teco diagnostics

TECO DIAGNOSTICS
AMILASA
MÉTODO CINÉTICO
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REACTIVO DE AMILASA:
Para la determinación cuantitativa de la actividad de la amilasa en suero humano
u orina usando procedimientos manuales o automáticos.
INTRODUCCION.
La amilasa fue determinada cuantitativamente por primera vez por un método
yodométrico introducido por Wohlegemuth en 19081. Somogyi introdujo un
procedimiento en 1938 que estandarizó las cantidades de almidón y yodo 2. Su
trabajo se volvió la base para los ampliamente usados métodos Amiloclástico y
Sacarogénico introducidos en 19563 y 19604 respectivamente. Las desventajas de
estos métodos incluyen largos periodos de incubación, interferencias de glucosa
endógena, y reacciones de colores inestables dando como resultado una pobre
reproducibilidad y confiabilidad.
Algunos procedimientos han sido sugeridos5, 6, 7, 8, incluyendo uno, el cual usa el
substrato definido de maltotetraosa. Estos métodos representan una mejora
significativa de la medición de la amilasa pero aun esta sujeto a tiempos
relativamente largos de incubación, posible interferencia de glucosa endógena y
una serie de interferencias potenciales con la formación de NADH10.
Wallenfels et.al. 11, introdujo p-Nitrofenillgicósidos como sustrato definido para
la determinación de amilasa en un procedimiento que eliminó la interferencia de
la glucosa endógena y el piruvato. El presente procedimiento esta basado en
modificaciones de Wallenfels, usando
un sustrato de p-Nitrofenil-DMaltoheptaosida (PNPG7) con la glucosa Terminal bloqueada para reducir la
degradación espontánea del sustrato por glucosidasa y glucoamilasa 12. La prueba
se ejecuta en forma cinética con un periodo de tiempo muy corto y ofrece mucha
mayor estabilidad que las metodologías previas de la amilasa.
La determinación de la actividad de la amilasa en suero y orina es comúnmente
realizada para el diagnostico de la pancreatitis aguda. En la pancreatitis aguda,
los niveles de amilasa están elevados por periodos de tiempo mas largos en orina
mas que en el suero. Por lo tanto, determinar la proporción de amilasa y
aclaramiento de creatinina es importante para seguir el curso de la pancreatitis13.
PRINCIPIO.
PNPG7 Amilasa
PNPG3
PNPG1
Glucoamilasa
Glucosidasa
PNPG3
+ Maltotetraosa
PNPG1 + Glucosa
p-Nitrofenol + Glucosa
La amilasa
hidroliza a p-Nitrofenil D-Maltoheptaosido (PNPG7) a pNitrofenilmaltotriosa (PNPG3) y Maltotetraosa. La Glucoamilasa hidroliza
PNPG3 a p-Nitrofenilglicosido (PNPG1) y glucosa. Entonces PNPG1 es
hidrolizado por glucosidasa a glucosa y p-Nitrofenol, el cual produce un color
amarillo. El rango de incremento en absorbancia es medido a 405 nm y es
proporcional a la actividad de la amilasa en la muestra.
COMPOSICION DEL REACTIVO
(Las concentraciones refieren a reactivos reconstituidos): p-Nitrofenil Dmaltoheptaosido 0.9 mM, Glucosidasa (levadura) 25,000 IU/L, Glucoamilasa
(Rhizopus sp.) 10,000 IU/L, Cloruro de Sodio 50 mM, Cloruro de Calcio 5 mM,
Buffer 50 mM, pH 6.9 +/- 0.1.
CUIDADOS Y PRECAUCIONES.
1.- Solo para uso diagnostico in Vitro.
2.- Tome las precauciones universales requeridas para el manejo de todos los
reactivos de laboratorio. No se recomienda pipetear con la boca ningún tipo de
reactivo.
PREPARACION DEL REACTIVO.
Disuelva los contenidos de cada frasco con el volumen de agua desionizada
indicado en la etiqueta del frasco. Evite pipetear con la boca para prevenir la
contaminación del reactivo por amilasa salival. Después de agregar el agua al
frasco, tápelo bien y mézclelo por inversión. NO LO AGITE.
ALMACENAJE DEL REACTIVO.
1.- Almacene el reactivo seco en refrigeración (2-8°C). El reactivo es estable
hasta la fecha de caducidad mostrada en la etiqueta.
2.- El reactivo reconstituido es estable por al menos 10 días a temperatura
ambiente (15-30°C) y por al menos 30 días en refrigeración (2-8°C).
DETERIORO DEL REACTIVO
El reactivo debe desecharse si:
1.- Se presenta turbidez, la turbidez puede ser un signo de contaminación.
2.- La humedad ha penetrado el frasco y se ha solidificado.
3.- El reactivo no se disuelve completamente con la reconstitución.
4.- El reactivo reconstituido tiene una absorbancia de 0.70 o más cuando es
medido contra agua a 405 nm.
COLECTA Y MANEJO DEL ESPECIMEN
1.- Después de la colecta de la sangre, rápidamente separe el suero del coagulo.
Este suero no bemolizado es el espécimen ideal, pero el plasma de tubos con
heparina también puede ser usado.
2.- Otros anticoagulantes, tales como citrato y EDTA, se unen al Calcio, un ion
necesario para la actividad de la amilasa. Por lo tanto, no deberá utilizarse el
plasma con cualquier anticoagulante diferente a la heparina13.
3.- Las muestras de orina deben ser recolectadas durante un periodo de 24 horas,
ajustando a pH 7 con NaOH 0.1N ó HCl 0.1N y mantenga refrigerado hasta la
prueba. No hay necesidad de agregar conservadores en las muestras de orina 7.
4.- La amilasa en suero y orina se encuentra estable por una semana a
temperatura ambiente (18-25°C) y por algunos meses cuando es refrigerada de
2-8°C y protegida contra la evaporación y contaminación bacteriana14.
SUSTANCIAS DE INTERFERENCIA.
1.- La macroamilasemia incrementa la actividad de la amilasa pancreática en
suero9, 20.
2.- Un número de enfermedades afectan la determinación de la amilasa.16
3.- Young et. Al15. ha enlistado ciertas drogas y otras sustancias que se sabe
interfieren con la actividad de la amilasa.
4.- La lipemia y la hemólisis incrementan los valores de la amilasa7.
5.- La insulina y algunas bacterias también incrementarán la actividad de la
amilasa16.
MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROVEIDOS.
1.- Pipetas precisas.
2.- Tubos de prueba/gradilla.
3.- Cronometro.
4.- Espectrofotómetro capaz de leer a 405 nm (400-420 nm) con cubeta de
control de temperatura (37°C)
5.- Baño Maria (37°C)
6.- Controles.
PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO.
Vea el manual adecuado para la aplicación.
PROCEDIMIENTO MANUAL
1.- Reconstituya el reactivo de acuerdo a las instrucciones.
2.- Pipetee 1.0 mL de reactivo dentro de los tubos etiquetados como “Control”
“Paciente” etc.
3.- Preincube todos los tubos a 37°C por al menos 3 minutos.
4.- Coloque en cero el espectrofotometro con agua a 405 nm. Agregue 0.025 ml
(25 µL) de muestra y lea después de 15 segundos.
5.- Continúe leyendo cada 30 segundos durante 2 minutos.
6.- Determine la diferencia de absorbancia por minuto (ΔAbs/min)
7.- Multiplique la ΔAbs/min por 4824 para obtener el resultado en IU/L.
CALIBRACION.
El procedimiento debe ser estandarizado por la absorbancia mili molar de
Nitrofenol, la cual es 8.5 a 405 nm bajo las condiciones descritas anteriormente
para cada nuevo lote.
CONTROL DE CALIDAD
La validez de la reacción debe monitorearse usando suero control con valores
conocidos de amilasa normal y anormal para cada prueba.
TECO DIAGNOSTICS
AMILASA
MÉTODO CINÉTICO
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CALCULOS.
REFERENCIAS.
ΔAbs/min x V.T. x 1000 = IU/L amilasa en la muestra
AMM x V.M. x P.L.
Donde:
ΔAbs/min: La diferencia por minuto de la absorbancia.
V.T.: Volumen total de la prueba (1.025 mL)
1000: Conversión de IU/mL a IU/L.
AMM: Absorbancia Milimolar de p-Nitrofenol (8.5)
V.M.: Volumen de muestra (0.025 ml).
P.L. Paso de luz (1 cm)
ΔAbs/min x 1.025 x 1000 = Abs/min x 4824
8.5 x 0.025 x 1.0
= IU/L amilasa
Ejemplo: Si ΔAbs/min= 0.03 entonces 0.03 x 4824 = 144.7 IU/L.
Unidades SI:
Para convertir a unidades SI (nkat/L), multiplique el valor IU/L por 16.67.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO.
1.- Las muestras que excedan el limite de linealidad (1500 IU/L) deben ser
diluidas con un volumen igual de salina, repetir la prueba. Multiplique el
resultado por dos.
2.- Las actividades de amilasa y amilasa pancreática se incrementan
engañosamente en el suero de un paciente con macroamilasemia.
VALORES ESPERADOS21, 22.
Suero: hasta 96 IU/L.
Orina: 18 hasta 330 IU/L.
Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores
esperados, ya que existen las diferencias entre instrumentos, laboratorios y
poblaciones.
CARACTERISTICAS ESPECÍFICAS DE DESARROLLO.
1.- Linealidad: 1,500 IU/L
2. Sensibilidad: Basado en un instrumento con resolución de 0.001 absorbancia,
el presente procedimiento tiene una sensibilidad de 5 IU/L.
3. Comparación: Un estudio comparativo se desarrolló entre este método y otro
fabricante con la misma metodología en suero y orina. Los resultados se
muestran a continuación. Las muestras de orina de 70 tuvieron un rango de 60
IU/L a 1000 IU/L y las muestras de suero de 71 tuvieron un rango de 30 IU/L a
900 IU/L.
Muestra
Suero
Orina:
71
70
Coeficiente
de Correlación
0.99
0.99
1. Wohlegemuth, J. Bio Chem., 29:1 (1908).
2. Somogyi, M., J. Bio. Chem., 125:399 (1938).
3. Street, H.V., Close J.R., Clin. Chem. Acta, 1:256 (1956).
4. Henry, R.J., Chiamori, N., Clin. Chem., 6:434 (1960).
5. Rinderknecht, H.P., et al., Experentia, 23:805 (1967).
6. Zinteerhofer, L., et al., Clin. Chem. Acta, 43:5 (1973).
7. Tietz, N.W., et al., Abs. of Proc. of Int'l Seminar and
Workshop on Enzymology, Chicago, I11. (May 1972).
8. Schiwara, H.W., Artzl. Lab, 17:430 (1971).
9. Pierre, K.J., et al., Clin. Chem., 22:1219 (1976).
10. Kaufman, R.A., Tietz, N.W., Clin. Chem., 26/7:851 (1980)
11. Wallenfels, K., et al., Carbohydrate Research, 61:359 (1978).
12. Blair, H.E., U.S. Patent Pending
13. Tietz, N.W., Textbook of Clinical. Chemistry., Philadelphia,
W.B. Saunders Company, pp. 725-734 (1986).
14. Demetriou, J., et al., Clinical Chemistry: Principles and
Technics, 2nd Ed., (Henry, R.J., et al eds.), Hagerstown (MD)
Harper & Row (1974).
15. Young, D.S., Effects of Drugs on clinical Laboratory Tests,
3rd Ed. 3-34 AACC Press, Washington D.C. (1990).
16. Friedman, R.B., Effects of Disease on clinical Laboratory
Tests, 2nd Ed. 3-28. AACC Press, Washington D.C. (1989).
17. Young, D.S., et al., Clin. Chem., 21:ID (1975).
18. Henry, R.J., et al., Clinical Chemistry: Principles and Technics 2nd
Ed.,Hagerstown (MD), Harper & Row, Ch. 13 (1974).
19. Baeber, E.T., et al., Clin. Chem., 36:1124 (1990).
20. Cobbaert, C. Clin. Chem., 37:2159 (1991).
21. Davidson, et al., Evaluation of Pancreatic Amylase. EPS
Method for Use with Urine Samples, Clin. Chem. 38:976-977
(1992).
22. Junge, et al., Clin Biochem., 22:109 (1989).
A533: 10/01
Fabricado por:
Ecuación de
Regresión
y = 0.97 x + 0.78
y = 0.96 x + 1.99
4. Estudios de precisión: realizados de acuerdo a los lineamientos NCCLS
Dentro de pruebas (N= 21)
Media
DS.
C.V. %
60.6
2.4
4.0
414
8.9
2.1
Entre pruebas (N=20)
Media
D.S.
C.V. %
57.2
1.1
2.0
409
6.2
1.5
Distribuido por:
Grupo Tecnología y Laboratorios S.A de C.V.
T. (81) 8370 7992
www.grupotecnolab.com