Influencia del pH y la temperatura sobre la estabilidad del péptido

Influencia del pH y la temperatura sobre la estabilidad del péptido

Tecnología Farmacéutica 233
INFLUENCIA DEL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA ESTABILIDAD DEL
PÉPTIDO SINTÉTICO ANTIMALÁRICO SPf66
Mª Jesús Dorta, Ana Santoveña, Alexis Oliva, Matía Llabrés, José B. Fariña
Departamento de Ingeniería Química y Tecnología Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad de La
Laguna, 38200, La Laguna, Tenerife, Sapin.
Introducción
El objetivo primordial que persigue el diseño y
desarrollo de nuevas formas de dosificación para
la administración de vacunas, es la elaboración y
optimización de formulaciones que liberen los
antígenos de acuerdo con una pauta
previamente establecida y que consigan la
inmunización tras la administración de una sola
dosis (1). La alternativa más adecuada para la
consecución de este fin la constituyen las formas
de liberación controlada tales como: liposomas,
vesículas unilamelares, emulsiones y sistemas
poliméricos como microesferas e implantes. Sin
embargo, hay que tener en cuenta que los
medicamentos proteícos y peptídicos se
caracterizan por poseer una estructura compleja
y una elevada inestabilidad tanto física como
química. Por lo tanto, el principal problema que
plantea el desarrollo de estos sistemas es
mantener intacta la estructura de la molécula y,
por tanto, su capacidad inmunogénica durante su
elaboración,
almacenamiento,
transporte,
administración y liberación del antígeno en el
lugar de acción (2-4).
El objetivo del presente trabajo fue el estudio de
la estabilidad del péptido sintético antimalárico
SPf66 en las condiciones usuales de pH (2-7,4) y
temperatura (5-70 ºC) utilizadas en los ensayos
de cesión del mismo y en aquellas que pueden
darse durante su almacenamiento y transporte.
Materiales y Métodos
El pétido sintético SPf66 (lote 15-7) fue
suministrado por el Instituto de Inmunología San
Juan de Dios, Bogotá, Colombia. La secuencia
de
aminoácidos
del
péptido
es
GDELEAETQNVYAAPNYAAPNANPYSLFQKEK
MVLPNANPPANKKNAG con dos residuos de
cisteína en los extremos amino y carboxi
terminales, que permiten la polimerización del
mismo por oxidación, obteniéndose finalmente
una molécula compuesta de péptidos
individuales unidos entre sí mediante puentes
disulfuro.
Cromatografía de exclusión de tamaños (SEC)
Se empleó un cromatógrafo Waters, compuesto
por una bomba (modelo 600E, System
Controller) y un sistema de adquisición de datos
Máxima 820. La fase móvil consistió de una
mezcla acetonitrilo/agua (30/70) y trifluoracético
al 0.05%, a un flujo de 1.0 ml/min. las
determinaciones se realizaron a una longitud de
onda de 214 nm.
Estudios de estabilidad
- Influencia del pH: los ensayos se llevaron a
cabo a 37 ºC en un baño termostatizado en el
que se introdujeron diferentes disoluciones del
péptido SPf66 a una concentración de 400 µg/ml
en distintos tampones isotonizados a pH 2, 4 y
7.4. Los ensayos se realizaron por triplicado. A
intervalos de tiempo dependientes de la
degradación observada se tomaron muestras
que se diluyeron en fase móvil dentro del
intervalo de concentraciones.
- Influencia de la temperatura: se estudió la
estabilidad en disolución del péptido sintético
SPf66 en fase móvil (pH 2) y una concentación
de 40 µg/ml a 5, 25, 37 y 70 ºC. Para ello se
tomaron alícuotas de las muestras a diferentes
234 VI Congreso SEFIG y 3 as Jornadas TF
Resultados y Discusión
Los péptidos y proteínas terapéuticos se
diferencian de los convencionales en varios
aspectos, pero entre los más relevantes se
encuentra la complejidad de su estructura
organizada en diferentes niveles y su estabilidad
limitada. Por esta razón, no es posible detectar,
mediante el empleo de un único método
analítico, todos los posibles cambios físicos y/o
químicos que pueden sufrir y que comprometen
su actividad biológica y, por tanto terapéutica.
El péptido SPf66 fue previamente caracterizado
en nuestro laboratorio mediante el empleo de
técnicas tanto relativas (SEC) como absolutas
(dispersión de luz láser multiángulo y
espectrometría de masas MALDI-TOF). Los
resultados muestran que este péptido está
formado por subunidades individuales, en
concreto monómero, dímero y mezcla de trímerotetrámero, unidas mediante puentes disulfuro (5).
Los estudios de estabilidad del péptido SPf66
llevados a cabo a 37 ºC y diferentes pHs (2, 4 y
7.4) revelaron que la degradación pasa por la
transformación de las especies de mayor peso
molecular (mezcla trímero-tetrámero) en las de
menor peso molecular ( dímero y monómero) y
en otras no detectadas anteriormente. Los
resultados obtenidos se ajustaron al siguiente
modelo cinético de degradación utilizando para
ello el programa Mathematica 4.0 (Wolfram
Reseach):
k
X ←
X
41
1
4
42
k
→X2
↓
k40
dónde X1, X2 y X4 son las áreas de los picos
cromatográficos
correspondientes
a
el
monómero, dímero y mezcla de trímerotetrámero respectivamente, y K41, K42 y K40 las
constantes de velocidad de degradación de cada
proceso.
Las ecuaciones para cada uno de los picos
detectados son:
X
=
4
X
40
e
X2=
X 20 +
X
X1=
X 10 +
X
−
(k
40
+
k 41 + k
(1 − e (k
−
40
k
+
)t
k 41+ k 42 ) t
+ k 41 + k 42
40
(1 − e (k
−
40
40
42
40
+
ec.1
)k
42
ec.2
)k
41
ec.3
k 41+ k 42) t
k 40 + k 41 + k 42
Como puede observarse en la tabla 1 los
valores de las constantes de velocidad de
degradación obtenidas aumentan con el pH,
es decir, el péptido es más estable a pH ácido
que a pH neutro.
Tabla 1. Constantes de velocidad de
degradación (límites de confianza).
pH 2
0
pH 4
0
0.004
(0.003-0.005)
0
0.010
(0.008-0.013)
0
K40
(h-1)
K41
(h-1)
K42
pH 7.4
0.02
(0.005-0.036)
0.011
(0.002-0.019)
0
(h-1)
Como puede observarse en la figura 1 la
representación gráffica de los valores del logK41
vs pH mostró una línea recta (r: 0.96). Esto
sugiere que la catálisis básica podría ser el
mecanismo implicado en la degradación de las
especies de mayor peso molecular.
0
Log k 41
intervalos de tiempo dependientes de la
magnitud de la degradación observada y, se
analizaron directamente. Los ensayos se
realizaron por duplicado.
-1
-2
-3
0
2
4
6
8
10
pH
Figura 1. Log K41 vs pH (puntos: valores
experimentales; Línea continua: valores predichos).
Con respecto a los estudios de estabilidad
realizados a pH 2 y diferentes temperaturas (5,
25, 37 y 70 ºC), los resultados obtenidos no se
ajustaron a ninguna cinética de degradación
conocida, sin embargo permitieron concluir que
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la velocidad de degradación aumenta con la
misma.
Los resultados obtenidos en este trabajo nos
permiten extraer las siguientes conclusiones: a)el
péptido resulta inestable en las condiciones
usuales de temperatura y pH (37 ºC y pH: 2-7.4)
que se utilizan en los ensayos de cesión, b) la
degradación pasa por la transformación de las
especies de mayor peso molecular en las de
menor peso molecular, al parecer mediada por
una catálisis básica, y c) el péptido resulta
termolábil en el intervalo de temperaturas
estudiado (5-70 ºC).
Bibliografía
1. Cleland, J.L., Single-adminstration vaccines:
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5. Santoveña, A., Oiva, A., Guzmán, F., Patarroyo,
M., Llabrés, M., Fariña, J.B., Chromatographic of
antimalarial SPf66 peptide uusing MALDI-TOF
MS, CD and SEC, J. Chrom. B, 766, 3 (2002).
Agradecimientos
Los autores agradecen a el Dr. M. E. Patarroyo y
a la Dra. Fanny Guzmán el habernos proporcionado el
péptido sintético SPf66. Esta investigación ha sido
financiada como parte del proyecto PI-082/2000.