Lymphoflot

[ES]
187606/04 – 04/2008
Lymphoflot
Gradiente de densidad para el aislamiento de linfocitos
Tamaño de kit
[REF] 824 012
250 ml
[IVD] Reactivo para el diagnóstico in vitro
Descripción del producto
Lymphoflot es un gradiente de densidad filtrado asépticamente, listo para su uso, para el aislamiento de linfocitos en
la prueba de microlinfocitotoxicidad (determinación de antígenos HLA). El gradiente de densidad contiene las siguientes concentraciones de diatrizoato sódico y Ficoll:
Diatrizoato sódico
Ficoll
11,00 % (p/v)
6,35 % (p/v)
Características físico-químicas:
Densidad
pH
1,077 – 1,080 g/ml
7,1 – 7,4
Introducción
La técnica más utilizada para aislar linfocitos consiste en
mezclar sangre con un componente macropolímero que
agrega eritrocitos incrementando la tasa de sedimentación.
Esto no afecta prácticamente a la sedimentación de linfocitos. Los cuales se pueden pipetear una vez sedimentados
los eritrocitos.
Bfyum (1964) aplicó estos conocimientos utilizando un
sistema en el que el agente de agregación no se mezcla
con la sangre. Para ello, se mezcla un componente macropolímero con un componente de alta densidad. La sangre
se añade cuidadosamente encima de esta mezcla, agregándose los eritrocitos en la superficie interfacial y se
sedimentan en el fondo del tubo. La mayoría de los linfocitos permanece en la capa de plasma.
Bøyum (1968) desarrolló una técnica de un solo paso para
el aislamiento de linfocitos, utilizando una mezcla de
metrizoato sódico y Ficoll y una centrífuga. Thorsby y Brallie
(1970) utilizaron esta técnica con sólo pequeñas modificaciones para preparar suspensiones puras de linfocitos
para la prueba de microlinfotoxicidad y el cultivo de
linfocitos. Según confirmaron también otros autores (Harris
y Ukayiofo (1969), Ting y Morris (1971)), se trata de un
método fiable, sencillo y rápido para obtener linfocitos a
partir de la sangre fresca. El método se mostró superior a
otras técnicas para la obtención de linfocitos. Además, es
apropiado para obtener linfocitos a partir de sangre
anticoagulada, conservada hasta 24 horas a temperatura
ambiente.
Estabilidad y conservación
En el envase sin abrir, Lymphoflot se puede almacenar a
2...8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
Mantener Lymphoflot fuera de la lus solar. Una vez abierto
el frasco, Lymphoflot se debería guardar en el frigorífico a
2...8 °C, utilizándolo en un plazo de 4 semanas. Antes de
utilizarlo, Lymphoflot se volverá a calentar a temperatura
ambiente (20... 24 °C).
Principio del aislamiento de linfocitos
Lymphoflot tiene una densidad más alta que los trombocitos, linfocitos o monocitos, pero más baja que los eritrocitos y granulocitos. En el gradiente de densidad (Lymphoflot), se recubre con sangre diluida. Durante la centrifugación siguiente, los eritrocitos y granulocitos pasan por el
gradiente de densidad debido a su mayor densidad,
mientras que los linfocitos, trombocitos y monocitos, por su
menor densidad, se sedimentan por encima del gradiente
de densidad. Los trombocitos se eliminan mediante dos
procesos de lavado consecutivos.
Aislamiento de los linfocitos
1.
Se mezcla la muestra de sangre anticoagulada
(heparina, ACD) con el mismo volumen de solución
de Hanks (Biotest [REF] 824 035).
2.
Se introduce Lymphoflot (20... 24 °C) en un tubo de
centrifugación y se recubre con el mismo volumen de
la muestra de sangre diluida de forma que la sangre y
el Lymphoflot no se mezclen.
3.
Se centrifuga durante 20 minutos a 1000 x g sin freno.
Los linfocitos se sedimentan en forma de anillo blanco
en el límite entre el plasma y Lymphoflot. El anillo
celular se pipetea cuidadosamente en un nuevo tubo
de centrifugación, se completa con solución de Hanks
y se mezcla.
4.
Se centrifuga durante 10 minutos a 230 x g, se
decanta el sobrenadante, se vuelve a suspender el
sedimento de linfocitos, se completa con solución de
Hanks y se mezcla.
5.
Se vuelve a centrifugar durante 10 minutos a 110 x g y
se decanta el sobrenadante.
6.
Se re-suspende el sedimento de linfocitos en Lymphostabil (Biotest [REF] 824 020). Para la prueba de
microlinfotoxicidad, la suspensión de linfocitos debería
contener 2000 a 3000 linfocitos/μl.
Pureza y viabilidad
El método descrito ha resultado ser rápido, sencillo y fiable.
La técnica se puede emplear también para obtener suspensiones de linfocitos para su aplicación en el cultivo mixto de
linfocitos.
La contaminación de la suspensión de linfocitos con
eritrocitos suele estar por debajo del 5% del recuento de
eritrocitos total. En el caso de una terapia inmunosupresora
intensiva, además de linfocitos se pueden encontrar
algunos granulocitos inmaduros.
Cuando se utiliza sangre anticoagulada, es preciso eliminar
los trombocitos ya que sus antígenos HLA-ABC compiten
con los de los linfocitos por los anticuerpos en la prueba de
microlinfocitotoxicidad.
Referencias
1. Bøyum, A.: Separation of leucocytes from blood and
bone marrow. Scand.J.clin.Lab.Invest.
21: Suppl.97, 1968
2. Thorsby, E., Bratlie, A.: A rapid method for preparation
of pure lymphocyte suspension. Histocompatibility
Testing 1970: 655-666, Munksgaard , Copenhagen
3. Harris, R., Ukaejiofo, E.O.: Tissue typing using a routine
one-step lymphocyte separation procedure.
Brit.J.Haemat. 18: 229-235, 1970
4. Ting, A., Morris, P. J.: A technique for lymphocyte
preparation from stored heparinized blood. Vox Sang.
(Basel) 20: 561-563, 1971
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