L. 2004. "Neurotrophic factors and CNS disorders: findings in rodent
models of depression and schizophrenia". Prog Brain Res 146: 151-165.
APA. American Psychiatric Press. 1999.
Bai, O., Chlan-Fourney, J., Bowen, R., Keegan, D. & Li, X.M. 2003. "Expression of brain-derived
neurotrophic factor mRNA in rat hippocampus after treatment with antipsychotic drugs". J
Neurosci Res 71: 127-131.
Baldessarini, R. 2001: Drugs and the Treatment of Psychiatric Disorders. Depression and Anxiety
Disorders en: Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. Hardman, J.G.,
Limbird, L.E. y Gilman, A.G. New York.
Baldessarini, R. & Tarazi, F. 2001: Drugs and the Treatment of Psychiatric Disorders. Psychosis and
Mania en: Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. Hardman, J.G.,
Limbird, L.E. y Gilman, A.G. New York.
Bayas, A., Hummel, V., Kallmann, B.A., Karch, C., Toyka, K.V. & Rieckmann, P. 2002. "Human
cerebral endothelial cells are a potential source for bioactive BDNF". Cytokine 19: 55-58.
Bekris, S., Antoniou, K., Daskas, S. & Papadopoulou-Daifoti, Z. 2005. "Behavioural and neurochemical
effects induced by chronic mild stress applied to two different rat strains". Behav Brain Res 161:
45-59.
Bellido, I., Hansson, A.C., Gomez-Luque, A.J., Andbjer, B., Agnati, L.F. & Fuxe, K. 2004.
"Corticosterone strongly increases the affinity of dorsal raphe 5-HT1A receptors". Neuroreport
15: 1457-1459.
Berridge, C.W. & Waterhouse, B.D. 2003. "The locus coeruleus-noradrenergic system: modulation of
behavioral state and state-dependent cognitive processes". Brain Res Brain Res Rev 42: 33-84.
Berridge, K.C. 2006. "The debate over dopamine's role in reward: the case for incentive salience".
Psychopharmacology (Berl).
Berridge, K.C. & Robinson, T.E. 1998. "What is the role of dopamine in reward: hedonic impact, reward
learning, or incentive salience?" Brain Res Brain Res Rev 28: 309-369.
128
Bezchlibnyk, Y.B., Wang, J.F., McQueen, G.M. & Young, L.T. 2001. "Gene expression differences in
bipolar disorder revealed by cDNA array analysis of post-mortem frontal cortex". J Neurochem
79: 826-834.
Bisagno, V., Ferrini, M., Rios, H., Zieher, L.M. & Wikinski, S.I. 2000. "Chronic corticosterone impairs
inhibitory avoidance in rats: possible link with atrophy of hippocampal CA3 neurons".
Pharmacol Biochem Behav 66: 235-240.
Blendy, J.A. 2006. "The Role of CREB in Depression and Antidepressant Treatment". Biol Psychiatry.
Bottner, M., Krieglstein, K. & Unsicker, K. 2000. "The transforming growth factor-betas: structure,
signaling, and roles in nervous system development and functions". J Neurochem 75: 2227-2240.
Bravo, J.A., Parra, C.S., Arancibia, S., Andres, S., Morales, P., Herrera-Marschitz, M., Herrera, L., Lara,
H.E. & Fiedler, J.L. 2006. "Adrenalectomy promotes a permanent decrease of plasma corticoid
levels and a transient increase of apoptosis and the expression of Transforming Growth Factor
beta1 (TGF-beta1) in hippocampus: effect of a TGF-beta1 oligo-antisense". BMC Neurosci 7: 40.
Brionne, T.C., Tesseur, I., Masliah, E. & Wyss-Coray, T. 2003. "Loss of TGF-beta 1 leads to increased
neuronal cell death and microgliosis in mouse brain". Neuron 40: 1133-1145.
Brown, E.S., Rush, A.J. & McEwen, B.S. 1999. "Hippocampal remodeling and damage by corticosteroids:
implications for mood disorders". Neuropsychopharmacology 21: 474-484.
Budziszewska, B., Jaworska-Feil, L., Tetich, M., Basta-Kaim, A., Kubera, M., Leskiewicz, M. & Lason,
W. 2002. "Effect of antidepressant drugs on the human corticotropin-releasing-hormone gene
promoter activity in neuro-2A cells". Pol J Pharmacol 54: 711-716.
Burghardt, N.S., Sullivan, G.M., McEwen, B.S., Gorman, J.M. & LeDoux, J.E. 2004. "The selective
serotonin reuptake inhibitor citalopram increases fear after acute treatment but reduces fear with
chronic treatment: a comparison with tianeptine". Biol Psychiatry 55: 1171-1178.
Bye, N. & Nichols, N.R. 1998. "Adrenalectomy-induced apoptosis and glial responsiveness during
ageing". Neuroreport 9: 1179-1184.
Callado, L.F., Meana, J.J., Grijalba, B., Pazos, A., Sastre, M. & Garcia-Sevilla, J.A. 1998. "Selective
increase of alpha2A-adrenoceptor agonist binding sites in brains of depressed suicide victims". J
Neurochem 70: 1114-1123.
Cardenas, S.P., Parra, C., Bravo, J., Morales, P., Lara, H.E., Herrera-Marschitz, M. & Fiedler, J.L. 2002.
"Corticosterone differentially regulates bax, bcl-2 and bcl-x mRNA levels in the rat
hippocampus". Neurosci Lett 331: 9-12.
Castañeda, P. 2006. Análisis del efecto de sertralina sobre marcadores de plasticidad sináptica en un
modelo de depresión animal. Tesis para optar al grado de Doctor en Bioquímica: Universidad de
Chile.
Castren, E. 2005. "Is mood chemistry?" Nat Rev Neurosci 6: 241-246.
Cathala, L. & Paupardin-Tritsch, D. 1999. "Effect of catecholamines on the hyperpolarization-activated
cationic Ih and the inwardly rectifying potassium I(Kir) currents in the rat substantia nigra pars
compacta". Eur J Neurosci 11: 398-406.
Catz, S.D. & Johnson, J.L. 2001. "Transcriptional regulation of bcl-2 by nuclear factor kappa B and its
significance in prostate cancer". Oncogene 20: 7342-7351.
Cerwenka, A. & Swain, S.L. 1999. "TGF-beta1: immunosuppressant and viability factor for T
lymphocytes". Microbes Infect 1: 1291-1296.
Chen, A.C., Shirayama, Y., Shin, K.H., Neve, R.L. & Duman, R.S. 2001. "Expression of the cAMP
response element binding protein (CREB) in hippocampus produces an antidepressant effect".
Biol Psychiatry 49: 753-762.
Chen, L., Yu, Y.C., Zhao, J.W. & Yang, X.L. 2004. "Inwardly rectifying potassium channels in rat retinal
ganglion cells". Eur J Neurosci 20: 956-964.
Closse, A., Camps, M., Wanner, A. & Palacios, J.M. 1988. "In vivo labeling of brain dopamine D2
receptors using the high-affinity specific D2 agonist [3H]CV 205-502". Brain Res 440: 123-132.
Cohen, N.A., Brenman, J.E., Snyder, S.H. & Bredt, D.S. 1996. "Binding of the inward rectifier K+
channel Kir 2.3 to PSD-95 is regulated by protein kinase A phosphorylation". Neuron 17: 759767.
129
Conti, A.C., Cryan, J.F., Dalvi, A., Lucki, I. & Blendy, J.A. 2002. "cAMP response element-binding
protein is essential for the upregulation of brain-derived neurotrophic factor transcription, but not
the behavioral or endocrine responses to antidepressant drugs". J Neurosci 22: 3262-3268.
Corrodi, H., Fuxe, K. & Hokfelt, T. 1968. "The effect of immobilization stress on the activity of central
monoamine neurons". Life Sci 7: 107-112.
Coyle, J.T. & Schwarcz, R. 2000. "Mind glue: implications of glial cell biology for psychiatry". Arch Gen
Psychiatry 57: 90-93.
Cryan, J.F., Markou, A. & Lucki, I. 2002. "Assessing antidepressant activity in rodents: recent
developments and future needs". Trends Pharmacol Sci 23: 238-245.
Cryan, J.F., Page, M.E. & Lucki, I. 2005. "Differential behavioral effects of the antidepressants
reboxetine, fluoxetine, and moclobemide in a modified forced swim test following chronic
treatment". Psychopharmacology (Berl) 182: 335-344.
Curtis, J. & Finkbeiner, S. 1999. "Sending signals from the synapse to the nucleus: possible roles for
CaMK, Ras/ERK, and SAPK pathways in the regulation of synaptic plasticity and neuronal
growth". J Neurosci Res 58: 88-95.
Czeh, B., Michaelis, T., Watanabe, T., Frahm, J., de Biurrun, G., van Kampen, M., Bartolomucci, A. &
Fuchs, E. 2001. "Stress-induced changes in cerebral metabolites, hippocampal volume, and cell
proliferation are prevented by antidepressant treatment with tianeptine". Proc Natl Acad Sci U S
A 98: 12796-12801.
Czyrak, A., Mackowiak, M., Chocyk, A., Fijal, K., Tokarski, K., Bijak, M. & Wedzony, K. 2002.
"Prolonged corticosterone treatment alters the responsiveness of 5-HT1A receptors to 8-OHDPAT in rat CA1 hippocampal neurons". Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 366: 357-367.
Dantzer, R., Wollman, E.E. & Yirmiya, R. 2002. "Cytokines and depression: an update". Brain Behav
Immun 16: 501-502.
De Langen, C.D., Hogenboom, F. & Mulder, A.H. 1979. "Presynaptic noradrenergic alpha-receptors and
modulation of 3H-noradrenaline release from rat brain synaptosomes". Eur J Pharmacol 60: 7989.
De Langen, C.D. & Mulder, A.H. 1980. "On the role of calcium ions in the presynaptic alpha-receptor
mediated inhibition of [3H]noradrenaline release from rat brain cortex synaptosomes". Brain Res
185: 399-408.
Díaz-Véliz, G. 1988. Modificaciones conductuales a través del ciclo estral de la rata. Estudios
farmacológicos d ela participación de mecanismos dopaminérgicos.
Dinan, T.G. & Scott, L.V. 2005. "Anatomy of melancholia: focus on hypothalamic-pituitary-adrenal axis
overactivity and the role of vasopressin". J Anat 207: 259-264.
Dorfman, M., Arancibia, S., Fiedler, J.L. & Lara, H.E. 2003. "Chronic intermittent cold stress activates
ovarian sympathetic nerves and modifies ovarian follicular development in the rat". Biol Reprod
68: 2038-2043.
Douglas-Jones, A.G., Collett, N., Morgan, J.M. & Jasani, B. 2001. "Comparison of core oestrogen
receptor (ER) assay with excised tumour: intratumoral distribution of ER in breast carcinoma". J
Clin Pathol 54: 951-955.
Dow, A.L., Russell, D.S. & Duman, R.S. 2005. "Regulation of activin mRNA and Smad2 phosphorylation
by antidepressant treatment in the rat brain: effects in behavioral models". J Neurosci 25: 49084916.
D'Sa, C. & Duman, R.S. 2002. "Antidepressants and neuroplasticity". Bipolar Disord 4: 183-194.
Duman, C.H., Schlesinger, L., Kodama, M., Russell, D.S. & Duman, R.S. 2006. "A Role for MAP Kinase
Signaling in Behavioral Models of Depression and Antidepressant Treatment". Biol Psychiatry.
Duman, R.S. 2002. "Synaptic plasticity and mood disorders". Mol Psychiatry 7 Suppl 1: S29-34.
Duman, R.S., Strada, S.J. & Enna, S.J. 1989. "Glucocorticoid administration increases receptor-mediated
and forskolin-stimulated cyclic AMP accumulation in rat brain cerebral cortical slices". Brain
Res 477: 166-171.
130
Dwivedi, Y., Rizavi, H.S., Roberts, R.C., Conley, R.C., Tamminga, C.A. & Pandey, G.N. 2001. "Reduced
activation and expression of ERK1/2 MAP kinase in the post-mortem brain of depressed suicide
subjects". J Neurochem 77: 916-928.
Einat, H., Yuan, P., Gould, T.D., Li, J., Du, J., Zhang, L., Manji, H.K. & Chen, G. 2003. "The role of the
extracellular signal-regulated kinase signaling pathway in mood modulation". J Neurosci 23:
7311-7316.
Esteban, S., Llado, J., Sastre-Coll, A. & Garcia-Sevilla, J.A. 1999. "Activation and desensitization by
cyclic antidepressant drugs of alpha2-autoreceptors, alpha2-heteroreceptors and 5-HT1Aautoreceptors regulating monamine synthesis in the rat brain in vivo". Naunyn Schmiedebergs
Arch Pharmacol 360: 135-143.
Fava, M. & Kendler, K.S. 2000. "Major depressive disorder". Neuron 28: 335-341.
Feuvrier, E., Aubert, M., Mausset, A.L., Alonso, G., Gaillet, S., Malaval, F. & Szafarczyk, A. 1998.
"Glucocorticoids provoke a shift from alpha2- to alpha1-adrenoreceptor activities in cultured
hypothalamic slices leading to opposite noradrenaline effect on corticotropin-releasing hormone
release". J Neurochem 70: 1199-1209.
Finkbeiner, S. 2000. "CREB couples neurotrophin signals to survival messages". Neuron 25: 11-14.
Finkbeiner, S., Tavazoie, S.F., Maloratsky, A., Jacobs, K.M., Harris, K.M. & Greenberg, M.E. 1997.
"CREB: a major mediator of neuronal neurotrophin responses". Neuron 19: 1031-1047.
Flanders, K.C., Lippa, C.F., Smith, T.W., Pollen, D.A. & Sporn, M.B. 1995. "Altered expression of
transforming growth factor-beta in Alzheimer's disease". Neurology 45: 1561-1569.
Flugge, G. 1999. "Effects of cortisol on brain alpha2-adrenoceptors: potential role in stress". Neurosci
Biobehav Rev 23: 949-956.
Flugge, G., Johren, O. & Fuchs, E. 1992. "[3H]Rauwolscine binding sites in the brains of male tree shrews
are related to social status". Brain Res 597: 131-137.
Forger, N.G., Wagner, C.K., Contois, M., Bengston, L. & MacLennan, A.J. 1998. "Ciliary neurotrophic
factor receptor alpha in spinal motoneurons is regulated by gonadal hormones". J Neurosci 18:
8720-8729.
Forray, M.I., Andres, M.E., Bustos, G. & Gysling, K. 1995. "Regulation of endogenous noradrenaline
release from the bed nucleus of stria terminalis". Biochem Pharmacol 49: 687-692.
Frechilla, D., Otano, A. & Del Rio, J. 1998. "Effect of chronic antidepressant treatment on transcription
factor binding activity in rat hippocampus and frontal cortex". Prog Neuropsychopharmacol Biol
Psychiatry 22: 787-802.
Gallazzini, M., Attmane-Elakeb, A., Mount, D.B., Hebert, S.C. & Bichara, M. 2003. "Regulation by
glucocorticoids and osmolality of expression of ROMK (Kir 1.1), the apical K channel of thick
ascending limb". Am J Physiol Renal Physiol 284: F977-986.
Ganong, W. 1996a: Bases neurales de la conducta y de las emociones en: Fisiología Médica. Ganong, W.
Ciudad de México.
Ganong, W. 1996b: Médula y corteza suprarrenales en: Fisiología Médica. Ganong, W. Ciudad de
México.
Glavin, G.B. 1985. "Stress and brain noradrenaline: a review". Neurosci Biobehav Rev 9: 233-243.
Gold, P.W., Drevets, W.C. & Charney, D.S. 2002. "New insights into the role of cortisol and the
glucocorticoid receptor in severe depression". Biol Psychiatry 52: 381-385.
Gold, P.W., Licinio, J., Wong, M.L. & Chrousos, G.P. 1995. "Corticotropin releasing hormone in the
pathophysiology of melancholic and atypical depression and in the mechanism of action of
antidepressant drugs". Ann N Y Acad Sci 771: 716-729.
Gonzalez, S.L., Labombarda, F., Gonzalez Deniselle, M.C., Guennoun, R., Schumacher, M. & De Nicola,
A.F. 2004. "Progesterone up-regulates neuronal brain-derived neurotrophic factor expression in
the injured spinal cord". Neuroscience 125: 605-614.
Gould, E. & Tanapat, P. 1999. "Stress and hippocampal neurogenesis". Biol Psychiatry 46: 1472-1479.
Graeff, F.G., Guimaraes, F.S., De Andrade, T.G. & Deakin, J.F. 1996. "Role of 5-HT in stress, anxiety,
and depression". Pharmacol Biochem Behav 54: 129-141.
131
Greiner, M., Cardenas, S., Parra, C., Bravo, J., Avalos, A.M., Paredes, A., Lara, H.E. & Fiedler, J.L. 2001.
"Adrenalectomy regulates apoptotic-associated genes in rat hippocampus". Endocrine 15: 323333.
Grilli, M., Nisoli, E., Memo, M., Missale, C. & Spano, P.F. 1988. "Pharmacological characterization of
D1 and D2 dopamine receptors in rat limbocortical areas. II. Dorsal hippocampus". Neurosci Lett
87: 253-258.
Henrich-Noack, P., Prehn, J.H. & Krieglstein, J. 1996. "TGF-beta 1 protects hippocampal neurons against
degeneration caused by transient global ischemia. Dose-response relationship and potential
neuroprotective mechanisms". Stroke 27: 1609-1614; discussion 1615.
Hoffman, B. & Taylor, P. 2001: Neurotransmission. The Autonomic and Somatic Motor Nervous Systems
en: Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. Hardman, J.G., Limbird,
L.E. y Gilman, A.G. New York.
Holsboer, F. 1999. "The rationale for corticotropin-releasing hormone receptor (CRH-R) antagonists to
treat depression and anxiety". J Psychiatr Res 33: 181-214.
Holsboer, F. 2000. "The corticosteroid receptor hypothesis of depression". Neuropsychopharmacology 23:
477-501.
Holsboer, F. 2001. "Stress, hypercortisolism and corticosteroid receptors in depression: implications for
therapy". J Affect Disord 62: 77-91.
Holsboer, F., Gerken, A., von Bardeleben, U., Grimm, W., Beyer, H., Muller, O.A. & Stalla, G.K. 1986.
"Human corticotropin-releasing hormone in depression--correlation with thyrotropin secretion
following thyrotropin-releasing hormone". Biol Psychiatry 21: 601-611.
Holsboer, F., Liebl, R. & Hofschuster, E. 1982. "Repeated dexamethasone suppression test during
depressive illness. Normalisation of test result compared with clinical improvement". J Affect
Disord 4: 93-101.
Holsboer, F., Von Bardeleben, U., Gerken, A., Stalla, G.K. & Muller, O.A. 1984. "Blunted corticotropin
and normal cortisol response to human corticotropin-releasing factor in depression". N Engl J
Med 311: 1127.
Holsboer, F., von Bardeleben, U., Wiedemann, K., Muller, O.A. & Stalla, G.K. 1987. "Serial assessment
of corticotropin-releasing hormone response after dexamethasone in depression. Implications for
pathophysiology of DST nonsuppression". Biol Psychiatry 22: 228-234.
Hopkins, S.J. & Rothwell, N.J. 1995. "Cytokines and the nervous system. I: Expression and recognition".
Trends Neurosci 18: 83-88.
Ignatowski, T.A., Noble, B.K., Wright, J.R., Gorfien, J.L., Heffner, R.R. & Spengler, R.N. 1997.
"Neuronal-associated tumor necrosis factor (TNF alpha): its role in noradrenergic functioning
and modification of its expression following antidepressant drug administration". J
Neuroimmunol 79: 84-90.
Ising, M., Kunzel, H.E., Binder, E.B., Nickel, T., Modell, S. & Holsboer, F. 2005. "The combined
dexamethasone/CRH test as a potential surrogate marker in depression". Prog
Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 29: 1085-1093.
Izumi, J., Washizuka, M., Hayashi-Kuwabara, Y., Yoshinaga, K., Tanaka, Y., Ikeda, Y., Kiuchi, Y. &
Oguchi, K. 1997. "Evidence for a depressive-like state induced by repeated saline injections in
Fischer 344 rats". Pharmacol Biochem Behav 57: 883-888.
Janeway, C., Travers, P., Walport, M. & Shlomchik, M. www.garlandscience.com. 2001.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Search&db=books&doptcmdl=GenBookHL
&term=TGF-beta+AND+imm%5Bbook%5D+AND+126051%5Buid%5D&rid=imm.table.2499.
13/11/2006
Johnson, S.A., Fournier, N.M. & Kalynchuk, L.E. 2006. "Effect of different doses of corticosterone on
depression-like behavior and HPA axis responses to a novel stressor". Behav Brain Res 168: 280288.
Kandel, E.R., Schwartz, J.H. & Jessell, T.M. 1991: Cellular mechanisms of learning and biological basis
of individuality en: Principles of Neural Science. Kandel, E.R. Norwalk, CT.
132
Kelliher, P., Kelly, J.P., Leonard, B.E. & Sanchez, C. 2003. "Effects of acute and chronic administration
of selective monoamine re-uptake inhibitors in the rat forced swim test".
Psychoneuroendocrinology 28: 332-347.
Khundakar, A.A. & Zetterstrom, T.S. 2006. "Biphasic change in BDNF gene expression following
antidepressant drug treatment explained by differential transcript regulation". Brain Res 1106:
12-20.
Kiernan, J. 2000: Formación reticular en: El sistema nervioso humano. Kiernan, J. Ciudad de México.
Kim, E.S., Kim, R.S., Ren, R.F., Hawver, D.B. & Flanders, K.C. 1998. "Transforming growth factor-beta
inhibits apoptosis induced by beta-amyloid peptide fragment 25-35 in cultured neuronal cells".
Brain Res Mol Brain Res 62: 122-130.
Kobayashi, K., Noda, Y., Matsushita, N., Nishii, K., Sawada, H., Nagatsu, T., Nakahara, D., Fukabori, R.,
Yasoshima, Y., Yamamoto, T., Miura, M., Kano, M., Mamiya, T., Miyamoto, Y. & Nabeshima,
T. 2000. "Modest neuropsychological deficits caused by reduced noradrenaline metabolism in
mice heterozygous for a mutated tyrosine hydroxylase gene". J Neurosci 20: 2418-2426.
Koch, J.M., Kell, S., Hinze-Selch, D. & Aldenhoff, J.B. 2002. "Changes in CREB-phosphorylation during
recovery from major depression". J Psychiatr Res 36: 369-375.
Kodama, M., Russell, D.S. & Duman, R.S. 2005. "Electroconvulsive seizures increase the expression of
MAP kinase phosphatases in limbic regions of rat brain". Neuropsychopharmacology 30: 360371.
Krupinski, J., Kumar, P., Kumar, S. & Kaluza, J. 1996. "Increased expression of TGF-beta 1 in brain
tissue after ischemic stroke in humans". Stroke 27: 852-857.
Laaris, N., Haj-Dahmane, S., Hamon, M. & Lanfumey, L. 1995. "Glucocorticoid receptor-mediated
inhibition by corticosterone of 5-HT1A autoreceptor functioning in the rat dorsal raphe nucleus".
Neuropharmacology 34: 1201-1210.
Laifenfeld, D., Karry, R., Grauer, E., Klein, E. & Ben-Shachar, D. 2005. "Antidepressants and prolonged
stress in rats modulate CAM-L1, laminin, and pCREB, implicated in neuronal plasticity".
Neurobiol Dis 20: 432-441.
Laifenfeld, D., Klein, E. & Ben-Shachar, D. 2002. "Norepinephrine alters the expression of genes
involved in neuronal sprouting and differentiation: relevance for major depression and
antidepressant mechanisms". J Neurochem 83: 1054-1064.
Lecrubier, Y. 2001. "The burden of depression and anxiety in general medicine". J Clin Psychiatry 62
Suppl 8: 4-9; discussion 10-11.
Lehrmann, E., Kiefer, R., Finsen, B., Diemer, N.H., Zimmer, J. & Hartung, H.P. 1995. "Cytokines in
cerebral ischemia: expression of transforming growth factor beta-1 (TGF-beta 1) mRNA in the
postischemic adult rat hippocampus". Exp Neurol 131: 114-123.
Lyons, W.E., Mamounas, L.A., Ricaurte, G.A., Coppola, V., Reid, S.W., Bora, S.H., Wihler, C.,
Koliatsos, V.E. & Tessarollo, L. 1999. "Brain-derived neurotrophic factor-deficient mice develop
aggressiveness and hyperphagia in conjunction with brain serotonergic abnormalities". Proc Natl
Acad Sci U S A 96: 15239-15244.
Maes, M. 2001. "The immunoregulatory effects of antidepressants". Hum Psychopharmacol 16: 95-103.
Maes, M., Song, C., Lin, A.H., Bonaccorso, S., Kenis, G., De Jongh, R., Bosmans, E. & Scharpe, S. 1999.
"Negative immunoregulatory effects of antidepressants: inhibition of interferon-gamma and
stimulation of interleukin-10 secretion". Neuropsychopharmacology 20: 370-379.
Magarinos, A.M. & McEwen, B.S. 1995. "Stress-induced atrophy of apical dendrites of hippocampal
CA3c neurons: involvement of glucocorticoid secretion and excitatory amino acid receptors".
Neuroscience 69: 89-98.
Makino, S., Schulkin, J., Smith, M.A., Pacak, K., Palkovits, M. & Gold, P.W. 1995. "Regulation of
corticotropin-releasing hormone receptor messenger ribonucleic acid in the rat brain and pituitary
by glucocorticoids and stress". Endocrinology 136: 4517-4525.
Malberg, J.E. & Duman, R.S. 2003. "Cell proliferation in adult hippocampus is decreased by inescapable
stress: reversal by fluoxetine treatment". Neuropsychopharmacology 28: 1562-1571.
133
Mallei, A., Shi, B. & Mocchetti, I. 2002. "Antidepressant treatments induce the expression of basic
fibroblast growth factor in cortical and hippocampal neurons". Mol Pharmacol 61: 1017-1024.
Manji, H.K., Drevets, W.C. & Charney, D.S. 2001a. "The cellular neurobiology of depression". Nat Med
7: 541-547.
Manji, H.K. & Duman, R.S. 2001b. "Impairments of neuroplasticity and cellular resilience in severe mood
disorders: implications for the development of novel therapeutics". Psychopharmacol Bull 35: 549.
Mann, C.D., Vu, T.B. & Hrdina, P.D. 1995. "Protein kinase C in rat brain cortex and hippocampus: effect
of repeated administration of fluoxetine and desipramine". Br J Pharmacol 115: 595-600.
Martire, M., Pistritto, G. & Preziosi, P. 1989. "Different regulation of serotonin receptors following
adrenal hormone imbalance in the rat hippocampus and hypothalamus". J Neural Transm 78:
109-120.
McEwen, B.S. 1987. "Glucocorticoid-biogenic amine interactions in relation to mood and behavior".
Biochem Pharmacol 36: 1755-1763.
McEwen, B.S. 1994. "Steroid hormone actions on the brain: when is the genome involved?" Horm Behav
28: 396-405.
McEwen, B.S. 1996. "Gonadal and adrenal steroids regulate neurochemical and structural plasticity of the
hippocampus via cellular mechanisms involving NMDA receptors". Cell Mol Neurobiol 16: 103116.
McEwen, B.S. 1999. "Stress and hippocampal plasticity". Annu Rev Neurosci 22: 105-122.
McEwen, B.S. 2005. "Glucocorticoids, depression, and mood disorders: structural remodeling in the
brain". Metabolism 54: 20-23.
McEwen, B.S. & Sapolsky, R.M. 1995. "Stress and cognitive function". Curr Opin Neurobiol 5: 205-216.
McQuade, R. & Young, A.H. 2000. "Future therapeutic targets in mood disorders: the glucocorticoid
receptor". Br J Psychiatry 177: 390-395.
Meyer, H., Palchaudhuri, M., Scheinin, M. & Flugge, G. 2000. "Regulation of alpha(2A)-adrenoceptor
expression by chronic stress in neurons of the brain stem". Brain Res 880: 147-158.
Mogi, M., Harada, M., Kondo, T., Narabayashi, H., Riederer, P. & Nagatsu, T. 1995. "Transforming
growth factor-beta 1 levels are elevated in the striatum and in ventricular cerebrospinal fluid in
Parkinson's disease". Neurosci Lett 193: 129-132.
Molteni, R., Fumagalli, F., Magnaghi, V., Roceri, M., Gennarelli, M., Racagni, G., Melcangi, R.C. &
Riva, M.A. 2001. "Modulation of fibroblast growth factor-2 by stress and corticosteroids: from
developmental events to adult brain plasticity". Brain Res Brain Res Rev 37: 249-258.
Mora, S. & Díaz-Véliz, G. 1993: Paradigms for the study of behavior en: Methods in Neuroscience.
Conn, M. San Diego, CA.
Murray, C.J.L., Lopez, A.D., Harvard School of Public Health., World Health Organization. & World
Bank. 1996. The global burden of disease : a comprehensive assessment of mortality and
disability from diseases, injuries, and risk factors in 1990 and projected to 2020. In Global
burden of disease and injury series ; v. 1. Cambridge, MA: Published by the Harvard School of
Public Health on behalf of the World Health Organization and the World Bank ; Distributed by
Harvard University Press.
Myint, A.M., Leonard, B.E., Steinbusch, H.W. & Kim, Y.K. 2005. "Th1, Th2, and Th3 cytokine
alterations in major depression". J Affect Disord 88: 167-173.
Nakagawa, S., Kim, J.E., Lee, R., Malberg, J.E., Chen, J., Steffen, C., Zhang, Y.J., Nestler, E.J. & Duman,
R.S. 2002. "Regulation of neurogenesis in adult mouse hippocampus by cAMP and the cAMP
response element-binding protein". J Neurosci 22: 3673-3682.
Nestler, E.J., Barrot, M., DiLeone, R.J., Eisch, A.J., Gold, S.J. & Monteggia, L.M. 2002. "Neurobiology
of depression". Neuron 34: 13-25.
Neusch, C., Weishaupt, J.H. & Bahr, M. 2003. "Kir channels in the CNS: emerging new roles and
implications for neurological diseases". Cell Tissue Res 311: 131-138.
Nibuya, M., Morinobu, S. & Duman, R.S. 1995. "Regulation of BDNF and trkB mRNA in rat brain by
chronic electroconvulsive seizure and antidepressant drug treatments". J Neurosci 15: 7539-7547.
134
Nibuya, M., Nestler, E.J. & Duman, R.S. 1996. "Chronic antidepressant administration increases the
expression of cAMP response element binding protein (CREB) in rat hippocampus". J Neurosci
16: 2365-2372.
Nichols, N.R., Agolley, D., Zieba, M. & Bye, N. 2005. "Glucocorticoid regulation of glial responses
during hippocampal neurodegeneration and regeneration". Brain Res Brain Res Rev 48: 287-301.
Nichols, N.R., Laping, N.J., Day, J.R. & Finch, C.E. 1991. "Increases in transforming growth factor-beta
mRNA in hippocampus during response to entorhinal cortex lesions in intact and
adrenalectomized rats". J Neurosci Res 28: 134-139.
Nickola, T.J., Ignatowski, T.A., Reynolds, J.L. & Spengler, R.N. 2001. "Antidepressant drug-induced
alterations in neuron-localized tumor necrosis factor-alpha mRNA and alpha(2)-adrenergic
receptor sensitivity". J Pharmacol Exp Ther 297: 680-687.
NIMH. National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, US Department of Health and
Human Services. 2002. Public domain pdf file.
http://www.nimh.nih.gov/publicat/depression.cfm. 2006
Nussey, S. & Whitehead, S. BIOS Scientific Publishers Ltd, 2001. 2001. URL.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=endocrin.box.471. 06/11/2006
O'Brien, S.M., Scott, L.V. & Dinan, T.G. 2004. "Cytokines: abnormalities in major depression and
implications for pharmacological treatment". Hum Psychopharmacol 19: 397-403.
Okugawa, G., Omori, K., Suzukawa, J., Fujiseki, Y., Kinoshita, T. & Inagaki, C. 1999. "Long-term
treatment with antidepressants increases glucocorticoid receptor binding and gene expression in
cultured rat hippocampal neurones". J Neuroendocrinol 11: 887-895.
Pariante, C.M. 2004. "Glucocorticoid receptor function in vitro in patients with major depression". Stress
7: 209-219.
Pariante, C.M., Pearce, B.D., Pisell, T.L., Owens, M.J. & Miller, A.H. 1997. "Steroid-independent
translocation of the glucocorticoid receptor by the antidepressant desipramine". Mol Pharmacol
52: 571-581.
Parker, K.J., Schatzberg, A.F. & Lyons, D.M. 2003. "Neuroendocrine aspects of hypercortisolism in major
depression". Horm Behav 43: 60-66.
Paxinos, G. & Watson, C. 1982. The rat brain in stereotaxic coordinates. Sydney ; Orlando: Academic
Press.
Pepin, M.C., Govindan, M.V. & Barden, N. 1992a. "Increased glucocorticoid receptor gene promoter
activity after antidepressant treatment". Mol Pharmacol 41: 1016-1022.
Pepin, M.C., Pothier, F. & Barden, N. 1992b. "Antidepressant drug action in a transgenic mouse model of
the endocrine changes seen in depression". Mol Pharmacol 42: 991-995.
Perillan, P.R., Chen, M., Potts, E.A. & Simard, J.M. 2002. "Transforming growth factor-beta 1 regulates
Kir2.3 inward rectifier K+ channels via phospholipase C and protein kinase C-delta in reactive
astrocytes from adult rat brain". J Biol Chem 277: 1974-1980.
Perillan, P.R., Li, X., Potts, E.A., Chen, M., Bredt, D.S. & Simard, J.M. 2000. "Inward rectifier K(+)
channel Kir2.3 (IRK3) in reactive astrocytes from adult rat brain". Glia 31: 181-192.
Pillai, A., Terry, A.V., Jr. & Mahadik, S.P. 2006. "Differential effects of long-term treatment with typical
and atypical antipsychotics on NGF and BDNF levels in rat striatum and hippocampus".
Schizophr Res 82: 95-106.
Pletscher, A., Shore, P.A. & Brodie, B.B. 1956. "Serotonin as a mediator of reserpine action in brain". J
Pharmacol Exp Ther 116: 84-89.
Prehn, J.H., Bindokas, V.P., Marcuccilli, C.J., Krajewski, S., Reed, J.C. & Miller, R.J. 1994. "Regulation
of neuronal Bcl2 protein expression and calcium homeostasis by transforming growth factor type
beta confers wide-ranging protection on rat hippocampal neurons". Proc Natl Acad Sci U S A 91:
12599-12603.
Quignard, J.F., Harley, E.A., Duhault, J., Vanhoutte, P.M. & Feletou, M. 2003. "K+ channels in cultured
bovine retinal pericytes: effects of beta-adrenergic stimulation". J Cardiovasc Pharmacol 42:
379-388.
135
Rajkowska, G. 2000a. "Histopathology of the prefrontal cortex in major depression: what does it tell us
about dysfunctional monoaminergic circuits?" Prog Brain Res 126: 397-412.
Rajkowska, G. 2000b. "Postmortem studies in mood disorders indicate altered numbers of neurons and
glial cells". Biol Psychiatry 48: 766-777.
Rajkowska, G. 2002. "Cell pathology in bipolar disorder". Bipolar Disord 4: 105-116.
Rajkowska, G., Miguel-Hidalgo, J.J., Wei, J., Dilley, G., Pittman, S.D., Meltzer, H.Y., Overholser, J.C.,
Roth, B.L. & Stockmeier, C.A. 1999. "Morphometric evidence for neuronal and glial prefrontal
cell pathology in major depression". Biol Psychiatry 45: 1085-1098.
Reis, F.L., Masson, S., de Oliveira, A.R. & Brandao, M.L. 2004. "Dopaminergic mechanisms in the
conditioned and unconditioned fear as assessed by the two-way avoidance and light switch-off
tests". Pharmacol Biochem Behav 79: 359-365.
Ren, R.F., Hawver, D.B., Kim, R.S. & Flanders, K.C. 1997. "Transforming growth factor-beta protects
human hNT cells from degeneration induced by beta-amyloid peptide: involvement of the TGFbeta type II receptor". Brain Res Mol Brain Res 48: 315-322.
Reynolds, J.L., Ignatowski, T.A., Gallant, S. & Spengler, R.N. 2004a. "Amitriptyline administration
transforms tumor necrosis factor-alpha regulation of norepinephrine release in the brain". Brain
Res 1023: 112-120.
Reynolds, J.L., Ignatowski, T.A. & Spengler, R.N. 2005a. "Effect of tumor necrosis factor-alpha on the
reciprocal G-protein-induced regulation of norepinephrine release by the alpha2-adrenergic
receptor". J Neurosci Res 79: 779-787.
Reynolds, J.L., Ignatowski, T.A., Sud, R. & Spengler, R.N. 2004b. "Brain-derived tumor necrosis factoralpha and its involvement in noradrenergic neuron functioning involved in the mechanism of
action of an antidepressant". J Pharmacol Exp Ther 310: 1216-1225.
Reynolds, J.L., Ignatowski, T.A., Sud, R. & Spengler, R.N. 2005b. "An antidepressant mechanism of
desipramine is to decrease tumor necrosis factor-alpha production culminating in increases in
noradrenergic neurotransmission". Neuroscience 133: 519-531.
Rhoades, R. & Pflanzer, R.G. 1996: The Adrenal Glands en: Human physiology. Fort Worth.
Rodriguez-Landa, J.F., Contreras, C.M., Gutierrez-Garcia, A.G. & Bernal-Morales, B. 2003. "Chronic, but
not acute, clomipramine or fluoxetine treatment reduces the spontaneous firing rate in the
mesoaccumbens neurons of the rat". Neuropsychobiology 48: 116-123.
Rojas-Corrales, M.O., Berrocoso, E., Gibert-Rahola, J. & Mico, J.A. 2004. "Antidepressant-like effect of
tramadol and its enantiomers in reserpinized mice: comparative study with desipramine,
fluvoxamine, venlafaxine and opiates". J Psychopharmacol 18: 404-411.
Roozendaal, B., Hahn, E.L., Nathan, S.V., de Quervain, D.J. & McGaugh, J.L. 2004. "Glucocorticoid
effects on memory retrieval require concurrent noradrenergic activity in the hippocampus and
basolateral amygdala". J Neurosci 24: 8161-8169.
Rosenbrock, H., Koros, E., Bloching, A., Podhorna, J. & Borsini, F. 2005. "Effect of chronic intermittent
restraint stress on hippocampal expression of marker proteins for synaptic plasticity and
progenitor cell proliferation in rats". Brain Res 1040: 55-63.
Ross, E. & Kenakin, T. 2001: Pharmacodynamics en: Goodman & Gilman's the pharmacological basis of
therapeutics. Hardman, J.G., Limbird, L.E. y Gilman, A.G. New York.
Rothwell, N.J. 1999. "Annual review prize lecture cytokines - killers in the brain?" J Physiol 514 ( Pt 1):
3-17.
Russo-Neustadt, A., Beard, R.C. & Cotman, C.W. 1999. "Exercise, antidepressant medications, and
enhanced brain derived neurotrophic factor expression". Neuropsychopharmacology 21: 679-682.
Sachar, E.J. 1991: Disorders of Feeling: Affective Diseases en: Principles of Neural Science. Kandel,
E.R. New York, NY.
Santarelli, L., Saxe, M., Gross, C., Surget, A., Battaglia, F., Dulawa, S., Weisstaub, N., Lee, J., Duman,
R., Arancio, O., Belzung, C. & Hen, R. 2003. "Requirement of hippocampal neurogenesis for the
behavioral effects of antidepressants". Science 301: 805-809.
Sapan, C.V., Lundblad, R.L. & Price, N.C. 1999. "Colorimetric protein assay techniques". Biotechnol
Appl Biochem 29 ( Pt 2): 99-108.
136
Sapolsky, R.M. 1996a. "Stress, Glucocorticoids, and Damage to the Nervous System: The Current State of
Confusion". Stress 1: 1-19.
Sapolsky, R.M. 1996b. "Why stress is bad for your brain". Science 273: 749-750.
Sapolsky, R.M. 2000. "The possibility of neurotoxicity in the hippocampus in major depression: a primer
on neuron death". Biol Psychiatry 48: 755-765.
Sapolsky, R.M. 2001. "Depression, antidepressants, and the shrinking hippocampus". Proc Natl Acad Sci
U S A 98: 12320-12322.
Schaaf, M.J., de Jong, J., de Kloet, E.R. & Vreugdenhil, E. 1998. "Downregulation of BDNF mRNA and
protein in the rat hippocampus by corticosterone". Brain Res 813: 112-120.
Schmidt, P., Holsboer, F. & Spengler, D. 2001. "Beta(2)-adrenergic receptors potentiate glucocorticoid
receptor transactivation via G protein beta gamma-subunits and the phosphoinositide 3-kinase
pathway". Mol Endocrinol 15: 553-564.
Sclafani, A. 2002. "Flavor preferences conditioned by sucrose depend upon training and testing methods:
two-bottle tests revisited". Physiol Behav 76: 633-644.
Scott, L.V. & Dinan, T.G. 1998. "Vasopressin and the regulation of hypothalamic-pituitary-adrenal axis
function: implications for the pathophysiology of depression". Life Sci 62: 1985-1998.
Scott, L.V. & Dinan, T.G. 2002. "Vasopressin as a target for antidepressant development: an assessment
of the available evidence". J Affect Disord 72: 113-124.
Scully, J.L. & Otten, U. 1995. "Glucocorticoids, neurotrophins and neurodegeneration". J Steroid Biochem
Mol Biol 52: 391-401.
Shen, Y., Connor, T.J., Nolan, Y., Kelly, J.P. & Leonard, B.E. 1999. "Differential effect of chronic
antidepressant treatments on lipopolysaccharide-induced depressive-like behavioural symptoms
in the rat". Life Sci 65: 1773-1786.
Shieh, P.B., Hu, S.C., Bobb, K., Timmusk, T. & Ghosh, A. 1998. "Identification of a signaling pathway
involved in calcium regulation of BDNF expression". Neuron 20: 727-740.
Shih, R.A., Belmonte, P.L. & Zandi, P.P. 2004. "A review of the evidence from family, twin and adoption
studies for a genetic contribution to adult psychiatric disorders". Int Rev Psychiatry 16: 260-283.
Shirayama, Y., Chen, A.C., Nakagawa, S., Russell, D.S. & Duman, R.S. 2002. "Brain-derived
neurotrophic factor produces antidepressant effects in behavioral models of depression". J
Neurosci 22: 3251-3261.
Smith, M.A., Makino, S., Kim, S.Y. & Kvetnansky, R. 1995. "Stress increases brain-derived neurotropic
factor messenger ribonucleic acid in the hypothalamus and pituitary". Endocrinology 136: 37433750.
Sometani, A., Kataoka, H., Nitta, A., Fukumitsu, H., Nomoto, H. & Furukawa, S. 2001. "Transforming
growth factor-beta1 enhances expression of brain-derived neurotrophic factor and its receptor,
TrkB, in neurons cultured from rat cerebral cortex". J Neurosci Res 66: 369-376.
Sonino, N. & Fava, G.A. 1998. "Psychosomatic aspects of Cushing's disease". Psychother Psychosom 67:
140-146.
Soto, C. 2006. Muerte celular de fibroblastos y miofibroblastos cardiacos neonatos por sobre-expresión de
los receptores tipo 1 y 2 de angiotensina II. Memoria para optar al título de Químico
Farmacéutico: Universidad de Chile.
Stark, H., Bischof, A., Wagner, T. & Scheich, H. 2000. "Stages of avoidance strategy formation in gerbils
are correlated with dopaminergic transmission activity". Eur J Pharmacol 405: 263-275.
Stone, E.A., Platt, J.E., Herrera, A.S. & Kirk, K.L. 1986. "Effect of repeated restraint stress,
desmethylimipramine or adrenocorticotropin on the alpha and beta adrenergic components of the
cyclic AMP response to norepinephrine in rat brain slices". J Pharmacol Exp Ther 237: 702-707.
Stonehouse, A.H., Pringle, J.H., Norman, R.I., Stanfield, P.R., Conley, E.C. & Brammar, W.J. 1999.
"Characterisation of Kir2.0 proteins in the rat cerebellum and hippocampus by polyclonal
antibodies". Histochem Cell Biol 112: 457-465.
Szuster-Ciesielska, A., Slotwinska, M., Stachura, A., Marmurowska-Michalowska, H. & KandeferSzerszen, M. 2004. "Neuroleptics modulate cytokine and reactive oxygen species production in
blood leukocytes of healthy volunteers". Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 52: 59-67.
137
Tapia-Arancibia, L., Rage, F., Givalois, L. & Arancibia, S. 2004. "Physiology of BDNF: focus on
hypothalamic function". Front Neuroendocrinol 25: 77-107.
Tardito, D., Perez, J., Tiraboschi, E., Musazzi, L., Racagni, G. & Popoli, M. 2006. "Signaling pathways
regulating gene expression, neuroplasticity, and neurotrophic mechanisms in the action of
antidepressants: a critical overview". Pharmacol Rev 58: 115-134.
Terry, A.V., Jr., Hill, W.D., Parikh, V., Waller, J.L., Evans, D.R. & Mahadik, S.P. 2003. "Differential
effects of haloperidol, risperidone, and clozapine exposure on cholinergic markers and spatial
learning performance in rats". Neuropsychopharmacology 28: 300-309.
Thome, J., Sakai, N., Shin, K., Steffen, C., Zhang, Y.J., Impey, S., Storm, D. & Duman, R.S. 2000.
"cAMP response element-mediated gene transcription is upregulated by chronic antidepressant
treatment". J Neurosci 20: 4030-4036.
Tjurmina, O.A., Goldstein, D.S., Palkovits, M. & Kopin, I.J. 1999. "Alpha2-adrenoceptor-mediated
restraint of norepinephrine synthesis, release, and turnover during immobilization in rats". Brain
Res 826: 243-252.
Tsigos, C. & Chrousos, G.P. 2002. "Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, neuroendocrine factors and
stress". J Psychosom Res 53: 865-871.
Tzivion, G. & Avruch, J. 2002. "14-3-3 proteins: active cofactors in cellular regulation by serine/threonine
phosphorylation". J Biol Chem 277: 3061-3064.
Uhr, M., Holsboer, F. & Muller, M.B. 2002. "Penetration of endogenous steroid hormones corticosterone,
cortisol, aldosterone and progesterone into the brain is enhanced in mice deficient for both mdr1a
and mdr1b P-glycoproteins". J Neuroendocrinol 14: 753-759.
Ukai, W., Ozawa, H., Tateno, M., Hashimoto, E. & Saito, T. 2004. "Neurotoxic potential of haloperidol in
comparison with risperidone: implication of Akt-mediated signal changes by haloperidol". J
Neural Transm 111: 667-681.
Unsicker, K., Flanders, K.C., Cissel, D.S., Lafyatis, R. & Sporn, M.B. 1991. "Transforming growth factor
beta isoforms in the adult rat central and peripheral nervous system". Neuroscience 44: 613-625.
Vaidya, V.A. & Duman, R.S. 2001. "Depresssion--emerging insights from neurobiology". Br Med Bull
57: 61-79.
Valjent, E., Pages, C., Herve, D., Girault, J.A. & Caboche, J. 2004. "Addictive and non-addictive drugs
induce distinct and specific patterns of ERK activation in mouse brain". Eur J Neurosci 19: 18261836.
van der Hart, M.G., Czeh, B., de Biurrun, G., Michaelis, T., Watanabe, T., Natt, O., Frahm, J. & Fuchs, E.
2002. "Substance P receptor antagonist and clomipramine prevent stress-induced alterations in
cerebral metabolites, cytogenesis in the dentate gyrus and hippocampal volume". Mol Psychiatry
7: 933-941.
Van Eekelen, J.A., Jiang, W., De Kloet, E.R. & Bohn, M.C. 1988. "Distribution of the mineralocorticoid
and the glucocorticoid receptor mRNAs in the rat hippocampus". J Neurosci Res 21: 88-94.
Vazquez-Palacios, G., Bonilla-Jaime, H. & Velazquez-Moctezuma, J. 2004. "Antidepressant-like effects
of the acute and chronic administration of nicotine in the rat forced swimming test and its
interaction with fluoxetine [correction of flouxetine]". Pharmacol Biochem Behav 78: 165-169.
Vinaccia, S., Contrerars, F., Restrepo, L., Cadena, J. & Anaya, J. 2005. "Autoeficacia, desesperanza
aprendida e incapacidad funcional en pacientes con diagnóstico de artritis reumatoide".
International Journal of Clinical and Health Psycology 5: 129-142.
Visser, J.A. & Themmen, A.P. 1998. "Downstream factors in transforming growth factor-beta family
signaling". Mol Cell Endocrinol 146: 7-17.
Vizi, E.S. & Kiss, J.P. 1998. "Neurochemistry and pharmacology of the major hippocampal transmitter
systems: synaptic and nonsynaptic interactions". Hippocampus 8: 566-607.
von Bardeleben, U., Holsboer, F., Stalla, G.K. & Muller, O.A. 1985. "Combined administration of human
corticotropin-releasing factor and lysine vasopressin induces cortisol escape from dexamethasone
suppression in healthy subjects". Life Sci 37: 1613-1618.
Warsh, J. & Khanna, J. 1998: Antidepressants and Mood Stabilizing Agents en: Principles of medical
pharmacology. Kalant, H. y Roschlau, W.H.E. New York.
138
Weeber, E.J. & Sweatt, J.D. 2002. "Molecular neurobiology of human cognition". Neuron 33: 845-848.
WHO. World Health Organization. 2006. URL. http://www.who.int/mental_health/en/. 10/12/2006
Xu, H., Steven Richardson, J. & Li, X.M. 2003. "Dose-related effects of chronic antidepressants on
neuroprotective proteins BDNF, Bcl-2 and Cu/Zn-SOD in rat hippocampus".
Neuropsychopharmacology 28: 53-62.
Yamashita, T., Sekiguchi, A., Iwasaki, Y.K., Sagara, K., Iinuma, H., Hatano, S., Fu, L.T. & Watanabe, H.
2003. "Circadian variation of cardiac K+ channel gene expression". Circulation 107: 1917-1922.
Yehuda, R. 1997. "Stress and glucocorticoid". Science 275: 1662-1663.
Ying, S.W., Futter, M., Rosenblum, K., Webber, M.J., Hunt, S.P., Bliss, T.V. & Bramham, C.R. 2002.
"Brain-derived neurotrophic factor induces long-term potentiation in intact adult hippocampus:
requirement for ERK activation coupled to CREB and upregulation of Arc synthesis". J Neurosci
22: 1532-1540.
Young, A.M., Ahier, R.G., Upton, R.L., Joseph, M.H. & Gray, J.A. 1998. "Increased extracellular
dopamine in the nucleus accumbens of the rat during associative learning of neutral stimuli".
Zhao, B. & Schwartz, J.P. 1998. "Involvement of cytokines in normal CNS development and neurological
diseases: recent progress and perspectives". J Neurosci Res 52: 7-16.
Zhou, J.N., Hofman, M.A. & Swaab, D.F. 1996. "Morphometric analysis of vasopressin and vasoactive
intestinal polypeptide neurons in the human suprachiasmatic nucleus: influence of microwave
treatment". Brain Res 742: 334-338.
Zhu, Y., Ahlemeyer, B., Bauerbach, E. & Krieglstein, J. 2001a. "TGF-beta1 inhibits caspase-3 activation
and neuronal apoptosis in rat hippocampal cultures". Neurochem Int 38: 227-235.
Zhu, Y., Culmsee, C., Roth-Eichhorn, S. & Krieglstein, J. 2001b. "Beta(2)-adrenoceptor stimulation
enhances latent transforming growth factor-beta-binding protein-1 and transforming growth
factor-beta1 expression in rat hippocampus after transient forebrain ischemia". Neuroscience 107:
593-602.
Zhu, Y., Prehn, J.H., Culmsee, C. & Krieglstein, J. 1999. "The beta2-adrenoceptor agonist clenbuterol
modulates Bcl-2, Bcl-xl and Bax protein expression following transient forebrain ischemia".
Zhu, Y., Yang, G.Y., Ahlemeyer, B., Pang, L., Che, X.M., Culmsee, C., Klumpp, S. & Krieglstein, J.
2002. "Transforming growth factor-beta 1 increases bad phosphorylation and protects neurons
against damage". J Neurosci 22: 3898-3909.
Zurita, A., Martijena, I., Cuadra, G., Brandao, M.L. & Molina, V. 2000. "Early exposure to chronic
variable stress facilitates the occurrence of anhedonia and enhanced emotional reactions to novel
stressors: reversal by naltrexone pretreatment". Behav Brain Res 117: 163-171.
139

Javier Andrés Bravo Vivallo - Tesis

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