05 Biologia Celular y Molecular 18211KB Jul 10 2015 10:00:09
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Overview The Department of Cellular and Molecular Biology is scaffolded by a multidisciplinary scientific project focused on the role that the cell, and the way it functions at the molecular level, plays as core element of Biology. The Department understands as Cell Biology not only the study of the cell as isolated entity but also its integration into tissues and into the development of organs and organisms. To that aim it involves research groups interested in a variety of model systems, including microbes, be they prokaryotic or eukaryotic, invertebrates and vertebrates. These groups exploit a range of methodologies, such as genetics, physiology, molecular biology and biochemistry, biophysics, optical microscopy and omics. In addition, it includes groups decidedly exploring ‘bottom-up’ synthetic approaches to reconstruct minimal cytomimetic systems by means of the controlled assembly of proteins or nucleic acids in defined structures, thus allowing their integration into lipid vesicles and other cytomimetic compartments. These objectives have clear implications for Nanotechnology and Biotechnology. Miguel Ángel Peñalva Department Head 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 100 24/6/15 12:53 05 Biología Celular y Molecular Cellular & Molecular Biology 102 Miguel Ángel Peñalva Soto · Eduardo Antonio Espeso Fernández Biología Molecular y Celular de Aspergillus | Aspergillus Molecular and Cellular Biology 104 Germán Rivas Caballero · Carlos Alfonso Botello, Mercedes Jiménez Sarmiento y Silvia Zorrilla López Bioquímica de Sistemas de la División Bacteriana | Systems Biochemistry of Bacterial Division 106 Rafael Giraldo Suárez · M. Elena Fernández-Tresguerres Rodríguez-Vigil y Juan Francisco Giménez Abián Ensamblajes Macromoleculares Microbianos Sintéticos | Synthetic Microbial Macromolecular Assemblies 108 Jorge Bernardo Schvartzman Blinder · Dora Beatriz Krimer Smunis y Pablo Hernández Valenzuela Biología Molecular de los Cromosomas | Molecular Biology of the Chromosomes 110 Miguel Angel Vidal Caballero El Sistema Polycomb de Regulación Epigenética | Epigenetic Control by the Polycomb Group of Genes 112 Patricia Boya Funciones de la Autofagia en la Fisiopatología de los Organismos | Roles of Autophagy in Health and Disease 114 Jesús del Mazo Martínez Biología Molecular de la Gametogénesis | Molecular Biology of Gametogenesis 116 Rosa María Lozano Puerto · Blanca Pérez-Maceda Reconocimiento Célula-Biomaterial | Cell-Biomaterial Recognition 118 Susana Moreno Díaz de la Espina Matriz Nuclear y Regulación de la Organización y Funcionalidad Nuclear Nuclear Matrix and Regulation of the Nuclear Organization and Function 120 José Luis Barbero Esteban · Lucas Sánchez Rodríguez Dinámica Cromosómica en Meiosis | Chromosomal Dynamics in Meiosis 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 101 24/6/15 12:53 Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Miguel Ángel Peñalva Soto Eduardo Antonio Espeso Fdez. Profesor de Investigación [email protected] Científico Titular [email protected] PhD, 1982 Universidad Autónoma de Madrid Postdoctoral Antibióticos SA (Madrid) Institut de Genetique et Microbiologie, Universidad de Paris (Orsay, Paris) Científico Titular, 1987 Jefe de Grupo, 1987 Profesor de Investigación, 2001 CIB, CSIC Visiting Scientist, 2005-2006 MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, UK) Elegido miembro, 2000 EMBO PhD, 1989 Universidad Complutense de Madrid Postdoctoral, 1997-1999 Imperial College London EMBO-Postdoctoral Fellow Contratado, 2001-2004 Ramón y Cajal Científico Titular, 2004 Jefe de Grupo, 2004 CIB, CSIC Secretario, 2004-2008 Grupo Especializado de Hongos Filamentosos y Levaduras (SEM) Otros miembros | Other lab members: Herbert N. Arst (Ad honorem) Elena Reoyo Hernández Areti Pantazopoulou Mario Pinar Sala Manuel Sánchez López-Berges Maria Villarino Pérez Victor García Tagua Laura Mellado Maroñas Daniel Lucena Agell Patricia Hernández Ortiz Maria-Tsampika Manoli Miguel Hernández González http://www.cib.csic.es/es/grupo.php?idgrupo=8 Biología Molecular y Celular de Aspergillus Aspergillus nidulans es un modelo genético apropiado para estudiar exocytosis polarizada y transporte a larga distancia por microtúbulos y actina. Su tráfico intracellular se asemeja al de metazoos, pero el hongo es haploide, genéticamente manipulable y conveniente para microscopía. M ediante la combinación de abordajes genéticos y bioquímicos con microscopía multidimensional in vivo, estudiamos la organización y la dinámica del Golgi y del sistema endovacuolar, centrándonos en GTPasas RAB y ARF, sus reguladores y sus efectores. El Golgi de Aspergillus está formado por cisternas dispersas que pueden resolverse por microscopía óptica. Pretendemos comprender los mecanismos de maduración de cisternas del Golgi y específicamente la biogénesis de carriers post-Golgi en el TGN, así como las diferentes rutas por las que membrana y cargo salen del ER. Nuestro trabajo tiene importantes implicaciones tanto en medicina como en agricultura (la patogenicidad de los hongos hacia humanos y plantas dependen estrictamente de la exocitosis y los hongos son sensibles a ciertas drogas antitumorales) y también en el campo de la biotecnología, dado que una parte substancial del portafolio de enzimas industriales se fabrica con especies de Aspergillus como factorías celulares. Muchas rutas biosintéticas y catabólicas estan sujetas a regulación transcripcional. Estudiamos las señales, los receptores, la transducción de la señal y los mecanismos que modifican tanto las actividades como la localización celular de factores de transcripción. En los eucariotas el transporte de los factores transcripcionales al interior nuclear es un punto clave en la regulación de su actividad. Usando como modelo diferentes factores nucleares queremos entender los mecanismos de señalización y transporte entre citoplasma y núcleo en un organismo con organización celular cenocítica (multinucleado). En especial nos centramos en aquellos que median en la respuesta al estrés por cationes y la alcalinidad como son los factores con dedos de zinc SltA y CrzA. El estudio de estos reguladores pemite abordar la señalización mediada por calcio/calcineurina, analizar la proteólisis como mecanismo de activación postraduccional y el papel de la tolerancia al estrés en procesos de virulencia fúngica. Figura 1 | Figure 1 Portada del número de Julio de la revista Autophagy, por el artículo de Pinar et al. que demuestra que las membranas de la ruta de autofagia en hongos derivan de estructuras asociadas con el ER que se asemejan a los omegasomas de metazoos. Cover of the July 2013 issue of the journal Autophagy, for the article by Pinar et al. showing that fungal autophagic membranes derive from ER-associated srtuctures resembling metazoan omegasomes. Financiación | Funding • BIO2012-30695 (MINECO) • S2010/BMD-2414 (Comunidad de Madrid) • IPT-2011-0752-900000 (MINECO) • BFU2012-33142 (MINECO) • RD12/0018/0007 (ISCIII-FEDER) 102 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 102 24/6/15 12:53 Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Aspergillus Molecular and Cellular Biology Aspergillus nidulans is a genetic model well suited for studying polarised exocytosis and long-distance transport mediated by actin and microtubules. Intracellular traffic resembles that of metazoan cells, yet the organism is haploid, genetically amenable and microscopy-friendly. B y combining genetic and biochemical approaches with in vivo multidimensional microscopy, we are studying the organization and dynamics of the Golgi and endovacuolar systems, focusing on RAB and ARF GTPases, their regulators and their effectors. The Aspergillus Golgi is formed by non-stacked early and late Golgi cisternae that can be resolved by optical microscopy. We are studying the mechanisms of cisternal maturation in the Golgi, and specifically the mechanisms that determine the biogenesis of post-Golgi carriers in the TGN, as well as the different pathways for the exit of membrane and cargo from the endoplamic reticulum. Our work has important implications for both medicine and agriculture (fungal pathogenicity to plants and humans is strictly dependent on exocytosis and fungal cells are sensitive to certain anti-tumour drugs) and major ones for biotechnology, as a substantial share of the industrial enzyme catalogue is produced with Aspergillus species as cell factories. Most biosynthetic and catalytic pathways are transcriptionally regulated. We study signals, receptors, signaling transduction and the mechanisms behind the activation and cellular localisation of transcription factors. In eukaryotes, nuclear transport is a key regulatory step in the regulation of a transcription factor activity. Using as models diverse nuclear factors we try to understand the mechanisms involved in signaling and traffick between cytoplasm and nucleus in a coenocytic (multi nuclear) organism. Specifically we focus on the zinc-finger transcription factors SltA and CrzA that mediate in the responses to cation and alkaline pH stresses. Studying these regulators allow us to investigate the calcium-calcineurin mediated signaling, proteolysis as a mechanism of posttranslational activation and the role of stress tolerance in fungal virulence. Publicaciones Seleccionadas Selected Publications • Pinar, M, A Pantazopoulou & MA Peñalva [2013] Live-cell imaging of Aspergillus nidulans autophagy: RAB1 dependence, Golgi independence and ER involvement. Autophagy 9: 1-20. (Journal Cover). • Pinar, M, Pantazopoulou, A, Arst, HN, Jr, and Peñalva, MA [2013] Acute inactivation of the Aspergillus nidulans Golgi membrane fusion machinery: correlation of apical extension arrest and tip swelling with cisternal disorganization. Mol. Microbiol. 89: 228-248. (Editorial Minireview). • Etxebeste O, Villarino M, Markina-Iñarrairaegui A, Araújo-Bazán L, Espeso EA. [2013] Cytoplasmic dynamics of the general nuclear import machinery in apically growing syncytial cells. PLoS One 8(12):e85076. • Shantappa S, Dhingra S, Hernández-Ortiz P, Espeso EA, Calvo AM. [2013] Role of the zinc finger transcription factor SltA in morphogenesis and sterigmatocystin biosynthesis in the fungus Aspergillus nidulans. PLoS One. 8(7):e68492. • Hernández-Ortiz P, Espeso EA. [2013] Phospho-regulation and nucleocytoplasmic trafficking of CrzA in response to calcium and alkaline-pH stress in Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 89(3):532-51. Figura 2 | Figure 2 Señalización del factor CrzA y análisis fenotípico de cepas nulas CrzA y SltA. A) CrzA muestra diferentes estados de fosforilación y la adición de calcio o la alcalinización del medio altera el patrón de fosforilación. RC=resting cells. B) La ausencia de CrzA causa sensibilidad al calcio mientras que una cepa nula sltA es sensible a una gran variedad de cationes, y ambas a pH alcalino. Signalling of CrzA factor and phenotypic analyses of null crzA and sltA strains. A) CrzA displays different phosphorylation states. Addition of calcium or medium alkalinisation alter the phospho-pattern. RC=resting cells. B) Absence of CrzA activity results in calcium sensitivity. A null sltA strain is sensitive to a large variety of cations, both null strains are sensitive to alkalinity. • Zhang, J, R Qiu, HN Arst, Jr, MA Penalva, and X Xiang [2014] HookA is a novel dynein-early endosome linker critical for cargo movement in vivo. Journal of Cell Biology 204:1009-1026. (Editorial comment as Journal Focus). • Pantazopoulou, A, M Pinar, X Xiang & MA Peñalva [2014] Maturation of late Golgi cisternae into RabERAB11 exocytic post-Golgi carriers visualized in vivo. Mol Biol Cell 25: 2428-2443 (edited by Benjamin Glick) • Arst, HN, Jr, Hernández-González, M, Peñalva, MA, and Pantazopoulou, A. [2014] GBF/Gea mutant with a single substitution sustains fungal growth in the absence of BIG/Sec7. FEBS Lett 588, 4799-4786. • Peñalva MA, Lucena-Agell D, Arst HN Jr. [2014] Liaison alcaline: Pals entice non-endosomal ESCRTs to the plasma membrane for pH signaling. Curr Opin Microbiol. 22C:49-59. • Bertuzzi M, Schrettl M, Alcazar-Fuoli L, Cairns TC, Muñoz A, Walker LA, Herbst S, Safari M, Cheverton AM, Chen D, Liu H, Saijo S, Fedorova ND, Armstrong-James D, Munro CA, Read ND, Filler SG, Espeso EA, Nierman WC, Haas H, Bignell EM. [2014] The pH-responsive PacC transcription factor of Aspergillus fumigatus governs epithelial entry and tissue invasion during pulmonary aspergillosis. PLoS Pathog. 10(10):e1004413. • Liu W, Mellado L, Espeso EA, Sealy-Lewis HM. [2014] In Aspergillus nidulans the suppressors suaA and suaC code for release factors eRF1 and eRF3 and suaD codes for a glutamine tRNA. G3 (Bethesda). 4(6):1047-57. 103 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 103 24/6/15 12:53 Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Germán Rivas Caballero Investigador Científico [email protected] PhD, 1989 Universidad Autónoma de Madrid Postdoctoral, 1990-1993 NIH, Bethesda, USA Biozentrum, Univ. Basilea, CH Investigador, 1994 Científico Titular, 1995 Jefe de Grupo,1996 Investigador Científico, 2006 CIB, CSIC Investigadores del equipo | Staff scientists: Carlos Alfonso Botello Mercedes Jiménez Sarmiento Silvia Zorrilla López Otros miembros | Other lab members: Victor Hernández Rocamora Elisa Jiménez Cabré Begoña Monterroso Marco Concepción García Montañés Ana Raso Alonso Marta Sobrinos Sanguino Noelia Ropero Alicia Rodríguez http://www.cib.csic.es/es/grupo.grivas Bioquímica de Sistemas de la División Bacteriana Nuestro objetivo es entender cómo los elementos de la maquinaria de la división bacteriana (el divisoma) funcionan como un sistema integrado de interacciones moleculares para ejercer su función esencial. Desarrollamos y aplicamos novedosos abordajes de reconstitución bioquímica para construir, con un conjunto mínimo de proteínas, ensamblajes funcionales de división en ausencia de células. 1 Organización y reconstrucción bioquímica de componentes del anillo FtsZ en sistemas de membrana: La división bacteriana está mediada por un conjunto de proteínas que interaccionan en el sitio de división, ensamblando un anillo dinámico que dispara la citoquinesis y forma parte del divisoma. En Escherichia coli, la proteína FtsZ, principal elemento del anillo septal, se ancla a la membrana interna por la acción de las proteínas ZipA y FtsA, formando el primer ensamblaje molecular del divisoma, el proto-anillo. El posicionamiento del anillo en el punto medio está regulado por dos sistemas de control (el complejo MinCDE y la oclusión del nucleoide - SlmA) que inhiben su formación en lugares equivocados. Estudiamos las actividades e interacciones de FtsZ en reconstrucciones mínimas del protoanillo estructuradas en sistemas de membrana, como nanodiscos, microesferas, bicapas, vesículas y microgotas (Fig. 1). Investigamos la acción de MinCDE y SlmA sobre las propiedades de divisomas mínimos. 2 Reactividad macromolecular y organización en entornos aglomerados y confinados citomiméticos: El ensamblaje del divisoma in vivo tiene lugar en entornos caracterizados por la presencia de altas concentraciones de macromoléculas, que pueden estructurarse como redes dinámicas solubles o asociadas a la membrana. Aplicamos y diseñamos reconstrucciones sintéticas de estos microentornos para investigar el impacto de la exclusión de volumen y la unión a membranas sobre las propiedades y el comportamiento de divisomas mínimos. 3 Bioquímica física de interacciones macromoleculares: Investigamos las propiedades de asociación de FtsZ con otros elementos del divisoma mediante ultracentrifugación analítica, dispersión de luz y espectroscopías de fluorescencia (Fig. 2). En paralelo, estudiamos las interacciones de FtsZ con elementos del divisoma asociados a membrana mediante ensayos bioquímicos y biofísicos. Financiación | Funding • HEALTH-F3-2009-223432. (Comunidad Europea) • RGP0050-2010. (Human Frontier Science Program) • BIO2011-28941-C03. (MINECO) Publicaciones Seleccionadas Selected Publications • Ahijado-Guzmán R, Alfonso C, Reija B, Salvarelli E, Mingorance J, Zorrilla S, Monterroso B, Rivas G [2013] Control by potassium of the size-distribution of Escherichia coli FtsZ polymers is independent of GTPase activity. J. Biol. Chem. 288:27358-27365. • Cabré EJ, Sánchez-Gorostiaga A, Carrara P, Ropero N, Casanova M, Palacios P, Stano P, Jiménez M, Rivas G, Vicente M [2013] Bacterial division proteins FtsZ and ZipA induce vesicle shrinkage and cell membrane invagination. J. Biol. Chem. 288:2662526634. • Hernández-Rocamora VM, García-Montañés C, Reija B, Monterroso B, Margolin W, Alfonso C, Zorrilla S, Rivas G [2013] MinC shortens FtsZ protofilaments by preferentially interacting with GDP-bound subunits. J. Biol. Chem. 288:24625-24635. • Jiménez M, Cabré EJ, Raso A, Martos A, Rivas G [2013] Giant vesicles: a powerful tool to reconstruct bacterial division assemblies in cell-like compartments. Environ. Microbiol. 15:3158-3168. • Mellouli S, Monterroso B, Vutukuri HR, te Brinke E, Chokkalingam V, Rivas G, Huck WTS [2013] Selforganization of the bacterial cell-division protein FtsZ in confined environments. Soft Matter 9:1049310500. • Monterroso B, Alfonso C, Zorrilla S, Rivas G [2013] Combined light scattering, ultracentrifugation and fluorescence correlation spectroscopy studies on the associations and assembly of the Escherichia coli cell division FtsZ protein. Methods 59:349-362. • Rivas G, Alfonso C, Jiménez M, Monterroso B, Zorrilla S [2013] Macromolecular interactions of bacterial cell division FtsZ protein: From quantitative biochemistry and crowding to reconstructing minimal divisomes in the test tube. Biophys. Rev. 5:63-77. • Ahijado-Guzmán R, Prasad J, Rosman C, Henkel A, Tome L, Schneider D, Rivas G, Sönnichsen C [2014] Plasmonic nanosensors for simultaneous quantification of multiple protein-protein binding affinities. Nano Lett. 14:5528-5532. • Alvira S, Cuéllar J, Röhl A, Yamamoto S, Itoh H, Alfonso C, Rivas G, Buchner J, Valpuesta JM [2014] Structural characterization of the substrate-transfer mechanism in Hsp70/Hsp90 folding machinery mediated by Hop. Nat Commun. 5:5484. doi: 10.1038/ncomms6484. • Rivas G, Vogel SK, Schwille P [2014] Reconstitution of cytoskeletal protein assemblies for large-scale membrane transformation. Curr. Opin. Chem. Biol. 22C:18-26. 104 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 104 24/6/15 12:53 Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Figura 1 | Figure 1 Reconstitución de elementos del protoanillo en vesículas. Método de emulsión (A) para encapsular y polimerizar FtsZ dentro de GUVs permeables (B). (C) Contracción de GUVs debido a la interacción de polímeros de FtsZ y ZipA asociada a la membrana (0, 5, 10 min). (D) Bloqueo de la contracción al añadir un péptido de FtsZ que inhibe la interacción FtsZ-ZipA (Cabré et al. 2013; Rivas et al. 2014). Reconstitution of proto-ring elements in vesicles. Water-in-oil droplet transfer method (A) used to encapsulate and polymerize FtsZ inside permeable GUVs (B). (C) Shrinking of GUVs through the interaction of FtsZ with membrane-associated ZipA (0, 5 and 10’). (D) Blocking shrinkage by the addition of an FtsZ-derived peptide that inhibits FtsZ-ZipA interaction. (Cabré et al. 2013; Rivas et al. 2014). Figura 2 | Figure 2 Análisis biofísico de los diferentes comportamientos de los oligómeros de GDPFtsZ (gris) y los polímeros de GTP-FtsZ (negro) a partir de medidas de velocidad de sedimentación (A), dependencia con la concentración de la dispersión de luz estática (B), dispersión de luz dinámica (C) y espectroscopía de correlación de fluorescencia (D). (Monterroso et al. 2013). Biophysical analysis of the different behavior of GDP-FtsZ oligomers (grey) and GTPFtsZ polymers (black) from measurements of sedimentation velocity (A), concentration dependence static light scattering (B), dynamic light scattering (C) and fluorescence correlation spectroscopy (D). (Monterroso et al. 2013). Systems Biochemistry of Bacterial Division Our research aims at understanding how the elements of the bacterial division machinery (the divisome) work together as an integrated system of molecular interactions to fulfill its essential function. To address these questions we develop and apply novel biochemical reconstitution approaches to build, with a minimum set of elements, functional division assemblies in the absence of cells. 1 Biochemical organization and reconstruction of FtsZ ring components in minimal membrane systems: Bacterial division is mediated by a set of proteins that interact at the division site to assemble a dynamic ring, a structure that drives cytokinesis, forming part of the divisome. In Escherichia coli, the FtsZ protein, main element of the septal ring, is anchored to the inner membrane by the action of the proteins ZipA and FtsA, forming the first molecular assembly of the divisome, the proto-ring. The positioning of the ring at midcell is regulated by two control systems (MinCDE complex and nucleoid occlusion - SlmA) that inhibit its formation at wrong places. We study the activities and interactions of FtsZ in minimal reconstructions of the proto-ring structured in membrane systems as nanodics, microbeads, bilayers, vesicles and microdroplets (Fig. 1). We investigate the concerted action of MinCDE and SlmA on the properties of minimal divisomes. 2 Macromolecular reactivity and organization in crowded and confined cell-like environments: The assembly of the divisome in vivo takes place in environments characterized by the presence of high concentrations of macromolecules, which may be structured as soluble and membraneassociated dynamic networks. We apply and design synthetic reconstructions of these microenvironments to investigate the impact of excluded volume and surface binding effects on the properties and behavior of minimal divisomes. 3 Physical biochemistry of macromolecular interactions: We investigate the association properties of FtsZ with itself and with other divisome elements using analytical ultracentrifugation, light scattering and fluorescence spectroscopies (Fig. 2). In parallel, we study the interactions of FtsZ with membrane-associated division elements by biochemical and biophysical assays. 105 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 105 24/6/15 12:53 Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Rafael Giraldo Suárez Profesor de Investigación [email protected] PhD, 1991 Universidad Complutense de Madrid Postdoctoral, 1992-1994 División de Estudios Estructurales, Laboratorio de Biología Molecular del MRC (Cambridge, UK) Investigador Contratado MEC, 1995-1999 Científico Titular, 2000-2008 Investigador Científico, 2008-2009 Profesor de Investigación, 2010 CIB, CSIC Miembro, 2010 Academia Europea Investigadores del equipo | Staff scientists: M. Elena Fernández-Tresguerres Rodríguez-Vigil Juan Francisco Giménez Abián Otros miembros | Other lab members: María Moreno del Álamo Cristina Fernández Fernández Fátima Gasset Rosa Laura Molina García Aída Revilla García Ana María Serrano López Maria Cruz Sánchez Martínez http://www.cib.csic.es/es/grupo.php?idgrupo=61 Ensamblajes Macromoleculares Microbianos Sintéticos Mediante aproximaciones de Biología Sintética, desarrollamos módulos derivados de RepA, una proteína de replicación propia de plásmidos bacterianos, que permiten controlar el ensamblaje amiloide en condiciones cuasifisiológicas y construir en microorganismos una proteinopatía amiloide modelo genérica. Esperamos así poder deconstruir e intervenir las rutas y mecanismos de citotoxicidad compartidos entre las amiloidosis bacterianas y humanas. N uestro grupo desveló (1998-2008) el mecanismo que activa, en bacterias Gram-negativas, la replicación de plásmidos por proteínas de la familia RepA. Descubrimos que una conformación funcionalmente activa se selecciona por la unión de RepA a secuencias de DNA, que actúan como efectores alostéricos, y por la chaperona DnaK (Hsp70). Recientemente (2007-2012), encontramos que la unión al DNA también promueve in vitro el ensamblaje como fibras amiloides de un dominio “winged-helix” (WH1) en RepA, al igual que sucede con las proteínas causantes de las encefalopatías espongiformes y de la enfermedad de Parkinson. Como prueba de concepto, la amiloidogénesis es inhibida por una molécula que interfiere con la unión de RepAWH1 al DNA. Durante los dos últimos años (2012-2014), hemos estudiado cómo se comporta RepA-WH1 in vivo. Cuando se expresa en E. coli, fuera de su contexto funcional natural y fusionada a una proteína marcadora fluorescente, RepA-WH1 causa una proteinopatía amiloide sintética. Aunque Patentes | Patents • Rafael Giraldo y María Moreno del Álamo. 25 septiembre 2013. Anticuerpo monoclonal B3h7 anti-oligómeros amiloides RepA-WH1, hibridoma que lo produce y aplicaciones. OEPM / P201331391 Financiación | Funding • CSD2009-00088 (MINECO) • BIO2012-30852 (MINECO) no es un agente infeccioso, por lo que se considera un “prionoide”, RepA-WH1 es capaz de moldear su conformación amiloide sobre moléculas de la misma proteína, tanto in vitro como in vivo. Hemos caracterizado, mediante microfluídica, su propagación vertical de célula madre a células hijas. Los linajes bacterianos transmiten epigenéticamente dos estirpes amiloides alternativas de RepA-WH1: múltiples partículas globulares de toxicidad aguda o un único agregado elongado, que reduce en menor medida la proliferación celular. La chaperona DnaK modula la interconversión entre ambas estirpes de RepA-WH1. RepA-WH1 parece mimetizar fidedignamente en bacterias la patogenicidad que amiloides con relevancia clínica ejercen sobre las mitocondrias, orgánulos que descienden de α-proteobacterias de vida libre adquiridas como endosimbiontes. El prionoide bacteriano sintético RepA-WH1 es un modelo mínimo y bioseguro para desentrañar los mecanismos y vías comunes a las proteinopatías amiloides. Publicaciones Seleccionadas Selected Publications • Lane AB, Giménez-Abián JF, Clarke DJ [2013] A novel chromatin tether domain controls topoisomerase IIa dynamics and mitotic chromosome formation. J Cell Biol 203:471-486. • Gasset-Rosa F, Coquel AS, Moreno-del Álamo M, Chen P, Song X, Serrano AM, Fernández-Tresguerres ME, Moreno-Díaz de la Espina S, Lindner AB, Giraldo R [2014] Direct assessment in bacteria of prionoid propagation and phenotype selection by Hsp70 chaperone. Mol Microbiol 91:1070-1087. • Molina-García L, Giraldo R [2014] Aggregation interplay between variants of the RepA-WH1 prionoid in Escherichia coli. J Bacteriol 196:2536-2542. 106 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 106 24/6/15 12:53 By means of Synthetic Biology approaches, we are developing modules derived from RepA, a DNA replication protein in bacterial plasmids, which allow control on amyloid assembly under quasi-physiological conditions and the construction in microorganisms of a generic amyloid proteinopathy. We thus aim later to deconstruct, and enable intervention on, the pathways and mechanisms of cytotoxicity shared by human and bacterial amyloidosis. O ur group had pioneered (1998-2008) knowledge on the mechanisms enabling initiation of plasmid DNA replication, in Gram-negative bacteria, by proteins of the RepA family. We had discovered that a functionally active RepA conformation is selected by specific DNA sequences, acting as allosteric effectors, and by DnaK, a chaperone of the Hsp70 family. More recently (20072012), we found that binding to DNA also promotes in vitro the assembly into amyloid fibres of a winged-helix domain (WH1) in RepA, as described for proteins involved in spongiform encephalopathies and Parkinson’s disease. As a proof of concept, RepA-WH1 amyloidogenesis can be inhibited by a molecule interfering with binding to DNA. In the last two years (2012-2014), we have focussed our research on how RepA-WH1 behaves in vivo. When it is expressed in E. coli, uncoupled from its natural functional context as a fusion to a fluorescent protein reporter, RepA-WH1 causes a synthetic amyloid proteinopathy. Although RepA-WH1 is not infectious, therefore behaving as a ‘prionoid’, it templates the amyloid conformation by cross-seeding, both in vitro and in vivo. We have surveyed through microfluidics the vertical transmission of RepA-WH1 amyloidosis from mother to daughter bacterial cells. We have discovered that bacterial lineages epigenetically propagate two alternative amyloid strains of RepA-WH1: either multiple globular particles with acute cytotoxicity, or a single elongated aggregate, mildly detrimental to cell proliferation. DnaK chaperone modulates the conformational switch between both strains of RepA-WH1. RepA-WH1 seems to parallel in bacteria the pathogenicity of clinically relevant protein amyloids on mitochondria, organelles descending from free-living α-proteobacteria that subsequently underwent symbiosis. The bacterial synthetic prionoid RepA-WH1 might be a suitable, minimal and bio-safe model system for untangling key pathways common to amyloid proteinopathies. Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Synthetic Microbial Macromolecular Assemblies Figura 1 | Figure 1 La amiloidogénesis de RepA-WH1 in vitro (dcha.) implica la disociación, mediada por efector (DNA), de dímeros en monómeros metaestables que se ensamblan jerárquicamente en filamentos y fibras amiloides entrelazados. Estructuras resueltas en colaboración con A. Romero (2003) y O. Llorca (2015). En E. coli los agregados amiloides (izda., sectores rojos) son citotóxicos y verticalmente transmisibles. RepA-WH1 amyloidogenesis in vitro (right) implies effector (DNA)-mediated dissociation of dimers into metastable monomers that assemble hierarchically into intertwined amyloid filaments and variably twisted fibres. Structures solved in collaboration with the groups of A. Romero (2003) and O. Llorca (2015). In E. coli, amyloid aggregates (left, red sectors) are cytotoxic and vertically inheritable. 107 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 107 24/6/15 12:53 Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Jorge Bernardo Schvartzman Blinder Profesor de Investigación [email protected] PhD, 1979 Universidad Politécnica de Madrid, España Postdoctoral, 1980-1982 Brookhaven National Laboratory (New York, USA) Fullbright Fellow, 1987-1989 Albert Einstein College of Medicine (New York, USA) Científico Titular, 1985 Jefe de Grupo, 1980 Investigador Científico, 2002 Profesor de Investigación, 2007 CIB, CSIC Investigadores del equipo | Staff scientists: Dora Beatriz Krimer Smunis Pablo Hernández Valenzuela Otros miembros | Other lab members: Jorge Cebrián Castillo Vanessa Fernández Calleja Alicia Castán García José Manuel Belmonte Rodríguez Celia Bolomburu Idoia García Hernando Leticia García Martínez María-Luisa Martínez-Robles http://www.cib.csic.es/es/grupo.php?idgrupo=2 Biología Molecular de los Cromosomas Nos interesa la interrelación y coordinación de los procesos biológicos en los que está involucrado el DNA: replicación, transcripción, reparación y recombinación, cómo están regulados y cómo modifican o son afectados por factores genéticos, epigenéticos y ambientales como la topología del DNA, la organización de la cromatina y el estrés nutricional. A ) Utilizamos la electroforesis bidimensional en geles de agarosa para demostrar que la movilidad electroforética de moléculas de igual masa varía dependiendo de si están superenrolladas, encadenadas o anudadas. Esto nos ha permitido identificar las condiciones óptimas para distinguir cada familia de topoisómeros. También analizamos el comportamiento de minicromosomas circulares y lineares de Saccharomyces cerevisiae en células sincronizadas en presencia y ausencia de la topoisomerasa 2 (topo 2). Los resultados indican que la topo 2 no es necesaria para la replicación y segregación de cromosomas artificiales lineales de levaduras de pequeño tamaño (YACs). b) Hemos estudiado la replicación del DNA durante la diferenciación terminal en células eritroleucémicas murinas (MEL). Utilizamos la incorporación de BrdU, la citometría de flujo, el peinado del DNA y la tinción por inmunofluorescencia indirecta para demostrar que la velocidad de progreso de las horquillas replicativas se ralentiza y la distancia entre orígenes disminuye a medida que las células dejan de proliferar y se acumulan en G1. Proponemos que este comportamiento es general causado por la heterocromatinización, confirmada por la acumulación progresiva de la HP1∞ que caracteriza la diferenciación celular terminal. c) Una de las causas más importantes de inestabilidad genómica es la parada de las horquillas replicativas del DNA. Estudiamos los mecanismos celulares que previenen la parada de horquillas y aquellos que operan sobre las horquillas detenidas para prevenir la inestabilidad que su reactivación puede ocasionar. Nos interesan especialmente el bloqueo de las horquillas ocasionado por la colisión entre las maquinarias replicativa y transcripcional y por el estrés topológico del DNA, en cuya liberación las DNA topoisomerasas juegan un papel central. Deficiencias en estos mecanismos son la base molecular de varias enfermedades, caracterizadas por una alta inestabilidad genética y predisposición al cáncer. Publicaciones Seleccionadas Selected Publications • Schvartzman JB, Martínez-Robles ML, Hernández P, Krimer DB [2013] The benefit of DNA supercoiling during replication. Biochemical Society Transactions 41: 646-651. • Schvartzman JB, Martínez-Robles ML, Hernández P, Krimer DB [2013] Plasmid DNA topology assayed by two-dimensional agarose gel electrophoresis. In Methods Mol Biol 1054: 121-132, DNA Electrophoresis: Methods and Protocols (Svetlana Makovets, ed.) Springer Science Business Media, New York. • Fernández-Nestosa MJ, Monturus ME, Sánchez Z, Torres F, Fernández A, Fraga M, Hernández P, Schvartzman JB, Krimer DB [2013] DNA methylation-mediated silencing of PU.1 in leukemia cells resistant to cell differentiation. SpringerPlus 2, 392 DOI:10.1186/2193-1801-2-392. Figura 2 | Figure 2 Moléculas de DNA aisladas de células MEL DS19 durante la diferenciación extendidas por peinado molecular. La detección inmunocitoquímica de tramos marcados secuencialmente con IdU (en rojo) seguido de CldU (en verde) permite identificar los sitios de iniciación de la replicación y la distancia entre orígenes así como calcular la velocidad de progreso de las horquillas. Selected DNA molecules isolated from MEL DS19 cells along differentiation stretched by DNA combing. The immunocytological detection of sequentially labelled tracks with IdU (red) followed by CldU (green) allows the identification of replication origins and inter-origin distances as well as the calculation of the rate of replication fork progression. • Cebrián J, Monturus ME, Martínez-Robles ML, Hernández P, Krimer DB, Schvartzman JB [2014] Topoisomerase 2 Is Dispensable for the Replication and Segregation of Small Yeast Artificial Chromosomes (YACs). PLoS ONE 9(8): e104995. DOI:10.1371/journal.pone.0104995. • Cebrián J, Kadomatsu-Hermosa MJ, Castán A, Martínez V, Parra C, FernándezNestosa MJ, Schaerer C, Martínez-Robles ML, Hernández P, Krimer DB, Stasiak A, Schvartzman JB [2014] Electrophoretic Mobility of Supercoiled, Catenated and Knotted DNA Molecules. Nucleic Acids Res DOI: 10.1093/nar/gku1255. • Cebrián J, Castán A, Martínez V, Parra C, Kadomatsu-Hermosa MJ, FernándezNestosa MJ, Schaerer C, Hernández P, Krimer DB, Schvartzman JB [2015] Direct evidence for the formation of precatenanes during DNA replication. Journal of Biol Chem DOI: 10.1074/jbc.M115.642272. 108 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 108 24/6/15 12:53 We are interested in the relationships and coordination between biological processes where DNA is involved: replication, transcription, repair and recombination, how are they regulated and how they alter or are affected by genetic, epigenetic and environmental factors such as DNA topology, chromatin organization and nutritional stress. A ) We used two-dimensional (2D) agarose gel electrophoresis to show that for molecules of the same mass the electrophoretic mobility of supercoiled, catenated and knotted DNAs differ as the electrophoretic conditions change. This allowed us to identify the optimal conditions to distinguish each family of topoisomers. We analyzed also the behavior of circular and linear minichromosomes of Saccharomyces cerevisiae in synchronized cells in the presence and absence of topoisomerase 2 (topo 2). The results obtained indicated that topo 2 is dispensable for the replication and segregation of small linear yeast artificial chromosomes (YACs). b) We investigated DNA replication during terminal cell differentiation in murine erythroleukemia (MEL) cells. We used BrdU labeling, cell flow cytometry, genome-wide DNA combing and indirect immunofluorescent staining to show that the rate of replication fork movement slowdown and the inter-origin distance becomes shorter as cells stop proliferating and accumulate in G1. We propose this is a general feature caused by the heterochromatinization, confirmed by the progressive accumulation of HP1∞ that characterizes terminal cell differentiation. c) DNA replication fork arrest is one of the most important causes of genomic instability. We study the cellular mechanisms that prevent fork arrest and those operating at the arrested forks to prevent the instability that their reactivation may cause. We are especially interested in the induction of fork arrest produced upon collision between DNA replication and RNA transcription machineries and by the accumulation of topological DNA stress, in whose release DNA topoisomerases play a central role. Deficiencies in these mechanisms are the molecular basis of several diseases characterized by a high genetic instability and cancer predisposition. Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Molecular Biology of the Chromosomes Financiación | Funding • BFU2011-22489 (MINECO) Figura 1 | Figure 1 Análisis de la topología del DNA. A) La electroforesis bidimensional en geles de agarosa con distintas concentraciones de cloroquina permite distinguir todos los topoisómeros de moléculas circulares covalentemente cerradas (CCCs). Así se puede identificar el topoisómero más abundante y calcular la densidad de superenrollamiento. B) El recubrimiento del DNA con la proteína RecA permite visualizar moléculas encadenadas por microscopía electrónica. Analysis of DNA topology. A) Two-dimensional (2D) agars gel electrophoresis in the presence of different concentrations of chloroquine allows the identification of all the topoisomers of covalentlyclosed circles (CCCs). This technique can be used to recognize the most abundant topoisomer to calculate supercoiling density. B) Covering DNA molecules with the bacterial protein RecA allows the identification of catenanes by electron microscopy. 109 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 109 24/6/15 12:53 Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Miguel Angel Vidal Caballero Investigador Científico [email protected] PhD, 1985 Universidad Complutense de Madrid Postdoctoral, 1985-1989 National Institute for Medical Research (MRC, UK) Científico Titular, 1991 Jefe de Grupo, 1991 Investigador Científico, 2008 CIB, CSIC Otros miembros | Other lab members: Mónica Bravo Madrigal Katarzyna Starowicz Fabio Nicolini https://www.cib.csic.es/es/grupo.php?idgrupo=14 El Sistema Polycomb de Regulación Epigenética El grupo de genes Polycomb (PcG) codifica reguladores epigenéticos que forman complejos con actividad modificadora de cromatina. Bien conocidos como reguladores transcripcionales durante el desarrollo embrionario, participan críticamente en diferenciación y homeostasis celulares, actuando sobre progenitores. Nuestro trabajo se centra en los complejos que monoubiquitinan la histona H2A. L a monoubiquitinación de la histona H2A (lisina 119) correlaciona con estados de transcripcionalmente reprimidos y, fundamentalmente, depende de RING1A y RING1B, E3 protein ligasas del sistema Polycomb. Estas proteín ligasas son parte esencial de los complejos PRC1, uno de los dos tipos de ensamblajes moleculares del sistema Polycomb. RING1A y RING1B, así como RYBP, una subunidad común a todos los complejos no canónicos PRC1, fueron identificados en el laboratorio. En la actualidad, usamos modelos murinos de pérdida de función y otros que expresan formas modificadas de subunidades PRC1 para el estudio funcional y bioquímico de subunidades PRC1. El compartimento hematopoyético y células pluripotentes (neural, ES) son nuestros modelos de trabajo. Uns observación general es la apreciación de que las subunidades PRC1 promueven proliferación/ supervivencia celulares. Así, la inactivación combinada de los homólogos Ring1A y Ring1B resultan en paradas proliferativas casi inmediatas, debida al aumento de niveles de reguladores negativos de proliferación que detienen el ciclo celular antes de la fase S. Además, estas células muestran alteraciones en replicación y evidencia de inestabilidad genómica. RING1A y RING1B pueden actuar sobre el proceso replicativo en sí, o sobre las vías de reparación disparadas por el estress replicativo. Dado el efecto dominante que el bloqueo del ciclo celular tiene sobre cualquier otro tipo de análisis de las células mutantes sería importante desacoplar esta actividades de las asociadas con regulación transcripcional. Para esclarecer los mecanismos de acción de RING1A y RING1B utilizamos aproximaciones proteómicas dirigidas a la identificación de proteínas asociadas. Con este fin usamos una línea de ratones que expresa una forma modificada de RING1B que permite su aislamiento eficaz, previo al análisis por cromatografía líquida y espectrometría de masas. El trabajo está enfocado a líneas hematopoyéticas. Figura 1 | Figure 1 Asociación de RING1B con la maquinaria de replicación. Sitios de interacción de RING1B con la abrazadera de replicación PCNA, detectada en un ensayo de ligación en proximidad (PLA) como focos coloreados en rojo. DNA nuclear (teñido con DAPI, A) y replicando (marcado mediante incorporación de EdU, un análogo de timidina, en verde, B). Barra, 10 μm. Asociation of RING1B with the replication machinery. Proximity ligation assay (PLA) detects RING1B association to the replicative slide clamp PCNA, visualized as red foci. Total DNA (DAPI, A) and replicating DNA (B, EdU). Scale bar, 10 μm. 110 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 110 24/6/15 12:53 The Polycomb group (PcG) of genes encode epigenetic regulators assembled in complexes displaying chromatin modifying activities. Well known developmental regulators, they participate in cell differentiation and tissue homeostasis with an emphasis in progenitor cells. We focus on core subunits of complexes that monoubiquitylate histone H2A. R ING1A and RING1B, the evolutionary conserved Polycomb E3 ligases, are responsible for most of histone H2A (lysine 119) monoubiquitylation, a modification that correlates with transcriptional repression. RING1A and RING1B are part of the core of PRC1 complexes, one of the two major categories of Polycomb assembles. We identified RING1A and RING1B and also RYBP, a subunit unique to non-canonical PRC1 complexes. We use loss-of-function mouse models as well as mouse strains that express tagged variants for functional and biochemical analysis regarding transcriptional and non-transcriptional activities. Currently, we investigate roles of RING1 and RYBP proteins in hematopoyetic and neural homeostasis and in ES cells pluripotency. A general observation arising from these studie is the positive role that PRC1 subunits have on cell proliferation/survival. Thus, compound inactivation of Ring1A and Ring1B paralogs leads to acute proliferation arrest that involves a variety of proliferation inhibitors that prevent entry in S-phase. A more detailed analysis of these cells, however, allowed the identification of RING1A and RING1B activities during replication and genome stability. Work to ascertain whether it is a role in assisting replication or in fixing replicative stress is underway. Understanding these activities would also help to overcome the dominant, obscuring effects that impaired cell cycle progression has on the analysis of transcriptional programs in mutant cells. We have set up a proteomic approach aimed at identifying RING1A/ RING1B partners that could illuminate mechanisms in transcriptional and non-transcriptional functions. It uses a mouse model carrying a knockedin modifification of the Ring1B locus that expresses a tagged-Ring1B protein. The model, one as physiological as it can get, also permits the access to PRC1 complexes in primary cells or in ex-vivo expanded primary cells that are not often available as established tissue culture cells lines. Ongoing works focuses on hematopoietic cell lineages. Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Epigenetic Control by the Polycomb Group of Genes Financiación | Funding • BFU2010-18146 (MINECO) • Oncocycle S2010/BMD2470 (CAM) • FP7-People-2011-ITN • SAF2013-47997-P (MINECO) Publicaciones Seleccionadas Selected Publications • Morimoto-Suzki N, Hirabayashi Y, Tyssowski K, Shinga J,Vidal M, Koseki H, Gotoh Y [2014] The polycomb component Ring1B regulates the timed termination of subcerebral projection neuron production during neocortical development. Development 141:4343-53. • Vidal M [2014] Polycomb complexes: chromatin regulators required for cell diversity and tissue homeostasis. pp95-139. C. Bonifer and P.N. Cockerill (eds.). Transcriptional and Epigenetic Mechanisms Regulating Normal and Aberrant Blood Cell Development, Epigenetics and Human Health, Springer-Verlag Berlin Heidelberg. • Kondo T, Isono K, Kondo K, Endo TA, Itohara S, Vidal M, Koseki H [2014] Polycomb potentiates Meis2 activation in midbrain by mediating interaction of the promoter with a tissue-specific enhancer. Dev Cell 28:94-101. Figura 2 | Figure 2 Mitosis aberrante en células mutantes que carecen de RING1A y RING1B. La tinción de DNA con DAPI muestra un puente cromosomal probablemente consecuencia de replicación incompleta. Barra, 10 μm. Aberrant mitosis of RING1A and RING1B-deficient cells. DAPI-stained mitosis showing chromosomal bridges indicating incomplete DNA replication. Scale bar, 10 μm. • Martínez-Gómez AI, Villegas S, Aguado-Llera C, Bacarizo J Cámara-Artigas A, Vidal M Neira JL [2014] The isolated N terminus of Ring1B is a well-folded, monomeric fragment with native-like structure. Protein Eng Des Sel 27:1-11. • Frangini, A. Sjöberg, M., Román-Trufero, M., Dharmalingam, G., Haberle,V., Bartke, T.,Lenhard, B., Malumbres, M., Vidal M, Dillon N [2013] The Aurora B Kinase and the Polycomb Protein Ring1B Combine to Regulate Active Promoters in Quiescent Lymphocytes. Mol Cell 51:647–661. • Yokobayashi S, Liang CY, Kohler H, Nestorov P, Liu Z, Vidal M, van Lohuizen M, Roloff TC, Peters AH [2013] PRC1 coordinates timing of sexual differentiation of female primordial germ cells. Nature 495: 236-240. • van Arensbergen J, García-Hurtado J, Maestro MA, CorreaTapia M, Rutter G, Vidal M, Ferrer J [2013] Ring1B bookmarks genes in pancreatic embryonic progenitors for repression in adult beta cells. Genes Dev. 27:52-63. 111 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 111 24/6/15 12:53 Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Patricia Boya Cientifica titular [email protected] PhD, 2000 Universidad de Navarra Postdoctoral, 2001-2005 CNRS (París, Francia) Universisty of Cambridge (UK) Contrato, 2005-2009 Ramón y Cajal Científica Titular, 2009 CIB, CSIC Otros miembros | Other lab members: Lorena Esteban Martínez Raquel Gómez Sintes Lucía García Ledo Esther Seco Martín Ana Serrano Puebla Sergio Rivas Muñoz Elena Sierra Filardi http://www.cib.csic.es/es/grupo.php?idgrupo=73 Funciones de la Autofagia en la Fisiopatología de los Organismos En nuestro laboratorio utilizamos modelos celulares y animales para comprender el papel de la autofagia en la fisiología y la patología de los organismos. Este es un proceso de degradación intracelular que permite la eliminación y el reciclaje de componentes celulares. Es una importante respuesta frente al ayuno nutricional, participa en la degradación de orgánulos celulares y permite la supervivencia en situaciones de estrés. E l interés de nuestro laboratorio se centra en entender por que el proceso de la autofagia es esencial para mantener la homeostasis de las células y qué patologías subyacen a alteraciones de este mecanismo de degradación intracelular. La importancia del proceso de autofagia queda patente por la letalidad embrionaria de animales deficientes en algunos de los genes Atg. En nuestro grupo estudiamos la relación de la autofagia con procesos esenciales para las células como la proliferación, diferenciación y la muerte celular. Hemos demostrado que este proceso es importante para la diferenciación neuronal ya que animales deficientes de autofagia no generan neuronas maduras y poseen defectos en neuritogenesis. Por otro lado hemos demostrado que la inducción temprana de la autofagia durante procesos neurodegenerativos supone una respuesta citoprotectora. Daño axonal producido in vivo en animales deficientes de autofagia aumenta los niveles de muerte celular y por el contrario la inducción farmacológica de este proceso retrasa el proceso de neurodegeneración. Estamos así mismo interesados en la relación de la autofagia con procesos de envejecimiento del sistema nervioso y hemos demostrado una disminución de la actividad de autofagia que podría en parte estar compensado por otros mecanismos de degradación lisosomal como la autofagia mediada por chaperonas. Además y estrecha colaboración con empresas españolas estamos buscando nuevos productos que sean capaces de modular estos procesos. Hemos puesto a punto varios métodos de cribado para la determinación de nuevos compuestos que induzcan o bloqueen el proceso de autofagia y que puedan luego ser aplicados a la terapia para enfermedades humanas. Figura 1 | Figure 1 Distribución de la población total del células ganglionares de la retina de ratón montada en plano y teñidas para el factor de transcripción Brn3a (A y B), y representación del mapa de isodensidades de número de células ganglionares (C y D). Retinal ganglion cell distribution in mouse retinal flatmounts stained for the transcription factor Brna (A and B). Isodensity map of retinal ganglion cell numbers (C and D). 112 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 112 24/6/15 12:53 In our group we use cellular and animal models to understand the role of autophagy in the physiology and pathology of organisms. Autophagy is an intracellular degradative process that allows the elimination and recycling of cellular constituents. This process is induced in many stress situations acting as a cytoprotective response. W e want to understand why the process of autophagy is essential to maintain cellular homeostasis and how deregulations in this mechanism can influence several pathological situations. Animals deficient for several autophagy regulators, the Atg genes, die during embryonic development revealing the importance of this process to maintain cellular homeostasis. In our group we study the relationship of autophagy with essential processes of proliferation, differentiation and cell death. We have recently demonstrated that autophagy is essential for neuronal differentiation since autophagydeficient animals generate reduced numbers of neurons in vitro and have defects in neuritogenesis. We have also shown that autophagy is an early cytoprotective response during several neurodegenerative conditions. Axonal damage in autophagy-deficient animals increases cell death and conversely, pharmacological upregulation of this process increases neuronal survival. In addtion we are interested in the role of autophagy during the aging process in the nervous system and have recently found a decrease in the activity of macroautophagy that seems to be partially compensated by un upregulation of other lysosomal pathways as chaperone mediated autophagy. We also collaborate with several companies in the search of new autophagy regulators. We have developed several screening methods to find new autophagy inducers and inhibitors that could we used as new therapies for the treatment of human diseases. Publicaciones Seleccionadas Selected Publications • Esteban-Martínez L, Boya P. [2015] Autophagic flux determination in vivo and ex vivo. Methods. Jan 30. pii: S1046-2023(15)00014-6. doi: 10.1016/j. ymeth.2015.01.008. • Rodríguez-Muela N, Hernández-Pinto AM, Serrano-Puebla A, García-Ledo L, Latorre SH, de la Rosa EJ, Boya P [2014] Lysosomal membrane permeabilization and autophagy blockade contribute to photoreceptor cell death in a mouse model of retinitis pigmentosa. Cell Death Differ. 2014 Dec 12. doi: 10.1038/cdd.2014.203. • Gabandé-Rodríguez E, Boya P, Labrador V, Dotti CG, Ledesma MD [2014] High sphingomyelin levels induce lysosomal damage and autophagy dysfunction in Niemann Pick disease type A. Cell Death Differ 2014, Jan 31 (doi: 10.1038/ cdd.2014.4). • Boya P, Diaz-Meco MT, Rubinsztein D, Sass M. [2014] Autophagy researchers. Autophagy. Mar;10(3):393-6. doi: 10.4161/auto.27581. • Wang F, Bexiga MG, Anguissola S, Boya P, Simpson JC, Salvati A, Dawson KA. [2013] Time resolved study of cell death mechanisms induced by amine-modified polystyrene nanoparticles. Nanoscale. 2013 Nov 21;5(22):10868-76. doi: 10.1039/ c3nr03249c. • Boya P, Codogno P. [2013] Cell biology: Recycling in sight. Nature. 2013 Sep 5;501(7465):40-2. doi: 10.1038/501040. • Boya P, Reggiori F, Codogno P. [2013] Emerging regulation and functions of autophagy. Nat Cell Biol. 2013 Jul;15(7):713-20. doi: 10.1038/ncb2788. • Oeste CL, Seco E, Patton WF, Boya P, Pérez-Sala D [2012] Histochem Cell Biol. 2013 May;139(5):659-70. doi: 10.1007/s00418-012-1057-6. • Rodríguez-Muela N, Koga H, García-Ledo L, de la Villa P, de la Rosa EJ, Cuervo AM, Boya P. [2013] Balance between autophagic pathways preserves retinal homeostasis. Aging Cell. 2013 Jun;12(3):478-88. doi: 10.1111/acel.12072. Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Roles of Autophagy in Health and Disease • Marta Mauro-Lizcano, Lorena Esteban-Martínez, Esther Seco, Ana Serrano-Puebla, Lucia Garcia-Ledo, Claudia Figueiredo-Pereira, Helena L A Vieira and Patricia Boya [2014] New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy, in press. http://dx.doi.org/10.1080/15548627.2015.1034403. Financiación | Funding • i-link0701 (CSIC 2014-2015) • SAF2012-36079 (MINECO 2013-2016) • INNPACTO IPT-010000-2010-48 (MICINN 2010-2013) • CONSOLIDER CDS2010-00045 (MICINN 2011-2016) • DSM 2013-2014 • Provital 2013-2016 Figura 2 | Figure 2 Corte de una retina de ratón que expresa constitutivamente el marcador de autofagosomas LC3 unido a la proteína fluorescente GFP (tinción en verde). En rojo se han marcado las mitocondrias que se han teñido utilizando el anticupero para la proteína mitocondrial TOMM20, y en azul se observan los núcleos teñidos con el marcador para DNA DAPI. Section of a retina from the GFP-LC3 mouse, an animal model that constitutively expresses the autophagosomal marker LC3 coupled to the fluorescent protein GFP in green. Mitochondria stained with TOMM20 are labelled in red and nuclei are revealed with the DNA marker DAPI in blue. 113 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 113 24/6/15 12:53 Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Jesús del Mazo Martínez Investigador Científico [email protected] PhD, 1978 Universidad Complutense de Madrid Research Associated, 1987-1989 California Institute of Technology , CALTECH, Pasadena L.A. (California, USA) Profesor Honorífico, 2006 Universidad de Valparaíso (Chile) Científico Titular, 1981 Jefe de Grupo, 1984 Investigador Científico, 2006 CIB, CSIC Otros miembros | Other lab members: Jesús García López Miguel Angel Brieño Enríquez Cristina Templado Meseguer Darío Fernández Zoppino Eduardo Larriba Tornel Julio Buñay Noboa Eleni Papadopoulou http://www.cib.csic.es/es/grupo.php?idgrupo=18 Biología Molecular de la Gametogénesis Nuestro interés se ha centrado en los últimos años en la biogénesis y función de diferentes RNAs reguladores, no-codificantes, de pequeño tamaño (tales como miRNAs, piRNAs , endo-siRNAs, snoRNAs) en el desarrollo y la diferenciación de la línea germinal y la reproducción en mamíferos y su papel en la desregulación genética y epigenética mediada por algunos reprotóxicos ambientales. L os RNAs pequeños no-codificantes (sncRNAs) son considerados como importantes reguladores postranscripcionales en el desarrollo de las células germinales. Además de microRNAs (miRNAs) endo-siRNAs y PIWI–RNAs (piRNAs), otros sncRNAs: pequeños RNA nucleolares (snoRNAs), o derivados de tRNAs o rRNAs parecen desempeñar importantes funciones reguladoras en la gametogénesis y la fertilización. Combinando secuenciación masima (NGS), bioinformática y biología celular y molecular estamos caracterizando el panorama de expresión de sncRNAs en la diferenciación desde células germinales primordiales (PGC) hasta gametos y sus implicaciones en la fertilización y el desarrollo de preimplantación temprano. Por ejemplo, mientras algunos snoRNAs y miRNAs se expresan abundantemente en PGCs son reemplazados por piRNAs en espermatozoides y por endo-siRNAs en ovocitos y cigotos. Es interesante comprobar como las secuencia de variantes de miRNA son mas abundantes en la espermatogéneis que sus correspondientes formas canónicas. Otras alternativas de funcionales de miRNAs como los mecanismos de edición de sncRNAs también se están analizando en nuestro sistema. Asi, la sustitución mediante ADAR de Adenosina por Inosina (reconocida como guanosina por la maquinaria celular [A-to-I]) en precursores de miRNAs, afecta el procesamiento de miRNAs. Descubrimos que la edición activa y la degradación de moléculas de precursor de RNAs editados ocurre durante el período de perifertilization. También estamos aplicando estos estudios de regulación génica a la valoración del efecto de reprotóxicos. Múltiples estudios han demostrado la asociación entre exposición a sustancias tóxicas ambientales, tales como los llamados disruptores endocrinos, y disfunciones del desarrollo en las células germinales. Estamos estudiando cómo la exposición prenatal, incluso a bajos niveles de exposición, a estos compuestos puede inducir cambios epigenéticos en la expresión de miRNAs en PGCs en las siguientes generaciones no expuestas. Figura 1 | Figure 1 Apoptosis en células germinales primordiales (PGCs) de ratones machos expuestos durante su vida fetal a vinclozolina (un fungicida utilizado en la agricultura, con efectos antiandrogénicos). Co-detección en microscopía confocal de apoptosis por TUNEL y marcaje específico con SSEA-1 para células PGC (13,5 días postcoitum). En la parte superior de la figura: Testis junto con el MesoNefros. Apoptosis in primordial germ cells (PGCs) of male mice exposed during fetal life to vinclozolin (a widely used fungicide in agriculture, with antiandrogenic effects). Examples of co-detection by confocal microscopy analysis of apoptosis by TUNEL and SSEA-1 positive PGCs cells (from 13.5 days post coitum embryos). Testis showed at the top of the figure along with the MesoNephros. 114 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 114 24/6/15 12:53 In recent years, our interest has been focused in the biogenesis and function of various small noncoding regulatory RNAs (such as miRNAs, piRNAs, endo-siRNAs, snoRNAs) in the development and differentiation of the germline and reproduction in mammals and their role in genetic and epigenetic deregulation mediated by some environmental reprotoxicants. T he small non-coding RNAs (sncRNAs) are considered as postranscriptional key regulators of germ cell development. In addition to microRNAs (miRNAs) endo-siRNAs and PIWI-interacting RNAs (piRNAs), other sncRNAs generated from small nucleolar RNAs (snoRNAs), -tRNAs or rRNAs-derevatives may also play important regulatory roles in gametogenesis and fertilization. Combining next generation sequencing (NGS), bioinformatics and cell and molecular biology approaches we are characterizing the regulatory landscape of small non-coding RNAs during germ cell differentiation from primordial germ cells (PGCs) to gameta and the consequences of the expression of the different classes of these small RNAS in fertilization and early preimplantation development. Both, microRNAs and snoRNA-derived small RNAs are abundantly expressed in PGCs but transiently replaced by piRNAs in spermatozoa and endo-siRNAs in oocytes and zygotes. Interestingly, miRNA sequence variants also shows an increment of non-canonical microRNA forms along male germ cell differentiation. Publicaciones Seleccionadas Selected Publications • García-López J., Alonso L., Cárdenas D.B., Artaza-Alvarez H, Hourcade J.de D., Martinez S., Brieño-Enríquez M. A., and del Mazo J. [2015] Diversity and functional convergence of small non-coding RNAs in male germ cell differentiation and fertilization. RNA, 21: 946-962. • Brieño-Enríquez M. A., García-López J., Cárdenas D. B., Guibert S., Cleroux E., Děd L., Hourcade J.de D, Pěknicová J., Weber M. and J. del Mazo [2015] Transgenerational paternal effects of prenatal germ cell exposure to vinclozolin are mediated by microRNAs. PLoS ONE 10(4): e0124296. doi:10.1371/journal. pone.0124296. • J. del Mazo, J. García-López and M. Weber [2014] Epigenetic traits of testicular cancer: from primordial germ cells to germ cell tumors. Epigenomics, June 2014, Vol. 6, (3): 253-25. • García-López J., Hourcade JdD, Alonso L., Cárdenas D.B. and del Mazo J. [2014] Global characterization and target identification of piRNAs and endo-siRNAs in mouse gametes and zygotes. BBA-Gene Regulatory Mechanisms. 1839:463475. • G. M. Oresti,. J. García-López, M. I. Aveldaño and J. del Mazo [2013] Cell-typespecific regulation of genes involved in testicular lipid metabolism: fatty acidbinding proteins, diacylglycerol acyltransferases and perilipin. Reproduction 146, 471-480. • J. García-López, M.A. Brieño-Enríquez and J. del Mazo [2013] MicroRNA biogenesis and variability. BioMolecular Concepts. 4(4): 367–380. • M. A. Brieño-Enríquez, J. Gacía-López, J. del Mazo [2013] Especificidad de los alteradores endocrinos en la expresión génica durante el desarrollo. Revista de Salud Ambiental, 13: 67-69. Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Molecular Biology of Gametogenesis • García-López, J., Hourcade, JdD, and del Mazo, J [2013] Reprogramming of microRNAs by adenosine-to-inosine editing and the selective elimination of edited microRNA precursors in mouse oocytes and preimplantation embryos. Nucleic Acids Research 41: 5483–5493. • J. del Mazo M.A. Brieño-Enríquez, J. García-López, L.A. López-Fernádez and M. De Felici. [2013] Endocrine disruptors, gene deregulation and male germ cell tumors. International Journal of Developmental Biology 57: 225 - 239. Other functional alternatives in the miRNAs such as RNA editing mechanisms are also being analysed in our system. Adenosine-to Inosine (A-to-I) editing represents a post-transcriptional modification of doublestranded RNA, including miRNA precursors. Inosine is recognized as guanosine (G) by the cell machinery, which affects the subsequent processing of edited molecules. We discovered that both active editing and the degradation of edited precursor RNA molecules occur during the perifertilization period. We are also applying these basic gene regulatory aspects to the effect of reprotoxicants. Multiple studies demonstrated the association between exposure to environmental toxicants -such as the so-called endocrine disruptors- and developmental dysfunctions in germ cells. We are studying how prenatal exposure to this compounds could induce induces epigenetic changes in the expression of miRNAs in PGCs in the following non-exposed generations, even at low level of exposure. Figura 2 | Figure 2 Financiación | Funding • 11-MRES-PNRPE-9-CVS-072-Nº210064934 (Ministère de l’Ecologie, du Developpment Durable, des Transports et du Logement. República Francesa) • 201020E016 (PIE) • BFU2013-42164-R (MINECO) Se ha demostrado que RNAs derivados de pequeños RNAs nucleolars (snoRNAs) pueden actuar como silenciadores de genes. SNORD21 mostró actividad del tipo miRNA. Se muestra la predicción de estructura de SNORD21 como ejemplo de snoRNA detectados en las células germinales y cigotos y la potencial region de interaccion entre caja C/D (posible guía para metilación del rRNA) del snoRNAs y el rRNA. It has been demonstrated that several small RNAs derived from snoRNAs can act as gene silencers. Predicted secondary structures of the SNORD21 as an example of small nucleolar RNAs (snoRNA) detected in germ cells and zygotes. SNORD21 showed miRNA activity. Potential base pairing interactions between C/D Box snoRNAs and rRNA are showed. The D Box motif serves as a guide for rRNA methylation. 115 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 115 24/6/15 12:53 Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Rosa María Lozano Puerto Científica Titular [email protected] PhD, 1990 Universidad Autónoma de Madrid Postdoctoral, 1991-1993 University of California Berkeley (USA) Investigador Contratado, 1993-2001 MEC, CIB Científica Titular, 2001 Jefe de Grupo, 2008 CIB, CSIC Investigadora del equipo | Staff scientist: Blanca Teresa Pérez-Maceda Otros miembros | Other lab members: María Encarnación López Fernández Natalia Soledad Fagali http://www.cib.csic.es/grupo.php?idgrupo=67 Reconocimiento Célula-Biomaterial Se investiga la respuesta celular y molecular de la célula al interaccionar con materiales metálicos y cerámicos de aplicación en reparación ósea. Entre los metálicos se analizan aleaciones de Cobalto-Cromo y de biodegradables de base Magnesio y, entre los cerámicos, las hidroxiapatitas. Se estudian los efectos de las partículas metálicas del desgaste-corrosión del material implantado. En cerámicos, se diseñan superficies con distintas proteínas. L as aleaciones Cobalto-Cromo con alto contenido en carbono (CoCrHC) se proponen como material alternativo para prótesis de cadera. Las bajas tasas de desgaste–corrosión que presentan éstas aleaciones contrastan con las del par polietileno/metal, ampliamente utilizado en clínica y que se caracteriza por generar gran cantidad de partículas en el lugar del implante, que se han relacionado con procesos de osteolisis y pérdida final de la prótesis lo que ha motivado la búsqueda de otros materiales. Es por esta razón por la que se propone el estudio de las aleaciones de CoCrHC y del efecto de las partículas que se generan como consecuencia del proceso de tribocorrosión de este material. Los efectos producidos en la célula por los productos derivados del desgastecorrosión de las aleaciones CoCrHC, partículas e iones, se evalúan en las líneas celulares representativas del entorno de la prótesis osteoarticular. El Mg y sus aleaciones son materiales interesantes debido a las propiedades que presentan: son ligeros, su módulo elástico y densidad son semejantes a los del hueso, son reabsorbibles, sus productos de corrosión no son tóxicos y son fácilmente excretados en la orina. Sin embargo, la principal limitación reside en que la velocidad de degradación de éstos es mayor que la velocidad necesaria para la regeneración del tejido. Se pretende, mediante la aplicación de tratamientos, controlar la velocidad de degradación y diseñar materiales de base Mg cuya reabsorción esté sincronizada con la regeneración del tejido óseo a reparar. Se estudia además, el efecto de las partículas de Mg sobre la respuesta celular. Se diseñan nuevas superficies biomiméticas sobre materiales cerámicos como son las hidroxiapatitas sustituidas con silicio mediante la funcionalización con distintas proteínas, como son ciertos factores de crecimiento que favorecen la vascularización del tejido estimulando la actividad biológica de otros péptidos implicados en el crecimiento del tejido óseo. Figura 1 | Figure 1 Microscopía multidimensional en tiempo real in vivo de macrófagos J774 en presencia de partículas de magnesio. Imágenes del cultivo de macrófagos expuesto a las partículas de Mg (1 mg/ml; negro) durante distintos tiempos (0 y 24 horas). A las 24 horas, los macrófagos se dividen y algunos mueren al interaccionar con las partículas que se van degradando durante el cultivo. (Referencia Alvarez F. y colab. en Microscopy: advances in scientific research and education). In vivo time-lapse multidimensional microscopy of macrophages J774 in presence of magnesium particles. Images of macrophages´ culture exposed to Mg particles (1 mg/ml; black images) at different times (0 and 24 hours). At 24 h., some macrophages duplicate and those located close to particles displayed morphological changes that developed in cell death. Mg particles degrade and become clear. (Reference Alvarez F. et al. in Microscopy: advances in scientifc research and education). 116 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 116 24/6/15 12:53 Research is focus in the analysis of the molecular and cell response upon interaction with metallic and ceramic materials for application in bone tissue repair. Metallic materials as cobalt-chromium alloys with high carbon content and some biodegradable magnesium-base, and ceramics as hydroxyapatites are selected. The effect on the cell of metallic debris, particles and ions, are under study. In ceramics, new surfaces are designed with proteins. T otal hip replacement by metallic biomaterials with loss of function has become an important concern in human health. The most widespread clinical substitution for hip substitution is given by the polyethylene/metal joint replacement. However, excessive wear of polyethylene causes the production of particles that is believed to be the major cause of the progressive osteolysis and subsequent loosening of prosthesis. This problem has strongly driven the use of Metal on Metal (MoM) combinations as a replacement in joint prosthesis, specifically, made of CoCr alloys, due to their substantially low corrosion and wear rates. But unfortunately, there are still wear particles and ions that are released in the body with these implants. The effect of the wear debris and ions derived from the tribocorrosion process of the MoM in the cell response are under analysis in studies with those cell lines that better represent the osteoarticular prostheses cell microenvironment. osteoconductivity. The density, elastic modulus and compressive strength properties of Mg are more similar to bone. Mg is a necessary element for the incorporation of calcium to bone and to stimulate the growth of new tissue, is non-toxic and degrades in body fluids, making suitable for orthopedic applications. In spite of the desirable properties, Mg-based materials have very high corrosion rate that need to be controlled. Research pretends with different approaches synchronize the degradation kinetic of Mg-based materials and bone tissue repair and analyze the effect of Mg particles on cell response. Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Cell-Biomaterial Recognition New ceramic materials hydroxyapatite-based are under study upon functionalization with proteins, as are several growth factors that promotes tissue vascularization and increase the biological activity of other peptides involved in bone tissue growth. Magnesium (Mg) and its alloys are biodegradable materials suitable for bone repair application due to its biodegrability, reabsorbability and Publicaciones Seleccionadas Selected Publications • Lozano RM*, Pérez-Maceda BT, Carboneras M, Onofre-Bustamante E, GarcíaAlonso MC, Escudero ML [2013] Response of MC3T3-E1 osteoblasts, L929 fibroblasts and J774 macrophages to fluoride surface-modified AZ31 magnesium alloy. Journal of Biomedical Materials Research: Part A. 101: 2753-2762. *Corresponding author. • Alvarez F, Lozano Puerto R, Pérez-Maceda B, Grillo C, Schilardi P, Fernández Lorenzo M [2013] Efecto de micropartículas de Mg con y sin tratamiento con KF en células osteoblásticas y macrofagos. The Journal of the Argentine Chemical Society. 100: 48-52. • Billi F, Iglesias C, Onofre E, Lozano RM, Pérez-Maceda B, Rubio JC, Escudero ML, García-Alonso MC [2013] Characterization of oxidized TiAlV after fretting-corrosion tests using near-field microscopy. British Journal of Surgery. Abstract. 100 (Suppl. 1): 13. • Bodelón O, Iglesias-Urraca C, Díaz I, Lozano RM, Pérez-Maceda BT, Clemente C, Alobera MA, García-Alonso MC, Rubio Suárez JC, Escudero ML. [2014] Analysis of metallic traces from biodegradation of AZ31 magnesium alloy in rat organs. British Journal of Surgery. Abstract. 101 (Suppl. 1): 6. • Iglesias-Urraca C, Bodelón O, Díaz I, Lozano RM, Pérez-Maceda B-T, Clemente C, Alobera MA, García-Alonso MC, Rubio Suárez JC, Escudero ML. [2014] Clinicalradiological and histological correlation of AZ31 alloy used as a prosthetic implant. British Journal of Surgery. Abstract. 101 (Suppl. 1): 6. • Alvarez F, Lozano Puerto RM, Pérez-Maceda BT, Grillo CA, Fernández Lorenzo MA [2014] Effect of Mg particles on MC3T3-E1 and J774 cellular cycle. Influence of fluoride treatment. European Cells and Materials. Vol 28 (Suppl 3): 65. • Alvarez F, Lozano Puerto RM, Pérez-Maceda BT, Grillo CA, Fernández Lorenzo MA [2014] Multidimensional microscopy: A suitable technique to follow in vivo the interaction between biodegradable biomaterials and cells. In “Microscopy: advances in scientific research and education” Microscopy book nº 6 Vol.1. Editor: A. Méndez-Vilas. Editorial: Formatex Research Center (Badajoz, España): 523-529. Financiación | Funding • MAT2011-29152-C02-02 (MINECO) • CAM S2009/MAT1472 (CAM) Grupo asociado 117 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 117 24/6/15 12:53 Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Susana Moreno Díaz de la Espina Investigadora Científica [email protected] PhD, 1975 Universidad Complutense Madrid Postdoctoral, 1976-1978 DKFZ (Heidelberg, Alemania) Visiting Scientist, 1987 NCI/NIH. Frederick (MD, USA) Científica Titular, 1979 Jefa de Grupo, 1981 Jefa de Laboratorio, 1997 Investigadora Científica, 2002 CIB, CSIC Otros miembros | Other lab members: Malgorzata Ciska Ana Ugidos Valladares Mercedes Carnota Romero http://www.cib.csic.es/es/grupo.php?idgrupo=31 Matriz Nuclear y Regulación de la Organización y Funcionalidad Nuclear Nuestro objetivo es el análisis de la lámina nuclear de plantas. Hemos determinado los análogos funcionales de las laminas de metazoos, las proteínas NMCP y caracterizado sus dos homólogos NMCP1 y NMCP2 en la monocotiledónea Allium cepa y su interacción con las proteínas SUN que son las únicas proteínas asociadas a laminas conservadas en plantas y forman parte de los complejos que unen el núcleoesqueleto y citoesqueleto en metazoos y plantas. L a lámina nuclear está muy conservada en eucariotas, aunque sólo bien caracterizada en metazoos; sus principales componentes, las laminas, no están conservados en otros eucariotas. En nuestro laboratorio investigamos las proteínas que componen la lámina en plantas que carecen de genes de laminas. Hemos analizado varias proteínas candidatas a realizar funciones de laminas en plantas. El análisis bioinformático de las proteínas NMCP, unas de las principales candidatas, reveló que se trata de una familia muy conservada que comparte muchas características con las laminas de metazoos como son los dos tipos básicos, la estructura tripartita con un largo segmento central coiled coil con capacidad de dimerización y varias secuencias específicas conservadas (Fig 1; Ciska et al., JXB 2013), que unido a su capacidad de dimerizar y formar filamentos, localización en la lámina, asociación a proteínas SUN, expresión regulada durante el desarrollo e implicación en algunas de las funciones de las laminas como la regulación del tamaño Figura 1 | Figure 1 Estructura de NMCPs y laminas. Ambas presentan una distribución similar de coiled coils (cajas naranja), regiones conservadas (barras verdes), sitios para cdk1 (barras rojas), NLS (cajas verdes) y un segmento de aa ácidos (caja roja). Las NMCPs carecen de plegamiento Ig (elipse negra) y la caja CAAX de laminas pero tienen el extremo C-terminal conservado. Regiones que dirigen las NMCP a la EN (*). y forma nuclear, organización de la heterocromatina y asociación del núcleoesqueleto al citoesqueleto, nos han permitido establecer que constituyen los análogos funcionales de las laminas en plantas (Ciska and Moreno Díaz de la Espina, PSB 2013). La producción de anticuerpos contra dominios conservados de las proteínas nos ha permitido determinar las características de las proteínas NMCP1 y NMCP2 endógenas en Allium cepa, su localización nuclear y presencia en el núcleoesqueleto. Estamos caracterizando también en este sistema las proteínas que interaccionan con ellas, principalmente las SUNs. Todos estos datos junto con otros de la literatura nos han llevado a establecer por primera vez un modelo de organización de la lámina en plantas (Fig 2; Ciska and Moreno Díaz de la Espina, FPS 2014). El grupo trabaja integrado en el International Plant Nucleus Consortium (http://bms.brookes.ac.uk/ipnc). Financiación | Funding • BFU2010-15900 (MINECO) • PIE 201020E019 (CSIC) Structural analogies of NMCPs and lamins. Both display a similar distribution of coiled coils (orange boxes), conserved regions (green bars), cdk1 phosphorylation sites (red bars), a NLS (green boxes) and a stretch of acidic aminoacids (red boxes). NMCPs lack the Ig fold (black ellipse) and the CAAX box of lamins, but have a conserved C-terminus. Regions mediating NE localization of NMCPs (*). 118 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 118 24/6/15 12:54 The plant lamina and its main interacting partners. The NMCP-based lamina binds to NPCs through Nup136 and NUA, and associates to nucleocytoplasmic linkers by binding of NMCPs to SUNs and plant specific KASH proteins (WIP). These complexes connect the lamina with the actin cytoskeleton and the γ-TuC complexes but also anchor proteins to the ONM (RanGAP). Not elucidated interactions (?). Nuclear Matrix and Regulation of the Nuclear Organization and Function Our aim is the analysis of the plant nuclear lamina. We have determined the functional analogs of metazoan lamins in plants, the NMCP protein family and analyzed the two homologs MMCP1 and NMCP2 in the monocot Allium cepa, as well as their interactions with SUN proteins that are the only lamin-binding proteins conserved in plants and form the protein complexes that link the nucleoskeleton and cytoskeleton in metazoan and plants. Publicaciones Seleccionadas Selected Publications • Ciska M, Moreno Diaz de la Espina S [2014] The intriguing plant nuclear lamina. Front Plant Sci. 5, 166. DOI: 10.3389/fpls.2014.00166. • Gasset-Rosa F, Coquel AS, Moreno-del Álamo M, Chen P, Song X, Serrano AM, Fernández-Tresguerres ME, Moreno-Díaz de la Espina S, Lindner AB, Giraldo R T he nuclear lamina is highly conserved in eukaryotes, but only well characterized in metazoa. The main components of the metazoan lamina are the lamins that are not conserved in other eukaryotes. We investigate the proteins that form the lamina in plants that lack genes for lamins. We have analyzed several protein candidates to play lamin functions in plants. The bioinformatic analysis of NMCP proteins, the main candidates to play lamin functions in plants, revealed that this is a highly conserved family of proteins that share multiple characteristics with metazoan lamins as are the two basic types, the tripartite structure with a long central coiled coil domain with dimerization ability, and several conserved specific domains (Fig 1; Ciska et al., JXB 2013), which along with their ability to dimerize and form filaments, localization in the lamina, binding to SUN proteins, developmentally regulated expression and involvement in some of the nuclear functions regulated by lamins such as nuclear shape and size determination, heterochromatin organization and association of the nucleoskeleton to cytoskeleton allowed us to establish that they constitute the functional analogs of metazoan lamins in plants (Ciska and Moreno Díaz de la Espina, PSB 2013). Antibodies produced against conserved regions of NMCP1 and NMCP2 allowed us the characterization of the endogenous proteins in this system and the determination of their nuclear localization and presence in the nucleoskeleton. We are also characterizing the proteins interacting with NMCPs in this system, mainly the SUNs. The above results along with others in the literature allowed us to establish for the first time a model for the organization of the plant nuclear lamina (Fig 2; Ciska and Moreno Díaz de la Espina, FPS 2014). The groups belongs to the International Plant Nucleus Consortium (http://bms. brookes.ac.uk/ipnc) Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology Figura 2 | Figure 2 La lámina vegetal y sus principales interacciones. La lámina de proteínas NMCP se une a los PNC a traves de Nup136 y NUA, y se asocia a los complejos que conectan núcleo y citoplasma por unión de las NMCPs a SUNs y proteínas KASH específicas (WIP). Estos complejos conectan la lámina con el citoesqueleto de actina y los complejos γ-TuC pero también anclan proteínas a la MNE (RanGAP). Interacciones no aclaradas (?). [2014] Direct assessment in bacteria of prionoid propagation and phenotype selection by Hsp70 chaperone. Mol Microbiol 91: 1070-1087. • Ciska M, Moreno Díaz de la Espina S [2013] NMCP/LINC proteins. Putative lamin analogs in plants? Plant Signaling & Behavior 8: 12e26669. • Ciska M, Masuda K, Moreno Díaz de la Espina S [2013] Lamin-like analogues in plants: the characterization of NMCP1 in Allium cepa. J Exp Bot 64: 1553-1564. 119 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 119 24/6/15 12:54 Biología Celular y Molecular | Cellular & Molecular Biology José Luis Barbero Esteban Investigador Científico [email protected] PhD, 1981 Universidad Complutense de Madrid Lucas Sánchez Rodriguez Associate Research, 1984 NYU Medical Center. Pathology Department. Dr. Angel Pellicer laboratory (New York, USA) Profesor de Investigación [email protected] PhD, 1976 Universidad Complutense de Madrid Postdoctoral, 1977-1979 Investigador Asociado, 1979-1981 Zoological Institute University of Zurich Researcher, 1983-1996 Pharmacia/Antibioticos Pharma Jefe de Grupo, 1981-1984 European Molecular Biology Laboratory (Heidelberg, Alemania) Group Leader, 1996-2006 Pharmacia/Department of Immunology and Oncology. CNB. Científico Titular, 1985 Investigador Científico,1989 Profesor de Investigación, 2004 CIB, CSIC Investigador Científico, 2006 CIB, CSIC Otros miembros | Other lab members: http://www.cib.csic.es/es/grupo.php?idgrupo=64 Dinámica Cromosómica en Meiosis El complejo de cohesinas y el control de la dinámica de dicho complejo en la cromatina son esenciales para la correcta segregación cromosómica. Errores en estos mecanismos conducen a la muerte celular, patologías como el síndrome de Down, la formación de tumores, la infertilidad y otras cohesinopatías. E n colaboración con los grupos de AM Pendás (Centro de Investigación del Cancer, Salamanca) y de JA Suja (Universidad Autónoma de Madrid) se han estudiadado diferentes proteínas denominadas “cohesin-regulators” que controlan la dinámica del complejo de cohesinas, no solo durante la segregación cromosómica, sino también en procesos de control de la expresión génica en los que las cohesinas actúan modelando la estructura de ciertas regiones de los cromosomas. Esencialmente hemos estudiado la topoisomerasa alfa-2, las acetiltransferasas ESCO1 y ESCO2 y la histona quinasa haspin en mamíferos. Por otra parte, nuestra investigación se ha centrado en estudiar en colaboración con diferentes laboratorios, las patologías producidas como consecuencia de la falta de función de la cohesina específica de meiosis STAG3, identificada y caracterizada por primera vez en 2001 en mi laboratorio. El estudio en ratones deficientes en STAG3 demostró la necesidad de su función para la fertilidad (referencia 7). El descubrimiento de mutaciones en humanos de la STAG3 que conducen a la patología denominada como “Premature ovarian failure” y su posible implicación en cáncer de ovario se ha publicado en la prestigiosa New England J. Med. con la participación de nuestro laboratorio (referencia 6). L. Sánchez está trabajando sobre la evolución de los mecanismos de determinación sexual. Maria Fernanda Ruiz Lorenzo Chromosomal Dynamics in Meiosis Are there link between human syndromes with physical and mental problems, a tumor growing out of control and the incapability to contribute to next generation? This question can be answered if we look at the biological functions of a protein complex, named cohesin. I n collaboration with the groups of AM Pendás ( Cancer Research Center, Salamanca) and of JA Suja (Autonoma University of Madrid) we have study the function of different proteins called “cohesinregulators” that control the dynamics of the cohesin complex, not only during the chromosomal segregation, but also in processes of control of the gene expression in which the cohesins act shaping the structure of certain regions of the chromosomes, such as the topoisomerase α II, the acetyltransferases ESCO1 and ESCO2 and of the histone-kinase haspin in mammals. On the other hand, our recent research has centered on studying, in collaboration with different laboratories, the pathologies produced as consequence of the lack of function of the meiosis specific cohesin STAG3, which was identified and characterized by the first time in 2001 in my laboratory. The study in deficient mice in STAG3 demonstrated the need of his function for the fertility (reference 7). The discovery of mutations in human STAG3, which drive to the pathology named as “ Premature ovarian failure “ and his possible implication in cancer of ovary has been published in the prestigious journal New England J. Med. with the participation of our laboratory (reference 6). L. Sánchez is working on the evolution of sex-determining mechanisms. Publicaciones Seleccionadas Selected Publications • Barbero JL [2013] Cohesin Complexes: Modulators of Chromatin Organization Control Gene Expression in Immune System. In: Advances in Medicine and Biology Vol. 58.pp. 167-176. Editor: Leon V. Berhardt. Nova Science Publisher, Inc. New York. USA. ISBN: 978-1-62257-803-0. • Calvente A, Viera A, Parra MT, de la Fuente R, Suja JA, Page J, Santos JL, García de la Vega C., Barbero JL, Rufas JS [2013] Dynamics of cohesin subunits in grasshopper meiotic divisions. Chromosoma 122: 77-91.(DOI 10.1007/s00412-012-0393-6). • Barbero JL [2013] Genetic basis of cohesinopathies. The Application of Clinical Genetics 6:15-23. • Rocío Gómez, Alberto Viera, Inés Berenguer, Elena Llano, Alberto M. Pendás, José Luis Barbero, Akihiko Kikuchi and José A. Suja [2014] Cohesin removal precedes topisomerase II α-dependent decatenation at centromeres in male mammalian meiosis II. Chromosoma. 123:129-146. DOI 10. 1007/s00412-013-0434-9. Figura 1 | Figure 1 Implicación del complejo de cohesinas y sus reguladores en las patologías humanas denominadas cohesinopatías. Cohesin and cohesin regulators in human cohesinopathies. Financiación | Funding • Bases Moleculares de la Aneuploidía en Cáncer: Control de la Segregación y Estabilidad Cromosómica. AP 98712012 (2012-2014) FUNDACIÓN DE INVESTIGACIÓN MÉDICA MUTUA MADRILEÑA. 120 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 120 • Barbero, JL [2014] Molecular Genetics of Cohesinopathies. In: eLS. John Wiley&Sons Ltd, Chichester. doi: 10.1002/9780470015902.a0025309. • Caburet S., Arboleda VA, Llano E., Overbeek PA, Barbero JL, Oka K., Harrison W., Vaiman D., Ben-Neriah Z., Garcia-Tuñon I., Fellous M., Pendás AM, Veitia RA and Vilain E [2014] Mutant Cohesin in Premature Ovarian Failure. New England J. Med. 370:943-949. • Llano E., Gómez-H L.,García-Tuñon I., Sánchez Martín M., Caburet S., Barbero JL, Schimenti JC, Veitia RA and Pendás AM [2014] STAG3 is a strong candidate gene for male infertility. Human Mol. Genet. 23:3421-3431. • Ruiz, M.F., Sarno, F., Zorrilla, S., Rivas, G. and Sánchez, L. (2013) Biochemical and functional analysis of Drosophila-Sciara chimeric Sex-lethal proteins. PLoS ONE 8(6): e65171. • Sánchez, L. (2014) Sex determining mechanisms in insects based on imprinting and elimination of chromosomes. Sexual Development 8: 83-103. 24/6/15 12:54 PhD, 2005 Universidad Complutense de Madrid Postdoctoral, 2005-2009 MRC-Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, UK) Postdoctoral, 2009-2012 Investigadora Ramón y Cajal, 2012 CIB, CSIC Publicaciones Seleccionadas Selected Publications • Oliva MA, Martin-Galiano AJ, Sakaguchi Y, Andreu JM [2012] Tubulin homolog TubZ in a phage partition system. Proc Natl Acad Sci USA 109 (20):7711-6. http://www.cib.csic.es/en/grupo.php?idgrupo=43 Financiación | Funding • RYC-2011-07900 (Ministerio de Ciencia e Innovación) • BFU2013-47014-P (MINECO, cofinanciado con fondos FEDER) Tubulinas y FtsZ: Modulación del Ensamblaje de Proteínas Bases moleculares de la segregación de factores de virulencia por sistemas de partición tipo III. E l éxito de los factores de virulencia radica en su habilidad para mantenerse en las bacterias. Los sistemas de partición ayudan al posicionamiento de estos elementos durante la división. Hemos identificado un sistema tipo III en el fago c-st de C. Botulinum (codifica para el botox-C), donce el complejo nucleoproteico tubCR permite anclar el fago a la proteína motora TubZ para su movilización. Además descubrimos la existencia de un regulador conservado, TubY. Ahora nos centramos en entender cómo funciona el sistema. Francisco Javier Ruiz Dueñas Investigador Ramón y Cajal [email protected] PhD, 1999 Universidad Complutense de Madrid Postdoctoral, 1999-2000 Centro di Ricerca di Risonanze Magnetiche, CERM (Florencia, Italia) Postdoctoral, 2001-2002 Investigador I3P, 2003-2005 Investigador contratado, 2006-2009 Investigador Ramón y Cajal, 2010 CIB, CSIC http://www.cib.csic.es/lignina/lignina_en.html Financiación | Funding • RYC-2009-04798 • KBBE-2010-4-265397 (EC FP7) • BIO2011-26694 (MICINN) • KBBE-2013-7-613549 (EC FP7) • CSP15-1609 (U.S. Department of Energy Joint Genome Institute, DOE-JGI) Biotecnología para la Biomasa Lignocelulósica Búsqueda e ingeniería de nuevas peroxidasas fúngicas de alto potencial redox. N uestra actividad científica se centra en la obtención de nuevas peroxidasas con propiedades catalíticas de interés que se puedan emplear en procesos industriales de oxidación, en sustitución de reactivos químicos agresivos. Para ello se ha diseñado una estrategia que consiste en la búsqueda de genes de nuevas enzimas de tipo peroxidasa en secuencias de genomas fúngicos, y en el posterior diseño a medida de sus propiedades catalíticas y estabilidad mediante el empleo de técnicas de ingeniería de proteínas. 05 _ DPTO BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR _ 15-06-24.indd 121 • Oliva MA, Andreu JM [2014] Tubulin and FtsZ superfamily of protein assembly machines. (review) In: eLS, Encyclopedia of Life Sciences (e-Book chapter; John Wiley & Sons, Ltd. Chichester) doi: 10.1002/9780470015902.a0025586. • Andreu JM, Oliva MA [2013] Purification and assembly of bacterial tubulin BtubA/B and constructs bearing eukaryotic tubulin sequences. Methods in Cell Biology 115, 269-281. Tubulins & FtsZ: Targeting Proteins Self-Assembly Molecular basis of virulence factors segregation by type III partition systems. T he extraordinary success of virulence elements relies on their stable maintenance in bacteria. Partition systems are positioning systems that evenly distribute those DNAs during division. We identified a type III partition system in Clostridium botulinum phage c-st (encodes Botox-C), where the centromere-like tubC is recognized by TubR and anchored to tubulin-like TubZ to mobilise the phage. We also discovered a conserved regulator, TubY. Now we focus on the understanding of how this system works. Programa Ramón y Cajal | Ramón y Cajal Program María A. Oliva Blanco Investigadora Ramón y Cajal [email protected] Publicaciones Seleccionadas Selected Publications • Barrasa JM, Blanco MN, Esteve-Raventós F, Altés A, Checa J, Martínez AT, RuizDueñas FJ [2014] Wood and humus decay strategies by white-rot basidiomycetes correlate with two different dye decolorization and enzyme secretion patterns on agar plates. Fungal Genet Biol 72: 106-114. • Fernández-Fueyo E, Ruiz-Dueñas FJ, Martínez MJ, Romero A, Hammel KE, Medrano FJ, Martínez AT [2014] Ligninolytic peroxidase genes in the oyster mushroom genome: heterologous expression, molecular structure, catalytic and stability properties, and lignin-degrading ability. Biotechnol. Biofuels 7:2. • Ruiz-Dueñas FJ, Lundell T, Floudas D, Nagy LG, Barrasa JM, Hibbett DS, Martínez AT [2013] Lignin-degrading peroxidases in Polyporales: an evolutionary survey based on ten sequenced genomes. Mycologia 105: 1428–1444. • Hori C, Ishida T, Igarashi K, Samejima M, Suzuki H, Master E, Ferreira P, Ruiz-Duenas FJ, Martínez AT, Covert S, Blanchette B, Cullen C [2014] Analysis of the Phlebiopsis gigantea genome, transcriptome and secretome provides insight into its pioneer colonization strategies of wood. PLOS Genetics 10: Pages: e1004759. • Linde D, Coscolín C, Liers C, Hofrichter M, Martínez AT, Ruiz-Dueñas FJ [2014] Heterologous expression and physicochemical characterization of a fungal dyedecolorizing peroxidase from Auricularia auricula-judae. Protein Expr Purif 103: 28-37. Biotechnology for Lignocellulosic Biomass Screening and engineering of new high redoxpotential fungal peroxidases. O ur research activity aims to obtain novel peroxidases with catalytic properties of interest that can be used in industrial oxidation processes, substituting harsh chemical reagents. To attain this objective, a strategy has been designed consisting of searching for genes encoding new type-peroxidase enzymes in fungal genome sequences, and subsequent tailored designing of their catalytic properties and stability by using protein engineering techniques. 121 24/6/15 12:54