Resolución cristalográfica de la enzima superóxido dismutasa de

Resolución cristalográfica de la enzima superóxido dismutasa de

Encuentro Científico Internacional
Cristalización de Eritrocruorina de
Eisenia foetida
Debir Dávila Carrasco
Juan Faya Castillo
Diego Leonardo Cabrejos
Fernando Bachega
Richard Garratt
¿Qué son las Eritrocruorina?
• En muchos anélidos, el transporte de oxígeno está a cargo de
proteínas extracelulares gigantes (~3,0 MDa - ~3,6 MDa),
conocidas como eritrocruorinas, las cuales están formadas
por 180 subunidades(Royer et al., 2006).
• La HbEf tiene 180 cadenas polipeptídicas, de las cuales 144
subunidades formarían cuatro globinas diferentes, la unión
entre éstas globinas va a constituir un cap y 36 subunidades
formarían tres tipos diferentes de linkers, originando un
heterotrímero.
• HbEf es una proteína de gran tamaño, de naturaleza
extracelular, resistente a la oxidación, y muestra una alta
cooperatividad de unión por el oxígeno.
• En las últimas décadas las eritrocruorinas despertaron mucho
interés científico por su potencial uso como sangre artificial.
Objetivo
• El presente trabajo se realizó con el fin de
obtener cristales de HbEf para obtener
patrones de difracción que permitan construir
su estructura 3D, tal que podamos
comprender la función de esta proteína en la
lombriz.
Métodos
• Los especímenes de Eisenia foetida fueron
colectados en el campo, transportados al
laboratorio y lavados con agua potable.
• La hemolinfa fue colectada en un beacker de
100 mL conteniendo 5 mL de buffer TRIS-HCl
100 mM pH 7,0 (Buffer A).
• El filtrado fue concentrado hasta 1mL con un
concentrador Amicon-Millipor - 30 KDa.
• La HbEf, contenida en el filtrado, se purificó
por cromatografía de exclusión molecular
usando una columna Superdex 200 10/300 GL.
• Las fracciones eluídas con color rojo que
contenían HbEf fueron cuantificadas a 280nm
en un espectofotrometro UNICO®.
• Las fracciones con gran cantidad de HbEf
fueron nuevamente concentradas hasta 1mL y
mantenidas en refrigeración a 4°C.
• Alicuotas de 30μL de estas fracciones fueron
sometidas a electroforesis desnaturante, en
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 15%, para
confirmar su purificación.
• La cristalización se realizó con la técnica de difusión de vapor
en gota pendiente, usando placas de cristalización
CrystalQuick de 24 pozos y las soluciones de cristalización Grid
Screens. 2,0 μL de solución de proteína + 2,0 μL de solución
precipitante se colocaron en un cubreobjetos mientras que
300 μL de solución precipitante en los pozos de la placa.
Resultados
• Purificamos eritrocruorina de Eisenia foetida
mediante cromatografía de exclusión molecular.
• Cristalización por vapor-difusión en gota pendiente.
El recuadro muestra cristales de HbEf obtenidos en
las condiciones: pH 7,0 y en presencia de sulfato de
amonio en una concentración de 2,4 M.
Gel de electroforesis SDS-PAGE mostrando HbEf (linkers y globinas) purificada. M:
Marcador de peso molecular; 1-7: Fracciones en que la proteína fue eluída. El análisis
muestra que purificamos sólo caps (unión de globinas) a partir de la fracción 5 (Aprox. 12
mL de elución).
Conclusiones
• Purificamos eritrocruorina de Eisenia foetida mediante
cromatografía de exclusión molecular. En las 4 primeras
fracciones (ver figura 01) obtenemos el complejo de
eritrocruorina (caps + linkers) mientas que en las
fracciones 5 a 7 sólo al conjunto de globinas
denominado caps.
• HbEf se cristalizó en las condiciones: pH 7,0 y en
presencia de sulfato de amonio en una concentración
de 2.4 M, el tiempo de crecimiento de los cristales fue
de aproximadamente 24 horas.
Agradecimientos
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Prof. Dr Pedro Chimoy.
Prof. Msc. Consuelo Rojas.
Personal del ISFC-USP
Prof. Dr Luis Rodriguez.
Lic. Jorge Cachay.
Br. Edwin Vázquez.
Amigos integrantes del poderoso CEGENP