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Cultivo in-vitro vegetal
Desarrollo aséptico de protoplastos,
células , tejidos u órganos vegetales
en un medio de cultivo , tan definido
como sea posible y que se mantenga
bajo condiciones ambientales
controladas .
Pasos para iniciar un cultivo in vitro
1- elección del explanto
2-Acondicionamiento y esterilización
3-Implantación en el medio de cultivo
4-Incubación
Explanto
Inóculo
Trozo de material vegetado de
una planta madre a ser
cultivado
ó
Célula, tejido u órgano vegetal
usado para iniciar un cultivo
in-vitro
Material vegetal a subcultivar
que ya está en cultivo in-vitro
Explanto
•La elección del
explanto
depende del
propósito del
cultivo.
Por ejemplo las
yemas axilares y
los meristemas
son apropiados
para
micropogación.
Explantos
• Partes de órganos
– Hojas
– Tallos
– Raíces
– vástagos
– Yemas axilares
– Semillas
– Hypocótilos
• Tipos celulares específicos
– Polen
– Endosperma
Elección del explanto
• Fácil de esterilizar
• Juvenil
• Que responda al cultivo
•Las partes aéreas son mas limpias que las subterráneas
•Cuanto más pequeño sea el explanto más posibilidades
de evitar problemas fitopatológicos (virus, microplasmas,
bacterias), pero disminuye su posibilidad de desarrollo
•Los tejidos internos suelen estar menos contaminados
que los más externos
•Explantos similares puede reaccionar de forma diferente
por influyen:
•Su localización en la planta madre
•Su condición de juvenilidad
Juvenilidad
Frecuentemente asociada a buena habilidad para
enraizar y/o ausencia de floración
La iniciación de cultivos a partir de explantos no
juveniles es problemática
Dónde se localizan los tejidos juveniles?
Juvenil es diferente de jóven
Jóven se refiere a la edad, es el opuesto de viejo.
Juvenil es el opuesto de adulto,
Puede estar referido a:
•Al período de desarrollo del vegetal en el cual el
órgano se inició (las yemas latentes en la base de
un tallo se iniciaron en los seedling)
•La proximidad al sistema radicular
Polaridad
Un explanto en cultivo puede presentar polaridad en
cuanto a la proliferación celular y /o a la morfogénesis
Esto puede estar relacionado con su posición y/o
orientación en la planta madre o con su orientación
dentro del recipiente de cultivo
Example of polarity:
Shoot initiation happens only at one
side of the leaf of Saintpaulia
asepsis
Evitar contaminación utilizando
métodos de esterilización
axénico
Libre de asociación con otros
organismos vivos
Matar o inhibir microorganismos o sus
esporas con calor, filtros, químicos u
otros sistemas
esterilización
Los cultivos de tejidos son técnicas asépticas
Esterilización
• Bacteria and fungi will overgrow the explant on
the medium unless they are removed
• Pre-treatments to clean up the explant
• Detergents
• Sterilants and Antibiotics
Pre-treatments
• Transfer plants to a greenhouse to reduce
endemic contaminants
• Force outgrowth of axillary buds
• Washing removes endemic surface
contaminants
Surface sterilization of plant material
Base protocol
1. Wash explants in a mild detergent before treatment with the
disinfecting solution. (Herbaceous material may not require
this step).
2. Rinse explants thoroughly under running tap water for 10-30
minutes.
3. Submerge explants into the disinfectant solution. Seal bottle
and gently agitate.
4. Under sterile conditions, decant the solution and rinse
explants several times with sterile distilled water.
Surface sterilization of plant material
COMMONLY USED DISINFECTANTS
FOR PLANT TISSUE CULTURE
Disinfectant
Concentration (%)
Exposure (min)
Calcium hypochlorite
9-10
5-30
Sodium hypochlorite*
0.5-5
5-30
Hydrogen peroxide
3-12
5-15
Ethyl alcohol
70-95
0.1-5.0
Silver nitrate
1
5-30
Mercuric chloride
0.1-1.0
2-10
Benzalkonium chloride
0.01-0.1
5-20
*Commercial bleach contains about 5% sodium hypochlorite, and thus may be
used at a concentration of 10-20%, which is equivalent to 0.5-1.0% sodium
hypochlorite.
Sterilization procedures may be enhanced by:
1. Placing the material in a 70% ethyl alcohol solution
prior to treatment with another disinfectant
solution. The use of a two-step (two-source)
sterilization procedure has proven beneficial with
certain species.
2. Using a wetting agent, such as Tween 20 or 80 can
be added to the disinfectants to reduce surface
tension and allow better surface contact.
3. Conducting the sterilization process under
vacuum. This results in the removal of air bubbles
and provides a more efficient sterilization process.
Surface sterilization of plant material
An elaborated example of surface sterilization
•Cut the plant material to an appropriate size to fit the
container which will be used during the sterilsation
procedure
•Rinse plant material under running tap water
•Shake for a few seconds in alcohol
•HgCl2 (0.1 - 1%) + Teepol 2 drops/100ml: 3-5 min
•Rinse in autoclaved distilled water
•Commercial bleach 7-15% + Teepol 2 drops/100ml: 10-30
min
Operations in the Sterile Cabinet:
1. Tie back your hair, roll your sleeves up and remove your
watch and other jewellery. Wash your hands thoroughly
with the disinfectant solution suitable for skin
application. If allergic to any disinfectant wash your
hands with water and wear a pair of surgical gloves.
2. Sterilize the inside of the cabinet by spraying with 70%
alcohol and wiping dry with sterile tissue.
3. Collect and organize all the items you will need close to
or inside the cabinet.
4. Working in the cabinet, take a sterilized piece of
biomass with a pair of forceps (do not touch the plant
material with your hands). Also sterilize your
instruments by dipping them in alcohol between each
manipulation and flaming them.
El tamaño óptimo de un explanto es del orden de 0,5 a 1cm2.
El medio de cultivo en relación a las
características del explanto
ü When you make an explant
like an axillary bud, you
remove it from the sources of
many chemicals and have to
re-supply these to the
explants to allow them to
grow.
Shoot tip - Auxins
and Gibberellins
Leaves sugars, GAs
Roots - water, vitamins
mineral salts and cytokinins
Azúcar:
La concentración de sacarosa depende
fundamentalmente de la edad del material
vegetal a cultivar.
Los tejidos jóvenes requieren
concentraciones de azúcar.
menores
En términos generales el crecimiento y
desarrollo de un cultivo se incrementa con el
aumento de azúcar.
Agua:
En algunas especies un exceso de agua en los
medios de cultivo (cultivos líquidos o sólidos
con bajas concentraciones de agar) provoca
la vitrificación del cultivo.
pH is normally adjusted between 5.5 and 6.0 before
autoclaving
Para la mayoría de la especies el pH óptimo de un cultivo está comprendido entre
5.0 y 6.5.
it governs the solubility of the salts
influences the uptake of medium ingredients
affects the gelling efficiency of agar
Los valores pH bajos traen aparejados la baja estabilidad de algunos
reguladores de crecimiento (auxinas y giberelinas) y vitaminas, la
precipitación de sales del medio y la disminución de la absorción del
amonio.
pH is altered by autoclaving and during the culture
period
El acondicionamiento del mismo se realiza antes de la esterilización del medio, y
el mismo sufrirá una disminución del orden de 0,3-0,5 unidades.
FITORREGULADOR
PROPOSITO
RANGO
Inducción de callos
10-30 µM
Estimulación de organogénesis
1-10 µM
Inducción de callos
10-30 µM
Regeneración de raíces
1-10 µM
AUXINAS
IAA
IBA
2,4-D
Inducción y mantenimiento de callos y 1-50 µM
cultivos sumergidos en estado indiferenciado
pCPA
ácido
p-clorofenoxiacético
Inducción y mantenimiento de callos y 1-50 µM
cultivos sumergidos en estado indiferenciado
NAA
Inducción de callos
2-20 µM
Inducción de raíces
0,2-2 µM
CITOQUININAS
K
6-furfurilaminopurina
Inducción y crecimiento de callos y suspensiones 1−20 µM
BAP
Inducción y crecimiento de callos y suspensiones 0,5−5,0 µM
Inducción de la multiplicación de vástagos, 5−50 µM
yemas axilares y meristemas
Inducción de morfogénesis (vástagos)
1−10 µM
Multiplicación de yemas y meristemas
5−50 µM
2iP
Inducción de callos
(N-isopentenilaminopurina) Inducción de morfogénesis
Zea
2−10 µM
10−25 µM
Multiplicación de yemas, vástagos y meristemas
30−50 µM
Inducción de morfogénesis
0,05−10 µM
GIBERELINAS
Gib A3
Promoción de crecimiento de vástagos
0,3−14 µM
Incremento del desarrollo de embriones y 0,3-48 µM
cultivo de óvulos
ACIDO ABSISICO
ABA
Prevención de germinación precoz y 0,04−10 µM
promoción del desarrollo de embriones
somáticos
Explanto
Tallos adventicios
Raíces
Callos
Auxinas
Citoquininas
Container types and closure devices
Temperature
Para la mayoría de las especies se trata de iniciar cultivos a
lrededor de 22 ± 2°C.
En general es aplicable que la temperatura más adecuada para
el desarrollo de un cultivo es de 3 a 4ºC más elevada que la
media que soporta la planta in vivo.
Fotoperíodo
Duración del día 16h.
Bajas intensidades : cultivos
mixotroficos.
Intensidad
de luz
Para cultivos autotróficos se
requieren mayores intensidades
Recordar que la intensidad depende
del tipo de sistema de cierre de
recipiente de cultivo
Callus
Callus
• Unorganized, growing mass of cells
• Dedifferentiation of explant
– Loosely arranged thinned walled, outgrowths from
explant
– No predictable site of organization or differentiation
• Often can be maintained indefinitely by
subculture, but may lose ability to redifferentiate
• Compact vs friable
• Habituation
Maintenance of Callus
General - Callus induction and maintenance media
contain the same basal constituents.
Most callus requires auxin and cytokinin in the
maintenance medium, particularly after prolonged
culture (except habituated cells).
Callus is re-cultured after 4 to 6 cell doublings, when
growth becomes nutrient limited in a batch culture.
This interval is referred to as a subculture or
passage.
Callus morphology cells may be tightly joined and the tissue mass is
one solid piece (compact)
or cells are loosely joined and individual cells readily
separable (friable), which is affected by the genotype
or the medium composition.
A friable callus is often used to initiate a liquid cell
suspension culture
Genotypic Effects on Callus Morphology
Arabidopsis
Tobacco
3.0 mg/L 2,4-D
Compact Callus
Friable Callus
Medium Effects on Tobacco Callus Morphology
0.1 mg/L kinetin
3.0 mg/L 2,4-D
friable callus
2.0 mg/L IAA
3.0 mg/L 2-iP
compact callus
Cytogenetic/genetic variation –
Cells of callus are genetically very heterogeneous and the
heterogeneity increases during culture
Regenerated plants will reflect this genetic variation
(somaclonal variation).
Somaclonal variation – genetic variation that arises in
somatic (non-germ line) cells
However, morphogenetic competence is more associated
with genetically stable (e.g. meristematic) cells
The cytogenetic changes that occur are polyploidy/aneuploidy,
translocation, epigenetics etc, although the exact genetic basis for
most somaclonal variation is unknown
Cytogenetic variation can be minimized by choosing explants that
are meristematic and maintain callus in media that favor cell
division
epigenética es “el estudio de cambios
heredables en la función génica que
se producen sin un cambio en la
secuencia del ADN”.
Ejemplo de Epigenética
TCAGCTGACTGACTGACTGATCGACTGTTAGCTGACTCAGCTGATCGACTAG
TCAGCTGACTGACTGACTGATCGACTGTTAGCTGACTCAGCTGATCGACTAG
Las bases son las mismas, pero pueden “marcarse” con
diferentes métodos para modificar su expresión, al igual
que se hace con un texto usando diferentes tipos de letra,
subrayado o negrita para destacar los títulos u otras
partes.
EPIGENÉTICA
Mecanismos
silenciadores
Comprende:
Metilación de DNA
Modificación de
histonas:
Deacetilación
Metilación
RNA de interferencia
Callus Growth Patterns
I. Growth patterns leading to continued proliferation of
unorganized callus – maintenance
II. Growth patterns leading to organized development morphogenesis (adventitious organogenesis or somatic
embryogenesis)
Callus Growth Is Predominantly at the Periphery of
the Tissue
Division
E. Sutton, UC Davis
Senescencia
Células
meristemáticas
División
Diferenciación
aumento de
protoplasma
Célula madura
Muerte celular
Expansión
I. Growth Patterns Leading to Continued Proliferation of
Unorganized Callus
A. Induction of growth (manifested as a lag) - Fresh medium induces
quiescent cells (stationary phase) to enter the cell cycle, G1⇒S⇒G2⇒M.
Cells in G1 phase proceed through S (DNA/RNA synthesis) phase and
then through a short G2 phase prior to mitosis
B. Division phase - rapid increase in cell number through periclinal (parallel
to nearest surface) divisions subjacent to the periphery of the callus, and
followed by anticlinal (perpendicular to surface) divisions.
Division >> fresh weight gain resulting in substantial reduction in cell
volume (regressive growth), cells dedifferentiate (become meristematiclike),
C. Cell expansion - no differentiation
II. Growth patterns leading to organized development
A. Induction of growth (lag) –
B. Division phase –
C. Differentiation - cell division slows, during this period
differentiation occurs which is then followed by cell expansion
resulting in the development of an organized structure.
morphogenesis (adventitious organogenesis or somatic
embryogenesis)
Jerusalem Artichoke Tuber Callus
Cell number increases 10-fold in the first 7 days
and cells dedifferentiate into meristematic cells
Induction
Cell division
Differentiation
• Organogenesis
• Somatic embryogenesis
Shoot Organogenesis of Tobacco
High cytokinin
Low cytokinin
Somatic Embryogenesis of Carrot
2,4-D (mg/L)
Organogenesis
The formation of organs (such as
leaves, shoots, roots) on a plant
organ, usually of a different kind.
Organogenesis
ü The process of initiation and development of a
structure that shows natural organ form and/or
function.
ü the ability of non-meristematic plant tissues to
form various organs de novo.
ü the production of roots, shoots or leaves.
ü These organs may arise out of pre-existing
meristems or out of differentiated cells.
ü This, like embryogenesis, may involve a callus
intermediate but often occurs without callus.
Plant Organogenesis
ü Indirect:
– This pathway includes a callus
stage.
• Callus: Undifferentiated tissue
that develops on or around an
injured or cut plant surface or
in tissue culture.
ü Direct:
– It bypasses a callus stage. The
cells in the explant act as
direct precursors of a new
primordium
• An organ or a part in its most
rudimentary form or stage of
development
Organogenesis indirecta
Explanto → Callos → desarrollo meristemoide
→ Primordio
• Auxin/cytokinin 10:1-100:1 induces
roots.
• Auxin/cytokinin 1:10-1:100 induces
shoots
• Intermediate ratios around 1:1 favor
callus growth.
Embriogénesis somática
Somatic Embryogenesis
ü The production of embryos from somatic or
“non-germ” cells.
ü Usually involves a callus intermediate stage
Somatic Embryos
üTissue culture conditions can be modified
to cause to somatic cells to reprogram
into a bipolar structure
üThese bipolar structures behave like a
true embryo - called somatic embryos
El desarrollo de los
embriones somáticos
pasa por los mismos
estados morfológicos
de desarrollo que un
embrión cigótico:
proembrión globular,
trapezoidal,
embrión cordiforme
y torpedo.