modificación inflamatoria y mucoide en el

modificación inflamatoria y mucoide en el

2do Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas.
2da Jornada Científica Virtual de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal.
MODIFICACIÓN INFLAMATORIA Y MUCOIDE EN EL MODELO DE
ASMA ALERGICA EN COBAYOS EXPUESTO A MATERIAL
PARTICULADO DE LA CIUDAD DE MEXICO.
Carlos Iván Falcón Rodrguez1,2*, Karen Cristhel Meneses Soberano3, , Santiago Tena
Hernández2, Brisa Samara Reyes Nava4, Rodolfo Angulo Olais5, Andrea de Vizcaya Ruiz5,
Patricia Segura Medina2*
1. Posgrado en Ciencias Biológicas, UNAM. Distrito Federal, México.
2. Departamento de Investigación en Hiperreactividad Bronquial. Instituto Nacional de
Enfermedades Respiratorias, INER. Distrito Federal, México.
3. Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. Villahermosa, Tabasco. México.
4. Universidad Autónoma de Guerrero, Acapulco. Guerrero, México.
5. Departamento de Toxicología. Cinvestav-Zacatenco. IPN. Distrito Federal, México.
*[email protected]
*[email protected]
RESUMEN
El asma es una enfermedad que afecta a 300 millones de personas en el mundo e
incrementará en 100 millones más para 2025. Probablemente la contaminación ambiental
esté relacionada ya que en ciudades se incrementa esta condición. En Áreas urbanas
encontramos diferentes contaminantes tal como gases, y Solidos o líquidos, llamados
aerosoles. Los aerosoles o material particulado están formados por diferentes elementos y
presentan diferente tamaño y pueden depositarse en los pulmones. Además incrementan
la infamación o la proteína CC16. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la
exposición de las partículas finas sobre la inflamación y la producción de moco, así como
evidenciar cambios en la proteína CC16 en lavado bronquioalveolar en animales sanos,
asmáticos, asmáticos y expuestos a material particulado. Utilizamos 15 cobayos macho
(400-450g), divididos en 3 grupos. Control/AF, Asmático/AF y Asmático/PM. Los animales
se sensibilizaron (asmáticos). Día 1 se inyectaron OVA+AlOH 3. El día 8 se nebulizaron
(OVA), 5 min. Día 15 se nebulizaron (OVA), 1 min. Los animales inhalaron aire filtrado o
Material particulado, en un concentrador de partículas (5h/día/3días=15h total). El día 21
se retaron nuevamente a OVA y 24 horas después se llevó acabo la eutanasia. Se extrajo
el LBA y se realizó el botón en una cito-centrífuga para teñirlo con Giemsa. Los cortes
histológicos se tiñeron con PAS. En ambos casos se realizó el conteo celular. También se
realizó una ELISA para CC16. Nuestros resultados evidencian que la exposición a PM
incrementa el daño en el modelo de asma.
INTRODUCCIÓN
El asma es una enfermedad crónica de las vías aéreas, esta condición se caracteriza por la
exacerbación de tos, disnea, y opresión torácica. Los pacientes usualmente presentan el
volumen espiratorio forzado (FEV1) reducido [1]. Afecta alrededor de 300 millones de
personas en todo el mundo. Los más afectados son los niños, aunque también los adultos
manifiestan presentan esta condición [2]. En esta condición participan gran cantidad
células inflamatorios, entre las que destacan los neutrófilos [3], eosinófilos [4],
mastocitos, basófilos, linfocitos B y T [5] y de células dendríticas. Estas últimas son
importantes en el desarrollo del asma [6]. Todos estos elementos celulares mantienen el
proceso inflamatorio dentro del árbol bronquial, además mantienen la respuesta de tipo
Th2 dentro de la vía aérea
[6]. Todos estos
estos
productos
incrementan la
hiperreactividad bronquial y favorecen los cambios en la estructura pulmonar, mejor
conocida como remodelación. La remodelación se caracteriza por el aumento en las
células del músculo liso, el incremento en el grosor de la membrana basal y la
hipersecreción de moco debida a la hiperplasia de células mucoproductoras del epitelio
[4]. La metaplasia mucoide puede estar asociada a la Célula Bronquiolar no ciliada o
Célula de Clara, ya que es una stem cell dentro del bronquiolo pulmonar y puede generar
células mucoproductoras. Además la Célula de Clara es secretora de una proteína, llamada
CC16 y cuya actividad es regular la respuesta inmunológica dentro de pulmón, a través de
la inhibición de la actividad de la fosfolipasa A2 [7]. CC16 es un biomarcador de daño o
exposición a diferentes agentes por vía inhalada [8]. Todos estos cambios ocurren en el
asma, sin embargo se ha estimado que para el año 2025 aumentará el número de
personas asmáticas, sumando 100 millones más de casos [9]. Probablemente este
aumento puede estar asociado a la contaminación ambiental, ya que la incidencia de
enfermedades alérgicas en países industrializados ha incrementado notablemente
[10,
11]. En la atmósfera de las grandes ciudades se encuentran de forma común gran
cantidad de elementos que conforman a la contaminación, tales como Dióxido de azufre
(SO2), Dióxido de nitrógeno (NO2), Monóxido de Carbono (CO), compuestos orgánicos
volátiles (COV), Ozono (O3), Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) y el material
particulado (MP) [12]. Este último difiere de los contaminantes anteriores en su estado, ya
que no es un gas y su difusión en el pulmón no es rápida, sino que permanece en alojado
en los pulmones. El material particulado es una mezcla entre sólidos o líquidos en
dispersión; es decir en un gas en la atmósfera. Son liberados al ambiente a través de la
combustión de productos derivados de combustibles fósiles, carbón y madera [13].
Naturalmente las partículas se forman en la atmosfera y esto depende de las condiciones
climáticas. Suelen adosarse a infinidad de elementos, por lo que podemos encontrar una
gama de ellos, tales como metales, hidrocarburos aromáticos, endotoxinas [13], polen
[14], hongos [15], sulfato de amonio, nitrato de amonio [12, 16], carbón elemental,
carbón orgánico [16] y paraformaldehído [17]. Otra característica importante es el
tamaño de estas y se han dividido en una serie de fracciones. La fracción gruesa (PM102.5m) penetra hasta los pulmones. Sin embargo, la fracción fina (PM2.5m) es capaz de
depositarse en bronquiolos y alveolos, además puede distribuirse a otros órganos [18]
(Figura 1). La exposición a PM produce daño en el tracto respiratorio por incremento de la
permeabilidad celular y reducir la actividad mucociliar, además de incrementar el estrés
oxidante, incrementa el efecto toxico mediante la producción de citocinas inflamatorias. E
incrementa la producción de moco. Inclusive en modelos de asma alérgica en animales,
las partículas incrementan el daño o exacerban las crisis asmáticas. El objetivo de este
estudio fue evaluar el efecto de la exposición de las partículas finas sobre inflamación y la
producción de moco, así como evidenciar cambios en la proteína CC16 en lavado
bronquioalveolar en animales sanos y asmáticos.
MÉTODO
Sensibilización, Exposición a Partículas y Reto Ovoalbúmina
Los cobayos fueron colocados de forma aleatoria en tres grupos distintos (n=5). Con
excepción del grupo del grupo control, todos los animales fueron sensibilizados con un
alérgeno (Tabla 1). En el día 1, se les administro vía i.p. e i.d. una solución con 60 mg de
ovoalbúmina (OVA) y 1 mg de AlOH3 en un total del 0.5 ml de solución salina (NaCl al
0.9%). Se realizaron los refuerzos de sensibilización el día 8 y 15. En una cámara con
conexión a un nebulizador ultrasónico (Modelo US-1, Puritan Bennett, Carlsbad, CA)
inhalaron solución (3 mg/ml de OVA) en solución salina durante 5 minutos. El día 15
(0.5mg/ml de OVA) en solución salina durante 1 min. Posteriormente se realizó el reto el
de la misma manera que el día 15. El día 22 se llevó acabo la eutanasia de todos los
grupos fue llevada a cabo.
Exposición a Partículas
La recolección del material particulado fue realizada en Cinvestav, Zacatenco situado al
norte de la Ciudad de México de 8:00 a 13:00 horas. Se empleó un concentrador de
partículas, el cual permite capturar aire atmosférico por medio de una bomba de vacío y
acoplados a filtros en cascada (PM2.5μm). El aire enriquecido de partículas se distribuyó
en cámaras de exposición selladas herméticamente, en donde el grupo sensibilizados fue
expuesto el día 1, 2 y 3 a las partículas finas concentradas, mientras que los demás
grupos estuvieron expuestos a aire filtrado mediante filtros HEPA (Tabla 1).
Eutanasia
Previo a la necropsia, los animales fueron anestesiados con pentobarbital sódico [60
mg/kg
i.p.
(Pisa,
farmacéutica,
México),
hasta
alcanzar
un
paro
respiratorio.
Posteriormente se insertó una cánula en la tráquea y se realizaron los lavados
bronquioalveolares. Se instilaron 5 ml de solución fisiológica (37 ºC), durante un minuto y
se recuperó suavemente (por duplicado). El líquido se almaceno a 4°C para su posterior
conteo.
Para la extracción de los pulmones, se pinzó el hilio del pulmón izquierdo, de esta manera
se instilo soluciona fijadora (Fijador amortiguado 10%) en el pulmón derecho. En seguida
se fijaron por inmersión en la misma solución.
Fluido de Lavado Bronquioalveolar e Histología
Se realizó el conteo total de células y en seguida se elaboró el botón celular en una cito
centrifuga (Cyto cent). Las laminillas se tiñeron con Giemsa para su conteo diferencial.
Con el fin de aislar las células presentes en cada muestra, el bronquioalveolar (LBA) de
cada animal fue centrifugado a 400 x g, 4 ºC, por 10 minutos. Para los cortes histológicos,
se realizó la técnica histológica de rutina a los pulmones fijados, después se tiñeron con
PAS en el microscopio fotónico de campo claro (Primo Star, Zeiss)
Análisis Estadístico
El análisis estadístico fue llevado a cabo mediante el programa Prisma, Graph Pad 5.0 5.0.
En él se realizaron pruebas de ANOVA.
RESULTADOS
En el conteo diferencial que se realizó en los lavados bronquioalveolares de los diferentes
grupos (Figura 2) se observó el incremento de las células inflamatorias con respecto a los
animales del grupo control expuesto a aire filtrado. El aumento fue significativo para
linfoctios, eosinófilos, neutrófilos y macrófagos. Especialmente el número de eosinófilos
incrementa significativamente entre el grupo asmático/PM comparado contra el grupo
control y asmático (figura 3).
Metaplasia mucoide
La evaluación de los cortes histológicos con la tinción de PAS evidencio en el grupo control
el número basal de células mucoproductoras (Figura 4). Sin embargo, en el conteo celular
que se realizó, este número de células incrementa significativamente en el modelo
asmático, así mismo en el grupo asmático/AF y en el grupo asmático/PM (Figura 5).
CC16
Realizamos un análisis mediante ELISA para CC16 en LAB. Los resultados evidencian el
incremento de esta proteína en los lavados en los grupos asmáticos y asmáticos/PM,
sugiriendo mayor daño en estos grupos.
CONCLUSIONES
La exposición a material particulado de la Ciudad de México incrementa el infiltrado
inflamatorio en el modelo de asma alérgica en cobayos, especialmente de neutrófilos,
eosinófilos,
macrófagos
y
linfocitos.
Además
incrementa
el
número
de
células
mucoprodutoras. El bronquiolo no presenta glándulas y/o células caliciformes que
produzcan moco. Sin embargo previos estudios han mencionado que existe una stem cell,
conocida como célula de Clara o Célula bronquiolar no Ciliada, y presenta un marcador
especifico, la proteína CC16. Previos estudios han mencionado que la Célula de Clara se
transforma a fenotipo mucoproductor cuando se inhalan irritantes, ya que es una buena
manera de englobarlos y desecharlos. Sin embargo, cuando la célula se transforma a
mucoproductora presenta su propio marcador, CC16 y sustancia mucoide, como
glucoproteínas ya sean ácidas o neutras [19]. Por otro lado, la prueba de Elisa para CC16
incrementó en el modelo asmático y expuesto a material particulado, esto es un primer
acercamiento del daño por permeabilidad epitelial que están generando las partículas
[20].
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ANEXOS
Figura 1. Depósito del material particulado en relación con su tamaño.
Días
Grupo 1
2
3
8
15
21
24
I
-
AF AF -
-
OVA Eutanasia
II
OVA + AlOH3 AF AF OVA OVA OVA Eutanasia
III
OVA + AlOH3 PM PM OVA OVA OVA Eutanasia
Tabla 1. Modelo experimental. OVA, Ovoalbúmina; AF, Aire Filtrado; PM, Material
particulado.
Figura 2. Células de lavado bronquialveolar. A) Control/AF. B) asmático/AF. C)
Asmático/PM. Flecha roja señala eosinofilos. Flecha verde señala linfocitos. Flecha azul
macrófagos. Flecha negra neutrófilos. Giemsa, 400X
Figura 3. Conteo celular diferencial. El incremento significativo 4 tipos
inflamatorios de lavado bronquioalveolar. *ANOVA P<0.05 Control Vs expuestos.
células
Figura 4. Corte Histológico, tinción de PAS. A) control/AF. B) Asmático/AF. C)
Asmático/PM. Las flechas señalan las células PAS positivas. 400X
Figura 5. Porcentaje de células mucoproductoras. En el grupo control/AF es diferente
sificativamente comparando asmático/AF y asmático/PF. *ANOVA P<0.05 Control Vs
expuestos.
Figura 6. Prueba de ELISA para la proteína CC16. Se observa el incremento significativo
en el grupo asmático/AF y asmático/PF comparando contra el control *ANOVA P<0.05,
Control Vs expuestos.