1 caracterización histopatológica de nervios

1 caracterización histopatológica de nervios

2do Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas.
2da Jornada Científica Virtual de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal.
CARACTERIZACIÓN HISTOPATOLÓGICA DE NERVIOS ISQUIÁTICOS
DE RATONES TRANSGÉNICOS CON ATAXIA ESPINOCEREBELOSA
TIPO 2.
Virginia Villanueva Espinosa1, Andrés Dovale Borjas2, Melvis Taylín Zumeta Dubé3, María
de la C. García Barceló4, Yamila Rodríguez Cruz5, Mónica Fernández Jiménez6, Julio César
García Rodríguez7.
1- Residente de 4to año de Histología. ICBP: “Victoria de Girón”. La Habana. Cuba.
2- MsC. Profesor Titular y Consultante. Especialista de segundo grado en Histología, ICBP:
“Victoria de Girón”. La Habana. Cuba.
3- Profesora Auxiliar. Especialista de primer grado en MGI e Histología, ICBP: “Victoria de
Girón”. La Habana. Cuba.
4- MsC. Profesora Auxiliar. Especialista de segundo grado en Histología, ICBP: “Victoria de
Girón”. La Habana. Cuba.
5- Profesora Asistente. Especialista de primer grado en MGI e Histología, ICBP: “Victoria
de Girón”. La Habana. Cuba.
6- Profesora Auxiliar. Especialista de segundo grado en Histología, ICBP: “Victoria de
Girón”. La Habana. Cuba.
7- Dr. CS. Profesor titular de Bioquímica. Investigador titular.
Correo electrónico: e-mail: [email protected]
RESUMEN
Introducción: Las enfermedades neurodegenerativas, constituyen un grave problema
de salud. Entre ellas la ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2) es la más común en Cuba.
Sin embargo con relación a los cambios histológicos de los nervios periféricos, en
particular los nervios isquiáticos, resultan insuficientes las investigaciones realizadas y las
reportadas por la literatura; a pesar de que los estudios electrofisiológicos plantean que
en el sistema nervioso periférico una de las estructuras que primero se afectan son los
nervios
periféricos. Objetivo:
determinar
las
alteraciones
de las
histológicas de los nervios isquiáticos en ratones transgénicos con SCA2.
1
características
Material y métodos: Se utilizaron como modelo biológico ratones machos, transgénicos
y homocigóticos de la línea FO66. Se conformaron dos grupos uno control y otro de
ratones transgénicos. Se efectuó el estudio histológico de los nervios, los que fueron
procesados por el método de la parafina. Se realizó el estudio histoquímico e
inmunohistoquímico de estos nervios.
Resultados: En los nervios isquiáticos de los ratones transgénicos con SCA2, se
observaron alteraciones histológicas como fibras con internodos mielinizados más cortos
y de diámetro menor, incremento en el número de células (células de Schwann y
macrófagos), así como adelgazamiento del endoneuro y el perineuro; mientras que en
los ratones controles las características histológicas de estos nervios fueron normales.
Conclusiones: Las alteraciones histopatológicas observadas son compatibles con
desmielinización segmentaria y degeneración axonal del nervio periférico estudiado.
INTRODUCCIÓN
Las enfermedades neurodegenerativas constituyen un grave problema de salud. Se
caracterizan por ser discapacitantes al provocar un deterioro neurológico progresivo,
acompañado de una disminución en la funcionalidad e independencia personal. Entre
ellas se encuentran las ataxias espinocerebelosas 1.
El término ataxia es referido a un estado patológico en la coordinación de los
movimientos. Se utiliza para describir un trastorno de la marcha caracterizado por
inestabilidad e incoordinación motora, que afecta fundamentalmente las manos, los
brazos, las piernas, el habla y los movimientos oculares; así como hipotonía e hipotrofias
dístales, pudiendo ser causada por varias condiciones médicas o neurológicas 2.
Las ataxias hereditarias se distinguen en dos grandes grupos, las ataxias cerebelosas
autosómicos recesivas (ARCA) y las ataxias cerebelosas autosómicas dominantes
(ADCA); que resultan de una disfunción a nivel del cerebelo y de sus vías aferentes y
eferentes, así como alteración en la médula espinal, nervios periféricos o una
combinación de estas tres condiciones 2. Las autosómicas dominantes se conocen como
ataxias espinocerebelosas (SCA), caracterizadas por una gran variedad clínica, patológica
y molecular2-8.
Estudios epidemiológicos indican que la SCA2 es la segunda entre las ataxias
espinocerebelosas con mayor frecuencia mundialmente; representa el 15% de todas las
SCA, y el 33% de las SCA 7. El comportamiento epidemiológico a nivel mundial de la
SCA2, está estimado en 5 a 7 casos por cada 100 000 habitantes, aunque en poblaciones
particulares, esta puede ser elevada como consecuencia de la procedencia de sus
2
fundadores 2, 3, 5, 6. Anualmente nacen 22 niños portadores del gen, enferman 35 nuevos
casos y fallecen 15 enfermos 6.
La ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2), es la más común en Cuba
2-8
. Las más
elevadas tasas de incidencia y prevalencia a nivel mundial han sido encontradas en la
provincia Holguín, donde radica el 70% de los individuos enfermos con SCA2 en el país
7,
8
.
La edad de inicio varía desde 3 a 79 años, no reportándose diferencias significativas en la
edad de inicio entre masculinos (media 32,1 ± 13,6) y femeninos (media 32,7 ± 13,4)
6,
7
. La edad de inicio de la enfermedad disminuye de generación en generación como
consecuencia del fenómeno de anticipación genética 9.
La SCA2 tiene un fenotipo clínico muy variable6, 7, 9. El síntoma inicial más frecuente es la
alteración de la marcha en el 94,28 % de los enfermos 6, mientras que en el 5,72% son
la disartria cerebelosa, la dismetría, la adiadococinesia y los movimientos oculares
enlentecidos2,
6, 9
. El curso clínico hasta la incapacidad para caminar se extiende por 4 a
10 años, ocurriendo la muerte entre los 12 y 25 años después de la manifestación de los
primeros síntomas2,
5, 7, 10
. La enfermedad progresa rápidamente cuando se inicia antes
2
de los 20 años .
En la SCA2, se han encontrado alteraciones estructurales en el cerebelo, tronco
encefálico y médula espinal, en estudios electrofisiológicos realizados existen alteraciones
presintomáticas en los nervios medianos y tibiales. Lo que sugiere que el mecanismo no
está solo confinado al sistema nervioso central (SNC) 2,
10
y que el sistema nervioso
periférico (SNP) pudiera estar severamente comprometido, sin embargo resulta escasa la
literatura que argumente alteraciones histológicas de sus componentes.
En ensayos preclínicos desarrollados en especies animales como ratas y ratones, el ratón
ha sido considerado el biomodelo ideal. Estos estudios han sido de gran importancia para
el esclarecimiento de los mecanismos moleculares implicados en el proceso patológico y
para la evaluación de estrategias terapéuticas potenciales 9. En ellos se han realizado
estudios de habilidad y aprendizaje motor11, 12.
En Cuba también se ha generado un modelo transgénico de ratón de SCA2, con el que se
realizan estudios de coordinación motora e inmunohistoquímica en neuronas de Purkinje,
células cerebrales, hepáticas, musculares, pulmonares y renales
13, 14
. No obstante, el
estudio de las características histológicas de los nervios periféricos, en particular de los
nervios isquiáticos, aún resulta incipiente, a pesar de la comprobada alteración funcional
observada en humanos y ratones transgénicos, de la hipotonía e hipotrofias dístales, y de
la alta incidencia y prevalencia de SCA2 en el país.
La
presente
investigación
constituye
un
estudio
que
se
propone
describir
las
características histológicas los nervios periféricos en ratones transgénicos con SCA. Los
3
hallazgos de la presente investigación contribuirán a un mejor conocimiento de esta
entidad nosológica, lo que sería de gran importancia pues permitiría incidir con mayor
efectividad sobre este serio problema médico social. Estudiar esta enfermedad y
encontrar vías de solución al mismo constituye uno de los problemas de la salud pública,
en el cual también participa nuestro país.
Objetivo: Determinar las alteraciones de las características histológicas en los nervios
isquiáticos de ratones transgénicos con SCA2.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se realizó un trabajo experimental sobre la base de un estudio prospectivo y descriptivo,
donde se utilizaron ratones machos, transgénicos y homocigóticos de la línea FO66 como
modelo biológico, que se obtuvieron del cruce de ratones OF1 ♂ y B6D2F1 ♀. Las crías
fueron proporcionadas por el Centro Nacional para la Producción de Animales de
Laboratorio (CENPALAB).
Se emplearon ocho ratones FO66, a razón de tres o cinco animales/caja según grupo. Los
animales se conservaron en las instalaciones para roedores del CENPALAB y se
mantuvieron en adecuadas y similares condiciones higiénicas y ambientales, según las
normas establecidas para animales de experimentación regidas por los Procedimientos
Operacionales de Trabajo (POT) afines establecidas en el CENPALAB.
Se conformaron dos grupos con ratones híbridos FO66 cada uno, un grupo control
constituido por tres animales y un grupo de ratones transgénicos atáxicos formado por
cinco animales. Los animales del grupo de ratones transgénicos atáxicos eran
homocigóticos dominantes para el gen SCA2, y los del grupo control eran producto del
mismo cruce parental, pero carentes del gen. Los animales fueron destetados a los 21
días de vida postnatal y al año de vida se practicó la eutanasia.
Procesamiento del material
Los ratones fueron anestesiados con pentobarbital sódico por vía intraperitoneal, a una
dosis de 40 mg/Kg de peso corporal. Para la eutanasia e inicio de la fijación se realizó la
perfusión intracardiaca con formalina al 12 %, después de muertos los animales, se
colocó al ratón en decúbito supino y ubicando una de las extremidades posteriores por
encima de la otra se realizó una incisión desde la cresta ilíaca hasta la articulación de la
rodilla. Se separó la piel para observar el rafe aponeurótico de los músculos bíceps
femoral y semitendinoso, a 0.5 cm por debajo de este, se abordó el nervio isquiático por
disección, obteniendo un segmento de aproximadamente 2 cm del mismo
Estudio histológico
4
15
.
Los nervios fueron fijados en formalina tamponada neutra al 12%. Posteriormente fueron
16
lavados en agua corriente y se procesaron por el método de la parafina
. Se realizaron
cortes de 6 μm de grosor en un micrótomo vertical marca Spencer. Las Láminas fueron
coloreadas con Hematoxilina y Eosina (H/E) y con la técnica tricrómica de Mallory siendo
observadas en un microscopio NIKON COOLSCOPE con objetivo de 40x de magnificación.
Se analizaron las características morfológicas de los nervios periféricos (las fibras
nerviosas y las vainas envolventes de tejido conectivo), dentro de las que se exploraron:
signos de desmielinización segmentaria (lesión que afecta algunas zonas con sus
correspondientes internodos y respeta otras), signos de degeneración axonal, signos de
fibrosis del endoneuro y perineuro, o la presencia de reacción inflamatoria17.
Estudio inmunohistoquímico
Para identificar la naturaleza de las células observadas en los cortes de nervios de
ratones del grupo experimental, coloreadas con Hematoxilina y Eosina, a las muestras
tomadas y procesados por el método de la parafina se le realizaron cortes histológicos de
6 μm de grosor en un micrótomo vertical marca Spencer. Se procesaron mediante
inmunohistoquímica por el método Avidina-Biotina Inmunoperoxidasa
18
. Se utilizó como
anticuerpo primario un monoclonal para detectar subpoblaciones de macrófagos: CD68
18
. Los cortes fueron contrastados con Hematoxilina de Mayer por 1 min y observados en
un microscopio NIKON COOLSCOPE.
Se consideraron como positivas las células que presentaban el citoplasma coloreado de
rojo parduzco18. y se tuvo en cuenta la intensidad de la inmunotinción para CD68, esta
fue clasificada semicuantitativamente usando cuatro puntos según escala
18
, la cual fue
ajustada para este estudio: 0= no hay inmunotinción, 1= inmunotinción débil, 2=
inmunotinción moderada, 3= inmunotinción fuerte o intensa.
RESULTADOS
Al analizar el grupo control, se observó que en las muestras teñidas con hematoxilina y
eosina y con la coloración especial de Mallory, los nervios mostraron un aspecto normal.
Los nervios seccionados en cortes transversales, mostraron el sitio ocupado por la
mielina como un pequeño espacio vacío y se constató la presencia del axón en posición
central o algo desviado hacia alguno de los lados. En la superficie exterior del espacio
que ocupaba la mielina, se observaron los núcleos de las células de Schwann. El
endoneuro, perineuro y epineuro no mostraron alteraciones (figura 1).
En ninguno de los animales del grupo control se observaron signos de desmielinización
segmentaria, degeneración axonal, fibrosis del endoneuro ni del perineuro, ni reacción
inflamatoria en ninguno de los nervios estudiados.
5
Al examinar el grupo de ratones transgénicos atáxicos, se observó que en todos los
animales algunas fibras de los nervios seccionados transversalmente y coloreados con
hematoxilina y eosina, no mostraban el sitio ocupado por la mielina de forma precisa y
regular (figura 2). En algunos casos el axón se encontró ausente dentro de la fibra.
Fig. 1. Fotomicrografías de nervios de ratones del grupo control en corte longitudinal (A)
y transversal (B) que muestran el endoneuro (flechas) y el perineuro (*). Se observan
características histológicas normales. Coloración Tricrómica de Mallory. Magnificación:
1000 X (A), 540X (B).
Fig. 2. Fotomicrografía de un nervio de un ratón atáxico donde se observan fibras
nerviosas en cortes transversal y longitudinal que muestra los sitios ocupados por la
mielina de forma irregular (flechas). Coloración H/E. Magnificación 1140X.
En las muestras de cortes oblicuos y en las de corte longitudinal, impresionó que en
cuatro animales, la mayor parte de las fibras presentaban los internodos mielinizados
más cortos y su diámetro más delgado que los observados en el grupo control, rodeados
6
por fibras con apariencia normal. En ellos además se percibió la presencia de numerosas
células, las que parecían corresponder con células de Schwann y macrófagos entre las
fibras nerviosas.
El estudio inmunohistoquímico para macrófagos con el anticuerpo primario monoclonal
CD68, mostró inmunotinción débil ante la presencia de abundantes células en los nervios
periféricos de los ratones transgénicos atáxicos (figura 3).
Fig. 3. Fotomicrografía de un corte transversal de un nervio periférico en un ratón del
grupo de ratones transgénicos atáxicos que muestra la presencia de macrófagos
(flechas). Técnica Inmunohistoquímica para CD 68. Magnificación 2700 X.
En las láminas teñidas con la coloración especial de Mallory, al corte longitudinal se
observó el perineuro, rodeando al fascículo del nervio, más delgado que el observado en
el grupo control, y en el interior del mismo cada fibra revestida por escaso tejido
conectivo laxo del endoneuro (figura 4A).
7
Fig. 4. Fotomicrografías de nervios de ratones transgénicos atáxicos en corte longitudinal
(A) y transversal (B). En A se observa el escaso endoneuro y el perineuro delgado
(flechas). En B se muestran anillos acidófilos concéntricos en el espacio ocupado por la
mielina (flechas). Coloración Tricrómica de Mallory. Magnificación: 1000 X (A), 540X (B).
Las fibras de los nervios seccionados en cortes transversales, mostraban el sitio ocupado
por la mielina como un pequeño espacio vacío e irregular, y en cuatro de estos animales
se observó, en numerosas fibras, este espacio ocupado por un anillo acidófilo
concéntrico, en presencia o no del axón (figura 4B), rodeados por fibras con apariencia
normal.
En ninguno de los animales del grupo de ratones transgénicos atáxicos se observaron
signos de degeneración axonal del tipo de tumefacción, ni fragmentación del axonal con
presencia de ovoides de mielina. Tampoco fueron observados fibrosis del endoneuro ni
del perineuro, ni vasos sanguíneos dilatados.
DISCUSIÓN
Las características histológicas observadas en los nervios isquiáticos del grupo control
fueron normales. No mostraron signos indicativos de daños en su estructura histológica,
tales como desmielinización segmentaria, degeneración axonal, fibrosis del endoneuro ni
del perineuro, ni reacción inflamatoria en ninguno de los nervios de los animales de este
grupo.
Sin embargo en la presente investigación, en el estudio histológico de los nervios
isquiáticos de ratones transgénicos atáxicos, se observó que en algunas fibras nerviosas
el sitio correspondiente a la mielina era impreciso e irregular, en la mayoría de las fibras
el axón se localizó en posición central o algo excéntrico, y en algunos casos no se
observó la presencia del axón, lo que coincide en algunos aspectos con lo descrito por la
literatura para diferentes enfermedades neurodegenerativas
17
.
La existencia de internodos más cortos y de diámetros más delgados, observados en los
cortes oblicuos y longitudinales de los nervios de animales transgénicos atáxicos, sugiere
la presencia de signos de remielinización descritos en la literatura
17
. Y la presencia de
anillos acidófilos concéntricos localizados en los pequeños espacios que corresponden a
los ocupados por la mielina, pudieran estar en relación con el citoplasma de las células de
Schwann e indicar los signos de desmielinización y remielinización que se han planteado
en diferentes estudios
17, 20, 21
.
Se considera que la acumulación de prolongaciones de las células de Schwann,
observados al corte transversal, se presentan como ovillos de citoplasma celular que
rodean el axón, a lo que se le ha denominado “bulbos de cebolla”, modificaciones
8
estructurales que forman parte de las que ocurren en la desmielinización segmentaria
17
.
La desmielinización primaria puede exhibir detritus de mielina en el citoplasma de las
células de Schwann, con separación, vacuolización o con ambos fenómenos de las vainas
electrondensas de mielina; el axón puede estar desnudo de mielina pero ser normal
17, 21
.
Los resultados del presente trabajo mostraron que en ninguno de los animales del grupo
de ratones transgénicos atáxicos, se observó tumefacción, ni fragmentación del axonal
con presencia de ovoides de mielina, sin embargo si se percibió la presencia de
numerosas células, las que parecían corresponder con células de Schwann y macrófagos
entre las fibras nerviosas. El reclutamiento de macrófagos ha sido considerado por
numerosos autores como signo de degeneración axonal walleriana 17, 20, 21.
La atrofia axonal, que es uno de los cambios degenerativos, se reconoce por el tamaño
menor del axón en relación a la vaina de melina circundante, la cual puede mostrar un
aspecto
corrugado
compensatorio;
asimismo,
la
célula
de
Schwann
exhibe
un
engrosamiento del citoplasma, que puede extender una lengüeta de dicho citoplasma y
separar el axón
22
. Las alteraciones de la mielina observadas como pequeños espacios
vacíos e irregulares y anillos acidófilos concéntricos, en cuyo interior se visualiza o no el
axón, pudiera indicar signos de degeneración axonal de tipo degeneración walleriana,
donde los axones se disuelven y la mielina se rompe e invade el sitio del axón; formando
ovoides de mielina
La
no
17, 21
apreciación
.
de tumefacción,
ni
fragmentación
axonal
con
presencia
de
compartimentos ovalados pequeños (ovoides de mielina), pudiera estar en relación con la
técnica histológica empleada, pues las muestras se procesaron por el método de la
parafina, se obtuvieron cortes de 6 um y fueron observados en un microscopio fotónico
de campo brillante.
La presencia de células que parecen corresponder con macrófagos, entre numerosas
fibras nerviosas, sugiere una posible lesión, ya que la apreciación de estas células
inflamatorias en esta localización es una de las características reportadas en biopsias y
necropsias de humanos y animales con nervios periféricos lesionados o dañados
17, 20, 21
.
La respuesta macrofágica en la degeneración walleriana es clave para la iniciación del
proceso de regeneración
21
. El endoneuro es invadido por macrófagos que penetran la
membrana basal de la célula de Schwann (que permanece intacta) para ejercer su
trabajo de limpieza de detritus celulares
17, 21
. Los macrófagos liberan interleucinas que
estimulan a la célula de Schwann (probablemente también a fibroblastos) para la
producción del factor de crecimiento nervioso y factor 1 similar a insulina. Así, una fibra
degenerada es remplazada por varias yemas axonales
21
. Y por otra parte también en la
desmielinización segmentaria las fibras nerviosas pueden tener macrófagos que fagocitan
y eliminan los restos de mielina
21
.
9
Sin embargo, el marcaje ligero que se observó en el análisis inmunohistoquímico para
macrófagos pudiera estar en correspondencia con que el anticuerpo utilizado no era
específico de la especie. Y por otra parte, debe tenerse en consideración que se trate de
otro
tipo
celular,
pues
en
algunos
tipos
de
enfermedades
neurodegenerativas
espinocerebelosas se ha descrito que el núcleo de las células en muchos órganos, como
las células de Schwann en las raíces de los ganglios posteriores y los nervios periféricos,
muestran agrandamiento del núcleo de la célula entre dos y cinco veces del tamaño
normal y gliosis
23
. Por lo que este hallazgo pudiera corresponderse con células de
Schwann que también tienen función fagocítica en el proceso de degeneración.
Otra
característica
que ha
sido
observada en
las
enfermedades
degenerativas
espinocerebelosas, es la degeneración de neuronas sin cambios histológicos significativos
que se produce en las zonas afectadas
23
. Aspecto que parece corresponderse con el
hecho de que en uno de los animales de la presente investigación, se apreciaron axones
con características histológicas de apariencia normal.
En el presente estudio tampoco fueron observados fibrosis del endoneuro ni del
perineuro, sin embargo si se apreció un aparente adelgazamiento del perineuro y del
endoneuro de los nervios de los ratones transgénicos atáxicos, lo que es atribuido por
algunos autores a enfermedades neurodegenerativas
17, 21
.
CONCLUSIONES
En los nervios isquiáticos de los ratones transgénicos atáxicos con SCA 2, se encontraron
alteraciones histológicas tales como fibras nerviosas con internodos mielinizados más
cortos y su diámetro más delgado, e incremento en el número de macrófagos en el
endoneuro, elementos
que
son
compatibles con
desmielinización segmentaria y
degeneración axonal.
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