NT-proCNP

NT-proCNP
(EN) ENZYME IMMUNOASSAY FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF HUMAN
NT-proCNP IN PLASMA AND SERUM
CAT. NO. BI-20872 12 X 8 TESTS
(DE) ENZYM IMMUNOASSAY FÜR DIE QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON HUMAN
NT-proCNP IN PLASMA UND SERUM
KAT. NR. BI-20872 12 X 8 TESTE
(FR) DOSAGE IMMUNOENZYMATIQUE POUR LA DETERMINATION QUANTITATIVE DU
NT-proCNP HUMAIN DANS LE PLASMA OU LE SERUM
REF: BI-20872 12 X 8 TESTS
(IT) IMMUNODOSAGGIO ENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DI
NT-proCNP UMANO SU CAMPIONI DI PLASMA O SIERO
CAT. NO. BI-20872 12 X 8 TEST
(ES) ENZIMOINMUNOENSAYO PARA LA DETERMINACION CUANTITATIVA DE
NT-proCNP HUMANA EN PLASMA Y EN SUERO
CAT. NO. BI-20872 12 X 8 TESTS
rev.no. 120627 (replacing 110331)
Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, A-1210 Wien, Divischgasse 4
Tel. +43/1/291 07 45, Fax +43/1/291 07 85, E-mail [email protected]
1/24
CONTENT / INHALT / SOMMAIRE / CONTENUTO / CONTENIDO
1)
2)
3)
4)
5)
ENGLISH ….. 3
DEUTSCH …. 7
FRANÇAIS .. 11
ITALIANO … 15
ESPANIOL .. 19
Additional information on our products is available on our website.
Zusätzliche Informationen zu unseren Produkten finden Sie auf unserer Webseite.
Pour toute information complémentaire sur nos produits, visiter notre site Internet.
Ulteriori informazioni sui nostri prodotti possono essere cercate sulla nostra home page.
Encontrará información adicional sobre nuestros productos en nuestra página web.
www.bmgrp.com
2/24
1) INTRODUCTION
C NP belongs to a well characterised group of natriuretic peptides like atrial natriuretic (ANP) and brain natriuretic peptide
(BNP), which play various important roles as regulatory mechanisms as well as bio-markers. They participate in the
regulation of blood pressure and body fluid homeostasis, modify growth and development of cardiovascular tissues and
bone. ANP and BNP are cardiac hormones, secreted by the atria and ventricles, respectively, in the normal adult heart. In
contrast to ANP and BNP, very little CNP is produced by cardiac tissue, but is expressed primarily in the brain, pituitary
gland, vascular endothelium, kidney and female reproductive tract.
All natriuretic peptides are produced as propeptides, which are subsequently cleaved into the biologically active, Cterminal hormone and the N-terminal fragment (NT-proANP 1-98, NT-proBNP 1-76 and NT-proCNP, which length is still
under discussion). Since those N-terminal fragments are much more stable, and circulate in higher amounts than the active
hormones, they are easier and more reliable to be measured in serum or plasma. So we developed a sandwich
immunoassay for NT-proCNP using antibodies directed against amino acids 1-19 and 30-50. The physiological role of CNP
is not only studied in cardiac disease, but also in bone developmental biology, generally in bone research, renal diseases,
embryonic developmental research and vascular diseases.
Indications:
 vascular disease
 diabetes
 skeletal development
 sepsis
2) CONTENTS OF THE KIT
CONT
PLATE
WASHBUF
ASYBUF
STD
CTRL
CONJ
SUB
STOP
KIT COMPONENTS
Polyclonal sheep anti NT-proCNP antibody precoated microtiter strips in
stripholder packed in aluminium bag with desiccant
Wash buffer concentrate 20x, natural cap
Assay buffer, red cap, ready to use
Standards, (0; 2.5; 5; 10; 20; 40 pmol/l), white caps, ready to use
Control, yellow cap, ready to use, exact concentration see label
Conjugate, (anti NT-proCNP-HRPO), amber cap, ready to use
Substrate (TMB solution), blue cap, ready to use
STOP solution, white cap, ready to use
QUANTITY
12 x 8 tests
1 x 50 ml
1 x 10 ml
6 x 500 µl
1 x 500 µl
1 x 22 ml
1 x 22 ml
1 x 7 ml
3) ADDITIONAL MATERIAL ADDED TO THE KIT
 2 self-adhesive plastic film (aluminium foil)
 QC protocol
 Protocol sheet
 Instruction manual
4) EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
 Precision pipettes calibrated to deliver 50 µl, 200 µl, 300 µl and disposable tips
 ELISA reader for absorbance at 450 nm (reference 630 nm)
 Graph paper or software for calculation of results
 Distilled or deionised water
3/24
5) REAGENTS AND SAMPLE PREPARATION
A ll reagents of the kit are stable at +4°C (2-8°C) until expiry date stated on the label of each reagent.
Sample preparation:
proCNP in freshly collected blood samples is stable for at least 2.5 hrs at RT. Nevertheless we recommend to perform
plasma or serum separation by centrifugation as soon as possible (e.g. 20 min at 2000 x g, preferably at +4°C (2-8°C)).
Aliquot the acquired plasma or serum samples and store them at -25°C or lower. Samples can be subjected to 5 freeze-thaw
cycles without any loss of immune reactivity. Lipemic or hemolyzed samples may give erroneous results. Samples should be
mixed well before assaying. We recommend duplicates for all values. If samples read higher than the highest STD we
recommend to dilute them with ASYBUF (assay buffer) (e.g.: 1+1 and 1+3) and re-measure the samples.
For further information on sample stability please visit our website www.bmgrp.com technical file or contact our customer
service by e-mail [email protected] or by phone +43/ 1/ 29107-45.
Rekonstitute as follows:
WASHBUF (Wash buffer): Dilute the concentrate 1:20 (1+19), e.g. 50 ml WASHBUF + 950 ml distilled water. Crystals in
the buffer concentrate will dissolve at room temperature. Buffer is stable at +4°C (2-8°C) until expiry date stated on label.
Use only diluted WASHBUF (Wash buffer) to perform the assay.
6) PRINCIPLE OF THE ASSAY
7) ASSAY PROTOCOL
All reagents and samples have to be brought to room temperature (18-26°C) before they can be used in the assay.
Mark position for BLANK/STD/SAMPLE/CTRL (Blank/Standard/Sample/Control) on the protocol sheet.
Take microtiter strips out of the aluminium bag, reserve a minimum of one well as blank. Unused strips can be stored
with desiccant in the aluminium bag at +4°C (2-8°C) until the expiry date.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Add 50 µl STD/SAMPLE/CTRL (Standard/Sample/Control) in duplicate into respective wells, except blank.
Add 200 µl CONJ (anti NT-proCNP-HRPO) into each well, except blank, swirl gently.
Cover tightly and incubate for 4 hours at room temperature (18-26°C) in the dark.
Aspirate and wash wells 5x with 300 µl diluted WASHBUF (Wash buffer), remove remaining WASHBUF by hitting
plate against paper towel after the final washing step.
Add 200 µl SUB (Substrate) into each well.
Incubate for 30 min at room temperature (18-26°C) in the dark.
Add 50 µl STOP (Stop solution) into each well.
Measure absorbance immediately at 450 nm with reference 630 nm, if available.
4/24
8) CALCULATION OF RESULTS
R ead the optical density (OD) of all wells on a plate reader using 450 nm wavelength (correction wavelength 630 nm).
Subtract the blank OD from the values of STD, CTRL and sample. Construct the standard curve from the OD values of the
STD. Use commercially available software or graph paper. Obtain sample concentration from this standard curve. The assay
was evaluated with 4PL algorithm. Different curve fitting methods need to be evaluated by the user. Respective dilution
factors have to be considered.
Example typical STD-curve:
The quality control (QC) protocol supplied with the kit shows the results of the final release QC for each kit at production
date. Data for OD obtained by customers may differ due to various influences and/or due to the normal decrease of signal
intensity during shelf life. However, this does not affect validity of results as long as an OD of 1.50 or more is obtained for the
STD with the highest concentration and the value of the CTRL is in range (target range see label).
9) ASSAY CHARACTERISTICS
Serum, apparently healthy: 2.7 pmol/l (median, n=42)
Apparently healthy
Serum, hospital panel: 2.8pmol/l (median, n=23)
individuals and
EDTA plasma, hospital panel: 3.0 pmol/l (median, n=25)
hospital panel:
Each laboratory should establish own normal values.
Standard range:
0 – 40 pmol/l
1pg/ml = 0.151 pmol/l (referring to recombinant proCNP 1-64)
Conversion factor:
Sample volume:
50 µl human serum or plasma
Detection Limit:
(0 pmol/l + 3 SD): 0.2 pmol/l
Incubation time:
4 hours / 30 min
Cross reactivity:
Not determined, homology to other species for the epitopes used in this assay:
Epitope 1: rat (88%), sheep (94%), pig (94%), mouse (88%), bovine (88%)
Epitope 2: rat (95%), sheep (90%), pig (95%), mouse (95%), bovine (90%)
For further information on assay characteristics please visit our website www.bmgrp.com technical file or contact our
customer service by e-mail [email protected] or by phone +43/ 1/ 29107-45.
5/24
10) PRECISION
Intra-Assay: 2 samples were tested 5 times within 1 assay lot by one operator.
Inter-Assay: 2 samples were tested 30 times in 3 different lots by 4 different operators.
Intra-Assay (n=5)
Mean (pmol/l)
SD (pmol/l)
CV%
Sample 1
5.1
0.26
5%
Sample 2
20.0
1.17
6%
Inter-Assay (n=30)
Mean (pmol/l)
SD (pmol/l)
CV%
Sample 1
5.0
0.07
1%
Sample 2
20.0
0.15
1%
11) TECHNICAL HINTS
 Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.
 Do not mix stoppers and caps from different reagents or use reagents between lots.
 Do not use reagents beyond expiration date.
 Protect reagents from direct sunlight.
 Substrate solution should remain colorless until added to the plate.
 To ensure accurate results, proper adhesion of plate sealers during incubation steps is necessary.
 Avoid foaming when mixing reagents.
12) PRECAUTIONS
All test components of human source were tested with 3rd generation tests against HIV-Ab and HBsAg; and were found
negative. Nevertheless, they should be handled and disposed as if they were infectious.
Liquid reagents contain ≤0.1% Proclin 300 as preservative.
Proclin 300 is not toxic in concentrations used in this kit. It may cause allergic skin reactions – avoid contact with skin or
eyes.
 Do not pipette by mouth.
 Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics where reagents are used.
 Avoid all contact with the reagents by using gloves. The stop solution contains sulfuric acid, contact can lead to
irritations of eyes and skin. Flush with water after contact!
13) LITERATURE
1. “Identification of amino-terminal pro-C-type natriuretic peptide in human plasma”
T.C.R Prickett et al., Biochem. and Biophy. Res. Comm., 286, 513-517 (2001)
2. “Overexpression of CNP in chondrocytes rescues achondroplasia through a MAPK- dependent pathway”
Akihiro Yasoda et al., Nature Medicine, 10, 80-86 (Dez 2003)
3. “C-type natriuretic peptide in reproduction, pregnancy, and fetal development”
T. Walther et al. J. of Endo, 180,17-22 (2004)
6/24
1) EINLEITUNG
CNP gehört zur Familie der Natriuretischen Peptide, wie das Atrial Natriuretische (ANP) und Brain Natriuretische Peptid
(BNP) welche wichtige Biomarker und Regulationsmoleküle sind. Sie regulieren den Blutdruck und Flüssigkeitshaushalt und
modifizieren Wachstum und Entwicklung von Herzgewebe und Knochen. ANP und BNP sind Herzhormone, welche im
Atrium bzw. im Ventrikel gebildet werden und bei erhöhter Belastung des Herzens ausgeschüttet werden. Im Gegensatz zu
ANP und BNP wird CNP nur in geringem Umfang im Herzen produziert und stammt daher hauptsächlich aus Gehirn,
Hypophyse, vaskulärem Endothelium, den Nieren und den weiblichen Geschlechtsorganen.
Die Natriuretischen Peptide werden als Propeptide ausgeschüttet und dann in ein C-terminales Hormon (biologisch aktiv)
und in ein N-terminales Fragment (diese sind NT-proANP 1-98, NT-proBNP 1-76 und NT-proCNP, bei dem die Länge noch
diskutiert wird) gespalten. Die N-terminalen Fragmente sind stabiler und kommen in höheren Konzentrationen im Blut vor als
die aktiven Hormone. Aus diesem Grund sind die Fragmente analytisch leichter und reproduzierbarer erfassbar als die
Hormone. Daher haben wir einen Sandwich Immunoassay mit Antikörpern gegen die Epitope 1-19 und 30-50 von humanem
NT-proCNP entwickelt. CNP wird nicht nur im Zusammenhang mit Herzkrankheiten sondern auch beim Längenwachstum
von Knochen, Nierenerkrankungen, der Embryonalentwicklung und vaskulären Erkrankungen studiert.
Indikationen:




vaskuläre Erkrankungen
Diabetes
Knochenentwicklung
Sepsis
2) INHALT DES KITS
CONT
PLATE
WASHBUF
ASYBUF
STD
CTRL
CONJ
SUB
STOP
KIT KOMPONENTEN
Polyklonaler Schaf anti NT-proCNP Antikörper, beschichtet auf
Mikrotiterplatten-streifen im Streifenhalter, verpackt in einem Aluminiumbeutel
mit Trockenmittel
Waschpuffer, 20fach Konzentrat, durchsichtige Kappe
Verdünnungspuffer, rote Kappe, gebrauchsfertig
Standards, (0; 2,5; 5; 10; 20; 40 pmol/l), weiße Kappen, gebrauchsfertig
Kontrolle, gelbe Kappe, gebrauchsfertig, exakte Konzentration siehe Etikett
Konjugat, (anti NT-proCNP-HRPO), braune Kappe, gebrauchsfertig
Substrat (TMB Lösung), blaue Kappe, gebrauchsfertig
Stopplösung, weiße Kappe, gebrauchsfertig
MENGE
12 x 8 Teste
1 x 50 ml
1 x 10 ml
6 x 500 µl
1 x 500 µl
1 x 22 ml
1 x 22 ml
1 x 7 ml
3) ZUSÄTZLICHES MATERIAL IM KIT
 2 selbstklebende Abdeckfolien (Alufolie)
 QC Protokoll
 Protokollblatt
 Arbeitsanleitung (Beipacktext)
7/24
4) ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL UND GERÄTE
 Kalibrierte Präzisionspipetten für 50 µl, 200 µl, 300 µl, inkl. Pipettenspitzen
 Mikrotiterplattenphotometer mit 450 nm Filter (630 nm Referenz)
 Millimeterpapier oder Software
 Destilliertes oder deionisiertes Wasser
5) REAGENZIEN UND PROBENVORBEREITUNG
A lle Reagenzien des Kits sind bei +4°C (2-8°C) bis zum Ablaufdatum (siehe Etikett des Reagenz) stabil.
Probenvorbereitung:
ProCNP ist im Vollblut für mindestens 2,5h stabil. Dennoch empfehlen wir, die Plasma- oder Serumseparation durch
Zentrifugation so bald wie möglich durchzuführen (z.B. 20 min bei 2000 x g, vorzugsweise bei +4°C (2-8°C)). Die
gewonnenen Plasma- oder Serumproben sollten aliquotiert und bei -25°C oder tiefer (Langzeitlagerung) aufbewahrt werden.
Fünf Frier/Tau-Zyklen verursachen keine Verluste der Immunreaktivität in den Proben. Lipämische und hämolytische Proben
können falsche Ergebnisse liefern. Proben vor Verwendung gut mischen. Wir empfehlen Doppelbestimmungen. Bei Proben,
deren Messwert oberhalb des Messbereiches liegt, empfehlen wir diese mit ASYBUF (Verdünnungspuffer) zu verdünnen
(z.B.: 1+1 und 1+3) und erneut anzusetzen.
Nähere Informationen zur Probenstabilität finden Sie auf unserer Website unter www.bmgrp.com technical file oder Sie
kontaktieren unser Kundenservice, Email unter [email protected], Tel. unter +43/ 1/ 29107- 45.
Handhabung:
WASHBUF (Waschpuffer): Das mitgelieferte Konzentrat wird 1:20 (1+19) verdünnt (zB. 50 ml WASHBUF + 950 ml
destilliertes Wasser). Kristalle im Pufferkonzentrat lösen sich bei Raumtemperatur auf. Der verdünnte Puffer ist bei +4°C
(2-8°C) bis zum Ablaufdatum haltbar. Für die Testdurchführung darf nur verdünnter WASHBUF (Waschpuffer) verwendet
werden.
6) TESTPRINZIP
Siehe Kapitel 6) PRINCIPLE OF THE ASSAY im englischen Teil des Beipacktextes
7) TESTPROTOKOLL
Im Test dürfen nur Reagenzien und Proben verwendet werden, welche Raumtemperatur (18-26°C) aufweisen.
Markieren Sie die Positionen für BLANK/STD/PROBE/CTRL (Leerwert/Standard/Probe/Kontrolle) am Protokollblatt.
Nehmen Sie die benötigten Mikrotiterstreifen aus dem Aluminiumbeutel. Mindestens 1 Well für den Leerwert
reservieren. Nicht verwendete Mikrotiterstreifen können mit Trockenmittel im Aluminiumbeutel bis zum angegebenen
Ablaufdatum gelagert werden.
1. Pipettieren Sie 50 µl STD/PROBE/CTRL (Standard/Probe/Kontrolle) in Doppelbestimmung in die Mikrotiterstreifen,
mit Ausnahme des Leerwertes.
2. Pipettieren Sie 200 µl CONJ (anti NT-proCNP-HRPO) in alle Wells mit Ausnahme des Leerwertes, gut mischen.
3. Streifen abdecken und 4 Stunden bei Raumtemperatur (18-26°C) im Dunkeln inkubieren.
4. Inhalt der Wells verwerfen und 5x mit 300 µl verdünntem WASHBUF (Waschpuffer) waschen. Nach dem letzten
Waschschritt Reste von Waschpuffer durch Ausklopfen auf saugfähigem Papier entfernen.
5. Pipettieren Sie 200 µl SUB (Substrat) in alle Wells.
6. 30 Minuten bei Raumtemperatur (18-26°C) im Dunkeln inkubieren.
7. Pipettieren Sie 50 µl STOP (Stopplösung) in alle Wells.
8. Sofort die Extinktion bei 450 nm messen, falls möglich 630 nm als Referenz verwenden.
8/24
8) BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
M essen Sie die optische Dichte (OD) von allen Wells mit einem Mikrotiterplattenphotometer mit einem 450 nm Filter
(Referenz 630 nm). Die OD des Leerwertes ist von den Werten der STD, CTRL und Proben abzuziehen. Konstruieren Sie
eine Standardkurve aus den OD Werten der STD unter Verwendung von kommerziell erhältlichem Millimeterpapier oder
einer geeigneten Software. Das Testsystem wurde evaluiert mit einem 4 Parameter Algorithmus. Andere Auswerte
Algorithmen müssen vom Verwender evaluiert werden. Die Konzentration der Proben wird aus der Standardkurve
abgelesen. Eventuelle weitere Verdünnungen müssen berücksichtigt werden.
Typische STD-Kurve:
Siehe Kapitel 8) CALCULATION OF RESULTS im englischen Teil des Beipacktextes
Auf dem beigepackten QC Protokoll sind die Resultate bei der QC Freigabe des Kits vermerkt. Vom Verwender erhaltene
Daten der OD können abweichend sein, bedingt durch verschiedene Einflüsse und/oder dem normalen Signalverlust des
Kits während der Laufzeit. Dieser mögliche Signalverlust hat keinen Einfluss auf die Gültigkeit der Resultate, so lange die
OD des höchsten Standards den Wert 1,50 oder höher erreicht und der Wert der CTRL im gültigen Bereich ist (Bereich siehe
Etikett).
9) TESTMERKMALE
Werte von anscheinend
gesunden Spendern bzw.
Panel Krankenhaus:
Standardbereich:
Umrechnungsfaktor pg/ml zu
pmol/l:
Probenvolumen:
Detektionsgrenze:
Inkubationszeiten:
Kreuzreaktivitäten
Serum, anscheinend gesunde Spender: 2,7 pmol/l (median, n=42)
Serum, Panel Krankenhaus: 2,8 pmol/l (median, n=23)
EDTA Plasma, Panel Krankenhaus: 3,0 pmol/l (median, n=25)
Jeder Verwender sollte den Normalbereich seiner Proben evaluieren.
0 – 40 pmol/l
1pg/ml = 0,151 pmol/l (bezogen auf rekombinant proCNP 1-64)
50 µl Serum oder Plasma
(0 pmol/l + 3 SD): 0,2 pmol/l
4 Stunden / 30 Min
Nicht ermittelt, Homologien zu anderen Spezies bezogen auf die benutzten Epitope:
Epitop 1: Ratte (88%), Schaf (94%), Schwein (94%), Maus (88%), Rind (88%)
Epitop 2: Ratte (95%), Schaf (90%), Schwein (95%), Maus (95%), Rind (90%)
Nähere Informationen zu den Testmerkmalen finden Sie auf unserer Website unter www.bmgrp.com technical file oder Sie
kontaktieren unser Kundenservice, Email unter [email protected], Tel. unter +43/ 1/ 29107-45
10) PRÄZISION
Intra-Assay: 2 Proben wurden 5 mal in einem Test von 1 Operator getestet.
Inter-Assay: 2 Proben wurden 30 mal in 3 verschiedenen Lots von 4 verschiedenen Operatoren getestet
Intra-Assay (n=5)
Mean (pmol/l)
SD (pmol/l)
CV%
Sample 1
5,1
0,26
5%
Sample 2
20,0
1,17
6%
Inter-Assay (n=30)
Mean (pmol/l)
SD (pmol/l)
CV%
Sample 1
5,0
0,07
1%
Sample 2
20,0
0,15
1%
11) TECHNISCHE MERKMALE
 Reagenzien von verschiedenen Lots oder Testen dürfen nicht gemischt werden.
 Stöpsel oder Verschlüsse von verschiedenen Reagenzien dürfen nicht vertauscht werden.
 Abgelaufene Reagenzien dürfen nicht verwendet werden.
 Reagenzien sind vor direktem Sonnenlicht zu schützen.
 Substratlösung muss vor Verwendung farblos sein.
 Mikrotiterstreifen müssen bei den Inkubationen mit Abdeckfolie abgedeckt sein.
 Vermeiden Sie Schaumbildung beim Mischen der Reagenzien.
9/24
12) VORSICHTSMASSNAHMEN
Alle Bestandteile humanen Ursprunges wurden mit Testen der 3. Generation auf HIV-Ak und HBsAg getestet und negativ
gefunden. Trotzdem sollten die Reagenzien als potentiell infektiös behandelt werden.
Die flüssigen Reagenzien enthalten ≤ 0,1% Proclin 300 als Konservierungsmittel.
Proclin 300 ist in der verwendeten Konzentration nicht toxisch. Vermeiden Sie Kontakt mit Augen, Haut und Schleimhaut.
Allergische Reaktionen sind möglich.
 Nicht mit dem Mund pipettieren.
 Nicht Rauchen, Essen, Trinken oder Kosmetika benutzen während der Verwendung der Testreagenzien.
 Verwenden Sie Handschuhe zur Vermeidung jedes Kontaktes mit Reagenzien.
 Die Stopplösung enthält Schwefelsäure, welche bei Kontakt die Augen und Haut reizen kann. Bei Berührung gründlich
mit Wasser spülen.
13) LITERATUR
Siehe Kapitel 13) LTERATURE im englischen Teil des Beipacktextes.
10/24
1) INTRODUCTION
Le CNP est membre d’un groupe bien caractérisé de peptides natriurétiques, tels que le peptide natriurétique atrial (ANP)
et le peptide natriurétique cérébral (BNP), qui jouent divers rôles essentiels en tant que mécanismes de régulation et
marqueurs biologiques. Ils participent à la régulation de la pression sanguine et à l’homéostasie hydrique de l’organisme et
modifient la croissance et le développement des tissus cardio-vasculaires et des os. L’ANP et le BNP sont des hormones
cardiaques sécrétées par les oreillettes et les ventricules, respectivement, dans le cœur normal de l’adulte. Contrairement à
l’ANP et au BNP, le tissu cardiaque produit très peu de CNP, qui est principalement exprimé dans le cerveau, l’hypophyse,
l’endothélium vasculaire, le rein et l’appareil reproducteur de la femme.
Tous les peptides natriurétiques sont produits sous forme de propeptides, ultérieurement segmentés en hormone Cterminale biologiquement active et en fragment N-terminal (NT-proANP 1-98, NT-proBNP 1-76 et NT-proCNP, dont la
séquence fait toujours l’objet de discussions). Ces fragments N-terminaux étant bien plus stables et circulant en quantités
plus élevées que les hormones actives, leur mesure dans le sérum ou le plasma est plus aisée et plus fiable. Nous avons
donc développé un immunodosage type sandwich pour le NT-proCNP à l’aide d’anticorps dirigés contre les acides aminés 119 et 30-50. Le rôle physiologique du CNP est non seulement étudié dans les pathologies cardiaques, mais également dans
la biologie du développement osseux, généralement dans la recherche sur l’os, les maladies rénales, la recherche sur le
développement embryonnaire et les pathologies vasculaires.
Indications:
 pathologie vasculaire
 diabète
 développement du squelette
 sepsis
2) CONTENU DE LA TROUSSE
CONT
COMPOSANTS DE LA TROUSSE
barrettes de microtitrage revêtues d’anticorps polyclonal de mouton anti
PLATE
NT-proCNP avec portoir pour barrettes dans un sac alu avec dessiccateur
WASHBUF
Tampon de lavage, concentré 20x, bouchon neutre
ASYBUF
Tampon de dosage, bouchon rouge, prêt à l’emploi
STD
Standards, (0; 2.5; 5; 10; 20; 40 pmol/l), bouchon blanc, prêt à l’emploi
Contrôle, prêt à l’emploi, bouchon jaune; voir l’étiquette pour la concentration
CTRL
exacte
CONJ
Conjugué, (anti NT-proCNP- HRPO), bouchon orange, prêt à l’emploi
SUB
Substrat (solution TMB), bouchon bleu, prêt à l’emploi
STOP
Solution STOP, bouchon blanc, prête à l’emploi
QUANTITE
12 x 8 tests
1 x 50 ml
1 x 10 ml
6 x 500µl
1 x 500µl
1 x 22 ml
1 x 22 ml
1 x 7 ml
3) AUTRE MATERIEL INCLUS DANS LA TROUSSE
 2 bandes de film plastique adhésif (feuille d’aluminium)
 Protocole Qualité
 Feuille de protocole
 Manuel d’utilisation
4) MATERIEL ET EQUIPEMENT NECESSAIRE MAIS NON FOURNI
 Pipettes de précision calibrées pour délivrer de 50 µl, 200 µl, 300 µl et embouts jetables
 Lecteur de microplaques ELISA pour la mesure de l’absorbance à 450 nm (référence 630 nm)
 Papier millimétré pour le calcul des résultats
 Eau distillée ou désionisée
11/24
5) PREPARATION DES REACTIFS ET DES ECHANTILLONS
T ous les réactifs de la trousse restent stables à +4°C (2-8°C) jusqu’à la date de péremption (voir étiquette du réactif).
Préparation des échantillons:
Le proCNP des échantillons de sang fraîchement collectés est stable pendant au moins 2h30 à température ambiante.
Nous recommandons néanmoins d’effectuer une séparation du plasma ou du sérum par centrifugation dès que possible (par
ex., 20 min à 2 000 x g, de préférence à +4°C (2-8°C)). Après les avoir aliquotés, conserver les échantillons de plasma ou
de sérum acquis à moins 25°C ou plus bas. Les échantillons peuvent être soumis à 5 cycles de congélation / décongélation
sans perte de réaction immunitaire. Les échantillons lipémiques ou hémolysés peuvent fournir des résultats erronés. Les
échantillons doivent être bien mélangés avant le dosage. Nous recommandons de pratiquer les dosages en double pour
toutes les valeurs. Si les échantillons indiquent une valeur plus élevée que le standard supérieur, nous recommandons leur
dilution avec l’ASYBUF (Tampon de dilution) (par ex. : au 1+1 ou 1+3) et d’effectuer une nouvelle mesure des échantillons.
Vous trouverez de plus amples informations sur la stabilité des échantillons en consultant notre site web à l’adresse
www.bmgrp.com technical file ou contactez notre service clientèle à l’adresse email [email protected], ou en
composant le numéro de téléphone +43/1/29107-45.
Manipulation:
WASHBUF (Tampon de lavage): Diluer le concentré à 1:20 (1 + 19). Par exemple, 50 ml de WASHBUF + 950 ml d’eau
distillée. Les cristaux dans le concentré de lavage se dissoudront à température ambiante. Le tampon reste stable à +4°C
(2-8°C) jusqu’à la date de péremption mentionnée sur l’étiquette. Utiliser uniquement du WASHBUF (Tampon de lavage)
dilué pour l’exécution du dosage.
6) PRINCIPE DU DOSAGE
Voir au chapitre 6) PRINCIPLE OF THE ASSAY de la version anglaise de la notice.
7) PROTOCOLE DU DOSAGE
Tous les réactifs et échantillons doivent être portés à température ambiante (18-26°C) avant leur utilisation dans le
dosage.
Marquer la position du BLANK/STD/SAMPLE/CTRL (Blanc/Standard/Echantillon/Contrôle) sur la feuille du protocole.
Sortir les barrettes de microtitrage du sac alu, marquer au minimum un puits comme Blanc. Conserver les barrettes
non-utilisées avec le dessiccateur à +4°C (2-8°C) dans le sac alu jusqu’à la date d’expiration.
1. Ajouter 50 µl de STD/SAMPLE/CTRL (Standard/Echantillon/Contrôle) en double dans chaque puits, sauf le blanc.
2. Ajouter 200 µl de CONJ (anti NT-proCNP-HRPO) dans chaque puits, sauf le blanc, puis agiter doucement.
3. Couvrir hermétiquement et incuber pendant 4 heures à température ambiante (18-26 °C) à l’abri de la
lumière.
4. Aspirer et laver 5 fois les puits avec 300 µl de WASHBUF (Tampon de lavage) dilué. Après le dernier lavage, taper
la plaque contre une serviette afin d’enlever les dernières gouttes de WASHBUF.
5. Ajouter 200 µl de SUB (Substrat) dans chaque puits.
6. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante (18-26 °C) dans le noir.
7. Ajouter 50 µl de STOP (Solution stop) dans chaque puits.
8. Mesurer immédiatement l’absorbance à 450 nm avec une référence à 630 nm, si possible.
12/24
8) CALCUL DES RESULTATS
M esurez la densité optique (DO) de chaque puits avec un photomètre pour microplaques à filtre de 450 nm (Référence
630 nm). Soustraire l’absorbance du blanc des valeurs STD, CTRL et des échantillons. Construire la courbe d’étalonnage à
partir des valeurs des étalons, utilisant du papier millimétré vendu couramment dans le commerce ou un logiciel prévu à cet
effet. Le système de dosage a été évalué avec un algorithme à quatre paramètres (4PL). Des algorithmes d’évaluation
différents doivent être évalués par l’utilisateur. La concentration des échantillons devra être reportée sur la courbe
d’étalonnage. Tenir compte des facteurs de dilution respectifs.
Courbe STD typique:
Voir au chapitre 8) CALCULATION OF RESULTS dans la version anglaise de la notice d’utilisation.
Le protocole de contrôle qualité fourni avec la trousse présente les résultats du dernier contrôle qualité de chaque trousse.
Les données de densité optique obtenues par les utilisateurs peuvent être différentes suite à diverses influences et/ou à la
perte de signal que l’on constate pendant la durée de vie d’une trousse. Cependant, cette perte de signal éventuelle n’a pas
d’incidence sur la validité des résultats, à partir du moment où la DO de l’étalon ayant la concentration la plus élevée est au
moins égale à 1,50 et que la valeur de CTRL est située dans une plage acceptable (pour la plage, voir l’étiquette).
9) CARACTERISTIQUES DU DOSAGE
Gamme des valeurs
Sérum, prévisionnel normales: médiane = 2.7 pmol/l (n=42)
prévisionnel normales,
Sérum, hôpital panel: médiane = 2.8 pmol/l (n=23)
hôpital panel:
EDTA-plasma, hôpital panel: médiane = 3,0 pmol/ ( n=25)
Chaque laboratoire doit établir sa propre gamme de valeurs normales.
Gamme standard:
0 – 40 pmol/l
Facteur de conversion:
1pg/ml = 0.151 pmol/l (en référence recombinante proCNP 1-64)
Volume de l’échantillon:
50 µl sérum ou plasma humain
Limite de detection:
(0 pmol/l + 3 SD): 0.2 pmol/l
Temps d’incubation:
4 heures / 30 min
Non déterminée, homologie avec d’autres espèces pour les épitopes utilisés dans ce
Réaction croisée:
dosage:
Epitope 1 : rat (88 %), mouton (94 %), cochon (94 %), souris (88 %), bovin (88 %)
Epitope 2 : rat (95 %), mouton (90 %), cochon (95 %), souris (95 %), bovin (90 %)
Vous trouverez de plus amples informations sur la stabilité des échantillons en consultant notre site web à l’adresse
www.bmgrp.com technical file ou contactez notre service clientèle à l’adresse email [email protected], ou en
composant le numéro de téléphone +43/1/29107-45.
10) PRECISION
Précision intra-série : 2 échantillons ont été testés 5 fois d’un opérateur d’un essai
Précision inter-séries : 2 échantillons ont été testés 30 fois d’un 4 opérateur d’un 3 essai
Intra-Essai (n=5)
Echantillo 1 Echantillo 2
Inter-Essai (n=30)
Echantillo 1
Moyenne (pmol/l)
5.1
20.0
Moyenne (pmol/l)
5.0
SD (pmol/l)
0.26
1.17
SD (pmol/l)
0.07
CV%
5%
6%
CV%
1%
Echantillo 2
20.0
0.15
1%
11) CONSEILS TECHNIQUES
 Ne pas remplacer ou mélanger les réactifs qui sont fournis avec ce kit avec ceux de lots ou de sources différents.
 Ne pas mélanger les embouts ou bouchons de réactifs différents, ni utiliser les réactifs d’autres lots.
 Ne pas utiliser les réactifs au-delà de leur date d’expiration.
 Protéger les réactifs contre la lumière.
 Les solutions d’amplificateur doivent être incolores.
 Pour obtenir les résultats fiables, il est essentiel de sceller correctement la microplaque pendant les étapes d’incubation.
 Eviter de faire mousser les réactifs lors du mélange.
13/24
12) PRECAUTIONS
Les produits d’origine humaine utilisés dans ce test ont été testés avec les essais de troisième génération contre le VIHAb et l’AgHbs et ont été trouvés négatifs. Cependant, ils doivent être manipulés comme étant susceptibles de transmettre
des maladies infectieuses. Réactifs liquides contenant comme conservateur du Proclin en concentration ≤ 0,1%. Eviter tout
contact avec la peau et la muqueuse. Proclin 300 n’est pas toxique dans les concentrations utilisées dans cette trousse.
Cependant, il peut entraîner les réactions allergiques et tout contact avec la peau ou les yeux doit être évité.
 Ne pas pipetter avec la bouche.
 Ne pas manger, boire, fumer, ni appliquer les produits cosmétiques pendant la manipulation des réactifs.
 Porter les gants pour éviter tout contact avec les réactifs.
 L’acide sulfurique irrite les yeux et la peau. Laver avec de l’eau en cas de contact. Eviter le contact avec la peau et les
muqueuses. Les irritations sont possibles. Laver avec de l’eau en cas de contact !!
13) LITERATURE
Voir au chapitre 13) LITERATURE dans la version anglaise de cette notice.
14/24
1) INTRODUZIONE
Il CNP appartiene al ben caratterizzato gruppo dei pepidi natriuretici, quali il peptide natriuretico atriale (ANP) e il peptide
natriuretico cerebrale (BNP), manifestano importanti funzioni regolatorie e come bio-marcatori. Partecipano alla regolazione
della pressione sanguigna e dell’omeostasi dei fluidi corporei, modificano la crescita e lo sviluppo del tessuto cardiovascolare
e dell’osso. ANP e BNP sono ormoni cardiaci, secreti rispettivamente da atrio e ventricolo nel cuore degli adulti.
Diversamente da ANP e BNP, il CNP è prodotto in quantità molto piccola dal tessuto cardiaco, mentre è principalmente
espresso nel cervello, ghiandola pituitaria, endotelio vascolare, rene e tratto riproduttivo femminile.
Tutti i peptidi natriuretici sono prodotti come pro-peptidi, i quali sono successivamente scissi nell’ormone C-terminale,
biologicamente attivo, e nel frammento N-terminale (NT-proANP 1-98, NT-proBNP 1-76 e NT-proCNP, la cui lunghezza è
tutt’ora non ben definita). Poichè questi frammenti N-terminali sono nettamente più stabili e circolano nel sangue in
concentrazione maggiore rispetto agli ormoni attivi, risulta più facile e pratica la loro determinazione su siero o plasma.
Perciò Biomedica ha sviluppato un immunodosaggio tipo sandwich per NT-proCNP che utilizza anticorpi diretti contro gli
amminoacidi 1-19 e 30-50. Il ruolo fisiologico del CNP non è argomento di studio solo per quanto riguarda le cardiopatie, ma
anche per la biologia legata allo sviluppo dell’osso, specialmente nel settore ricerca sull’osso, alle nefropatie, alla ricerca
sullo sviluppo embrionale e sulle malattie vascolari.
Indicazioni del dosaggio
 malattie vascolari
 diabete
 sviluppo scheletrico
 Sepsi
2) CONTENUTO DEL KIT
CONT
PLATE
WASHBUF
ASYBUF
STD
CTRL
CONJ
SUB
STOP
COMPONENTI DEL KIT
Strip di microtitolazione pre-rivestite di anti NT-proCNP di pecora e cornice
per le strip, confezionate in busta con dessiccante
Tampone di lavaggio concentrato 20x, tappo non colorato
Tampone di dosaggio, tappo rosso, pronto all’uso
Standard, (0; 2.5; 5; 10; 20; 40 pmol/l), tappo bianco, pronto all’uso
Controllo, tappo giallo, pronto all’uso, vedere l’etichetta per l’esatta
concentrazione
Coniugato, (anti NT-proCNP-HRPO), tappo ambrato, pronto all’uso
Substrato (soluzione di TMB), tappo blu, pronto all’uso
Soluzione di arresto, tappo bianco, pronta all’uso
MENGE
12 x 8 test
1 x 50 ml
1 x 10 ml
6 x 500 µl
1 x 500 µl
1 x 22 ml
1 x 22 ml
1 x 7 ml
3) ALTRO MATTERIALE AGGIUNTO AL KIT
 2 copripiastra auto-adesivi
 Protocollo QC
 Protocol sheet
 Manuale di istruzioni d’uso
4) MATERIALE ED EQUIPAGGIAMENTO RICHIESTO MA NON FORNITO
 Micropipette di precisione calibrate per volumi di 50 µl, 200 µl, 300 µl e puntali monouso
 Lettore di micropiastre ELISA con filtro a 450 nm (riferimento a 630 nm)
 Carta per grafici o software per il calcolo dei risultati
 Acqua distillata o deionizzata
15/24
5) PREPARAZIONE DEI CAMPIONI E DEI REATTIVI
I reattivi contenuti nel kit sono stabili a +4°C (2-8°C) fino alla data riportata sull’etichetta di ciascun flacone.
Preparazione dei campioni
Il proCNP nei prelievi di sangue fresco è stabile per circa 2,5 ore a temperatura ambiente. Si consiglia, quindi, di separare
il plasma o il siero per centrifugazione (es. 20 min. a 2000 x g preferibilmente a +4°C (2-8°C)) nel più breve tempo possibile
dopo il prelievo. Aliquotare i campioni di plasma o siero e conservarli a -25°C o temperature inferiori. I campioni possono
essere soggetti a 5 cicli di congelamento-scongelamento senza perdere la loro attività. Campioni lipemici o emolizzati
possono dare risultati errati. Rendere ben omogenei i campioni prima del dosaggio. Si consiglia di eseguire i dosaggi in
doppio. Se la lettura di un campione è superiore rispetto a quella dello standard a concentrazione maggiore, diluirlo con
ASYBUF (tampone per diluizioni) (es. 1+1 e 1+3) e ridosarlo.
Per ulteriori informazioni sulla stabilità dei campioni si prega di visitare il sito web www.bmgrp.com technical file o il
distributore autorizzato locale.
Modalità di ricostituzione dei reattivi:
WASHBUF (Tampone di lavaggio): Diluire il tampone concentrato 1:20 (1+19): ad es. 50 ml WASHBUF + 950 ml acqua
distillata. I cristalli eventualmente presenti nel tampone concentrato, si disciolgono a temperatura ambiente. Il tampone diluito
è stabile a +4°C (2-8°C) fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta. Utilizzare solo il WASHBUF (Tampone di lavaggio)
diluito durante l’esecuzione del dosaggio.
6) PRINCIPIO DEL DOSAGGIO:
Vedi capitolo
6) PRINCIPLE OF THE ASSAY delle istruzioni in lingua inglese.
7) PROTOCOLLO DI DOSAGGIO
Portare tutti i reattivi e i campioni a temperatura ambiente (18-26°C) prima di usarli per il dosaggio.
Evidenziare la posizione di BIANCO/STD/CAMPIONE/CTRL (Bianco/Standard/Campione/Controllo) sul protocol sheet.
Togliere le strip della micropiastra dalla confezione, considerare almeno un pozzetto per il Bianco. Conservare le strip
inutilizzate con il dessiccante a +4°C (2-8°C) nella canfezione fino alla data di scadenza.
1. Aggiungere 50 µl di STD/CAMPIONE/CTRL (Standard/Campione/Controllo) in doppio nei corrispondenti pozzetti,
ad eccezione del bianco.
2. Aggiungere 200 µl di CONJ (anti NT-proCNP-HRPO) in ciascun pozzetto, ad eccezione del bianco, picchiettare
delicatamente la micropiastra.
3. Coprire bene con il copripiastra adesivo e incubare per 4 ore a temperatura ambiente (18-26°C) al buio.
4. Aspirare e lavare i pozzetti 5x con 300 µl di WASHBUF (Tampone di lavaggio) diluito, togliere il WASHBUF
restante picchiettando la micropiastra su carta assorbente dopo l’ultimo lavaggio.
5. Aggiungere 200 µl di SUB (Substrato) in tutti i pozzetti.
6. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (18-26°C) al buio.
7. Aggiungere 50 µl di STOP (soluzione di arresto) in tutti i pozzetti.
8. Misurare subito l’assorbanza a 450 nm con riferimento a lunghezza d’onda di 630 nm, se possibile
8) CALCOLO DEI RISULTATI
L eggere la densità ottica (OD) di tutti i pozzetti con un lettore di micropiastre utilizzando la lunghezza d’onda 450 nm
(correzione con lunghezza d’onda 630 nm). Sottrarre l’OD del bianco da quella di STD, CTRL e campioni. Costruire la curva
standard dai valori OD degli standard. Per l’elaborazione dei dati, utilizzare un programma computerizzato o carta
millimetrata. Calcolare la concentrazione dei campioni da questa curva standard. Il test è stato valutato con l’interpolazione a
4 parametri. Sistemi di interpolazione differenti devono essere convalidati dagli utilizzatori. Tenere conto dei fattori di
diluizione.
16/24
Typical STD-curve:
Vedi capitolo 8) CALCULATION OF RESULTS in lingua inglese.
Il foglio di controllo di qualità fornito insieme al kit mostra i risultati ottenuti al rilascio finale di ogni kit dal Controllo di
Qualità (QC). I valori di densità ottica ottenuti dagli utilizzatori possono essere differenti a causa di vari fattori e/o alla
diminuzione nell'intensità del segnale derivata dal decadimento naturale del kit.
In ogni caso, questo aspetto non incide sulla validità dei risultati finché la densità ottica del calibratore con la concentrazione
più alta, sia superiore a 1.50.
9) CARATTERISTICHE DEL DOSAGGIO
Siero, apparentemente sani: 2,7 pmol/l (mediana, n=42)
Valori da individui
Serum, ospedale panel: 2,8pmol/l (mediana, n=23)
apparentemente sani,
EDTA plasma, ospedale panel: 3,0 pmol/l (mediana, n=25)
ospedale panel:
Si raccomanda che ciascun laboratorio stabilisca i propri valori di normalità.
Range standard:
0 – 40 pmol/l
Fattore di conversione:
1pg/ml = 0.151 pmol/l (riferirsi a recombinante proCNP 1-64)
Volume di campione:
50 µl di siero a plasma umani
Sensibilità:
(0 pmol/l + 3 SD): 0.2 pmol/l
Tempo di incubazione:
4 ore / 30 min
Cross reattività:
Non determinata, omologie con altre specie per quanto riguarda gli epitopi utilizzati:
Epitopo 1: ratto (88%), pecora (94%), maiale (94%), topo (88%), bovino (88%)
Epitopo 2: ratto (95%), pecora (90%), maiale (95%), topo (95%), bovino (90%)
Per ulteriori informazioni sulla caratteristiche del dossago si prega di visitare il sito web www.bmgrp.com technical file o il
distributore autorizzato locale.
10) PRECISIONE
Intra-Saggio: 2 campioni a sono stati dosati 5 volte per valutare la precisione intra-saggio.
Inter-Saggio: 2 campioni a sono stati dosati in 30 esperimenti diversi 3 lots un 4 eteronimo operators per valutare la
precisione inter-saggio.
Campioni 1 Campioni 2
Campioni 1 Campioni 2
Inter-saggio (n=30)
Intra-saggio (n=5)
Media (pmol/l)
5,0
20,0
Media (pmol/l)
5,1
20,0
SD (pmol/l)
0,07
0,15
SD (pmol/l)
0,26
1,17
CV%
1%
1%
CV%
5%
6%
11) ACCORGIMENTI TECNICI
 Non mescolare o sostituire i reattivi di lotti differenti.
 Non mescolare tra loro i tappi di differenti reattivi.
 Non usare reattivi oltre la loro data di scadenza. Proteggere i reattivi dalla luce solare diretta.
 La soluzione di substrato deve restare incolore fino all’aggiunta nei pozzetti della micropiastra.
 Per assicurare l’ottenimento di risultati accurati, far aderire bene il copripiastra adesivo durante le incubazioni.
 Evitare la formazione di schiuma nel mescolare i reattivi.
17/24
12) PRECAUZIONI
Tutti i componenti del kit di origine umana sono stati testati con dosaggi di 3a generazione per HIV-Ab e HBsAg e sono
risultati essere negativi. Nonostante ciò, tali componenti devono essere manipolati e smaltiti come materiale potenzialmente
infetto. I reagenti liquidi contengono una percentuale ≤ 0.1% di Proclin 300 come conservante.
La sodio azide è tossica! Evitare il contatto con la pelle e le mucose. Il Proclin 300 non è tossico nelle concentrazioni
utilizzate in questo kit. Può causare reazioni cutanee di tipo allergico – evitare il contatto con la pelle o gli occhi.
 Non pipettare a bocca.
 Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nei luoghi dove sono manipolati i reattivi.
 Evitare qualsiasi contatto con i reattivi utilizzando guanti monouso.
 La soluzione di arresto contiene acido solforico. L’acido solforico è irritante per gli occhi e la pelle. Lavare con acqua in
caso di contatto. Evitare il contatto con la pelle e le mucose. Possibili irritazioni. Lavare con acqua dopo il contatto!
13) BIBLIOGRAFIA
Vedi capitolo 13) LITERATURE delle istruzioni in lingua inglese.
18/24
1) INTRODUCCION
El CNP pertenece a un grupo de péptidos natriuréticos bien caracterizados del tipo del péptido natriurético atrial (ANP) y
del péptido natriurético cerebral (BNP), los cuales juegan varios importantes papeles tanto en mecanismos de regulación
como actuando como biomarcadores. Participan en la regulación de la presión sanguínea y en la homeostasis de los fluidos
corporales, modifican el crecimiento y el desarrollo de los tejidos cardiovasculares y el hueso. El ANP y el BNP son
hormonas cardiacas secretadas por el atrio y ventrículos, respectivamente en un corazón adulto normal. A diferencia del
ANp y BNP el tejido cardiaco produce muy poca cantidad de CNP, pero se expresa principalmente en el cerebro, en la
glándula pituitaria, en el endotelio vascular en el riñón y en el tracto reproductivo femenino.
Todos los péptidos natriuréticos se producen como propeptidos, los cuales posteriormente se fragmentan en la hormona
C-terminal y en el fragmento N terminal, biológicamente activos (NT-pro ANP 1-98, NT-proBNP 1-76 y NT-proCNP cuya
longitud se encuentra actualmente en discusión). Debido a que los fragmentos N terminal son mucho más estables y
circulan en cantidades mucho mayores que las hormonas activas resulta más fácil y accesible realizar su cuantificación en
suero o plasma. Por esta razón se ha desarrollado un inmunoensayo de tipo sándwich para la detección de NT-proCNP
utilizando anticuerpo dirigidos frente a los aminoácidos 1-19 y 30-50. El papel fisiológico del CNP se estudia únicamente en
las enfermedades cardiacas, sino también en la fisiología del desarrollo óseo, en general en investigaciones sobre el hueso,
enfermedades renales, investigaciones sobre desarrollo embrionario y enfermedades vasculares.
Indicaciones
 Enfermedades vasculares.
 Diabetes
 Desarrollo esquelético.
 Sepsis.
2.) CONTENIDO DEL KIT
CONT
COMPONENTES DEL KIT
Tiras de micropocillos recubiertas de Anticuerpo Policlonal ovino anti-NT
PLACA
proCNP en un soporte, incluidas en bolsa de aluminio con desecante.
WASHBUF
Tampón de lavado, concentrado 20x, tapón transparente
ASYBUF
Tampón de ensayo, tapón rojo, listo para usar
STD
Estándares, (0; 2,5; 5; 10; 20; 40 pmol/l), tapón blanco, listo para usar
Control, tapón amarillo, listo para usar, ver la etiqueta para comprobar las
CTRL
concentraciones exactas.
CONJ
Conjugado, (anti-NT proCNP - HRPO), tapón ámbar, listo para usar
SUB
Substrato (solución de TMB), tapón azul, listo para usar
STOP
Solución de parada, tapón blanco, lista para usar
CANTIDAD
12 x 8 tests
1 x 50 ml
1 x 10 ml
6 x 500 µl
1 x 500 µl
1 x 22 ml
1 x 22 ml
1 x 7 ml
3) MATERIAL ADICIONAL INCLUIDO EN EL KIT
 2 tiras adhesivas de plástico
 Protocolo para el Control de calidad QC
 Hoja con el esquema del protocolo
 Manual de instrucciones
4) MATERIAL Y EQUIPAMIENTO REQUERIDO QUE NO SE SUMINISTRA
 Pipetas de precisión calibradas de 50 µl, 200 µl, 300 µl y puntas desechables.
 Lector de ELISA con capacidad para leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia 630 nm).
 Papel para representación gráfica o programa informático para el cálculo de los resultados.
 Agua destilada o desionizada.
19/24
5) PREPARACION DE LOS REACTIVOS Y DE LAS MUESTRAS
T odos los reactivos en el kit son estables a +4ºC (2-8ºC) hasta la fecha de caducidad establecida en la etiqueta de cada
reactivo.
Preparación de las muestras:
El Pro CNP es estable en las muestras de sangre recién extraídas durante al menos 2.5 horas a TA. Sin embargo, se
recomienda realizar una separación del plasma o del suero por centrifugación lo antes posible (ej; 20 min a 2000 xg,
preferentemente a +4ºC (2-8ºC)). Una vez realizada la separación del suero o el plasma, realizar alícuotas de la muestra y
almacenar a -25ºC o más bajo. Las muestras pueden someterse a 5 ciclos de congelación-descongelación sin pérdida de su
reactividad inmunológica. Las muestras con elevado contenido en lípidos o muy bemolizadas pueden conducir a resultados
erróneos. Las muestras deberían mezclarse correctamente antes de utilizarse en el ensayo. Se recomienda la
Realización de duplicados para todos los valores. Si las muestras arrojasen un valor superior al del estándar más elevado
se recomienda diluir con ASYBUF (tampón de dilución) (ej. 1+1 y 1+3) y someter nuevamente a ensayo.
Para información adicional sobre estabilidad de la muestra por favor visite nuestra página web www.bmgrp.com
technical file o contacte con nuestro Servicio al cliente por e -mail [email protected] o por teléfono
+43/1/29107-45.
Reconstituir como se indica:
WASHBUF (tampón de lavado): Diluir el concentrado 1:20 (1+19) ej 50 ml WASHBUF + 950 ml de agua destilada. Los
cristales en el tampón concentrado s disuelven a temperatura ambiente. El tampón es estable a +4ºC (2-8ºC) hasta la fecha
de caducidad que se indica en la etiqueta. Utilizar únicamente WASHBUF diluido (tampón de lavado) para la realización del
ensayo.
6) PRINCIPIO DEL ENSAYO
V er capítulo 6) PRINCIPLE OF THE ASSAY de la versión inglesa del manual de instrucciones del ensayo.
7) PROTOCOLO DEL ENSAYO
Todos los reactivos y las muestras deben alcanzar la temperatura ambiente (18-26°C) antes de su utilización en el
ensayo.
Marcar la posición para el BLANC/STD/ MUES/CTRL (Blanco/ Estándar/ Muestras/Control) en la hoja del esquema de
la placa.
Sacar las tiras de la bolsa de aluminio, y emplear como mínimo un pocillo como blanco. Las tiras de los pocillos no
utilizadas pueden almacenarse en la bolsa de aluminio junto con el desecante a +4ºC (2-8ºC) hasta la fecha de
caducidad.
1. Añadir 50 µl de STD/SAMPLE/CTRL (estándar / muestra/control) por duplicado a los pocillos respectivos, excepto
para el blanco.
2. Añadir 200 µl del CONJ (anti NT-proCNP-HRPO) en cada pocillo, excepto para el blanco, agitar suavemente .
3. Tapar con cuidado e incubar durante 4 horas a temperatura ambiente (18-26°C) en la oscuridad.
4. Aspirar y lavar los pocillos 5x con 300 µl de WASHBUF diluido (Tampón de lavado), eliminar el excedente de
WASHBUF golpeando la placa suavemente sobre papel absorbente después del último lavado.
5. Añadir 200 µl de SUB (Substrato) a cada pocillo.
6. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente (18-26ºC) en oscuridad.
7. Añadir 50 µl de STOP (solución de parada) a cada pocillo.
8. Medir la absorbancia inmediatamente a 450 nm y utilizar como referencia un filtro de 630 nm, si está disponible.
20/24
8) CALCULO DE RESULTADOS
L eer la densidad óptica (OD) de todos los pocillos en un lector de placas usando una longitud de onda de 450 nm
(corrección de longitud de onda a 630 nm). Restar el valor del blanco a los valores de los STD, CTRL y muestras. Realizar
una curva estándar a partir de los valores de las absorbancias de los estándares. Utilizar un programa informático o un
papel de representación gráfica. Obtener el valor de la concentración de la muestra a partir de la curva estándar. El ensayo
fue evaluado con un algoritmo de 4 PL. Los distintos métodos de ajuste de curvas empleados deben se evaluados por el
usuario. Se deben de considerar distintos factores de dilución.
Typical STD-curve:
V er capítulo 8) CALCULATION OF RESULTS del ensayo de la versión inglesa del manual de instrucciones del ensayo.
El certificado del control de calidad que se suministra con el kit muestra los resultados del último control de calidad para
cada kit en la fecha de producción. Los datos de la densidad óptica obtenidos por los clientes pueden diferir debido a
diversos factores y/o debido a una disminución normal de la intensidad de la señal lo largo de la vida media. Sin embargo,
esto no afecta a la validez de los resultados siempre que se obtenga un valor de 1,5 para la densidad óptica del estándar de
concentración más elevada y que el valor del CTRL se encuentre en rango (rango del valor diana se encuentra en la
etiqueta).
9) CARACTERISTICAS DEL ENSAYO
Suero, individuos aparentemente sanos: 2,7 pmol/l (median, n=42)
Valores de individuos
Suero, hospital panel: 2,8pmol/l (median, n=23)
aparentemente sanos,
EDTA plasma, hospital panel: 3,0 pmol/l (median, n=25)
hospital panel:
Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de normalidad.
Rango estándar
0 a 40 pmol/l
Factor de conversión
1pg/ml = 0,151 pmol/l (la referencia recombinante proCNP 1-64)
Volumen de la muestra: 50 µl de suero o plasma humano
Límite de Detección
(0 pmol/l + 3 SD): 0,2 pmol/l
Tiempo de Incubación: 4 horas / 30 min
Reacciones Cruzadas
Sin determinar. Homología frente a otras especies para los epítopos utilizados en este ensayo:
Epítopo 1: rata (88%), oveja (94%), cerdo (94%), ratón (88%), bovino (88%)
Epítopo 2: rata (95%), oveja (90%), cerdo (95%), ratón (95%), bovino (90%)
Para más información en las características del ensayo por favor visite nuestra página web www.bmgrp.com technical file
o contacte con nuestro servicio de atención al cliente por e-mail [email protected] o por teléfono +43/1/29107-45.
10) PRECISION
Intra-Ensayo: Para valorar la precisión intra-ensayo se analizaron 5 replicados de 2 muestras de concentraciones
conocidas
Inter-Ensayo: Para valorar la precisión inter-ensayo se analizaron 2 muestras de concentraciones conocidas en 30
ensayos, 3 variosa lots, 4 varios operators
Inter-Ensayo (n=30)
Intra-Ensayo (n=5)
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 1
Muestra 2
Media (pmol/l)
5,0
20,0
Media (pmol/l)
5,1
20,0
SD (pmol/l)
0,07
0,15
SD (pmol/l)
0,26
1,17
CV%
1%
1%
CV%
5%
6%
21/24
11) OBSERVACIONES TECNICAS
 No mezclar o sustituir reactivos de diferentes lotes o fabricantes.
 No mezclar los tapones de los viales de diferentes reactivos o de reactivos de diferentes lotes.
 No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad.
 Proteger los reactivos de la acción directa de la luz solar.
 La solución de substrato debería permanecer incolora hasta que se añada a la placa.
 Para asegurar unos resultados más exactos, tapar la placa con el papel adhesivo durante los pasos de incubación.
 Evitar la formación de espuma cuando se mezclen los reactivos.
12) PRECAUCIONES
Todos los componentes de procedencia humana fueron testados con ensayos de 3ª generación frente a la presencia de
anticuerpos frente a VIH y al antígeno de superficie de la Hepatitis B con resultado negativo. Sin embargo, deberían
manipularse y eliminarse como si se tratara de material potencialmente infeccioso. Los reactivos líquidos contienen ≤ 0.1%
de Proclin 300 como conservante. La Proclina 300 no es tóxica en las concentraciones empleadas en este kit. Puede
provocar reacciones alérgicas en la piel, evitar el contacto con la piel ó los ojos.
 No pipetear con la boca.
 No comer o beber o aplicarse cosméticos en las zonas de manipulación de los reactivos.
 Evitar el contacto con los reactivos utilizando guantes. La solución de parada contiene ácido sulfúrico, y el contacto con
este componente puede producir irritación de los ojos y de la piel. Si tiene lugar un contacto, enjuagar con abundante
agua.
13) LITERATURA
Ver capítulo 13) LITERATURE
de la versión inglesa del manual de instrucciones del ensayo.
22/24
SYMBOLS
Expiry date / Verfallsdatum / Date de péremption / Data di scadenza /Fecha de caducidad / Data
de validade / Uiterste gebruiksdatum / Udløbsdato / Utgångsdatum / Termin Ważności / Lejárati
idő / Doba exspirácie / Doba exspirace
Consider instructions for use / Bitte Gebrauchsanweisung beachten / Consultez la notice
d'utilisation / Consultare le istruzioni per l'uso / Consulte las instrucciones de utilización / Consulte
as instruções de utilização / Raadpleeg de gebruiksaanwijzing / Se brugsanvisningen / Läs
anvisningarna före användning / Proszę przeczytać instrukcję wykonania / Vegyük figyelembe a
használati utasításban foglaltakat / Postupujte podľa pokynov na použitie / Postupujte dle návodu
k použití
In vitro Diagnostic Medical Device (for in Vitro Diagnostic Use)/ In vitro Diagnostikum (zur In-vitroDiagnostik) / Dispositif médical de diagnostic in vitro (Pour usage diagnostique in vitro) /
Dispositivo medico per diagnostica in vitro (per uso diagnostico in vitro) / Dispositivo médico de
diagnóstico in vitro (para uso diagnóstico in vitro) / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro
(Para utilização de diagnóstico "in vitro") / Medisch hulpmiddel voor diagnostiek in vitro (Voor
diagnostisch gebruik in vitro) / Medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik (Udelukkende til in vitro
diagnostisk anvendelse) / Medicinteknisk produkt avsedd för in vitro-diagnostik (För in vitrodiagnostiskt bruk) / Wyrób medyczny do Diagnostyki In Vitro / In vitro orvosdiagnosztikai termék /
In vitro diagnostický zdravotnícky materiál (určené pre diagnostiku „in vitro“) / In vitro diagnostický
zdravotnicky materiál (určeno pro diagnostiku „in vitro“)
Lot-Batch Number / Charge-Chargennummer / Lot-Code du lot / Lotto-Numero di lotto / LoteCódigo de lote / Lote-Código do lote / Lot-Partijnummer / Lot-Batchkode / Lot-Satskod / Numer
serii / Lot-Batch szám / Číslo šarže / Číslo šarže
Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por / Fabricado por /
Vervaardigd door / Fabrikation af / Tillverkad av / Wyprodukowane pr / Gyártotta / Vyrobené /
Vyrobeno
Catalogue Number / Bestellnummer / Numéro de référence / Numero di riferimento / Número de
referencia / Número de referência / Referentienummer / Referencenummer / Katalognummer /
Numer katalogowy / Katalógusszám / Katalógové číslo / Katalogové číslo
Store at between / Lagerung bei zwischen / Conserver à entre / Conservare a tra / Conservar a
temp. entre / Armazene a entre / Bewaar bij tussen / Opbevares mellem / Förvaras vid /
Przechowywać w / Tároljuk …… között / Skladujte v rozsahu / Skladujte v rozmezí
Contains sufficient for x tests / Inhalt ausreichend für x Tests / Contient suffisant pour x tests /
Contenuto sufficiente per x test / Contiene suficiente para x pruebas / Contém suficiente para x
testes / Bevat voldoende voor x bepalingen / Indeholder tilstrækkeligt til x prøver / Innehållet
räcker till x analyser / Zawartość na x testów / Tartalma X teszt elvégzésére elegendő / Obsahuje
materiál pre x testov / Obsahuje materiál pro x testů
23/24
BI-20872 NT-proCNP
ASSAY PROTOCOL AND CHECKLIST
PREPARATION OF REAGENTS:

Bring all reagents to room temperature (18-26°C).

Prepare reagents and samples as instructed.

Bring unused and prepared components to the storage temperature mentioned in the
package insert.

Take microtiter strips out of the aluminium bag and mark positions on the protocol sheet.
TEST PROCEDURE:

Step 1) Add 50 µl STD/ SAMPLE/ CTRL (standard/diluted sample/diluted control) into
each well, except blank.

Step 2) Add 200 µl CONJ (Conjugate) into each well, except blank, swirl gently.

Step 3) Cover tightly and incubate for 4 hours at room temperature (18-26°C) in the
dark.

Step 4) Aspirate and wash wells with 300 µl diluted WASHBUF (Wash buffer) five times.
Remove remaining buffer by hitting plate against paper towel.

Step 5) Add 200 µl SUB (Substrate) into each well.

Step 6) Incubate for 30 minutes at room temperature (18-26°C), in the dark.

Step 7) Add 50 µl STOP (Stop solution) into each well.

Step 8) Read optical density at 450 nm with reference 630 nm, if available.
24/24