master dual staining kit

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Avda. Conocimiento, 100
P.T. Ciencias de la Salud
18016 Granada
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MASTER DUAL STAINING KIT
DESCRIPCIÓN:
Master Dual Staining Kit contiene reactivos para llevar a cabo de forma manual o automatizada la doble tinción
immunohistoquimica sobre secciones de tejidos humanos fijados en formalina tamponada e incluidos en parafina.
Este kit contiene un sistema de revelado basado en el sistema de Micropolímeros y es suficiente para la
realización de 30 determinaciones siguiendo el protocolo recomendado.
Presentación
: La referencia/presentación general para este Kit es:
MAD-001882QK – 30 test
Esta referencia es para presentación en envases de Polietileno de Baja Densidad (LDPE) con gotero. En caso de que el usuario desee
otro tipo de presentaciones (referencias/volúmenes diferentes) deberá contactar con el proveedor.
Uso Previsto
: Diagnóstico in vitro en la especie humana
Condiciones de almacenamiento : Frigorífico entre 2 y 8ºC.
Periodo de validez : El envase una vez abierto puede conservarse hasta la fecha de caducidad del reactivo señalada en
la etiqueta. Si el reactivo ha sido almacenado en otras condiciones a las señaladas en este documento el usuario deberá
chequear previamente su correcto funcionamiento teniendo en cuenta que la garantía del producto ya no es válida.
Instrucciones especiales de manipulación: Este reactivo está especialmente diseñado para su manejo en los
inmunoteñidores LabVision Autostainer 480 y 780.
Advertencias y precauciones: 1) El producto solo debe ser manejado por usuarios entrenados y en laboratorios
autorizados. Para su manejo en investigación existen otras presentaciones igualmente idóneas.
2) Téngase en cuenta que la última responsabilidad en la optimización e interpretación de las hibridaciones cromogénicas
practicadas corresponde al facultativo responsable y los técnicos que emplean el kit y que, asimismo, este conjunto de
reactivos no es más que una herramienta útil para la interpretación de los hallazgos morfológicos de cada caso en
conjunción con otros tests diagnósticos y los pertinentes datos clínicos del paciente.
3) El reactivo contiene azida sódica (NaN3) como conservante. Aunque este producto es altamente tóxico y si se mezcla
con agua o ácidos, principalmente en presencia de metales, existe peligro de explosión, estos riesgos están minimizados
al máximo cuando se emplea a concentraciones inferiores al 0,05% como ocurre en este caso. No obstante para el
manejo de este reactivo deben tomarse las siguientes precauciones: a) Uso de guantes y del equipo de protección
establecido para las técnicas de hibridación e inmunohistoquímicas del laboratorio así como estricto respeto de las
prácticas generales de seguridad existentes en el mismo; b) No almacenar los reactivos en envases metálicos ni emplear
utillaje de esta naturaleza para su manejo; c) Almacenar los residuos para su eliminación reglada en contenedores
apropiados según la normativa vigente en cada laboratorio. Nunca arrojarlos por el desagüe.
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POSIBLES COMBINACIONES DE ANTICUERPOS Y SUS APLICACIONES DIAGNÓSTICAS :
Mix anticuerpos
Utilidad
MelanA+PHH3
Identificar con facilidad el número de
mitosis en una lesión melánica
(MAD-001767+ MAD-000584QD)
1
Foto
los anticuerpos utilizados no están incluidos en el kit
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CK7+CDX2
(MAD-001004QD+ MAD-000343QD)
p504 (racemasa)+p63
(MAD-000485QD)
p63+C-erbB2
(MAD-000479QD+ MAD-000308QD)
p501(prosteína)+p63
(MAD-000517QD+ MAD-000479QD)
p16 (RUO)+PHH3
(MAD-000585QD+ MAD-000479QD)
Posible utilidad en diferenciar un tumor
metastásico de origen intestinal de un
tumor de origen pulmonar, pancreático,
mamario o con origen primitivo en el
ovario
PIN cóctel – diferenciar las áreas de
próstata normal, PIN y adenocarcinoma
acinar de próstata
Valoración simultanea de la expresión
proteica del gen HER2 tanto en el
componente in situ como en el infiltrativo
Diferenciar entre carcinoma urotelial y de
próstata en posibles casos pobremente
diferenciados y con morfología
semejante
Identificar el nivel de las mitosis en un
epitelio cervical displásico.
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p16(RUO)+Ki67
(MAD-000585QD+ MAD-000310QD)
CD20+CD3
(MAD-002037QD+ MAD-000621QD)
CD4+CD8
(MAD-000600QD+ MAD-000318QD)
CD10+Bcl2
(MAD-002022QD+ MAD-004002QD)
Valoración del índice mitótico en un
epitelio displásico cervical. Útil en la
valoración de los extendidos citológicos
cervicales
Diferenciar entre el componente B y T de
una proliferación linfoide
Visualización simultanea de los linfocitos
CD4 y CD8 positivos; de utilidad en
proliferaciones linfoides de linfocitos T
cutáneas
Diferenciar entre el componente linfoide
de tipo centro germinal benigno y
maligno
LIMITACIONES Y PRECAUCIONES DEL REACTIVO
El uso sobre tejido congelado no ha sido evaluado.
Las mezclas de anticuerpos usadas en la doble tinción inmunohistoquímica deben ser las recomendadas y suministradas
por el proveedor. En caso contrario debe tenerse en cuenta que los dos anticuerpos tienen que proceder de
animales diferentes (ratón/conejo).
Debido a la presencia de un cromógeno soluble en soluciones alcohólicas, la deshidratación debe ser realizada
al aire o mediante temperatura y el montaje hecho con medios de montaje acuosos.
TIPOS DE MUESTRA
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Secciones de 4 micras de espesor montadas sobre portaobjetos especiales para inmunohistoquímica y obtenidas de
tejidos incluidos en parafina, preferiblemente fijados en formalina tamponada.
PRINCIPIO DEL MÉTODO ANALÍTICO
El objeto de la tinción inmunohistoquímica es convertir en una tinción visible la reacción anticuerpo-antígeno específica de
las moleculas que se pretenden a estudiar en células o tejidos.
De esta manera el Master Dual Staining Kit presenta un conjunto de reactivos altamente específicos y sensibles que
permite la doble visualización de la unión de dos anticuerpos a sus antígenos específicos.
El funcionamiento de este kit se basa en el uso de un mix de dos micropolímeros marcados cada uno con enzimas
diferentes (Peroxidasa y Fosfatasa Alcalina), que reconocen cada uno a las inmunoglobulinas (anticuerpos) desarrolladas
en conejo y ratón respectivamente.
En el caso de haber ocurrido reacción entre los anticuerpos primarios y sus antígenos, los micropolimeros se unen
específicamente a cada uno de ellos y debido al marcaje enzimático, añadiendo los cromógenos y los substratos
correspondientes, se obtienen precipitados de diferentes colores que permiten detectar al microscopio la presencia de los
antígenos específicos.
En el caso del Master Dual Staining Kit, los precipitados obtenidos serán de color marrón para los anticuerpos
desarrollados en Ratón y de color rojo/purpura para anticuerpos de Conejo.
COMPONENTES Y REACTIVOS SUBMINISTRADOS EN EL KIT:
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Bloqueante de la Peroxidasa Endógena
Ultrabloqueante
Mix de Polímeros
Cromógeno DAB:
Tampón substrato
DAB
Cromógeno Rojo
Tampón substrato
Cromógeno rojo
MAD-021540Q-10
MAD-001823QK-A
MAD-001882QK-C
10ML
10ML
10ML
MAD-001844QK-Q1
MAD-001812QK-B
10ML
1ML
MAD-001849QK-A
MAD-001849QK-B
10ML
1ML
EQUIPAMIENTO Y MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO EN EL KIT
 Módulo PT
 Buffers para el Módulo PT
- CITRATO pH6
- EDTA pH8
- TRIS EDTA pH9
 Portaobjetos tratados con silano o tratados eléctricamente
 Cubreobjetos
 Estufa
 Batería de desparafinado-hidratación (Xileno, etanol absoluto y a concentraciones del 80% y 70%)
 Tampón TBS - Tween 20
 Hematoxilina de contraste
 Microscopio óptico
PROTOCOLO TÉCNICO PARA LA DOBLE TINCIÓN INMUNOHISTOQUIMICA SOBRE TEJIDOS INCLUIDOS EN
PARAFINA UTILIZANDO EL MASTER DUAL STAINING KIT
1. Desparafinado y Recuperación antigénica por Calor
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Incubar los portaobjetos con las secciones de tejido parafinado en la estufa a 60ºC toda la noche.
Colocar los portaobjetos en el módulo PT usando las siguientes condiciones:
Precalentar a 65ºC
Desparafinación y recuperación 20 minutos a 95ºC
2. Detección y revelado (manual o automático)
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Lavar en Tampón TBS - Tween 20 a TA
Aplicar sobre el tejido 200 µl del bloqueante de la Peroxidasa e incubar 10 min a TA
Lavar 3 veces en tampón TBS – Tween 20.
Aplicar sobre el tejido 200 µl del Ultrabloqueante e incubar 8 min a TA.
Desechar sin lavar.
Aplicar sobre el tejido 200 µl del Mix de Anticuerpos e incubar* 10 min a TA.
Lavar 3 veces en tampón TBS – Tween 20.
Aplicar sobre el tejido 200 µl del Mix de Polímeros e incubar 30 min a TA.
Lavar 3 veces en Agua Destilada
Mezclar una gota del cromógeno DAB en 1 ml de Substrato del DAB y aplicar la solución resultante sobre el
tejido; incubar 5 min a TA
k. Lavar 3 veces en tampón TBS – Tween 20.
l. Mezclar una gota del cromógeno Rojo en 2.5 ml de Substrato del Crómogeno Rojo y aplicar la solución
resultante sobre el tejido; incubar 10 min a TA
m. Lavar 3 veces en Agua destilada.
5. Tinción de Contraste y montaje
a.
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Teñir con Hematoxilina de Contraste 30 segundos.
Azular en agua corriente.
Deshidratar (secar al aire o con temperatura).
Montar con medio de montaje acuoso e interpretar los resultados al microscopio.
(*) Entre 10 y 20 minutos. Para conocer las condiciones adecuadas de cada mix de anticuerpos debe contactar
con el proveedor.
INCIDENCIAS Y RECLAMACIONES
Se recomienda seguir exhaustivamente todas las indicaciones contenidas en estas instrucciones técnicas. En caso de
que se produzcan resultados atípicos o no esperados se ruega contacten con el delegado comercial de la zona
representante de Vitro S.A. En su defecto, pueden dirigirse a Master Diagnóstica en la dirección comercial, telefónica o
electrónica arriba indicada.
LIMITACIONES DEL REACTIVO
Si se han cumplido todas las condiciones de almacenamiento y manejo en el laboratorio, este reactivo está garantizado
durante todo su tiempo de caducidad. Master Diagnóstica no es responsable de los daños, lesiones personales o
pérdidas económicas en que este reactivo pueda encontrarse implicado.
BIBLIOGRAFÍA:
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Palanisamy. Novel Dual Color Immunohistochemical methods for detecting ERG-PTEN and ERG-SPINK1 status
in prostate carcinoma. Mod Pathol. Author manuscript; available in PMC 2013 December 1.Published in final
edited form as: Mod Pathol. 2013 June; 26(6): 835–848
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