Utilización del Test de ELISA para el diagnóstico de Triquinelosis

Utilización del Test de ELISA para el diagnóstico de Triquinelosis

FUNDAMENTOS E IMPORTANCIA DE LA UTILIZACIÓN DEL TEST DE
ELISA PARA EL DIAGNÓSTICO DE TRICHINELLOSIS EN CERDOS DE
ARGENTINA
Mabel Ribicich
Med Vet. M Sc
Parasitología y Enfermedades Parasitarias
Facultad de Ciencias Veterinarias
Universidad de Buenos Aires
Miembro de la International Commission on Trichinellosis (ICT)
[email protected]
Introducción
El crecimiento demográfico constante en la población mundial, el proceso de urbanización
creciente, los mercados globales de comercialización de carnes, la convergencia de salud
humana y animal hacia un moderno concepto de Salud Pública y los cambios políticos,
económicos, sociales, ambientales y religiosos, condicionan el marcado incremento de la
trichinellosis en las personas y en los animales domésticos y salvajes, durante los últimos
20 años.
En Argentina, la especie porcina es la comúnmente involucrada en la aparición de
brotes humanos. El parásito, perteneciente al género Trichinella, alojado en la carne de
cerdo, esperará dentro de su micro hábitat, la llegada del próximo hospedador, que en el
caso de ser el hombre, desencadenará una enfermedad parasitaria, con síntomas
gastroentericos, fiebre y dolores musculares hasta complicaciones sistémicas con atención
hospitalaria e incluso riesgo de muerte. El grado de compromiso del paciente dependerá
fundamentalmente de la cantidad de larvas ingeridas y la respuesta inmune del hospedador.
Es en este período donde el rol del médico es fundamental, para diagnosticar
tempranamente los síntomas de la enfermedad y poder limitar el número de personas
afectadas. El
veterinario tiene una
función primordial para limitar el brote de
trichinellosis, determinar la fuente de infección y realizar el seguimiento epidemiológico de
esta enfermedad transmitida por alimentos (ETA). Sin embargo, su rol más preponderante
se encuentra en la etapa de prevención, en los establecimientos porcinos y en el frigorífico,
realizando la detección del parásito en todos los animales que serán destinados a consumo.
La distribución de la parasitosis es mundial, y la epidemiología de la infección varía
considerablemente entre las especies involucradas, la dieta, estilo de vida, distribución,
comportamiento e interrelaciones entre animales y humanos.
Biología molecular
Las distintas especies del genero Trichinella con sus similitudes biológicas,
la
ausencia de características morfológicas distintivas y las especies no encapsuladas como T.
pseudospiralis, T. papuae y T zimbabwensis (T10) dificultan el diagnóstico diferencial (Zarlenga,
et al., 2001). La determinación molecular de una larva de Trichinella puede realizarse por
medio de un análisis de multiplex-PCR (Pozio, 1999, 2002; Zarlenga, 2001) y permite la
identificación de siete especies (T. spiralis, T. nativa, T. britovi, T. pseudospiralis, T. murrelli, T.
nelsoni, y T. papuae), un genotipo (Trichinella T6) y tres poblaciones de T. pseudospiralis.
Además, otros dos genotipos (Trichinella T8 y Trichinella T9) pueden distinguirse de T.
britovi por el análisis de un fragmento de restricción de PCR (RFLP) para el gen que
codifica la proteína de 43 kDa, la cual es una de las más importantes dentro de los
antígenos de excreción-secreción (E/S) producidos in vitro por las larvas. (Wu, 1999).
En Argentina,
la especie encontrada en humanos, cerdos
y otros animales salvajes
corresponde a Trichinella spiralis, de acuerdo a la tipificación del Centro de Referencia de
Trichinella en Roma, Italia.
Aspectos epidemiológicos
Las diferencias entre ciclo doméstico y selvático, son solo teóricas, con una
retroalimentación constante entre ambos, con presencia de mamíferos, aves y reptiles. Sin
embargo, los carnívoros, en la punta de la cadena alimenticia, cumplen un rol determinante
para perpetuar el parásito en la naturaleza.
Los animales domésticos y salvajes que comparten el nicho ecológico con los
cerdos destinados a consumo cumplen un rol fundamental en el mantenimiento de
la parasitosis
Dentro de los países más afectados se encuentran los de Europa del Este: Rumania,
Yugoslavia y Rusia. Estos países, concentran el mayor número de brotes con casos
humanos producidos por consumo de carne de caballo, carne de caza y en ocasiones
cerdos, que albergaban larvas infectantes de distintas especies de Trichinella. Argentina se
encuentra en el cuarto lugar, con consumo fundamentalmente de carne de cerdo cruda o
semicocida con L1 de Trichinella spiralis. Este lugar que ocupa Argentina, junto a otros
países de Europa, merece una análisis sociológico de los hábitos y costumbres importados
al país a fines del siglo XIX y principios del XX, época en la cual se produjo la mayor
corriente inmigratoria y junto con ella
la importación de recetas de preparación y
conservación de fiambres caseros únicas por sus características en América.
En Argentina, la enfermedad en las personas, se mantenía entre 100 y 200 casos
anuales. A partir de la década del 90 se observó un notable incremento de personas
afectadas (Fig. 1).
Las provincias de la zona central del país, Buenos Aires, Santa Fe y
Córdoba son las que concentran el 89% de los casos humanos, mientras que el 11 %
restante se reparte entre el sur noreste y noroeste del país (Fig. 2).
1200
1000
800
600
400
200
0
61
19 19 67 9 73
79
5
1
19 19 8 9 91
97
1
03
19
20
Fig. 1. Casos de trichinellosis humana en Argentina, durante el período 1961/2003
89%
4%
1%
6%
Fig. 2. Distribución de la trichinellosis humana en Argentina, según regiones.
89% zona central (Buenos Aires, Córdoba, Santa Fe) Período 1961/2003
La prevalencia de los focos porcinos, se encuentra entre el 7 y el 10%, mientras que la
prevalencia en los frigoríficos habilitados es del 0.01 y 0.03%. Esta información, provista
por el SENASA, evidencia claramente la necesidad de diferenciar la carne porcina segura,
provenientes de establecimientos con buenas practicas de manejo (GPP) y que mantienen
una baja prevalencia de la enfermedad, debido al control en el establecimiento, de aquellos
donde se crían cerdos en condiciones higiénico sanitarias deficientes.
Aspectos inmunológicos
Los métodos serológicos, en particular, el test de ELISA, provee oportunidades para la
detección rápida de la infección por Trichinella en cerdos y humanos.
En los cerdos, el test de ELISA tiene la ventaja que puede ser usado previo al sacrificio de
los animales para detectar la infección. La implementación del test de ELISA permite
realizar este trabajo en los establecimientos porcinos para de esta manera ofrecer un
producto al consumidor, diferenciable en la boca de expendio.
Hay características morfológicas relevantes de la L1 de T spiralis para la repuesta inmune del
hospedador, una de ellas es la presencia de esticosoma.
El esticosoma es una estructura compuesta por una hilera de 50-55 células discoides
llamadas esticocitos que ocupan la mitad anterior de la L1 infectiva, rodeando el esófago.
(Fig. 3)
La estructura y función de este órgano ha sido objeto de investigaciones exhaustivas ya que
estas células poseen gránulos secretorios y el contenido de los mismos es antigénico.
Hay dos tipos de esticocitos en la L1 infectiva:
Los que contienen β gránulos y los que contienen α gránulos.
Estos 2 tipos celulares secretan el contenido de sus gránulos durante el ciclo de mudas. Los
esticocitos del adulto difieren significativamente de la L1.
T spiralis posee un grupo de antígenos, conocidos como antígenos de respuesta rápida
encontrados
tan temprano como a las 2 semanas post-infección
y otro grupo de
antígenos, conocidos como antígenos de respuesta lenta, detectables a las 4 semanas
post-infección.
Fig. 3. Corte de L1 de Trichinella spiralis a la altura del esófago, evidenciando el esticosoma. (Takahashi ,1997)
Los antígenos de respuesta rápida
La fosforilcolina (PC) es un hapteno asociado con una variedad de constituyentes
parasitarios internos y que posee extensas reacciones cruzadas con proteínas carriers
diferentes. La PC está en la larva muscular, en los órganos exócrinos del adulto así como
también en los gránulos exócrinos del tracto genital del macho.
Los gránulos se descargan externamente y probablemente estimulen el sistema inmune del
hospedador para producir anticuerpos anti-PC. Estos anticuerpos anti-PC pueden tener
reacciones cruzadas con la hemolinfa, un constituyente exclusivamente intraparasitario.
Los antígenos de Trichinella encontrados en infecciones tempranas de humanos y cerdos
mostraron reactividad cruzada con anticuerpos de otros parásitos. Esta reactividad cruzada
era causada por la presencia de fosforilcolina en estos antígenos.
Los antígenos ES del adulto contienen epitopes que difieren de los de las larvas en los
músculos.
La presencia de PC en los productos de ES del adulto explican porque no hubo éxito en
la utilización de antígenos ES del adulto para la realización de
inmunodiagnóstico
especifico.
Por lo tanto, la caracterización de las proteínas carriers antigénicas es esencial para
futuros estudios de inmunidad en Trichinella y para entender el rol funcional que ésta debe
jugar en el establecimiento de la parasitosis. (Takahashi ,1997)
Los antígenos de respuesta lenta (Grupo II)
La síntesis de antígenos larvales ES se produce en el esticosoma. La larva desarrollada en el
quiste comienza la síntesis de antígenos ES después de la formación del esticosoma, esto
es a los 14 días post-infección. Los productos
enquistada son antigénicamente diferentes.
E-S de larva pre-enquistada y de la
Se identifican 6 proteínas principales en el grupo II de antígenos en el rango de 43-68 kDa,
con punto isoeléctrico 5.0-6.3 y con un epitope inmunodominante G2.1 que contiene
fucosa y tyvelosa.(Wisnewski, N. et.al., 1993). La diferencia encontrada entre los pesos
moleculares y puntos isoeléctricos es debida a las distintas proteínas carriers.
Es interesante destacar que los gránulos del esticosoma no son homogéneos, siendo los α y
γ gránulos los antigénicos, mientras que dentro de los β gránulos hay antigénicos y noantigénicos. Luego que los ES son secretados, estos son transportados al núcleo de la célula
nurse y están involucrados en la formación de la misma. Otros son transportados fuera del
quiste teniendo acceso al sistema inmune del huésped, otros son absorbidos sobre la
superficie de la cutícula. Esta observación explica porqué la superficie cuticular y los
gránulos del esticosoma muestran antigenicidad. Basados en este hallazgo los antígenos
reciben el nombre de Superficie/Esticosomal (S/S).
Los antígenos S/S son equivalentes a los antígenos ES larvales, sin embargo, los
antígenos de superficie y los esticosomales no son exactamente los mismos, ya que los
antígenos esticosomales son reconocidos por anticuerpos monoclonales (mAbs) NIM-M1
y NIM-M2, mientras que los de superficie solo son reconocidos por NIM-M2.
(Takahashi, Y., 1997)
La presencia de productos ES sobre la superficie cuticular protegen al parásito de
la digestión por el jugo gástrico y en consecuencia las larvas desarrolladas en los quistes
musculares son infectivas por vía oral solamente después de la formación del esticosoma
(aproximadamente 15 días). Trichinella muestra antígenos de superficie en la primera muda
luego de la infección oral, pero los adultos no poseen antígenos ES larvales sobre su
superficie. Este mecanismo está involucrado en el cambio en la antigenicidad de la
superficie de los nematodes.
En la preparación del test de ELISA se utilizan como antígenos los productos
excretores secretores E/S de las L1, y un antígeno purificado y caracterizado que contiene
tyvelosa. Hasta la década del 80, los antígenos utilizados eran preparados con extractos
totales de las L1, con interferencias y reacciones cruzadas, especialmente con nematodes del
tubo digestivo (Ascaris suum, Trichuris suis)
Es a partir de estas investigaciones que se concentran los esfuerzos para lograr un
antígeno purificado E/S que pudiera cumplir con los objetivos de lograr una mayor
sensibilidad y especificidad en el diagnóstico.
En animales inoculados con dosis crecientes de T spiralis, se observa un incremento de los
títulos positivos que serán de mas temprana aparición (14- 56 días postinfección) de
acuerdo al numero de larvas inoculadas. (Ribicich, et al., 2000) (Fig. 4) (Tabla 1)
Cinetica de anticuerpos anti Trichinella spiralis en cerdos
inoculados con 5000 larvas (Grupo 3)
1
D.O
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
Cerdo 5
0,3
Cerdo 8
0,2
Cerdo 15
0,1
Dias
0
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
77
84
91
100
Fig 4. Evolución de los anticuerpos durante 100 días post-infección, en cerdos inoculados con 5000 larvas
infectantes de T spiralis (Ribicich, et al., 2000)
Tabla 1. Tiempos de seroconversión y resultados de la DAR de cerdos infectados
con dosis crecientes de T spiralis (Ribicich, et al., 2000)
Grupo
0 (no inoculado)
1 (100 larvas)
2 (500 larvas)
3 (5000 larvas)
4 (50000 larvas)
Cerdo Nº 1º día positivo ELISA Nº larvas/g
6
-
0
7
-
0
9
42
0
18
28
4
21
21
2
4
28
20
13
21
0
14
56
0
5
14
40
8
21
72
15
21
8
3
7
160
16
7
104
17
28
580
La sensibilidad del test de ELISA y el valor predictivo para cerdos inoculados
experimentalmente con T spiralis se encuentra en el 100 %.
Un nuevo desafío consistió en testear la prueba bajo condiciones de campo, con sistemas
de crianza de cerdos, propios de la región, con predominio de crianza al aire libre.
Los resultados preliminares demostraron que los cerdos criados en sistemas al aire libre y
los criados en confinamiento, con un adecuado manejo sanitario demostraron negatividad a
la prueba parasitológica directa (digestión artificial) y a las indirectas (test de ELISA). En
los animales
criados bajo condiciones higiénico-sanitarias deficientes se detectó una
prevalencia serológica del 9.27%. (Ribicich, et al., 2004)
Conclusiones
La sensibilidad y valor predictivo positivo del test de ELISA utilizando antígeno
ES para el diagnóstico de T spiralis en cerdos en condiciones experimentales se
encuentra en el 100%, mientras que en condiciones de campo la sensibilidad de
la misma se reporta entre el 93.1 -99.2%.
Ambas técnicas
Digestión artificial (DAR)
y
test de ELISA, poseen
limitaciones: la sensibilidad de la técnica de ELISA esta en 0.01 lpg, sin
embargo la posibilidad de falsos negativos, la hace inadecuada para su
utilización en el frigorífico.
Argentina, es considerada zona endémica, en consecuencia, la utilización del
test, sumado a acciones en terreno, permitiría ajustar los mecanismos de
control y prevención de la enfermedad
El diagnostico serológico a través del test de ELISA puede utilizarse con el
objetivo de :
Herramienta para la vigilancia epidemiológica
Manejo de focos porcinos
Descarte temprano de animales positivos
Acceso a mercados internacionales
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