RESEARCH CENTER FOR ANIMAL HEALTH AND SAFETY

Transcripción

CENTRO DE INVESTIGACION EN SANIDAD ANIMAL
(CISA – INIA)
EXTRACCIÓN DEL ADN DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA PARA SU DETECCIÓN
MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
PNT/CISA/PPA/ EXTRACCIÓN ADN /1
REV. 2013
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CONTENIDO
CENTRO DE INVESTIGACION EN
SANIDAD ANIMAL (CISA-INIA)
Laboratorio de Referencia de la UE de PPA (EURL-ASF)
Centro de Investigación en Sanidad Animal
CISA-INIA, Valdeolmos 28130, Madrid, Spain.
Contacto
Dr. Carmina Gallardo
Virginia Pelayo
1. OBJETO.
2. ALCANCE.
3. REFERENCIAS.
3.1. DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN.
3.2. DOCUMENTOS (PNTs) A UTILIZAR CONJUNTAMENTE.
E-mail: [email protected]
4. GENERALIDADES.
5. REALIZACIÓN.
5.1. MATERIALES Y REACTIVOS.
PNT CISA/PPA/ EXTRACCIÓN ADN /1
PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE TRABAJO PARA LA
EXTRACCIÓN DEL ADN DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA
PARA SU DETECCIÓN MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
5.2. PREPARACIÓN.
5.3. REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA.
5.4
PUNTOS CRÍTICOS
5.5
MEDIDAS DE SEGURIDAD.
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1. OBJETO.
4.
El objeto del presente procedimiento es describir el método a seguir para la
extracción específica de ADN del virus de la peste porcina africana (VPPA) en material
clínico utilizando el kit de extracción de ácidos nucleicos High Pure PCR Template
Preparation Kit [Ref. 11796828001 (ROCHE)] para su posterior amplificación mediante la técnica
de PCR.
Esta técnica se encuentra incluida en el Manual de la OIE (capítulo 2.8.1 del “Manual
de las Pruebas de Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres” de la
edición del 2012).
PPA REVISIONES:
1.
2.
2. ALCANCE.
Se recomienda, en el caso de muestras de sangre-EDTA, analizarlas siempre sin diluir,
y, en el caso de homogeneizados de tejidos, analizarlos por duplicado sin diluir y en
una dilución 1/10.
3. 3. REFERENCIAS.
3.1. DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN.
1.
2.
3.
AFRICAN SWINE FEVER. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial
Animals (mammals, birds and bees). CHAPTER 2.8.1. OIE, 2012
[http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.08.01_ASF.pdf]
Protocol High Pure PCR Template Preparation Kit: Commercial nucleic acid
ROCHE [http://www.roche-applied-science.com/proddata/gpip/3_6_8_48_1_1.html]
Agüero M, Fernández J, Romero LJ, Zamora MJ, Sánchez C, Belák S, Arias M,
Sánchez-Vizcaíno JM. “A highly sensitive and specific gel-based multiplex RT-PCR
Arias, M., Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2012). African swine fever. In: Zimmerman, J.,
Karriker, L.A., Ramirez, A., Schwartz, K.J, Stevenson, G.W. (Eds), Diseases of swine,
10th Edition. John Wiley and Sons, United States of America, pp. 396-404.
Arias, M.; Sánchez, C.; González, M.A.; Carrasco, L. y Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2002).
“Peste porcina Africana” In “Curso digital de enfermedades infecciosas porcinas”.
[http://www.sanidadanimal.info/cursos/curso/7/7-ppa.htm] on line, July, 2002.
3.
Este procedimiento es de aplicación a los siguientes tipos de muestras de origen
porcino; suero, sangre (con EDTA) y homogeneizados de tejidos. También se palica a
homogeneizados de garrapatas género Ornithodoros.
assay for the simultaneous and differential diagnosis of African swine fever and
Classical swine fever in clinical samples”. Vet Res. 2004 Sep-Oct;35(5):551-63.
M. Agüero, J. Fernández, L. Romero, C. Sánchez, M. Arias, J.M. Sánchez-Vizcaíno.
2003. “Highly Sensitive PCR Assay for Routine Diagnosis of African Swine Fever
Virus in Clinical Samples”. J. Clin. Microbiol., vol. 41, no. 9, p. 4431-4434.
Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). RECOGNIZING
AFRICAN SWINE FEVER. A FIELD MANUAL. 2000 Edition.
[ http://www.fao.org/docrep/004/X8060E/X8060E00.HTM]
3.2. DOCUMENTOS (PNTs) A UTILIZAR CONJUNTAMENTE.



PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA PESTE PORCINA
AFRICANA (PNT/CISA/PPA/MUESTRAS/1).
DETECCIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA MEDIANTE
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) CONVENCIONAL
(PNT/CISA/PPA/PCR/1)
DETECCIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA MEDIANTE
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL
(PNT/CISA/PPA/PCR/2)
4. GENERALIDADES.
4.1. ABREVIATURAS.
ADN: ácido desoxirribonucleico.
E+: Control positivo de extracción.
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E-: Control negativo de extracción.
PPA: Peste Porcina Africana.
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa.
r.p.m.: revoluciones por minuto.
VPPA: Virus de la peste porcina africana
4.2. PRINCIPIO.
El proceso de extracción de ácidos nucleicos utilizando el kit comercial High Pure PCR
Template Preparation Kit se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos
en presencia de sales caotrópicas. Las células son inicialmente lisadas durante una
corta incubación con proteinasa K en presencia de una sal caotrópica (HCl-guanidina),
que inmediatamente inactiva todas las nucleasas. Los ácidos nucleicos se unen o
adsorben selectivamente al filtro de fibra de vidrio (sílica) en un tubo de centrífuga
especial. Los ácidos nucleicos permanecen unidos al filtro durante los siguientes pasos
de lavado y centrifugado, donde se eliminan las moléculas celulares contaminantes,
sales y proteínas. Posteriormente, los ácidos nucleicos se eluyen de la membrana de
sílica mediante tampones de elución con baja concentración de sales (ligeramente
alcalinos) o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los
ácidos nucleicos, liberándolos así de la membrana.
5. REALIZACIÓN.
5.1. MATERIALES Y REACTIVOS.
MATERIAL






Congelador de <-10ºC.
Congelador ≤-70ºC.
Gradillas tubos eppendorff od e características similares.
Microcentrífuga de mesa.
Micropipetas automáticas monocanal de 1-10 µl.







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



Nevera de 4±3ºC.
Papel absorbente.
pHmetro (0,01 UpH).
Pipeteador automático Pipetboy acu o equivalente.
Pipetas de vidrio o plástico, estériles, para descargar 1-25 ml.
Puntas de micropipeta con filtros resistentes a aerosoles de rangos 1 10,
2-20, 20-200 y 100-1000 µl, estériles.
Puntas de pipetas desechables de 1-20, 20-200 and 200-1000 l.
Reloj cronómetro.
Tubos eppendorf (o equivalentes) de 0,5 ml, 1,5 ml y 2 ml.
Termobloque (72±2ºC).
Vórtex.
REACTIVOS INCLUIDOS EN EL KIT:
Conservación: temperatura ambiente.
 Binding Buffer (20 ml) [6 M guaninidina HCl, 10 mM urea, 10 mM Tris-HCl,
20% Triton X-100 (v/v), pH 4,4].
 Proteinase K, recombinant PCR grade 20 mg/mL (liofilizada).
 Inhibitor Removal Buffer (33 ml) [5 M guanidine-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH
6.6].
 Wash Buffer (20 ml) [20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5].
 High Pure Filter Tubes: 2 bolsas con 50 tubos de polipropileno con dos
capas de lana de fibra de vidrio hasta 700ml de volumen de muestra.
 Collection Tubes: 2 bolsas con 50 tubos de polipropileno (2ml)
REACTIVOS NO INCLUIDOS EN EL KIT:





Etanol absoluto [Ref.: 1.00983.1000 (Merck) o características similares].
H2O destilada grado de PCR.
Isopropanol (≥ 99%) [Ref.: I9516 (Sigma) or o características similares].
Controles del proceso de extracción:
E+ Muestra positiva al VPPA empleada como control positivo
durante el proceso de extracción del ADN: muestra positiva
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
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(suero,sangre con EDTA, tejido homogeneizado en dilución 1/10 o
sobrenadante de cultivo) diluidos en muestra negativa. Es recomendable
que el positivo de extracción se encuentre en el límite de detección de
la técnica para asegurar el rendimiento del proceso de extracción del
ADN. Conservar a <-10ºC en alicuotas. Fecha de caducidad: 6 meses
E- Muestra negativa utilizada como control negativo en el proceso de
extracción: Agua destilada grado PCR incluida en proceso de extracción
para excluir posibles contaminaciones
3.
Mezclar invirtiendo los tubos e incubar 10 min a 72±2ºC. Centrifugar unos
segundos, un pulso de centrífuga, para eliminar restos de muestra en la
tapa.
4.
Añadir 100 l de isopropanol.
5.
Mezclar agitando en vórtex. Centrifugar unos segundos, un pulso de
centrífuga, para eliminar restos de muestra en la tapa.
6.
Pasar la mezcla al High Pure filter tube colocado sobre un tubo colector.
Centrifugar 1 min a 8.000 g (con muestras de sangre, repetir el paso de
centrifugación si queda muestra sobre el filtro).
7.
Descartar el tubo colector y colocar el tubo columna sobre un nuevo tubo
colector
8.
Añadir 500 l Inhibitor Removal Buffer. Centrifugar 1 min a 8.000 g.
9.
Descartar el tubo colector y colocar el tubo columna sobre un nuevo tubo
colector.
5.2. PREPARACIÓN
5.2.1. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS.
La preparación de las muestras a analizar se realizará según se describe en el
procedimiento de preparación de muestras para el diagnóstico de la peste porcina
africana [PNT/CISA/PPA/MUESTRAS/1].
5.2.2 PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS:



Proteinasa K liofilizada: resuspender la proteinasa K en 4,5 ml de agua
destilada estéril y alicuotar en volúmenes de 500 l. Conservación: <-10ºC
hasta su uso.
Inhibitor Removal Buffer: añadir 20 ml de etanol absoluto al vial original.
Etiquetar y marcar la fecha en la botella. Conservar a temperatura
ambiente
Wash Buffer: añadir 80 ml de etanol absoluto al vial original. Etiquetar y
marcar la fecha en la botella.
Conservar a temperatura ambiente.
5.3. REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA.
1.
Pipetear 200 l de Binding Buffer y 40 l de Proteinasa K en un tubo de
microcentrífuga de 1,5ml.
2.
Añadir 200 l de muestra. Incluir en cada proceso de extracción E+ y E(200 l H2O).
10. Añadir 450 l de Wash Buffer. Centrifugar 1 min a 8.000 g.
11. Descartar el tubo colector y colocar el tubo columna sobre un nuevo tubo
colector.
12. Repetir el paso de lavado.
13. Centrifugar sobre un tubo vacío a 13.000 g 10 seg.
14. Colocar la columna sobre un tubo de 1,5 ml con tapa.
15. Añadir 50 l de agua destilada estéril, precalentada a 72±2ºC,
asegurando que cubre totalmente el filtro. Centrifugar 1 min a 8.000 g.
16. Recoger el eluido conteniendo el ADN y guardar a <-10ºC hasta su uso
(fecha de caducidad: 12 meses) o a 4±3ºC si se va a emplear en 1-2 h
desde su obtención.
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5.4. PUNTOS CRÍTICOS
5.5. MEDIDAS DE SEGURIDAD.
El punto crítico durante todo el proceso de análisis es el riesgo de contaminación de
las muestras y, por tanto, los posibles falsos positivos que en este caso se obtendrían.
La contaminación puede deberse al propio VPPA presente en las muestras que
puedan ser positivas o en los controles positivos empleados en el proceso de
extracción. Por ello, es imprescindible seguir y cumplir unas estrictas normas de
trabajo para minimizar el riesgo de contaminación intrínseco a la técnica de PCR:
 Todos los pasos que implican el análisis de muestras por PCR se realizarán en
espacios diferenciados, con equipamiento y material específicos para cada
uno: preparación de muestras, extracción de ADN, montaje de mezcla de
PCR, análisis por electroforesis de los productos de PCR.
 Trabajar siempre con guantes de látex o nitrilo limpios en el laboratorio de
PCR.
 Cada vez que el técnico que esté realizando el análisis acceda a una zona de
PCR diferente, deberá cambiarse los guantes desechando los que tenía
puestos.
 El material será de uso exclusivo para el paso del procedimiento para el que
esté destinado por su situación/identificación.
 Utilizar una punta de pipeta diferente cada vez que se pipetee en un tubo
conteniendo alguna muestra o ADN.









Leer y seguir cuidadosamente el protocolo.
Conservar los reactivos a la temperatura indicada antes y después de su
utilización.
No mezclar reactivos ni instrucciones de diferentes kits.
Evitar cualquier contaminación de los reactivos.
No utilizar los reactivos una vez superada la fecha de caducidad.
No comer, beber ni fumar en el laboratorio.
No pipetear los reactivos con la boca.
Utilizar siempre guantes de látex o nitrilo.
El Binding Buffer, el Inhibitor Removal Buffer y el Wash Buffer incluidos en el kit
de extracción de ADN contienen derivados de guanidina que son irritantes, por lo
que deben ser manipulados con precaución. En caso de contacto con piel,
mucosas y/u ojos, lavar inmediatamente con agua abundante. Si ocurre un
vertido accidental, diluir con agua antes de limpia

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