Detección de cambios proteicos inducidos por concentraciones

Detección de cambios proteicos inducidos por concentraciones

Detección de cambios proteicos inducidos por concentraciones
subinhibitorias de antibióticos
Dra. Eva Torres-Sangiao,
Departamento de Microbiologia y Parasitologia, Universidad de
Santiago de Compostela
Introducción
Actualmente,
los
métodos
fenotípicos
convencionales
siguen
manteniéndose
como
las
herramientas más usadas y útiles para la determinación de mecanismos de resistencia, por su bajo
coste y accesibilidad. Por otro lado, los métodos genotípicos moleculares, surgen como un modo
de aumentar la sensibilidad, especificidad y velocidad de detección de genes específicos de
resistencia, al tiempo que como respuesta a la necesidad de una tipificación epidemiológica de
cepas. Sin embargo, estos métodos moleculares tienen la gran desventaja de su elevado coste,
complejidad, tiempo requerido y la necesidad de personal cualificado.
1. Métodos fenotípicos convencionales
•
Micro / macro – dilución
•
Disco difusion y E-test
2. Métodos moleculares fenotípicos
•
Electroforesis en gel de campos pulsantes (PFGE)
•
Tipificación multilocus de secuencias (MLST)
•
Hibridación fluorescente in situ usando péptidos de ácidos nucleicos (PNA-FISH)
•
PCR: múltiple, en tiempo real y cuantitativa (qPCR)
•
Micromatríces (Microarrays)
3. Espectrometría de masas: MALDI-TOF-MS
La espectrometría de masas (EM) , es una técnica de análisis utilizada para la determinación de
estructuras. Su evolución, hacia espectrómetros de masas como el MALDI-TOF, ha permitido el
uso de esta tecnología en los laboratorios de Microbiología, ya que permite identificar el perfil
proteico de una muestra por huella peptídica.
Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization- Time of Fly-Mass Spectrometry, mas conocido
como MALDI-TOF-MS, separa moléculas previamente ionizadas en función de su relación masa /
carga (m/z), generándose así unos espectros específicos para cada bacteria, lo que nos permite de
una manera rápida y sencilla, obtener un resultado con categoría de especie, con una elevada
fiabilidad.
Identificación por el MALDI-TOF-MS
La reproducibilidad de los resultados obtenidos por MALDI-TOF-MS en el lab de diagnóstico
microbiológico, se apoya en la identificación de las proteínas más abundantes, como p.ej., las
proteínas ribosómicas, presentes además en todas las células vivas, por lo que los perfiles
proteicos generados no están influenciados significativamente por la variabilidad en las condiciones
de cultivo.
Diferentes
grupos
de
estudio
micro-
proteómicos y de sistemas, han diseñado
Perfiles proteicos de diferentes bacterias (bioMerieux)
archivos con los espectros de masas de
fragmentación
obtenidos
de
péptidos
por
y
proteínas,
MALDI-TOF-MS,
correspondientes a las distintas bacterias y
otros
microorganismos,
para
una
misma
emisión del láser y una misma distancia de
migración.
La
puntuación
basada
en
los
patrones de coincidencia o scores para el
microorganismo
desconocido,
se
compara
(correlaciona) con una librería de referencia,
mediante un software específico.
En la figura siguiente se pueden observar distintos espectros correspondientes a Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Neisseria meningitides y Neisseria gonorrhoeae.
Sta p hy lo coc cu sa ure us
Sta ph yl oc occ us epidermidis
Neisseri a me ni ng it id is
Nei sse ria go norrh oea e
Identificación de mecanismos de resistencias por MALDI-TOF-MS
MALDI-TOF-MS también es una herramienta útil para identificar fenotipos de resistencia en el
laboratorio de diagnóstico microbiológico. La investigación actual se centra en cuatro direcciones
principales: (1) identificación de modificaciones en los antibióticos por las enzimas degradantes, ya
que los productos de degradación por hidrólisis, muestran una relación m/z diferente de la de la
molécula nativa; (2) identificación de los mecanismos determinantes de resistencia a través de
estudios proteómicos de bacterias multirresistentes como por ejemplo, las proteínas Qnr, PBPs
modificadas o β-lactamasas; (3) análisis de las modificaciones de los sitios en los lugares diana,
como la metilación del ribosoma; sin abandonar (4) la identificación de mutantes por minisecuenciación.
Un ejemplo, es la determinación de resistencia a imipenem, un antibiótico útil en el tratamiento de
infecciones causadas por enterobacterias productoras de BLEE. En el estudio llevado a cabo por M.
Kempf y cols., analizaban la presencia y / o ausencia de picos asociados a imipenem, y su
metabolito natural, en una cepa de Acinetobacter baumanii productora de carbapenemasas. El
resultado era interpretado como positivo para la producción de carbapenemasas, cuando el pico
específico asociado a imipenem, a 300 m/z, desaparecía después del tiempo de incubación
establecido, al tiempo que, el pico asociado a su metabolito natural, a 254 m/z aumentaba en
Intensidad. La relación entre las intensidades de picos asociadas a imipenem y su metabolito
debería ser < 0,5.
En las figuras siguientes pueden observarse los perfiles de los espectros de masa
correspondientes a un A. baumanii resistente a imipenen por la producción de carbapenemasas y
un A. baumanii sensible, respectivamente.
Espectro de masa del ensayo de hidrólisis del imipenem con una cepa de A. baumannii
resistente a los carbapenemes.
Espectro de masa del ensayo de hidrólisis del imipenem con una cepa de A. baumannii
sensible a los carbapenemes
Kempf M, et al. Rapid detection of carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii using Matrix-Assisted
Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry. 2012 PLoS ONE 7(2): e31676. doi:10.1371.
Otros estudios, otras hipótesis
En un estudio realizado por Y.R. Wang y cols., un total de 100 cepas de S. aureus, aisladas de
muestras clínicas, fueron analizadas por MALDI-TOF-MS, y los datos obtenidos interpretados por el
software Biotyper. La identificación de S. aureus por MALDI-TOF-MS fue altamente correlacionada
con la tipificación por métodos bioquímicos y serológicos, con una precisión del 97%. El análisis de
“clusters” por Biotyper mostraba que los 100 aislados se dividían en 2 tipos, con una distancia de
400, S. aureus resistente a meticilina (SARM) (rojo) y S. aureus sensibles (SASM) (verde). La
intensidad máxima de picos observada en la región de 3 784 Da – 5 700 Da para la relación m/z,
permitía la diferenciación entre SARM (rojo) y SASM (verde).
Wang YR, et al. Characterization of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens by Matrix
Assisted Laser Desorption/Ionization Time-off flight Mass Spectrometry. 2013. Biomed Environ Sci; 26: 430-6.
Las infecciones nosocomiales que implican a SARM, continúa siendo un grave problema en la
gran mayoría de países. Ante la sospecha o existencia de un brote, las cepas infecciosas deben
ser tipificadas, sin embargo, la mayoría de métodos moleculares además de caros requieren tiempo
y personal cualificado, no estando al alcance de todos los laboratorios de diagnóstico
microbiológico.
La caracterización molecular de cepas de S. aureus por medio de MALDI-TOF-MS, ha sido
recientemente analizada por M. Josten y cols., a través de un estudio con 401 cepas de SARM y
SASM, incluyendo cepas clínicas y de laboratorio. La tipificación retrospectiva de un brote de
MRSA les permitió diferenciar MSSA, MRSA, y S. aureus en el borde de la resistencia (SABOR). A
través de cambios en las Intensidades de ciertos picos, también les permitió la diferenciación de los
principales complejos clonales de S. aureus, CC5, CC22, CC8, CC45, CC30 y CC1, estos cambios
además se relacionaban con mutaciones concretas de los genes respectivos. La confirmación de la
identificación de todos los péptidos analizados no solo fue contrastada con las bases de datos
disponibles, fue confirmada por secuenciación de mutantes y expresión de fragmentos de ARN
antisentido. Las señales identificadas, se derivan principalmente de las proteínas de estrés y
proteínas ribosomales.
Los siguientes espectros por MALDI-TOF, se corresponden con dos cepas de laboratorio de S.
aureus, NCTC 8325-4 (A) y su variante S. aureus NCTC SH1000 (B), las cuales muestran diferente
actividad del factor transcripcional, factor sigma B (SigB). S. aureus NCTC 8325-4 con una débil
actividad de este factor SigB, se refleja por una mayor intensidad de pico correspondiente a la
proteína ribosómica Hup, m/z 9627. En contraste, el espectro de S. aureus NCTC SH1000 está
dominada por señales adicionales de proteínas derivadas del stress de SigB, de la mayor actividad
de transcripción de SigB. [prot SA0772, relación m/z 6889 y 3445 (valor para el péptido doblemente
cargado); prot SAS049, relación m/z 5525; protSA1452 relación m/z 6552] ). El 94% de los aislados
mostraban los mismos patrones de espectros.
Josten M. et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of
Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. 2013. J Clin
Microbiol; 51: 1809-17.
Respuesta adaptativa de Staphylococcus aureus USA300, resistente a la meticilina, a
las concentraciones subinhibitorias de antibióticos analizados por EM libre de
marcaje
Los resultados expuestos a continuación son parte del trabajo de la tesis doctoral, escrita y
presentada en inglés por la autora de esta ponencia, cuyo título: “Staphylococcus aureus
resistentes a la meticilina adquiridos en la comunidad. Efecto de las concentraciones subihihibitorias de los antibióticos en el perfil del proteoma de la cepa USA300. Patogénesis y
sensibilidad.” fue defendida en la Universidad de Santiago de Compostela. Las instituciones
colaboradoras se listan al final de este escrito.
Staphylococcus aureus es un agente causante de muchas infecciones graves en el ámbito de la
atención sanitaria. El aumento de la virulencia de las cepas adquiridas en la comunidad, como la
del clon USA300, de S. aureus resistente a la meticilina (AC-SARM), que han surgido
recientemente, además de difíciles de tratar, muestan una mayor capacidad de infectar, incluso a
individuos sanos.
Estudio proteómico de S. aureus USA300
Material y métodos
A. Culture conditions
0.25 or 0.5 MICs
CTRL LNZ TIG OXA VAN
Overnight / 37° C /
200rpm
S.aureus into
5 ml TSB
4h / 37° C / 250rpm
4h / 37° C / 200rpm
OD600 = 2 + 0.2
OD600 = 0.04 + 0.005
Dilution 1:100 (0.1 ml : 10 ml)
Ratio space / volumen = 5:1
10μl plated on blood agar
Overnight CFU
OD600 = 0.75 + 0.05
Ratio space / volumen = 5:1
200g / 4° C / 10min
Supernatant
0.22μ filter
Pellet washed x 3
resuspended
lysated
clarified
B. SDS-PAGE and in-gel trypsin digestion
Concentration
Quantification
Separation& Dye
In-gel Trypsin digestion
Desalted & Stage-tips
Elution
Dionex Ultimate 3000 nLC system connected to LTQ-Orbitrap MS/MS
UniProt database
Andromeda configuration
USA300
TCH1516
USA300
FPR
Resultados y discusión
Se obtuvieron un total de 668 331 MS / MS espectros de masas adquiridos de las cinco
condiciones diferentes analizadas (control sin tratar y células tratadas con ½ y ¼ de las CMIs de
linezolid, tigeciclina, oxacilina y vancomicina). Aproximadamente 230 000 espectros identificados,
representaron más de 10 000 secuencias peptídicas que desencadenaron la identificación de 1 286
proteínas, aprox el 50 % del proteoma de USA300 (∿ 2 600 proteínas).
Los cromatogramas o TICs obtenidos, representan Intensidades totales frente a tiempos de
retención. Estos TICs mostraban patrones superponibles para cada antibiótico independientemente
de la concentración.
A partir de estos TICs, el software X-Calibur permite obtener los conocidos espectros de masas,
donde se representan las Intensidades frente a relación m/z.
Todos los picos observados se encontraban en la región del espectro correspondiente a una
relación m/z de 300 – 800 Da, dado que los péptidos (10 – 30 aa de longitud) presentan menores
pesos moleculares, y además en la ionización de las moléculas se consiguen cargas de hasta +7 (7
H+).
Esta información, de TICs y espectros, es analizada posteriormente bioinformática y
cuantitativamente, en este caso, con el pack-suite MaxQuant (incluyendo la ingeniería de búsqueda
Andromeda y el software estadístico Perseus), facilitado por el Instituto Planck, y a través de
páginas web como UniProtKB.
1.
MaxQuant, software hace
la lectura de los TICs y espectros
generando
información
de
intensidades,
masas
y
secuencias peptídicas asociadas
a una proteína.
2.
a través de bases de datos
como
UniProtKB,
podemos
ampliar la información asociada
a
cada
proteína:
función
molecular, localización celular,
proceso biológico, etc,
3.
con
los
datos
de
intensidades
e
intensidades
normalizadas, podemos analizar
cuantitativamente los resultados
y realizar análisis estadísticos (ttest, ANOVA–test, etc).
MS data • txt database
analysis • Peptides sequences Protein
Bioinformatics • UniProt : cellular localization,
molecular function, biological
Analysis
processes, …
Label- free
quantification • Statistical analysis
Por ejemplo, con respecto a la distribución de los
procesos biológicos correspondiente a nuestro clon
USA300, cerca del 25% del proteoma son proteínas
involucradas en procesos del metabolismo de DNA,
RNA
y
ribosomas,
las
cuales
además
son
expresadas a lo largo de toda la curva de
crecimiento bacteriano .
Y el software Perseus, además del análisis
estadístico,
nos
permite
obtener
los
denominados heat-maps, los cuales nos
permiten tener una visión global del proteoma
bacteriano para cada condición, al tiempo
que podemos compararlos.
Los efectos observados para cada antibiótico fueron dosis-dependientes y acordes con el
mecanismo de acción. Linezolid y vancomicina no inducían grandes cambios con respecto al
control, especialmente vancomicina que no mostraba diferencias estadísticamente significativas.
Sin embargo, tigeciclina, mostraba una “down"-regulación del proteoma de USA300, observado por
una disminución en el número de proteínas identificadas en ambas sub-CMIs. Por el contrario,
oxacilina, parecía aumentar el número de proteínas identificadas en la fracción soluble, mientras
parecía disminuirlo en la fracción no soluble. Esta observación implicaba que, proteínas
típicamente intracelulares (ribosómicas o de membrana) se habían desplazado desde el pellet al
sobrenadante, como consecuencia de una más que probable lisis de la pared celular.
Continuando con oxacilina como ejemplo de nuestro estudio, p.ej, el análisis estadístico por t-test
para la concentración de ½ CMI, mostraba esta distribución (Vocano-Plot):
A la derecha, proteínas que mostraban
mayor abundancia en las condiciones
de oxacilina ( > 2 fold-change), a la
iquierda
proteínas
que
mostraban
menor abundancia en las condiciones
de oxacilina ( < 0.5 fold-change).
Proteínas subrayadas ( ) = proteínas
estadísticamente significativas .
Respuesta al estrés. Mecanismo de resistencia
En términos generales, los mecanismos de resistencia a β-lactámicos estaba "up"- regulados,
1.
La abundancia de BlaZ era superior para cualquiera de las condiciones con respecto al
control, especialmente con linezolid y oxacilina.
2.
La abundancia de MecA, aunque sin diferencias estadísticamente significativas con
respecto al control, se observaba aumentada en las condiciones de antibióticos, especialmente
con linezolid y vancomicina.
3.
Se identificó una PBP2 en todas las condiciones, con una abundancia variable pero similar
al control, excepto para la concentracion de ½ de linezolid. Además, con esta concentración,
también se identificaba una PBP3, solo identificada para esta sub-MIC (½) de linezolid y oxacilina.
Por otro lado, tigeciclina disminuía la resistencia a aminoglucósidos, por la menor abundancia de
aph(3'), implicada en la resistencia a kanamicina. Y por último, con respecto a la resistencia a
glucopéptidos, se observa una mayor abundancia de la RNA polimerasa B, RpoB, especialmente
con oxacilina.
Respuesta al stress. Respuesta no-especifica o común
Algunos de los cambios observados en el proteoma de USA300, comunes para todos los
antibióticos, podría ser asumida como una respuesta no específica debido a la presión antibiótica.
Especialmente, esta respuesta era compartida para los dos inhibidores de síntesis proteica,
linezolid y tigeciclina, y el inhibidor de la síntesis de la pared celular, oxacilina. Por ejemplo,
proteínas como IsdA o ClfB implicadas en la adhesión celular y formación de biopelículas,
especialmente en condiciones restringidas de hierro y calcio, respectivamente, se encontraban en
mayor abundancia en los tres antibióticos con respecto al control. Por otro lado, la menor
abundancia de varios proteínas implicadas en la virulencia, como Aur o HlgA podría estar más
relacionado con las condiciones in vitro de nuestro estudio, consecuencia de su regulación por
sistemas de dos componentes o transcripcionales dependientes de estímulos.
Con respecto a los mecanismos de resistencia, como se comentó anteriormente, en términos
generales, los mecanismos de resistencia a β-lactámicos estaba "up"- regulados - especialmente la
abundancia de MecA-, así como PstS, proteína de transporte conocida por participar en la
adaptación reversible al estrés antibiótico para sobrevivir en presencia de β-lactámicos, y por
extensión, en nuestro estudio, a otros antibióticos.
EsxA, SplA
LukS-PV
FnbB, Coa, SdrD
TIGECYCLINE
EsaA, SspB,
IsaB, Sek
ClfA
Hly, Aur,
HlgA, Sak
SplC, SplE
Ear, Hld
FnbA
ClfB, IsdA
PstS, MecA
OXACILLIN
LukF-PV, LukDE
SCIN
Eap, PsmA1
Virulence:
LINEZOLID
Pbp3
SdrE
Biofilm:
En resumen, estos resultados describen la respuesta del clon USA300 a dos concentraciones
subinhibitorias (½ y ¼ CMI) de cuatro antibióticos de uso clínico, linezolid, tigeciclina, oxacilina y
vancomicina, mediante el uso de EM libre de marcaje, lo que ha permitido el análisis cuantitativo de
aproximadamente 1280 proteínas diferencialmente expresadas en cada condición. Este estudio a
diferencia de estudios anteriores sobre transcriptoma, donde se controlan los cambios en mRNA,
pero no en las proteínas que reflejan directamente adaptaciones fisiológicamente relevantes, nos
permite una visión global de la adaptación de la cepa hipervirulenta USA300 en respuesta a la
presión antibiótica.
Conclusiones
Staphylococcus aureus tiene una marcada capacidad para adaptarse a diferentes condiciones
ambiantes, in vitro y / o in vivo. mediante la modulación o redireccionamiento de su metabolismo
central.
La respuesta común de USA300 para superar el estrés, debido a la presión antibiótica, se
caracterizó por la mayor abundancia de proteínas involucradas en mecanismos de resistencia y
formación de biopelículas.
Perspectivas:
Flujo de trabajo en los laboratorios de
diagnóstico microbiológico
Flujo de trabajo en los laboratorios de
investigación
Perspectivas futuras de un posible flujo de trabajo en
los lab de diag microbiol
Agradecimientos
Prof Carlos García Riestra.
Prof Harald G Wiker at Gade Research Group for Infection and Immunity at University of
Bergen (UiB)t.
Dr. Frank deLeo and Dr. Henry Chambers at the National Institutes of Health, Hamilton,
Montana, USA and the Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, University of
California, San Francisco.
Dr. Olav Mjaavatten at the Probe Proteomic Unit at UiB y Dra. Veronika Kuchařová and Åse
Fredriksen at The Gade Research Group for Infection and Immunity at UiB.
Intituto de Salud Carlos III (Madrid) y Complejo Hospitalario Universitario, A Coruña
(España)
Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.
Departmento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela
(España)
The Gade Research Group for Infection and Immunity, Department of Clinical Sciences.
Faculty of Medicine and Dentistry at University of Bergen (Norway).