Microscopía óptica de luz polarizada

Transcripción

MICROSCOPÍA
ÓPTICA
Dr. Enrique Ricart
Servicio Análisis Clínicos
Hospital Virgen de los Lirios. Alcoi
Sesión clínica
29 de Enero de 2010
MICROSCOPÍA ÓPTICA
? Principio:
física óptica geométrica.
? Visualización
de estructuras biológicas
(células) ó cristalinas mediante un
instrumento óptico:
? Células sin teñir
? Células teñidas
? Microcristales
Células sin teñir
?
M. O. Luz transmitida a campo claro.
?
M. O. Contraste de fase:
?
?
?
Las estructuras biológicas son sumamente transparentes a la luz visible. La técnica
introduce cambios de fase, que resultan de pequeñas diferencias en el índice de refracción
y en el espesor de las diferentes partes del objeto producidas en la luz que las atraviesa. Si
el índice de refracción del material es mayor al del medio tiene lugar una demora, que se
llama “cambio de fase”.
En un microscopio de contraste de fases: cada objetivo tiene un condensador determinado.
En el condensador hay un anillo que deja pasar la luz, su objetivo correspondiente tiene un
anillo que no deja pasar la luz. Se hacen coincidir ambos anillos y lo que se ve son clarososcuros dando una sensación de relieve al objeto.
Tipos del sistema de fases:
1.
2.
3.
Contraste fases de campo claro.
Fases
Campo de Fondo oscuro
Células sin teñir/microcristales
? M. O. Interferencia:
El que permite observar imágenes de interferencia entre rayos que
atraviesan la muestra y otros que no lo hacen.
? M. O. Fluorescencia primaria:
Permite observar la luz emitida por fluorescencia en la preparación
sometida a luz azul - violeta o ultravioleta. Se emplea especialmente en
el estudio de microorganismos y moléculas orgánicas.
? M. O. Polarización.
Células teñidas
Tipos de sistema de tinción:
?
1.
Estructurales:
?
?
?
?
?
2.
Hematoxilina-eosina
Tricrómico
May-Grundwald-Giemsa
Papanicolau
Panóptico
Químicas:
? Cualitativas: PAS, Enzimoquímicas, Inmunofluorescencia
? Cuantitativas: Azul Metileno, Feulgen
Microscopio óptico: conceptos-1
?
?
?
Instrumento óptico constituido por dos o más
lentes convergentes destinado a observar de
cerca objetos extremadamente pequeños.
La combinación de sus lentes produce el
efecto que la estructura que se mira aparezca
con
dimensiones
muy
aumentadas,
haciéndose perceptible lo que no es a simple
vista.
ES UN APARATO
DE PRECISIÓN.
Microscopio óptico: conceptos-2
?
El microscopio ha de ser binocular como mínimo, con platina
desplazable e iluminación incorporada.
?
Debe de tener condensador, oculares 10X y objetivos seco (40X)
y objetivo de inmersión en aceite (100X).
?
Parte del material (elementos formes) que vamos a observar es
prácticamente transparente:
•
•
?
El diafragma se debe de cerrar al mínimo.
Se debe bajar el condensador.
Debido a que muchos elementos formes son algo refractarios y
es difícil distinguirlos, debe cambiarse continuamente el enfoque
del microscopio.
Microscopio óptico: estructura
?
?
?
?
?
?
?
?
OCULAR
TUBO
OBJETIVOS
PLATINA
CONDENSADOR
PIÑÓN DE ENFOQUE
DIAFRAGMA DE CAMPO
SOPORTE DE FILTROS
OCULAR
?
Consta de una serie de lentes convergentes. Aamplía la imagen.
El número que lleva grabado indica el aumento del ocular: si se multiplica este
número por el coeficiente de aumento de un objetivo nos da el “aumento total” del
microscopio.
Si dividimos este número por el aumento del objetivo, se obtiene el “índice del
campo visual” (en mm), es decir, el diametro del campo visible en el plano del
objeto.
?
?
?
TUBO
?
Mono, Bi ó Triocular
?
PIE
?
?
Lámpara 6v/15w
PLATINA
?
?
?
En cruz
Giratoria
PIÑÓ
N DE ENFOQUE
PIÑÓN
?
?
Tornillos macro y micrométrico
?
OBJETIVOS:
?
?
?
Sistema de lentes convergentes
que forma una imagen real y
aumentada situada entre el
ocular y su foco (lámpara y
condensador).
Tipos: Plan, Pol, Ph, Ach.
Anillo de color:
Negro
aceite de
cedro
Blanco
agua
Anaranjado
glicerina
Amarillo
yoduro
metileno
Azul
Magenta
seco
Sin cubre
Inscripció
Inscripción en el objetivo
PlanC N
40
0.65
160/8
Acromático plano
Coeficiente de aumento 40x
Apertura numérica
Debe utilizarse con un tubo cuya longitud
sea 160 mm
Ph1
Condensador contraste fases 1
0.17
Cubreobjetos de un espesor de 0.17 mm.
Si no hay cifra, sino un signo (-):
insensible a diferencias mayores de
espesor;
un cero: puede verse la preparación sin
cubrir.
Microscopio óptico OLYMPUS
modelo BX41 TF-5 serie 9E10715
?
OCULAR: WHB 10x/20. Gafas
? CONDENSADOR: O, Ph1, Ph2; Ph3, DF
? OBJETIVOS:
PlanC N (magenta)
4x/0.10/8 /-/FN 22
PlanC N (amarillo)
10x/0.25 Ph1/8 /-/FN 22
PlanC N (azul)
40x/0.65 Ph2/8 /0.17/FN 22
PlanC N (blanco/negro)
100x/1.25 Oil Ph3/8 /-/FN 22
CONDENSADOR
Sistema de lentes convergentes cuya función es concentrar sobre la
preparación los rayos luminosos procedentes de una superficie
uniformemente iluminada (lámpara halógena) y reflejados por un espejo.
?
?
?
?
?
Condensa el haz de rayos de luz para obtener la máxima intensidad en la
mínima superficie.
Diafragma del condensador.
Tornillos de centrado.
Rueda arriba-abajo.
DIAFRAGMA DE CAMPO
?
?
Reduce el chorro de luz a un tamaño suficiente para que pase por el
condensador.
SOPORTE PARA FILTROS
?
?
Filtro azul (LBD-IF).
Microscopio óptico: manejo-1
ENFOCAR CORRECTAMENTE el microscopio:
El principio de iluminación de Köhler, permite iluminar únicamente el campo del objetivo a observar, y
con una completa uniformidad.
Puede realizarse:
•
•
si el microscopio dispone de un condensador desplazable en altura,
si el microscopio está provisto de lámpara de microscopía con colector y diafragma iris.
?
Iniciar siempre la regulación con el condensador en su posición más alta y teniendo intercalada la
lente frontal (lente auxiliar).
?
Enfocar el objeto con un objetivo de 10X aumentos sin tener en cuenta la iluminación.
?
Cerrar el diafragma de la lámpara (diafragma de campo luminoso). El diafragma en el pie del
microscopio ejerce la función de diafragma de campo luminoso.
?
Reproducir el diafragma de campo luminoso en el objeto, bajando el condensador.
?
Centrar el diafragma de campo luminoso con los tornillos de centrado del condensador.
?
Abrir el diafragma de campo luminoso hasta que todo el campo visual esté íntegramente iluminado.
?
Regular el contraste de la imagen con el diafragma (de apertura) del condensador.
?
Regular la claridad de la imagen mediante filtros o tensión de la lámpara.
?
ENFOQUE DIOPTRIAS. GAFAS
?
CENTRADO DEL MICROSCOPIO: diafragma de campo
?
CENTRADO DEL CONDENSADOR
?
CENTRADO DE LA LENTE AUXILIAR
?
LIMPIEZA:
Parte mecá
mecánica
kleenex humedecido Acetona
Parte óptica
kleenex humedecido Alcohol Absoluto
+ Dietilé
Dietiléter (50/50)
Objetivo seco (4x 20x 40x):
kleenex humedecido Alcohol Absoluto
+ Dietilé
Dietiléter (50/50)
Objetivo inmersió
inmersión (100x):
kleenex seco
Para enfocar la preparación:
?
?
?
?
?
?
se enciende la lámpara
se coloca el objetivo 10x en el eje óptico del ocular.
Se aproxima tanto como sea posible el objetivo a la
preparación y se levanta lentamente la platina.
Cuando aparece la imagen bien formada pero borrosa, se
termina el enfoque con el tornillo micrométrico.
Para una buena observación es muy importante una
correcta iluminación, que se requiere en mayor intensidad
para grandes aumentos.
Por lo común, para las observaciones a pocos aumentos, el
objetivo tiene las lentes de gran diámetro y el enfoque se
consigue a cierta distancia (algunos centímetros).
Microscopio óptico Luz Polarizada
Identificación microcristales en líquido sinovial
?
Principio Luz Polarizada:
Comportamiento de las estructuras al ser observadas con luz
polarizada: se necesita un polarizador (debajo del condensador), y un
analizador por encima de las lentes del objetivo.
?
?
Si el material es isotrópico: la propagación de la luz polarizada a su través
ocurre a la misma velocidad, cualquiera que sea la dirección del plano de
incidencia. Son sustancias con el mismo índice de refracción en todas
direcciones.
Bajo estas circunstancias, los materiales anisótropos (como los cristales),
presentan dos índices de refracción distintos (birrefringente) que
corresponden a las diferentes velocidades de transmisión, ya que la
velocidad de propagación de la luz difiere según la dirección que se
considere.
?
Birrefringencia:
Capacidad de alterar el plano de vibración de la luz que atraviesa el cristal en
función de las diferentes velocidades de paso a su través. Es propia de los
cristales biaxiales, al tener dos ejes ópticos implican la existencia de dos
direcciones para que pase la luz a su través sin ser refractada.
?
?
?
Intensidad: FUERTE/DÉBIL
Ángulo extinción: PARALELO/OBLICUO
Compensador rojo de primer orden:
Es una platina delgada (cristal cuarzo) que enlentece el componente rojo de
la luz blanca en un cuarto de longitud de onda.
Si se interpone entre el polarizador y el analizador, se consigue que el fondo
aparezca rojo en vez de negro, y el cristal problema se tornará azul o amarillo
dependiendo del tipo de cristal y de la orientación que presente respecto al
eje de vibración lenta del compensador.
?
Elongación ó signo: POSITIVA/NEGATIVA
?
Luz Polarizada Simple:
Las estructuras birrefringentes se
observan como objetos luminosos
(brillantes) sobre un fondo negro
oscuro.
?
Luz Polarizada Compensada:
Identificar y diferenciar la positividad o
negatividad
de
las
estructuras
birrefringentes basándose en los
diferentes colores producidos cuando
los
cristales
están
orientados
paralelos o perpendiculares al eje del
compensador rojo de primer orden.
Microscopio óptico Luz Polarizada Simple
Microscopio óptico Luz Polarizada Compensada
Identificació
Identificación microcristales en lílíquido sinovial
Microscopio óptico: aplicaciones en
urgencias
SEDIMENTO
URINARIO
DISMORFIAS
ERITROCITARIAS
en orina
LÍQUIDOS
BIOLÓGICOS
10 mL orina reciente
1500 a 2000 rpm/5 min.
•M.O luz transmitida a
campo claro
•M.O contraste fase
•Tiras reactivas
10 mL orina reciente
1500 a 2000 rpm/5 min.
contraste fase
•Osmómetro
•XE-5000: VCM y ADE
?Recuento
•M.O luz transmitida a
y Fórmula
Leucocitaria
?Microcristales (LIQ SIN)
•M.O
campo claro
•M.O polarización
Microscopio óptico: preparación muestras
Portaobjetos
76x26 mm
Grosor: 1 mm
Cámara Recuento
NEUBAUER
Profundidad: 0.1 mm
Superficie: 0.0025 mm2
TestSimplets
(tinción supravital)
76x26 mm
Grosor: 1 mm
Cubreobjetos
22x22 mm
Grosor: 0.15 mm
Cubrecámaras
22x22 mm
Grosor: 0.25 mm
Cubre TestSimplets
24x36 mm
Grosor: 0.15 mm
1. Preparación de las muestras
?
?
?
?
?
?
a) Obtención: sin anticoagulante (ó hep Na).
b) Observar antes de 4 horas.
c) Mejor en el sedimento; 3000 rpm/10 min.
d) Limpiar portaobjetos con alcohol absoluto.
e) En fresco ó en TestSimplets.
f ) Examinar a 40x. Condensador bajado.
1A. Preparación de las muestras
?
?
?
a) Los cristales pueden NO verse en M.O. luz campo
claro por exceso de luz. Bajar el condensador para
dar contraste.
b) Con M.O. luz polarizada simple puede ser difícil
saber el plano del foco a causa del campo de fondo
negro. Introducir más luz usando un compensador
rojo de primer orden.
c) Ningún estudio del líquido sinovial está completo si
no se realiza una observación con M.O. luz
polarizada.
2. Observación de muestras con Luz
Polarizada Simple:
a) Instalación del analizador y polarizador
•
La marca (línea blanca) grabada en el polarizador está posicionada
cruzada a la dirección de vibración del polarizador
b) Funcionamiento
•
•
•
Girar el revólver portaobjetivos para colocar el objetivo en uso.
Mirando a través de los oculares, girar el polarizador a la posición donde
el campo de visión sea el más oscuro (posición Nicol cruzada).
Colocar una muestra en la platina y comenzar la observación. Ajustar los
diafragmas de campo e iris.
3. Interpretación de estructuras con Luz
Polarizada Simple
CRISTALES
UMS
PPCD
HIDROXIAPATITA
COLESTEROL
OXALATO CÁLCICO
FOSFATOS CÁLCICOS BÁSICOS
CORTICOIDES
ARTEFACTOS
Polvo
Talco guantes
Rayaduras del cubre o del porta
Fibras colágeno
Fibras cartílago
Fibras artificiales tejidos
Fragmentos prótesis
Anticoagulantes
Gránulos almidón
Detritus (purulento)
MICROSCOPÍ
Líquido Sinovial
Normal
NO
inflamatorio
I
Inflamatorio
II
Purulento
III
Microcristalino
IV
Hemorrágico
V
Turbio
Amarillento
Blanquecino
Hemático
Marrón
Transparencia
Color
Claro
Amarillo pálido
Claro
Amarillo pálido
Turbio
Amarillento
Turbio
Amarillento
Blanquecino
Verde
Viscosidad
Alta
Alta
Disminuida
Muy disminuida
Disminuida
Disminuida
Leucocitos
(Cél/mm3)
<200
<2000
2000-75000
50000>100000
500->100000
>5000 leucocitos
>10000 hematíes
Polinucleares
(%)
<25
<30
50-80
75-100
<90
>25-<50
Glucosa
(mg/dL)
80-110
80-110
40-80
<40
40-80
Variable
Proteínas
(g/dL)
<3.0
<3.0
>3.0
>4.0
>3.0
Interferencia
positiva
Cristales
NO
NO
SI/NO
SI/NO
SI
SI/NO
Líquido Sinovial
NO inflamatorio
Inflamatorio
Purulento
Hemorrágico
Artrosis
Artritis Reumatoide
Artritis Séptica
(gonocócica)
Traumatismo
Artritis traumática
Síndrome Reiter
Gota
Neuroartropatía
Mixedema
Artropatía Psoriásica
Pseudogota
(Condrocalcinosis)
Hemofilia
Osteocondromatosis
sinovial
Artritis vírica
Sd. Reiter
Sinovitis vellonodular
Necrosis aséptica
Conectivopatías
Tto anticoagulante
Osteocondritis
disecante
Sinovitis vellonodular
Sds. Proliferativos
Trombocitosis
Neuroartropatía
Gota/Pseudogota
Prótesis
Microscopio óptico
?
a) Morfología
?
b) Localización
?
c) Birrefringencia
M.O. Campo claro
?
Intensidad
Ángulo de extinción
M.O. Polarización Simple
?
Elongación (signo)
M.O. Polarización Compensada
?
Microscopio óptico
?
a) Morfología
?
b) Localización
?
c) Birrefringencia
M.O. Campo claro
?
Intensidad
Ángulo de extinción
M.O. Polarización Simple
?
Elongación (signo)
M.O. Polarización Compensada
?
Identificación cristales Líquido Sinovial
Cristal
URATO
MONOSÓDICO
MONOHIDRATO
(UMS)
PIROFOSFATO
CÁLCICO
DIHIDRATO
(PPCD)
Morfología
Acicular con
extremos
puntiagudos;
Bastón-Varilla con
bordes paralelos
8-10 µ
Polimorfos:
Romboides
Cuadrados
Ovalados
Rectangulares
Bastón-Varilla
Tabletas
Agujas
2-10 µ
Localización
Intracelular
(crisis aguda)
Extracelular
Intracelular (+++)
Extracelular
Ángulo extinción Paralelo: brillante si está oblicuo al
polarizador o del analizador y deja de serlo cuando es
paralelo.
Ángulo extinción Oblicuo: viceversa
Birrefringencia
(Intensidad/Ángulo
extinción)
FUERTE
Paralelo
DÉBIL
Oblicuo
Birrefringencia
(Elongación)
Patología
NEGATIVA
GOTA
Hiperuricemias:
Acidosis
Rabdomiolisis
Sds.
Mieloproliferativos
POSITIVA
Condrocalcinosis:
Pseudogota
Hiperpatiroidismo 1º
Hemocromatosis
Mixedema
Hemofilia
Artrosis
Diabetes
Elongación Negativa: AMARILLO paralelo al
compensador; AZUL perpendicular al compensador.
Elongación Positiva: AZUL paralelo al compensador;
AMARILLO perpendicular al compensador.
Pueden verse ambos cristales en un mismo líquido
MICROSCOPÍ
Identificació
Identificación cristales Lí
Líquido Sinovial
Cristal
Morfología
COLESTEROL
Agregados de
Láminas rectangulares
(cuadradas) con
muescas en ángulo
Agujas-Bastones
Grandes- >100 µ
(*)
Localización
Birrefringencia
(Intensidad/
Ángulo extinción)
Extracelulares
FUERTE
Birrefringencia
(Elongación)
Láminas:
SIN EJE (0)
Agujas:
NEGATIVA
Conectivopatías:
AR; LES; DM
Artrosis
Gota crónica
Espondilitis
Quistes Óseos
Xantomas
Arteriosclerosis
SIN EJE (0)
Bursitis calcificante
Tendinitis
Artrosis
Artropatías
destructivas
Osteocondromatosis
sinovial
IRC
Diálisis
Conectivopatías
Hiperparatirodismo
Sarcoidosis
AR
Agujas o Romboides
al M. E; < 1 µ
HIDROXIAPATITA
Visibles a M.O si
forma agregados de
particulars esféricas o
discoides con
estriaciones
concéntricas o
excéntricas
“monedas brillantes”
(**) (***)
Intracelulares
Extracelulares
(**) Tinción con rojo S-Alizarina: precipitado naranja-rojizo en racimos.
DÉBIL
Patología
(*) Indica sinovitis crónica.
(***) Indica degeneración, calcificación articular.
Cristal
Morfología
FOSFATO
DICALCIO
DIHIDRATADO
M.E
Difracción de
rayos X
OXALATO
CÁLCICO
Parecen cristales
de UMS
Bipiramidal en
“sobre de carta”
Localización
Birrefringencia
(Intensidad/Ángulo
extinción)
POSITIVA
Intracelulares
Extracelulares
FUERTE
CRIOGLOBULINA
IgG ?
LÍPIDOS (Grasa)
Glóbulos
“cruces de Malta”
2-6 µ
Birrefringencia
(Elongación)
Intracelulares
Extracelulares
FUERTE
SIN EJE (0)
Patología
Artropatía
Destructiva
Diálisis
Empleo en la toma
muestra
POSITIVA (VERDE)
Con tinción rojo
Congo
Son fragmentos
de Amiloide
POSITIVA
Son ésteres de
colesterol
Monoartritis
Agudas
HEMATOIDINA
Intracelulares
Extracelulares
Producto de la Hb
Hemartros
Cristal
CHARCOTLEYDEN
Intracelulares
Extracelulares
Sinovitis eosinófila
Cristal
Morfología
CORTICOIDES
Parecen cristales
de UMS o PPCD
Extremos romos
1-20 µ
Pleomórficos
HEPARINA LITIO
Parecen cristales
de PPCD
HEPARINA
CÁLCICA
EDTA-K2 polvo
METALES
Localización
Intracelular (+++)
Extracelular
Birrefringencia
(Intensidad/Ángulo
extinción)
Birrefringencia
(Elongación)
FUERTE
NEGATIVA
POSITIVA
SIN EJE (0)
DÉBIL
POSITIVA
Parecen cristales
de PPCD
Patología
Inyección
intraarticular
Incluso 6 meses
Sin significado
clínico
Empleo en la toma
muestra
Empleo en la toma
muestra
Parecen cristales
de UMS
Pequeños
Amorfos
DÉBIL
Intracelulares
Extracelulares
SIN EJE (0)
Empleo en la toma
muestra
En prótesis
Metalosinovitis
Cristal
Morfología
DETRITUS
Pequeños
Irregulares
Bordes no
paralelos
VARIABLE
GRÁNULOS
ALMIDÓN
Variables
Redondeados
“cruz de Malta”
FUERTE
CARTÍLAGO
COLÁGENO
Irregulares
Tipo Bastón
300 µ
POLVO
RAYADURAS
FIBRAS
ARTIFICIALES
FIBRINA
Localización
Birrefringencia
(Intensidad/Ángulo
extinción)
Extracelular
FUERTE
FUERTE
Parecen cristales
de UMS
Agujas,
irregulares,
ramificados o con
curvas
DÉBIL
Birrefringencia
(Elongación)
POSITIVA
Patología
Artrosis
Postraumatismo
Microscopio óptico
?
a) SENSIBILIDAD: 80%
?
b) ESPECIFICIDAD: 96%
?
c) FAMILIARIZARSE CON LA OBSERVACIÓN
EN EL M. O. LUZ POLARIZADA
?
d) PRACTICAR, PRACTICAR, PRACTICAR
Microscopio óptico
Líquidos Biológicos
?
1) Body Fluid Analysis for Cellular Composition; Aproved
Guideline. CLSI document H56-A (ISBN 1-56238-614-X).
Clinical and Laboratory Standards Institute. Pennsylvania,
USA, 2006.
?
2) Analysis of Body Fluids in Clinical Chemistry; Aproved
Guideline. CLSI document C49-A (ISBN 1-56238-638-7).
Clinical and Laboratory Standards Institute. Pennsylvania,
USA, 2007.
?
3) Comisión de Magnitudes Biológicas relacionadas con la
Urgencia Médica. SEQC. Recomendaciones para el estudio
del líquido sinovial. Quim Clin 2004; 23(6): 434-438.

Microscopía óptica de luz polarizada

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