Comportamiento fisiológico del basidiomicete marino Nia vibrissa
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Comportamiento fisiológico del basidiomicete marino Nia vibrissa
Serie Oceanológica. No. 10, 2012 ISSN 2072-800x Comportamiento fisiológico del basidiomicete marino Nia vibrissa (Basidiomycota: Agaricales) en presencia de hidrocarburos aromáticos policíclicos Physiologic behavior of the marine basidiomycete Nia vibrissa (Basidiomycota: Agaricales) in presence of polycyclic aromatic hydrocarbons Ayixón Sánchez Reyes*, Yessica Delgado Rodríguez*, Ramón Alberto Batista García*, Erisbel Samón-Legrá**, Diana Enríquez Lavandera**, Silvia Acosta Díaz*, Ana Luisa Martínez Cruz* * Centro de Investigaciones del Petróleo. Churruca # 481, e/ Vía Blanca y Washington, Cerro, La Habana, Cuba, CP 12 000, Teléf.: (537) 640 3560. Correo: [email protected] ** Instituto de Oceanología. Ave. 1ra No.18406 e/184 y 186, Rpto. Flores, Playa, CP 11600, Ciudad de La Habana, Cuba, Telef.: (537) 271 6008. Resumen Las potencialidades fisiológicas de los hongos ligninolíticos, se consideran una alternativa para la restauración ecológica de ecosistemas impactados con petróleo crudo y sus derivados. Nia vibrissa, un basidiomicete marino aislado recientemente en playas del litoral sur oriental de Cuba, constituye una especie promisoria para la remoción de compuestos orgánicos persistentes. Como objetivo fundamental de este trabajo se planteó caracterizar fisiológicamente el cultivo sumergido de Nia vibrissa en medio líquido de sabouraud, suplementado con pireno y dibenzotiofeno, dos hidrocarburos aromáticos policíclicos de notable impacto ambiental. Se evaluó la biomasa fúngica como medida de crecimiento y los parámetros pH, conductividad, y consumo de la fuente de carbono durante 15 días. Se comprobó que Nia vibrissa creció en el medio seleccionado en presencia de pireno y dibenzotiofeno a una concentración de 0,01%, evidenciando tres fases de crecimiento. En los cultivos suplementados con ambos hidrocarburos como tratamientos independientes, así como en el control sin tratar, se evidenció un aumento significativo de la conductividad. El pH inicial se incrementó con el tiempo de fermentación hasta valores cercanos a la alcalinidad. Este trabajo constituye el primer estudio fisiológico de Nia vibrissa en Cuba y representa un importante aporte al conocimiento de la ecología y fisiología de hongos marinos. Abstract The physiologic potentialities of ligninolytic fungi are considered an alternative for the ecological restoration of ecosystems impacted by crude oil and its derivatives. Nia vibrissa, a marine white rot basidiomycete, recently isolated in Cuban south-eastern beaches, constitutes a promissory species for the removal of persistent organic compounds. The fundamental objective of this work was the physiological characterization of submerged cultures of Nia vibrissa in liquid Sabouraud medium, enriched with pyrene and dibenzothiofhene, two aromatic polycyclic hydrocarbons with significant environmental impact. Fungal biomass was evaluated as growth measure, and parameters like pH, conductivity, and carbon source consumption were assessed during 15 days. It was verified that Nia vibrissa grew in the selected medium in presence of pyrene and dibenzothiofhene at a concentration of 0,01%, evidencing three growth phases. In the cultures enriched with both hydrocarbons as independent treatments, as well as in the untreated control, a significant increase in conductivity was confirmed. Initial pH increased with the fermentation time until near-alkalinity values. This work constitutes the first physiologic study of Nia vibrissa in Cuba and it represents an important contribution to marine fungi ecology and physiology. Palabras Claves: Dibenzotiofeno, hongos marinos, restauración ambiental, pireno. Keywords: Dibenzothiofhene, marine fungi, environmental restoration, pyrene. INTRODUCCIÓN En la actualidad la creciente demanda energética ha incrementado la utilización del petróleo y sus derivados, y con ello la aparición de zonas contaminadas ya sea por derrames de buques u operaciones del proceso de perforación, extracción, refinación y transporte. La actividad petrolera impacta directamente el ambiente, teniendo consideración especial las emisiones 30 Serie Oceanológica. No. 10, 2012 ISSN 2072-800x atmosféricas, los residuales sólidos y los efluentes líquidos, los cuales arrastran cantidades apreciables de hidrocarburos (Tanaka, Matsui, Konishi, Maruhashi & Kurane, 2002; Baldi, Pepi & Fava, 2003). Los efluentes líquidos inciden sobre los ecosistemas acuáticos y terrestres provocando la ruptura del equilibrio natural de los mismos. Entre los hidrocarburos con mayor impacto ambiental se consideran los policíclicos aromáticos (HAP). Se definen como especies recalcitrantes para los ecosistemas terrestres y acuáticos. Actualmente la comunidad científica internacional apela a la búsqueda de soluciones para atenuar su efecto ambiental y las graves consecuencias para el planeta y la salud humana en particular (Castaño, Errico, Malats & Kogevinas, 2004). Los microorganismos y en especial los hongos se consideran imprescindibles para las acciones de restauración ecológica en ambientes contaminados con compuestos orgánicos persistentes. Los hongos filamentosos poseen patrones de excreción enzimáticos que favorecen la degradación parcial o completa de numerosos sustratos (Esser & Lemke, 2001). Los basidiomicetos sobresalen entre los representantes fúngicos de mayor atracción para estas actividades (Dávila & Vázquez-Duhalt, 2006). Ellos expresan y excretan eficazmente al medio extracelular, enzimas inespecíficas de gran interés en acciones de biodegradación y biotransformación de xenobióticos (Higuchi, 2004; Martínez et al., 2005). Nia vibrissa, basidiomicete de podredumbre blanca aislado en playas del litoral sur oriental de Cuba, constituye un representante fúngico de gran importancia ecológica (Samón-Legrá & Enríquez, 2010). No hay referencias bibliográficas sobre la fisiología de este hongo marino, ni sobre sus potencialidades en la biodegradación de hidrocarburos, de manera que la prospección de sus enzimas y metabolitos con este fin resulta interesante y novedosa. El pireno y el dibenzotiofeno (DBT) se utilizan como compuestos modelos en los estudios de biodegradación de compuestos aromáticos condensados y aromáticos azufrados (Kanaly & Harayama, 2000; Li, Zhang, Feng, Cai & Xu, 2007). Numerosos estudios publicados en la literatura especializada apuntan la utilidad de dichos sustratos en la evaluación de sistemas biológicos, con el fin de detectar nuevas cepas microbianas con potencialidades biotecnológicas para la microbiología e ingeniería ambientales (Zheng & Obbard, 2002; Zahra, Gili & Sharareh, 2006; Kim et al., 2007). Para la realización de este trabajo se definieron como objetivos los siguientes: caracterizar fisiológicamente el cultivo sumergido del basidiomicete marino Nia vibrissa atendiendo a su crecimiento en medio líquido de Sabouraud suplementado con pireno y dibenzotiofeno; así como analizar las modificaciones que este provoca en la conductividad y el pH del medio, como factores de relevancia para el adecuado desarrollo de un microorganismo in vitro. MATERIALES Y MÉTODOS Microorganismos Se utilizó una cepa del basidiomicete marino de podredumbre blanca Nia vibrissa, aislada de restos de madera de deriva colectados a lo largo de la zona intermareal de la playa Imías, provincia Guantánamo, Cuba. La identificación de esta cepa se realizó en el Instituto de Oceanología del Ministerio de Ciencia Tecnología y Medio Ambiente (Samón-Legrá & Enríquez, 2010), y su aislamiento se garantizó mediante el método indirecto de incubación de sustratos vegetales en cámara húmeda (Volkmann-Kohlmeyer & Kohlmeyer, 1993). Inóculos Los inóculos que se utilizaron fueron obtenidos en placas Petri de 10 cm de diámetro sobre medio agar extracto de malta (BioCen, 2004). Los cultivos se incubaron a 28ºC durante 7 días, bajo condiciones de luz natural. Para la inoculación de las fermentaciones se utilizaron porciones de micelio de 5 mm de diámetro del borde exterior de la colonia. 31 Serie Oceanológica. No. 10, 2012 ISSN 2072-800x Medios de cultivo Para la conservación e inóculo se empleó el medio agar extracto de malta (BioCen, 2004). El medio líquido de Sabouraud (BioCen, 2004) se utilizó para la fermentación sumergida. Este medio se suplementó con pireno y dibenzotiofeno comercial, grado analítico, sustratos certificados por la Norma Internacional de Calidad ISO 9001 (Laboratory Chemicals Riedel-de Haën) a concentración fija para cada ensayo. Caracterización fisiológica de Nia vibrissa en medio líquido de Sabouraud Se utilizaron matraces erlenmeyers de 250 mL de capacidad que contenían 50 mL de medio líquido de sabouraud suplementado con 0,01% de pireno y DBT como tratamientos independientes. Los matraces fueron inoculados con cinco porciones de micelio de 5 mm de diámetro del borde de crecimiento activo de la colonia, e incubados en zaranda orbital (modelo GFL 3300) a 150 r.min-1 durante 15 días a 28ºC. Los controles abióticos se prepararon en erlenmeyers que contenían medio de cultivo suplementado con los sustratos seleccionados. Como controles bióticos se utilizaron erlenmeyers con medio de cultivo inoculado con la cepa de estudio, sin la adición de los hidrocarburos aromáticos policíclicos. Se realizaron dos réplicas por cada variante. Se determinaron a los tratamientos y controles experimentales los parámetros pH, conductividad y peso seco de la biomasa como medida del crecimiento fúngico a los 3, 6, 9, 12 y 15 días de incubación. Se estimó la concentración de glúcidos totales para el monitoreo del consumo de la fuente de carbono según el método fenol/sulfúrico descrito por Dubois, Gilles, Hamilton, Rebers & Smith (1956). Determinaciones analíticas pH y conductividad Las determinaciones de pH y conductividad se realizaron a la temperatura óptima recomendada para el ensayo (250C), con pH metro/conductímetro digital (ORION, Thermo Scientific) para los tratamientos con pireno y DBT, control biótico y medio de cultivo sin tratar. Peso Seco La biomasa se estimó mediante método gravimétrico. Se colocó papel de filtro (Filter-Lab) a 60°C en la estufa por 24 h, después se enfrío el papel en el desecador por 20 min y se pesó en balanza analítica (Sartorius BL210S). Se separó el micelio de los extractos crudos mediante filtración en un embudo Buchner y un matraz kitazato con ayuda de una bomba de vacío. Se lavó la biomasa con agua destilada y el papel de filtro se colocó en la estufa a 60°C durante 24 h. Se dejó enfriar en un desecador por 20 min y se pesó el papel secante junto con la biomasa (Castro, 2008). El cálculo del peso de la biomasa se realizó según la ecuación siguiente: Glúcidos totales La determinación de la concentración de glúcidos totales presente en los tratamientos se realizó según el método fenol/sulfúrico descrito por Dubois et al. (1956). En tubos sumergidos en baño de agua-hielo se adicionó 0,5 mL de muestra; 0,5 mL de fenol 5% (p/v) y 2,5 mL de H2SO4 concentrado. Se colocaron todos los tubos en baño María durante 15 min a temperatura de ebullición y luego se enfrió hasta temperatura ambiente. El monitoreo de la absorbancia a 32 Serie Oceanológica. No. 10, 2012 ISSN 2072-800x 490 nm se realizó mediante método continuo durante 30 s. Se obtuvo una curva de calibración con medio líquido de Sabouraud empleando una concentración inicial de 5,0 mg.mL-1 para la interpolación de los datos. Procesamiento estadístico Para el procesamiento estadístico de los datos se consideró un diseño completamente aleatorizado, empleándose el paquete estadístico StatGraphics Plus 5.1. La normalidad de los datos se comprobó mediante el test de Shapiro-Wilks, y la homogeneidad de varianza se evidenció por el test de Cochran-Haltley-Bartlet. En la determinación de diferencias entre las medias se aplicó un procedimiento de comparación múltiple de medias. El método utilizado consistió en el análisis de las menores diferencias significativas de Fischer (LSD -siglas en inglés-). Los datos que no se ajustaron a una distribución normal, se analizaron mediante métodos no paramétricos empleando el paquete estadístico Statistic 6.0. RESULTADOS Caracterización fisiológica de Nia vibrissa en Medio Líquido de Sabouraud Biomasa En la figura 1, se presentan los datos de biomasa producida por los tratamientos con DBT, pireno y el control biótico a los 3, 6, 9, 12 y 15 días de fermentación. La cepa en estudio mostró la capacidad de crecer en el medio de cultivo seleccionado y en medio suplementado con DBT y pireno a la concentración 0,01% como tratamientos independientes, sin que se identificaran afectaciones morfológicas visibles en la biomasa respecto al control. El análisis de varianza para la determinación de las diferencias existentes en la variable analizada para los distintos niveles, permitió establecer que el crecimiento alcanzado por el hongo fue significativo respecto a los valores de biomasa al inicio de la fermentación para un nivel de significación α< 0,05. La curva de crecimiento correspondiente al control biótico mostró un comportamiento típico para hongos filamentosos en medio líquido agitado. Entre los días 0 y 9 se manifiestan dos fases importantes del crecimiento: fase de adaptación y fase de crecimiento rápido. En el día 9 de fermentación se obtuvo el máximo valor de biomasa (13,68 g.L-1), y después la velocidad específica de crecimiento disminuye hasta entrar en la fase de crecimiento neto o autolisis. Figura 1.Crecimiento del hongo Nia vibrissa durante 15 días de fermentación en erlenmeyers de 250 mL de capacidad con 50 mL de medio líquido de sabouraud, suplementado con 0,01% de pireno y DBT como tratamientos independientes a 28ºC y 150 r.min-1 (….. Pireno; _ _ _ DBT; ___ Control Biótico). Figure 1. Growth of the fungus Nia vibrissa during 15 days of fermentation in 250-mL Erlenmeyers with 50 mL of liquid Sabouraud medium, enriched with 0,01% pyrene and DBT as independent treatments, at 28ºC and 150 r.min-1(….. Pyrene; _ _ _ DBT; ___ Biotic Control). 33 Serie Oceanológica. No. 10, 2012 ISSN 2072-800x El tratamiento con DBT reveló un perfil de crecimiento caracterizado por tres etapas: una fase de adaptación de 3 días, fase de crecimiento rápido comprendida entre los días 3 y 6, con el máximo valor de biomasa para este tratamiento (11,55 g.L-1), seguido de una disminución en los valores de peso seco correspondiente a una etapa de autolisis aparente, puesto que después del día 12 el crecimiento del microorganismo revierte su tendencia hacia el aumento de la biomasa. El tratamiento con pireno reflejó una larga fase de adaptación con duración de 6 días, posteriormente se evidenció un aumento del crecimiento (etapa de crecimiento rápido) hasta el día 12 de fermentación, con un máximo valor de peso seco (12,48 g.L-1), manifestándose durante los próximos 3 días una disminución de la biomasa no significativa estadísticamente. Aunque se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos analizados respecto al crecimiento para un nivel de significación α<0,05; los valores máximos de peso seco alcanzado en las variantes no muestran diferencias significativas entre sí. pH y conductividad En las figuras 2 y 3, se muestran los resultados de las determinaciones de pH y conductividad para los tratamientos con DBT y pireno, control biótico y medio de cultivo. El medio de cultivo sin tratar no reflejó variaciones significativas en los valores de pH y conductividad iniciales: 5,2 y 1850,5 µS.cm-1 respectivamente, durante los 15 días de fermentación. Se notó una ligera disminución de los valores de pH en los grupos estudiados. Este fenómeno para el DBT y pireno ocurre hasta el tercer día, mientras que para el control biótico se alarga hasta el día 6. Para los tratamientos y control biótico se manifestó un aumento en los valores de pH a partir de los límites mencionados anteriormente, alcanzándose niveles máximos al día 15 de fermentación (7,51 para DBT; 7,81 para pireno; 8,62 para control biótico). El análisis estadístico demostró que no existen diferencias significativas entre las variantes analizadas, respecto a los valores de pH registrados a los diferentes días (ANOVA no paramétrico: test de Kruskal-Wallis: H (14, N= 30) =13,99933; p= 0,4498). Figura 2.Variación del pH en los tratamientos, control biótico y medio de cultivo, durante 15 días de fermentación en erlenmeyers de 250 mL de capacidad con 50 mL de Medio Líquido de Sabouraud, suplementado con 0,01% de pireno y DBT como tratamientos independientes a 28ºC y 150 r.min-1 (….. Pireno; _ _ _ DBT; ___ Control Biótico; __..__.. Medio de Cultivo). Figure 2. pH variation in the treatments, biotic control and culture medium, during 15 days of fermentation in 250-mL Erlenmeyers with 50 mL of liquid Sabouraud medium, enriched with 0,01% pyrene and DBT as independent treatments, at 28ºC and 150 r.min-1(….. Pyrene; _ _ _ DBT; ___ Biotic Control; __..__.. Culture Medium). Los valores de conductividad para el tratamiento con pireno y control biótico poseen un comportamiento similar entre sí, el cual se caracteriza por un aumento exponencial a partir de los días 6 y 9 respectivamente, alcanzando valores máximos al día 12 (4030 µS.cm-1 para 34 Serie Oceanológica. No. 10, 2012 ISSN 2072-800x Conductividad µS.cm ‐1 Pireno y 4407,5 µS.cm-1 para control biótico). Estos valores difieren estadísticamente con los niveles de conductividad evaluados durante los primeros 6 y 9 días de fermentación, respectivamente; sin embargo no se detectaron diferencias entre ambas variantes. 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 3 6 9 12 15 18 Tiempo (Días) Figura 3. Variación de la conductividad (µS.cm-1) en los tratamientos, control biótico y medio de cultivo, durante 15 días de fermentación en erlenmeyers de 250 mL de capacidad con 50 mL de Medio Líquido de Sabouraud, suplementado con 0,01% de pireno y DBT como tratamientos independientes a 28ºC y ___ DBT; ___ Control Biótico; __..__.. Medio de Cultivo). 150 r.min-1 (….. Pireno; Figure 3. Variation in the conductivity (µS.cm-1) in treatments, biotic control and culture medium, during 15 days of fermentation in 250-mL Erlenmeyers with 50 mL of liquid Sabouraud medium, enriched with 0,01% pyrene and DBT as independent treatments, at 28ºC and 150 r.min-1(….. Pyrene; _ _ _ DBT; ___ Biotic Control; __..__.. Culture Medium). El tratamiento con DBT mostró un aumento con tendencia lineal a partir del tercer día de fermentación, obteniéndose un punto de máxima conductividad al día 15 (5242,5 µS.cm-1). Este tratamiento mostró los niveles más elevados de conductividad durante todo el proceso fermentativo. A partir del día 12 los valores de conductividad observados en este tratamiento difieren estadísticamente de los estimados durante los 9 primeros días de incubación. En la gráfica se aprecia como permanecen sin variación los valores de conductividad para el medio de cultivo sin tratar durante toda la fermentación. Concentración de glúcidos totales La concentración de glúcidos totales presentes en los tratamientos y el control biótico permitió estimar el consumo de carbohidratos por la cepa objeto de estudio (Fig. 4). El tratamiento con DBT y el control biótico durante los seis primeros días de fermentación, mostraron una rápida y significativa disminución en la concentración de glúcidos totales, en un rango entre 20 mg.mL-1 hasta 1,18 mg.mL-1 y 2,29 mg.mL-1 respectivamente. El perfil de estas curvas se caracteriza por una pendiente abrupta. A partir del día seis estos grupos no mostraron variaciones significativas manteniéndose prácticamente constante hasta el día 15 de fermentación. 35 Serie Oceanológica. No. 10, 2012 ISSN 2072-800x Figura 4. Concentración de glúcidos totales en los tratamientos y control biótico, durante 15 días de fermentación en erlenmeyers de 250 mL de capacidad con 50 mL de Medio Líquido de Sabouraud, suplementado con 0,01% de pireno y DBT como tratamientos independientes a 28ºC y 150 r.min-1 (….. Pireno; _ _ _ DBT; ___ Control Biótico). Los valores están referidos como mg.mL-1 de dextrosa. Figure 4. Total glucide concentration in the treatments and biotic control during 15 days of fermentation in 250-mL Erlenmeyers with 50 mL of liquid Sabouraud medium, enriched with 0,01% pyrene and DBT as independent treatments, at 28ºC and 150 r.min-1 (….. Pyrene; _ _ _ DBT; ___ Biotic Control). Values are referred as mg.mL-1 of dextrose. El análisis estadístico entre estas dos variantes no mostró diferencias intraespecíficas significativas. El tratamiento con pireno reflejó un perfil que asemeja una diauxia invertida, compuesta por tres fases: fase inicial de consumo de carbohidratos (3 días de duración; 10,85 mg.mL-1), fase de adaptación corta con una concentración al día 6 de 9,03 mg.mL-1, seguido de una abrupta disminución de la concentración de glúcidos totales hasta el día 9 (1,38 mg.mL-1), a partir del cual los valores presentan poca variación hasta el final de la fermentación (1,05 mg.mL-1). Este tratamiento solamente mostró diferencias significativas con el control biótico y la variante con DBT al día 6 de fermentación. DISCUSIÓN Caracterización fisiológica de Nia vibrissa en Medio Líquido de Sabouraud Comparado con otros microorganismos, los hongos marinos han sido pobremente investigados, aunque en general el interés por el estudio de la microbiota asociada a hábitats marinos y estuarinos aumenta considerablemente (Liberra & Lindequist, 1995). Los hongos marinos que habitan entre los granos de arena de las playas se conocen como hongos arenícolas. Este grupo posee una importancia ecológica relevante porque sus miembros desempeñan importantes funciones como descomponedores primarios de muchos sustratos orgánicos, principalmente lignocelulósicos, por lo que contribuyen a mineralizar y reciclar los nutrientes en ese ambiente (Hyde et al., 1998). En este grupo se encuentra la especie Nia vibrissa, basidiomiceto recientemente aislado en playas de Cuba. Adecuadas condiciones de cultivo, constituyen un requisito indispensable para la máxima producción de micelio y la síntesis continua de sustancias biológicamente activas, factores de singular relevancia en la remoción de estructuras orgánicas recalcitrantes en el ambiente. De acuerdo con estudios realizados por Helmholz, Etoundi & Lindequist (1999), N. vibrissa constituye un hongo marino que puede ser cultivado in vitro fácilmente en medios sintéticos y complejos. Muestra adecuado crecimiento bajo condiciones estándar comparado con otras especies fúngicas marinas y terrestres, de manera que no es un evento raro el crecimiento mostrado en medio líquido de sabouraud de la cepa relativa a nuestro estudio. Como se constata, la adición al medio de cultivo de concentraciones de 0,01% de pireno y DBT, no afectó el crecimiento de forma significativa en sus términos más generales, debido a 36 Serie Oceanológica. No. 10, 2012 ISSN 2072-800x que en ambos tratamientos se observó un curso temporal del crecimiento que incluyó las fases principales en que se divide la progresión de la biomasa fúngica en medio líquido agitado. Además, no se observó afectación en la morfología de los pellets formados respecto al control biótico. Ambos resultados apoyan la idea de que la concentración de hidrocarburos aromáticos seleccionada, no resultó letal para el crecimiento del hongo en las condiciones en que se realizó la fermentación. El tratamiento con DBT muestra una fase de adaptación de igual duración respecto al control, aunque su fase de crecimiento rápido es mucho más corta con solo 3 días de duración en comparación con los seis que muestra el control biótico. Esta reducción se puede entender como una respuesta fisiológica del hongo a los efectos de toxicidad del hidrocarburo, que resultan más evidentes en la extensa etapa de autolisis aparente que experimenta este tratamiento. Esta fase, caracterizada por el desequilibrio que genera la muerte de un mayor número de células en el cultivo, se interpreta también como una etapa que el microorganismo utiliza para reajustar su maquinaria metabólica bien en favor del crecimiento o del mantenimiento celular en condiciones de estrés; lo cual se sustenta en la reanimación de este parámetro a partir del día 12 de incubación. Sin embargo, los efectos de toxicidad del pireno pudieran explicarse solo en la primera fase del crecimiento del hongo, en la cual, el valor mínimo de peso seco alcanzado difiere significativamente del control, y se evidencia una fase de adaptación más extendida que en el resto de las variantes. Una vez superada esta barrera fisiológica por el microorganismo, el curso temporal del crecimiento se manifiesta sin graves desviaciones. Gómez-Bertel et al. (2008) en trabajos realizados con la especie Phanaerochaete chrysosporium, plantean la existencia de mecanismos adaptativos asociados a tolerancia genética, que pueden surgir en hongos terrestres por la exposición prolongada a compuestos orgánicos persistentes. Durante el tratamiento, la cepa desarrolla de manera paralela varios mecanismos inmediatos o progresivos que permiten adquirir tolerancia a diferentes entidades moleculares como son: derivados fenólicos, metales pesados y colorantes sintéticos. Los mecanismos son disímiles: engrosamiento de la pared celular que favorece la biosorción de mayor cantidad de xenobióticos, síntesis de sustancias activas como las melaninas y la producción de ácidos orgánicos. El efecto cooperativo de estos mecanismos probablemente se relacione con el aumento de la biodisponibilidad, disminuyendo la tensión superficial entre los hidrocarburos y el medio acuoso, lo que proporciona mayor accesibilidad al microorganismo. Nuestros resultados concuerdan con los informados por Castro (2008) en la degradación de fenantreno por cepas de hongos terrestes (Aspergillus sp., Phanaerochaete chrysosporium y Penicillium pinophillum), quien evidenció que no se manifestaron efectos de toxicidad del hidrocarburo empleado sobre el crecimiento fúngico en el rango de concentraciones 0,05 – 0,5 g.L-1. Asimismo D´Annibale, Rosetto, Leonardi, Federic & Petroccioli (2006) informaron el crecimiento y desarrollo de especies de basidiomicetos terrestres (Allescheriella sp., Phlebia sp.) en presencia de hidrocarburos aromáticos policíclicos como el naftaleno, antraceno y derivados de estructura análoga, alcanzando tasas máximas de 12 g.L-1, con las que nuestros resultados son comparables. Salmanov, Aliyeva, Veliyev & Bekrashi (2008) mostraron un amplio estudio donde comprobaron el crecimiento de varios géneros fúngicos (Aspergillus sp., Mucor sp., Fusarium sp.) en matrices petrolizadas (Keroseno, Diesel, Petróleo crudo), demostrando que estos microorganismos utilizan las fracciones aromáticas como fuente de carbono y energía, con lo cual encausan el metabolismo de las mismas hacia el aumento de la biomasa. Dos razones resaltan la importancia de este estudio: las diferencias significativas en el crecimiento alcanzado por N. vibrissa entre el inicio y final de la fermentación, así como con los picos máximos de producción de biomasa - la producción de cantidades significativas de biomasa aumenta el área superficial disponible para la remoción (Kaćar et al., 2002; Qingbiao et 37 Serie Oceanológica. No. 10, 2012 ISSN 2072-800x al., 2004; Iqbal & Saeed, 2007) - y el hecho de que no se encontraron informes referentes a la aplicación de N. vibrissa en la degradación de los hidrocarburos seleccionados. pH, conductividad y glúcidos totales Entre los factores que influyen en el cultivo de un microorganismo en condiciones de laboratorio se encuentran el pH y la salinidad del medio. Nia vibrissa fue cultivado durante 15 días en medio líquido agitado con valores iniciales de pH y conductividad fijos, durante este tiempo y producto de la actividad metabólica del microorganismo, las condiciones del cultivo están sujetas a múltiples variaciones que pueden influir significativamente en su comportamiento fisiológico (Jones, 2000). Contrario a lo esperado, el pH del medio de cultivo sometido a tratamiento con microorganismo tanto en presencia de HAP como en el control biótico, tiende a aumentar. Al inicio de la fermentación se manifiesta en todos los casos una leve disminución de los valores de pH, la cual puede estar relacionada con el metabolismo oxidativo inicial de aquellos componentes del medio que constituyen la fuente de carbono más accesible, y con el rápido consumo de glúcidos en los primeros 6 días de crecimiento, lo que conlleva a una acumulación de ácidos orgánicos en el cultivo. Toda vez que el basidiomiceto supera la fase de crecimiento lento, el pH aumenta progresivamente hasta alcanzar valores cercanos a los límites de la alcalinidad. La especie objeto del estudio fue cultivada a pH inicial 5,7. Curran (1980) planteó que muchos hongos marinos crecen mejor a pH ligeramente ácidos. Este hecho también es una realidad aceptada para la mayoría de los hongos terrestres. Sin embargo, el hábitat natural donde este tipo de microorganismos desarrolla su nicho ecológico, muestra niveles de pH en el rango de la neutralidad. Helmholz et al. (1999) mostraron que Nia vibrissa cultivado en medio sintético, con glucosa como fuente de carbono a pH 7,5, incrementaba su crecimiento cerca de 19 veces en términos de peso seco de la biomasa. De este modo el atípico aumento en los niveles de pH en la medida que avanzó la fermentación pueden ser explicados teniendo en cuenta lo planteado por Damare, Raghukumar, Muraleedharan & Raghukumar (2006a y b), quienes afirmaron que a pesar de que los hongos terrestres generalmente muestran óptimo crecimiento a pH entre 4,5 - 6,0, los hongos marinos facultativos, crecen y producen muchas de sus enzimas extracelulares a pH entre 7-8. Además es probable que el microorganismo modifique su metabolismo, en la dirección de establecer condiciones semejantes a las del medio natural en que se desarrolla, así los valores de pH 7,5 para DBT; 7,8 para pireno; 8,6 para el control biótico, se encuentran más cercanos al pH del agua de mar, que al pH inicial del medio de cultivo en que se inoculó nuestro modelo biológico. Una última razón se relaciona con el consumo de la fuente de carbono. El carbohidrato predominante en el medio de cultivo utilizado es la dextrosa. Según muestra la curva de glúcidos totales, desde el inicio de la fermentación hasta el sexto día tiene lugar una rápida disminución de este parámetro en todas las variantes, aunque en el tratamiento con pireno se alarga hasta el noveno día. Se puede considerar entonces, que la fuente de carbono más sencilla y asequible, se encuentra prácticamente agotada en un estadío temprano del crecimiento, con lo cual el microorganismo comienza a metabolizar oxidativamente las peptonas del medio de cultivo, generando amonio como producto final, que contribuye a alcalinizar el medio. Otro importante factor para el cultivo de hongos marinos lo constituye el nivel de salinidad del medio. Una característica primordial de los anteriores, respecto a los hongos terrestres, es su alta tolerancia respecto a este factor. Muchos microorganismos que habitan las costas exigen condiciones de salinidad estrictas para su crecimiento. Nia vibrissa se considera facultativo en cuanto a salinidad. Sin embargo, al igual que sucedió con el pH, la conductividad 38 Serie Oceanológica. No. 10, 2012 ISSN 2072-800x en el medio de cultivo experimentó un abrupto aumento de sus niveles en todas las variantes. Este comportamiento puede deberse a varios factores. La presencia de altas concentraciones de iones sodio en el agua de mar, confiere propiedades únicas a las células de los organismos marinos. El sodio, incluso en pequeñas concentraciones, resulta tóxico a la mayoría de las células vivientes en ambientes de agua dulce. La evolución ha resuelto este inconveniente en los organismos marinos por medio de un eficiente funcionamiento de una ATPasa responsable del eflujo de sodio (Benito, Garcia- Deblás & Rodriguez-Navarro, 2002), con la cual la cepa evaluada regula los niveles iónicos del medio en que se encuentre. Por otro lado, los organismos marinos necesitan mantener un potencial de agua menor que la del medio circundante, que permita a sus células la entrada de agua mediante ósmosis. Los hongos marinos mantienen este gradiente debido a la acumulación de osmolitos como glicerol, manitol, polioles y trealosa (Blomberg & Adler, 1992). Es posible que esta retención osmótica interna, se acompañe con una mayor actividad en los transportadores que controlan el bombeo hacia el exterior celular de iones eléctricamente cargados, que contribuirían al aumento de la conductividad en el medio extracelular. Otro aspecto a considerar sería el efecto de la adición de los HAP. Probablemente la presión selectiva que ejerce el medio de cultivo sobre el microorganismo, permite que se potencie la actividad de varios transportadores iónicos en el sentido del eflujo, como alternativa para establecer condiciones más adecuadas para el crecimiento o la degradación de los hidrocarburos. Aunque en este último caso, el hecho que el control sin tratar muestre similar aumento de la conductividad, hace que nos inclinemos por una razón ecológica: el microorganismo altera las condiciones del medio de acuerdo a potencialidades genéticas seleccionadas evolutivamente o bien adecua su dotación genética en el sentido de la supervivencia. CONCLUSIONES Estos resultados constituyen un aporte científico novedoso a la ecología y fisiología de hongos marinos, resulta la primera investigación fisiológica de Nia vibrissa en Cuba, en el cual se comprobó el crecimiento de la cepa estudiada en presencia de hidrocarburos aromáticos policíclicos, así como el aumento significativo del pH y la conductividad en un medio complejo en condiciones de laboratorio. BIBLIOGRAFÍA Baldi, F., Pepi, M. & Fava, F. (2003).Growth of Rhodosporidium toroloides strain DBVPG 6662 on dibenzothiophene crystals y orimulsion. Applied and Environmental Microbiology,(69) 4689-4696. Benito, B. Garcia- Deblás, B. & Rodriguez-Navarro, A. (2002). Potassium-or sodium-efflux ATPase, a key enzyme in the evolution of fungi. Microbiology, (148) 933-941. BioCen.2004. Manual de medios de cultivo. Centro Nacional de Biopreparados. Cuba. Blomberg, A. & Adler, L. (1992). Physiology of osmotolerance in fungi. Advances in Microbial Physiology, (33)145-212. 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