E.QA11

VALIDACIÓN DE MÉTODO ANALÍTICO PARA
DICLOFENACO EN AGUA POR CROMATOGRAFÍA
GASES-LÍQUIDOS
Avilés Flores, M.(1)*; Sánchez Zarza, M. (2); González Esquivel, L. A. (3); Aguilar Aguas, E.(4)
2,3
4
*
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua
Instituto Tecnológico de Zacatepec (ITZ)
Autor que presentará trabajo: Avilés Flores, M
Dirección de contacto: 1Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Paseo Cuauhnáhuac 8532,
Jiutepec, Morelos 62550 México. Tel. (777)3293664. Tel. (777)3293600 ext 289. Fax (777)3293664.
[email protected]
Compuestos Emergentes ó Disrupción endocrina
Resumen. Se presentan los resultados obtenidos en la validación de un método analítico para la
determinación de diclofenaco en muestras de agua por cromatografía de gases acoplada a un detector
de masas (GC-MS) y cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). La extracción del analito se
realizó mediante extracción en fase sólida (SPE) con cartuchos Chromabond C18 de 3 mL/500 mg. Los
parámetros validados son linealidad, precisión, exactitud, límites de detección, límites de
cuantificación y estabilidad de soluciones. Las concentraciones para Cromatografía de gases masas
(GC-MS) se realizaron de 0.001 a 0.060 µgL-1, los límites de detección y cuantificación obtenidos
0.0015 y 0.0091 µgL-1 respectivamente. Las concentraciones para Cromatografía de líquidos de alta
resolución (HPLC) se efectuaron en el rango de 0.08, a 40 µgL-1, los límites de detección y
cuantificación son 0.0135 y 0.11 µgL-1. El método analítico resulto ser específico, lineal, preciso,
exacto en el intervalo de concentraciones estudiadas, comprobándose de esta forma la validez del
método analítico con la cuantificación de muestras reales de agua residual.
Palabras clave: Diclofenaco, extracción en fase sólida, validación
Abstract. Shows the results obtained in the validation of an analytical method for determination of
diclofenac in water samples by gas chromatography coupled with a mass detector (GC-MS) and high
performance liquid chromatography (HPLC). Analyte extraction was performed by solid phase
extraction (SPE) cartridges C18 Chromabond 3 mL/500 mg. The validated parameters are linearity,
precision, accuracy, detection limits, quantification limits and stability of solutions. The concentrations
for gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) were performed from 0,001 to 0,060 μgL-1, the
detection and quantification limits obtained 0.0015 and 0.0091 μgL-1 respectively. The concentrations
for high performance liquid chromatography (HPLC) were performed in the range of 0.08 to 40 μgL-1,
the limits of detection and quantification are 0.0135 and 0.11 μgL-1. The analytical method proved to
be specific, linear, precise, accurate in the range of concentrations studied, proving thus the validity of
the analytical method to the quantification of real samples of wastewater.
Keywords: diclofenac, solid phase extraction, validation
1. Introducción
En la actualidad los fármacos, antibióticos, analgésicos, antinflamatorios, anticonceptivos,
antidepresivos, antiepilépticos, betabloqueadores, reguladores del colesterol y antisépticos se han
convertido en sustancias cada vez más presentes en los caudales de los grandes ríos. Son sustancias que
ingerimos con cierta frecuencia y que excretamos a través de la orina y las heces por lo que llegan a las
aguas residuales y a las plantas depuradoras, donde los tratamientos son insuficientes para eliminar los
residuos farmacológicos en su totalidad, por lo que estos acaban viajando hasta los ríos, lagos, mares,
acuíferos[1].
Los compuestos farmacéuticos y sus productos de degradación biológica (metabolitos) se encuentran
como contaminantes traza y ultra traza en los efluentes y en las plantas de tratamiento de aguas
residuales (PTAR) en el medio ambiente en bajas concentraciones (ngL -1 ó µgL-1), de acuerdo con
varios estudios de investigación llevado a cabo en todo el mundo[2-3-4-5].
El diclofenaco, o ácido 2-[(2,6-diclorofenil) amino] fenilacético, es un fármaco muy popular utilizado
como analgésico, antiartrítico y antirreumático que pertenece al grupo de los llamados fármacos
antiinflamatorios no esteroideos. Normalmente se utiliza en forma de sal sódica. Se usa en todo el
mundo y se estima que el volumen de producción es de cientos de toneladas anuales. Varios estudios
han identificado la presencia de diclofenaco y otros antiinflamatorios, Ternes 8 determinó niveles de
diclofenaco, indometacina, ibuprofeno, naproxeno, ketoprofeno y fenazona en efluentes de aguas
residuales que excedían el nivel del μgL -1. Todos estos compuestos también se encontraron en aguas
superficiales en concentraciones muy bajas.
Buser [6] observó la presencia de diclofenaco, detectando concentraciones mayores a 370 ngL-1, en un
influente del lago Greifensee y siendo éstas menores en un efluente del mismo lago (mayores a 12 ngL1
). No detectó diclofenaco en los sedimentos del lago, y éste mostró una adsorción despreciable por
parte de las partículas de sedimentos. El autor concluyó que la fotólisis era la causa mayor de la
disminución de las concentraciones de diclofenaco en los efluentes de las aguas superficiales. En los
influentes de plantas depuradoras suizas, encontró concentraciones de 0,5-1,8 μgL-1, mientras que las
concentraciones en los efluentes respectivos eran tan solo del 50% de la concentración de entrada, en la
mayoría de los casos. En nuestro país es necesario desarrollar e implementar métodos analíticos para la
determinación de estos contaminantes en matrices ambientales.
2. Materiales y Métodos
Reactivos
Diclofenaco, pureza 98% marca Sigma, Fosfato monobásico de potasio grado reactivo, J. T. Baker,
Hidróxido de sodio grado reactivo, J. T. Baker, Ácido fosfórico J. T. Baker, Metanol grado HPLC,
Acetonitrilo grado HPLC, Agua grado HPLC, Derivatizante trimetilsilildiazometano marca Sigma,
Surrogado 4, 4’ Diclorobifenilo, Cartuchos CROMABOND C18 ec 3 mL/500 mg. Fase móvil Solución
amortiguadora de fosfatos 0.25 M a pH 4.7 ± 0.1: Acetonitrilo (30:70), flujo 1 mL/minuto, Longitud de
onda 280 nm, volumen de inyección: 100 µL.
Equipos
Cromatógrafo de gases VARIAN modelo 3800 acoplado a espectrómetro de masas/masas modelo
VARIAN SATURNO 2200, Columna capilar VF5ms 30 m X 0.25mm X 0.25 µm, Balanza analítica
OHAUS, Potenciómetro Orion-Termo, Baño Ultrasónico.
Cromatógrafo de Líquidos modelo HP 1050 con detector Ultravioleta-visible, Columna Thermo C18
250mm X 4.6 mm, 5 µm, Sistema de extracción en fase sólida marca VARIAN equipado con una
bomba de vacío.
Validación del método analítico
En la validación del Diclofenaco se desarrolló un método mediante adición de estándar, el cual implica
una extracción en fase sólida utilizando cartuchos de extracción en fase sólida Chromabond C18 de
3mL 500 mg.
Los parámetros evaluados fueron linealidad, exactitud y precisión expresada en sus formas de
repetibilidad y precisión intermedia.
Exactitud. El análisis de exactitud se realizó con seis réplicas para las diferentes concentraciones, se
determinó el porcentaje de recuperación, la desviación estándar y el coeficiente de variación.
Precisión. El estudio de la precisión se realizó a través del modelo de repetibilidad de seis réplicas; se
determinaron los valores medios, la desviación estándar y el coeficiente de variación.
De igual manera para el ensayo de la precisión intermedia se utilizaron 3 valores de concentración que
correspondieron a valores bajos, medios y altos.
3. Resultados
Linealidad. La determinación de este parámetro se llevó a cabo empleando siete concentraciones
crecientes de diclofenaco (0.001, 0.002, 0.004, 0.008, 0.015, 0.030, 0.060 µgL-1), para cromatografía de
gases-masas. Las concentraciones de las curvas de calibración para cromatografía de líquidos de alta
resolución fueron 0.08, 0.20, 0.40, 1.0, 4.0, 2.0 y 4 µgL-1. En la figura 1 se presenta el cromatograma
del diclofenaco.
Los resultados obtenidos fueron evaluados mediante un análisis de regresión lineal y la prueba t de
Student para el intercepto, la pendiente y el coeficiente de correlación. El coeficiente de correlación (r)
para los dos metodologías fue mayor a 0.99; el coeficiente de variación (CV) fue menor del 5% lo que
indica que el instrumento es preciso bajo las condiciones de análisis establecidas. Las ecuaciones de la
recta son:
y(CG-M) = 204518 X (concentración) + 349.26
y(HPLC) = 243.97 X (concentración) + 1.8817
Figura 1 Cromatograma de diclofenaco
Precisión. El estudio de la precisión se realizó a través de repetibilidad del método preparando seis
réplicas de concentración de 0.005, 0.015 y 0.060 µgL-1 para CG y de 0.080, 1.0 y 4.0 µgL-1 para
HPLC. En el análisis estadístico para los dos casos, se determinaron los valores promedio, la
desviación estándar y el coeficiente de variación entre las lecturas obtenidas. En cromatografía gasesmasas se obtuvo un coeficiente de variación de aproximadamente 2%, lo cual indica una buena
precisión del método (Figura 2). Se evaluó la precisión intermedia para determinar variaciones en los
datos cuando el método lo aplican distintos analistas en días diferentes. Los coeficientes de variación
de 1.2 y 1.8% para los ensayos 1 y 2 tuvieron variaciones menores del 20%.
Concentración teórica CG (ug/L)
Concentración recuperada CG (ug/L)
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0.0049
0.0151
0.0607
Figura 2 Precisión Cromatografía de Gases-Masas
En el estudio de precisión de cromatografía de líquidos se alcanzó un coeficiente de variación adecuado
1.97%, que indica la buena precisión del método de acuerdo al límite para los métodos cromatográficos
(Figura 3). Los coeficientes de variación de la precisión intermedia para los ensayos 1 y 2 fueron de 1.8
y 2.3% y sus variaciones menores al 30%.
Concentración teórica HPLC (ug/L)
Concentración recuperada HPLC (ug/L)
4
3
2
1
0
0.075
0.910
3.410
Figura 3 Precisión Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución
Exactitud. En el estudio de exactitud se evaluó la eficiencia del método de extracción determinándose
como porcentaje de recuperación.
Para CG-M se prepararon muestras con diferentes concentraciones de diclofenaco, los valores
promedio de porcentaje de recobro se encontraron dentro de los límites 102 -105% y los coeficientes de
variación para cada uno de los niveles de concentración estudiados resultaron ser menor que el 5%
(Tabla 1)
Tabla 1 Exactitud del método cromatografía gases- masas
Concentración
Porcentaje de Recobro
(μgL-1)
(%)
0.005
97.2 100.82 106.12
94.04 99.80 101.84
0.015
99.33 102.68
0.06 101.67
98.20
101.31
96.13 99.33 104.73
102.67
97.56 99.50 103.85
Los valores obtenidos para los límites de detección y cuantificación son 0.0015 y 0.0091 μgL -1
respectivamente.
Para exactitud de cromatografía de líquidos los valores de porcentajes de recobro estuvieron dentro de
los límites 85.6 – 96.0 (tabla 2) y los coeficientes de variación para cada uno de los niveles de
concentración estudiada resultaron ser menor que el 2%.
Tabla 2 Exactitud del método por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Concentración
Porcentaje de Recobro (%)
-1
(μgL )
0.08
85.63 97.75 88.88 91.75 91.75 96.00
1.00
92.8 87.17 88.36 92.83 91.92 91.78
4.00
94.92 98.77 94.29 94.35 93.70 95.44
La determinación del límite de detección y cuantificación se realizó en base a la desviación estándar de
la respuesta del blanco y a la pendiente de la curva de linealidad, obteniéndose valores de 0.0135 μgL -1
para el límite de detección y 0.110 μgL -1 para el límite de cuantificación.
Estabilidad de la muestra
Para comprobar si el método desarrollado es indicativo de estabilidad, la solución estándar de
diclofenaco se sometió a distintas condiciones de almacenamiento.
La diferencia absoluta reportada de acuerdo a la prueba de estabilidad analítica no rebasa el 1% por lo
que se considera estable para el estudio comprendido en 4 días (tabla 3).
Tabla 3 Estabilidad de la solución analítica
Estabilidad de la solución diclofenaco 4 μgL-1
Tiem Día 1
Día 2
Día 3
Día 4
po
cero
Estándar
100 101.08 100.44 100.90 99.69
preparado
Estándar
100.23 100.32 99.88 100.76
frío
Estándar
99.40 99.60
99.77 100.12
Temp
Ambiente
Análisis de muestras reales de agua residual
Para calibrar el método se realizó un muestreo en plantas de tratamiento de agua residual (PTAR) en el
Estado de Morelos, con el fin de cuantificar la presencia de diclofenaco los resultados se presentan en
la tabla siguiente:
Tabla 4 Resultados muestras de agua residual
Agua residual
(PTAR)
Influente
Efluente
Concentración μgL-1
CG-M
HPLC
< 0.009
< 0.11
< 0.009
< 0.11
4. Discusión
Un coeficiente de correlación mayor de 0.99 para la relación de áreas versus concentración, sugiere una
fuerte relación entre la respuesta del instrumento y las concentraciones conocidas de diclofenaco. En
CG-M un coeficiente de variación menor del 2%, indica que el instrumento es preciso bajo las
condiciones de análisis establecidas. En la precisión intermedia para determinar variaciones en los
datos cuando el método lo aplican distintos analistas se obtuvieron coeficientes de variación promedio
de 1.2 y 1.8% para los ensayos 1 y 2 a su vez indican variaciones menores del 20%.
En HPLC el coeficiente de variación de 1.97% muestra que el método analítico es reproducible; los
coeficientes de variación promedio de 1.8 y 2.3% de los diferentes analistas indican que existe una
variación menor del 30%.
El método de extracción en CG-M presenta un porcentaje de recuperación de 102 -105%; el coeficiente
de variación promedio fue menor del 5% de la concentración teórica con respecto a la concentración
real, lo que indica que el método analítico es adecuado para determinar con exactitud diferentes
concentraciones de diclofenaco.
Para HPLC se obtuvieron porcentajes de recuperación de 85.6 – 96.0%, el coeficiente de variación
promedio fue del 2%. No se encontraron picos que interfirieran de manera significativa con la respuesta
de diclofenaco.
Estabilidad. No se observaron variaciones significativas en la solución de diclofenaco cuando se
somete a distintas condiciones de almacenamiento.
En la cuantificación de muestras de agua residual (influente y efluente) no se cuantificó
concentraciones superiores a los límites 0.0091 para CG-M y 0.11 μgL-1 para HPLC.
5. Conclusiones
Se desarrolló un método analítico y específico por CG-MS y HPLC-UV para la determinación de
diclofenaco en muestras de agua. El método validado es lineal, exacto preciso, sensible, confiable y
reproducible en el intervalo de concentraciones establecidas y permite la determinación cuantitativa de
diclofenaco en muestras de agua potable, superficial, subterránea y residual.
6. Referencias
[1] Halling-Sorensen, B., Nielsen, S. N., Lanzky, PF., Ingerslev, F., Holten-Lutzhoft, Jorgensen, SE.,
1998, Ocurrence, fate and effects of pharmaceutical substances in the environmental a review.
Chemosphere 36, 357-393.
[2] Ternes, TA; Stumpf, M; Mueller, J., Haberer, K ; Wilken, RD, Servos, M., 1999.. Behavior and
occurrence of estrogens in municipal sewage treatment plants--I. Investigations in Germany, Canada
and Brazil. Science. Total Environ. 225, 81-90
[3] Gebhardt, W., Schroder, H.P., 2007. Liquid chromatography-(tandem) mass spectrometry for the
follow-up of the elimination of persistent pharmaceuticals during wastewater treatment applying
biological wastewater treatment and advanced oxidation. J., Chromatography. A, 1160, 34
[4] Castiglioni, S-: Fanelli, R., Calamari, D., Bagnati. R., Zuccato, E; 2004, Regul.. Toxicol.
Pharmacol., 39, 25
[5] Roberts, PH, Tomás, KV; 2006, The occurrence of selected pharmaceuticals in waste water
effluent and surgace water of the lower tyne catchment. Science Total Environ., 356, 143-153.
[6] Buser, H., Muller, M., Theobald, N. 1998. Occurrence and fate of the pharmaceuticals drug clofibric in
surface waters; rapid photodegradation in a lake. Environmental Science and Technology. 32, 3449-3456.