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Revista Científica Agropecuaria 17(1-2): 7-15(2013) © 2013 Facultad de Ciencias Agropecuarias - UNER EFECTO DE MEDIOS DE CULTIVO EN EL CRECIMIENTO IN VITRO DE ONCIDIUM BIFOLIUM SIMS. “FEDERAL” Carlos A. DALZOTTO1* 1 Becario de Iniciación en la Investigación del Proyecto PID UNER 2144. Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales. Facultad de Ciencias Agropecuarias (UNER). Ruta 11, km 10,5 (3101) Oro Verde, Entre Ríos. * Autor para correspondencia ([email protected]) RESUMEN El objetivo de este trabajo fue, evaluar el efecto de 4 medios de cultivo utilizando azúcar refinada, agua de coco y 2 fertilizantes foliares comerciales adicionados al medio base de Murashige y Skoog, 1962 (MS) durante el crecimiento in vitro de plántulas de Oncidium bifolium Sims. “federal”. A partir de 120 plantas de O. bifolium “federal” de 261 días cultivadas in vitro, fueron repicadas a 4 medios de cultivo (M); M1: MS completo + 30 g.L-1 de sacarosa; M2: MS a la mitad de la concentración +30 g. L-1 de azúcar refinada + 120 ml.L-1 agua de coco; M3: M2 + 1 g.L-1 fertilizante Peters® (20-20-20); M3: M2 + 1 g.L1 fertilizante Peters® (10-30-20). A los 95 días después del repique los medios M2, M3 y M4 presentaron los mayores valores promedios en altura de plantas, número de raíces y materia seca total, sin que se observaran diferencias significativas (p≤0,05) entre ellos; sí mostraron diferencias significativas (p≤0,05) con respecto al M1. El M4 fue el que presentó el mayor porcentaje de plantas con pseudobulbos y la longitud de los mismos mostró diferencias significativas (p≤0,05) con respecto a los otros medios. El mayor porcentaje de plantas con brotes correspondió al medio M2; y el número y longitud de los brotes no presentaron diferencias significativas (p≤0,05) entre los diferentes medios de cultivo. La relación biomasa aérea/raíz fue superior a 1 en todos los casos; el mayor incremento de la materia seca en el sistema radical fue observado en las plantas cultivadas en los medios M2, M3 y M4. Posteriormente, las plantas fueron extraídas de los frascos, lavadas y plantadas en palo con musgo de Sphagnum. A los 135 días después del trasplante, la supervivencia de las plantas fue del 95%, presentando buen y crecimiento y aspecto general. Palabras clave: orquídeas, crecimiento in vitro, medios de cultivo, rusticación SUMMARY Effects of “in vitro” culture media and growing of Oncidium bifolium Sims. “federal” The objective of this work was to evaluate the effect of four culture media using refined sugar, coconut water and two commercial foliar fertilizers added to the base culture of Murashige y Skoog, 1962 (MS) during the “in vitro” growing of Oncidium bifolium Sims. “federal” seedlings. From 120 plants of O. bifolium that were 261 days before cultured in vitro, they were transplanted to 4 culture *Original recibido (24/04/13) Original aceptado (06/11/13) Carlos A. Dalzotto media (M); M1: MS full strength + 30g.L-1 of saccharose; M2: MS half strength + 30g.L-1 of refined sugar +120 ml.L-1 of coconut water; M3: M2 + 1g.L-1 of Peter fertilizer (20-20-20); M3: M2 +1g.L-1 of Peter fertilizer (10-30-20). Ninety five days after the transplant the cultures M2, M3 and M4 presented the higher average values in plants, roots number and total dry matter with no apparent significant differences (p< 0.05) between them; though they showed significant differences (p< 0.05) with respect to M1. M4 presented the higher percentage of seedlings with pseudobulbs and the length thereof showed significant differences with respect to the other media. The higher percentage of plants with shoots corresponded to M2 media; and the number and length of the shoots did not present significant differences (p< 0.05) among the different media. The area/root biomass relationship was superior to 1 in all cases; the higher increment in the dry matter of the radical system was observed in plants cultured in M2, M3 and M4 media. Later, the plants were extracted of the jars, washed and planted in a stick with moss of Sphagnum. After 135 days of the transplantation, the survival of plants was 95%, showing general good looking and growing. Key words: orchids; in vitro growth; culture media, rustication Introducción Las orquídeas (Orchidaceae) pertenecen a una de las familias más diversas del reino vegetal, con aproximadamente 880 géneros y más de 22075 especies (Stevens, 2008). El género Oncidium, es un grupo de orquídeas de origen americano, muchas de ellas nativas de la Argentina (Freuler, 2008). En la provincia de Entre Ríos, O. bifolium está citada como especie epífita nativa cuya distribución es amplia en toda la zona litoral y centro norte del país, siendo la provincia de Buenos Aires su límite austral (Cellini et al., 2009). En Entre Ríos se encuentra confinada a los cursos de agua de los arroyos y en la zona del delta del Paraná. Si bien la especie tipo suele tener variaciones en cuanto al tamaño de la flor y pigmentación de los pétalos, se han producido variaciones naturales con pétalos sin pigmentación (amarillo entero) y otros con pigmentación rojo vináceo uniforme. Estas variedades naturales han sido denominadas como “pétalos amarillos” y “federal”, respectivamente y no resulta fácil su localización. 8 El cultivo in vitro es una técnica biotecnológica de extendido uso tanto en el campo de la investigación básica y aplicada, como en producción comercial. Ésta consiste en una serie de procedimientos que permiten el crecimiento de pequeñas partes de un vegetal, cultivadas asépticamente en condiciones de ambiente y nutrición controladas (Hartmann y Kester, 1999). El medio de cultivo empleado en la micro propagación consiste en una mezcla de sales inorgánicas y compuestos orgánicos requeridos para la nutrición de los cultivos y existen numerosas formulaciones (Flachsland et al., 1996; Mroginski et al., 2010). Una de las variantes dentro del cultivo in vitro es la adición de compuestos orgánicos al medio de cultivo basal (Pierick, 1990). Entre los más utilizados en la micropropagación de orquídeas se destacan la utilización de pulpa de frutas y el agua de coco (Flores – Escobar et al. 2008, 2011; Stancato et al., 2008; Salazar – Mercado, 2012). En este contexto, la adición de compuestos orgánicos es de suma importancia para el desarrollo de las plantas y favorece en gran medida el crecimiento, RCA. Rev. cient. agropecu. 17(1-2): 7-15 (2013) Efecto de medios de cultivo en el crecimiento in vitro de Oncidium bifolium Sims. “federal” así como la formación de raíces y pseudobulbos por la alta concentración de azúcares, aminoácidos, antioxidantes, minerales, ácidos orgánicos y agentes promotores del crecimiento que contienen (Moreno Martínez y Menchaca García, 2007). Por otra parte, varios autores (Rego Oliveira y Tadeu de Faria, 2005; Unemoto et al., 2007; Romero – Tirado et al., 2007; Pedroso de Moraes et al., 2009), destacan la importancia en el uso de fertilizantes comerciales como un medio para facilitar la preparación de medios de cultivo, y la reducción de los costos de producción en varias especies de orquídea. En vista de lo anterior, el objetivo de este trabajo fue, evaluar el efecto de 4 medios de cultivo utilizando azúcar refinada, agua de coco y 2 fertilizantes foliares comerciales adicionados al medio basal de Murashige y Skoog 1962 (MS) durante el crecimiento in vitro de plantas de O. bifolium Sims. “federal”. Materiales y métodos Esta experiencia se desarrolló en el Laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales, del espacio curricular Fisiología Vegetal, de la Facultad de Ciencias Agropecuarias (UNER). Se partió de plantas de O. bifolium “federal” de 261 días cultivadas in vitro. Estas plantas fueron cultivadas previamente en el mismo laboratorio, en un medio de cultivo semisólido MS, a la mitad de la concentración suplementado con 30 g. L-1 de sacarosa y 5 g. L-1 de Agar Agar Britania; pH 5,6 – 5,8. Estas plantas fueron transferidas a diferentes medios de cultivo (M) (Cuadro 1), suplementados con 5 g. L-1 de Agar Agar Britania y el pH fue ajustado entre 5,6 – 5,8. Los medios de cultivos se esterilizaron en autoclave a 121 ºC y 1 kg cm2 de presión durante 15 minutos. El agua de coco se extrajo de frutos frescos. Se emplearon 6 frascos (repeticiones) de 150 ml conteniendo 30 ml de cada medio de cultivo. Se cultivaron por frasco 5 plantas de 1 – 1,5 cm de altura, 4 - 5 hojas y 1 - 3 raíces. Las plantas repicadas a los diferentes medios de cultivos se llevaron a cámara de crecimiento a una temperatura de 24 ± 1 ºC y un fotoperíodo de 16 horas, con luz grow lux e incandescente. Cuadro 1. Medios de cultivo evaluados durante el crecimiento “in vitro” de plantas de O. bifolium “federal” Medios de cultivos (M) Composición M1 MS medio basal completo + 30 g.L-1 de sacarosa grado analítico M2 Sales de MS a la mitad de la concentración +30 g.L-1 de azúcar refinada + 120 ml.L-1 agua de coco M3 Sales de MS a la mitad de la concentración + 30 g.L-1 de azúcar refinada + 120 ml.L-1 agua de coco + 1 g.L-1 fertilizante Peters® (NPK, 20-20-20) M4 Sales de MS a la mitad de la concentración + 30 g.L-1 de azúcar refinada + 120 ml.L-1 agua de coco + 1 g.L-1 fertilizante Peters® (NPK, 10-30-20) A los 95 días después del repique (ddr) se evaluaron las siguientes variables: a) Altura de planta: tomada de la base de la planta a la punta de la hoja más larga con calibre digital. RCA. Rev. cient. agropecu. 17(2): 7-15 (2012) b) Número de raíces formadas por planta. c) Ausencia o presencia de pseudobulbos: expresándose en porcentaje de planta con pseudobulbo. 9 Carlos A. Dalzotto d) Longitud de los pseudobulbos: en aquellas plantas que presentaban pseudobulbo se midió su longitud con calibre digital. e) Ausencia o presencia de brotes: expresándose en porcentaje de plantas con brotes. f) Altura de los brotes: en aquellas plantas que presentaban brotes se midió su altura con calibre digital. g) Peso seco de biomasa total, biomasa aérea y biomasa de raíces: para la determinación del peso seco se tomaron al azar 15 plantas de cada tratamiento y se pesaron en una balanza de precisión por separado la biomasa aérea y las raíces de cada planta, obteniéndose el peso fresco. Posteriormente se llevaron a estufa a una temperatura de 85 ºC hasta peso constante y se pesaron nuevamente obteniéndose el peso seco de biomasa aérea y el peso seco de las raíces. h) Relación biomasa aérea/raíz: dicha relación se obtuvo a partir de los valores de peso seco de biomasa aérea y de biomasa de raíces. Los datos obtenidos de las variables biométricas a), b), d), f) y g) se analizaron estadísticamente, a partir de un diseño totalmente al azar. Se efectuaron análisis de varianza y la diferencia entre medias empleando la prueba de Duncan para un nivel de significación del 95 % (p≤0,05) utilizando el software InfoStat (Di Rienzo et al., 2008). Rusticación Las plantas logradas in vitro fueron acondicionadas para la etapa de aclimatación exvitro. Para ello se retiraron del medio semisólido un total de 76 plantas, independientemente del tratamiento que provenían, se lavaron sus raíces con agua para eliminar restos de medio y luego se sumergieron unos minutos en una solución de fungicida (Carbendazim, 0,1 ml L-1). Las plantas se colocaron en forma masiva (4 a 7 plantas) en recipientes de polipropileno de 6 cm de altura x 8 cm de diámetro conteniendo piedra mora partida de tamaño pequeño hasta ¾ partes de la altura. Una vez completados los vasos, se colocaron en una bandeja, se aplicó nuevamente el fungicida Carbendazim con aspersor manual, y se los cubrió con una bolsa de nylon para evitar la pérdida de agua por evaporación y lograr un efecto de cámara húmeda. En estas condiciones 10 las plantas permanecieron una semana en laboratorio con luz natural difusa. Posteriormente las plantas se sacaron de los recipientes y fueron montadas en palos de Bignonia de 15 cm de longitud por 1,5 a 3 cm de diámetro sin esterilizar. En su parte media se apoyaron dos plantas de O. bifolium “federal”, se les cubrieron las raíces con musgo de Sphagnum y se ataron con hilo encerado, de manera que quedaran firmes en el palo. Las plantas fueron regadas periódicamente en condiciones de laboratorio durante 30 días, luego fueron llevadas al invernáculo. A los 135 días después del transplante a palo, se evaluó la supervivencia, altura de plantas, número de brotes por plantas y presencia de pseudobulbos. Resultados Desde los primeros 30 días después del repique (ddr) se visualizaron diferencias en el tamaño de las plantas, así como en la formación de raíces y pseudobulbos en cada medio de cultivo. Cuadro 2. Valores medios para altura de planta de O. bifolium “federal” cultivados en los diferentes medios de cultivo (M) a los 95 días después del repique. Letras distintas indican diferencias significativas (p≤0,05). Coeficiente de variación 25,19% Medios de cultivo (M) M1 M2 M3 M4 Altura de (mm) 26,4 44,9 48,0 49,2 a b b b A los 95 ddr los medios de cultivo M2, M3 y M4 presentaron las medias más altas para las variables altura de planta (Cuadro 2) y número de raíces (Cuadro 3), sin que se observaran diferencias significativas (p≤0,05) entre ellas; pero sí evidenciaron diferencias significativas (p≤0,05) con respecto a M1 (Figura 3). RCA. Rev. cient. agropecu. 17(1-2): 7-15 (2013) Efecto de medios de cultivo en el crecimiento in vitro de Oncidium bifolium Sims. “federal” Cuadro 3. Valores medios número de raíces en planta de O. bifolium “federal” cultivados en los diferentes medios de cultivo (M) a los 95 días después del repique. Letras distintas indican diferencias significativas (p≤0,05). Coeficiente de variación 32,76% Plantas con pseudobulbos (%) Medios de cultivo (M) M1 M4 M2 M3 Número de raíces 3,3 5,9 6,1 7,0 a b bc c Cuadro 4. Valores medios longitud de pseudobulbo en plantas de O. bifolium “federal” cultivados en los diferentes medios de cultivo (M) a los 95 días después del repique. Letras distintas indican diferencias significativas (p≤0,05). Coeficiente de variación 21,55% Medios de cultivo (M) M1 M2 M3 M4 Longitud de pseudobulbo (mm) 10,1 a 14,0 b 14,3 b 16,8 c 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 M1 M2 M3 M4 Medios de cultivo (M) Figura 1. Porcentaje de plantas (%) de O. bifolium “federal” con pseudobulbos cultivadas en los diferentes medios de cultivos, a los 95 días después del repique El mayor porcentaje de plantas que lograron la formación de brotes correspondió al medio de cultivo M2, siendo del 67%, mientras que para los medios de cultivo M1, M3 y M4 fue de 60%, 57% y 50% respectivamente (Figura 2). RCA. Rev. cient. agropecu. 17(2): 7-15 (2012) Figura 2. Porcentaje de plantas con brotes (%) en los diferentes medios de cultivos, a los 95 días después del repique, en O. bifolium “federal” Porcentaje de plantas con brotes (%) El medio de cultivo M4 presentó el mayor porcentaje de plantas con pseudobulbos (77%) y la longitud de los mismos mostró diferencias significativas (p≤0,05) con respecto a los medios de cultivo M1, M2 y M3. El menor porcentaje de plantas con pseudobulbos (Figura 1) y longitud (Cuadro 4), correspondió al medio de cultivo M1. 70 60 50 40 30 20 10 0 M1 M2 M3 M4 Medios de cultivo (M) Las variables número de brotes por plantas y longitud de los brotes no 11 Carlos A. Dalzotto presentaron diferencias significativas (p<= 0,05) entre los diferentes medios de cultivo. Aunque se observó una tendencia en M1 con menor número y altura de brotes y M4 con mayor (Cuadro 5). La materia seca a los 95 días de crecimiento in vitro en los diferentes medios de cultivo, indicó un mayor porcentaje acumulado a nivel raíz en comparación con la parte aérea (Cuadro 6) y esa diferencia se destacó aún más en las plantas cultivadas en el medio de cultivo M4. M1 Cuadro 5. Valores medios para número de brotes por plantas y longitud de brotes, en planta de O. bifolium “federal” cultivados en los diferentes medios de cultivo (M) a los 95 días después del repique. Letras distintas indican diferencias significativas (p≤0,05). CV: Coeficiente de variación M2 Medios de cultivo (M) M1 M2 M3 M4 CV (%) Número de brotes Altura de brotes (mm) 1,0 1,5 1,8 1,9 60,46 14,7 18,3 18,6 22,2 56,43 M3 a ab b b a ab ab b M4 Figura 3. Plantas de O. bifolium “federal” cultivadas “in vitro” a los 95 días después del repique en los diferentes medios de cultivo (M). A) M1: MS B) M2: MS + agua de coco; C) M3: MS + agua de coco + fertilizante (20-20-20); D) M4: MS + agua de coco + fertilizante (10-30-20) Cuadro 6. Porcentaje de materia seca de la biomasa aérea, raíces y total de plantas de O. bifolium “federal”, cultivadas en los diferentes medios de cultivo (M) a los 95 días después del repique Medios de cultivo (M) M1 M2 M3 M4 12 Biomasa aérea 7,73 7,39 7,08 7,07 Materia seca (%) Biomasa raíces 12,69 13,60 12,51 14,95 Biomasa total 8,12 8,66 8,12 8,44 RCA. Rev. cient. agropecu. 17(1-2): 7-15 (2013) Efecto de medios de cultivo en el crecimiento in vitro de Oncidium bifolium Sims. “federal” En relación al peso seco por planta, tanto en biomasa aérea, raíces y totales, las que fueron cultivadas en los medios de cultivo M2, M3, y M4 presentaron los mayores valores medios, no encontrándose diferencias significativas (p≤0,05) entre ellos. Mientras que el medio de cultivo M1 fue el que presentó menor peso seco, mostrando diferencias significativas en relación a los demás medios de cultivo (M2, M3 y M4) (Cuadro 7). Cuadro 7. Valores medios peso seco por planta en biomasa aérea, raíces y total en O. bifolium “federal” cultivados en los diferentes medios de cultivo (M) a los 95 días después del repique. Letras distintas indican diferencias significativas (p≤0,05). CV: Coeficiente de variación Medios de cultivo (M) M1 M2 M3 M4 CV (%) Biomasa aérea 0,011 0,019 0,024 0,024 16,66 0,030 a b b b Biomasa aerea 0,025 Raíces Peso seco (g) Biomasa raíces 0,002 0,010 0,010 0,011 27,23 a b b b Biomasa total 0,013 0,029 0,034 0,035 16,42 a b b b valores de relación fueron de 2, 2,5 y 2,3, respectivamente. Peso seco (g) 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 -0,005 M1 M2 M3 M4 -0,010 -0,015 Medios de cultivo (M) Figura 4. Partición de biomasa seca aérea y radical de plantas de O. bifolium “federal” a los 95 días después del repique para los diferentes medios de cultivo (M) En cuanto a la relación biomasa aérea/raíz que es un indicativo del particionamiento de la materia seca entre los órganos, fue superior a 1 en todos los casos (Figura 3 y 4). El medio de cultivo M1 es el que presentó una mayor relación (6,9), valor que estaría indicando un mayor acumulo de materia seca en la biomasa aérea durante el crecimiento de las plantas bajo condiciones in vitro. Al contrario, un mayor incremento de la materia seca en el sistema radical fue observado en las plantas cultivadas en los medios de cultivo M2, M3 y M4, cuyos RCA. Rev. cient. agropecu. 17(2): 7-15 (2012) Discusión Con el medio de cultivo sin agregado de agua de coco y fertilizantes (M1), se obtuvieron la menor altura de plantas, pocas raíces y menor porcentaje de plantas con pseudobulbos, coincidiendo con lo encontrado por Moreno Martínez y Menchaca García (2007) en Stanhopea tigrina (Orchidaceae) obteniendo los mayores valores para las mismas variables al agregar al medio de cultivo MS, 120 ml de agua de coco. Salazar – Mercado (2012) también demostró que la adición de componentes orgánicos como agua de coco al medio MS, favoreció un mayor crecimiento y desarrollo de Cattleya mendelii (Orchidaceae). Los medios de cultivos con fertilizantes y azúcar refinada (M3 y M4), presentaron los mayores valores promedio para las variables altura de planta, número de raíces y porcentaje de plantas con pseudobulbos, valores que coinciden con datos reportados por Romero – Tirado et al., 2007, en Laelia 13 Carlos A. Dalzotto anceps (Orchidaceae), al utilizar en el medio de cultivo el fertilizante Peters® (24-8-16) al 25% (0,5 g/l) más azúcar refinada. Los mayores pesos secos logrados ya sean en biomasa aérea, raíces y totales, se obtuvieron en los medios de cultivo suplementados con agua de coco y fertilizantes. Similares resultados se observaron en la investigación llevado a cabo por Stancato et al, 2008, al adicionarle al medio de cultivo fertilizante (NPK, 10-1010 y NPK, 10-30-20) o compuestos orgánicos (pulpa de manzana, pulpa de banana o pulpa de tomate) en comparación al medio basal MS para la especie Miltonia spectabilis (Orchidaceae). En la investigación de Rego - Oliveira y Tadeu de Faria (2005) en un estudio comparativo de diferentes medios de cultivo (MS, Knudson C (1946), Vacin & Went (1949) y medios a base de fertilizantes NPK, 10-5-5 y 10-30-20), obtuvieron que con el medio conteniendo fertilizante NPK (10-5-5) lograron la mayor longitud promedio de las raíces para las especies Catasetum fimbriatum (Morren) Lindl. y Cyrtopodium paranaensis Schlt. (Orchidaceae). Mientras que el medio a base de NPK (10-30-20) tuvo el mejor promedio en número de raíces, para Catasetum fimbriatum. En el mismo estudio, la relación entre materia seca de la raíz y materia seca de los brotes, los mayores valores lo lograron en los medios a base de fertilizantes, para la especie Cyrtopodium paranaensis. Unemoto et al, 2007, obtuvieron los mejores resultados en la propagación in vitro de Oncidium nanum Lindl. y Cattleya forbesii Lindl., utilizando un medio de cultivo con fertilizante foliar NPK, 6-6-8. Rusticación A los 135 días después del trasplante ex vitro, la supervivencia de las plantas fue del 95%, las mismas se presentaron en buenas condiciones de crecimiento y aspecto general, sin presentar muerte de órganos 14 (raíces u hojas), con un promedio de altura de 5,4 cm medidos sobre las plantas madres las cuales presentaban pseudobulbos de buen desarrollo y 2 brotes por plantas. Conclusiones El medio basal (MS) suplementado con azúcar refinada y agua de coco junto con el empleo del fertilizante Peters® 20-20-20 o 10-30-20, tienen el mismo efecto sobre el crecimiento de O. bifolium “federal”, dando como resultado plantas más vigorosas con mayores alturas, número de raíces, peso seco (biomasa aérea, raíces y totales) y porcentaje de plantas con pseudobulbos. Los suplementos utilizados son económicos y de fácil adquisición en el mercado. Se obtuvieron plantas aptas para su transplante ex vitro, con buen desarrollo radical y tamaño, logrando una alta supervivencia de plantas, con un bajo porcentaje de muerte o pérdidas por ataque de patógenos (5%). Agradecimientos El presente trabajo fue financiado por la Universidad Nacional de Entre Ríos en el marco del PID-UNER 2144 y es parte del trabajo final de graduación del autor defendido en noviembre de 2012. Referencias bibliográficas CELLINI, J.M.; SALOMÓN, L.; GARCÍA, R.; CELLINI, L.; SANCHEZ, M. (2009). Límite sur del área de distribución de Oncidium bifolium Sims. Bol. Soc. Arg. de Botánica. Vol. 44. suplemento, p. 83. XXXII Jornadas Argentinas de Botánica. Huerta Grande, Córdoba. FLACHSLAND, E.; TERADA, G.; REY, H.; MROGINSKI, L. (1996). Medios de cultivo para la germinación “in vitro” de 41 especies de orquídeas. FACENA. 12: 93-100. FLORES – ESCOBAR, G.; LEGARIA – SOLANO, J.P.; GIL – VÁSQUEZ, I.; COLINAS – LEÓN, M.T. (2008). 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