Aplicaciones de la espectroscopía infrarroja y Raman.

Aplicaciones de la espectroscopía infrarroja y Raman.

APLICACIONES BIOLÓGICAS DE LA
ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL
P. Carmona
Instituto de Estructura de la Materia (CSIC)
GRUPO DE BIOESPECTROSCOPIA
Aplicaciones Biológicas de la Espectroscopía Vibracional
Estudios
estructurales
Aplicaciones
bioanalíticas
Proteínas y RNA virales.
Componentes de alimentos
reestructurados
(proteínas, agua, lípidos).
P. Carmona (IEM)
M. Molina (UCM)
C. Pargada (UCM)
J. Bartolomé (FEHV)
P. Carmona (IEM)
M. Careche (IF)
A. Herrero (IF)
F. Jiménez (IF)
Biodiagnóstico
P. Carmona (IEM)
A. Toledano (IC)
I. Alvarez (IC)
Interacción radiación electromagnética-vibraciones moleculares
ESPECTROSCOPIA INFRARROJA Y RAMAN
Grupos funcionales
Estructura espacial
Análisis Químico
Interacción radiación electromagnética-vibraciones moleculares
ESPECTROSCOPIA INFRARROJA Y RAMAN
Grupos funcionales
Estructura espacial
Análisis Químico
TIPOS DE ESTRUCTURAS A ESTUDIAR POR IR-RAMAN
Secundaria
Terciaria Cuaternaria
Intercambio isotópico H/D
Identificación
Frecuencias
características.
Correlaciones
espectro-estructura.
Cuantificación
Ajuste de perfiles.
Dominios temporales de
intercambio H/D
Regresión PLS.
Espectroscopía de correlación 2D
2850 cm-1
2920 cm-1
725 cm-1
1450 cm-1
~1300 cm-1
1350-1180 cm-1
1650-1658 cm-1
1615-1640 cm-1
820-800 cm-1
850-825 cm-1
A-DNA
B-DNA
IR spectra of biological components highlighting the most prominent absorption features. Spectra for a protein
(myoglobin), lipid (dimyristoylphosphatidylcholine, DMPC), nucleic acid (poly-A), and carbohydrate (sucrose) are
shown.
1650-1658 cm-1
1615-1640 cm-1
ESTRUCTURA SECUNDARIA DE PROTEINAS
Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales
Y = a + b1X1 + b2X2 +...+ bpXp
Yi, Xi = espectros de proteínas
5’-G C C A G C C C C C U
3’-C A CA G C G G G G G U
G
A
1600
1400
1200
1000
Wavenumber/cm
-1
800
600
629
724
668
921
867
1043
983
1317
1575
1482
1098
1250
1416
1368
1530
1599
1705
812
783
Raman Intensity/Arbitr. Units
1700
1650
1600
Wavenumber/cm
-1
1676
1635
1663
1699
1621
Raman Intensity/Arbitr. Units
Syringe pump
Membrane
∅ 10
6
5
Cell front plate
Quartz cell
syringe pump
microdialysis fibre
laser
CINETICAS DE INTERCAMBIO H/D MEDIBLES POR
ESPECTROSCOPIA IR-RAMAN
(k ≤ 2.5 min-1)
Proteínas
´
Acidos Nucleicos
lámina-β
doble hélice A, B (pares GC)
α-hélice
estructura Z (pares GC, AT, AU)
est. cuat. (lámina-β, α-hélice, desordenada)
est. cuat. (pares GC, AT, AU)
(a)
Synchronous and (b)
asynchronous 2D correlation
spectra
constructed
from
dynamic spectra.
VENTAJAS DE LA ESPECTROSCOPIA OPTICA DE
CORRELACION 2D
• Resolución de bandas solapadas.
• Asignación de modos vibracionales mediante correlación de
bandas.
• Secuenciación temporal de cambios espectrales.
• Detectar interacciones moleculares a través de grupos que
generan bandas correlacionadas.
A
1480
cm -1
1570
1660
1750
1750
1660
1570
1480
Espectros síncronos de la proteína P22
Hepatitis C virus
25
15
10
5
950 900 850 800 750 700
-1
Wavenumber/cm
Time/min
20
Microscopio Raman Renishaw
Factor 2: 26.56 %
30
25
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
-35
-40
SINF
NC
-15
-10
-5
0
5
10
15
Factor 1: 54.66 %
A Factor 1 versus Factor 2 plot (score plot) of principal component
analysis from 16 healthy control and 29 scrapie-infected samples (NC
and SINF groups, respectively). (Carmona et al., J. Gen. Virol., 2005).
S tructure of protein
Typical protein (lysozyme)
β Sheet
Other
α Helix
β Turn
Amino acid
The steric structure of the protein is
formed by interaction of amino acids.
Therefore, the steric structure depends
on the sequence of amino acids.
The structure of the protein is
classified into 4 structures as follows:
1. Primary
2. Secondary
3. Tertiary
4. Quaternary
5
Abs
0
200
Quantitative analysis using UV/Vis
spectrometer
Benzene ring
(280 nm)
Almost all proteins have a peak at 280 n, therefore,
quantitative analysis of protein can be performed
with a UV/Vis spectrometer. An alternative
quantitative analysis method is colorimetry using
reagent (such as the Lowry method , Biuret method,
etc.)
250
300
350
400
Wavelength[nm]
Concentration [%, M etc.]
Quantitative analysis
Abs
Abs
Calibration curve
Concentration [%, M etc.]
First of all, spectra of
each protein
concentration are
measured to produce
a calibration curve.
Next, unknown
samples are measured
and quantitative
analysis is performed
using the calibration
curve.
IR spectrum of typical protein
Amid I peak contains the
secondary structure
information (α-Helix, βSheet etc.)
Using this peak, the IR-SSE
program calculates SSE by
PCR ( Principal
Component Regression) or
PLS (Partial Least Square)
method.
1654
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,4
-0,6
-1,0
1632
-0,8
1686
Principal Component 1, Loadings
0,8
-1,2
1700
1680
1660
1640
1620
cm -1
Loadings plot of Factor 1 (Principal Component 1) for the
score plot in the previous Figure.
1600
35
β-Sheet Structure (%)
30
25
20
15
10
5
0
Controls
Infected
Bar diagram for the means of ß-sheet percentages measured for
healthy control and scrapie-affected samples from genetically selected
animals. (Carmona et al., Chemistry and Biology, 2004).
VIBRACIONES MOLECULARES
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Espectroscopia Infrarroja
Espectroscopia Raman
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Absorción de radiación infrarroja
Difusión inelástica de radiación
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
APLICACIONES
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
• Estructura de la materia a nivel molecular (moléculas orgánicas, inorgánicas y
cristales)
• Análisis químico (determinación de compuestos inorgánicos, orgánicos y
biológicos) en estado sólido, líquido o gaseoso.
Teoría de grupos
ESTRUCTURA
Cálclulos de frecuencias de vibración