Bacterias Lácticas y Fermentación Maloláctica

Bacterias Lácticas y Fermentación Maloláctica

BACTERIAS ACIDO LACTICAS
Y FERMENTACION
MALOLACTICA
Dra. Mariana Combina
Laboratorio de Microbiología Enológica
EEA Mendoza -INTA
BAL
Cocos o bacilos
Cocos o bacilos
Gram positivos
No Esporulados
Catalasa negativa
REACCION DE CATALASA
2 H2 O 2
2 H2O + 1 O 2
Cocos o bacilos
Gram positivos
Propiedades
metabólicas y
nutricionales comunes
No Esporulados
Catalasa negativa
Acido láctico
Anaerobios aerotolerantes (citocromos, heminas)
RELACIONES CON EL OXIGENO
Compuestos tóxicos del oxígeno
Superóxido O2
peróxido de hidrógeno H2O2
Supeóxido dismutasa
2 O2 + 2 H+
O2 + H2O2
Catalasa
2 H 2O2
Peroxidasa
C-org. + H2O2
Mn+2
2 H2O + O2
2Mn+2 + 2 O2
2 MnO2
C-O + H2O
2 MnO2
MnO2- + O2 + Mn+2
Cocos o bacilos
Gram positivos
No Esporulados
Propiedades
metabólicas y
nutricionales comunes
Catalasa negativa
Acido láctico
Anaerobios aerotolerantes (citocromos, heminas)
Poliauxótrofos
POLIAUXOTROFOS
Mn+2
Vitaminas de grupo B
aminoácidos
bases púricas y pirimidínicas
Medios complejos
con peptona o Extracto de levadura
y azúcar fermentable
Acido pantoténico (uva, tomate)
Cocos o bacilos
Gram positivos
Propiedades metabólicas y
nutricionales comunes
No Esporulados
Catalasa negativa
Acido láctico
Anaerobios aerotolerantes (citocromos, heminas)
Poliauxótrofos
Metabolismo homo y heterofermentativo
ADP
ATP
acetato
Metabolismo
Azúcares: monosacáridos
disacáridos (sacarosa)
pentosas (arabinosa, xilosa,
ribosa, ramnosa)
hexosas (glucosa, fructosa)
D-lactico/L-lactico
Ácidos orgánicos: cítrico, málico y tartárico
Alcoholes:
glicerol
Pentosas se metabolizan por vía pentosa fosfato
1 pentosa
1 lactato + 1 acetato + 2 ATP
CLASIFICACION GENERAL
Pediococcus
cocos
2 planos
homoferment.
Lactococcus
(Streptococcus)
cocos
1 plano
(cadenas)
homoferment.
Leuconostoc
(Oenococcus)
cocos
Lactobacillus
bacilos
1 plano
homo
hetero
heteroferment.
L. mali
L. casei (facultativo)
L. plantarum
L. hilgardii
L. fructivorans, otros
BAL están presentes en todas la etapas de la vinificación
Uva
103-104 ufc/mL
(madurez y sanidad uva)
Lb. plantarum
Lb. casei
Lb. hilgardii
Lb. mesenteroides
P. damnosus
Inicio de FOH
102-103 ufc/mL
Final FOH
mantiene bajo (fase latencia-variable)
Desarrollo hasta 106-108 ufc/mL
SO2
Depende de distintos factores
(pH, etanol, temperatura, SO2,
interacción levadura, autolisis levaduras
CO2)
Oenococcus oeni y algunos Pediococcus o Lactobacillus
Oenococcus oeni
Glucosa
2 NADH
CO2
Pentosa P
G3P
Fructosa
F6P
ATP
acetilP
acetato
2
1 NAD
1 NADH
etanol
ATP
Piruvato
lactato
1 NAD
1 ATP
2
ATP
En condiciones limitantes de NAD
ferm láctica
no limitantes de NAD ferm. ácido mixta
Oenococcus oeni
Glucosa
2 NADH
Fructosa
1 NAD
CO2
manitol
ribulosa5P
G3P
ATP
acetilP
acetato
2 NAD
1 NADH
etanol
ATP
Piruvato
lactato
acetato +
1 NAD
1 NAD
CO2
Citrato
secuencial
Presencia de otros aceptores externos modifica el metabolismo y
estimula el crecimiento
Oenococcus oeni
Glucosa
2 NADH
CO2
ribulosa5P
G3P
Piruvato
acetilP
Acetoina
ATP
Acido acético
(0,1-0,2 g/L)
diacetilo
Estimula el crecimiento bacteriano
Citrato
pH elevado + acético - diacetilo
pH bajo
- acético + diacetilo
Zaunmuller, 2006
FML
málico-cítrico secuencial??
Necesidad de control una vez finalizada la FML
Las bacterias permanecen largo tiempo en vino
Curvas de crecimiento (FML-espontánea)
9
7
log UfC/ml
6
2 per. media móvil (log
UfC/ml)
5
4
Lavalle
Final de
degradación del
ácido málico
3
4
11
21
29
38
46
53
60
Dias
9
8
7
La Consulta
log UFC/ml
log UFC/ml
8
6
log UFC/ml
5
2 per. media móvil (log
UFC/ml)
4
3
Final de
degradación del
ácido málico
2
1
9
19
23
27
32
Días
39
43
63
FERMENTACION MALOLÁCTICA EN VINOS
FML
mecanismo adicional de energía (ATP)
Membrana
++
+
++ - Fuerza protón motriz
+
+ Gradiente químico (pH)
Potencial eléctrico (cargas + y -)
H+
H+
El mantenimiento de potencial requiere ATPasa
Eflujo de protones requiere ATP
Influjo de protones genera ATP
FERMENTACION MALOLÁCTICA EN VINOS
Oenococcus
oeni
Malato - -
Deben alcanzar
106 cel/mL
Malato - CO2 alcaliniza y
lactato
H+
exterior
Lactato H+
Fuerza protón motriz
(simporte)
interior
ADP
H+
H+
ATP
aumenta gradiente de
pH
Modificaciones en el vino- Positivas
Acidez
Suaviza
Volumen
Aroma
Estabilidad
Disminuye AT (pH aumenta 0,1-0,3 unidades)
Decrece astringencia
Aumenta la condensación de taninos
Polisacáridos
Reducción de los herbáceos
Frutales (¿?) damasco,ciruela
Madera, roble
Manteca y lácteos (diacetilo: 1-4 mg/L)
β-glucosidasas en O.oeni
Consumo de azúcares-bacteriocinas
FML espont.en botella
Modificaciones en el vino -negativas
Acidez
Elevar AV (0,2-0,3 g/L)
Color
Puede disminuir hasta 30%:
Modificación del pH
Antocianasa (antocianos glucosilados)
Consumo de acetaldehído
Manteca
Producción de diacetilo (5-7 mg/L) (puede ser
degradado por las levaduras)
Aroma
Enmascara aromas varietales
Riesgo
Aromas fenolicos y piridinas
Aminas biógenas
Etil-carbamatos
Fermentación maloláctica
Depende de factores:
Azucares residuales (hexosas, pentosas, acidos
azúcares-nitrógeno
orgánicos) disponible
pH
Etanol
SO2
Fuentes de nitrógeno: autolisis
mantenimiento sobre borras
(absorción de compuestos tóxicos para BAL y
generación de CO2)
Temperatura
Fermentación maloláctica
Depende de factores:
pH <3,0
no BAL
Oenocuccus más R
azúcares-nitrógeno
pH crítico: 3,5 disponible
(otras BAL)
pH
Etanol
SO2
Importante: balance uso azucares y málico
(óptimo enzima ML: 3,8 – 60% act: 3,0-3,2)
Ensayo pH: 3,15 FML 165 días
3,8 FML 14 días
PH bajo: favorece FML y ingreso de málico
pH elevado: lenta entrada de málico
favorece el uso de azucares
Temperatura
aumento AV- picado
Fermentación maloláctica
Depende de factores:
azúcares-nitrógeno disponible
pH
OH> 10%
Etanol
Importante: efecto inhibidor se potencia con
pH – transporte malico
SO2
10% OH/pH 3,3: solo Oenococcus
inhibe la mayoría de BAL
Temperatura
12% OH/pH 3,2: selección de un m.o. nativo
Fermentación maloláctica
Depende de factores:
azúcares-nitrógeno disponible
pH
Etanol
SO2
Todas las formas de SO2 son activas (+ o -)
Dependiente de pH
Degrada acetaldehido libera SO2 ligado
SO2
Temperatura
10 mg/L libre
sin problema
30 mg/L libre
inhibe
Fermentación maloláctica
Depende de factores:
azúcares-nitrógeno disponible
pH
Etanol
SO2
Temperatura óptima
Temperatura óptima
creci: 28-30 ºC
FML: 18-20 °C
Temperatura
Frío: 10-15ºC crecimiento insuficiente
106 cel/mL de mosto
Factibilidad de FML
Otros factores que afectan la FML
Taninos
MERLOT
Evidencia en algunos tintos más FML que en otros
Tendría fracciones tánicas que inhiben FML
Antocianos
estimulan el crecimiento
Taninos
inhiben
Solo luego de polimerización FML
Extracto de vino
igual que testigo sin vino
Taninos de la piel
Taninos de semilla
Taninos de madera
estimulan
inhiben (concentrac 10 veces sup.)
estimulan
Manoproteínas protegen a BAL de taninos
Cabernet Sauvignon no dio igual – Tanah similar
Otros factores que afectan la FML
Carencias nutritivas
Mantenimiento sobre borras
Excesiva clarificación
Compactación de borras – mover
Nutrición
En agua de hidratación
(levaduras inactivas,
aa, vitaminas,
minerales)
En vinos difíciles (idem
+ polisacáridos y
celulosa para
suspensión)
Concentración inicial de acido málico
Exceso de oxígeno
Rango 0,8 a 4 g/L
Debe evitarse al final de la FA
Otros factores que afectan la FML
Residuos de fungicidas
Cepa de levadura
Botriticidas
Switch (fluodioxinil+ciprodinil)
Competencia por sustrato
SO2
Etanol
Acidos grasos (C6-C12)
Péptidos
Adecuada elección de la
cepa
Tabla de compatibilidad con la FML
Level of compatibility
Yeast strains
5
++
QA23
ICV D254
71B
AMH
W15
4
+
DV10
R2
M2
W
W27
6U
CY3079
W46
RC212
ICV D80
VN
VRB
ICV GRE
ICVD47
Rhone 4600
CM
CS2
299
NEM
PMA
BC
CEG
43
3
+EC1118
PM
ICV D21
BDX
BRL97
SLO
Cross evolution
BGY
CSM
VQ15
228
2
CEG
SIMI White
2323
2226
RHST
T306
2056
RA17
BM45
BM4x4
BA11
1
-M1
K1
WAM
Opale
0
No information
C1108
C or R7
FC9
QD145
T73
ALB
Syrah
M69
CGC62
CK
GHM
MCS
SVG
Que hacer para si la FML no se produce
Eliminación de tóxicos
Re-inoculación
Paredes de levaduras
Bentonita
H2O2
Adecuada elección de la cepa
Nutrición
Control de temperatura
Adaptación de la cepa a las condiciones del vino
Test rápido para la FML
Fermentación maloláctica
Espontánea
Impredecible
Largos retrasos
Costo
Riesgo alteración (Brett)
FML sp -Aminas
biógenas
Disminución de la
calidad sensorial
Inoculada
Uso de inóculos
comerciales
Problemas
Medio poco favorable
Falta de adaptación
Bacterias no autóctonas
Implantación deficiente
Inadecuada activación
Optimizar el tiempo de
inoculación
Tiempo de inoculación
Inoculación temprana
Inoculación tardía
Simultáneamente con las
levaduras o
tempranamente en la FA
Después de completarse
la FA
Co-inoculación – experimentación desde 2004
Objetivo:
Evaluar la factibilidad de la co-inoculación en mostos tintos
Variables:
Distintas cepas de BAL MBR y en diferentes combinaciones con levaduras (paper)
Cepas MBR y pre-aclimatadas
Tiempo óptimo de inoculación temprana (24 hs y 48 hs)
Impacto sobre:
•
•
•
•
viabilidad de las levaduras y FA
viabilidad de las BAL y FML.
producción de acido acético
características físico-químicas y organolépticas de los vinos Malbec.
•
Comparar los resultados obtenidos con co-inoculación con la práctica
tradicional de inoculación secuencial (al final de la fermentación alcohólica)
utilizando inóculos 1-Step y MBR.
Co-inoculación – ensayos 2007
- Malbec 1 = 3,6
- Malbec 2 = 3,8
D254 + Alpha 1-Step
Inoculación
simultanea
24 y 48hs
Inoculación
secuencial
Control MBR
Tiempo para alcanzar concentraciones de ácido málico
menores a 0,1 g/L en los mostos Malbec 1 y 2
Mosto
Tratamiento
1
24
48
FA 1-Step
FA MBR
Tiempo de FML
desde inoculación
(días)
8
5
6
8
24
48
FA 1-Step
FA MBR
8
5
6
8
2
Final FA 13 días
Tiempo total de
fermentación
(FA+FML)(días)
13
13
19
20
13
13
19
20
Levaduras y fermentación alcohólica
Malbec 1
1,12
24-1
FA 1-Step-1
1,1
Malbec 2
1,12
48-1
FA MBR-1
24-2
FA 1-Step-2
1,1
1,08
48-2
FA MBR-2
Densidad
Densidad
1,08
1,06
1,06
1,04
1,04
1,02
1,02
1
1
0,98
0,98
0
2
4
6
8
Tiempo (días)
10
12
14
0
2
4
6
8
Tiempo (días)
10
12
14
Seguimiento de la fermentación alcohólica realizada en los mostos 1 y 2 por la levadura ICV D254 y la
bacteria Uvaferm Alpha 1-Step inoculada en distintos tiempos (24, 48 y FA 1-Step) y su control MBR
inoculada al final de la FA (FA-MBR).
2
4
6
8
10
12
14
16
0
2
4
Tiem po (días)
2
1
0
12
15
3
2,7
2,4
2,1
1,8
1,5
1,2
0,9
0,6
0,3
0
16
18
21
24
6
5
4
3
2
1
0
0
3
Inoculación BAL
6
9
12
15
18
21
24
Tiem po (días)
Tiem po (días)
Final FA
14
8
7
Log UFC/mL
6
5
4
3
9
12
9
Ácido L-málico(g/L)
Log UFC/mL
3
2,7
2,4
2,1
1,8
1,5
1,2
0,9
0,6
0,3
0
6
10
Malbec 1 - FA MBR
9
8
7
3
8
Tiem po (días)
Malbec1 -FA 1-Step
0
6
3
2,7
2,4
2,1
1,8
1,5
1,2
0,9
0,6
0,3
0
Ácido L-málico (g-L)
0
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Ácido L-málico (g-L)
4
3
2
1
0
Log UFC/mL
Malbec 1-48
3
2,7
2,4
2,1
1,8
1,5
1,2
0,9
0,6
0,3
0
L-málico(g/L)
Log UFC/mL
Malbec 1-24
9
8
7
6
5
ICV D254
1-Step
Ácido L-málico
Degradación del ácido L-málico y viabilidad de Saccharomyces cerevisiae (ICV D254) y Oenococcus oeni
(Uvaferm Alpha 1-Step y MBR) en el mosto 1 (pH 3,6) en distintos tiempos de inoculación. 24: 1-Step adicionada
a las 24 horas, 48: 1-Step adicionada a las 48, FA 1-Step: 1-Step adicionada al final de la FA y FA MBR: cepa
MBR adicionada al final de la FA. La línea de puntos indica la población de BAL nativas previas a la inoculación
con la cepa comercial
Evaluación del consumo de azúcares
Mosto
1
2
Tratamiento
24
48
FA
FA
24
48
FA
FA
1-Step
MBR
1-Step
MBR
Acido D-Láctico
(g/L)
0,134
0,170
0,138
0,141
0,064
0,080
0,070
0,083
Producción de ácido acético en mostos 1 y 2 fermentados con la levadura ICV D254 inoculados con la
bacteria láctica comercial Uvaferm Alpha 1-Step en distintos tiempos (24, 48 y FA 1-Step) y su control
MBR inoculada al final de la FA (FA MBR).
Malbec 2
1
0,8
0,8
AV (g/L acético)
AV (g/L acético)
Malbec 1
1
0,6
0,4
0,2
24-1
FA 1-Step-1
48-1
FA MBR-1
0
0,6
0,4
0,2
24-2
FA 1-Step-2
48-2
FA MBR-2
0
0
2
4
6
8
10 12 14 16
Tiem po (días)
18
20
22
24
0
2
4
6
8
10 12 14 16
Tiem po (días)
18
20
22
24
Valores físico-químicos finales de los vinos Malbec 1 y 2 fermentados con la levadura ICV D254 y la
bacteria Uvaferm Alpha 1-step inoculada en distintos tiempos (24, 48 y FA 1-Step) y su control MBR
inoculada al final de la FA (FA MBR).
Mosto
Tratamiento
Acidez
Volátil (g/L
ac. acético)
1
24
48
FA 1-Step
FA-MBR
0,71
0,70
0,65
0,68
Acidez
total
(g/L ac.
tartárico)
5,11
4,94
4,57
4,72
24
48
FA 1-Step
FA-MBR
0,80
0,60
0,70
0,62
5,08
4,51
4,62
4,54
2
pH
Etanol
(% v/v)
3,70
3,76
3,88
3,85
14,13
14,54
14,84
14,87
1,67
1,53
1,61
1,95
3,83
3,95
3,93
3,92
14,26
14,72
14,97
15,08
1,69
1,83
2,03
1,95
Azúcares
reductores
(g/L)
24
48
F1
FMBr
Intensidad de color
4,00
3,50
Astringencia
3,00
Matiz violeta
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
Amargo
Intensidad aromática global
0,00
Reducido
Frutal
Láctico
Fig. Nº1: Descriptores organolépticos de vinos Malbec pH 3,6. Medias correspondientes a 11
degustadores. INTA. 2007.
Conclusiones
Los inóculos de bacterias 1-Step previamente aclimatados presentan:
•Óptimo comportamiento para ser utilizados en inoculación temprana.
• Buena adaptación tanto en mosto como en vino.
• Rápida degradación del ácido málico.
Parámetros como la viabilidad de las levaduras y
performance de la FA no fueron negativamente afectados.
En sólo un caso se observó un leve aumento en la acidez volátil
final de los vinos comparado con los tratamientos control (dentro de
los límites tolerados).
El análisis sensorial de los vinos mostró algunas diferencias
significativas las cuales en general se presentaron a favor de la
inoculación temprana con las cepas pre-aclimatadas
Consideraciones
Intentar que la FML finalice conjuntamente con la FA o días después
Evaluar el riesgo de las fermentaciones languidecientes
Mejor resistencia a los inhibidores (pesticidas)
Poco consumo de azucares (ácido D-láctico)
Cepas preaclimatadas mas rápidas que cepas de inoculación
directa
Importante la matriz y la elección de la cepa de levadura
Control de población nativa de BAL
Desarrollo exitoso de la FML
No afecta perfil sensorial o mejora preferencia consumidor
Muchas gracias !!!
[email protected]