diagnóstico de patógenos de abejas y si importancia en el colapso

diagnóstico de patógenos de abejas y si importancia en el colapso

Universidad Complutense de Madrid
Máster en Zoología
Trabajo Fin de Máster
DIAGNÓSTICO DE PATÓGENOS DE ABEJAS Y SU
IMPORTANCIA EN EL COLAPSO O DECLIVE DE
COLONIAS
María Buendía Abad
Directores
Dr. Mariano Higes Pascual
Dra. Concepción Ornosa Gallego
Noviembre 2015
1
Universidad Complutense de Madrid
Máster en Zoología
DIAGNÓSTICO DE PATÓGENOS DE ABEJAS Y SU
IMPORTANCIA EN EL COLAPSO O DECLIVE DE
COLONIAS
- Trabajo Fin de Máster MARÍA BUENDÍA ABAD
Noviembre 2015
La autora:
El/La director/a:
Fdo.: María Buendía Abad
Fdo.: Mariano Higes
Dep. de Patología Apícola
Centro Agrario de Marchamalo. IRIAF
VºBº el/la tutor/a:
Fdo.: Concepción Ornosa Gallego
Zoología y Antropología Física
Facultad de Ciencias Biológicas
UCM.
Fdo.: Concepción Ornosa Gallego
Dep. de Zoología y Antropología Física
Facultad de Ciencias Biológicas
2
RESUMEN
En el marco de un programa europeo (EPILOBEE) se ha llevado a cabo un estudio con el objetivo de
determinar la prevalencia real de ciertos patógenos de Apis mellifera Linnaeus 1758 en la Comunidad
Autónoma de Castilla- La Mancha (España) que podrían estar involucrados en el fenómeno conocido
como Síndrome de Despoblamiento de las Colonias. A partir de muestras tomadas durante los años
2013 y 2014, se procedió a la detección de los principales agentes mediante técnicas estandarizadas de
análisis. El ácaro de Varroa destructor se identificó directamente sobre las muestras de abejas adultas,
siguiendo las recomendaciones de la Oficina Internacional de Epizootías (OIE), mientras que los demás
agentes incluidos en el estudio se detectaron mediante la técnica de la PCR (Nosema ceranae, Nosema
apis, Apicystis bombi, Lotmaria passim, Crithidia mellificae, Acarapis woodi) y RT-qPCR (Virus del lago
Sinai (LSV), Virus de Realeras negras (BQCV), Virus de Alas deformadas (DWV)). N. ceranae fue el
patógeno de los analizados con la prevalencia más alta, seguido por la familia de los tripanosomátidos
(dentro de la cual la especie L. passim fue la más prevalente, por encima de C. mellificae) y V. destructor.
Mientras que A. woodi, y LSV no fueron detectados en ninguna muestra. Asimismo, se detectaron una
serie de relaciones significativas entre la presencia de algunos de estos organismos. Los resultados de
este trabajo coinciden con lo reportado en anteriores estudios, además de contribuir a la elaboración de
la base de datos del proyecto EPILOBEE. Sin embargo, futuras investigaciones son necesarias para
esclarecer el papel de alguno de estos agentes nosógenos, así como el de todos los demás factores que
podrían estar involucrados en el reciente aumento de la mortalidad de las abejas de la miel.
PALABRAS CLAVE: Apis mellifera, EPILOBEE, Síndrome de Despoblamiento de Colmenas, Parásitos,
Nosema ceranae, PCR, España.
ABSTRACT
As part of an European project (EPILOBEE), here we present a study to know the real prevalence of
certain pathogens of Apis mellifera Linnaeus 1758 in Castilla-La Mancha (Spain) that may be involved
with the phenomenon known as Colony Collapse Syndrome Colonies. From samples taken during 2013
and 2014, were analyzed to determine the main agents using standardized analytical techniques. The
mite V. destructor was identified directly on the samples of adult bees, following the recommendations
of the World Organisation for Animal Health (OIE), while the other agents included in the study were
detected by PCR technique (Nosema ceranae, Nosema apis, Apicystis bombi, Lotmaria passim, Crithidia
mellificae, Acarapis woodi,) or RT-qPCR (Lake Sinai Virus (LSV), Black Queen Cell Virus (BQCV), Deformed
Wing Virus (DWV)). N. ceranae was the pathogen with the higher prevalence, followed by the
trypanosomatids family (within which the specie L. passim was the most prevalent, above of C.
mellificae) and V. destructor. While A. woodi, L. passim, LSV were not detected in any sample. Also,
significant relationships among the presence of some of these organisms were detected. The results of
this study coincide with those reported in previous studies, and contribute to the development of the
database of the EPILOBEE project. However, it is necessary to do further researches in order to clarify
the role of some of these pathogens, as well as all other factors that could be involved in the recent
increase in the mortality of honey bees.
KEYWORDS: Apis mellifera, EPILOBEE, Colony Collapse Disorder, Parasites, Nosema ceranae, PCR,
Spain.
3
INTRODUCCIÓN
Un adecuado estado sanitario de las colonias de abejas melíferas (Apis mellifera,
Linnaeus, 1758) es fundamental dada su importancia, no solo a la hora de obtener
productos como la miel, la jalea real o la cera, sino también como pieza clave en la
polinización y el equilibrio de diferentes ecosistemas (Bradbear, 2009).
El conocido como “Síndrome de despoblamiento de las colmenas” en España o
Colony Collapse Disorder en Estados Unidos, supone un fenómeno de recurrente
actualidad del que muchos medios de comunicación se han hecho eco desde hace
más de una década y sobre él se están realizando continúas investigaciones con el fin
de determinar cuáles son los factores que lo provocan. Este síndrome presentó unos
síntomas inespecíficos como una disminución gradual del número de abejas adultas
de una colonia, descensos en la producción de miel y polen, aparición de
enfermedades de la cría y desorganización social de la colonia. Esta pérdida de
población y desestructuración de la colonia determinaba que las abejas supervivientes
no podían mantener las funciones básicas de la colmena, y esta acaba por colapsar.
El fenómeno se manifestó en España de una manera generalizada a principios del
presente siglo (Higes et al., 2005) y, posteriormente fueron reportándose casos
similares en el resto del mundo. Efectivamente, de diferentes zonas geográficas del
planeta se publicaron datos alarmantes sobre una creciente mortalidad de las colonias
de abejas (Bacandritsos et al., 2010; European Parliament, 2010;) lo que determinó
que tanto las autoridades sanitarias como diferentes grupos de investigación centraran
su atención sobre este problema. Actualmente, parece que el declive de las
poblaciones de abejas no depende de tan solo un factor, sino que es la consecuencia
de múltiples causas, agentes y factores que pueden actuar de forma aislada o en
conjunto, como puede ser el cambio climático, la pérdida y fragmentación de los
ecosistemas, la acción de los pesticidas o los agentes patógenos (Cox-Foster et al.,
2007; European Parliament, 2010; Higes et al., 2010a; Potts et al., 2010; van
Engelsdorp & Meixner., 2010; Farooqui, 2013; Higes et al., 2013; Goulson et al., 2015).
Sin embargo, se admite que los patógenos, y fundamentalmente los parásitos, juegan
un papel fundamental en este proceso (Evison et al., 2012).
Dentro del marco de la Unión Europea, España es el país con el mayor número de
colonias de abejas registradas (2,5 millones, aproximadamente), lo que supone
aproximadamente el 21% del total de las colonias de abejas de toda la UE. También el
sector apícola español es el que presenta un mayor número de profesionales, siendo
4
además, el primer productor Europeo de miel con más de 33 toneladas por año
(Chauzat et al., 2013), dado que se trata de un país con un clima idóneo para que,
durante una gran parte del año,
las abejas puedan mantener su actividad. La
Comunidad Autónoma de Castilla – La Mancha alberga un gran número de estas
colonias (161.754), siendo la quinta en términos de producción de miel, con una
Denominación de Origen mundialmente conocida por su calidad, como es la “Miel de
la Alcarria”. Por ello, dados los beneficios, tanto económicos como medioambientales,
que estos insectos producen, son necesarios programas de control y vigilancia de
dichos himenópteros, con el objetivo de conocer qué agentes nosógenos son los más
prevalentes y cuál es su efecto real sobre la viabilidad de las colonias de abejas, ya
sea por su propia acción o en conjunto con otros factores.
Durante los años 2012, 2013 y 2014, se ha desarrollado un Programa de Vigilancia
Piloto a nivel europeo, coordinado y dirigido por el Laboratorio de Referencia de la UE
para las enfermedades de las abejas (Sophia Antipolis, Francia), con el objetivo de
obtener datos reales sobre el estado de salud de las colonias de abejas en los países
miembros. Así pues, el proyecto EPILOBEE (Chauzat et al., 2014) es el resultado de
una gran coordinación y esfuerzo por parte de los países colaboradores, para poder
elaborar una base de datos segura y representativa del estado de salud de las abejas
en la Unión Europea en general y en cada uno de sus estados miembros de forma
particular.
En lo que a nuestro país se refiere, se han desarrollado programas de investigación
con el objetivo de implementar y adaptar los programas de vigilancia piloto a cada una
de las CCAA. Inicialmente, según el programa nacional, el cometido a realizar en el
laboratorio de Patología Apícola del Centro Apícola Regional (CAR) de Castilla – La
Mancha era detectar la presencia de Varroa destructor en las colmenas seleccionadas
para el estudio, pero posteriormente, con cargo al proyecto INIA-RTA2013-00042-06,
también se planteó la detección de otros patógenos que podrían estar relacionados
con el debilitamiento y la mortalidad de las colonias de abejas.
Los agentes patógenos que fueron seleccionados para su detección en las
muestras fueron los que siguen:
1. Varroa destructor (Anderson & Trueman, 2000). Inicialmente descrito como
Varroa jacobsoni por Oudemans (1904). Posteriormente Anderson & Trueman
(2000) demostraron que el Género Varroa es un complejo de especies y que el
ácaro que afecta a A. mellifera difiere al descrito por Oudemans para la abeja
asiática Apis cerana, Fabricius, 1793 (Garrido-Bailón, 2013). Perteneciente al
5
Orden Mesostigmata, este ácaro hematófago continúa siendo, desde hace
muchos años, uno de los principales problemas para la salud de las abejas
melíferas (Rosenkranz et al., 2010). Su hospedador original es la abeja
asiática, Apis cerana, pero se ha propagado en un corto periodo de tiempo por
todo el mundo, infectando también a la abeja europea, causando graves
pérdidas en la apicultura mundial. Además de su propia acción patógena, se
piensa que cumple un papel como vector de otros agentes patógenos, tales
como algunos virus (Nordström et al., 1999, Tentcheva et al., 2004). Causa la
enfermedad conocida como varroosis.
2. Nosema ceranae (Fries, Feng, Silva, Slemenda & Pieniazek,). Este
microsporidio (Nosematidae), al igual que V. destructor, es un parásito original
de Oriente, que ha llegado a infectar también a la abeja europea y a los
representantes del género Bombus Latreille, 1802. Su detección en A. mellifera
Linnaeus, 1758 en España en 2004 (Higes et al., 2005, 2006) y posteriormente
en Europa y Asia (Fries et al., 2006; Chauzat et al., 2007; Huang et al., 2007;
Topolska & Kasprzak, 2007; Chen et al., 2008) supuso una gran controversia
sobre el papel del mismo en el Síndrome de Despoblamiento, considerándose
actualmente como una enfermedad emergente a nivel mundial. Provoca una
enfermedad denominada nosemosis tipo C, en la que el microsporidio se
reproduce en las células epiteliales del ventrículo de las abejas, causando toda
una serie de desórdenes alimenticios, hormonales y finalmente, la muerte.
3. Nosema apis (Zander, 1909). Agente causal de la nosemosis tipo A, que
presenta un cuadro clínico característico de la enfermedad, diferente al debido
a la nosemosis C. Al igual que N. ceranae, el microsporidio se reproduce en el
interior del epitelio del ventrículo de las abejas adultas. Actualmente, está
distribuido por todo el mundo, aunque está más asociado a climas templados
con patrones estacionales (Bailey, 1955; Martín-Hernández et al., 2012).
4. Tripanosomátidos. Esta familia de protozoos que pueden afectar a las abejas
de la miel están siendo recientemente muy estudiados por su posible papel en
el declive de colonias (Ravoet et al., 2013). Sin embargo, aun hoy en día se
desconoce realmente que especie de tripanosomátido es la más prevalente,
aunque son dos las especies descritas: Crithidia mellificae y Lotmaria passim.
 Crithidia mellificae (Landridge & McGhee, 1967).
Perteneciente al
orden de los Tripanosomátidos, este protozoo se desarrolla en el tracto
digestivo de los insectos. Sin embargo, no se ha establecido de forma
6
clara el papel patogénico de este organismo, ya que las tasas de
mortalidad en abejas infectadas y no infectadas es muy similar
(Landridge & McGhee, 1967; Cox-Foster et al., 2007; vanEngelsdorp et
al., 2009), en contraste a lo descrito para Crithidia bombi (Yourth et al.,
2008).
 Lotmaria
passim
(Evans
&
Schwarz,
2015).
Tripanosomátido
recientemente descrito. Gracias a las técnicas genómicas actuales se
determinó que el tripanosomátido más frecuentemente detectado en
abejas era una especie diferente a C. mellificae, estableciéndose un
nuevo taxón (Cepero et al., 2014). Actualmente los trabajos científicos
sugieren que, efectivamente, se trata del tripanosomátido predominante
en las abejas de la miel en lugar de C. mellificae (Ravoet et al., 2015)
5. Acarapis woodi (Rennie, 1921). Ácaro traqueal de las abejas adultas, causa la
enfermedad conocida como acarapisosis. Su efecto patógeno varía según
varios factores (edad de la abeja, número de ácaros) pudiendo causar
alteraciones mecánicas (incapacidad de vuelo, abdomen dilatado, obstrucción
de la tráquea) y desórdenes en el comportamiento (OIE, 2008; Garrido-Bailón,
2013; Cepero et al., 2015), lo que conlleva un debilitamiento general del
insecto, pudiendo causar la muerte del mismo. Asimismo, puede actuar como
vector de virus y bacterias (Scott-Dupree et al., 1995)
6. Apicystis bombi (Liu, Macfarlane & Pengelly). Inicialmente descrito como
Mattesia bombi, en 1996 fue reclasificado en un nuevo género, Apicystis (Lipa
& Triggiani, 1996). Perteneciente al orden Neogregarinorida, este protozoo, a
pesar de su baja prevalencia, causa serios problemas, tanto físicos como de
comportamiento en las colonias de Bombus sp. (Schmid-Hempel, 2001;
Rutrecht & Brown, 2008) y de Apis mellifera (Plischuk et al., 2011)
7. Virus de Realeras Negras (BQCV) (Bailey & Woods, 1974). Dicistroviridae.
Causa el ennegrecimiento de las celdillas reales selladas con prepupas
muertas en su interior (COLOSS). También afecta a las pupas de las obreras,
pero en este caso es asintomático (Antúnez et al., 2012). Según algunos
estudios previos, este virus podría estar íntimamente relacionado con la
presencia de N. apis (Bailey et al., 1983; Tentcheva et al., 2004, Higes et al.,
2007a).
8. Virus de Alas Deformadas (DWV) (Bailey et al., 1979). Familia Iflaviriadae.
Suele registrar elevadas prevalencias tanto en abejas como en los ácaros de
7
Varroa. Responsable de las deformidades de las alas y un acortamiento del
abdomen cuando la infección se produce durante la fase de desarrollo de la
pupa de ojos blancos (Tentcheva et al., 2004). Normalmente asociado a
aquellas colmenas con una gran infestación de V. destructor (Nordström et al.,
1999, Antúnez et al., 2012), puesto que en ausencia del ácaro, el virus se
mantiene con muy bajas prevalencias (De Miranda et al., 2010).
9. Lake Sinai Virus (LSV) (Runckel et al., 2011). Familia Secoviridae. Se ha
sugerido que este complejo vírico puede desempeñar un papel importante en la
salud de las abejas (Runckel et al., 2011; Cepero et al., 2014).
Así pues, los principales objetivos del presente trabajo son:
-
Analizar las muestras de abejas adultas procedentes del Programa de
Vigilancia Piloto recogidos durante los años 2013 y 2014 en Castilla – La
Mancha, para poder determinar la prevalencia real de los principales agentes
patógenos.
-
Estudiar las posibles relaciones existentes entre dichos agentes, así como
aquellos factores que puedan favorecer su acción y su presencia.
-
Contribuir a la elaboración de la base de datos del programa EPILOBEE para
la salud de las abejas.
MATERIAL Y MÉTODOS
Para los estudios de esta naturaleza se requiere un elevado número de muestras,
además de una alta representatividad, lo que determina el que para su obtención se
utilice un riguroso protocolo estandarizado, garantizando su adecuada recepción para
el estudio y que se explica a continuación.
Las muestras fueron recolectadas por apicultores seleccionados al efecto, siempre
bajo la supervisión de veterinarios responsables de cada explotación. De este modo, el
presente trabajo comenzó en el Laboratorio de Patología Apícola Centro Apícola
Regional de Castilla-La Mancha (IRIAF) con el análisis de las muestras que habían
sido recolectadas durante el 2013 y 2014 en esta Comunidad Autónoma, y que habían
sido conservadas en las condiciones adecuadas para su posterior análisis en el citado
laboratorio.
8
1. TAMAÑO MUESTRAL Y SELECCIÓN DE LAS COLONIAS
En mayo de 2014, el censo de colmenas (REGA1) en nuestro país ascendía a
un total de 2.576.138, distribuidas en 25.898 explotaciones repartidas por toda
España, valor similar al registrado para 2013.
Por otro lado, el número de colmenares muestreados debería permitir detectar
una prevalencia de los distintos agentes patógenos de, al menos, un 15%
(prevalencia asumible para un patógeno emergente, además de ser propia de
microsporidios endémicos de insectos), con un error del 5%, en una población total
de 100.000 colmenares. Como resultado, se estimó que el número de explotaciones
a muestrear en todo el país debía ser de 203, con una distribución proporcional en
cada Comunidad Autónoma, según el número de colmenares que posea que posea
(Tabla 1).
COMUNIDAD AUTÓNOMA
COLMENAS
NºEXPLOTACIONES
NºCOLMENARES
A MUESTREAR
Andalucía
584.570
4.074
44
Aragón
106.350
1.352
10
Principado de Asturias
34.715
1.459
2
Baleares
10.043
530
0
Canarias
32.342
1.305
2
Cantabria
10.627
264
0
Castilla La Mancha
161.754
1.835
14
Castilla y León
380.698
4.170
32
Cataluña
100.882
1.505
8
Extremadura
514.535
1.140
36
Galicia
105.403
3.334
8
Madrid
9.655
253
0
Región de Murcia
93.484
486
8
Comunidad F. Navarra
12.720
465
2
País Vasco
25.976
1.518
3
La Rioja
17.883
276
2
374.501
1.932
32
2.576.138
25.898
203
Comunidad Valenciana
TOTAL ESPAÑA
Tabla 1. Relación del número de colmenas y explotaciones por Comunidad Autónoma, así como el número
de colmenares seleccionados proporcionalmente en cada una de las mismas. Fuente: MAGRAMA.
Asimismo, el número de colmenas muestreadas por colmenar viene
determinado por el número de colmenas que tenga cada apiario seleccionado para
participar en el estudio (Tabla 2), con un máximo de 13 colmenas para aquellos
1
Registro General de Explotaciones Ganaderas
9
colmenares que sobrepasen las 61 y todas para aquellos que cuenten con menos
de 8 colmenas.
CENSO COLMENAS
≤8
MUESTRA
todas
9-10
8
11-20
10
21-30
11
31-60
12
>61
13
Tabla 2. Número de colmenas a muestrear a proporción del tamaño del colmenar. Fuente: MAGRAMA.
Por lo tanto, para hacer la selección de las colmenas participantes en el estudio
se requirieron de dos etapas: selección de colmenares y selección de las colmenas
dentro de los mismos. Los colmenares que participaron en el estudio se
seleccionaron desde la Conserjería de Agricultura de la Junta de Comunidades de
Castilla-La Mancha, siguiendo las directrices marcadas por la Dirección General de
Ganadería del MAGRAMA de forma aleatoria2, teniendo en cuenta la distribución de
las explotaciones en cada provincia. La selección de las colmenas a muestrear
también se llevó a cabo aleatoriamente por los veterinarios responsables de los
colmenares seleccionados. Cada colmena se identificó adecuadamente 3 y se
realizó un seguimiento de los colmenares participantes objeto de trashumancia4. Así
pues, en Castilla La Mancha, se visitaron un total de 13 apiarios en el año 2013 y
10 en el año 2014, resultando un total de 274 colmenas muestreadas (Tabla 3).
2013
2014
Albacete
4
COLMENAS
MUESTREADAS
52
4
COLMENAS
MUESTREADAS
52
Ciudad Real
0
0
2
22
Toledo
2
24
4
49
Cuenca
5
50
0
0
Guadalajara
2
25
0
0
TOTAL CLM
13
151
10
123
EXPLOTACIONES
EXPLOTACIONES
Tabla 3. Relación entre las explotaciones seleccionadas por provincia y las colmenas muestreadas en cada
explotación durante los años 2013-2014 en Castilla La Mancha.
2
2/3 de los colmenares se seleccionaron al azar, el 1/3 restante se seleccionó al azar de entre
aquellos colmenares que participaron en el programa previo.
3
Real Decreto 209/2002
4
Artículo 11 del Real Decreto 209/2002.
10
2. PROCEDIMIENTO DE MUESTREO
Por otro lado, el muestreo implicaba tres visitas a cada colmenar seleccionado.
Dada la diversidad climatológica del país, cada visita a todos los colmenares (1ª, 2ª
y 3ª) se llevó a cabo en un intervalo máximo de 30 días. Cada visita exige
cumplimentar un formulario de inspección diferente de acuerdo al número de visita
del que se tratara, identificando cada colmena y colmenar mediante un código
específico. El trabajo de recogida de información en dicho formulario (prácticas
apícolas, condiciones del colmenar, observaciones clínicas, etc.), así como la
recolección las muestras biológicas, fue realizado por los veterinarios responsables
de cada explotación, que prestaron especial atención a cualquier signo de
enfermedad, intoxicación o presencia de ácaros similares a las enfermedades
exóticas.
La primera visita supuso como toma de contacto con las condiciones iniciales
de la colonia, y se realizó a finales de otoño - principios del invierno, según las
condiciones climatológicas de cada CCAA. Se contabilizó el número de colonias
vivas y sanas, y se llevó a cabo una revisión para detectar posibles síntomas
causados por V. destructor y Nosema spp., además de otros patógenos. En la
segunda visita (final del invierno – comienzo de la primavera) se valoraba la
mortalidad invernal, tomando datos de las condiciones de cada colmena
seleccionada (número de colonias muertas o débiles, incrementos/detrimentos no
causados por enfermedades y otros cambios). Por último, la tercera visita servía
para valorar la mortalidad producida durante la estación de cosecha de miel (finales
de primavera – principios de verano), recolectándose datos sobre el estado de las
colmenas, de la misma forma en la que se hizo en la segunda visita. Al cabo de un
mes, el apicultor debía facilitar un informe sobre el estado de los colmenares
seleccionados.
Las muestras recolectadas para el análisis de V. destructor, aproximadamente
300 obreras vivas, se tomaron (solo en la primera visita) sobre cría no operculada,
es decir, aquellas celdillas con huevos o larvas que las abejas de interior aún no
han cubierto con cera. Sin embargo, para el análisis de las especies de Nosema se
recogieron 60 abejas adultas de la periferia. Esta diferencia en la recogida de
muestras se debe a que, en la periferia de la colmena abundan las abejas de más
edad, además de una gran parte de las pecoreadoras que regresan, dos grupos
que suelen estar más parasitados. Para ambas muestras se utilizaron envases
(cajas de cartón con pegatinas verdes) que evitaran el aplastamiento de las abejas.
11
Se conservaron en frío para impedir su descomposición hasta el momento del
análisis, o bien se trasladaron vivas al laboratorio. Cuando las colonias presentaban
anomalías visibles (signos clínicos o comportamientos anormales), se recolectaron
asimismo unas 30 abejas, preferentemente vivas, introduciéndolas en envases de
50 ml y conservadas de igual modo en frío. También se recolectaron muestras de
cría, miel y polen para diversos análisis que no se incluyeron en el presente estudio.
Las muestras recolectadas se sometieron a dos tipos de pruebas:
-
Análisis sistemáticos en muestras sistemáticas en los laboratorios de las CCAA
y el Laboratorio Central Veterinario de Algete. Examen, detección y
cuantificación de V. destructor (OIE, 2008). Se aprovechó, asimismo, para
buscar la presencia del escarabajo Aethina tumida Murray 1867, y del ácaro
Tropilaelaps spp. También se tuvo que examinar una muestra de cada colonia
procedente de colmenares participantes en el programa 2012-2014 para la
detección de Nosema spp.
-
Análisis en muestras sintomáticas (LCV Algete y MAGRAMA). En aquellas
colmenas que presentaran síntomas de enfermedad o intoxicación a lo largo de
las tres visitas.
3. PROCESADO Y ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS
Durante el periodo de recolección de muestras incluido en el Programa de
Vigilancia Piloto (2013 - 2014), un total de 274 muestras (>300 abejas
adultas/muestra) de colmenas procedentes de los 23 apiarios seleccionados
llegaron (congeladas o vivas) al Centro Apícola Regional para su posterior análisis
(Tabla 3). A su llegada al CAR, a cada muestra se le asignó un código identificativo.
Fue necesario mantener las abejas en las condiciones adecuadas de conservación
en congelación a -80ºC y estandarizadas a nivel europeo 5. Una vez divididas e
identificadas las submuestras (adultas, cría, polen, cera y miel), se procedió al
procesado de las mismas, en el caso del presente estudio, únicamente las abejas
adultas.
 Análisis de Varroa destructor
A la hora de determinar la presencia del ácaro V. destructor se siguieron las
directrices del EURL para el programa EPILOBEE 6 . Antes del análisis, se
determinó el número de abejas de cada muestra, normalmente en torno a 300
5
6
Laboratorio de Referencia Europea para la salud de las abejas (EURL)
Adaptación de los métodos del OIE (2008)
12
abejas adultas, en su mayor parte obreras (salvo algunas excepciones en las
que se recolectaron zánganos y reinas, lo cual quedó reflejado en el libro de
registros del CAR con el objetivo de llevar un control sobre qué contenía cada
muestra), para poder obtener un porcentaje de parasitación7. Posteriormente,
se realizó una inspección en busca de alteraciones en la morfología y síntomas
patognomónicos de la parasitación por este ácaro (abdomen y alas
deformadas, etc.), después de lo cual se llevó a cabo un análisis macroscópico
para detectar la presencia de V. destructor. Los ácaros encontrados en cada
muestra fueron recolectados en tubos Eppendorf (1.5 mL) debidamente
etiquetados.
 Extracción de DNA y RNA
120 abejas de cada muestra fueron seleccionadas e introducidas en bolsas
estériles (BA6040 strainer bags) para su macerado con 18 ml de buffer AL 50%
(Antúnez et al., 2012; Cepero et al., 2014) con un Stomacher 80 Biomaster
(Seward). El macerado obtenido se depositaba en tubos Falcon de 50 ml para,
a continuación, ser centrifugados en una centrífuga durante 10 minutos a 3000
rpm, de donde se obtenían dos fases: sedimento, que se utilizó para la
posterior extracción de DNA, y sobrenadante, para la extracción de RNA. Hasta
el momento de la extracción, todo el material se conservará a -80ºC.
El sedimento obtenido según el proceso anterior fue utilizado, como se ha
indicado, para la posterior extracción del DNA. Para ello, una vez retirado el
sobrenadante de cada tubo, se añadieron 3 mL de H2O miliQ al sedimento para
resuspenderlo. A continuación, utilizando una pipeta Pasteur estéril, se
transfirieron 400 μL de la suspensión a una placa (Collection Microtube
Racked, Qiagen) de 96 pocillos con perlas de vidrio (2 mm diámetro, Sigma)
siendo posteriormente agitado en un TissueLyser (Qiagen) durante 6 minutos a
30 Hz para romper los exoesqueletos de las abejas, las paredes de las esporas
y los tejidos de abeja, consiguiendo de esta manera, una posterior extracción
de DNA más eficiente. De este modo, en cada pocillo se consigue un macerado
de la muestra recogida en cada colmena. Una vez que se sometió la muestra a
este procesado mecánico, se pipetearon 150 μL de cada macerado obtenido en
cada uno de los pocillos en una placa Deepwell (Eppendorf), junto con 30 μL de
buffer ATL (Quiagen) y 20 μL de Proteinasa K (Quiagen) para su incubación a
56ºC una noche, almacenando el excedente para futuros análisis (Martín7
(nº V. destructor*100)/nº abejas de la muestra
13
Hernández et al., 2012). A continuación, con el robot BioSprint (Quiagen) se
realizó la extracción del DNA usando el protocolo BS96 DNA Tissue, después
de lo cual se conserva la placa a -20ºC. Los tres últimos pocillos de la placa se
dejan vacíos para incluir los controles de PCR (un positivo y dos negativos),
además de ir incluyendo un control negativo de extracción y PCR (macerado
del buffer AL utilizado) cada 20 pocillos.
Para la extracción del RNA se tomaron 400 μL de sobrenadante de cada
muestra, que fue depositado en los pocillos de las placas 96-well microtitre con
20 μL de Proteasa (Quiagen) y posteriormente incubado durante 15 minutos a
70ªC, almacenando el excedente. Añadimos la Master Mix (200 μL de
Isopropanol, 30 μL de Magthect Susp. G) y se extrajo con un BioSprint
(Quiagen). A continuación, para eliminar los restos de DNA, añadiremos DNase
I (Quiagen).
 PCR, RT- PCR y qRT- PCR (Figuras y Tablas: Anexo I)
Una vez extraídos los ácidos nucleicos, y mediante la técnica de la PCR, se
procedió a la detección de los principales patógenos involucrados en la
mortalidad de las abejas. En concreto, se investigó la presencia de especies de
Acarapis según la técnica descrita por Cepero et al. (2014), los microsporidios
N. apis y N. ceranae según la técnica descrita por Martín Hernández et al.
(2012), tripanosomátidos y neogregarinos tal y como describen Meeus et al.
(2010). Mediante la técnica de RT-PCR se detectó la presencia del complejo
Lake Sinai Virus (LSV) según la técnica descrita por Ravoet et al. (2013); los
Virus de Alas Deformadas (DWV) y de las Realeras Negras (BQCV) se
analizaron según la técnica descrita por Chantawannakul et al., (2006)
mediante qRT-PCR.
En el caso concreto de los tripanosomátidos y neogregarinos, en lugar de
realizar una PCR doble, como se indica en Meeus et al., (2010) se realizaron
sendas PCRs simples para cada organismo, puesto que los resultados
obtenidos no eran repetibles (Higes 2015, com. pers.).
 Secuenciación de tripanosomátidos
A fin de esclarecer cual era el tripanosomátido más prevalente en las
muestras obtenidas (C. mellificae, L. passim u otros no descritos hasta el
momento), se seleccionaron un total de 15 muestras (tres por provincia,
utilizando positivos de ambos años) que hubieran dado resultados positivos por
14
el método descrito por Meeus et al. (2010). Sobre los productos de PCR de las
muestras seleccionadas se llevó a cabo un procedimiento de purificación de las
muestras con un QIAquick PCR purification kit (Qiagen) como se describe en
Gómez-Moracho et al., (2015), y se secuenciaron en el Parque Científico de
Madrid (España) en un secuenciador automático ABI3730XL usando Big Dye
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El programa estadístico empleado para todos los análisis fue el SPSS 23
(Centro de Estadística del CSIC, Madrid). Para observar la correlación entre los
diferentes agentes nosógenos se realizó un estudio de dependencia de respuesta
con χ2, resuelto con un Test de Pruebas exactas de Fisher. Además, se determinó
si las prevalencias de dichos agentes cambiaron en los dos años de duración del
estudio, así como al considerar ambos años en conjunto, para lo que se llevó a
cabo un análisis descriptivo por años de la prevalencia de cada elemento para el
total de colmenas y colmenares, usando Pruebas de Significación.
RESULTADOS
En el presente trabajo se muestran las prevalencias medias de los principales
patógenos que podrían afectar a las colonias de abejas melíferas en Castilla- La
Mancha. De los diez agentes patógenos que se incluyeron en este estudio para su
detección, únicamente dos (A. woodi y LSV) no se detectaron en ninguna de las
muestras analizadas.
En el año 2013, el patógeno más prevalente fue N. ceranae con un 39.7%, muy por
encima a la del otro microsporidio, N. apis, que registró una prevalencia media de un
15.2%. Los tripanosomátidos fueron el segundo patógeno más prevalente (27.2%),
mientras que V. destructor se detectó solamente en un 11.9% de las muestras
analizadas. Se detectó una menor prevalencia de A. bombi (4.3%), mientras que A.
woodi no se detectó en ninguna de las muestras. En cuanto a los virus, destacó el
BQCV, con una prevalencia del 23.8%, seguido por DWV con un 11.9% de
prevalencia). Por el contrario, el LSV no fue detectado en ningún caso.
Asimismo, en 2014, N. ceranae siguió siendo el patógeno más prevalente, aunque
aumentó notablemente su prevalencia en las muestras analizadas hasta alcanzar el
64.2%. Sin embargo, en el caso de N. apis, su prevalencia disminuyó hasta el 1.6%.
También aumentaron las prevalencias de tripanosomátidos y V. destructor, con un
15
40.7% y un 33.3%, respectivamente. Por el contrario, los casos de A. bombi no fue
detectado en ninguna de las muestras analizadas, al igual que A. woodi. Respecto a
los virus, el DWV aumentó su prevalencia a un 29.3%, al contrario que el BQCV, cuya
prevalencia descendió hasta el 21.1%. El LSV no fue detectado en ninguna de las
muestras incluidas en el estudio. Todos estos datos están reflejados en la Figura 1.
70
64,2
60
50
40,7
39,7
40
%
33,3
20
10
29,3
27,2
30
11,9
23,8
21,1
15,2
1,6
2013
11,9
4,3
0
0 0
2014
0 0
0
AGENTE PATÓGENO
Figura 1. Análisis descriptivo por años de las prevalencias medias de cada patógeno.
Analizando ambos años en conjunto, el patógeno más prevalente fue N. ceranae,
con una prevalencia media del 50.7%, registrándose en Ciudad Real la máxima
prevalencia (77.3%) y en Cuenca la más baja (36.0%). En segundo lugar, en cuanto a
prevalencia, están los tripanosomátidos (33.2%), destacando su presencia en apiarios
de Albacete (47.1%), mientras que en la provincia de Guadalajara registró su valor
más bajo (12.0%). V. destructor ocupa el tercer puesto con una prevalencia de un
21.5%. La mayor prevalencia encontrada para este patógeno fue de un 50.0% en
Ciudad Real, mientras que la más baja se sitúa en Cuenca (10.0%), con un porcentaje
de parasitación medio de un 0.6% y únicamente dos muestras con una parasitación
elevada (>15.0%). Los neogregarinos analizados (A. bombi) únicamente se detectaron
en la provincia de Cuenca (14.0%), pero en distintos colmenares. Por su parte, N. apis
solo fue detectado en 4 de las 5 provincias, con una prevalencia media de un 9.1%,
con su máximo registrado en Guadalajara (28.0%).
Respecto a los virus, solo BQCV y DWV fueron detectados en las muestras
analizadas, como se ha dicho anteriormente. La prevalencia media de BQCV fue de un
22.6%, detectándose en mayor medida en Cuenca (46.0%) y en menor cantidad en
Ciudad Real (9.1), mientras que para DWV encontramos una prevalencia media de
16
19.7%, con el máximo registrado en la provincia de Ciudad Real (22.7) y el mínimo en
Guadalajara (16.0%). Se ha incluido una tabla resumen de las prevalencias totales y
desglosadas por provincias de estos patógenos estudiados en el apartado Figuras y
Tablas (Anexo II).
En cuanto a las relaciones entre patógenos, se ha observado que en aquellas
colonias con V. destructor la presencia de DWV fue significativamente mayor (χ2,
p<0.05). Con el microsporidio N. ceranae no se observó correlación alguna con la
presencia de V. destructor, pero al estudiar ambos años por separado, se ve que en el
año 2014 hay cierta dependencia, aunque no llega a ser significativa (p=0.074). Si que
se observó correlación entre N. ceranae y BQCV (p=0.031), así como cierta asociación
(p=0.093) con N. apis, que al estudiar los dos años por separado, se vuelve
significativa para el año 2013 (p=0.01). Sin embargo, la presencia de N. ceranae no
está significativamente asociada con la presencia de Tripanosomátidos (p=0.755). En
el caso de A. bombi., se observa una correlación con la presencia de DWV (p=0.037)
en el año 2013, mientras que en el 2014 no se detectó dicho neogregarino en ninguna
de las muestras analizadas.
Los resultados obtenidos de la secuenciación de los productos de PCR de las
muestras de tripanosomátidos seleccionados, evidenciaron una predominancia de la
especie de L. passim (73.33%) frente a la especie con C. mellificae (20%). Una
muestra positiva a tripanosomátidos no permitió su identificación específica (secuencia
dudosa que no se correspondía claramente con ninguna especie). Es destacable que
este resultado supone la primera detección de L. passim en Castilla-La Mancha.
PROVINCIA
ALBACETE
TOLEDO
GUADALAJARA
CUENCA
CIUDAD REAL
ADSG APÍCOLA DE TOLEDO
MUESTRA
PA14-0004
PA14-0015
PA14-0067
PA14-0044
PA14-0058
PA14-0063
PA14-0101
PA14-0104
PA140114
PA14-0118
PA14-0121
PA14-0906
PA14-0923
PA14-0925
PA14-0233
ORGANISMO
L. passim
C. mellificae
L. passim
C. mellificae
L. passim
NO DETERMINADO
C. mellificae
L. passim
L. passim
L. passim
L. passim
L. passim
L. passim
L. passim
L. passim
Tabla 4. Resultados obtenidos de la secuenciación de muestras de tripanosomátidos
17
DISCUSIÓN
N. ceranae continúa siendo el agente nosógeno más prevalente en la zona de
estudio, como ya ha sido reportado en anteriores trabajos (Higes et al., 2009a; MartínHernández et al., 2012), con una prevalencia media de un 50.7%, presentando
siempre prevalencias superiores al 35.0% en todas las provincias. Sin embargo, esto
no es algo exclusivo de nuestro país, sino que coincide con lo registrado en otras
zonas geográficas (Giersch et al., 2009; Runckel et al., 2011; Li et al., 2012; Martínez
et al., 2012; Morimoto et al., 2013; Yang et al., 2013). Desde su detección en Apis
mellifera por primera vez en Europa (Higes et al., 2006) este patógeno ha provocado
una gran controversia acerca de su papel en las pérdidas de las colonias de abejas
(Higes et al., 2013). Sin embargo, actualmente se considera un patógeno emergente
que ha experimentado una expansión poblacional reciente desde su área geográfica
de origen, en Oriente (Botías et al., 2012ª; Gómez-Moracho et al., 2015), siendo capaz
de infectar, además de a las abejas melíferas, a otras especies de polinizadores como
abejorros y abejas solitarias (Chen et al., 2008; Plischuk et al., 2009; Ravoet et al.,
2014). Todo ello confirma la gran capacidad de este agente para dispersarse por todo
el mundo (Martín-Hernández et al., 2007; Higes et al., 2010). Además, su presencia
puede favorecer la aparición de otras enfermedades oportunistas, así como trastornos
en el comportamiento de las abejas, alteraciones en la cría
y pérdidas en la
producción de miel y polen (Botías et al., 2012b).
Anteriormente a su detección, se consideraba que la única especie de microsporidio
capaz de parasitar a las abejas melífera era N. apis (Higes et al., 2010), normalmente
asociado a un cuadro clínico característico y con una estacionalidad determinada (bajo
nivel de infección en verano, un pequeño pico en otoño y un gran pico en primavera)
(Bailey, 1955). Sin embargo, actualmente el microsporidio mayoritariamente detectado
en las abejas es N. ceranae (Higes et al., 2013), que provoca una enfermedad bien
diferenciada a la producida por N. apis y que se denomina nosemosis tipo C (Higes et
al., 2010). La gran prevalencia de N. ceranae, muy superior a la detectada para N.
apis, ha llevado a plantear la hipótesis de un posible reemplazo de N. apis por parte de
N. ceranae en las colonias de abejas. Sin embargo, los resultados muestran que la
situación de N. apis en nuestro país es endémica, mientras que N. ceranae presenta
un patrón más propio de una epidemia, y una rápida expansión como resultado de un
mayor potencial biótico y del salto a un nuevo hospedador, de A. cerana a A. mellifera
(Martín-Hernández et al., 2012).
18
Ya que la detección de N. ceranae como patógeno de A. mellifera es relativamente
reciente (Higes et al., 2006), aun quedan por resolver algunos interrogantes acerca de
su patología.
Este microsporidio se multiplica en A. mellifera del mismo modo que lo hace N.
apis, aunque puede invadir los tejidos, llegando a limitar la capacidad de recuperación
del epitelio al afectar también a las células de regeneración. Sin embargo, esto no se
había detectado en la abeja asiática, produciéndose un mecanismo de autolimitación,
determinando una menor diseminación del parásito en A. cerana (Fries et al., 2006).
Las lesiones celulares producidas por ambos microsporidios son similares, aunque
aparecen ciertas diferencias (presencia de lisosomas en el citoplasma, rotura de las
membranas celulares) (Liu, T.P., 1984; Higes et al., 2007). Asimismo, se ha sugerido
una posible capacidad para infectar otros tejidos además del epitelio ventricular (Chen
et al., 2009). Todo ello contribuye a la alta patogenicidad de N. ceranae para su nuevo
hospedador, induciendo en él una mayor mortalidad de la que provoca N. apis, tal y
como ha sido reportado por anteriores estudios (Higes et al., 2007b; Paxton et al.,
2007).
También se ha descrito que la infección por N. ceranae afecta a la capacidad de
vuelo de las abejas, de modo que la tasa de abejas que retornan a la colmena tras
pecorear disminuye (Higes et al., 2008; Wolf et al., 2014). Además, se han reportado
otras alteraciones respecto al comportamiento que podrían estar relacionadas con el
estrés energético debido a la infección por N. ceranae (Martín-Hernández et al., 2011),
con consecuencias como una mayor apetencia por el alimento y una menor capacidad
reguladora (Campbell et al., 2010). También provoca inmunosupresión (Antúnez et al.,
2009), aumentando el riesgo de sufrir infecciones oportunistas causadas por virus.
Lesiones similares han sido descritas, asimismo, en abejas reinas, acompañadas de
cambios hormonales que podrían alterar la salud de éstas, y, consecuentemente, de la
colonia (Higes et al., 2009b).
En un sistema social organizado como es una colonia de abejas, cualquier efecto
que se produzca a nivel individual puede perturbar su equilibrio (Higes et al., 2013).
Así pues, la supervivencia de la colonia depende, de un modo u otro, de la vida de las
obreras, que puede verse afectada por la infección causada por N. ceranae,
reduciendo en gran medida la población de abejas adultas (Higes et al., 2007b; Paxton
et al., 2007; Botías et al., 2010). Este debilitamiento de la colonia podría deberse a que
muchas de las abejas infectadas no consiguen volver a la colmena, disminuyendo la
población de pecoreadoras (Higes et al., 2008). De este modo, y para mantener el
19
equilibrio de la colonia, las abejas jóvenes comienzan a pecorear antes de lo debido
(Amdam & Omholt, 2003; Perry et al., 2015), modificando, así, todo el sistema de
trabajo de la colonia. Consecuentemente, las actividades internas de la colmena
(cuidado de la cría, higiene, termorregulación, etc) pueden verse afectadas,
incrementando el riesgo de desarrollar enfermedades de la cría (Hedtke et al., 2011).
Una vez que la colonia no puede mantener la tasa de reemplazo de abejas adultas, la
colonia colapsa rápidamente (Higes et al., 2008; Botías et al., 2010).
Todos estos factores nos llevan a concluir que N. ceranae constituye, a día de hoy,
un problema sanitario apícola grave, pues tiene capacidad para colapsar una colonia
de abejas, infectando a las mismas de forma individual con consecuencias colectivas
(Paxton et al., 2007; Higes et al., 2008; Martín-Hernández et al., 2009).
La prevalencia media de N. apis fue de un 9.1%, con una notable diferencia entre
los años 2013 (15.2%) y 2014 (1.6%). Sin embargo, para N. ceranae esta prevalencia
de pasó de un 39.7% en 2013 a 64.2% en 2014. Esto puede deberse a que el año
2013 tuvo una temperatura media de 14.97ºC, constituyendo el año menos cálido
desde 1997, además de una precipitación media (715 mm), por encima de lo común
(AEMET), condiciones que a priori son más favorables para la multiplicación de N.
apis. Por el contrario, el año 2014 fue extremadamente cálido, con una temperatura
media de 15.96ºC, y ligeramente más húmedo de lo habitual (680 mm) (AEMET),
condiciones que pudieron resultar más apropiadas para el desarrollo de N. ceranae
pudo alcanzar unas condiciones óptimas. Sin embargo, a pesar de que la climatología
es un factor importante que podría influir en estas diferencias, no hay que
menospreciar el papel que juegan la altitud, que afecta de forma directa a la
vegetación, y las prácticas apícolas, como la trashumancia o el tipo de colmena
utilizado (Higes et al., 2013).
Como se ha mencionado, también se analizó las relaciones entre ambos
microsporidios, resultando únicamente significativa en el año 2013. Esta relación no es
novedosa, puesto que ambos microsporidios están muy relacionados y pueden
coinfectar a un mismo huésped (Runckel et al., 2011; Martín-Hernández et al., 2012;
Ravoet et al., 2013). Esta correlación positiva probablemente se deba a la mayor
prevalencia de N. apis durante el año 2013.
Un antecedente de lo sucedido con N. ceranae es el caso de V. destructor, que
también se trata de un patógeno original de la abeja asiática, A. cerana, que dio el
salto a un nuevo hospedador y pasó a expandirse mundialmente. Este ácaro es uno
de los principales sospechosos para participar en el Síndrome de Despoblamiento
20
(Rosenkranz et al., 2010; Dainat et al., 2012: Francis et al., 2013). Sin embargo, en la
abeja asiática no constituye un verdadero problema, ya que, como resultado de la
selección natural, estas abejas han podido desarrollar mecanismos que las hacen
tolerantes al ácaro (Peng et al., 1987). Sin embargo, este “trade-off” entre parásito y
hospedador no ocurre con la nueva especie hospedadora, A. mellifera, lo que ha
determinado su expansión a lo largo de todo el planeta, además de una mayor
mortalidad que en la especie hospedadora inicial (Oldroyd, 1999). En nuestro estudio,
la prevalencia media fue de un 21.5% y el porcentaje de parasitación medio fue de un
0.6%, detectándose ácaros en todas las provincias, con un notable aumento de los
casos positivos del año 2013 (11.9%) al 2014 (33.3%). A pesar de la legislación
vigente para el control de la varroasis8 (Piotrowski,1982; Boecking & Genersch, 2008)
que regula la aplicación de tratamientos para el control de dicho ácaro durante el
periodo otoñal, no siempre se aplican los tratamientos de la manera adecuada por
parte del apicultor, hecho que podría determinar los resultados obtenidos.
Este ácaro tiene una gran acción patógena, pues afecta tanto a las abejas adultas
como a la cría. La pérdida de hemolinfa durante el desarrollo ontogénico es crucial,
pudiendo disminuir la esperanza de vida o inducir cambios en el desarrollo de algunos
órganos y en el comportamiento (De Jong et al., 1982; Schneider & Drescher, 1987;
Amdam et al., 2004; Le Conte et al., 2010; Dainat et al., 2012) al igual que ocurre con
la pérdida de peso en la abeja adulta (De Jong et al., 1982; Rosenkranz et al., 2010).
Además, actúa como un eficiente vector de multitud de virus (Ball, 1983), tales como
DWV (Bowen-Walker et al., 1999; Boecking & Genersch, 2008; De Miranda &
Genersch, 2010), KBV (Chen et al., 2004; Shen et al., 2005a), SBV (Shen et al.,
2005b), ABPV (Ball, 1983), e IAPV (Di Prisco et al., 2011).
Al considerar los dos años en común, obtenemos que la presencia de V. destructor
está relacionada de forma significativa con la de DWV (p=0.009), de acuerdo a los
resultados obtenidos en estudios anteriores (Nordström et al., 1999; Tentcheva et al.,
2004; Antúnez et al., 2012; Dainat et al., 2012; Francis et al., 2013Cepero et al., 2014).
Sin embargo, al analizar cada uno de los años de forma independiente, esta
correlación se pierde.
En cuanto a los tripanosomátidos, se produjo un aumento en la detección de
positivos a lo largo del periodo de estudio, pues en 2013 se registraron un 27.2% de
los positivos, mientras que en el 2014 la cifra ascendió al 40.7%. A pesar de que se
sabe que los tripanosomátidos causan un impacto importante sobre los abejorros
8
RD608/2006
21
(Brown et al., 2000), su papel en la pérdida de colonias de abejas melíferas está aún
por determinar, pues no se han registrado diferencias entre la mortalidad de abejas
infectadas y no infectadas (Landridge & McGhee, 1967; Cox-Foster et al., 2007;
vanEngelsdorp et al., 2009; Runckel et al., 2011). Sin embargo, otros estudios más
actuales afirman que C. mellificae se trata de un nuevo patógeno que contribuye a
aumentar la mortalidad (Ravoet et al., 2013). Al igual que ocurrió con N. apis, los
tripanosomátidos encontrados en las abejas se atribuían por defecto a C. mellificae.
Sin embargo, recientes estudios han logrado diferenciar un nuevo taxón y una nueva
especie, Lotmaria passim (Cepero et al, 2014; Ravoet et al., 2015; Schwarz et al.,
2015), que predominaría a nivel global en lugar de C. mellificae (Schwarz et al., 2015),
coincidiendo así con los resultados aquí obtenidos.
Para el neogregarino A. bombi, las prevalencias registradas en los dos años
también variaron, pues mientras que en el año 2013 se registró en un 4.3% de los
casos, en el 2014 no se halló ninguna muestra positiva. Estas bajas prevalencias
corresponden con lo reportado por estudios previos (Plischuk et al., 2011) debido a su
detección reciente en abejas (Cepero et al, 2014), aunque también se han publicado
trabajos en los que las prevalencias registradas son mayores (Ravoet et al., 2013). Se
ha encontrado una correlación positiva entre la presencia de dicho agente patógeno
con DWV (p=0.037).
A pesar de que el ácaro traqueal A. woodi puede agravar de manera considerable
la mortalidad de las abejas, no está considerado como un verdadero problema en
nuestro país (Chauzat et al., 2013). Así pues, la ausencia de muestras positivas para
el A. woodi entra dentro de la normalidad para este patógeno en nuestro país (Higes et
al., 2010b), pese a que se han reportado trabajos con prevalencias superiores a las
que cabría esperar (Garrido-Bailón, 2012).
En cuanto a los virus, como ya se ha comentado, únicamente hemos obtenido
muestras positivas para dos de ellos (BQCV y DVW), mientras que en el análisis del
LSV no se halló ninguna muestra positiva. El más prevalente es BQCV, que registra
una disminución en cuanto a prevalencias relativas entre el 2013 (23.8%) y el 2014
(21.1%); al contrario que DWV, que aumenta notablemente su prevalencia de un año a
otro (11.9% en 2013, 29.3% en 2014). Así pues, los virus más prevalentes en la región
de Castilla- La Mancha durante el 2013 y el 2014 fueron BQCV y DWV, datos que
coinciden con los resultados de prevalencias obtenidos por anteriores trabajos (Chen
& Siede, 2007; Antúnez et al., 2012; Ravoet et al., 2013).
22
Además de la correlación hallada entre V. destructor y DWV, también se ha
encontrado dependencia entre N. ceranae y BQCV al considerar ambos años en
conjunto (p=0.009) y, al analizar cada año por separado, en el 2013 (p=0.032). Esta
correlación puede deberse a que el microsporidio cause una mayor susceptibilidad al
tracto digestivo de ser infectado por el virus (Chen & Siede, 2007). La asociación entre
N. ceranae y BQCV coincide con lo reportado por otros autores en trabajos previos
recientes (Dainat et al., 2012).
CONCLUSIONES
Los patógenos más prevalentes detectados en el área (Castilla-La Mancha) y el
periodo
de
estudio
(2013-2014)
son
N.
ceranae,
los
tripanosomátidos
(fundamentalmente L. passim), Black Queen Cell Virus (BQCV), V. destructor y
Deformed Wing Virus (DWV), coincidiendo con los resultados previos obtenidos en
nuestro país (Garrido-Bailón, 2012; Higes et al., 2009a; Martín-Hernández et al.,
2012).
Así pues, es sobre dichos patógenos sobre los que se deben centrar los esfuerzos
para mantener en buenas condiciones la salud de las abejas melíferas, ya que estos
agentes son los que, al menos en España y a más corto plazo, pueden causar un
aumento de la mortalidad de las mismas. Sin embargo, no se debe descuidar el control
del resto de factores que, de una forma u otra, contribuyen al fenómeno de
Despoblamiento de las Colonias, pues subestimar sus efectos podría conllevar fatales
consecuencias.
Asimismo, son necesarios futuros estudios que permitan esclarecer que efectos
causa cada factor en la salud de las abejas y los polinizadores en general, no solo con
respecto a los patógenos, sino analizando también la repercusión que el clima, la
pérdida de hábitat o los pesticidas puedan tener sobre la salud global de las abejas.
23
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero agradecer a mis directores de este Proyecto de Final de
Máster. Dr. Mariano Higes, por haberme dado la oportunidad de trabajar con él, por la
ayuda y la paciencia, la confianza y por todo lo que he aprendido de él, no sólo sobre
abejas, sino también sobre el mundo de la investigación y su manera de ver la vida del
investigador. Dra. Concepción Ornosa Gallego, por facilitarme el contacto con el
Centro Apícola, el buen trato y cercanía, también por sus consejos en la redacción del
texto, además de por sus enseñanzas durante el Máster.
A la Dr. Raquel Martín, por su tiempo y dedicación, las recomendaciones, por su
ayuda, por estar ahí para aclarar cualquier duda que me pudiera surgir y por la
confianza que ha tenido en mí.
A la Dra. Laura Barrios por el análisis estadístico y su paciencia con los jóvenes
investigadores.
A todas aquellas instituciones que me han permitido realizar este trabajo, gracias.
A todo el personal del CAR que desde el primer día me han tratado de la mejor
manera posible. Especialmente al personal del Laboratorio de Patología Apícola:
Virginia, Teresa, María Gajero, Mari Carmen, Carmen, Cristina, María Benito,
Almudena, Javi, Jesús, Sole y todos aquellos con los que he compartido el día a día.
Por vuestra infinita paciencia conmigo, vuestro compañerismo y amistad desde el
primer día, por hacerlo todo mucho más fácil y por regalarme estos meses
inolvidables, gracias de corazón.
Este trabajo ha sido posible gracias a la financiación recibida en el proyecto de
investigación INIA-RTA2013-00042-C10-06 y a la colaboración de las Asociaciones de
Apicultores involucradas en el estudio, así como al personal de la Consejería de
Agricultura de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha encargado de
coordinar la toma de muestras.
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97. vanEngelsdorp, D., Evans, J. D., Saegerman, C., Mullin, C., Haubruge, E., Nguyen,
B. K., Frazier, M., Frazier, J., Cox-Foster, D., Chen, Y., Underwood, R., Tarpy,
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32
103. http://www.coloss.org
33
FIGURAS Y TABLAS: ANEXO I
AGENTE
N.
ceranae
N.apis
C.
mellificae
PCR
A. bombi
L. passim
A. woodi
LSV
BQCV
RTqPCR
DWV
CEBADORES
SECUENCIA
CONDICIONES
218 CER-F
5'-CGGCGACGATGTGATATGAAAATATTAA-3'
218 CER-R
5'-CCCGGTCATTCTCAAACAAAAAACCG-3'
321 APIS-F
5'-GGGGGCATGTCTTTGACGTACTATGTA-3'
321 APIS-R
5'-GGGGGGCGTTTAAAATGTGAAACAACTATG-3'
CRI-SEF
5’- CTTTTGGTCGGTGGAGTGAT- 3’
CRI-SER
5’- GGACGTAATCGGCACAGTTT- 3’
API-NEOF
5’- CCAGCATGGAATAACATGTAAGG- 3’
API-NEOR
5’- GACAGCTTCCAATCTCTAGTCG- 3’
ITS-IR1
5’-GCTGTAGGTGAACCTGCAGCAGCTGGATCATT-3’
ITS-5.8R
5’-GGAAGCCAAGTCATCCATC-3’
AW180-FOR
5’-GGAATATGATCTGGTTTAGTTGGTC-3’
AW180-REV
5’- GAATCAATTTCCAAACCCACCAATC-3’
LSVdeg-F
5’-GCCWCGRYTGTTGGTYCCCCC-3’
LSVdeg-R
5’-GAGGTGGCGGCGCSAGATAAAGT-3’
10 min a 95ºC; 35 ciclos de 30s a 95ºC, 30s
a 61.8ºC y 45s a 72ºC; y una extensión
final de 7 min a 72ºC
10 min a 95ºC; 35 ciclos de 30s a 95ºC, 30s
a 61.8ºC y 45s a 72ºC; y una extensión final
de 7 min a 72ºC
10 min a 94ºC; 35 ciclos de 30s a 94ºC, 30s
a 57ºC y 1 min a 72ºC; y una extensión final
de 7 min a 72ºC
10 min a 94ºC; 35 ciclos de 30s a 94ºC, 30s
a 57ºC y 1 min a 72ºC; y una extensión final
de 7 min a 72ºC
10 min a 95ºC; 35 ciclos de 30s a 95ºC, 30s
a 55ºc y 45s a 72ºC; y una extensión final
de 7 min a 72ºC
10 min a 95ºC; 35 ciclos de 30s a 95ºC, 30s
a 59ºC y 45s a 72ºC; y una extensión final
de 7 min a 72ºC
10 min a 95ºC; 35 ciclos de 30s a 95ºC, 30s
a 60ºC y 45s a 72ºC; y una extensión final
de 7 min a 72ºC
BQCV 9195F
5’-GGTGCGGGAGATGATATGGA-3’
BQCV 265r
5’-GCCGTCTGAGATGCATGAATAC-3’
BQCV 8217T*
5’-FAM-TTTCCATCTTTATCGGTACGCCGCC-TAMRA-3’
DWV 9587F
5’-CCTGGACAAGGTCTCGGTAGAA-3’
DWV 9711R
5’-ATTCAGGACCCCACCCAAAT-3’
DWV 9627T*
5’-FAM-CATGCTCGAGGATTGGGTCGTCGT-TAMRA-3’
*5’ (FAM, 6-carboxy-Fluiresceína); 3’ (TAMRA, tetra-metilcarboxyrhodamina).
AMPLICON
218-219 pb
321 pb
417 pb
260 pb
550 pb
180 pb
600 pb
10 min a 95ºC; 45 ciclos de 10s a 95ºC y
40s a 60ºC
305 pb
10 min a 95ºC; 45 ciclos de 10s a 95ºC y
40s a 60ºC
250 pb
Tabla 5. Resumen de las condiciones de PCRs realizadas para cada patógeno
34
FIGURAS Y TABLAS: ANEXO II
PROVINCIA
MUESTRAS
V.
destructor
A. woodi
A. bombi
Tripanosomátidos
N.
ceranae
N. apis
DVW
BQCV
LSV
GUADALAJARA
25
12,0
0,0
0,0
12,0
64,0
28,0
16,0
28,0
0,0
CUENCA
50
10,0
0,0
14,0
16,0
36,0
18,0
18,0
46,0
0,0
TOLEDO
73
16,4
0,0
0,0
28,8
61,6
1,4
20,5
27,4
0,0
ALBACETE
104
26,9
0,0
0,0
47,1
41,3
7,7
20,2
9,6
0,0
CIUDAD REAL
22
50,0
0,0
0,0
45,5
77,3
0,0
22,7
9,1
0,0
TOTALES
274
21,5
0,0
2,6
33,2
50,7
9,1
19,7
22,6
0,0
Tabla 6. Resumen de las prevalencias medias totales y desglosadas por provincias para cada uno de los patógenos.
35