Estado actual del análisis de lípidos
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Estado actual del análisis de lípidos
MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Estado actual del análisis de lípidos M.C. Dobarganes Departamento de Caracterización y Calidad de los Alimentos Instituto de la Grasa MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Resumen INSTITUTO DE LA GRASA Clasificación de lípidos Etapas en el análisis de lípidos Uso combinado de las técnicas de separación Posibilidades y tendencias en el análisis de lípidos MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Que son los lípidos? INSTITUTO DE LA GRASA - Difíciles de definir y clasificar - Conjunto muy heterogéneo de moléculas cuya característica distintiva aunque no general es la insolubilidad en agua siendo, por el contrario, solubles en disolventes orgánicos. MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Clasificación de lípidos Saponificables Simples Ácidos grasos Ceras Glicéridos: mono, di y triacilgliceroles Complejos Glicéridos Fosfoglicéridos Glicosilglicéridos Cardiolipinas No saponificables Hidrocarburos Esteroles Tocoferoles y tocotrienoles Carotenoides Alcoholes grasos Esfingolípidos Ceramidas Esfingomielinas Glucolípidos Esfingosina Glicerol MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Principales ácidos en los lípidos de la dieta INSTITUTO DE LA GRASA CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH ÁCIDO PALMÍTICO CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH ÁCIDO ESTEÁRICO CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH=CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH ÁCIDO OLEICO:MONOINSATURADO N-9 CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH = CH CH2 CH= CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH ÁCIDO LINOLEICO: DIINSATURADO N-6 CH3 CH2 CH = CH CH2 CH= CH CH2 CH = CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH ÁCIDO LINOLÉNICO: TRIINSATURADO N-3 MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Principales ácidos grasos poliinsaturados INSTITUTO DE LA GRASA CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH = CH CH2 CH= CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH ÁCIDO LINOLEICO: DIINSATURADO w-6 CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH = CH CH2 CH= CH CH2 CH =CH CH2 CH =CH CH2 CH2 CH2 COOH ÁCIDO ARAQUIDÓNICO: POLIINSATURADO w-6 CH3 CH2 CH = CH CH2 CH= CH CH2 CH = CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH ÁCIDO LINOLÉNICO: TRIINSATURADO w-3 CH3 CH2 CH = CH CH2 CH= CH CH2 CH = CH CH2 CH = CH CH2 CH = CH CH2 CH2 CH2 COOH ÁCIDO EICOSAPENTAENOICO: POLIINSATURADO w-3 CH3 CH2 CH = CH CH2 CH= CH CH2 CH = CH CH2 CH = CH CH2 CH = CH CH2 CH = CH CH2 CH2 COOH ÁCIDO DOCOSAHEXAENOICO: POLIINSATURADO w -3 MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Ceras INSTITUTO DE LA GRASA Ésteres de ácidos grasos y alcoholes grasos (normalmente C16 a C30) http://lipidlibrary.aocs.org/ MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Glicéridos Simples INSTITUTO DE LA GRASA http://lipidlibrary.aocs.org/ MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Glicéridos complejos: Fosfoglicéridos (grupos amino) INSTITUTO DE LA GRASA Colina Serina Etanolamina http://lipidlibrary.aocs.org/ MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Glicéridos complejos: Fosfoglicéridos (Carbohidrato) INSTITUTO DE LA GRASA http://lipidlibrary.aocs.org/ MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Glicéridos complejos: Glucoglicéridos INSTITUTO DE LA GRASA http://lipidlibrary.aocs.org/ MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Glicéridos complejos: Cardiolipinas http://lipidlibrary.aocs.org/ MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Esfingolípidos : esfingomielinas http://lipidlibrary.aocs.org/ MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Glucoesfingolípidos INSTITUTO DE LA GRASA Esfingolípidos compuestos por una ceramida (esfingosina + ácido graso) y un glúcido de cadena corta http://lipidlibrary.aocs.org/ MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Otros lípidos saponificables de interés: Eicosanoides INSTITUTO DE LA GRASA Ácido araquidónico Cicloxigenasa Lipoxigenasa Prostaglandina Leucotrieno Tromboxano MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Lípidos no saponificables La mayor parte son moléculas isoprenoides Hidrocarburos Esteroles Escualeno, licopeno, caroteno Colesterol, fitoesterles Tocoferoles y tocotrienoles Carotenoides Vitaminas A y Q INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Lípidos no saponificables: Esteroles INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Otros lípidos de interés: Hormonas y vitaminas esteroideas INSTITUTO DE LA GRASA Vitamina D3 Vitamina D2 Colesterol Testoesterona Estradiol Progesterona MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Tocoferoles y tocotrienoles http://lipidlibrary.aocs.org/ MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Carotenoides INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Vitaminas A y K http://lipidlibrary.aocs.org/ INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Problemas en el análisis de lípidos Grupos de compuestos con estructura muy variada La presencia de ácidos grasos y de derivados isoprenoides, en muchos casos con alto grado de insaturación, indica inestabilidad de la mayor parte de las moléculas lipídicas El primer aspecto de importancia es la necesidad de preservar la muestra antes de la extracción y/o el análisis MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Características ideales de los análisis INSTITUTO DE LA GRASA Mínimo número de etapas (tiempo y errores) Mínima cantidad de muestra (disolventes y tiempo) Mínimo tiempo de análisis Automatización de técnicas (costes laborales) MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Cual es el objetivo del análisis de lípidos? INSTITUTO DE LA GRASA Objetivo del análisis de lípidos Contenido (extracción) Caracterización o identificación de sustrato (componentes mayoritarios y minoritarios) Control de procesos (técnicas rápidas) Evaluación de calidad (hidrólisis, oxidación, contaminantes) Control de compuestos específicos (aditivos, contaminantes, etc) MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Polaridad de lípidos y disolventes Lípidos Disolventes Hidrocarburos Ésteres de ácidos grasos Triacilgliceroles Ácidos grasos Alcoholes grasos Esteroles Diglicéridos Monoglicéridos Eicosanoides Fosfolípidos Esfingolípidos Hexano Ciclohexano Benceno Éter dietílico Cloroformo Dioxano Acetona Acetonitrilo Piridina Butanol, propanol, etanol, metanol Agua MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA La extracción depende del objetivo Extracción de aceites de semillas (hexano) Extracción de lípidos de alimentos y biológicos Extracción completa de ésteres Extracción mínima de lípidos polares Cloroformo-metanol Extracción de lípidos polares Extracción con hidrólisis ácida previa Obtención de lípidos ligados a moléculas no lipídicas Disminución del número de especies moleculares Extracción con hexano o éter etílico MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Aspectos importantes de la extracción de lípidos Diferenciar entre muestra para determinar el contenido total de lípidos o para conocer algún aspecto de su composición Contenido total: El objetivo fundamental es la cantidad de lípidos Composición: El objetivo fundamental es la preservación de los componentes a analizar INSTITUTO DE LA GRASA Eliminación de agua a baja temperatura: liofilización Protección con antioxidantes y/o nitrógeno en muestras de baja estabilidad La elección del disolvente influye en el contenido graso Baja polaridad: Elevada selectividad para lípidos aunque baja solubilidad para lípidos `muy polares Elevada polaridad: menor selectividad y posibilidad de solubilizar compuestos no lipídicos MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Extracción de la muestra de lípidos Método ISO-774-1 Extracción en Soxhlet con hexano o éter etílico Método ISO-1443: digestión de la muestra con HCl 3N previa a la extracción de la grasa en Soxhlet Método de Folch et al. (1957): solución de cloroformo:metanol 2:1 Método de Bligh and Dyer (1959): solución de cloroformo:metanol 2:1 Método de Hara et al. (1978): solución de hexano :2-propanol 3:2 http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Sistemas de extracción de la muestra de lípidos INSTITUTO DE LA GRASA Extracción discontinua con mezcla de disolventes Extracción semicontinua (soxhlet) Extracción continua (Soxtec) http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm Mejoras en las técnicas de extracción MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Posibilidad de automatización Técnicas limpias y selectivas Mayor rapidez y eficacia Idealmente, baratas, sencillas y sin utilización de disolventes tóxicos INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Extracción Acelerada con Disolventes (ASE) 130-140 atm; 30-200 ºC Extracción Asistida por Microondas (MAE) Extracción de lípidos: Nuevas técnicas INSTITUTO DE LA GRASA (300 W; 1-15 min) Extracción con Fluidos Supercríticos (SFE) (31 ºC; 73 atm) ASE MAE SFE MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Separación de componentes de la muestra de lípidos Primacía de las técnicas cromatográficas de separación en todas las etapas posteriores a la extracción: INSTITUTO DE LA GRASA Purificación de la muestra extraída Concentración, en su caso, de los compuestos de interés Separación de los compuestos de interés Distinción entre separación por grupos y por componentes individuales Técnicas de baja resolución Técnicas de elevada resolución MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Base de la separación Métodos de separación cromatográficos Fase estacionaria Fase móvil INSTITUTO DE LA GRASA Interacción entre fases Adsorción Sólido Líquido/gas Fuerzas de Van der Waals Reparto Líquido Líquido/gas Diferencias de solubilidad Gel Líquido Tamaño molecular Exclusión Intercambio iónico Resina Líquido Fuerzas electrostáticas MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Sistemas de purificación y separación de grupos INSTITUTO DE LA GRASA Extracción liquido – líquido TLC Cromatografía en columna clásica Extracción en fase sólida (SPE) Todas las técnicas se siguen utilizando aunque la extracción en fase sólida se utiliza cada vez más debido a su adaptación a tiempos mínimos de separación y a distintos tamaños de muestra MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Sistemas de purificación y separación: Extracción en fase sólida Fase normal –Si–OH –Si–(CH2)3 NH2 –Si–(CH2)3 CN –Si–(CH2 )3 OCH2 CH(OH)CH2 OH –Si–C18 H37 –Si–C8 H17 Fase reversa –Si–C2 H5 –Si– C6 H5 MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Cromatografía líquida de alta eficacia INSTITUTO DE LA GRASA Adsorción o Fase normal: Separación por polaridad (fase estacionaria polar) Reparto o Fase reversa : Separación por solubilidad (fase móvil polar) Exclusión: Separación por tamaño molecular MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) INSTITUTO DE LA GRASA Los parámetros que influyen en la resolución (nº de platos teóricos) Fase estacionaria Naturaleza Cantidad de fase o Geometria de la columna (Longitud/ diametro) Tamaño de partícula Disolvente de elución Régimen isocrático o gradiente Flujo (mL/min) Últimos avances en la cromatografía líquida (UPLC) MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Cromatografía “ultra” Ultra presión Mejora de los sistemas de control de presión (hasta 12.000 psi) Ultra eficacia INSTITUTO DE LA GRASA Tamaño de partícula (1-3 µm) Desarrollo de detectores universales Detector de aerosol cargado (CAD) Columna de sílice (10% NO3Ag) de 3 µm de tamaño de partícula http://lipidlibrary.aocs.org MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Análisis de triglicéridos Columna 200 × 2.1 mm Hypersil MOS, 3 µm Acetone/ACN (30:70) Flow rate 0.5 ml/min Detector de índice de refracción INSTITUTO DE LA GRASA ( P G ) Separación de lípidos de yema de huevo MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Spherisorb Silica, 3µ, 100 x 4.6 mm 1. Colesterol 2. Ácido palmítico 3. Fosfatidiletanolamina 4. Fosfatidilserina 5. Fosfatidilcolina 6. Esfingomielina 1. 2. 3. 4. Colesterol Fosfatidiletanolamina Fosfatidilcolina esfingomielina http://www.discoverysciences.com/Library_home.aspx MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN 0.4 mL/min a. b. c. d. e. f. Ergosterol Lanosterol Colesterol Estigmasterol Campesterol β-sitosterol INSTITUTO DE LA GRASA 0.8 mL/min 1.2 mL/min Columna: Acquity UPLC-BEH C18 (50 x 2.1 mm, 1.7 µm) Lerma-García et al., 2010 MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Nuevos sistema de detección universal: Detector de aerosol cargado INSTITUTO DE LA GRASA La fase móvil es nebulizada, el disolvente se elimina a temperature ambiente y los analitos se mezclan con nitrogeno ionizado. Se mide la carga que adquieren, que depende de la cantidad de compuesto. MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Cromatografía de gases Separación de compuestos con volatilidad alta o media Elevada resolución de especies moleculares Todavía es la técnica más adecuada en la separación de compuestos lipídicos, siempre que la volatilidad de los compuestos a separar lo permita o sea posible aumentar la volatilidad mediante reacciones de derivatización INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Principales reacciones de derivatización INSTITUTO DE LA GRASA Tranesterificación O O H O C R O O C R O O OH- + CH3O H 3 CH3O C R Silanización R-OH O H O H O C R + R MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Últimos avances en la cromatografía de gases INSTITUTO DE LA GRASA Cromatografía de gases ultrarrápida (UFGC) Cromatografía de gases a temperatura elevada (HTGC) Evolución de la cromatografía de gases MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Dimensiones de columna Longitud (m) D.I. (mm) Calentamient o (ºC/ min) Inicial 1–4 32 - 64 1 - 10 30 - 60 10 - 20 Convencional 15-60 0.25 - 0.32 1 - 20 20 - 30 2 - 5 Rápida 5 - 15 0.10 - 0.18 20 - 60 5 - 15 0.5 - 2 Ultrarrápida 2 - 5 0.10 60 - 600 2 - 3 0.05 – 0.5 CG Tiempo de Analisis (min) Ancho de pico (s) MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Necesidad de un nuevo sistema cromatográfico INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Cromatografía de gases ultrarrápida Columnas 2.5, 5, 10 m con d.i. de 0.1 mm Velocidades de programación de temperaturas de hasta 20°C/s (1200 °C/min) Rango de temperaturas desde 35 to 370°C (siempre que sea compatible con la fase estacionaria) Rápido enfriamiento de 350°C to 50°C (1 min) MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Ésteres metílicos de aceite de oliva Columna: MEGAWAX 5m x 0.1mm, 0.1µ µm Temperature program: 150 (10 s), 1.7 °C/s, 250 (20 s) C18:1 C18:2 C16:0 C18:0 C16:1 C18:3 C20:0 C20:1 0 0.25 0.5 0.75 time (min) 1 C24:1 1.25 1.5 MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Análisis de ésteres metílicos INSTITUTO DE LA GRASA Columna: MEGAWAX (5m x 0.1mm, 0.1µ µm Programa de temperatura: 17+1 8 16 40 (10 s), 1.7 °C/s, 250 (20 s) 14 15 23 24 19 20 21 22 1 27 26 28 31 25 29 30 32 34 33 3 4 6 1.7 1.8 1.9 2 2.1 2.2 8 11 5 0.5 1 7 10 9 1.5 Time (min) 13 2 2.5 2.3 20. C18:2n6t 2. C6:0 21. C18:3n6 3. C8:0 22. C18:3n3 4. C10:0 23. C20:0 36+ 5. C11:0 24. C20:1 37 6. C12:0 25. C20:2 7. C13:0 26. C20:3n6 8. C14:0 27. C21:0 9. C14:1 28. C20:3n3 10. C15:0 29. C20:4n6 11. C15:1 30. C20:5n3 12. C16:0 31. C22:0 13. C16:1 32. C22:1n9 14. C17:0 33. C22:2 15. C17:1 34. C23:0 16. C18:0 35. C24:0 17+18. C18:1n 9t+ c 36+37.C24:1+C22:6n3 12 2 0 35 1. C4:0 2.4 19. C18:2n6c MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Análisis de triglicéridos Columna:100% dimetilpolisiloxano, Dimensiones: 2.5 m 0.32 mm, 0.05 µm Temperatura: 150ºC(0.5 min), 60ºC/min hasta 340ºC (0.5 min). INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Cromatografía de gases de alta temperatura INSTITUTO DE LA GRASA Desarrollo de fases cromatográficas de bajo sangrado, estables a elevada Temperatura (350 – 400 ºC) 1. Glycerol 2. Butanotriol 3. Monooleina 4. Tricaprina 5. Dioleina 6. Trioleina MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Técnicas de identificación: Espectrometría de masas INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Técnicas de ionización Baja energía: Facilidad de formación del ión molecular Alta energía: Fragmentación de la muestra con formación de múltiples iones La combinación de ambos sistemas facilita enormemente la identificación de lípidos INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Utilización combinada de técnicas para obtener la máxima información INSTITUTO DE LA GRASA En muchos casos es necesario obtener una información detallada de los componentes presentes en la muestra Ejemplo: Análisis de destilados de desodorización MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Proceso de refinación INSTITUTO DE LA GRASA Refinación física Refinación qumica Compuestos eliminados Subproducto Desgomado Desgomado Fosfolípidos Lecitinas Neutralización Ácidos grasos libres Jabones Decoloración Decoloración Pigmentos Desodorización Desodorización Volátiles Destilado Ácidos grasos libres y volátiles Destilado Destilación/ neutralización MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Combinación de técnicas:Análisis de destilados de desodorización INSTITUTO DE LA GRASA Compuestos presentes Triglicéridos Diglicéridos Monoglicéridos Acidos grasos Esteres alquílicos Hidrocarburos Esteres de esteroles Ceras Esteroles Tocoferoles Bases de la separación Polaridad Peso/ tamaño molecular Volatilidad MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Cromatografía de adsorción: Separación por polaridad Hexano:éter etílico 90:10 Éter etílico Fracción no polar Fracción polar Ésteres alquílicos Ésteres de esteroles Ceras Triglicéridos Ácidos grasos Tocoferoles Esteroles Diglicéridos Monoglicéridos INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Cromatografía de exclusión INSTITUTO DE LA GRASA Triglicéridos ≈ 900 Ceras/esteres esteroles ≈ 600 Diglicéridos ≈ 600 Esteroles ≈ 400 Monoglicéridos ≈ 400 Hidrocarburos ≈ 400 Ácidos grasos ≈ 300 Ácidos grasos ≈ 300 MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Cromatografía de exclusión INSTITUTO DE LA GRASA (A) Total (B) Fr. no polar (C) Fr. polar 100% 4% 96% MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Cromatografía de gases de alta temperatura INSTITUTO DE LA GRASA (A) Total (B) Fr. no polar (C) Fr. polar MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Evolución del análisis de lípidos El desarrollo del análisis de lípidos ha estado asociado al de los métodos cromatográficos y al de la química orgánica. En el momento actual, sin embargo, el avance de las técnicas analíticas está más relacionado con la bioquímica de lípidos y con las ciencias de la salud INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Reconocimiento del papel de los lípidos INSTITUTO DE LA GRASA Los lípidos están relacionados con funciones celulares críticas, por ejemplo, en las membranas La actividad de los lípidos se puede modificar en estados patológicos Enfermedades importantes –ateroesclerosis, diabetes, obesidad, accidentes vasculares y enfermedad de Alzheimer- están relacionadas con alteraciones del metabolismo lipídico MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Desarrollo de las “ómicas” Genómica Proteómica Metabolómica Lipidómica: Caraterización completa de las especies moleculares de lípidos y de su papel biológico respecto a la expresión de las proteínas envueltas en el metabolismo lipídico INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Necesidades y consecuencias Análisis de muestras de elevada complejidad con mínimo tratamiento Evaluación directa de muestras biológicas Desarrollo de técnicas de identificación de compuestos Espectroscopía de resonancia magnética nuclear Espectrometría de masas (MALDI) Desarrollo de los sistemas de tratamiento informático para la gestión de datos MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Análisis de lípidos sin separación cromatográfica previa INSTITUTO DE LA GRASA Plasma Extracción de lípidos Análisis EM Identificación y cuantificación automáticas Análisis Análisis de EM datos MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Espectrometría de masas de imagen (neurona) INSTITUTO DE LA GRASA (a) distribuciíón de colina (b) distribución de C22:6 (c) distribución de vitamina E (d) Intensidad Ventajas del desarrollo de la lipidómica MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Mejora rápida de las técnicas de identificación Disminución del coste de los sistemas CG-EM y LC-EM Desarrollo de las técnicas de separación cromatográfica rápidas Posibilidades de disminución del tratamiento de la muestra y utilización directa de los métodos de identificación Consecuencias del avance en el análisis de lípidos MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Cada vez es posible detectar concentraciones menores de lípidos Se aprovecha la sensibilidad y elevada resolución de los nuevos sistemas de detección Importancia de nuevos contaminantes presentes en concetraciones de µg/kg (ppt) que se determinan cuantitativamente mediante el uso de isótopos FTALATOS MONOCLORO PROPILDIESTERES ACRILAMIDA INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Ftalatos: Aditivos en plásticos Probable carcinogénico Contaminación generalizada por la facilidad de migración Debido a su carácter lipofílico, se encuentran con facilidad en aceites grasas y alimentos grasos Análisis (GC-EM) difícil por la facilidad de contaminación de la muestra Análisis mediante LC/MS: determinación cuantitativa mediante isótopos MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Los espectros corresponden a los compuestos puros y a los isótopos utilizados como estandar interno a. 2-etilhexil ftalato; b. 2-etil hexil ftalato d-4 c. di(2-etilhexil) ftalato; d. di(2-etilhexil) ftalato d-4 MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Esteres de Monocloropropanodiol INSTITUTO DE LA GRASA Presente en muchos alimentos (proteinas hidrolizadas, salsas, patatas fritas, pan tostado, café, donuts, etc) La Comisión Europea limita el contenido en algunos alimentos a 20 µm/kg Entre los aceites y grasas se encuentra en cantidades significativas en el aceite de palma (> 4 mg/kg) La detección de cantidades significativas en aceite ENOVA (digliceridos) que originó su retirada del mercado MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Formación de ésteres de monocloropropanodiol Monoésteres y diésteres INSTITUTO DE LA GRASA monocloropropanodiol Su formación depende de la temperatura, de la presencia de iones cloruro, y existe buena correlación con la cantidad de diglicéridos y monoglicéridos Formación de ésteres de monocloropropanodiol durante la refinación de aceites de girasol y colza MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Acrilamida: Análisis HPLC/MS/MS INSTITUTO DE LA GRASA NH2 C O CH CH2 carbonyl NH2 C O CH2 NH2 CH COOH Asparagine Probable neurotóxico y carcinogénico Análisis LC/MS (isótopo de 1H o 13C cono estándar interno) Límite de cuantificación 1µg/kg MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN INSTITUTO DE LA GRASA Direcciones recomendadas http://lipidlibrary.aocs.org/ Excelente web para el conocimiento detallado de los diferentes tipos de lípidos y de las técnicas aplicables a su análisis. Incluye tutoriales básicos, una amplia librería de espectros de masa y RMN y una bibliografía actualizada. http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm Especialmente interesante en las técnicas de preservación, extracción y purificación http://www.discoverysciences.com/Library_home.aspx Excelente librería de GC y HPLC incluyendo con detalle las condiciones de trabajo