Diagnóstico de PRRSV : su importancia

“Diagnóstico de PRRSV : su importancia”
Fernando A. Osorio
Professor
Nebraska Center for Virology and
School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences
University of Nebraska-Lincoln
[email protected]
Esta platica incluirá:
Diagnostico serológico
Diagnostico por aislamiento viral
Diagnostico molecular
PRRSV en un cerdo :
Efectividad de diferentes tecnicas de diagnostico en
diferentes fases de la infeccion
Viremia Carga viral en tejidos Diagnos(co por necropsia y muestreo de animales
clinicamente infectados: PCR/AV/IHC/ISH Respuesta total de An@cuerpos (ELISA Idexx) Infeccion con PRRSV 0 1 mo. 2 mos. +/-­‐ 5 mos. +1 yr Diagnos(co por serologia ELISA en suero o fluidos orales Diagnos(co viremia PCR/Aislamiento Viral Diagnos(co Infeccion por analisis de fluidos orales PCR Diagnos(co Infeccion por bioensayo o cerdos cen(nelas Animales Reactores Positivos
Unicos al PRRS ELISA
“Singleton”
Animales Reactores Positivos
Unicos al PRRS ELISA
Alternativas:
1. Repetir ensayo (singleton y sus contactos)
2.Ensayo serologico alternativo
Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
ELISAs de bloqueo o competitivas
3. Bio-ensayo in vivo
Immunofluorescencia Indirecta
para Serologia de PRRSV
3. Ig andti-Ig procina marcada con fluoresceina
2. Suero del porcino
1. Celulas infectadas con PRRSV y fijadas (Ag)
Animales Reactores Positivos
Unicos al PRRS ELISA
Resultado del
Primer test de ELISA
Posibles resultados de la repeticion del ensayo
Cerdo 1: Sospechado
de infeccion
Deteccion de PRRSV
Por bio-ensayo
Necropsia:
Pulmon
Linfonodos
Tonsilas
Bazo/Otros tejidos
Cerdo 2:
100% susceptible
(libre de PRRSV)
Inoculacion IP /IM
Homogenaado del pool de tejidos
ELISA sseroconverssion
Viremia
Respuesta positiva en
Cerdo 2
Que lineas celulares se pueden usar para aislar PRRSV
de muestras clinicas?
MARC celulas de riñón
de mono (Kwang et al 1993)
Macrofagos alveolares
del cerdo
riñón 18h ZMAC Cells No inoculadas Inoculadas con PRRSV ZMAC
Zuckermann et al
(UIUC, 2010)
Eficiencia superior de la linea macrofagica porcina ZMAC para
aislar PRRSV , comparada con las celulas MARC-145 y los
cultivos de macrofagos alveolares (PAM)
Cortesia de Dr. Federico Zuckermann (UIUC) Aislamiento de PRRSV en celulas
Practicidad vs. Eficacia
Pros Celulas MARC 145 • Linea celular mas • No son sensibles a accesible a laboratorios muchas cepas de PRRSV Cul(vos de Macrofagos • Sensibles a las mayoria Alveolares Porcinos de cepas de PRRSV ( PAM) Linea de macrofagos porcinos ZMAC Contras • MUY sensibles a la mayoria de cepas de PRRSV/Op(ma sensibilidad • Solo 30 % de las PAM replican PRRSV • Dificiles de preparar •  Mas dificiles de crecer mantener y estandardizar en diferentes laboratorios RT-PCR para deteccion de PRRSV
RT
PRRSV
PRRSV
PRRSV
RNA
cDNA
PCR
Plataforma Para el Test de PCR Tiempo Real Cepheid Smart Cycler Cortesia Dra. Jane Christopher-­‐Hennings SDSU Reac(vos listos para su uso. pre-­‐
montados en el tubo de reaccion y liofilizados Cortesia Dra. Jane Christopher-­‐Hennings SDSU Presentacion como kit comercial Cortesia Dra. Jane Christopher-­‐Hennings SDSU Principio de Accion de la 5’nuclease (Real-­‐Time) PCR Argon Laser Add polymerase, dNTPs, primers, and Taqman probe Charge coupled device Begin PCR DNA R R denature anneal Q Each reporter dye represents one strand of amplified DNA Cortesia Dra. Jane Christopher-­‐Hennings SDSU Principio de accion del sistema de faro molecular ( “molecular beacon” )para Real-­‐
Time PCR Argon Laser Add polymerase, dNTPs, primers, and molecular beacon Charge coupled device DNA Molecular beacon R
Q R Q Each reporter dye represents one strand of amplified DNA Cortesia Dra. Jane Christopher-­‐Hennings SDSU Results
North American PRRSV
Cortesia Dra. Jane Christopher-Hennings SDSU
Curva estandar para cuantificar ARN de
PRRSV
Cortesia Dra. Jane Christopher-Hennings SDSU
Muestras de campo (semen). Curva de
amplificacion
Cortesia Dra. Jane Christopher-Hennings SDSU
Carga viral en suero y semen por PCR
Boar 2
Boar 1
10000000
copies/ml
copies/ml
10000000
100000
1000
1
5
10
15
19
24
29
36
44
58
72
1
86
5
10
15
19
24
29
36
44
58
Days post inoculation
Days post inoculation
Boar 3
Boar 4
72
86
10000000
copies/ml
10000000
copies/ml
1000
10
10
100000
1000
100000
1000
10
10
1
5
10
15
19
24
29
36
44
58
72
1
86
5
10
15
19
24
29
36
44
58
Days post inoculation
Days post inoculation
Boar 5
Boar 6
72
86
72
86
10000000
copies/ml
10000000
copies/ml
100000
100000
1000
100000
1000
10
10
1
5
10
15
19
24
29
36
44
58
Days post inoculation
72
86
1
5
10
15
19
24
29
36
44
58
Days post inoculation
Cortesia Dra. Jane Christopher-Hennings SDSU
Cuantificacion molecular de PRRSV in vivo (viremia)
PCR cuantitativa de ultima generacion: PCR digital “a
gotita”(droplet digital PCR ddPCR)
La muestra amplificar es dividida en 20.000 goticulas identicas
( los DNAs background y el target se distribuyen aleatoriamente)
positiva
negativa
Amplificacion
cada gota es una medicion
digital independiente
Resultado : X copias target (concentracion directa)