Sistema para el registro del potencial de acción de células

Transcripción

Proyecto Final
Sistema para el registro del
potencial de acción de células
cardíacas con Microelectrodos
Intracelulares
Autor: Cristian Pablo Pennisi
Director: Dr. Leonardo Nicola Siri
Comisión Evaluadora :
Ing. Federico Falco
Bioing. Gabriel Gentiletti
Arq. Enzo Grivarello
Ing. José Vilá
Universidad Nacional de Entre Ríos
Facultad de Ingeniería - Bioingeniería
Oro Verde - Entre Ríos - Argentina
Diciembre de 1998
2
Indice Analítico
RESUMEN
7
ORGANIZACIÓN GENERAL DEL DOCUMENTO
8
SECCIÓN 1: OBJETIVOS Y ANTECEDENTES
9
1. CAPÍTULO UNO: OBJETIVOS
10
1.1 OBJETIVOS GENERALES
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
10
10
2. CAPÍTULO DOS: ANTECEDENTES
11
2.1 ACTIVIDAD ELÉCTRICA DEL CORAZÓN
2.1.1 El corazón : breve descripción anatómica y fisiológica
2.1.2 Origen de la actividad eléctrica del corazón
2.1.2.1 Potencial de membrana.
2.1.2.2 Modelo de las conductancias en paralelo
2.1.2.3 La ecuación de Nernst
2.1.2.4 La ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz
2.1.3 Potencial de acción cardíaco
2.1.3.1 El potencial de acción en el miocardio ventricular
2.1.3.2 El potencial de acción en el nódulo sinusal
2.1.4 Registro de la actividad eléctrica del corazón
2.1.4.1 Métodos in vivo
2.1.4.2 Métodos in vitro
2.2 METODOLOGÍA PARA EL REGISTRO DEL POTENCIAL DE ACCIÓN CON MICROELECTRODOS
11
11
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12
13
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18
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INTRACELULARES
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30
30
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37
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39
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41
2.2.1 Sistema ambiental
2.2.1.1 Perfusión de solución fisiológica
2.2.1.2 El control de la temperatura
2.2.1.3 Perfusión de oxígeno
2.2.2 Sistema óptico
2.2.3 Sistema mecánico
2.2.3.1 Mesa antivibratoria
2.2.3.2 Micromanipulador
2.2.3.3 Elementos de fijación
2.2.4 Sistema para el registro analógico de la señal
2.2.4.1 Microelectrodos
2.2.4.2 Preamplificador
2.2.4.3 Guarda electrostática
2.2.4.4 Compensación de capacitancia
2.2.4.5 Circuito amplificador
2.2.4.6 Estimulación del preparado
2.2.4.7 Eliminación de interferencias
3
2.2.4.8 Voltímetro
2.2.4.9 Osciloscopio
2.2.5 Sistema de adquisición digital de la señal
2.2.5.1 Requisitos del hardware
2.2.5.2 Requisitos del software
2.3 DISEÑO DEL ESPACIO DE TRABAJO
2.3.1 El diseño de puestos de trabajo
2.3.2 Elección de la postura de trabajo óptima
2.3.3 El espacio de trabajo para personal sentado
2.3.3.1 Dimensiones del espacio de trabajo
2.3.3.2 Area de la superficie horizontal de trabajo
2.3.3.3 Altura de la superficie horizontal de trabajo
2.3.4 Espacio físico y distribución [18]
2.3.4.1 Principios guía de distribución
2.3.4.2 Métodos de análisis
2.3.4.3 Situación general de los componentes
2.3.4.4 Distribución específica de los componentes
42
42
42
42
44
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45
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46
46
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50
SECCIÓN 2 : DESARROLLO DEL PROYECTO
52
3. CAPÍTULO TRES : SISTEMA AMBIENTAL
53
3.1 PERFUSIÓN DE SOLUCIÓN FISIOLÓGICA
3.2 EL CONTROL DE LA TEMPERATURA
3.2.1 Características del sistema
3.2.2 Fuente de alimentación
3.2.3 Controlador de temperatura
3.2.4 Termómetro digital
3.3 SISTEMA DE PERFUSIÓN DE OXÍGENO
3.4 SISTEMA AUXILIAR DE VACÍO
3.5 DISTRIBUCIÓN DE LOS DISTINTOS SISTEMAS
4. CAPÍTULO CUATRO : SISTEMA ÓPTICO
4.1 LUPA BINOCULAR
4.2 SISTEMA DE ILUMINACIÓN
4.2.1 Lámpara
5. CAPÍTULO CINCO : SISTEMA MECÁNICO
5.1 MESA ANTIVIBRATORIA
5.1.1 Superficie de trabajo
5.1.2 Estructura de acoplamiento
5.2 MICROMANIPULADOR
5.3 ELEMENTOS DE FIJACIÓN
5.3.1 Bases magnéticas
5.3.2 Estructura metálica
6. CAPÍTULO SEIS : SISTEMA PARA EL REGISTRO ANALÓGICO DE LA SEÑAL
6.1 MICROELECTRODOS
6.1.1 El electrodo indiferente
6.1.2 Vidrio
6.1.3 Estirador de micropipetas
6.1.4 Llenado
53
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55
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59
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60
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71
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4
6.2 CIRCUITO ELECTRÓNICO DE REGISTRO
6.2.1 Preamplificador
6.2.1.1 Conexión física del microelectrodo
6.2.1.2 Descripción del circuito
6.2.2 Compensación de capacitancia
6.2.3 Circuito amplificador
6.2.4 Filtro pasabajo
6.2.5 Estimulador
6.2.6 Eliminación de interferencias
6.2.7 Voltímetro digital
6.2.8 Osciloscopio
6.2.9 Comparación de las características del amplificador con modelos comerciales
7. CAPÍTULO SIETE : SISTEMA DE ADQUISICIÓN DIGITAL DE LA SEÑAL
7.1.1 Características del hardware
7.1.1.1 Computadora personal (PC)
7.1.1.2 Placa conversora A/D
7.1.2 Características del software :
7.1.2.1 Descripción del LabVIEW
7.1.2.2 Estrategias y técnicas de adquisición con LabVIEW
7.1.2.3 Descripción del programa de adquisición
8. CAPÍTULO OCHO : DISEÑO DEL ESPACIO DE TRABAJO
8.1 UBICACIÓN FÍSICA
8.2 SUPERFICIE DE TRABAJO
8.2.1 Mesa antivibratoria
8.2.1.1 Área
8.2.1.2 Altura
8.2.2 Escritorio
8.2.2.1 Área
8.2.2.2 Altura
8.2.3 Espacio físico y distribución
8.2.3.2 Situación específica de los componentes
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75
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96
96
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99
SECCIÓN 3 : PRUEBAS DEL SISTEMA
102
9. CAPÍTULO NUEVE : PRUEBAS DE BANCO
103
9.1 CONTROL DE TEMPERATURA
9.1.1 Prueba en circulación por gravedad
9.1.2 Prueba en recirculación
9.2 SISTEMA MECÁNICO
9.3 SISTEMA ELECTRÓNICO DE REGISTRO
9.3.1 Microelectrodos
9.3.2 Amplificador y sistema de eliminación de interferencias
10. CAPÍTULO DIEZ
VITRO”
103
103
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108
109
111
: VERIFICACIÓN DEL SISTEMA MEDIANTE UN EXPERIMENTO “IN
10.1 USO DEL SISTEMA COMPLETO
10.1.1 Preparación del experimento
10.1.2 Realización de los registros
10.1.3 Registros obtenidos
113
113
113
114
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5
SECCIÓN 4 : ASPECTOS ECONÓMICOS
118
11. CAPÍTULO ONCE : ANÁLISIS DE COSTOS
119
11.1 COSTOS DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO
11.1.1 Costo de I+D real
11.1.1.1 Personal
11.1.1.2 Equipamiento
11.1.1.3 Materiales
11.1.1.4 Gastos preoperativos
11.1.1.5 Costo total
11.1.2 Costo de I+D a precio de mercado de los factores
11.1.2.1 Personal
11.1.2.3 Materiales
11.1.3 Comparación de los costos de I+D
11.2 ESTIMACIÓN DEL PRECIO DE VENTA
11.2.1 Producción en la Universidad
11.2.2 Producción fuera de la Universidad
11.2.3 Comparación de precios
119
119
119
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124
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SECCIÓN 5 : APÉNDICES
127
1. APÉNDICE UNO : CONCEPTOS TEÓRICOS ASOCIADOS CON EL CONTROL DE LAS
VIBRACIONES.
128
1.1 CARACTERIZACIÓN DE UN SISTEMA ANTIVIBRATORIO
128
1.2 FUNDAMENTOS DE VIBRACIÓN
129
1.2.1 Movimiento armónico simple
129
1.2.2 Frecuencia natural
130
1.2.3 Compliancia
130
1.2.4 Transmisibilidad
131
1.3 ESTRUCTURA DE ACOPLAMIENTO ENTRE SOPORTE DEL MICROELECTRODO Y LA SUPERFICIE
[]
132
DE TRABAJO
1.4 ESTRUCTURA DE ACOPLAMIENTO ENTRE LA SUPERFICIE DE TRABAJO Y EL SUELO[42]
134
2. APÉNDICE DOS : DESCRIPCIÓN DEL PROGRAMA REALIZADO EN LABVIEW
135
SECCIÓN 6 : BIBLIOGRAFÍA
138
6
Resumen
La electrofisiología cardíaca permite estudiar el funcionamiento del corazón a partir de las
señales eléctricas de las células que lo componen. Los potenciales de acción de las células
cardíacas constituyen uno de los tipos de señales más importantes para la investigación
básica. El estudio de los potenciales de acción cardíacos es útil para caracterizar los
fenómenos que dan origen a diferentes situaciones fisiológicas y fisiopatológicas del
sistema cardiovascular. Por otra parte, la acción terapéutica de drogas cardioactivas puede
comprenderse a través del conocimiento del efecto específico sobre determinadas
corrientes o canales iónicos de las células cardíacas, que modifican directamente la
morfología de los potenciales de acción.
El presente trabajo describe la construcción y puesta a punto de un sistema completo para
el registro de potenciales de acción de células cardíacas mediante el uso de la técnica de
microelectrodos intracelulares. Se trata de una técnica ‘in vitro’: los registros se llevan a
cabo sobre trozos de tejido cardíaco colocados en una cámara que le brinda las condiciones
ambientales necesarias. Estas condiciones aseguran la supervivencia de los tejidos por
varias horas, durante las cuales se realizan las maniobras experimentales. Los potenciales
de acción se miden entre un microelectrodo de vidrio insertado en el interior de una célula
y un electrodo de referencia extracelular colocado dentro de la solución de perfusión de la
cámara. Para registrar los potenciales de acción en células no automáticas, se utiliza un
estimulador electrónico.
El sistema desarrollado consta de las siguientes cuatro partes, agrupadas de acuerdo a la
función que cumplen:
¾ Un sistema para el mantenimiento de las condiciones ambientales, constituido por un
control de temperatura para baño termostatizado y los medios necesarios para el
suministro de solución fisiológica y de oxígeno.
¾ Un sistema para la observación del tejido, que consta de una lupa binocular y un
sistema de iluminación.
¾ Un sistema mecánico, para sostener de manera estable el microelectrodo y poder
insertarlo en el tejido mediante movimientos precisos, constituido por una mesa
antivibratoria, un micromanipulador y una estructura de soporte.
¾ Un sistema electrónico, constituido por un amplificador para acondicionar las señales
de los potenciales de acción, un estimulador, un osciloscopio digital para visualizarlas
en tiempo real, una placa conversora A/D para digitalizarlas y una PC que maneja el
programa de adquisición para la visualización y el almacenamiento de las mismas.
El sistema completo constituye el puesto de trabajo de un operario del Laboratorio, por lo
que fueron tenidos en cuenta criterios de diseño ergonómicos para el montaje y la
ubicación de los distintos sistemas de control y visualización dentro del mismo.
El sistema se encuentra actualmente en funcionamiento en el Laboratorio de
Bioelectricidad de la FI-UNER donde es utilizado a los fines del proyecto de investigación
“Efecto de anticuerpos contra receptores β-adrenérgicos sobre las propiedades eléctricas
del corazón”.
7
Organización general del documento
Los contenidos de este documento se han subdividido en seis secciones, las que se
enumeran a continuación :
1. OBJETIVOS Y ANTECEDENTES: se describen los fundamentos teóricos para la
delimitación del problema a resolver y un bosquejo general del sistema y los objetivos
del proyecto.
2. DESARROLLO DEL PROYECTO: se describen en detalle los desarrollos específicos de
cada parte del sistema.
3. PRUEBAS DEL SISTEMA: se describen las pruebas de banco de cada parte y el desempeño
del sistema completo en condiciones reales de operación con experimentos ‘in vitro’.
4. ASPECTOS ECONÓMICOS: se detalla el análisis de los costos de investigación y
desarrollo de este proyecto. Se realiza además una valoración estimativa de los costos
de producción de mismo.
5. APÉNDICES: se desarrollan aspectos teóricos y/o detalles anexos del proyecto.
6. BIBLIOGRAFÍA.
8
Sección 1: Objetivos y Antecedentes
9
1. CAPÍTULO UNO: OBJETIVOS
En el Laboratorio de Bioelectricidad de la FI-UNER, en el marco del PID ¨Efecto de
anticuerpos contra receptores beta-adrenérgicos sobre las propiedades eléctricas del
corazón¨ se planteó la necesidad de construir un sistema capaz de llevar a cabo el registro
de los potenciales de acción cardíacos, con la técnica de microelectrodos intracelulares.
Por lo tanto se generó el presente proyecto, con los siguientes objetivos :
1.1 Objetivos Generales
¾ Analizar los considerandos teóricos para optimizar el montaje de un sistema completo
para el registro de potenciales de acción cardíacos mediante microelectrodos
intracelulares.
1.2 Objetivos Específicos
¾ Desarrollar y poner en funcionamiento un puesto de trabajo apto para el registro de
potenciales de acción cardíacos mediante microelectrodos intracelulares.
10
2. CAPÍTULO DOS: ANTECEDENTES
2.1 Actividad eléctrica del corazón
Para poder definir los requisitos que debe cumplir el sistema para el registro de los
potenciales de acción, es necesario conocer cuáles son las propiedades del sistema
biológico objeto de estudio. Se comenzará entonces con una breve reseña anatómica y
fisiológica del corazón, para luego hablar de las propiedades eléctricas de las células que lo
componen. Finalmente se enumeran los métodos utilizados para llevar a cabo el registro de
dicha actividad eléctrica.
2.1.1 El corazón : breve descripción anatómica y fisiológica
El corazón es el órgano central del sistema circulatorio. En el humano está situado hacia el
frente de la cavidad torácica, apenas desviado del centro hacia la izquierda a nivel de la
axila. Tiene la forma de un cono invertido, con su base hacia arriba a la derecha, y el apex
apuntando hacia abajo, a la izquierda y adelante.
2
1
2
3
3
3
1
4
4
4
5
6
6
5
8
7
8
Figura 2-1 : El corazón (a) vista anterior (b) vista posterior. Los números indican (1) vena cava superior, (2)
aorta, (3) arteria pulmonar, (4) vena pulmonar, (5) aurícula izquierda, (6) aurícula derecha, (7) ventrículo
derecho, (8) ventrículo izquierdo. (adaptada de [1])
Las paredes del corazón están formadas por un músculo hueco, el miocardio, con algunas
fibras dispuestas en forma espiral alrededor del cono y otras desde la base hacia el apex.
Un tabique muscular a lo largo del eje anatómico divide al corazón en dos partes, una
mitad derecha y otra izquierda; el miocardio de la mitad izquierda es considerablemente
más grueso que el de la mitad derecha. Cada mitad está subdividida a su vez en dos
cámaras, la superior (aurícula) y la inferior (ventrículo) conectadas entre sí por válvulas.
Las aurículas son estructuras de paredes relativamente delgadas que actúan como cámaras
receptoras de la sangre que retorna al corazón; aquí el miocardio se halla dispuesto en dos
capas. Las aurículas cumplen básicamente las funciones de reservorio elástico y de
conducción desde el lecho venoso hacia el ventrículo derecho y desde la circulación
pulmonar hacia el ventrículo izquierdo; además de servir de bombas de refuerzo,
incrementando el llenado ventricular. Los ventrículos, de paredes gruesas, son los
11
encargados de bombear un cierto volumen de sangre desde un sistema venoso de baja
presión hacia un sistema arterial de distribución, de alta presión.
El corazón es entonces una bomba integrada dentro del sistema vascular: su función es
asegurar que la sangre fluya continuamente a través de los órganos del cuerpo,
proveyéndolos con suficiente oxígeno y nutrientes, y removiendo efectivamente los
productos metabólicos de desecho. En términos funcionales, las mitades derecha e
izquierda del corazón pueden ser consideradas independientes una de otra.
En el corazón derecho, la sangre con contenido reducido de oxígeno es vertida a través de
las venas cava superior e inferior dentro de la aurícula, desde donde ingresa luego al
ventrículo. La sangre en el ventrículo derecho es expulsada hacia los pulmones a través de
la arteria pulmonar. Durante su pasaje a través de los pulmones, la sangre libera dióxido de
carbono al aire inspirado y toma oxígeno de él, proceso denominado hematosis.
Una vez que esto sucede, la sangre fluye a través de las venas pulmonares hacia la aurícula
izquierda, pasando luego hacia el ventrículo, desde donde es bombeada hacia la aorta.
Luego, es distribuida a través de arterias grandes y pequeñas, alcanzando finalmente los
vasos más pequeños y los capilares en los órganos, donde intercambia con los tejidos las
sustancias que transporta. Finalmente, la sangre es recolectada en pequeñas y grandes
venas que por último se vacían en las venas cava. La parte del circuito que se desarrolla
entre la arteria pulmonar y las venas pulmonares es llamado de circulación pulmonar o
menor; la parte que recorre todo el cuerpo es llamado de circulación sistémica o mayor.
2.1.2 Origen de la actividad eléctrica del corazón
El corazón es un órgano que presenta una diferenciación estructural y funcional de un
mismo tejido básico, el tejido muscular estriado, que permite una optimización de las tres
funciones cardíacas relacionadas con la bioelectricidad : la actividad automática
(cronotropismo), la propagación del impulso eléctrico (dromotropismo) y la contracción
muscular (inotropismo). La función específica del corazón, la actividad contráctil, está
controlada por una secuencia muy precisa de señales eléctricas originadas normalmente en
una estructura diferenciada (nódulo sinusal) en forma de impulsos eléctricos (potenciales
de acción) más o menos periódicos (actividad marcapasos), que son conducidos hacia las
aurículas y, con un retardo apropiado, también hacia los ventrículos a través del sistema de
conducción (nódulo aurículo-ventricular, haz de His, sus dos ramas y las fibras de
Purkinje). Como resultado de esa excitación eléctrica se produce la contracción
secuenciada de las aurículas y los ventrículos [2] .
Para describir el comportamiento de las membranas biológicas que poseen propiedades
eléctricas, a menudo es conveniente el uso de modelos eléctricos análogos. A continuación
se describirán los parámetros que describen las propiedades de las células excitables, en
base al modelo más utilizado para representarlas.
2.1.2.1 Potencial de membrana.
Se denomina potencial de membrana (Em) al voltaje que se mide entre el interior de una
célula y el espacio extracelular que la rodea. En condiciones de reposo el espacio
intracelular posee un potencial más negativo que el del espacio extracelular.
12
Figura 2-2: Potencial de reposo en una célula cardíaca. (extraída de [3])
Las mayoría de las células poseen un potencial de membrana de aproximadamente -80 mV,
producto de diferencias en la concentración de iones dentro y fuera de la célula y en las
pemeabilidades membranales a los mismos.
La permeabilidad a los distintos iones está mediada por canales específicos, constituídos
por grandes proteínas incrustadas en la membrana celular. Estos canales se abren ante
estímulos apropiados, lo que permite a las cargas iónicas atravesar la membrana y crear
flujos de corrientes. Se puede encontrar una mayor descripción de los canales iónicos en la
referencia [3].
2.1.2.2 Modelo de las conductancias en paralelo
Si se supone que cada especie iónica migra a través de la membrana en forma
independiente de la presencia de las demás, es posible utilizar una analogía eléctrica para
la membrana celular. Se conectan en paralelo una rama para cada ion, cada rama
compuesta por una pila de valor Eion en serie con una conductancia. Para la mayoría de las
células (excitables o no), en el estado de reposo sólo es necesario considerar las
permeabilidades a los iones K+, Cl- y Na+, en ese orden de importancia. El modelo circuital
para la membrana en reposo tendrá pues tres ramas en paralelo, una para cada ion, tal
como se puede observar en la figura 1.3.
exterior
exterior
gK
gNa
gCl
Em
EK
ENa
ECl
Rm
Em
Er
interior
interior
Figura 2-3 : Modelo circuital de conductancias en paralelo para la membrana celular en estado de reposo. A
la derecha se representa un circuito equivalente simplificado.
Para un ion determinado, la corriente (Iion) en cada rama está determinada por la resistencia
de membrana y el potencial de membrana (Em) de acuerdo con la ley de Ohm :
iion = g ion .( E m − Eion )
donde gion y Eion son la conductancia de la membrana y el potencial de equilibrio para
dicho ion, respectivamente.
13
2.1.2.3 La ecuación de Nernst
La ecuación de Nernst define la relación existente entre las actividades de un ion a cada
lado de una membrana semipermeable con el potencial que se establece a través de dicha
membrana en condiciones de equilibrio electroquímico.
El potencial de equilibrio de un ion a través de una membrana plasmática está dado por la
ecuación de Nernst :
Eion =
RT a o
ln
zF
ai
donde Eion es el potencial de equilibrio para el ion, R la constante universal de los gases, T
la temperatura absoluta, z la valencia del ion, F la constante de Faraday, ao y ai las
actividades del ion fuera y dentro de la célula respectivamente. Se utiliza la actividad en
lugar de la concentración, ya que esta última incluye a los iones inmovilizados.
En el músculo cardíaco en reposo, donde la concentración extracelular de potasio es
aproximadamente 5.4 mM y la concentración intracelular es aproximadamente 120 mM
(las actividades correspondientes son aproximadamente 4 y 100 mM), la ecuación de
Nernst predice que el potencial de equilibrio del potasio es aproximadamente igual a -86
mV.
Debido a que el potencial de reposo celular es cercano al potencial de reposo para el
potasio predicho mediante la ecuación de Nernst, las variaciones en el potasio extracelular
influyen directamente sobre el potencial de reposo. Un aumento en la concentración de
potasio extracelular causa despolarización, mientras que reducción en el potasio
extracelular tiende a hiperpolarizar la membrana.
2.1.2.4 La ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz
El potencial de reposo se calcula a través de la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz, que
toma en cuenta las permeabilidades y las actividades de todas las especies iónicas que
contribuyen al potencial de membrana. Para un membrana permeable al sodio, al cloro y al
potasio, esta ecuación es :
Em =
RT PK a Ko + PNa a Nao + PCl a Cli
ln
zF
PK a Ki + PNa a Nai + PCl a Clo
La contribución de cualquier ion al potencial de membrana esta determinado tanto por el
gradiente de actividades a través de la membrana como por la permeabilidad de la
membrana a dicho ion. Un gradiente de actividad ausente o una permeabilidad nula
cancelaría la contribución de dicho ion al potencial de membrana.
2.1.3 Potencial de acción cardíaco
Todas las células del miocardio son capaces de modificar el potencial de reposo para
desarrollar una excitación transitoria, conocida como potencial de acción: la distribución
de cargas a través de la membrana invierte su polaridad momentáneamente, haciendo el
espacio intracelular positivo con respecto al espacio extracelular. Los potenciales de
acción son generados por la apertura y cierre de canales iónicos en la membrana
plasmática. La morfología del potencial de acción, difiere en las distintas zonas del
corazón, como puede verse en la siguiente figura.
14
NODO SA
NODO AV
HAZ DE HIS
AURICULA
FIBRAS DE PURKINJE
VENTRICULO
300 ms
Figura 2-4: Morfología del potencial de acción en las distintas zonas del corazón en mamíferos. La escala de
voltaje está expresada en mV. (adaptada de [3] y [4])
En las células contráctiles del miocardio normalmente se generan potenciales de acción
sólo bajo la influencia de un estímulo externo, como por ejemplo el potencial de acción de
las células vecinas o el pulso de voltaje de un marcapasos artificial. Este estímulo
despolariza la membrana, y si el potencial de membrana alcanza cierto valor umbral, se
genera un potencial de acción. Los potenciales de acción normales son siempre muy
semejantes entre sí en amplitud y forma.
El potencial de acción que se describe típicamente es el correspondiente al miocardio
ventricular, por ser el tejido cardíaco más estudiado. Debe recordarse que el potencial de
acción difiere en las distintas zonas del corazón, donde las características distintivas están
relacionadas con roles electrofisiológicos particulares. A modo de ejemplo, se describirá
en primer lugar el potencial de acción ventricular y luego el del nódulo sinusal. Una
descripción más detallada de los otros potenciales así como de los mecanismos que se
describirán a continuación puede encontrarse en las referencias [3] y [4]
2.1.3.1 El potencial de acción en el miocardio ventricular
El potencial de acción consiste de varias fases, cada una con un flujo de iones distinto en
dirección y especie:
Fase 0: corresponde a la despolarización rápida de la membrana, motivada por un rápido
aumento de la permeabilidad al Na+; este aumento de conductancia hace tender el potencial
de membrana al potencial de equilibrio del Na+ (+52 mV), aunque sin alcanzarlo, elevando
el potencial de membrana hasta cerca de los +20 mV. Cuando el voltaje a través de la
membrana se invierte (el potencial interior de la célula positivo con respecto al
extracelular), el flujo hacia adentro de sodio decrece abruptamente, dando paso a la
siguiente fase.
Fase 1: se produce una leve repolarización (rápida y breve), causada por un aumento de la
permeabilidad al K+, disminuyendo el potencial de membrana hasta cerca de 0 mV.
15
Fase 2: el potencial de membrana permanece cerca de 0 mV por 200-250 ms; esta meseta
es característica del músculo cardíaco, y se debe a una corriente lenta y sostenida de Ca++
hacia adentro, casi equilibrada por una corriente de K+ hacia afuera.
Fase 3: luego sigue una repolarización más rápida, de una duración cercana a los 50 ms,
donde la corriente de calcio es progresivamente inactivada, predominando la corriente de
salida de potasio. Como resultado, el potencial intracelular negativo es restablecido y la
membrana se repolariza hasta su potencial de reposo.
Fase 4: el potencial de membrana alcanza el valor de reposo, mantenido principalmente
por la corriente saliente de K+.
El potencial de acción puede tener una duración total que va desde 180 a 380 ms,
dependiendo de la frecuencia cardíaca.
tiempo (ms)
1
0
2
3
4
4
10 µA
tiempo (ms)
Figura 2-5 : Relación entre las fases del potencial de acción y los flujos de iones en una célula miocárdica
ventricular de mamífero. El potencial de acción se representa en el trazo superior, mientras que las corrientes
generadas por cada uno de los iones se grafican debajo. Para la corriente de potasio se muestran sus tres
componentes principales: IK (rectificador tardío), Ito (transitoria de salida) e IK1 (rectificador anómalo).
(adaptada de [3])
2.1.3.2 El potencial de acción en el nódulo sinusal
En este grupo de células la diferencia principal en el potencial de acción con el resto del
tejido cardíaco es la denominada despolarización diastólica espontánea, despolarización en
16
fase 4 o “potencial de marcapasos”. Estas células son capaces de autoexcitarse, generando
potenciales de acción en forma repetitiva que se propagan a los tejidos adyacentes, los
cuales sólo responden ante la presencia de un estímulo en condiciones fisiológicas.
Figura 2-6 : (A) Potencial de acción en el nódulo sinusal de conejo; (B) principales corrientes involucradas.
(adaptada de [4])
El potencial de acción en esta región es más pequeño que en otras (aproximadamente 60
mV pico a pico), con una fase 0 más lenta, por la falta de canales funcionales de Na+. La
fase 0 de este potencial de acción es producida en gran parte por la corriente entrante de
Ca++.
Como se dijo anteriormente, las células del nódulo sinusal producen un potencial de
marcapasos, es decir que son capaces de desarrollar espontáneamente un potencial de
acción, a intervalos de tiempo regulares (ritmo sinusal). El ritmo sinusal está regulado por
diferentes factores que pueden modificar :
• la pendiente de despolarización diastólica (PP),
• el valor del potencial diastólico máximo (PDM) y/o
• el umbral de activación (PU), alrededor de -40 mV, que da origen a la fase de
despolarización rápida, o sea a la fase 0. (ver figura 2.7)
17
Figura 2-7 : Factores que diminuyen la frecuencia de disparo del nódulo sinusal. (adaptada de [3])
Estos factores, que regulan la frecuencia de disparo del nódulo sinusal, se deben a la
interacción de mecanismos complejos con los canales iónicos de la membrana celular. El
estudio de estos mecanismos puede ser llevado a cabo mediante una serie de técnicas
electrofisiológicas de registro, cada una de las cuales brinda diferente información. Si bien
hoy en día existen técnicas de estudio que son capaces de identificar y caracterizar las
corrientes iónicas en parches de membrana con canales únicos (método de “patch-clamp”),
no se ha llegado a explicar por completo el mecanismo por el cual las células marcapasos
mantienen su ritmicidad espontánea [5].
2.1.4 Registro de la actividad eléctrica del corazón
La electrofisiología cardíaca se dedica al estudio del corazón a partir de su actividad
eléctrica. Por medio de las señales eléctricas obtenidas del corazón se pueden estudiar los
mecanismos involucrados en la generación y transmisión del impulso excitatorio que dan
origen a la contracción mecánica. Los estudios de electrofisiología cardíaca permiten
explicar la fisiología y fisiopatología de la actividad eléctrica del corazón, y sirven para
estudiar los mecanismos de acción de las diferentes estrategias terapéuticas. A
continuación se enumeran brevemente los métodos electrofisiológicos empleados para el
registro de la actividad eléctrica del corazón, los que pueden ser divididos en métodos “in
vivo” e “in vitro”. Una descripción más detallada puede hallarse en la bibliografía
específica citada en cada caso.
2.1.4.1 Métodos in vivo
Las técnicas de registro “in vivo” permiten el estudio de las señales provenientes del
corazón en organismos vivos. Estas son técnicas que, debido a su relativa simpleza y
difundida aplicación, se utilizan con mayor frecuencia en la práctica clínica con fines
diagnósticos. Se pueden citar:
¾ Electrocardiograma (ECG) :
El ECG fue descripto por primera vez por Einthoven en 1903. La observación
fundamental fue que la actividad eléctrica del corazón podía ser registrada mediante
electrodos colocados en la superficie del cuerpo, y que dicha actividad poseía un ritmo
que coincidía con el pulso.
Los componentes individuales de la señal eléctrica que se registra coinciden con
eventos que se producen en las diferentes regiones del corazón. De esta forma, los
intervalos entre los componentes específicos de la señal de ECG representan el retardo
de tiempo entre la activación de las diferentes regiones del corazón. Por ejemplo, el
llamado intervalo PR representa el intervalo de tiempo que hay entre la activación de la
18
aurícula y la de los ventrículos, por lo que refleja el retardo de conducción que se
produce en el nódulo AV. Las anomalías del ECG representan por lo tanto anomalías en
iniciación y propagación de la actividad eléctrica del corazón. Esto ha permitido que el
ECG se transforme en una herramienta diagnóstica primaria de enfermedades cardíacas,
tales como la hipertrofia o el infarto de miocardio, o de enfermedades de otro tipo que
indirectamente afectan al corazón. Ya que la propagación eléctrica en el corazón es
unidireccional, puede representarse mediante un vector. La configuración del ECG
depende de la localización de los electrodos de registro, los que pueden ubicarse sobre
la piel del paciente, en los miembros y/o en el tórax, (ECG de superficie), a través de la
cavidad nasofaríngea (ECG intracavitario) o directamente sobre el corazón cuando se
está realizando una intervención a tórax abierto. Cada ubicación específica permite una
visualización diferente de las componentes del vector cardíaco [6].
Como se mencionó anteriormente la despolarización espontánea de las células
marcapaso inicia el ciclo cardíaco. La propagación célula a célula está sincronizada y
produce la una activación ordenada de todas las regiones del corazón. La activación
comprende fases de despolarización y repolarización, cada una de las cuales produce
una señal detectable en el ECG. La señal de ECG está compuesta por diferentes fases,
las cuales se identifican mediante las letras P, Q, R, S y T como puede observarse en la
Figura 2-8. También puede observarse el correlato temporal de la señal de ECG con los
potenciales de acción de las diferentes estructuras cardíacas.
Figura 2-8 : El registro de ECG en relación con los potenciales de acción de las diferentes estructuras
cardíacas. NSA : nódulo sinusal, NAV : nódulo aurículo-ventricular. (extraída de [2])
¾ Potenciales de Acción Monofásicos (MAP) :
Una técnica para registrar actividad eléctrica de manera extracelular, ya sea en animales
de laboratorio o en la práctica clínica, es la de los potenciales de acción monofásicos
(MAP’s)[6]. Las señales registradas por este método se asemejan en su curso temporal a
los potenciales de acción registrados de manera intracelular. Se utilizan dos electrodos
especiales de contacto que se insertan mediante cateterización: un electrodo “de punta”
no polarizable y un electrodo de referencia, ambos de Ag/AgCl. Mediante el electrodo
de punta se ejerce una presión de 10 a 30 gr/mm sobre el tejido, sin llegar a penetrarlo.
19
El diámetro de la punta es usualmente de 1 a 2 mm, por lo que se registran varias
células a la vez, las que se hallan despolarizadas a causa de la presencia de este
electrodo. Las señales son generadas por la despolarización de las células miocárdicas
alrededor de la punta del electrodo, las que producen una diferencia de potencial entre
la punta y el electrodo de referencia.
Este método ofrece ventajas sobre otras técnicas electrofisiológicas de registro. La
mayor ventaja ofrecida por el MAP es que requieren menor cantidad de equipamiento
asociado que los potenciales registrados en forma intracelular. Los MAP brindan
información cuantitativa acerca del proceso de repolarización, lo que no es posible con
el uso de ECG. Se puede mencionar como desventaja que no se obtiene información
acerca del potencial de reposo de las células, debido al carácter extracelular de este tipo
de registro. Otra desventaja es el hecho de ser una técnica invasiva, ya que como se
mencionó previamente es necesario emplear cateterización para la colocación de los
electrodos en contacto con la pared del corazón.
2.1.4.2 Métodos in vitro
Las técnicas “in vitro” permiten la obtención de registros eléctricos sobre estructuras
aisladas del organismo, las que se mantienen en condiciones viables a partir del suministro
de soluciones de perfusión que contienen los nutrientes necesarios. De esta forma es
posible la obtención de registros a partir de corazones enteros, trozos de tejido, células y
hasta trozos de membrana celular aislados. A continuación se describen las técnicas más
comunes de registro.
¾ Electrograma :
El electrocardiograma obtenido de un corazón aislado, produce un registro denominado
electrograma. Este método sólo se utiliza en pequeños corazones de animales de
experimentación. Los corazones aislados son perfundidos mediante un aparato de
Lagendorff, el que le suministra continuamente una solución fisiológica a través de la
aorta. (una descripción detallada de este método de perfusión puede hallarse en la
referencia [6]). Para realizar el registro de la señal se emplean tres “electrodos”, uno
representado por la cánula metálica que se inserta en la aorta, el otro (usado como
tierra) conectado a la solución de perfusión y el tercero, por lo general, constituído por
un alambre de acero inoxidable insertado en la pared del ventrículo. La posición de este
último electrodo determina el eje sobre el cual se realizan las mediciones de la señal y
por lo general se coloca en el ápex del ventrículo. Con esta técnica, al igual que con el
ECG, pueden evaluarse los intervalos entre los diferentes eventos del ciclo cardíaco, así
como también la presencia de arritmias u otras patologías cardíacas. Como ventaja se
tiene que los estudios sobre corazones aislados permiten un análisis independiente de
ciertas variables que se hallan presentes en el organismo “in vivo”, como por ejemplo la
regulación autónomica de la frecuencia cardíaca.
¾ Registro con microelectrodos intracelulares :
En 1949, Ling y Gerard introdujeron el empleo de microelectrodos de vidrio llenos con
una solución conductora en el estudio de las células excitables. Efectivamente ellos
pudieron registrar el potencial de acción del músculo sartorio de rana. En 1951,
Weidmann y Woodbury los adaptaron para el estudio del músculo cardíaco, haciéndolos
flexibles por medio de un hilo de tungsteno, lo que les posibilita acompañar los
movimientos del corazón. Los registros intracelulares obtenidos con microelectrodos de
vidrio han puesto en evidencia las variadas morfologías de los potenciales de acción de
20
las distintas estructuras cardíacas y contribuyeron a aclarar los movimientos iónicos que
dan lugar a sus fases.
La técnica consiste entonces en insertar un microelectrodo de vidrio lleno con una
solución conductora en el interior de una célula y medir la diferencia de potencial con
respecto a un electrodo de referencia, colocado en el exterior de la célula. Se pueden
medir así potenciales de reposo y potenciales de acción en preparados multicelulares
(trozos de tejido) y en preparados unicelulares (células aisladas). Las células cardíacas
aisladas se obtienen a través de métodos de disociación enzimática[6].
¾ Registros mediante fijación de voltaje y fijación de corriente :
Estos métodos también utilizan microelectrodos intracelulares, pero se controlan
electrónicamente las propiedades eléctricas de la célula. En un método se fija el voltaje
(en inglés “voltage clamp”) y en el otro la corriente (“current clamp”) a través de la
membrana celular.
Como las conductancias iónicas dependen del potencial de membrana y del tiempo, la
técnica de fijación de voltaje permite estudiar el curso temporal de las conductancias
iónicas, separadamente de la acción del voltaje (que se mantiene constante). Equivale
matemáticamente al método de separación de variables. Si por cualquier circunstancia
el tejido modifica su conductancia, se deberá modificar el valor de la corriente necesaria
para mantener la relación óhmica. En 1952, Hodgkin y Huxley publicaron
determinaciones de las corrientes obtenidas en el axón gigante de calamar mediante la
técnica de fijación de voltaje. La utilización de esta técnica demoró algún tiempo en
aplicarse al músculo cardíaco, por las dificultades inherentes a la obtención de una
fijación del voltaje de manera uniforme en la estructura sincicial de compleja geometría
como es el corazón.
¾ Registro mediante “patch-clamp” :
La aparición de métodos relativamente simples que permiten obtener cardiomiocitos
aislados mediante disociación enzimática hizo posible superar la mencionada dificultad
inherente a la compleja organización geométrica del tejido cardíaco. La técnica de
patch-clamp permite hacer una fijación de voltaje de pequeñísimos “parches” de
membrana (alrededor de 1 µm de diámetro) para estudiar corrientes que atraviesan
canales únicos (“single channel recording”) o la membrana completa de una sola célula
aislada (‘whole cell recording”). Este método, descripto por Neher y Sakmann en el año
1976, trajo aparejado un enorme desarrollo en el estudio de las células cardíacas,
proporcionando nuevos e importantes datos acerca de sus propiedades
electrofisiológicas[7].
21
2.2 Metodología para el registro
microelectrodos intracelulares
del
potencial
de
acción
con
Como se mencionó al comienzo, el objetivo principal de este proyecto es la construcción y
puesta a punto de un sistema para el registro de potenciales de acción cardíaco con
microelectrodos intracelulares. Para obtener los registros intracelulares de potenciales de
acción, es necesario contar con una estación de trabajo (llamada comunmente ´setup´) que
se puede dividir básicamente en cuatro subsistemas, cuyos requisitos se describen a
continuación:
2.2.1 Sistema ambiental
La realización exitosa de registros de los potenciales de acción cardíacos requiere que el
tejido sometido a estudio, denominado comunmente ‘preparado’, permanezca durante
varias horas en estado viable. El sistema ambiental comprende entonces los medios
necesarios para mantener a la preparación celular en estado viable, el que debe cumplir con
los siguientes requisitos :
¾ Contener una concentración de iones y nutrientes similar a la del líquido extracelular
del organismo de donde proviene el tejido. Esta solución se conoce como solución
fisiológica. Se debe mantener circulando para proveer una renovación constante de los
nutrientes (oxígeno y glucosa) y poder eliminar los productos de desecho.
¾ Estar a temperatura controlada, dentro de los rangos de supervivencia celular, que para
el caso de los cardiomiocitos está aproximadamente entre los 25 y los 38oC.
¾ Estar a pH controlado, en un rango de 7.25 a 7.45.
Para el mantenimiento de las condiciones ambientales se debe implementar por lo tanto un
sistema para suministrar la solución fisiológica, a la que se le deben controlar la
temperatura, el pH y la saturación de oxígeno.
2.2.1.1 Perfusión de solución fisiológica
Este sistema está destinado al suministro de solución fisiológica al preparado bajo estudio.
Para alojar los preparados se utilizan por lo general cámaras de acrílico o policarbonato. El
“piso” de la cámara debe poseer un material que permita la inserción de agujas para
sostener el tejido. El material que se utiliza por lo general es el “Sylgard®”, un elastómero
siliconado fabricado por la compañía Dow Corning.
La solución debe ser ingresada a la cámara a través de tuberías, preferentemente de PVC.
La perfusión puede realizarse por gravedad o por bombeo. Es necesario prever además la
construcción de un sistema auxiliar que permita descartar la solución que debe ser retirada
de la cámara. Puede implementarse un drenaje por gravedad, un sistema de succión o
emplearse un bomba. En todos los casos, debido a que la solución fisiológica contiene
electrolitos, las tuberías que la transportan se comportan como conductores eléctricos,
llevando ruido al lugar de registro. Por lo tanto también es necesario realizar una conexión
a tierra de esta “línea” en alguna parte de su recorrido.
La composición iónica de la solución fisiológica depende de la especie cuyo tejido esté
bajo estudio. Las soluciones más empleadas para los preparados de cardiomiocitos son el
Tyrode con buffer bicarbonato y el Tyrode con buffer HEPES (ver página siguiente). Los
denominados sistemas buffer o tampón se agregan para mantener el pH de la solución de
perfusión dentro de los límites aceptables.
22
Las soluciones buffer contienen un ácido débil y su sal o una base débil y su sal. Poseen la
capacidad de resistir a los cambios en la concentración de hidrogeniones cuando se le
agregan pequeñas cantidades de ácidos o bases fuertes. Las células poseen naturalmente
sistemas buffer, pero su capacidad para mantener un pH constante en soluciones
débilmente tamponadas o no tamponadas es muy limitada. La disminución del pH,
normalmente conduce a la muerte celular. La acidificación puede ser explicada, al menos
en parte, en base a la disociación irreversible de macromoléculas proteicas en péptidos de
bajo peso molecular y el consecuente incremento de grupos carboxilo ionizables. El
tamponado de la solución de perfusión puede neutralizar esta acidificación del tejido y así
evitar su daño[8,9].
Los principales buffers usados son llamados buffers "fisiológicos", ya que exhiben un
rango de acción efectivo entre 7,2 y 7,4. A continuación se describen dos de los buffers
más usados en preparados de células cardíacas.
• Buffer HEPES:
El buffer HEPES (Ácido sulfónico N-2-Hidropiperazin-N'-2-etano) es un buffer que
posee un pK de 7,31 a 37ºC. Es un buffer amino-terciario heterocíclico, por lo que
puede interferir con las reacciones amino-aldehídos del tejido. Massie y col. (1972)
indican que este buffer es un sustituto no tóxico del buffer bicarbonato en los medios
usados para cultivos celulares.
• Buffer bicarbonato:
Este buffer es uno de los más fisiológicos que existen, debido a que se encuentra en los
sistemas vivos en la forma bicarbonato/ácido carbónico (CO3HNa/CO3H2). Su acción
puede comprenderse si se considera la se considera la ecuación :
CO2 + H2O ⇔ CO3H2 ⇔ CO3H- + H+
Si se agregan iones H+ al sistema, algunos se combinarán con bicarbonato y la reacción
se desplazará a la izquierda. Por consiguiente, no todos los iones hidrógeno que se
incorporen a la solución quedarán bajo la forma iónica. Si se agrega una base, en
cambio, el H+ será extraído en parte y la reacción se desplazará hacia la derecha
provocando una disociación del CO3H2 en H+ y CO3H-. Por lo tanto existe una relación
inversa entre el H+ y el CO3H- cuando se agrega un ácido o una base al sistema.
Puede verse que el nivel de CO2 (la PCO2) también interviene en la determinación del
pH, pero de manera diferente a la que lo hacen los ácidos y bases. Si se agrega o se
extrae CO2, en este caso las concentraciones de H+ y de CO3H- cambian en el mismo
sentido. Concretamente, el valor de pH está dado por la ecuación de HendersonHasselbach :
pH = pK + log
[CO3 H − ]
[CO3 H 2 ]
pK es el valor de pH donde existen iguales cantidades del ácido y de la sal
acompañante, que en este caso vale 6,1 a 37oC. La concentración de CO3H2 depende de
la presión parcial de CO2 y del coeficiente de solubilidad a. Por lo tanto se puede
reescribir la ecuación de la forma:
pH = 6,1 + log
[CO3 H − ]
a. PCO2
23
Puede verse así que este sistema buffer requiere un nivel constante de CO3H- y de CO2
para cumplir su función. Esto se logra colocando en la solución de perfusión una
concentración determinada de bicarbonato y burbujeándola luego con CO2. Este gas se
suministra a través de carbógeno, que es una mezcla que contiene 95% de O2 y el restante
5% de CO2. Como se verá más adelante, el O2 también debe burbujearse dentro de la
solución de perfusión, por lo que burbujeando carbógeno se realiza una doble función.
2.2.1.2 El control de la temperatura
Como se mencionó previamente, en las experiencias de laboratorio “in vitro” los
preparados celulares utilizados deben mantenerse bajo determinadas condiciones de
temperatura. En ocasiones se debe mantener dentro de límites estrictos la temperatura de la
solución que baña los preparados.
¾ Estrategias para mantener la temperatura
Existen distintas estrategias que para calentar y mantener la temperatura de los preparados.
Entre ellas podemos citar :
• Calentamiento directo de la solución: en esta estrategia se usan mantas térmicas, que
se enrollan alrededor del recipiente que contiene la solución que necesita ser calentada.
Son láminas constituidas por una resistencia eléctrica recubierta con una goma de
silicona. Pueden aplicarse con cintas adhesivas o cementos especiales para una fijación
permanente. Los modelos comerciales se alimentan con tensión alterna de 120 o 220 V
y son capaces de suministrar potencias en un rango de 180 a 1440 W[10]. En función de
esto último, su precio oscila entre los 100 y los 480 dólares (en EE.UU.). Necesitan de
un controlador adicional, que se vende en forma separada, que provee el control de
encendido o apagado según se requiera.
Su ventaja estriba en su sencillez y en su fácil montaje. Como principal desventaja se
puede citar que no son capaces de un control fino de la temperatura de la solución que
llega al preparado, requisito indispensable para nuestra aplicación. Además son difíciles
de conseguir en el mercado local.
• Calentamiento indirecto de la solución: en este caso se hace circular a la solución a
calentar a través de tuberías sumergidas en un recipiente que contiene líquido a
temperatura controlada. Este elemento, que se denomina comunmente baño
termostatizado, está constituido por un recipiente donde se puede alojar el líquido
calefactor, un elemento capaz de entregar la potencia requerida y algún sistema para
controlar la temperatura. Los modelos comerciales se componen básicamente de un
recipiente de acero inoxidable donde se aloja el líquido, que se mantiene a la
temperatura deseada mediante una resistencia eléctrica. Los baños están diseñados
comunmente para una alimentación de línea (220 ó 110 V de corriente alterna) y vienen
en rangos de potencia de 500 a 1500W, de acuerdo a la capacidad de agua que alojan.
24
Figura 2-9 : Baño termostatizado comercial de 7 litros de capacidad, 1300 W de potencia. Emplea un
control si-no, con el que mantiene la temperatura alrededor de ±0,4oC de la temperatura prestablecida. Posee
un agitador mecánico con el que homogeneiza la temperatura. Su valor de catálogo es de U$S 811. (extraída
de [21])
Como ventaja se puede citar, dependiendo del tipo de control utilizado, que mantienen
la temperatura del agua que alojan en valores muy estables. Además son fáciles de
conseguir en el mercado local y se le pueden realizar modificaciones para adaptarse a
las situaciones particulares. Como desventajas se puede citar que ocupan mucho espacio
y no se pueden colocar próximos al lugar de registro porque producen interferencias
eléctricas en el sistema de registro.
• Calentamiento directo de la cámara: en este tipo de estrategia se utiliza un sistema
que es capaz de mantener la temperatura del preparado, calentando o enfriando en
forma directa la cámara donde se encuentra el mismo. Para ello se utilizan los
denominados dispositivos de efecto Peltier. Los modelos comerciales manejan rangos
de temperatura de -20 a 100oC. Necesitan de un volumen de agua circulando para
remover o entregar el calor necesario. Entregan potencias del orden de los 300 a 400 W
y vienen con un módulo de control que logra un ajuste muy preciso de la temperatura
(±0,1oC). Como desventaja se puede citar que producen interferencias
electromagnéticas sobre los sistemas de registro y sólo se puede utilizar para volúmenes
pequeños. Debido a esto último su aplicación principal es para el termostatizado de
platinas de microscopio, donde los preparados son de pequeño tamaño. Además tienen
un elevado costo: aproximadamente de 4000 dólares[11,12].
25
Figura 2-10 : Platina termostatizada modelo TS-4 de Physitemp. Tiene capacidad para alojar un cápsula de
Petri de 35 mm. El módulo lateral posee los elementos Peltier y la tubería de recirculación de agua. (extraída
de [11])
• Calentamiento indirecto de la cámara: en estos sistemas se utiliza un fluido
circulante que es capaz de transferir la energía térmica a la cámara donde se aloja el
preparado. El control preciso de la temperatura del preparado se logra haciendo circular
líquidos frío y caliente a través de un bloque donde se sostiene la cámara. Utilizando
estrategias de control adecuadas, una computadora personal envía las señales de
apertura y cierre de distintas válvulas que regulan la mezcla del fluido térmico. En la
siguiente figura se puede ver un diagrama en bloques de un sistema comercial.
Figura 2-11 : Diagrama en bloques del sistema de control de temperatura TLC-MI de ALA Science.
(extraída de [13])
El modelo de la figura posee un rango de temperaturas de 4 a 45oC y brinda una
precisión en el control de ±0.3oC en el baño del preparado. El sistema incluye la
interfase para la computadora, el bloque térmico, los sensores de temperatura
(termistores) y los accesorios de conexión. La potencia que maneja es de 250 W para
calentamiento y 80 W para enfriamiento. Como ventaja se puede decir que se eliminan
los problemas de interferencia electromagnética que existen en los sistemas como los
descriptos anteriormente. Como desventaja se puede decir que es un sistema muy
complejo para para la precisión que alcanza, a la vez que posee un elevado costo
(aproximadamente 5000 dólares)[13].
¾ Controladores de temperatura
En los sistemas que utilizan un elemento calefactor para entregar el calor, para regular la
potencia que se suministra al mismo se utilizan diversos sistemas de control de
temperatura. Para realizar un control preciso de temperatura se emplean controladores de
lazo cerrado, donde en todo instante se trata de mantener la variable controlada
(temperatura) cercana a un valor de referencia. En todos ellos se dispone un elemento
26
transductor de temperatura que sensa la temperatura del elemento a calentar y desarrolla
una señal de error, que es igual a la diferencia entre el valor de referencia y el valor actual.
Esta señal de error se realimenta para indicar si debe entregarse potencia o no al elemento
calefactor. Pueden utilizarse varias estrategias de control. La diferencia entre ellas está en
la forma en que la señal de error es realimentada. Así, por ejemplo, la señal de error puede
ser multiplicada por una constante (controlador proporcional), integrada (controlador
proporcional-integral), etc.
Los controladores de lazo cerrado más sencillos, los denominados controladores si/no o
apagado/encendido, realimentan la señal de error para indicar si se debe encender o no la
alimentación del elemento calefactor. Tienen la ventaja de ser de construcción simple,
requiriendo de pocos componentes para su implementación. Como desventaja se puede
decir que cuando el sistema presenta retardos temporales (o tiempos muertos) el error en
estado estacionario toma valores elevados.
¾ Termómetro
El sistema debe contar con un termómetro independiente para indicar en todo momento la
temperatura de la cámara que contiene el preparado. Dado que la temperatura se encuentra
controlada dentro de márgenes estrechos, el termómetro debe brindar una lectura precisa,
con una resolución menor o igual al margen que se está controlando.
2.2.1.3 Perfusión de oxígeno
Se debe implementar un sistema para burbujear oxígeno dentro de la solución que baña los
tejidos celulares. El oxígeno se burbujea para mantener el metabolismo celular. En los
casos que se utilice el Tyrode con buffer bicarbonato, se burbujea con carbógeno, que
como se dijo anteriormente está constituido por un 95% de oxígeno y un 5% de CO2 .
2.2.2 Sistema óptico
Comprende los medios destinados a visualizar la preparación. Por el tamaño de los
preparados se puede usar un microscopio binocular o lupa de disección con un sistema
auxiliar de iluminación. El rango de magnificación que se necesita es relativamente bajo,
extendiéndose desde 6X hasta 50X.
La lupa puede apoyarse sobre la base que trae de fábrica, o bien puede atornillarse a la
superficie de trabajo. Es conveniente que se la pueda mover para acceder fácilmente a la
cámara experimental o para su limpieza.
La iluminación del preparado debe realizarse preferentemente con lámparas halógenas, que
pueden alimentarse a través de tensión continua y proporcionan una luz blanca lo
suficientemente intensa. La iluminación puede implementarse mediante una variedad de
sistemas disponibles comercialmente. En algunos sistemas la luz se trasmite hacia el sitio a
iluminar a través de fibras ópticas. Poseen una fuente de alimentación de tensión continua
o alterna y se puede variar en forma continua el nivel de iluminación. En lo posible se
recomienda utilizar sistemas que permitan colocar la fuente de alimentación fuera de la
jaula de Faraday, para evitar las interferencias electromagnéticas sobre el sistema de
registro (la función de la jaula de Faraday se discutirá en detalle más adelante, en el
apartado 2.2.4.2)
27
2.2.3 Sistema mecánico
El sistema mecánico comprende todos los medios destinados a posicionar de manera
estable el microelectrodo y el preparado. Las vibraciones que se transmitan a la punta del
microelectrodo, cuando éste se halla insertado en el interior de una célula, pueden provocar
interferencias en los registros que se estén llevando a cabo. Si las vibraciones son de baja
amplitud (décimas de micrómetros), pueden introducir ruido en los registros debido a un
fenómeno piezoeléctrico, producido en el vidrio del microelectrodo cuando el mismo es
sometido a pequeñas deformaciones. Si en cambio las vibraciones son de mayor amplitud
(del orden de unos pocos micrómetros) pueden provocar la rotura del microelectrodo o de
la célula sobre la que se está llevando a cabo el registro, con la consiguiente interrupción
del mismo y las pérdidas de tiempo que esto genera, ya que hay que recambiar el
microelectrodo y buscar otro sitio para la inserción.
El sistema antivibratorio por lo general comprende la implementación de una superficie de
trabajo libre de vibraciones, así como también un sistema de soporte para el
microelectrodo que permita moverlo con facilidad y otorgue una rigidez adecuada. A
continuación se describen las características que deben poseer cada uno de los
componentes del sistema mecánico.
2.2.3.1 Mesa antivibratoria
La superficie de trabajo y las estructuras de acoplamiento entre ésta y el suelo constituyen
en conjunto la denominada “mesa antivibratoria”. Las características de una mesa
antivibratoria están dadas por las de los elementos que la constituyen y fueron descriptas
en los párrafos precedentes. Por lo tanto, en este apartado se realizará una breve
descripción de las principales particularidades de los modelos comerciales de las mesas
antivibratorias.
¾ Modelos comerciales
Existen varios modelos comerciales de mesas antivibratorias (en la Figura 2-12 se muestra
un modelo de mesa antivibratoria comercial). Se puede realizar una clasificación de las
mismas de acuerdo al tipo de soporte con el que vienen provistas:
• Mesas con soportes pasivos: poseen aisladores neumáticos sobre las que se apoya la
superficie de trabajo. Los aisladores están constituidos por un diafragma de goma
sostenido por un cilindro rígido lleno con aire. Poseen frecuencias naturales de
resonancia muy bajas (comunmente 1 o 2 Hz). Por encima de estos valores de
frecuencia, las vibraciones se atenúan en forma abrupta.
• Mesas con soportes activos: los aisladores pasivos presentan un comportamiento pobre
a muy bajas frecuencias, sobre todo en el valor de la frecuencia de resonancia, donde se
produce una pequeña amplificación de las vibraciones. Para solucionar esto, se han
diseñado soportes que emplean un sistema activo de cancelación de las vibraciones.
Mediante sensores se miden las vibraciones producidas y se produce una realimentación
sobre actuadores apropiados a fin de cancelar las mismas. Alcanzan así frecuencias de
resonancia horizontal menores a 1 Hz.
28
Figura 2-12 : Mesa antivibratoria para registros electrofisiológicos de la firma Intracel[14]. La superficie de
trabajo está construida por un núcleo en “panal de abejas” entre dos planchas de acero inoxidable de 5 mm
de espesor. Los aisladores de soporte son pasivos y pueden llenarse con aire o nitrógeno a presión. (extraída
de [14])
2.2.3.2 Micromanipulador
El propósito de este apartado no es realizar una descripción exhaustiva acerca del
funcionamiento de los micromanipuladores, sino más bien mencionar cuáles son las
características principales que han de tenerse en cuenta a la hora de escoger un
micromanipulador para este tipo de aplicación.
Para registrar los potenciales de acción hay que posicionar el microelectrodo dentro las
células. En primer lugar se realiza una aproximación “gruesa” hasta las estructuras donde
se pretende realizar la penetración, para lo cual el microelectrodo debe poder moverse
dentro de rangos de 20 a 40 mm. Una vez escogido el sitio, se lleva a cabo la inserción del
microelectrodo en el tejido, hasta alcanzar el interior de una célula (más adelante se
explicará en detalle este procedimiento). Teniendo en cuenta las dimensiones de las células
(largo 50 a 100 µm ; diámetro 5 a 20 µm), está claro que el movimiento del
micromanipulador deberá poseer una resolución del orden de unos pocos micrómetros.
Esto último es importante sobre todo en la dirección axial del microelectrodo, a través del
cual se realiza la penetración. En el caso más común, este es el eje X del
micromanipulador, el cual debe poseer un movimiento fino con resolución menor al
diámetro de la célula.
Otro de los requisitos importantes que debe satisfacer el micromanipulador es el de
proveer un posicionamiento rígido y estable para el microelectrodo; esto es, no debe
presentar desplazamientos relativos ni deriva lenta (“drift”) a partir de su posición de
reposo.
Para el posicionamiento de los electrodos de estimulación, pueden usarse
micromanipuladores de características menos exigentes en cuanto a la resolución y a la
estabilidad, los que por ende resultan más económicos.
Los micromanipuladores que existen hoy en día en el mercado son capaces de satisfacer
los requerimientos antes mencionados, superándolos en la mayoría de los casos. Los mas
sencillos utilizan transmisión manual de los movimientos y el mecanismo es totalmente
mecánico. Existen otros modelos impulsados mediante motores paso a paso, mecanismos
hidráulicos o piezoeléctricos. La transmisión de los movimientos se puede controlar a
distancia a través de un pequeño teclado o con un joystick[26,29].
29
2.2.3.3 Elementos de fijación
Una forma adicional de controlar las vibraciones consiste en maximizar la rigidez de los
sistemas de soporte del microelectrodo y de la cámara donde se encuentra el preparado.
Además, es necesario eliminar cualquier movimiento relativo entre estos dos componentes
y la superficie de trabajo. Esto involucra el uso de soportes firmes para el
micromanipulador y para la cámara donde se coloca el preparado.
Existen numerosos sistemas que permiten la fijación del micromanipulador a la superficie
de trabajo. Los mismos pueden ser sujetados desde varillas metálicas, las que a su vez se
fijan a la superficie de trabajo. La fijación puede llevarse a cabo atornillando directamente
las varillas a la superficie de trabajo. Otro método consiste en utilizar bases de fijación
magnética, cuando la superficie de trabajo es de un material ferromagnético.
2.2.4 Sistema para el registro analógico de la señal
El sistema para el registro analógico provee todos los medios necesarios para capturar,
acondicionar y visualizar la señal. Un sistema de registro analógico completo debe estar
constituido por un microelectrodo, un amplificador de señal, un estimulador, un
osciloscopio. También es necesario contemplar un sistema para eliminar las interferencias
eléctricas (jaula de Faraday y puestas a tierra).
2.2.4.1 Microelectrodos
Los microelectrodos representan los elementos “transductores” del sistema de registro y
debido a sus características particulares merecen un tratamiento separado.
Los microelectrodos intracelulares están formados por un alambre de Ag metálica
recubierto con AgCl, colocado en el interior de una micropipeta de vidrio llena con una
solución electrolítica. Esta solución provee una conexión desde la célula hasta el electrodo.
Así, los “electrodos” de vidrio no son más que conductos de geometría apropiada que
sirven para establecer la conexión. Por esta razón, se utiliza el término micropipeta para el
conducto de vidrio solo (ver Figura 2-13). Cuando se llena con la solución electrolítica y se
provee un conexión mediante un electrodo de Ag/AgCl, se los denomina microelectrodos.
hombro
punta
1 mm
espina
Figura 2-13: Las partes de una micropipeta. (adaptada de [42])
¾ Propiedades físicas generales
La precisión con la cual las mediciones pueden ser llevadas a cabo usando
microelectrodos, muchas veces está limitada por las propiedades físicas que estos poseen.
Es necesario entonces conocer las propiedades físicas de los microelectrodos y tener en
cuenta cómo estas propiedades pueden afectar los registros. A continuación se describen
brevemente las más importantes. Una discusión más detallada puede encontrarse en las
referencias [42] y [15].
• Forma y tamaño
Como se verá más adelante, la forma de las micropipetas depende mucho del tipo de vidrio
empleado y del procedimiento de estiramiento. Por lo general, las micropipetas que se
30
fabrican para los microelectrodos intracelulares, tienen una forma aproximadamente cónica
en la región de la punta. La resistencia eléctrica es uno de los parámetros que más depende
del ángulo subtendido por el cono y la relación diámetro externo/diámetro interno en la
punta.
La característica más importante de un microelectrodo es el diámetro de la punta. Para
evitar el daño en la célula sobre la que se pretende realizar el registro, se necesita que éste
sea menor o igual al 0,5% del diámetro de la célula. Las células nodales tienen diámetros
que oscilan entre 5 y 10 µm, y las células miocárdicas contráctiles entre 10 y 20 µm. Esto
establece que pueden ser penetradas a lo sumo por microelectrodos de 0,05 µm y 0,1 µm
de diámetro en la punta respectivamente. Estos tamaños están por debajo del límite de
resolución de los microscopios ópticos. Por lo tanto para obtener una imagen de la punta se
recurre al uso de microscopía electrónica de barrido (SEM).
0,5 µm
Figura 2-14 : Fotografía tomada con un microscopio electrónico de barrido (magnificación x40000) de la
punta de una micropipeta estirada con el equipo Sutter P-97 (foto provista por el fabricante del equipo)
• Resistencia eléctrica
Debido a la poca facilidad que existe para observar las puntas de las micropipetas a través
de la microscopía óptica, la resistencia eléctrica del microelectrodo se vuelve el parámetro
más importante para caracterizarlo. Una “regla de oro” establece que cuanto más pequeño
sea el diámetro de la punta, mayor será la resistencia. Una resistencia muy elevada afecta
el potencial de punta del microelectrodo, genera más ruido e incrementa la constante de
tiempo del circuito. Por lo tanto, se puede ver que existe un compromiso entre lograr una
resistencia baja y a la vez una punta larga, flexible y con diámetro pequeño.
• Comportamiento mecánico
Se puede decir que las micropipetas que poseen una punta más larga y fina son muy
flexibles. Por el contrario, aquellas con punta corta y gruesa resultan muy rígidas. Las
micropipetas usadas para el registro intracelular de células cardíacas deben poseer puntas
flexibles para no quebrarse cuando el tejido se contrae mecánicamente.
31
¾ Circuito eléctrico equivalente[15]
La Figura 2-15(a) representa a un microelectrodo insertado en el interior de una célula para
la medición de los potenciales de acción. La parte (b) de la figura esquematiza el circuito
equivalente de esta situación. Tanto el electrodo interno a la micropipeta como el electrodo
de referencia pueden ser representados por una resistencia en paralelo con un capacitor,
ambos en serie con una pila que representa el potencial de unión electrodo-electrolito. A
partir del electrodo interno de la micropipeta se encuentra una resistencia Rl
correspondiente a la resistencia del electrolito. Conectado a ella se encuentra la
capacitancia distribuida Cd correspondiente a la capacitancia a través de la pared del
vidrio. Luego se presentan dos potenciales, asociados con la punta de la micropipeta : un
potencial de unión líquida (Ej) que se establece debido a la diferencia de concentración
ente el electrolito y el fluido intracelular y otro potencial “de punta” (Et) que se produce
debido a que el vidrio de la punta se comporta al igual que un electrodo de membrana de
vidrio. El circuito equivalente presenta además las resistencias de los fluidos intracelular
(Ri) y extracelular (Re), las que se hallan acopladas al microelectrodo a través de la
capacitancia distribuida.
A
A
al amplificador
alambre de
conexión
solución
electrolítica
B
B
Rma
micropipeta
Cma
Ema
Rl
Cd
Rl
líquido
extracelular
célula
Rmb
electrodo de
referencia
citoplasma
Cmb
Cd
Ej
Emb
Et
Ri
Em
Re
Figura 2-15 : (a) Esquema representando un microelectrodo insertado en el interior de una célula. (b)
Circuito equivalente para esta misma situación. Las referencias están en el texto. (adaptada de [15])
El circuito equivalente representado en la figura precedente puede ser simplificado,
despreciando algunos componentes y agrupando los parámetros más relevantes. Así, las
resistencias de los conductores Rma y Rmb, las resistencias de los fluidos intra y extracelular
pueden ser despreciadas, ya que la mayor contribución a la resistencia total está dada por la
resistencia Rl de la micropipeta, que se halla en el orden de 1 a 100 MΩ. La capacitancia
de los electrodos metálicos puede despreciarse y la capacitancia distribuida puede
agruparse en un único capacitor. Todos los potenciales pueden también agruparse en una
única fuente. El circuito simplificado es el más empleado para describir el comportamiento
de los microelectrodos. El mismo se esquematiza en la Figura 2-16 .
32
Rl
A
Em
Cd
Eeq
B
Er
Cm
Rm
Figura 2-16 : Circuito equivalente simplificado del microelectrodo insertado en el interior de una célula. Em
representa el potencial de membrana (o de acción), Cd la capacitancia total distribuida, Rl la resistencia del
microelectrodo y Eeq la sumatoria de los potenciales de unión líquida, de punta y de las interfases electrodoelectrolito (adaptada de [15]).
¾ Electrodo de referencia
Para medir la diferencia de potencial entre dos puntos se necesita tener un segundo
electrodo, en este caso en el medio extracelular. El electrodo colocado en el baño se
conoce como electrodo indiferente o electrodo de referencia. Un método muy difundido
consiste en colocar como electrodo de referencia un alambre de Ag/AgCl.
¾ Vidrio utilizado en la fabricación de micropipetas
Los vidrios utilizados para la fabricación de las micropipetas de vidrio pueden ser
clasificados en base a sus constituyentes químicos principales, de acuerdo a su temperatura
de ablandamiento o bien a sus propiedades eléctricas. Los vidrios más difundidos para la
fabricación de microelectrodos se detallan en la siguiente tabla :
Tabla 2-I : Propiedades eléctricas y térmicas de los diferentes vidrios Corning. (modificado de[16])
Vidrio
Constante
dieléctrica
Temperatura de
ablandamiento (oC)
Descripción
7490
3,8
1580
cuarzo
7760
4,5
780
borosilicato
0080
7,2
695
carbonato de sodio
¾ Fabricación de las micropipetas
Las micropipetas se fabrican a partir de tubos capilares de vidrio, mediante un equipo
especial denominado estirador de micropipetas. Existe una gran variedad de equipos
estiradores comerciales, los que van desde modelos reativamente simples, con controles
manuales, hasta modelos más sofisticados, controlados por microprocesador. En todos
ellos, el tubo de vidrio se coloca en entre dos mordazas, muy próximo a un filamento
destinado al calentamiento. Un vez fijado el tubo, se ejerce un fuerza de tracción sobre el
mismo, a la vez que se aplica una corriente eléctrica al filamento, que eleva la temperatura
del vidrio y comienza a ablandarlo. Cuando esto ocurre, las mordazas comienzan a
33
separarse gradualmente, la parte central del tubo se estira y se vuelva más delgada. En la
mayoría de los estiradores (los denominados de dos etapas), se activa un interruptor
cuando el vidrio llegó a estirarse hasta una determinada longitud. Este interruptor activa un
mecanismo que provoca un súbito tirón entre ambas mordazas, provocando finalmente la
separación del tubo en dos partes, las que constituyen las dos micropipetas.
¾ Llenado de las micropipetas
Los microelectrodos se llenan usualmente con soluciones concentradas de KCl (3M). Esto
se debe en primer lugar a que el K+ y el Cl- tienen movilidades similares, lo cual reduce el
valor del potencial de unión líquida. Para soluciones con igual composición pero con
distinta actividad, el potencial de unión líquida está dado por la expresión :
Ej =
µ + − µ − RT ⎛ a' ⎞
.
ln⎜ ⎟
µ + + µ − F ⎝ a' ' ⎠
donde Ej representa el potencial de unión líquida, µ+ y µ- la movilidad de los iones
positivos y negativos respectivamente, R la constante universal de los gases ideales, T la
temperatura absoluta, F la constante de Faraday, a’ y a” las actividades de las soluciones a
ambos lados de la unión. Puede verse así que si las movilidades son similares, el potencial
Ej será pequeño. Por otra parte, la existencia de una alta concentración de iones en la punta
del microelectrodo le otorga al mismo una baja resistencia eléctrica.
El llenado de las micropipetas con solución electrolítica representa una tarea dificultosa,
debido al flujo viscoso del aire que debe ser expulsado. De acuerdo a la relación de HagenPoiseuille, la resistencia viscosa que presenta un tubo cilíndrico es inversamente
proporcional a la cuarta potencia del radio. En un tubo cónico de longitud suficiente, la
resistencia viscosa es inversamente proporcional a la tercera potencia del radio, pero aún
así la resistencia en contra del flujo a través de una micropipeta es muy elevada. Existen
varios métodos para el llenado de las pipetas cada una de las cuales recurre a una técnica
diferente[42]. Se diferencian principalmente de acuerdo al tiempo que se tarda para el
llenado de las micropipetas, tardándose desde un par de días en algunos hasta unos pocos
segundos en otros. En la siguiente figura se pueden ver algunos de ellos.
34
Figura 2-17 : Ilustración de algunos métodos para el llenado de las micropipetas. (a) Directamente a través
de la punta. Si bien es sencillo, resulta muy lento (b) Directamente a través del vástago, con una jeringa y a
presión. Resulta relativamente lento y requiere cierta destreza manual. (c) Por ebullición, calentando a 7080oC la solución de agua y metanol dentro del matraz y aplicando luego vacío por el tubo auxiliar. Requiere
de un procedimiento complicado y el calor puede dañar las puntas. (d) Por destilación, donde moléculas de
agua pura difunden hacia la punta llenándola. Al igual que el primero, resulta muy lento. (e) Por fibra de
vidrio, en la figura se muestran los conductos hidráulicos a cada lado de la fibra. (f) Por fibra de vidrio, en
esta figura se muestra el mecanismo de transporte de la burbuja.(extraída de [42])
El método más difundido para el llenado de las micropipetas es el que utiliza la fibra de
vidrio interna, ya que sólo se tardan unos pocos segundos para llenar las mismas. Los
capilares de vidrio usados para su fabricación poseen una fibra de vidrio de unos 20 µm de
diámetro en la pared interna de la pipeta y se los conoce como vidrios “omega dot” por la
forma particular que posee su perfil. Su funcionamiento se basa en la existencia de dos
conductos hidráulicos (Figura 2-17-e) a ambos lados de la fibra que permiten que la
solución avance hacia la punta, transportando en forma simultánea las burbujas de aire en
sentido opuesto (Figura 2-17-f).
2.2.4.2 Preamplificador
Esta parte del instrumento posee funciones muy importantes. Aunque su nombre lo
indique, no necesariamente se produce una amplificación del voltaje de entrada en esta
etapa. Sus funciones principales son :
• Debe conducir la señal de entrada (voltaje de membrana) hacia la siguiente etapa del
circuito sin introducir ninguna modificación a la misma, es decir con ganancia unitaria
dentro de la banda de interés de la señal. Es el tipo de circuito conocido comunmente
como “seguidor de voltaje”. (antiguamente “seguidor por emisor” en los circuitos de
transistores).
35
• Debe prevenir que fluya un valor de corriente elevado a través del microelectrodo.
Especificaciones:
Para describir con mayor detalle cómo se alcanzan estos requisitos, se brinda a
continuación una lista de especificaciones que definen a un preamplificador para registro
intracelular :
1. Corriente de bias: es la corriente que fluye del terminal de entrada en ausencia de señal
aplicada. Debido a que esta corriente atravesará el microelectrodo se necesita que su
valor sea pequeño, de lo contrario se produciría un voltaje muy grande a la entrada del
amplificador. Si se tolera como máximo un aumento de voltaje de 1 mV y el
microelectrodo puede tener una impedancia de hasta 100MΩ, la corriente de bias no
debe ser mayor a 10 pA. (ver Figura 2-18)
Vi
Vo
x1
Ibias
RµE
Vo = Vi = RµE * Ibias
Figura 2-18 : Efecto de la corriente de bias sobre el voltaje de salida en ausencia de señal aplicada. El
sentido de circulación indicado por las flecha es arbitrario.
2. Resistencia de entrada: este parámetro también mide cuánto se opone el
preamplificador a que fluya corriente a través de él, en este caso cuando se le aplica un
voltaje a la entrada. Normalmente se busca que la resistencia de entrada del
preamplificador sea de 100 a 1000 veces superior a la resistencia del microelectrodo
(1010 a 1011 Ω). Actualmente los dispositivos con entradas FET presentan muy poco
inconveniente en alcanzar valores superiores a 1012 Ω.
Vi
RµE
Vo
Rin
Vo=Vi = Em*
Em
Rin
Rin+RµE
Figura 2-19 : Efecto de la impedancia de entrada del amplificador sobre la señal. Como puede verse, si se
logra que Rin>>RµE, se tiene que Vi≈Em.
3. Tiempo de establecimiento: esta especificación mide la velocidad con la cual el
preamplificador puede seguir señales de variación rápida. El tiempo de establecimiento
(ts) es el tiempo requerido para que la salida pase de un 10% a un 90% de su valor final,
luego de aplicar un escalón de voltaje en la entrada. Un valor aceptable para ts es
1/(5*fmax), donde fmax es el valor de la mayor componente frecuencial de la señal bajo
estudio. El tiempo de establecimiento debe especificarse para valores de resistencia de
microelectrodo razonables, por lo general 10 ó 20 MΩ.
4. Rango dinámico de entrada: es el rango de voltajes de entrada con los que trabaja el
preamplificador. Por lo general se trabaja con rangos superiores a ±2 V.
36
5. Deriva y estabilidad : son especificaciones que se dan en diferentes maneras de acuerdo
a cada fabricante. Pueden estar expresadas en unidades de voltaje sobre tiempo o sobre
temperatura. Un valor aceptable para la deriva térmica debe ser menor a 200 µV/oK.
6. Ancho de banda : esta especificación se expresa en términos de la frecuencia de corte
del preamplificador, que es el valor de frecuencia para el cual la amplitud de la salida
del mismo cae 3 dB con respecto a su valor a bajas frecuencias. Hay que diferenciar
entre el ancho de banda propio del preamplificador (usualmente del orden de los MHz)
y el ancho de banda del circuito limitador adicional (un filtro pasabajo) que poseen
algunos circuitos. Por lo general, los fabricantes de este tipo de equipos especifican el
ancho de banda con respecto al filtro pasabajo incorporado, el cual posee a su vez varias
frecuencias de corte. Esto permite establecer el ancho de banda acorde con las
necesidades particulares de cada tipo de registro.
7. Amplitud de ruido : es un parámetro que se utiliza para cuantificar la magnitud de ruido
introducido en la señal por el preamplificador y se mide en la salida del mismo cuando
la entrada se encuentra conectada a tierra. Algunos fabricantes especifican su valor para
una resistencia conectada entre la entrada y tierra, lo que introduce una fuente de ruido
adicional. La amplitud de ruido puede expresarse en valores de voltaje pico a pico (p-p)
o eficaces (rms), los que a su vez dependen del ancho de banda del preamplificador.
Una especificación aceptable es de 200 µV (rms) para un ancho de banda de 10 kHz.
8. Velocidad de cambio (slew rate) : este parámetro expresa la razón de cambio del voltaje
de salida del amplificador, cuando éste funciona en la región activa normal, en
respuesta a un escalón en la señal de entrada que provoca una salida próxima a la
saturación. Su valor se indica en V/seg. En este caso, por tratarse de un amplificador
con ganancia unitaria que nunca se encuentra cercano a las condiciones de saturación,
este parámetro no se tiene en consideración.
2.2.4.3 Guarda electrostática
El circuito equivalente del microelectrodo conectado a la entrada del amplificador está
representado por una resistencia en paralelo con un capacitor. En la parte (a) de Figura 220 se muestra el circuito equivalente, en el cual la resistencia total es prácticamente la del
microelectrodo y la capacitancia distribuida está compuesta de tres componentes : la
capacidad del microelectrodo y las capacitancias parásitas del cable de conexión y del
circuito de entrada.
Tal como se mencionó, la presencia de estas capacidades parásitas trae aparejado un efecto
indeseable de filtro pasa bajo, disminuyendo de manera considerable el tiempo de
establecimiento de la señal. Este último toma un valor de aproximadamente 2,2*Rµe*Ctot.
Por lo tanto la premisa consiste en hacer que la resistencia y la capacitancia distribuida
tomen valores pequeños. Para ello existen varias recomendaciones, entre ellas usar
microelectrodos de baja resistencia, no colocar los preparados muy profundamente para no
sumergir demasiado la punta de la pipeta en la cámara y minimizar el trayecto del cable de
conexión del microelectrodo al preamplificador. Las dos primeras recomendaciones se
satisfacen fácilmente, pero la tercera requiere que el circuito del preamplificador sea
montado y encapsulado próximo al microelectrodo.
Un método adicional de reducir la capacitancia distribuida es la llamada “guarda
electrostática”. El principio que se aplica es el siguiente : cuando las placas de un capacitor
son sometidas al mismo potencial no se produce flujo de carga alguno en el mismo. En la
Figura 2-20(b) puede verse el efecto de colocar un blindaje conectado a tierra alrededor del
37
cable de conexión del microelectrodo. El efecto es retrógrado, ya que si bien se elimina la
capacitancia Cs, se la reemplaza por una mucho mayor Cc. Si en lugar de ello se adopta el
conexionado de la Figura 2-20(c), se observa que el efecto de la capacitancia desaparece
ya que ambas placas se encuentran siempre al mismo potencial.
Figura 2-20 : Desarrollo de la guarda electrostática. (a) Los tres componentes de la capacitancia total
distribuida del circuito de entrada. (b) Una guarda a tierra elimina Cs pero la reemplaza por una capacidad
mucho mayor Cc..(c) La guarda es mantenida al mismo potencial que la entrada. (extraído de [42])
2.2.4.4 Compensación de capacitancia
Para eliminar la capacitancia distribuída algunos preamplificadores proveen lo que se
denomina circuito de compensación de capacitancia. El principio que se utiliza es la
realimentación positiva de una parte de la señal de salida a través de un capacitor (ver
figura siguiente). De esta forma, se coloca un valor “negativo” de capacitancia en paralelo
con la capacitancia total distribuida y ésta puede ser disminuida[42].
-
Vo
+
RµE ≈10M
C≈12pF
Figura 2-21 : Circuito de compensación de capacidad
38
2.2.4.5 Circuito amplificador
Esta parte del circuito de registro es la encargada de acondicionar la señal proveniente del
preamplificador. Su misión es la de amplificar dicha señal (de ahí su nombre) aunque
también cumple con otras funciones. A continuación se describen las características que
debe poseer, de acuerdo a la función específica :
¾ Amplificación de la señal a los niveles requeridos por la etapa siguiente : la señal de
los potenciales de acción se encuentra en un rango de aproximadamente -100 a +50 mV,
A los fines de visualizar la misma, no es necesario proveer amplificación, ya que los
instrumentos utilizados comunmente pueden manejar estos rangos. Sin embargo, si se
quiere digitalizar la señal para poder almacenarla, será necesario amplificarla para
poder aprovechar al máximo la resolución del sistema de conversión analógico/digital
(esto se discutirá con más detalla en el apartado 2.2.5)
¾ Corrección del voltaje de offset : como se mencionó previamente, existen una serie de
potenciales de offset asociados con la técnica de medición, que aparecen sumados al
potencial de membrana que se desea registrar. Se requiere entonces que el circuito
amplificador tenga la posibilidad de compensar la presencia de tales potenciales, en un
rango de aproximadamente ±200 mV.
¾ Limitador del ancho de banda de la señal : esta sección del circuito se implementa a
través de un filtro pasabajo y tiene como finalidad reducir el ancho de banda de la señal
antes de ingresarla a la placa conversora. De esta forma se evita el “aliasing” que se
produciría si están presentes en la señal componentes frecuenciales que estén por
encima de la frecuencia de Nyquist. Este tipo de filtro pasabajo también recibe el
nombre de “filtro antialiasing”. De acuerdo a la función de transferencia que lo
representa, existen muchos tipos de filtros, cada uno de los cuales posee características
que lo hacen más apropiado para una aplicación en particular. Para señales que se
analizan en el dominio del tiempo, como es el caso de los potenciales de acción, se
recomienda el uso de los filtros Bessel[16], ya que poseen una respuesta al escalón
sobreamortiguada. Esto implica que las señales no son distorsionadas al pasar por el
filtro. El inconveniente de los filtros Bessel es que presentan una transición suave entre
las bandas de paso y de rechazo, por lo que para lograr una separación más abrupta se
necesita incrementar el orden del filtro. Un filtro Bessel de orden 4 resulta suficiente
para este tipo de aplicación.
¾ Medición de la resistencia del microelectrodo : La medición de la resistencia del
microelectrodo resulta útil para verificar el estado del mismo durante la realización de
los experimentos. Para ello se utiliza el denominado método de inyección de corriente
constante. Se envía una corriente de valor conocido a través del microelectrodo, lo que
provocará una diferencia de potencial a la entrada del circuito de medición proporcional
a la resistencia. Usualmente los equipos proveen un botón pulsador mediante el cual se
activa un circuito que inyecta 1 nA, lo que resulta un valor de 1mV/MΩ. El mismo
puede ser leído en el voltímetro asociado al sistema de registro.
39
Figura 2-22 : Esquema funcional del método de inyección de corriente constante para la medición de la
resistencia del microelectrodo. (extraído de [42])
2.2.4.6 Estimulación del preparado
En la mayoría de los experimentos es necesario iniciar los potenciales de acción mediante
estímulos a intervalos controlados. La excepción a esto es el estudio de actividad
espontánea, como es el caso del nódulo sinusal. La iniciación regular de los potenciales de
acción se logra a través de la estimulación de los tejidos con estímulos eléctricos. Los
esímulos pueden ser aplicados tanto intra como extracelularmente. A continuación se
mencionan las principales características de cada uno de los métodos.
• Estimulación intracelular: se realiza a través de un microelectrodo de estimulación,
que es constructivamente idéntico al utilizado para el registro. En los preparados
multicelulares, debe utilizarse un mismo microelectrodo para cumplir ambas funciones.
Para estimular una célula aislada es necesario inyectar una corriente despolarizante, que
es del orden de unos pocos nA. Debido a las conexiones de baja resistencia existentes
entre los miocitos en un tejido, se requiere una cantidad de corriente más grande para
los preparados multicelulares, tanto mayor cuanto más grande sea el preparado. El pulso
de voltaje necesario se relaciona tanto con el valor de corriente a inyectar como con el
de resistencia del microelectrodo. Si por ejemplo se debe inyectar un pulso de corriente
de 100 nA a través de un microelectrodo de 10 MΩ, es necesario aplicar un pulso de
1V. Este pulso produce un artefacto considerable sobre el registro si no se toman las
medidas para eliminarlo. Los dispositivos modernos poseen circuitos electrónicos que
desconectan la entrada del preamplificador durante la aplicación del estímulo. Este
método está limitado por los tamaños del preparado, por lo que se usa preferentemente
en los registros de potenciales de acción de células aisladas.
• Estimulación extracelular: se utiliza con mayor frecuencia para la estimulación de
preparados multicelulares. Se establece un diferencia de potencial entre dos electrodos
metálicos que están en contacto con la superficie del preparado, lo que produce la
despolarización de las células y la iniciación de un potencial de acción que se propaga a
través de todo el tejido. Para minimizar la amplitud de los artefactos introducidos en el
electrodo de registro por acople capacitivo, los dos electrodos se colocan muy próximos
entre sí (1 o 2mm), lo que produce un campo de estimulación muy localizado.
Adicionalmente los conductores que llevan la señal hasta los electrodos y los propios
electrodos se trenzan entre sí, dejando separadas solamente las puntas. Como los
electrodos no pueden tocarse entre sí, una solución constructiva consiste en fabricar los
electrodos con alambres de plata teflonada, a la que se le quita la aislación en la punta.
El electrodo se posiciona en la superficie del preparado con la ayuda de un
micromanipulador. No es necesario que los electrodos entren en contacto con el tejido,
40
ya que los potenciales de acción pueden ser iniciados aún cuando los electrodos están
ubicados muy próximos al preparado (<1mm). De esta manera se evita el daño que se
produce por el contacto mecánico sostenido.
Otra forma de aplicar el estímulo en forma extracelular es a través de la llamada
“estimulación de campo”. En este caso se utilizan dos electrodos extensos y alejados del
tejido a los que se les aplica una diferencia de potencial que produce un campo eléctrico
dentro de la totalidad de la cámara experimental. Esto permite estimulación de
preparados pequeños, sin el riesgo de daños mecánicos que causan los electrodos de
contacto. Sin embargo, puede mencionarse como desventaja que la estimulación de
campo activa en forma extensiva los terminales nerviosos del tejido, lo que induce una
liberación sustancial de neurotransmisores durante la estimulación.
Los distintos tipos de estimulación recién descriptos necesitan de un equipo estimulador
electrónico. La forma de estímulo más común generada por estos aparatos consiste en un
pulso rectangular. Se puede estimular a tensión o a corriente constante. La mayoría de los
estimuladores poseen controles para el intervalo entre estímulos, la duración de cada
estímulo y la amplitud del mismo.
2.2.4.7 Eliminación de interferencias
La interferencia o ruido presente en el sistema de registro puede deberse a una variedad de
causas, principalmente a la presencia de campos eléctricos y magnéticos. Otra causa
común de interferencias son los instrumentos conectados a tierra en forma inadecuada. A
continuación se discuten algunos aspectos fundamentales a tener en cuenta para la
eliminación de las interferencias eléctricas.
¾ Interferencias por campos eléctricos : debido a la alta impedancia del circuito de
entrada, las interferencias por acople capacitivo desde conductores que están a un potencial
diferente que el microelectrodo se vuelven considerables. Una forma de reducir la
interferencia es interponer un material conductor conectado a tierra entre la fuente de
interferencia y el microelectrodo. En forma práctica esto se consigue “encerrando” al
circuito de registro dentro de la denominada jaula de Faraday. La jaula de Faraday puede
construirse con mallas de alambre conductor, montadas en estructuras apropiadas, o
mediante hojas de aluminio. Para proveer un blindaje eléctrico efectivo la jaula de Faraday
debe estar conectada al mismo punto de tierra que se utilice para los instrumentos
electrónicos (la puesta a tierra se discute en detalle más adelante).
¾ Interferencias por campos magnéticos : Los transformadores o motores colocados
próximos al sistema de registro, producen líneas de flujo disperso que puede inducir una
fuerza electromotriz en los conductores del circuito de registro. Para solucionar este
inconveniente hay que evitar la colocación de este tipo de fuentes de interferencia
próximas al sitio de registro, blindar magnéticamente mediante el uso de pantallas y evitar
la presencia bucles en los cables de registro[42].
¾ Puestas a tierra defectuosas o incorrectas : Los instrumentos electrónicos deben
conectarse a una masa común, para minimizar la interferencia de 50Hz. La jaula de
Faraday, la lupa binocular, la superficie de al mesa antivibratoria y las bases magnéticas
deben ser conectadas a una masa común. Se recomienda construir un terminal central de
tierra, constituido por conectores tipo “banana”, donde se puedan conectar todos los
instrumentos indicados. De esta forma el potencial de tierra de todos los instrumentos es el
mismo. Esto evita que se produzcan corrientes eléctricas entre los instrumentos que se
encuentran operando con potenciales de referencia diferentes : los denominados bucles de
41
tierra. También es importante la conexión de el tercer conductor de los cables de
alimentación de los instrumentos, el que además de proveer un blindaje adicional en los
equipos, debe estar presente por una cuestión de seguridad del personal[42].
2.2.4.8 Voltímetro
El voltímetro es uno de los dispositivos de salida del sistema, que permite medirr el valor
medio del potencial registrado por el microelectrodo. Es útil para visualizar el valor del
potencial de punta del microelectrodo cuando el mismo se halla sumergido dentro del
baño, antes de penetrar al preparado. Se puede así compensar muy precisamente a cero este
potencial mediante el control de offset descripto precedentemente. Además sirve para
mostrar el valor de la resistencia del microelectrodo cuando se acciona el pulsador de
inyección de corriente. Se recomienda el uso de voltímetros digitales, con una resolución
de 3 y ½ dígitos, para permitir la visualización de potenciales en un rango de ±199.9
mV[42].
2.2.4.9 Osciloscopio
El osciloscopio es otro de los dispositivos destinados a la salida de la señal de los
potenciales de acción en tiempo real. El único requisito importante es la capacidad que
debe poseer el instrumento de poder visualizar la señal de tan baja repetitividad como los
potenciales de acción (≤3Hz aproximadamente). Para ello hay que usar un osciloscopio
digital, ya que con uno analógico el trazo para señal de tan baja frecuencia desaparece muy
rápidamente de la pantalla impidiendo su correcta visualización. Existen modelos de
osciloscopios con memoria analógica, pero su precio es extremadamente caro.
2.2.5 Sistema de adquisición digital de la señal
Hasta aquí se han discutido los componentes del sistema de registro que permiten una
visualización en tiempo real de las señales provenientes del amplificador. Sin embargo es
necesario contar con un sistema de captura que permita su almacenamiento y facilite el
posterior procesamiento y análisis. Para ello se emplea un sistema de adquisición,
constituido por dispositivos físicos (hardware) y por programas (software). El hardware
esta compuesto por una computadora personal (PC-IBM compatible) y una placa
conversora analógico-digital (A/D). El software está compuesto por el sistema operativo y
el programa específico para realizar el manejo de los datos.
2.2.5.1 Requisitos del hardware
1. PC :
Las características fundamentales que deben considerarse para definir la PC necesaria para
esta aplicación son las siguientes : Tipo de placa madre (motherboard), velocidad del
microprocesador, capacidad de almacenamiento del disco rígido, capacidad de memoria
RAM, tipo de adaptador de video y tipo de monitor. También hay que considerar el tipo de
unidades de disquette y de CD-ROM necesarias, si se requiere impresora, mouse y otros
dispositivos periféricos[16]. Para poder definir estas características habrá que tener en
cuenta el sistema operativo que se escogerá para el manejo de la PC. También habrá que
considerar los requisitos particulares del software de adquisición y de la aplicación que se
está desarrollando, como ser necesidades de almacenamiento, de salida de datos por
impresora, etc.
2. Placa conversora A/D :
42
La placa conversora o placa de adquisición, es la encargada de transformar las señales
provenientes del amplificador, que están en forma analógica, para que puedan ser
interpretadas por la PC, que opera en forma digital. Por lo general, las placas también
poseen salidas en forma analógica y/o digital, contadores digitales y algunos controladores
accesorios. Los principales parámetros que definen una placa conversora A/D, pueden
resumirse de la siguiente manera:
• Número de entradas analógicas : es el número máximo de señales de entrada que
pueden ser digitalizadas en forma multiplexada.
• Frecuencia de muestreo : este parámetro especifica con qué velocidad se llevan a cabo
las sucesivas conversiones.
• Resolución : es el número de bits que el conversor utiliza para representar la señal
analógica en forma digital.
• Rango : este parámetro se refiere a los niveles mínimo y máximo de voltaje con los que
el conversor A/D puede trabajar. Por lo general se cuenta con varios rangos de trabajo
posibles. Para un placa el rango más pequeño es el que posee mayor resolución.
• Ganancia : algunas placas proveen un valor de ganancia programable para incrementar
el voltaje de la señal. La resolución, el rango y el valor de ganancia determinan en
conjunto cuál es el mínimo valor de voltaje detectable por la placa, el que representa el
denominado bit menos significativo (LSB).
• Linealidad, precisión relativa y offset : son parámetros que definen cuánto puede
desviarse el valor digital de la salida del conversor del valor que debe entregar en
condiciones ideales. Estos parámetros se expresan en relación al LSB.
• Salidas analógicas : algunas placas conversoras proveen salidas analógicas que pueden
ser usadas para generar estímulos o señales de control apropiadas desde la PC. Para
definir este parámetro de una placa hay que especificar principalmente número y tipo de
salidas, rango de voltajes, tiempo de establecimiento y resolución.
• Entrada y salida digital : las entradas/salidas digitales (D-I/O) pueden utilizarse en los
sistemas de adquisición para el control de procesos, generación de patrones,
comunicación con periféricos, etc. Lo importante para definir las D-I/O es el número de
líneas digitales disponibles, la frecuencia a la cual se pueden transmitir/recibir datos y la
capacidad de manejo de tales líneas.
• Temporización : la circuitería de temporización de las placas conversoras sirve para la
temporización, detección y conteo de eventos, generación de ondas cuadradas, pulsos,
etc. Para definir esta característica hay que especificar número y tipo de contadores
presentes en la placa, resolución (no de bits) de los mismos y frecuencia del reloj
(clock).
• Control de Acceso Directo a Memoria (DMA): algunas placas pueden operar usando
DMA para aumentar la velocidad de transferencia de los datos que son adquiridos.
Para definir la elección de la placa conversora también será importante tener en cuenta :
• Programas que se utilizan para su configuración y/o manejo.
• Costo y facilidad de obtención en el mercado nacional.
43
2.2.5.2 Requisitos del software
Como se mencionó previamente, el software está constituido por el sistema operativo de
manejo de la PC y el programa de adquisición.
1. Sistema operativo :
El sistema operativo sirve para controlar y administrar los recursos de la PC. La elección
del sistema operativo para el manejo de la PC es una cuestión sencilla. Se debe utilizar un
sistema operativo que permita el funcionamiento del programa de adquisición y demás
programas utilitarios que se necesiten en el ámbito del laboratorio. Esto último involucra
planillas de cálculo, procesadores de texto, procesadores estadísticos, etc.
2. Programa de adquisición :
El programa de adquisición permite el manejo de las señales provenientes del experimento.
Esto implica que, mediante el uso del programa, las señales se pueden visualizar,
almacenar y/o procesar. Para obtener un programa de adquisición se puede recurrir a dos
posibilidades :
• Comprar un programa específico de adquisición para señales electrofisiológicas, sin
invertir tiempo de programación pero perdiendo la libertad de realizar modificaciones al
mismo.
• Utilizar un lenguaje de programación para construir la aplicación que más se adecue a
los requisitos del trabajo, invirtiendo cierto tiempo en la programación de la misma.
La elección depende, entre otras, de la flexibilidad necesaria para la aplicación. Además
habrá que considerar la relación costo/beneficio entre adquirir un programa hecho vs.
desarrollar un programa.
44
2.3 Diseño del espacio de trabajo
En los puestos de trabajo para la realización de registros electrofisiológicos, la disposición
de los distintos elementos está generalmente regida por las preferencias de quienes lo
utilizan[16]. Aun así, es necesario seguir ciertos lineamientos que son comunes al diseño de
puestos de trabajo en general. El espacio de trabajo, a la vez que debe cumplir los
requisitos de mantener los preparados celulares y de servir para realizar los registros, debe
ser confortable y de uso sencillo para los usuarios. En este capítulo se brindarán los
conceptos teóricos fundamentales asociados con el diseño de espacios de trabajo que serán
tenidos en cuenta en la implementación del presente proyecto.
2.3.1 El diseño de puestos de trabajo
Conjuntamente con la sensación de desconfort y el aumento de fatiga experimentado por
un hombre que debe realizar tareas en posturas desfavorables, las malas posturas pueden
implicar, a largo plazo, perturbaciones funcionales graves. Así, si una parte del cuerpo
experimenta regularmente una sobrecarga estática, el funcionamiento del organismo sufre
alteraciones[17]. Más aun, pueden cometerse errores en el desarrollo normal de la tarea
debido a la fatiga causada por una mala disposición de los elementos de trabajo, los
controles y/o los “displays” visuales (en ergonomía se utiliza la palabra “display” para
definir a cualquier estímulo proveniente del medio que provoca una entrada de
información en el ser humano. Si el display es visual, obviamente la entrada será captada
con el sentido de la visión).
En el caso de los sistemas para registro usados en electrofisiología, tal como es el caso del
presente proyecto, el operador trabaja en un puesto desde donde debe adquirir diferentes
posturas. Estas provocan extensiones para alcanzar controles ubicados a diferentes alturas,
movimientos del cuello cuando el área de trabajo a visualizar así lo exige, movimientos
precisos de las manos para acceder con el microelectrodo dentro de las células, etc. Por lo
tanto es menester realizar un estudio racional de las alturas de los comandos y las
superficies de trabajo, así como también de la disposición de los diferentes elementos de
trabajo y equipos utilizados.
2.3.2 Elección de la postura de trabajo óptima
La postura de trabajo óptima debe establecerse en base a un análisis de las actividades
específicas que han de realizarse y los tipos de personas que deben utilizar el espacio[18].
Por la característica de las tareas realizadas en un puesto de trabajo como el descripto
anteriormente, se ha considerado conveniente escoger la postura de sentado. Permitir que
el operario se siente lo alivia de tener que mantenerse de pie, lo cual reduce la carga de
trabajo estático muscular requerida para mantener rígidas las articulaciones del pie, de la
rodilla, de la cadera y de la espina dorsal, además de reducir el consumo de energía. La
postura de sentado es mejor para la circulación que la de pie. Cuando la persona está de
pie, la sangre y los fluidos de los tejidos tienden a acumularse en las piernas, tendencia que
se reduce cuando se está sentado. Estar sentado ayuda al operario a adoptar posturas más
estables, que le permitirán llevar a cabo las tareas que requieren movimientos más finos o
precisos[17].
A pesar de estas ventajas, el operario sentado tiene desventajas en otros aspectos, por lo
que es necesario lograr una situación de compromiso. Tal vez lo más importante es que su
movilidad queda restringida severamente. Este hecho puede solucionarse en parte haciendo
45
más accesibles los diferentes controles manuales que deben ser operados durante la
realización de la tarea y/o adecuando el asiento al sitio particular (permitiéndole girar y
deslizarse, por ejemplo).
2.3.3 El espacio de trabajo para personal sentado
2.3.3.1 Dimensiones del espacio de trabajo
El espacio en el que se desenvuelve una persona que está desempeñando una tarea en
posición de sentado se denomina envoltura del espacio de trabajo[18]. Dentro de la
envoltura tridimensional de un espacio de trabajo, las consideraciones más específicas del
diseño del área de trabajo se refieren a las superficies horizontales (dimensiones, perfiles,
alturas, etc.), verticales e inclinadas (dimensiones, posiciones, ángulos, etc.). Estas
características deben determinarse, preferentemente, sobre la base de mediciones de
dimensiones estructurales y funcionales (mediciones antropométricas) de las personas que
habrán de utilizar el sistema[18].
2.3.3.2 Area de la superficie horizontal de trabajo
Muchos tipos de actividades manuales se efectúan sobre superficies horizontales, tales
como bancos de trabajo, mesas o mesadas. Por lo que respecta a tales superficies de
trabajo, se propuso considerar dos áreas: una normal y una máxima (Barnes, 1963). Estas
dos áreas aparecen en la Figura 2-23 y se han descripto de la siguiente manera :
¾ Area normal : es el área que puede alcanzarse con una extensión del antebrazo,
manteniendo la parte superior del brazo en su posición lateral natural.
¾ Area máxima : es el área que puede alcanzarse al extender el brazo a partir del hombro.
Sin embargo, investigaciones afines realizadas por otro investigador (Squires, 1956) han
servido como base para proponer un perfil algo diferente de la superficie de trabajo que
tiene en cuenta la interrelación dinámica del movimiento del antebrazo en cuanto el codo
también se mueve. El área que queda así circunscrita se superpone con el área propuesta
por Barnes. El área propuesta por este último es la que goza de mayor aceptación[18].
Figura 2-23 : Dimensiones (en pulgadas y en cm) de áreas de trabajo normal y máxima en un plano
horizontal, propuestas por Barnes, junto con un área de trabajo normal que, propuesta por Squires, aparece
en sobreimpresión a fin de mostrar las diferencias. (extraída de [18])
46
2.3.3.3 Altura de la superficie horizontal de trabajo
El amplio espectro de tareas realizadas por personal sentado ante mesas y bancos de
trabajo, además de la enorme variedad de diferencias individuales, excluyen evidentemente
que se establezca una altura única y universal apropiada a tales superficies. A modo
general puede enunciarse una regla que establece que la superficie de trabajo debería estar
a un nivel tal que los brazos pudieran colgar de forma relativamente natural, con una
posición relajada del hombro y con el antebrazo aproximadamente horizontal o
ligeramente inclinado hacia abajo[18].
La altura de la superficie de trabajo también depende de la tarea que ha de realizarse sobre
al misma. Como regla general se establece que las tareas que requieren mayor precisión
manual deben llevarse a cabo sobre superficies más altas.
La superficie de trabajo que resulta más apropiada en general esta muy relacionada, en
cuanto a la altura, con la altura del asiento, espesor de la superficie y grosor del muslo.
Siempre que sea posible deben proveerse algunas características ajustables, tales como la
altura del asiento, la posición del pie, o la altura de la superficie de trabajo.
La Figura 2-24 muestra las consideraciones antropométricas que entran en el diseño de un
espacio de trabajo de laboratorio, con características similares al diseño a realizar en el
presente trabajo. La figura de al izquierda pone de manifiesto la relación existente entre la
mujer, de menor tamaño, con la mesa y la pared del laboratorio. La repisa debe estar dentro
de la extensión de la persona en posición de sentada (área máxima de la envoltura de
trabajo). La misma consideración puede hacerse para el caso de instrumentos y controles
que estén ubicados lateralmente. La altura del ojo desempeña también un importante papel,
no sólo a lo referente al trabajo con microscopio, sino también en lo relativo a la
visibilidad de los diferentes controles y displays existentes a su alrededor. Dentro de
ciertos límites cabe confiar en la regulación de altura del asiento para adecuarla a la del
microscopio y superficie de la mesa. La figura de la derecha muestra la mismas relaciones
citadas, pero referidas a un hombre de mayor tamaño.
47
A
B
C
D
E
F
G
H
I
76,2
60,9
45,7
76,2-91,4
86,4-96,5
68,5
30,5-38,1
99,1(max)
106,7(max
)
Figura 2-24 : Consideraciones antropométricas para zonas de laboratorio, tanto para operarios masculinos
como femeninos. Las medidas del cuadro están dadas en centímetros. (adaptada de [17])
Las consideraciones de la Figura 2-24 son válidas para el diseño de la superficie de trabajo
donde se ubicará la cámara con el preparado. Para el caso de la superficie donde irá
colocada la PC, se deben contemplar otras consideraciones. De acuerdo con Tougas y
col.[19], en el diseño de puestos de trabajo que incluyan el uso de una PC, las pautas más
importantes a tener en cuenta son las siguientes:
• Monitor: en lo posible debe poder ajustarse su altura e inclinación. El mismo debe estar
de frente al operador. La distancia entre los ojos y la pantalla debe estar en un rango de
45 a 70 cm.
• Teclado: altura recomendada en el orden de los 64 a 76 cm. Debe colocarse en un sitio
tal que permita el apoyo de los antebrazos del operador sobre la mesa.
• Mesa: dado que no se debe realizar un trabajo de precisión, la altura de la misma debe
estar unos 5 a 10 cm por debajo de la línea de los codos.
• Silla: debe ser de altura ajustable para poder adaptarse a cada usuario en particular..
2.3.4 Espacio físico y distribución [18]
La distribución de los distintos componentes del sistema dentro del espacio físico puede
ejercer efectos sobre las personas, incluyendo sus trabajos, su comodidad e incluso su
48
bienestar físico. El término componente se refiere virtualmente a cualquier aspecto
relevante, como podrían ser los displays, controles, materiales, equipos o áreas de trabajos.
Como hipótesis razonable se establece que cualquier componente dado tiene, por lo
general, una situación optima desde la que llevar a cabo su finalidad. Este optimo debe
afirmarse sobre las características biomecánicas, antropométricas y de sensibilidad humana
implicadas. Por supuesto, los componentes deberían estar situados, con preferencia, en sus
lugares óptimos, pero puesto que esto con frecuencia no es posible hay que establecer a
veces prioridades. A continuación se mencionan algunos de los factores que se tienen en
cuenta para establecer la prioridades.
2.3.4.1 Principios guía de distribución
1. Principio de la importancia : este principio trata de la importancia operacional, es decir,
el grado en el que la realización de la actividad con el componente es vital para alcanzar
los objetivos del sistema o cualquier otra consideración.
2. Principio de la frecuencia de uso : tal como dice el nombre, este concepto se aplica a la
frecuencia con la que se utiliza algún componente.
3. Principio funcional : el principio funcional de distribución procura agrupar los
componentes según su función.
4. Principio de la secuencia de uso : por lo que respecta al uso de ciertos ítems, existen
secuencias o modelos de relaciones que aparecen con frecuencia durante la operación
del sistema.
Está claro que no existe o no se puede aplicar de una forma fehaciente una sola pauta
válida para todas las situaciones. Pero, de una manera muy general, y además de la premisa
del optimo, las nociones de importancia y de frecuencia probablemente son aplicables,
sobre todo, a las fases más básicas de situar componentes de un área general en un espacio
de trabajo; a su vez, los principios de frecuencia de uso y de funcionalidad tienden a
aplicarse más a la distribución de los componentes dentro de un área general.
2.3.4.2 Métodos de análisis
En los procesos de diseños resulta útil la recolección de datos relacionados con el espacio
físico. Los tipos de datos más importantes se relacionan con las actividades u operaciones
humanas que hayan de llevarse a cabo. Los criterios relevantes de tales actividades
incluyen la frecuencia, sus secuencias e interrelaciones, su importancia y el tiempo que se
les dedica. En alguna circunstancias también pueden utilizarse los criterios subjetivos de
comodidad, conveniencia o preferencia.
El análisis de actividad se lleva a cabo mediante diversas técnicas. Si existe un modelo
previo en el que basarse, el análisis puede realizarse mediante observación de su uso,
filmaciones, secuencias fotográficas, etc. Otros métodos para obtener datos incluyen el uso
de entrevistas o cuestionarios con personal experimentado en el uso del sistema. Se pueden
obtener así datos relativos a la frecuencia de uso, importancia o facilidad de manejo. En el
caso de sistemas nuevos, los parámetros deben inferirse de cualquier tentativa de esquema,
plano o concepto que estén disponibles. Algunas veces tales intentos de distribución
pueden comprobarse mediante el uso de prototipos o modelos físicos.
En el caso que desarrollamos en el presente trabajo, los datos fueron obtenidos a partir de
la experiencia personal del director del proyecto. Se recopilaron datos adicionales
mediante entrevistas con otros usuarios experimentados, visitas a sistemas que están
49
funcionando actualmente e información recopilada de bibliografía, que por cierto es muy
escasa.
Aunque las situaciones óptimas de algunos componentes específicos dependerían,
probablemente, de factores situacionales, cabe indicar ciertas generalizaciones sobre
ciertas clases de componentes, que se discutirán a continuación :
¾ Displays visuales : Se considera que la línea normal de visión está 15o por debajo del
horizonte. La sensibilidad visual, acompañada por movimientos moderados de ojos y
cabeza, permite una exploración visual bastante completa de un área alrededor del la
línea normal de la visión. El área que permite una visión más conveniente (y por lo
tanto la generalmente preferida para los displays visuales) se ha considerado como la
definida por un círculo, de un radio de unos 10 a 15o alrededor de la línea normal de la
visión. Estudios complementarios (Haines y Gilliland, 1973) determinaron que esta área
es más un óvalo que un círculo, y que debe ser el sitio de preferencia para la ubicación
de los displays que cumplan funciones más críticas.
¾ Controles manuales : La situación óptima de los instrumentos de control manual es,
naturalmente, una función del tipo de control, del modo de operación y de los criterios
adecuados de realización (precisión, fuerza, velocidad, etc.). En el caso práctico que se
considera en el presente trabajo, se puede pensar a los diversos controles existentes
como controles ubicados sobre paneles. Algunos de los controles que están ubicados
sobre paneles pueden ser operados con mayor efectividad de acuerdo a su ubicación
física. En la Figura 2-25 puede observarse una serie de áreas preferidas para cuatro
clases de instrumentos de control, basándose en sus prioridades relativas.
100
Area máxima de superficie plana para controles
secundarios
Límite preferencial para otros
controles secundarios
Controles de emergencia y
controles secundarios de
precisión y ajuste
75
50
Controles primarios
25
0
-50
-25
0
25
50
Distancia de derecha a izquierda del punto de referencia
del asiento, en centímetros.
Figura 2-25: Áreas preferidas de superficie vertical y límites para diferentes clases de controles manuales.
(adaptada de [18])
2.3.4.4 Distribución específica de los componentes
Una vez que se ha tomado una determinación sobre situaciones generales de los
componentes (tales como controles y displays), el siguiente proceso es el de distribuir
50
aquellos componentes que están dentro de una misma área general (por ejemplo los
diferentes botones, perillas e indicadores de un sólo instrumento). Existen dos aspectos del
proceso, a saber : la distribución básica de los componentes y el espacio entre ellos.
¾ Disposición de los componentes : La distribución de grupos de componentes puede
basarse en los principios de secuencia o de función. Allí donde existan secuencias
comunes o relaciones frecuentes en el uso de displays, controles u otros componentes,
la disposición debería hacerse de modo que se facilite el proceso secuencial de
movimiento (de las manos, de ojos, etc.). Cuando no existen secuencias comunes o
fijas, los componentes deben agruparse sobre la base de la función. En tales casos, los
diversos grupos deberían quedar claramente indicados mediante bandas, colores,
sombreados o de cualquier otro modo. Un ejemplo de tal agrupamiento se muestra en la
Figura 2-26.
Figura 2-26 : Ejemplo de controles y displays agrupados según su función, en el que los diferentes grupos
aparecen claramente indicados. (adaptada de [18])
¾ Espaciamiento de los instrumentos de control : La idea básica es la de reducir las
distancias entre los componentes, para aumentar la eficacia de las operaciones que se
realizan. Existe sin embargo un límite para la ubicación de los mismos, que está
establecido por el espacio mínimo que impide que se toquen otros controles cuando se
opera un determinado control. La ubicación debe basarse principalmente en la
combinación de factores antropométricos y en la precisión de los movimientos
requeridos para accionar el componente. Asimismo existen diversas tablas, que ofrecen
las distancias recomendadas entre instrumentos de control, para su aplicación en el
diseño de instrumentos y equipos que hagan uso de ellos.
51
Sección 2 : Desarrollo del proyecto
52
3. CAPÍTULO TRES : SISTEMA AMBIENTAL
Tal como se enunció previamente, para lograr las condiciones ambientales óptimas para el
preparado, básicamente hay que contemplar los siguientes subsistemas :
¾ Perfusión de solución fisiológica
¾ Control de la temperatura
¾ Perfusión de oxígeno
A continuación se describirá en detalle la manera en que fueron implementados cada uno
de ellos en este proyecto.
3.1 Perfusión de solución fisiológica
En el Laboratorio Bioelectricidad de la FI-UNER, donde se llevó a cabo la construcción
del sistema, el modelo animal con el que se trabaja es el conejo neocelandés. Para las
preparaciones de tejido cardíaco de estos animales, la solución de perfusión que se utiliza
es el Tyrode con buffer bicarbonato[20], cuya composición es la siguiente (en gramos por
litro y en milimoles por litro):
Sustancia
NaCl
KCl
CaCl2
MgSO4
NaHCO3
glucosa
gr/lt
8
0,2
0,2
0,2
1
1
[mMol]
135
2,7
1,7
1,6
5,95
5,5
El preparado es colocado en una cámara de acrílico. La cámara fue fabricada
especialmente para este desarrollo, y sus características principales se pueden ver en la
siguiente figura :
perforación para insertar
tuberías de entrada o salida
de solución
base rellena con elastómero
(espesor 2 mm)
acrílico transparente de 5
mm de espesor
50
22
33
Figura 3-1 : Esquema de la cámara fabricada para alojar el preparado. Medidas en mm.
53
Para proveer de solución a la cámara se utilizó un sistema de tuberías de PVC transparente,
que tienen un diámetro externo de 3,5 mm y un diámetro interno de 2 mm. Para realizar
distintas derivaciones e interrupciones del flujo se utilizaron llaves de tres vías tipo Luer,
las que fueron colocadas sobre un tablero de distribución. Estas llaves están constituidas
por un cuerpo de policarbonato, con vástagos de poliuretano y asas de HDPE (polietileno
de alta densidad)[21].
Figura 3-2 : Fotografía de dos modelos distintos de llaves de tres vías tipo Luer.
Se implementaron dos modos diferentes para la perfusión de la cámara:
¾ Perfusión por gravedad: en este modo se suministra continuamente solución fresca al
preparado. Para ello se cuenta con un reservorio colocado a un altura aproximada de
2,30 mts. que contiene la solución. El líquido circula entonces por gravedad. En parte de
su recorrido (próximo a su ingreso en la cámara) la tubería se encuentra sumergida
dentro de un baño termostatizado. Esto se realiza para elevar al nivel deseado la
temperatura del líquido (la justificación para su uso se discute más adelante, en este
mismo capítulo). Para que la cámara cuente con un nivel constante de líquido, se
descarta el excedente con un tubo de succión. Para proveer la succión en el tubo se
construyó un sistema auxiliar de vacío, que se describirá luego. El sistema permite
además el ingreso de agua destilada para el lavado de las tuberías.
¾ Recirculación: en determinadas ocasiones es necesario someter al preparado a
concentraciones conocidas de determinados agentes (drogas cardioactivas, sueros en
experimentación, fármacos, etc.). Por lo general resulta demasiado costoso preparar
grandes volúmenes de solución que contengan las concentraciones deseadas de los
agentes, para perfundir al preparado por gravedad. Por lo tanto se hace necesario
recurrir a este modo de perfusión, en el cual un volumen conocido de solución (con una
concentración predeterminada del agente) permanece circulando en un circuito cerrado.
La circulación continua se logra en este caso por medio de una bomba peristáltica de
rodillos y un sistema de tuberías de Tygon®. El Tygon® es un material termoplástico
transparente hecho en base a PVC, que posee propiedades elásticas aptas para este tipo
de sistema de bombeo. En el modo recirculación, la solución también es calentada antes
de su ingreso a la cámara.
mangueras de Tygon
perilla de variación
de la velocidad
cabezal de 6 rodillos
llave de encendido e
inversión de marcha
Figura 3-3 : Bomba peristáltica usada para la recirculación (MasterFlex-9440). Puede variarse la velocidad
en forma continua de 40 hasta 200 rpm, pudiendo bombear desde 0,08 hasta 46 ml/min. (extraída de [21])
54
El esquema funcional de este sistema completo de perfusión de solución se brinda en la
siguiente figura.
solución
posición de
la llave:
SOLUCIÖN
agua
posición de la llave:
POR GRAVEDAD
tablero de
distribución
baño termostatizado
posición de la llave:
CERRADO
cámara
desagote
bomba
peristáltica
tubo de
succión
preparado
Figura 3-4 : Sistema completo de perfusión de solución fisiológica. Se pueden apreciar los dos circuitos
posibles para realizar la perfusión : por gravedad, desde el reservorio, o mediante recirculación, con la
bomba. En el diagrama las llaves se encuentran en posición de circulación de solución por gravedad.
3.2 El control de la temperatura
3.2.1 Características del sistema
En el caso particular de este trabajo, el requisito que debe cumplir el control de
temperatura es mantener la temperatura de la solución en un margen muy estrecho: ±0.1oC
respecto de la temperatura preestablecida.
De las estrategias descriptas en el capítulo 2 (apartado 2.2.1.2), la más adecuada para la
aplicación del presente trabajo resultó ser la segunda: calentamiento indirecto de la
solución. Entre las razones para su elección se pueden citar su bajo costo y la posibilidad
de desarrollar los sistemas complementarios con relativa facilidad. El esquema del sistema
desarrollado puede verse en la Figura 3-5.
El líquido debe circular siempre por tuberías plásticas (PVC) para evitar su contaminación
con iones metálicos. Las tuberías que atraviesan el líquido del baño termostatizado se
colocaron a manera de “serpentina” atravesando un bloque de aluminio. El bloque, debido
a que posee una capacidad calorífica mayor que la del agua, actúa como un filtro pasabajo,
y de esta manera resulta poco sensible a variaciones bruscas de la temperatura del baño.
55
controlador
de
temperatura
solución de
perfusión
bloque de aluminio
preparado
sensor de T
fuente de
potencia
cámara
elemento calefactor
burbujeo para
agitación mecánica
Figura 3-5 : Esquema funcional del sistema de control de temperatura con todos sus componentes.
Una consideración importante en la implementación del sistema es evitar la pérdida de
calor en el trayecto que el líquido tiene que recorrer entre el baño y la cámara. Para ello
hay que situar el baño próximo a la cámara, pero aparece entonces el problema de la
interferencia electromagnética en el sistema de registro. Además, aunque el baño se
coloque lo suficientemente lejos, la solución circulante es conductora. Por lo tanto, el ruido
eléctrico que produzca el baño al encender la resistencia de calefacción se acoplará en
forma capacitiva y será sensado por el sistema de registro. Para solucionar este
inconveniente se decidió realizar la alimentación de potencia del elemento calefactor con
tensión continua.
El desarrollo del sistema se divide entonces en dos partes: el diseño de la fuente de
alimentación de potencia y el del controlador propiamente dicho. Se desarrolló además un
termómetro digital para indicar la temperatura de la cámara.
La fuente de alimentación de tensión continua debe poder suministrar la potencia necesaria
para calentar la cantidad de agua contenida en el baño. Para el volumen de agua que se
pretende calentar, los baños comerciales poseen una potencia del orden de los 500 W para
220 V de tensión alterna.
Se realizó rectificación de onda completa de la tensión alterna. Esto fue llevado a cabo
mediante un puente de diodos de 12A de corriente máxima.
Para cuantificar la proporción de tensión alterna superpuesta a la continua que se tiene en
la salida de una fuente de alimentación se utiliza el denominado factor de rizado o ripple.
Su valor es igual a la tensión eficaz de la ondulación residual dividido por el valor de
tensión continua. Para los fines de este trabajo, se considera en base a datos empíricos que
un factor de rizado del 1% resulta aceptable. Para obtener un factor de rizado igual al 1%
hay que calcular el valor del capacitor de acuerdo a la siguiente relación[22]:
C=
I
490 * V * r
Donde V e I son, respectivamente, la tensión y corriente continua a suministrar y r
representa el factor de rizado. Por lo tanto, para suministrar una potencia de 500 W se tiene
una tensión continua V = 220 V * 1,41= 311,12 V (recordar que hay que tomar el valor
máximo de la tensión de alimentación alterna, que es el valor al que se cargan los
capacitores) y una corriente I = P / V = 500 W/ 311,12 V = 1,6 A. De aquí :
56
C=
1,6
= 1049 µF
490 * 31112
, * 0.01
Resultó imposible encontrar capacitores en el mercado nacional que cumplan con el
requisito de capacidad 1000 µF y tensión de ruptura mayor a 300 V. Se hallaron
capacitores de valores adecuados de capacidad, pero la tensión máxima de los mismos era
a lo sumo de 250 V. Por lo tanto se replanteó el diseño de la fuente desde el punto de vista
de la tensión de suministro, la que fue reducida a 110 V. De esta forma, los nuevos valores
requeridos para los parámetros de la fuente resultan :
P
500W
500
=
=
= 3,21A
V 110V *1,41 155,5
3,21
C=
= 4212,8 µF
490 *155,5 * 0,01
I=
Por lo tanto la fuente fue diseñada para suministrar 150 V de tensión continua con una
corriente máxima de 3.2 A y el filtrado fue implementado con un capacitor electrolítico de
4700 µF, con tensión máxima de 250 V.
Interruptor principal
NA
D?
Fusible 5A
Fusible 3A
4700 uF
250 V
Vi = 110 V (ca)
Vo = 150 V (cc)
relé
Puente 12 A
(comando remoto)
Figura 3-6 : Circuito de la fuente de alimentación de corriente continua.
Las características adicionales que se consideraron fueron:
¾ Protección contra cortocircuitos: se implementó a través de dos fusibles (ver circuito).
El primero (5 A) se colocó para proteger al transformador de alimentación 220/110 V
ante posibles fallas en el circuito. El segundo (3 A) se colocó para proteger al circuito
de la fuente ante posibles cortocircuitos en la salida.
¾ Interruptor de comando remoto para conectar o desconectar la carga: esta etapa es
la encargada de activar o desactivar la alimentación de la carga cuando el controlador lo
requiera. Como se verá más adelante, el controlador produce una señal de control TTL,
que es igual a 0 V cuando se quiere apagar la fuente y 5 V cuando se la quiere encender.
Se implementó con un optotriac MOC 3011[23], conectado como indica la figura, que
activa la bobina de un relé encargado de conectar / desconectar la carga.
+5V
interruptor NA
110 V(ca)
330
MOC 3011
180
1N4001
2K4
10uF
Entrada
señal TTL (del
controlador de
temperatura)
OPTOTRIAC
0.1uF
RELE
TIC226
transformador
110 - 12V
Figura 3-7 : Circuito de comando remoto para activar/desactivar la fuente de alimentación.
57
3.2.3 Controlador de temperatura
Como se mencionó previamente, el controlador de temperatura debe ser capaz de mantener
la temperatura preestablecida del baño dentro de un rango de ±0.1ºC. En primer lugar se
implementó un controlador del tipo encendido-apagado. Se alcanzó el rango establecido
tomando las siguientes consideraciones :
¾ Se utilizó un sensor de temperatura con una constante de tiempo relativamente rápida
(1.4 segundos en agua agitada): el AD590 de Analog Devices[24]
¾ Se realizó un burbujeo de aire para agitar el líquido del baño. Esto logra homogeneizar
la temperatura del mismo más rápido y produce una transferencia más efectiva de la
energía calórica, ya que se pasa de convección simple a convección forzada.
¾ Se colocaron trozos de poliestireno expandido (Telgopor®) en la superficie del líquido
calefaccionado para evitar el intercambio de calor con el ambiente.
El esquema general del controlador es el siguiente :
Sensor
(1µA /oK)
100 mV/oC
Acondicionador de
señal
Visor numérico
de 3 ½ dígitos
Comparador
Salida TTL
(a la fuente de
alimentación)
Llave
selectora M
P
V ref
Figura 3-8 : Diagrama de bloques del controlador de temperatura. En la llave selectora M indica la posición
de medición del valor actual de temperatura y P la del valor de temperatura prestablecido para el baño.
El AD590 es un sensor de temperatura integrado, que produce una corriente de salida
proporcional a la temperatura absoluta (1 µA/oK). El siguiente circuito de
acondicionamiento fue implementado para obtener una salida de 100 mV/oC.
20 K
LM 136 - 5V
82 K
-VCC
4K7
10 K
+VCC
10 uF
-VCC
10 K
4 5
20 K
10 K
1 8
2
6
3
sensor
(remoto)
1uA/ K
CA3140
7
AD 590
+VCC
SALIDA
salida
100 mv/oC
(al comparador
y llave)
-VCC
Figura 3-9 : Circuito del controlador de temperatura : acondicionador de señal.
58
Un comparador, que posee una tensión de referencia en una de sus entradas y la salida del
circuito anterior en la otra, provee la señal de control para la fuente de potencia.
SALIDA TERMOMETRO
+5V
del acondicionador de
señal
7
1K
3
6
+VCC
2
CA3140
4 5
Vref
1 8
5K
multivueltas
-VCC
SALIDA
salida TTL :
(a la fuente de
alimentación)
comparador
Figura 3-10 : Circuito del controlador de temperatura : comparador y Vref.
De esta forma, cuando la tensión a la salida del circuito que mide la temperatura esté por
debajo del nivel de comparación, la salida del comparador será un nivel bajo (0 V), y
cuando esté por encima, la salida será un nivel alto (5 V). Esta señal se envía al circuito de
la fuente descripto en el apartado anterior.
Al circuito se le agregó un visor numérico de cristal de cuarzo líquido (LCD) de 3 y ½
dígitos, que indica la temperatura real del baño o la temperatura preestablecida para el
mismo, mediante una llave selectora.
3.2.4 Termómetro digital
Para medir la temperatura en la cámara experimental se construyó un termómetro digital.
Se utilizó el sensor AD590, y el circuito empleado para su implementación es exactamente
igual que el recién descripto para la etapa de medición de temperatura del controlador
(Figura 3-9, bloque acondicionador más el visor numérico). Para la visualización del valor
de temperatura se empleó un visor numérico LCD de 3 y ½ dígitos, que otorga al
instrumento una resolución de 0,1oC. El instrumento permite medir temperaturas en el
rango de 0 a 50oC, con una precisión de ± 0,1oC
3.3 Sistema de perfusión de oxígeno
Este sistema se utiliza para burbujear oxígeno dentro de la solución que baña los tejidos
celulares cuando se utiliza Tyrode con buffer HEPES como solución fisiológica. En el caso
de utilizarse Tyrode con buffer bicarbonato, hay que burbujear carbógeno (95% de O2 y
5% de CO2). Como se dijo anteriormente, en el Laboratorio se utiliza el Tyrode con Buffer
bicarbonato, por lo que el burbujeo se realiza con carbógeno.
El gas se suministra a partir de un cilindro a presión. La presión se reduce mediante un
reductor. También se tiene un flujímetro con válvula cónica para poder regular la salida del
gas de manera precisa.
La instalación se llevó a cabo utilizando tuberías de PVC de 5 mm de diámetro para la
sección principal y 3 mm de diámetro para las secciones secundarias. Al igual que en el
caso del sistema para la solución, se utilizaron llaves de tres vías tipo Luer, las que fueron
colocadas en un tablero para realizar las interrupciones o derivaciones necesarias. La línea
principal lleva el gas hasta el tablero de distribución, desde donde salen las dos ramas
59
secundarias: una para burbujear dentro del reservorio de solución y otro par burbujear
dentro de la cámara.
El esquema funcional del sistema completo de perfusión de gas se brinda en la Figura 3-11
conjuntamente con el resto de los sistemas de mantenimiento de las condiciones
ambientales.
3.4 Sistema auxiliar de vacío
El sistema de vacío se necesita para retirar el líquido sobrante de la cámara, ya que en el
modo de perfusión por gravedad la solución fresca está ingresando continuamente a la
misma. Para ello se coloca el extremo de un tubo por el que se realiza succión a una altura
correspondiente al nivel de líquido deseado. El vacío se realiza mediante una bomba
neumática dentro de un reservorio (trampa) en el que se recolecta el líquido que se retira de
la cámara. En este diseño, el aire a presión que sale por el otro extremo de la bomba se
aprovecha para realizar agitación del agua del baño termostatizado. En la Figura 3-11 se
puede ver la disposición en el sistema de los elementos recién descriptos.
3.5 Distribución de los distintos sistemas
A continuación se realiza un esquema funcional de los sistemas de perfusión para el
mantenimiento de las condiciones ambientales, donde se esquematiza cada uno de sus
componentes.
60
agua
solución
aire comprimido/vacío
carbógeno
solución
agua
tablero de
distribución
cámara
desagote
bomba
peristáltica
preparado
tubo de
carbógeno
bomba de
vacío
trampa de
agua
Figura 3-11 : Esquema completo del sistema de mantenimiento de las condiciones ambientales.
61
4. CAPÍTULO CUATRO : SISTEMA ÓPTICO
El sistema óptico empleado para la visualización de los preparados consiste en una lupa
binocular de disección y un sistema de iluminación, constituido por una lámpara halógena
y una fuente de alimentación de tensión continua. A continuación se describen las
características de cada uno de ellos.
4.1 Lupa binocular
Se utilizó una lupa binocular de disección de WPI, modelo PZM (Precision Stereo Zoom
Microscope)[29]. La misma posee las siguientes características :
¾ Oculares : de 10X y 20X
¾ Zoom : desde 0,7X hasta 4X
¾ Objetivo : 1X
¾ Rango de magnificación : 7X a 40X (ocular de 10X) - 14X a 80X (ocular de 20X)
¾ Distancia de trabajo : 90 mm.
¾ Campo de visión : 27,1 a 4,8 mm (ocular de 10X) - 15,7 a 2,8 mm (ocular de 20X)
La lupa se coloca sobre la superficie de trabajo de la mesa antivibratoria y se la utiliza para
controlar el procedimiento de aproximación del microelectrodo al preparado. No fue fijada
a la mesa, por lo que se la puede retirar cuando es necesario. En nuestro caso en particular,
la lupa también se utiliza para realizar la disección fina del preparado una vez que se
extrajo el corazón del animal, previamente al montaje final en la cámara.
Considerando el tamaño de los preparados (aproximadamente 5 a 10 mm de diámetro),
para una visualización adecuada resulto más conveniente el uso de los oculares de10X. En
la Figura 4-1 se muestra una fotografía de la lupa recién descripta, con detalles de los
movimientos que permite.
oculares
intercambiables
ajuste de la
distancia de
enfoque
ajuste del zoom
distancia de trabajo
ajuste de la
distancia de trabajo
y de rotación
respecto a la base
Figura 4-1 : Lupa binocular utilizada en la implementación de este trabajo. (extraída de [29])
62
4.2 Sistema de iluminación
El sistema de iluminación consiste de una lámpara halógena (dicroica) que se coloca
cercana a la cámara, y una fuente de iluminación de tensión continua, situada fuera de la
jaula de Faraday.
4.2.1 Lámpara
Se utilizó una lámpara dicroica de 12 V de tensión de alimentación y 50 W de potencia. Se
la colocó en un portalámparas que posee un brazo articulado, lo que permite el movimiento
del haz de luz producido hasta la posición deseada.
El portalámparas y el sistema articulado originalmente pertenecían a un modelo comercial
para lámparas de 220 V, por lo que fue necesario modificarlo para adaptarse a la lámpara
dicroica. En primer lugar se cambió el receptáculo de la lámpara, cambiándose por uno con
zócalo bi-pin. Adicionalmente se reemplazó el cable original, de 2x0,75 mm de sección,
por dos cables de 2 mm de sección con aislación especial para alta temperatura. Esto
último se realizó teniendo en cuenta que la lámpara necesita 50W/12 V=4,16 A de
corriente máxima.
Como se mencionó en el capítulo 2, el sistema de iluminación debe cumplir con el
requisito de no introducir ruido en el sistema de registro. Por lo tanto la fuente de
alimentación para la lámpara es de corriente continua.
El circuito implementado consiste en una fuente de alimentación regulada y variable.,
capaz de suministrar los 12V de tensión continua con una corriente de 5A. Permite variar
el valor de tensión para modificar el nivel de iluminación que recibe el preparado. El
circuito emplea un regulador ajustable de 5 A de corriente de trabajo, el LM338 de
National Semiconductor[25]. En la siguiente figura se esquematiza el circuito utilizado para
su construcción.
1N06
Interruptor
puente 10A
LM338
.1uF
+Vout
3
120
1uF
LAMPARA
1
220/18 V
Vin
ADJ
2
Alimentación 220 V (CA)
500
500
Figura 4-2 : Circuito de la fuente de alimentación de corriente continua empleada en el sistema de
iluminación.
Mediante el accionamiento del potenciómetro de 500Ω se puede ajustar el nivel de tensión
de salida, lo que hace variar la iluminación que incide sobre el preparado. El valor del
mismo y de la resistencia en serie fue calculada a partir de la siguiente relación :
⎛ R2 ⎞
Vo = 1,25 * ⎜
+ 1⎟
⎝ R1 ⎠
63
donde Vo es la tensión de salida de la fuente, R1 es igual a 120Ω y R2 es la suma del
potenciómetro más la resistencia en serie. En el nivel máximo (12V), la suma de las
resistencias debe ser igual a 1032 y en el nivel mínimo (6V), la suma debe valer 456. De
aquí la elección de 500Ω para el potenciómetro y 500Ω para la resistencia en serie. Esto
otorga un rango de 6,25 a 11,66 V, lo cual resulta aceptable.
De esta manera, la capacidad de ajustar el nivel de iluminación, sumado a la posibilidad
que ofrece la lámpara de poder moverse, permite lograr diferentes modalidades de
iluminación/contraste sobre el preparado.
64
5. CAPÍTULO CINCO : SISTEMA MECÁNICO
En este capítulo se describen todos los medios necesarios para posicionar de manera firme
y estable al microelectrodo, la cámara para alojar el preparado y sus sistemas auxiliares.
Como se mencionó en el apartado 2.2.3, los componentes principales de este sistema de
soporte lo constituyen la mesa antivibratoria y el micromanipulador. Además se cuenta con
un sistema estructural que se apoya sobre la superficie de la mesa antivibratoria y sirve
para mantener rígidamente unidos al micromanipulador, la cámara del preparado y sus
sistemas auxiliares.
5.1 Mesa antivibratoria
Se comentará en primer lugar la construcción de la superficie de trabajo y luego la
estructura de soporte, las que en conjunto constituyen la mesa antivibratoria. Los
fundamentos teóricos en que se basó el diseño, se discuten en el apéndice I.
5.1.1 Superficie de trabajo
El material escogido para la construcción de la superficie de trabajo fue el acero. De todos
los materiales disponibles, es el que mejor cumplió con el requisito de la relación
rigidez/masa y que a su vez resultó el más apropiado para implementar un sistema de
apoyo firme y sencillo para el micromanipulador. Tal sistema de apoyo está construido con
barras de acero y bases magnéticas, y será descripto en detalle más adelante, en el apartado
5.3.
La superficie de trabajo fue construida entonces a partir de una plancha de acero SAE
1020 de ¾ de pulgada de espesor (19,05 mm). La misma fue cortada en forma rectangular
de 700 mm de ancho por 450 mm de profundidad, tal que el peso resultó ser de unos 50
Kg. Fue cepillada en una de sus caras para proveer una superficie libre de imperfecciones y
así lograr un mejor agarre de las bases magnéticas. La cara inferior fue sometida a un
tratamiento anticorrosivo (líquido fosfatizante + convertidor de óxido), mientras que la
superficie de trabajo sólo fue limpiada con líquido fosfatizante. En aquellos lugares donde
no se efectúa la colocación de las bases magnéticas, se colocó un plástico autoadhesivo
(ConTact®) para proteger la superficie de la corrosión ante posibles salpicaduras.
5.1.2 Estructura de acoplamiento
La estructura de acoplamiento de la superficie de trabajo con el piso se compone de una
base pesada y aisladores neumáticos. La base está compuesta por dos patas de madera
rellenas con arena, sobre las cuales se apoya una losa de hormigón armado.
Los aisladores son tres cámaras de motocicleta infladas en forma parcial, que están
colocadas sobre la losa de hormigón. Fueron ubicadas de manera que soporten
uniformemente el peso de la superficie de acero. Además se colocó una tabla de madera
aglomerada entre la superficie de acero y las cámaras, para distribuir mejor el peso. Las
dimensiones son iguales en ancho y en largo que la losa de hormigón, pero con un espesor
de 10 mm.
Las patas están construidas en forma de “cajones” con madera terciada de 20 mm de
espesor y con una base ancha de madera dura de 25 mm de espesor. Se las llenó con arena
secada en horno a 120oC. Este procedimiento se realizó para eliminar la humedad y los
65
elementos orgánicos que pudieran con el tiempo deteriorar la madera. La losa de hormigón
apoya sobre la arena a través de dos tacos de madera de 120 x 320 x 200 mm. En la figura
5.1 se brinda información detallada acerca de la disposición física así como también de las
dimensiones de todos los componentes de la mesa antivibratoria.
Figura 5-1: Esquema de la mesa antivibratoria desarrollada, mostrando sus diferentes componentes. De
arriba hacia abajo se encuentran: superficie de acero, madera aglomerada, cámaras de motocicleta, losa de
hormigón armado, tacos de madera y patas llenas con arena. El dibujo se ha representado en una escala
aproximada. Medidas en mm.
5.2 Micromanipulador
Se utilizaron dos micromanipuladores : uno para el microelectrodo y otro para los
electrodos de estimulación. Ambos estaban disponibles en el Laboratorio antes de iniciar
este proyecto, por lo que no fue necesario adquirirlos.
66
Se consideró utilizar el de mejor calidad para posicionar el microelectrodo. El mismo es un
Narishige, modelo MM3[26], y se muestra en la figura 5.2. Posee las siguientes
características:
Rango de movimientos :
¾ eje X: 40mm ;
¾ eje Y: 20mm ;
¾ eje Z: 40 mm ;
¾ eje X (movimiento fino): 7mm
- graduación mínima: 10µm ;
- rotación completa del tambor 250µm.
Precio de catálogo: U$S 890.
soporte para el microelectrodo
control fino del eje X
control grueso del eje X
control del eje Y
Z
X
Y
control del eje Z
tornillo de ajuste
para sujeción
50mm
Figura 5-2 : Micromanipulador Narishige modelo MM3 empleado en la implementación de este trabajo. En
la figura se indican las funciones de cada control y también se representaron los ejes de referencia. (extraída
de [29])
Como se puede ver en la figura, el micromanipulador posee un orificio de 12 mm de
diámetro dentro del cual se inserta una varilla metálica. Tal varilla se ajusta con un tornillo
para poder sostener al micromanipulador desde el soporte. Como se verá en el apartado
siguiente, el soporte empleado en este caso es una base magnética.
Para el posicionamiento de los electrodos de estimulación se utilizó un micromanipulador
TAURUS de WPI[29], que posee las siguientes características :
Rango de movimientos :
¾ eje X: 35mm ;
¾ eje Y: 15mm ;
¾ eje Z: 25mm ;
¾ eje X (movimiento fino): 10 mm - graduación mínima: 10µm ;
Precio de catálogo : U$S 640
Cabe aclarar que este micromanipulador es constructivamente similar al descripto
anteriormente, por lo que no se consideró necesario incluir una fotografía del mismo.
5.3 Elementos de fijación
67
5.3.1 Bases magnéticas
Las bases magnéticas están destinadas a proveer un medio de anclaje firme entre el
micromanipulador y la estructura antivibratoria. Son dispositivos que poseen un poderoso
imán permanente, con un circuito magnético que se completa con la masa de la mesa
metálica. Si se cuenta con una superficie ferromagnética, resultan muy prácticas a la hora
de fijar los diferentes elementos. Es una ventaja importante por sobre otros sistemas de
anclaje que emplean roscas para su fijación. Estos sistemas poseen el inconveniente de
estar limitados para desplazarse sólo a posiciones fijas.
Estas bases poseen una varilla vertical de acero cromado y vienen provistas de un brazo,
también de acero cromado, que puede ajustarse a una variedad de posiciones, de acuerdo a
las necesidades particulares, como puede verse en la siguiente figura.
Figura 5-3 : Base magnética empleada para sostener las estructuras de registro. Las dimensiones de la base
son 48 x 48 x 60 mm, y su peso es de 1,8 kg. La varilla vertical es de 12 mm de diámetro y mide 168 mm de
largo. El brazo auxiliar es de igual longitud, pero posee un diámetro de 10 mm. La fuerza vertical de agarre
es de 80 kgf. El circuito magnético se activa-desactiva girando la perilla que se observa en el frente. (extraída
de [29]).
En el presente trabajo fueron empleadas cuatro de las bases recién descriptas para formar
la estructura rectangular de soporte. En el siguiente párrafo se describe su construcción.
5.3.2 Estructura metálica
Esta estructura fue fabricada en forma especial, utilizando barras metálicas de acero y
planchuelas varias de diferente calibre. Como se mencionó anteriormente, fue construida
para solidarizar la cámara (con el preparado) y el micromanipulador (con el
microelectrodo) a la superficie de trabajo de la mesa antivibratoria. De esta forma se busca
que las vibraciones que pudieran llegar a la superficie de trabajo no provoquen un
movimiento relativo entre la punta del microelectrodo y el tejido.
Se emplearon dos barras de acero de 12 mm de diámetro, a las cuales se les soldaron dos
planchuelas de 25 mm de ancho. Sobre las planchuelas se coloca la cámara con el
preparado. Para poder hacer foco con la lupa binocular sobre el fondo de la misma, las
planchuelas fueron dobladas, tal como se muestra en la
Figura 5-4.
68
lupa binocular
9 a 13 cm
barra de acero
(variable de
acuerdo al
enfoque)
8,5 cm
planchuela
cámara
3 cm
Figura 5-4 : Corte transversal de la estructura metálica para soporte de la cámara, mostrando sus
dimensiones laterales y la relación de altura con la lupa binocular
La siguiente figura muestra una vista en perspectiva de la estructura metálica junto con las
bases magnéticas.
barra de
acero
Figura 5-5: Esquema representando la disposición de la estructura metálica para el sostén de la cámara del
preparado y el micromanipulador. Medidas en mm.
La siguiente fotografía muestra la superficie de trabajo de la mesa antivibratoria, donde se
pueden observar algunos de los distintos componentes descriptos a lo largo de este
capítulo.
69
L
S
M
B
P
B
B
Figura 5-6 : Fotografía de la superficie de trabajo de la mesa antivibratoria. Se puede observar la ubicación
de los componentes descriptos a lo largo de este capítulo : P, soporte para el preparado; B, bases magnéticas;
M, micromanipulador; S, soporte del microelectrodo ; L, lámpara dicroica.
70
6. CAPÍTULO SEIS : SISTEMA PARA EL REGISTRO ANALÓGICO
DE LA SEÑAL
El sistema de registro completo de la señal puede dividirse en dos partes. Una parte
destinada al registro analógico de la señal, y otra al registro digital, que comprende la
digitalización y el almacenamiento de la misma. En este capítulo se describirá con mayor
detalle el conjunto de elementos necesarios para llevar a cabo el registro analógico de la
señal. Como se indicó previamente, este sistema de registro está constituido por un
microelectrodo, un amplificador de señal, un osciloscopio y un sistema de adquisición.
También se mencionarán en este capítulo, por encontrarse relacionados con el sistema de
registro, los medios destinados a eliminar las interferencias eléctricas y electromagnéticas.
El siguiente diagrama de bloques representa el sistema completo para el registro de la
señal.
estimulador
microelectrodo
PC
amplificador
placa
electrodos de
superficie
A/D
pre (x 1)
electrodo de
referencia
ganancia
cámara con el
preparado
filtro
monitor
osciloscopio
voltímetro
digital
SISTEMA DIGITAL
SISTEMA ANALÓGICO
Figura 6-1 : Diagrama en bloques del sistema de registro completo.
6.1 Microelectrodos
Para caracterizar los microelectrodos que se utilizaron en la implementación de este
trabajo, se puede decir que los mismos tenían resistencias que oscilaron en el rango de 5 a
10 MΩ, y que poseyeron una punta apropiada a los fines del registro. A continuación se
describen las características más importantes asociadas con la fabricación de los
microelectrodos utilizados, así como también la fabricación del electrodo indiferente.
6.1.1 El electrodo indiferente
El electrodo indiferente se implementó a través de un alambre de plata al cual se le dio una
forma particular (ver figura 6.2). Se trató de que el mismo no ocupe mucho espacio dentro
de la cámara y a la vez pueda tener un área considerable. Antes de colocarlo fue sometido
al proceso de clorurado mediante inmersión en una solución diluida (0,01M) de hipoclorito
de sodio.
71
terminal para conexión
eléctrica
alambre de plata clorurada
tornillo de fijación en la
pared de acrílico
cámara de acrílico
Figura 6-2 : Disposición física del electrodo de referencia dentro de la cámara de acrílico usada para alojar
al preparado.
6.1.2 Vidrio
Para la fabricación de los microelectrodos utilizados en el presente trabajo se usó el vidrio
tipo borosilicato con filamento (diámetro externo 1mm, diámetro interno 0,78 mm).
6.1.3 Estirador de micropipetas
El equipo empleado para fabricar los microelectrodos usados en este trabajo es el existente
en el Laboratorio de Bioelectricidad de la FI-UNER (marca Sutter, modelo P-97). El
mismo es un estirador horizontal de dos etapas : en una primera etapa, se aplica una fuerza
de tracción suave al tubo de vidrio mientras el mismo es calentado por un filamento
especial. En las segunda etapa, cuando se alcanza una elongación del tubo predeterminada,
se aplica una fuerza más fuerte que lo separa por la mitad, formando así dos micropipetas.
El tubo se coloca entre dos carros con mordazas que son traccionados simultáneamente por
cables de acero conectados al extremo de un solenoide, que es el que realiza la fuerza de
tracción cuando es activado eléctricamente. Este modelo particular de estirador,
denominado de Flaming y Brown por ser estos quienes lo desarrollaron[27], inyecta un jet
de aire durante el estiramiento para acelerar el proceso de enfriamiento del vidrio, y de esta
forma se pueden obtener puntas más cortas con diámetros pequeños. Otra característica
importante es el control de temperatura del filamento a través de la corriente controlada en
forma muy precisa. En la figura 6.3 puede verse un diagrama de los aspectos mecánicos
fundamentales del diseño de este estirador.
72
Figura 6-3 : Diagrama esquematizando los aspectos fundamentales del proceso de estiramiento de las
micropipetas en un estirador horizontal. (extraída de [27])
El modelo de estirador descripto posee un control por microprocesador de cada una de las
operaciones que realiza. Permite al usuario crear programas con los parámetros de
estiramiento particulares para cada caso[28]. Tales parámetros son :
¾ Cantidad de calor que se suministra al filamento (heat) : este parámetro controla el
nivel de corriente eléctrica entregada al filamento. La cantidad de calor requerida para
derretir el vidrio se basa en las características del filamento que posee el equipo y de
cada vidrio en particular. Para establecer el valor de este parámetro se debe ejecutar el
denominado “test de rampa” (ramp test). El test de rampa se debe ejecutar cada vez que
se cambie el filamento del equipo o se cambie el tipo de vidrio. Para ello se coloca el
tubo de vidrio en el equipo y se le solicita que inicie el test. El equipo suministra
corriente al filamento a una tasa constante de 650 mA/seg. A medida que el vidrio se
ablanda, las mordazas comienzan a separarse. Cuando las mismas alcanzan una
velocidad prefijada por el equipo, se interrumpe la tracción y se muestra en el visor el
valor del parámetro heat para esa combinación vidrio/filamento.
¾ Velocidad (velocity) : con este parámetro se controla el punto en que finaliza la primera
etapa de estiramiento. La velocidad del carro se incrementa cuando el vidrio se
comienza a ablandar y la etapa se detiene cuando se alcanza el valor de velocidad
prefijado. El valor de velocidad a especificar dependerá de la viscosidad y la
temperatura de ablandamiento del vidrio.
¾ Fuerza de estiramiento (pull) : este parámetro controla la fuerza de tracción que se
ejerce en la segunda etapa del estiramiento. Cuanto menor sea esta fuerza, menor será el
diámetro de la pipeta y más larga resultará la espina.
¾ Tiempo (time) : este parámetro controla el tiempo transcurrido entre las etapas de
estiramiento, durante la que se activa el enfriamiento por jet de aire.
¾ Presión de aire (pressure) : controla la presión del aire en la fase de enfriamiento
activa por jet.
En el caso particular de este trabajo, los parámetros para los vidrios que se utilizaron en la
fabricación de las micropipetas se detallan en la siguiente tabla . Cabe aclarar que ninguno
de los parámetros posee unidades, y que los valores se refieren a una escala relativa
73
establecida por el fabricante. Estos parámetros se ajustaron empíricamente de acuerdo con
las propiedades finales del microelectrodo, partiendo de valores iniciales sugeridos por el
fabricante del equipo.
Tabla 6-I: Parámetros que fueron determinados para el uso del estirador Sutter P-97 en la fabricación de
micropipetas para microelectrodos intracelulares.
Parámetro
tipo de
vidrio
Ramp test
Heat
Velocity
Pull
Time
Pressure
borosilicato
con
filamento
600
625
80
80
150
300
451
460
80
80
100
300
ID=0,58mm ;
OD=1mm
borosilicato
con
filamento
ID=0,78mm ;
OD=1 mm
Con el primero de los vidrios de la tabla, las resistencias oscilaron en un rango de 10 a 20
M, mientras que con el segundo se lograron resistencias menores (5 a 10 M).
6.1.4 Llenado
En el laboratorio se emplea el método de llenado que utiliza la fibra interna en el vidrio de
fabricación. Las pipetas se fabrican entonces con tubos de vidrio borosilicato con fibra de
vidrio interna y luego se las llena por el vástago con una jeringa que posee una aguja
especial ultrafina no metálica. Esta aguja (MicroFil de WPI[29]) posee una punta larga y
fina que permite comenzar el llenado muy cerca de la punta de pipeta, eliminando las
burbujas de aire y el atascamiento debido a partículas de polvo. La aguja esta construida
con una combinación de plástico y sílice. Poseen elasticidad y flexibilidad, aunque no son
irrompibles. El modelo con el que se cuenta en el laboratorio es la MicroFil MF34G, que
posee una longitud de 70 mm, 0.164 mm de diámetro externo, 0.1 mm de diámetro interno.
Figura 6-4 :Agujas para el llenado de las micropipetas (extraída de [29])
74
6.2 Circuito electrónico de registro
6.2.1 Preamplificador
6.2.1.1 Conexión física del microelectrodo
Para disminuir al máximo el valor de la capacitancia distribuida, se encapsuló al circuito
del preamplificador dentro de una pequeña caja de aluminio que se conoce comunmente
con el nombre de “cabezal”. El cabezal se coloca inmediatamente después del
microelectrodo, evitando así la presencia de un cable de conexión largo. Además, como se
describirá más adelante, la plaqueta donde se monta el circuito hace uso del principio de
guarda electrostática. La caja metálica del cabezal se encuentra conectada a tierra para
evitar la interferencia de campos eléctricos y magnéticos.
El microelectrodo se coloca en un adaptador especial (ver figura) denominado “holder”,
que se conecta directamente al cabezal[29]. Este adaptador esta construido de policarbonato.
Posee un orificio cilíndrico que primero se llena con solución electrolítica (KCl 3M) y
donde luego se inserta la micropipeta. La conexión eléctrica se establece a través de un
alambre de plata que se coloca en el interior de la micropipeta (como el que se muestra en
la figura) o bien a través de una bolilla o “pellet” de Ag/AgCl que se encuentra al final del
conducto cilíndrico. Tanto el alambre de plata como el pellet de Ag/AgCl se encuentran
conectados con un pin de 2 mm que se inserta en el cabezal. En la práctica se prefieren
aquellos que poseen pellet, ya brindan mayor estabilidad de voltaje.
alambre de plata clorurada
junta de goma
pin de 2mm
Figura 6-5 : Esquema del holder empleado para acoplar el microelectrodo al cabezal. La junta de goma sirve
para sujetar la pipeta, de modo que no se deslice cuando el holder se coloca en posición vertical o semivertical. (extraída de [29])
6.2.1.2 Descripción del circuito
Para la implementación del preamplificador se escogió el circuito integrado OPA129 de
Burr Brown[30]. Es un circuito integrado de corriente de bias ultra baja, que emplea la
tecnología Difet (Dielectrically Isolated FET), patentada por su fabricante. La disposición
particular de los pines de este circuito integrado (ver figura), permiten la implementación
de la guarda electrostática en la plaqueta de montaje, para evitar que las pérdidas a través
de las conexiones superen el valor de la corriente de bias.
75
Figura 6-6: Disposición del las patas de conexión del integrado OPA129.
El circuito del preamplificador se esquematiza en la figura 6.7 y a continuación se describe
su funcionamiento.
8
7
+15V
OPA129
3
entrada
6
salida
5
4
1
2
-15V
+15V
preset de
calibración
(1 nA)
1000M
reed switch
20K
multivueltas
Figura 6-7: Circuito del preamplificador
El circuito esquematizado representa sencillamente un seguidor de voltaje: la tensión a la
salida “sigue” a la tensión de entrada. Las características fundamentales están dadas por el
circuito integrado, el que otorga :
¾ corriente de bias : 100 fA
¾ impedancia de entrada : 1015 Ω
¾ rango dinámico : ±15V
¾ tensión de offset : ±0,5 mV (típico); ±2 mV (máximo)
¾ deriva de la tensión de offset : ±3 µV/oC (típico); ±10 µV/oC (máximo)
El preamplificador no posee corrección de offset ya que, como se verá más adelante, esta
operación se realiza en otra etapa del circuito electrónico.
La medición de la resistencia del microelectrodo, cuando el mismo se halla colocado en el
cabezal y sumergido en el baño, es un procedimiento útil para comprobar su estado. Por lo
general los equipos comerciales vienen con una llave en el panel frontal que permite
inyectar una corriente conocida a través del microelectrodo para medir su impedancia. Esta
corriente es comunmente de 1 nA, de forma de poder leer en el visor numérico 1mV por
cada MΩ de impedancia. Para lograr este objetivo se requiere de un conductor adicional en
el cable de conexión desde el aparato hasta el cabezal. Los cables disponibles en el
mercado local que poseen varios conductores internos resultan poco flexibles, lo que
implica que se puedan transmitir vibraciones hacia la punta del microelectrodo, lo que
resulta indeseable. Por lo tanto se optó por colocar el circuito de medición dentro del
cabezal para poder utilizar un cable más flexible. Tal circuito se esquematiza en la figura
76
6.7, y está compuesto por la resistencia de 1000 MΩ, el interruptor magnético (reed
switch) y el preset de calibración. Cuando se aproxima un imán al cabezal se cierra el
contacto del reed switch, lo que produce la inyección de una corriente de 1 nA a través del
microelectrodo y provoca un cambio en la salida de 1mV/MΩ. Esto puede lograrse incluso
teniendo el electrodo introducido dentro de la célula.
El conexionado en la plaqueta se realizó de acuerdo al siguiente esquema, para proveer una
guarda electrostática alrededor del terminal de entrada.
terminal de entrada
terminal de salida
guarda electrostática
Figura 6-8: Diagrama de la disposición de las pistas en la plaqueta donde se montó el circuito integrado
OPA 129 para el preamplificador.
6.2.2 Compensación de capacitancia
El circuito desarrollado en el presente trabajo no cuenta con compensación de capacidad
porque en principio está destinado al registro de potenciales de acción cardíacos, cuyo
curso temporal no posee componentes de alta frecuencia que puedan resultar afectados por
el tiempo de establecimiento de esta configuración. Si bien se podría haber implementado,
para realizar un diseño más versátil de aplicación al registro de potenciales de acción más
rápidos, esto no pudo ser posible. La causa fundamental es la misma que se discutió para el
medidor de resistencia del microelectrodo: la falta de cables en el mercado local que
tengan múltiples conductores y sean suficientemente flexibles.
6.2.3 Circuito amplificador
Esta parte del circuito está destinada a las siguientes funciones :
¾ Acondiciona la señal del preamplificador a los niveles requeridos por la siguiente etapa
(placa conversora A/D)
¾ Provee una corrección del voltaje de offset.
Debido a que la señal de entrada se encuentra, a lo sumo, dentro de los ±100 mV y se
desea aprovechar al máximo la resolución de la placa conversora, la ganancia fue fijada en
un valor de 20. De esta forma, las señales a la entrada de la placa conversora estarán en un
rango de ±2V, que, como se verá más adelante, se configuró para ±2,5 V.
La corrección de offset se implementó a través de un potenciómetro de 2K, con 10 vueltas
de recorrido mecánico. Esto es para proveer la suficiente resolución en el rango de voltaje
de offset que se pretende corregir, que es de ±200 mV.
En la siguiente figura se brinda el circuito empleado para implementar la etapa del
amplificador.
77
1 0 K (1 % )
p reset p ara aju ste
d e g anancia
10 K
12 K
-1 5 V
-1 5 V
4 1
5
4 1
1 0 K (1 % )
6
entrad a
d el cabezal)
5
2
1 K
2
3
6
3
7
aalid a X 2 0
T L081
7
T L081
+15V
68 K
+15V
68 K
+15V
-1 5 V
2 K (1 0 vu eltas)
lineal
co rrecció n d e o ffset (± 2 0 0 m V )
aalid a X 1
Figura 6-9 : Circuito amplificador y corrector de offset.
6.2.4 Filtro pasabajo
Esta parte del circuito fue diseñada teniendo en cuenta que se pueda registrar cualquier tipo
de potencial de acción cardíaco. Como las frecuencias de interés de la señal difieren según
la misma se trate de un potencial de acción auricular, sinusal o ventricular, debe poder
cambiarse la frecuencia de corte del filtro según se necesite. El sistema fue provisto
entonces de una llave selectora de tres puntos, cada uno de los cuales corresponde a
frecuencias de corte de 100, 500 y 1000 [Hz]. Las frecuencias de 100 y 500 pueden ser
usadas para las señales más lentas, como ser los potenciales de acción sinusales, mientras
que la frecuencia de 1000 puede ser usada para los potenciales auriculares y ventriculares.
Esta característica otorga cierta versatilidad al diseño, permitiéndole adaptarse fácilmente a
cada una de las situaciones de registro.
Dado que las características de la señal que se pretende estudiar están todas en el dominio
del tiempo, el tipo de filtro más adecuado para la implementación es un filtro Bessel. Los
mismos tienen una excelente respuesta al escalón (mínimo sobreimpulso) debido a que son
de fase lineal, y por lo tanto preservan todas las características temporales. Por otro lado,
con el fin de obtener una atenuación aceptable en la banda de rechazo, se determinó que el
filtro debía ser de orden cuatro.
Para su implementación se utilizó el circuito integrado UAF41 de Burr Brown[30], un filtro
activo universal que puede ser configurado como pasa bajo, pasa alto, pasa banda o
rechaza banda. Utiliza una arquitectura de variable de estado con un amplificador inversor
y dos integradores. Éstos últimos incluyen capacitores de 1000 pF integrados en la pastilla
con tolerancias del ±0.5%, lo que resuelve el problema de diseñar un filtro activo con un
margen ajustado de tolerancia y bajo costo. Existe un cuarto amplificador operacional que
puede ser utilizado para formar etapas adicionales o para filtros especiales tales como los
rechaza banda o Chebyshev inverso.
A continuación se muestra un esquema con la configuración interna del UAF41.
78
Figura 6-10: Diagrama interno del filtro activo universal UAF41. (extraída de [30])
El diseño de los filtros se realizó utilizando el programa FilterPro, suministrado por BurrBrown. Este es un programa especialmente diseñado para el cálculo de los valores de los
componentes necesarios para la realización de un filtro a partir de las especificaciones del
mismo. En general los filtros diseñados por este programa son implementados con
integrados en cascada. El programa automáticamente selecciona los integrados requeridos
y la configuración en que éstos deben ser dispuestos. Luego de ingresar los datos
requeridos por el programa, se calculan automáticamente los valores de las resistencias.
Además, si se necesitaran capacitores externos, el programa selecciona valores estándares
de los mismos y calcula los valores exactos de las resistencias para el filtro seleccionado.
También existe una opción para calcular el valor más cercano del componente al estándar
con un margen de no más del 1% de tolerancia. El programa muestra además un diagrama
en bloques con los integrados necesarios para implementar el filtro diseñado, con una
etiqueta que muestra la configuración y, en caso de que el orden del mismo sea mayor a
dos, el orden en que deben ser conectados los subcircuitos.
En las siguiente figura se muestra el circuito completo del filtro :
79
Del
amplificador
RG
RG
Entrada
50 K
RQ
88,7 K
50 K
12
3
2
4
8
14
VIN 1 BND PASS OUT
VIN 2
HI PASS OUT
VIN 3
LO PASS OUT
Q ADJ
AUX(-IN)
FREQ ADJ 1 AUX(+IN)
FREQ ADJ 2 AUXOUT
7
13
1
5
4
6
12
3
2
4
8
14
RQ
88,7 K
UAF41
VIN 1 BND PASS OUT
VIN 2
HI PASS OUT
VIN 3
LO PASS OUT
Q ADJ
AUX(-IN)
FREQ ADJ 1 AUX(+IN)
FREQ ADJ 2 AUXOUT
7
13
1
5
4
6
A la placa
conversora
Salida
UAF41
100K
200K
1M
100K
200K
1M
110K
221K
1,1M
110K
221K
1,1M
Llave selectora: 3
posiciones - 4 salidas
Figura 6-11: Diagrama del circuito empleado para implementar el filtro pasa bajo con frecuencia de corte
seleccionable. De acuerdo al dibujo, la posición inferior de la llave selectora configura el circuito para
fc=100 Hz, la intermedia para fc=500 Hz y la superior para fc=1000 Hz.
80
6.2.5 Estimulador
Para llevar cabo la estimulación de los preparados se utilizó un estimulador facilitado por
la Cátedra de Fisiología y Biofísica de la FI-UNER, marca GALIX, modelo MA-7[31]. Se
trata de un estimulador transesofágico portátil para uso en electrofisiología clínica. La
mayoría de las prestaciones que presenta el aparato exceden las necesidades de este
sistema, pero debido a que el aparato estaba disponible, se decidió utilizarlo en el sistema,
evitando así incurrir en la compra o en la construcción de uno nuevo. Las características
que posee el instrumento y son destacables para este sistema son :
• Frecuencia programable de 30 a 180 ppm (pulsos por minuto), en pasos de 5 ppm.
• Amplitud de pulso de 0,5mA a 25mA, en pasos de 0,5mA.
• Ancho de pulso de 2ms a 25ms, en pasos de 0,5ms.
La estimulación es extracelular: se provee a través de un par de electrodos de superficie de
Ag/AgCl (ver Figura 6-12). Los electrodos son dos alambres de Ag aislados entre sí por
tubitos de vidrio. En el extremo están doblados para no lastimar los preparados y poseen
una capa de AgCl, depositada por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio 0,01
M. Ambos electrodos se conectan mediante conductores trenzados al estimulador, en una
bornera de conexión provista por el aparato. Uno de los electrodos se conecta al terminal
positivo del estimulador y el otro al terminal negativo. Los dos extremos de los electrodos
están separados por una distancia de 1 a 2mm, para crear un campo de estimulación
localizado durante la inyección de corriente.
cable bipolar
blindado
bornera para
conexión
cable trenzado
electrodos de
superficie
estimulador
alambres de Ag
con la punta
clorurada
Figura 6-12 : Esquema del sistema de estimulación.
6.2.6 Eliminación de interferencias
Para la eliminación de interferencias provenientes de campos eléctricos se construyó una
jaula de Faraday, con caños estructurales de 2x2 cm y una malla metálica de alambre
(Figura 6-13). Fue provista de cuatro patas de 87 cm de altura, las que se fijaron al piso
mediante tornillos. La misma fue conectada a una bornera de tierra común conectada a una
jabalina. En la bornera de tierra común fueron conectados además todos los instrumentos
electrónicos del sistema de registro, la superficie metálica de la mesa antivibratoria, la
lupa, las bases magnéticas y el baño termostatizado.
81
120 cm
92 cm
60 cm
Figura 6-13 : Fotografía mostrando las dimensiones y la ubicación física de la jaula de Faraday construida
6.2.7 Voltímetro digital
El voltímetro está destinado a la salida del valor medio del potencial registrado por el
microelectrodo. En este diseño sirve además para visualizar el valor de la resistencia del
microelectrodo (a razón de 1mV/MΩ) cuando se cierra el interruptor magnético del
cabezal. Para su construcción se utilizaron módulos de fuera de uso existentes en el
laboratorio. El mismo está compuesto por un circuito conversor A/D ICL7016, que maneja
un visor numérico de cristal cuarzo líquido (LCD) de 3 ½ dígitos. Permite así la
visualización de potenciales de membrana de ±199.9 mV y resistencias de microelectrodo
de hasta 199.9 MΩ.
6.2.8 Osciloscopio
El osciloscopio usado es un instrumento que estaba disponible en el Laboratorio antes de
comenzar el proyecto y que satisface los requerimientos del sistema. Por esta razón no fue
necesario adquirirlo. Se trata de un osciloscopio digital Hitachi, modelo VC-6041(Z). La
característica más importante para esta aplicación es que tiene capacidad de
almacenamiento de hasta 4K por canal, lo que permite en el modo ROLL la observación de
eventos de baja frecuencia como son las señales de los potenciales de acción. Las restantes
características pueden hallarse en la referencia [32].
6.2.9 Comparación de las características del amplificador con modelos
comerciales
A fin de poder comparar las características del amplificador desarrollado con las de los
modelos comerciales, a continuación se brinda una tabla donde se detalla el valor de los
parámetros más representativos de cada uno.
82
Tabla 6-II : Características de algunos modelos comerciales de amplificadores para registro intracelular. En
la última columna se detalla el diseño del presente trabajo para poder realizar la comparación.
WPI
WPI
Warner
Instruments
FHC
Xcell-3
[34]
Intracel
[14]
Diseño de
este trabajo
Electro
705[29]
Duo-773
(715P) [29]
resistencia
de entrada
1012 Ω
1015 Ω
>1011 Ω
1012 Ω
1011 Ω
1015 Ω
corriente de
bias
10 pA
10 fA
ajustable a
cero
4 pA
-
100 fA
ganancia de
voltaje
x1
x1
x 1 ó x 10
seleccionable
x 10
rango de
voltaje máx.
±5 V
±15 V
-
±1 V
-
±15V
nivel de
ruido
500 µV p-p[a]
<50 µV pp[b]
500 µV p-p[a]
-
-
500µV p-p[b]
ancho de
banda del
circuito
limitador
filtro LP (1,
sin filtro
filtros: LP
sin filtro
filtro LP: 1 a
10 kHz)
incorporado (.1, 1, 10, 50,
incorporado
30 kHz
100, 1000
variable en
Hz) ; HP
forma
(50, 100,
continua
500, 1K, 2K,
10K, 15K)
VF -180
IE-251[33]
x 1 ó x 10
x 1 ó x 20
seleccionable seleccionable
filtro LP
(100, 500,
1000 Hz)
tiempo de
establecimiento
(10-90%)
15 µs
25 µs[c]
10 µs[c]
-
20 µs[d]
500 µs[e]
compensación de
capacidad
0 a 50 pF
0 a -10 pF
0 a 50 pF
10 a 100 pF
0 a 33 pF
no posee
corriente de
prueba del
µE
1 nA
1 pA ó 1 nA
seleccionable
1 nA
onda
cuadrdada. 1
kHz/1mV
1 nA
1 nA
ajuste del
voltaje de
offset
±300 mV
±300 mV
±200 mV
±2 V
-
±200mV
visor
numérico
no posee
LED 3 ½
dígitos
no posee
no posee
LCD 3 ½
dígitos
LCD 3 ½
dígitos
U$S 1073.(catálogo)
U$S 4563.(catálogo)
-
-
-
ver cap. 9
precio
a
Con la entrada conectada a masa a través de un resistencia de 20 M.
b
Con entrada conectada a masa
c
A través de una resistencia de entrada de 20 M y con compensación de capacidad.
d
A través de una resistencia de entrada de 10 M y con compensación de capacidad.
e
A través de un resistencia de 10 M.
83
Como puede verse, muchas de las características del amplificador diseñado y desarrollado
en este trabajo son similares y hasta superan las de los modelos comerciales. La excepción
es el tiempo de establecimiento, parámetro que tiene un valor elevado, por la falta de
compensación de capacidad en el amplificador.
84
7. CAPÍTULO SIETE : SISTEMA DE ADQUISICIÓN DIGITAL DE
LA SEÑAL
7.1.1 Características del hardware
Como se mencionó previamente, el hardware esta compuesto por la PC y por la placa
conversora A/D. En primer lugar se describirán cuáles son las características que se
evaluaron para la elección de la PC y posteriormente para la elección de la placa
conversora.
7.1.1.1 Computadora personal (PC)
Las PC más difundidas actualmente en nuestro país son las IBM compatibles, operando
bajo el sistema operativo Windows 95 de Microsoft. La gran mayoría de los programas
utilitarios que se utilizan en el laboratorio trabajan bajo Windows 95. La elección de este
sistema operativo, establece de cierta forma los requisitos mínimos indispensables para la
PC. Windows 95 requiere para su correcto funcionamiento el siguiente hardware :
Tabla 7-I: Requisitos mínimos e ideales de la PC para el sistema operativo Windows 95.
Sistema mínimo
Sistema óptimo
AT- 486
Pentium
486 - 40MHz
Pentium 133 MHz (o
mayor)
Memoria
16 MB
32 MB (o más)
Disco rígido
200 MB
1 GB (o más)
VGA
SVGA
Placa madre (motherboard)
Procesador
Placa de video / monitor
Entonces, en principio, mediante la configuración óptima quedaron determinados los
requisitos para la PC. Esto es debido a que la diferencia de precio hoy en día no es
significativa, no justificándose comprar un equipo de menor performance. Los puntos
adicionales que se consideraron fueron:
◊ Capacidad de almacenamiento en forma permanente : Por cada día de
experimentación se almacenan en promedio entre 30 y 40 archivos de datos con los
registros de los potenciales de acción. Como se verá más adelante, en el apartado
dedicado al software, los datos se guardan en archivos en formato de texto. Si se
considera que los registros duran en promedio un minuto y se establece un frecuencia de
muestreo de 1 kHz (1000 muestras por segundo), cada archivo contiene 60000 datos.
Como cada dato (en formato real) ocupa 10 bytes de memoria, un archivo tipo ocupará
60000 datos x 10 bytes/dato = 600000 bytes ≈ 585 KB. Por lo tanto se necesitan 30
archivos x 585 KB/archivo = 17,5 MB por día de experimento. Afortunadamente este
tipo de archivos puede comprimirse hasta un 80% de su tamaño, con lo que quedan
finalmente unos 3,5 MB por día. Igualmente esto representa mucho espacio y los discos
rígidos tienen una capacidad limitada. Se hace necesario entonces implementar un
sistema de almacenamiento en forma permanente con gran capacidad y que sea más
versátil que un disco rígido. Como mínimo, para cumplir con este requisito, se podrían
85
utilizar diskettes de 3 ½” (1.44 MB). El problema es que con el tiempo se incrementa
progresivamente la cantidad de diskettes acumulados, los que a su vez pueden llegar a
dañarse, con la consecuente pérdida de los datos. La solución más conveniente hoy en
día sería agregar una lectora/grabadora de CD-ROM. Además de encontrarse muy
difundido el uso de los CD, por lo que resulta conveniente poseer una unidad lectora,
estos discos pueden almacenar hasta 650 MB cada uno y son prácticamente inalterables
con el tiempo.
◊ Salida en papel: El sistema debe contar con una impresora para permitir la salida en
forma gráfica de los registros. Además, se pretende que la PC pueda servir para utilizar
otros programas que utilizan la impresora, por lo que la presencia de la misma es
indispensable. Mínimamente la PC debe contar con una impresora a chorro de tinta o a
inyección de burbujas, blanco y negro. Idealmente, podría ser a color.
Dado que en el Laboratorio se disponía de una PC antes de comenzar con este proyecto, no
fue necesario llevar a cabo la adquisición de la misma. Esta PC cuenta con las siguientes
características :
- Placa madre 486 - DX2
- Procesador Intel 486 - 66 MHz
- 16 MB de memoria RAM
- Disco rígido : 1 GB
- Placa de vídeo VGA
- Monitor VGA color
- Unidad de diskettes de 3 ½”
- Impresora Cannon BJ-100, a inyección de burbujas, blanco y negro.
- Mouse
- Teclado español, 101 teclas
El sistema operativo que originalmente tenía la PC era DOS 6.0, y utilizaba también
Windows 3.11. Se decidió entonces comprar el software Windows 95, ya que fue instalado
en esta PC y en otra que se utiliza en el Laboratorio de Bioelectricidad, para el sistema de
registro mediante “patch-clamp”.
Para el almacenamiento de los datos provenientes de los experimentos utiliza actualmente
(en forma provisoria) el disco rígido, pero se prevé para el futuro la adquisición de una
unidad lectora/grabadora de CD, por los criterios anteriormente expuestos.
7.1.1.2 Placa conversora A/D
Evaluando las características de la señal con la que se está trabajando, se pueden definir los
requisitos de la placa conversora para el sistema de adquisición :
◊ Número de entradas analógicas : este no es un requisito limitante, dado el sistema
actualmente sólo necesita de una entrada analógica, para digitalizar la señal del
potencial de acción proveniente del amplificador. Se puede prever para el futuro el
agregado de otro canal, que podría tomar por ejemplo la señal proveniente de otro
microelectrodo y la derivada analógica de cada uno de los canales. Igualmente la
mayoría de las placas no tienen inconvenientes en proveer 16 canales de entrada de
86
terminación simple (u 8 diferenciales), lo cual resulta bastante holgado para esta
aplicación.
◊ Frecuencia de muestreo : el ancho de banda máximo que puede tener la señal, de
acuerdo a la frecuencia de corte del filtro implementado en el amplificador, es de 1
KHz. Considerando el uso simultáneo de hasta cuatro canales y aplicando el criterio
práctico de muestrear a 4 veces la máxima frecuencia contenida en la señal, se tiene que
la placa debe tener como mínimo una frecuencia de muestreo de 16 KHz.
◊ Resolución y rango: Una resolución de 12 bits resulta suficiente, ya que en este caso se
tiene (400 mV de rango de señal/ 212 niveles posibles) = 97,6 µV ≈ 0,1 mV de
resolución en la señal del potencial de acción. Esto permite discriminar variaciones muy
pequeñas, en el orden del 0.025% del rango completo. La señal que se tiene a la salida
del amplificador está en el rango de ±2 V, por lo que una placa que posea ±2,5 V de
rango es suficiente.
◊ Ganancia : No es necesario proveer amplificación desde la placa de adquisición, por lo
que una placa con ganancia x1 es suficiente para esta aplicación.
◊ Linealidad, precisión relativa y offset : valores aceptables para estos parámetros, para la
aplicación que se está desarrollando son : no linealidad ±0,5 LSB ; precisión relativa
±0,5 LSB ; offset ±1 LSB. De esta forma se está asegurando no superar el error que
siempre se comete al realizar la conversión, que es de ±1 LSB.
◊ Salidas analógicas : por el momento no se necesitan, por lo que no se considerará esta
especificación.
◊ Entrada y salida digital (D-I/O): por el momento no se necesitan, por lo que no se
consideraron sus especificaciones.
◊ Temporización : Los circuitos de temporización por el momento no se necesitan, por lo
que no se consideraron sus especificaciones.
◊ Control de Acceso Directo a Memoria (DMA): En el caso de este trabajo, dado que se
pretende que la PC realice la adquisición de las señales sólo en determinados intervalos
de tiempo, durante los cuales no se realiza ninguna otra tarea que requiera la atención
exclusiva del microprocesador, el uso de DMA no es un factor importante a tener en
cuenta.
◊ Software: Como se mencionó previamente, la elección del software es un factor
determinante en la decisión sobre la compra de una determinada placa. Evaluando entre
comprar un paquete de software listo para usar y desarrollarlo mediante un lenguaje de
programación a la medida de las necesidades del proyecto, se decidió esta última
opción. Entre los posibles lenguajes que podían ser usados para la programación del
sistema de adquisición, se decidió elegir el LabVIEW, de National Instruments. Las
razones fundamentales fueron que es un software de programación específico para el
desarrollo de herramientas de adquisición y procesamiento, viene con bibliotecas de
subprogramas que aceleran y facilitan el desarrollo de los programas y, finalmente, se
encuentra disponible en la Facultad. Más adelante, en la sección dedicada al software se
brindarán más detalles acerca del LabVIEW.
Debido a la elección del software, la elección de las placas conversoras quedó restringida a
aquellas que puedan ser controladas mediante los manejadores (drivers) del LabVIEW. Las
placas que se evaluaron antes de decidir la compra fueron :
87
- Digidata 1200, de Axon Instruments : Se pensó en esta placa dado que en el sistema para
registro mediante “patch-clamp” ya se cuenta con una y ha otorgado excelentes resultados.
Brinda la posibilidad de ser usada tanto con programas específicos de adquisición y
procesamiento de señales electrofisiológicas y como con programas de desarrollo
propio[35]. Como principales desventajas se tiene que posee un costo elevado (U$S 3100),
hay que realizar los trámites de importación para comprarla y que los drivers de LabVIEW
para manejarla son de una versión más actual (v3.1) del programa que la versión existente
en la facultad (v3.0).
- Placas de National Instruments36: estas placas pueden ser manejadas sin inconvenientes
por los programas generados en el LabVIEW, por ser ambos del mismo fabricante. De
todas las placas evaluadas se decidió la compra de la PC-LPM 16 PnP ya que satisface los
requisitos planteados en el principio de este apartado. Se la adquirió al representante de
National Instruments en Argentina. A continuación se dan las características de la misma :
• 16 canales de entrada monopolares (8 en modo diferencial)
• Resolución de 12 bits
• Frecuencia de muestreo de 50 KHz
• Rangos de ±10V, ±5V y ±2,5V.
• Calibración por software (no hay que configurar ningún interruptor en la placa)
• Entrada/salida digital a través de dos líneas TTL de 8 bits.
• Dos contadores-temporizadores de 16 bits de resolución y frecuencia máxima de trabajo
de 8MHz.
• Linealidad : ±1 LSB como máximo
• Precision relativa : ±1 LSB típico, ±1,5 LSB como máximo
• Error de offset : ±1 LSB típico, ±2 LSB como máximo
• Costo : $400.
7.1.2 Características del software :
En este apartado se discutirán las características del software de adquisición, ya que como
se dijo anteriormente, el sistema operativo escogido es el Windows 95. Como también se
mencionó previamente, para el desarrollo de el programa de adquisición se utilizó el
software LabVIEW de National Instruments.
7.1.2.1 Descripción del LabVIEW
La mayoría de los lenguajes de programación utilizados en el desarrollo de un programa de
aplicación necesitan que las sentencias sean introducidas en forma de texto (el denominado
“código fuente”). Por esta razón se los denomina lenguajes de programación basados en
texto. En cambio, en el LabVIEW los programas se desarrollan construyendo diagramas de
bloque. Debido a esto se lo denomina lenguaje de programación gráfico[37].
El LabVIEW posee bibliotecas de funciones y subrutinas para la mayoría de las tareas de
programación, adquisición de datos, control de instrumentación, análisis y almacenamiento
de datos.
88
Los programas realizados con el LabVIEW se denominan Instrumentos Virtuales (VI’s)
debido a la similitud que poseen con los instrumentos del mundo real. Los VI’s poseen tres
características fundamentales :
1. Tienen una interfaz interactiva para el usuario llamada “panel frontal”. El panel frontal
contiene botones, perillas, visores digitales y otros controles e indicadores. Se pueden
ingresar o modificar parámetros a través del mouse o del teclado, y observar los
resultados en la pantalla de la PC.
2. Reciben las instrucciones del código fuente equivalente o “diagrama de bloques”.
3. Son jerárquicos y modulares, esto es, pueden usarse como programas principales o
como subprogramas de otros VI’s (sub-VI’s). LabVIEW emplea así el concepto de
programación modular, ya que se puede dividir una aplicación compleja en una serie de
tareas simples, que pueden ser ejecutadas en forma separada. Los subprogramas
generados pueden servir además para la construcción de distintos programas.
7.1.2.2 Estrategias y técnicas de adquisición con LabVIEW
En LabVIEW existen tres niveles de VI’s para realizar adquisición de datos: los de nivel
básico (easy I/O), intermedio (intermediate) y avanzado (advanced). Los últimos son más
flexibles y poderosos, y constituyen los bloques fundamentales para todos los otros subVI’s de adquisición. Los VI’s más básicos permiten programar muy rápidamente, pero
cuentan con muchos parámetros establecidos por defecto que los vuelven poco flexibles[38].
Para la adquisición de datos, se definen tres formas de hacerlo mediante LabVIEW :
¾ Adquisición Inmediata, sin uso de memoria intermedia (inmediate non-buffered): en
esta forma de adquisición se realiza la lectura de la(s) entrada(s) de la placa a intervalos
de tiempo preestablecidos por el programa. Es útil para la adquisición de cantidades
prefijadas de datos, lo que se conoce como un “scan” de un canal o grupo de canales.
¾ Adquisición Temporizada, sin uso de memoria intermedia (hardware timed nonbuffered): en esta otra forma, el contador presente en la placa establece los intervalos de
tiempo entre lecturas, por lo que la temporización es más precisa que en el modo
anterior ya que el contador es independiente del microprocesador de la PC. Esta forma
de adquisición es útil sólo para frecuencias de muestreo bajas (<1KHz).
¾ Adquisición Temporizada, usando memoria intermedia (timed buffered): Si se necesita
temporización precisa y a la vez una frecuencia de conversión alta, se utiliza este modo
de adquisición, donde el LabVIEW transfiere los datos a intervalos temporizados desde
la placa a un bloque de memoria intermedia (buffer). Este buffer puede ser simple (para
adquirir una cantidad de datos prefijados) o circular (para el caso de una adquisición
continua). En el primer caso se pueden leer los datos una vez que el programa haya
terminado la adquisición, o bien leer porciones menores mientras la adquisición está en
progreso. En el segundo caso habrá que cuidar de que no se llene el buffer más rápido
de lo que el programa puede retirar los datos del mismo.
7.1.2.3 Descripción del programa de adquisición
De las tres estrategias enunciadas en el apartado anterior se decidió utilizar la última :
adquisición temporizada usando memoria intermedia. Para su implementación se utilizó un
VI de nivel intermedio, obtenido de la biblioteca de subrutinas del LabVIEW. El VI es el
denominado AI-Continuous Scan (AI-CS). Este VI realiza adquisición en forma continua
de un canal o grupo de canales, almacena los datos en un buffer circular y entrega una
89
cantidad predeterminada de datos desde este buffer cada vez que se lo requiere. Es
particularmente apropiado para esta aplicación ya que se necesita la adquisición en forma
continua de la señal, para ser almacenada sólo en intervalos en que las condiciones del
experimento lo requieran.
A continuación se realiza un diagrama de flujo donde se puede seguir la lógica de las
operaciones realizadas por el programa de adquisición. Una descripción mas detallada del
programa de adquisición se brinda en el apéndice II.
90
inicio
se configura la placa de
adquisición
se llama al sub-VI AI-CS, que
llena un bloque de memoria
(buffer) con los datos
solicitados que envía la placa
ocurrió algún
error ?
si
se vacía el buffer
intermedio
se muestra un
mensaje de error
en pantalla
FIN
si
se enciende el led
DETENER en
pantalla
se vacía el buffer
intermedio
FIN
no
se transfieren los datos
del buffer a un vector
se dividen todos los
valores por 20 para
corregir el factor de
escala
se pulsó
DETENER ?
no
los datos se grafican en
pantalla
se enciende el led VER
en pantalla
se pulsó
GRABAR ?
si
se enciende el led
GRABAR en pantalla
no
se pulsó
EVENTO ?
no
se envían los datos al
archivo
si
se enciende el led
EVENTO en pantalla
se introduce un
comentario al archivo
Figura 7-1 : Diagrama de flujo del programa de adquisición implementado en LabVIEW.
Durante la ejecución del programa, el procedimiento que debe seguir el usuario para grabar
los datos es el siguiente (ver Figura 7-2):
1) Introducir el nombre para el archivo donde serán almacenados los datos, en la casilla
rotulada en el panel frontal GUARDAR COMO.
91
2) Pulsar el botón GRABAR. El botón funciona como interruptor si/no : cuando se quiere
detener la grabación simplemente hay que volver a pulsarlo para llevarlo a su estado
inicial.
Los datos se almacenan en archivos con formato de texto. En este tipo de archivos los
datos se ordenan en forma de tabla de resultados (en inglés spreadsheet). En esta tabla las
columnas están separadas por tabuladores y las filas separados por saltos de línea[39]. Para
llevar a cabo esta función, el programa desarrollado utiliza un VI obtenido de la biblioteca
de subrutinas del LabVIEW, el denominado Write to Spreadsheet File-VI. Cada vez que
se lo llama dentro del programa, este VI realiza los siguientes pasos :
1) Crea o abre el archivo indicado por el usuario. Si el archivo no existe, se crea uno con el
nombre indicado por el usuario. Si en cambio el archivo ya existe, los nuevos datos se
agregan a continuación de los que ya están guardados.
2) Ingresa los datos en el archivo en formato de texto.
3) Cierra el archivo.
Como ya se ha mencionado, para el almacenamiento de los datos se eligió el formato de
texto. Este formato permite la lectura de los archivos desde la mayoría de las aplicaciones
utilizadas para procesamiento y análisis estadístico, en particular por el STATISTICA
(StatSoft®) y el Microcal Origin (Microcal Software Inc.®), utilizados en el Laboratorio
donde se desarrolló este proyecto.
92
1
8
2
3
4
5
6
7
1. led indicador de que el programa está en modo visualización
2. botón y led indicador de grabación
3. botón y led indicador de detención del programa
4. ventana para ingresar el nombre del archivo donde almacenar los datos
5. marcador de eventos, led indicador y ventana para ingresar comentario
6. indicador de la frecuencia cardíaca promedio
7. indicador de la frecuencia de muestreo real
8. indicador gráfico de los potenciales de acción en pantalla.
Figura 7-2 : Panel frontal del VI, donde pueden observarse los distintos controles e indicadores disponibles
para el usuario
93
8. CAPÍTULO OCHO : DISEÑO DEL ESPACIO DE TRABAJO
Tal como se mencionó en el apartado 2.3.2, en este tipo de sistemas para registro lo ideal
es que el operario trabaje sentado. En base a esta premisa se establecieron los lineamientos
generales para el diseño de superficies de trabajo para personal sentado. Además se
mencionaron criterios para la distribución general y específica de los diversos
componentes dentro del sistema. En este capítulo se describe cómo fueron tenidas en
cuenta las consideraciones de la superficie de trabajo y del espacio físico en la
construcción del sistema.
8.1 Ubicación física
El sistema fue instalado en un ambiente de aproximadamente 9 x 3 mts, destinado en forma
compartida al Laboratorio de Bioinstrumentación y a la Cátedra de Bioingeniería II. Ocupa
un área aproximada de 2 x 2 metros, dentro de dicho ambiente. La es una fotografía en la
que se puede observar la ubicación física de los componentes del sistema.
2
1
3
Figura 8-1 : Fotografía que muestra la disposición física de los distintos componentes del sistema. 1) sector
donde se ubica el preparado y se realizan las maniobras de inserción del microelectrodo bajo la lupa; 2)
sector destinado a los elementos de los sistemas de perfusión y gaseado; 3) sector destinada a la
instrumentación electrónica.
Si se toma como referencia al operario sentado de frente a su puesto de trabajo, los
distintos elementos del sistema se pueden agrupar en tres sectores diferentes :
1. De frente: la cámara para el preparado en su sistema de soporte, el sistema de
visualización (la lupa con su sistema de iluminación), el estimulador y los
micromanipuladores.
2. A la izquierda : los elementos y controles que forman parte del sistema de perfusión de
solución fisiológica y de perfusión de oxígeno (el reservorio para la solución, la bomba
peristáltica, un tablero con las llaves de tres vías y el baño termostatizado) El tubo de
oxígeno fue instalado fuera de este sector, en un lugar tal que no interrumpiera el paso,
94
no corra riesgo de voltearse accidentalmente y pueda ser retirado con facilidad para su
recambio.
3. A la derecha: todos los controles e instrumentos electrónicos, los que fueron colocados
en una repisa o “rack” sobre un escritorio: el osciloscopio, el amplificador, el control de
temperatura, el control de iluminación, la fuente de alimentación de ±15V, el
termómetro de la cámara. Encima del mismo escritorio se instaló la PC.
8.2 Superficie de trabajo
Existen dos lugares dentro del área de trabajo del sistema que por sus características
pueden considerarse como superficies de trabajo para el operario. Estas son la superficie
de trabajo de la mesa antivibratoria y la superficie de trabajo del escritorio donde se coloca
la PC y demás equipos. A continuación se considerarán cada una de ellas.
8.2.1 Mesa antivibratoria
8.2.1.1 Área
Se consideró el área normal propuesta por Barnes, (Figura 2-23) en la que se tiene una
superficie rectangular de 119,4 x 39,4 cm. La elección se debe a que las tareas que se
realizan arriba de la mesa antivibratoria están restringidas a un espacio limitado, donde el
operario sólo trabaja sobre la cámara con el preparado o con el micromanipulador. Por esta
razón, la superficie de trabajo de la mesa antivibratoria fue diseñada con 110 cm de ancho
y 50 cm de profundidad.
8.2.1.2 Altura
De acuerdo a lo establecido en el apartado 2.3.3.3, se considera que la superficie de trabajo
para personal sentado trabajando en un área de laboratorio, debe estar entre 86,4 y 96,5
cm. Como las tareas que se realizan sobre la mesa requieren de precisión manual, se trató
de fijar un valor para la altura que estuviera próximo al máximo del rango. Además, esto
mejora las características de las patas de la mesa antivibratoria, ya que al ser más altas
pueden llenarse con más arena y ser más pesadas. De esta forma se tiene una mesa con una
altura final de 94,5 cm. En la Figura 8-2 pueden observarse las dimensiones que establecen
la altura de la mesa. Para que operarios con distintas características antropométricas
puedan adecuarse a la superficie de trabajo fue menester colocar una silla con altura
regulable.
95
20
10
60
50
80
700
945
25
Figura 8-2 : Vista frontal de la mesa antivibratoria. La zona sombreada indica el contenido de arena en las
patas. Medidas en mm. (escala 1:100)
8.2.2 Escritorio
8.2.2.1 Área
El área considerada para la superficie del escritorio fue tal que pudieran entrar el rack para
los instrumentos y la PC. El rack fue construido con un ancho estándar de 19 pulgadas
(48,26 cm) y un largo de 50 cm. La longitud fue establecida considerando el equipo de
mayor dimensión en esa dirección, que es el osciloscopio. Como el ancho aproximado del
monitor de la PC es de 40 cm, y se previó dejar lugar para el mouse, el ancho de la
superficie del escritorio se fijó en 1,10 m. Para calcular la longitud de dicha superficie se
consideró el espacio ocupado por el monitor (40 cm), el teclado delante de él (17 cm) y un
espacio para apoyar las muñecas cuando se utiliza el teclado (5 a 10 cm). Por lo tanto se
estableció una profundidad igual a 70 cm. En la Figura 8-3 se observa un diagrama del
escritorio construido, donde están delineadas las áreas para el rack y los distintos
componentes de la PC.
8.2.2.2 Altura
La altura de al superficie del escritorio es de 78 cm, acorde al valor máximo establecido en
el apartado 2.3.3.3. En el rack para los instrumentos las alturas pueden ser ajustables,
pudiéndose ubicar cada uno de ellos al nivel deseado, como se verá más adelante. En la
Figura 8-3 se observa un diagrama del escritorio construido, donde se indica la altura de la
superficie de trabajo.
96
1100
1
2
480
400
130
700
500
400
3
4
450
140
170
780
435
500
5
400
200
r=55
Figura 8-3 : Esquema del escritorio mostrando tanto las áreas como las alturas de la superficie de trabajo.
Las áreas corresponden al rack (1), y los componentes de la PC: el monitor (2), el mouse (3), el teclado (4) y
el gabinete que contiene la unidad central de procesamiento o CPU (5). Medidas en milímetros...
8.2.3 Espacio físico y distribución
Para la distribución de los distintos componentes del sistema dentro del espacio físico se
hizo uso de dos de los principios guías enunciados anteriormente : para la distribución
general de los componentes se utilizaron los principios de importancia y funcional; para la
distribución específica se utilizó sólo el principio funcional.
Los elementos del sistema fueron agrupados en principio de acuerdo a su función.
Nuevamente, si se considera al operario sentado de frente a la mesa antivibratoria, se
tienen agrupadas a su alrededor las siguientes funciones :
Sistema de perfusión de solución fisiológica y burbujeo de oxigeno : ubicado a su
izquierda. Los reservorios para la perfusión por gravedad fueron colocados en un estante
de 30 x 43 cm ubicado a 1,80 m de altura. Más abajo, contra la pared, está el tablero de
distribución de solución y de oxígeno. Un estante con las mismas dimensiones que el
anterior, ubicado a 1,20 m de altura, sirve para apoyar la bomba peristáltica utilizada en el
sistema de recirculación. El baño termostatizado por donde pasan las tuberías para ser
calentadas se encuentra sobre la superficie de la mesa antivibratoria.
Sistema electrónico : ubicado a la derecha (ver Figura 8-4). Como se mencionó
anteriormente, todo el instrumental electrónico, ya sea de visualización, de registro o de
control, fue colocado sobre el escritorio, en el rack.
97
Figura 8-4 : Fotografía mostrando la ubicación de los instrumentos, a la derecha del operario. Se han
dibujado flechas para indicar las líneas de visión. La flecha del centro representa la línea horizontal de
visión, tomada como referencia (0o). Hacia abajo la línea de visión normal (-15o) y hacia arriba la línea de
visión secundaria (+15-20o).
Dentro del rack los elementos fueron distribuidos de acuerdo al principio de frecuencia de
uso :
• En la línea de visión normal, preferida para los displays visuales críticos, se ubico el
osciloscopio. Este instrumento se observa casi de manera continua para controlar el
estado del registro. Esto implica, por ejemplo, cuidar que no se ha salido el
microelectrodo, observar que el preparado está siendo estimulado, etc.
• En la línea horizontal de visión, área preferida para controles primarios, se ubicó al
amplificador. El control de offset y el indicador digital del voltaje de membrana que
posee este instrumento se utilizan en forma frecuente durante el experimento.
• Más arriba, unos 15o por encima de la línea horizontal de visión, en el área destinada a
controles secundarios, se ubicaron la fuente de alimentación regulable para el sistema
de iluminación y el control de temperatura. El control de temperatura se fija al
comienzo del experimento en una temperatura deseada y por lo general no se vuelve a
tocar. La fuente de alimentación se utiliza muy poco, en ocasiones que es necesario
disminuir el nivel de iluminación. Por ejemplo, para evitar el deslumbramiento cuando
se quiere hacer una penetración muy precisa.
• En el último de los estantes del rack, en el área máxima de superficie para los controles
secundarios, fueron ubicados un termómetro digital que indica la temperatura de la
cámara con el preparado, y una fuente de alimentación de ±15 V utilizada para el
amplificador y dicho termómetro.
En la Figura 8-5 se ha representado una vista frontal del escritorio y el rack, donde se
puede observar la ubicación de los elementos recién descriptos.
98
fuente de
alimentación
±15 V
fuente de
alimentación
del sist. de
iluminación
termómetro
digital
control de
temperatura
osciloscopio
amplificador
monitor (PC)
teclado (PC)
impresora (PC)
CPU (PC)
mouse (PC)
Figura 8-5 : Vista anterior del escritorio y el rack con los instrumentos, ubicados cada uno en su sitio.
8.2.3.2 Situación específica de los componentes
En este apartado se describen las consideraciones utilizadas en la disposición específica de
los componentes de cada elemento desarrollado. A continuación se describirán sólo
aquellos elementos en los cuales se prestó especial cuidado en la ubicación de los
componentes, en los que fue aplicado el principio de agrupamiento funcional.
¾ Tablero de distribución de solución y gas :
En este tablero, se manejan los flujos de solución de perfusión y de gas (carbógeno u
oxígeno), a partir del accionamiento apropiado de llaves de tres vías. En la Figura 8-6 se
esquematiza la vista anterior del tablero y el estante de apoyo de la bomba de
recirculación. Se puede observar cómo están agrupadas las llaves de acuerdo al sistema al
que pertenecen (de gas o de solución).
99
Figura 8-6 : Vista anterior del tablero de distribución de solución y gas, y del estante de apoyo de la bomba
recirculadora. En el sector izquierdo se agrupan los controles de gas : 1) llave de control del burbujeo de gas
en el reservorio de perfusión de solución por gravedad ; 2) llave de control del burbujeo de gas en la cámara
del preparado. En el sector derecho se agrupan los controles de solución : 3) llave que permite la selección de
envío de agua o solución por gravedad hacia la cámara ; 4) llave para abrir/cerrar el desagote ; 5) llave de
selección del modo de perfusión entre circulación por gravedad, recirculación o circulación cerrada.
¾ Amplificador :
En este instrumento, los diversos controles, indicadores y fichas disponibles para el
usuario, se distribuyeron de acuerdo a su función.
Cabe aclarar que se utilizó un gabinete metálico de 19” de ancho, donde el lugar disponible
en el panel frontal del mismo resultó más grande de lo necesario para la cantidad de
controles y fichas colocadas. Sin embargo se dejó un espacio suficiente como para
implementar en el futuro un segundo canal de registro completo.
En la Figura 8-7 se tienen, de izquierda a derecha e identificados por recuadros de color
más claro, los siguientes grupos :
1. Sección de encendido y borne de puesta a tierra del chassis del equipo.
2. Sector de entrada/salida del amplificador, donde se tiene la entrada a través de un
conector DIN de 3 pines, la salida sin amplificar (x1) a través de un conector BNC y la
perilla de corrección de offset.
3. Sector destinado al filtro, donde se tiene la llave selectora de frecuencia de corte y la
salida filtrada y amplificada x20 a través de un conector BNC.
4. Sector del indicador (voltímetro)
100
1
2
3
4
Figura 8-7 : Aspecto del panel frontal del amplificador desarrollado. 1) Sección de encendido y borne de
puesta a tierra ; 2) Sector de entrada/salida del amplificador ; 3) Sector destinado al filtro ; 4) Sector del
voltímetro digital.
101
Sección 3 : Pruebas del sistema
102
9. CAPÍTULO NUEVE : PRUEBAS DE BANCO
En este capítulo se desarrollarán los resultados obtenidos en las pruebas de banco del
sistema desarrollado en el presente proyecto. A continuación se describen las pruebas
realizadas a los subsistemas para el control de la temperatura, el control de las vibraciones
y la electrónica de registro.
9.1 Control de temperatura
Para evaluar el desempeño del sistema de control de temperatura se analizará la variación
en la temperatura de la cámara en las condiciones de funcionamiento habituales, esto es, en
circulación por gravedad y en recirculación.
9.1.1 Prueba en circulación por gravedad
En esta prueba, en condiciones iniciales, el agua del baño termostatizado se hallaba a una
temperatura de 25,3oC. El reservorio para la circulación por gravedad contenía agua
destilada, la cual estaba una temperatura de 25,2oC. Se analizará la repuesta del baño y de
la cámara ante un escalón de 4,7oC en el valor preestablecido de la temperatura en el
controlador, lo cual se logró prefijando en el mismo una temperatura de 30oC para el baño.
La siguiente figura muestra la repuesta del baño y de la cámara ante la mencionada
maniobra.
31
30
temperatura ( oC)
29
28
27
26
25
24
0
5
10
15
20
25
30
35
tiempo (min)
Figura 9-1 : Respuesta ante un escalón de temperatura del sistema a) temperatura del baño (gráfica superior,
trazo negro) ; b) temperatura de la cámara (gráfica inferior, trazo azul).
En la gráfica se puede observar cómo difieren las dinámicas de cada subsistema. El baño
responde al escalón como un sistema de segundo orden subamortiguado, con un máximo
sobreimpulso producido aproximadamente a los ocho minutos y un error en estado
103
estacionario de ±0,1oC. Esto es razonable, ya que este tipo de controles tienen siempre un
error en estado estacionario distinto de cero que oscila alrededor el valor de consigna. Este
error se trató de minimizar en el diseño del sistema.
Lo más notable es la respuesta de la cámara ante el estímulo producido por la respuesta del
baño (en este caso no se puede hablar de un respuesta al escalón). Esta respuesta es
característica de un sistema de segundo orden sobreamortiguado. Puede observarse que en
este caso el error en estado estacionario respecto de la temperatura prestablecida es
prácticamente constante (o no es posible de detectar una variación del mismo con la
resolución del termómetro utilizado). Se ha verificado en forma empírica que este error es
siempre del orden de -2oC, dependiendo de la temperatura ambiente y de la velocidad de
perfusión, y se produce debido a que la transferencia de calor entre el agua del baño y el
agua que está circulando por las tuberías sumergidas en el mismo no tiene un 100% de
eficiencia. La pequeña variación de temperatura observada a los 18 minutos se debe
probablemente a la respuesta al sobreimpulso del baño, retardada por un tiempo muerto.
9.1.2 Prueba en recirculación
Se parte de las condiciones del punto anterior, donde la temperatura del baño
termostatizado es de 30 ± 0,1oC y la de la cámara 27,9oC. Se accionan las llaves
correspondientes en el tablero de control y se enciende la bomba. La velocidad de la
misma se fija en aproximadamente 120 r.p.m. y se observa el comportamiento de la
temperatura de la cámara, el que se muestra en la siguiente figura. Al igual que la Figura 91, se representó en la gráfica de arriba el valor de temperatura del baño y en la de abajo la
temperatura de la cámara.
31,0
30,5
temperatura ( oC)
30,0
29,5
29,0
2
1
28,5
28,0
27,5
27,0
0
5
10
15
20
25
30
35
tiempo (min)
Figura 9-2 : Comportamiento de la temperatura de la cámara en condiciones de recirculación. La flecha 1
indica el accionamiento de la bomba en 120 rpm. La flecha 2 indica el reajuste de velocidad a 140 rpm.
En principio, cuando se establecen las condiciones de recirculación (flecha 1 en la Figura
9-2), existe un pequeño descenso de la temperatura en la cámara debido a que las
104
mangueras de la bomba estaban vacías y debían purgarse. Luego, la temperatura alcanzada
en la cámara es 0,2oC superior a la que tenía antes de la recirculación. Esto es debido a que
la velocidad con la que se está recirculando es inferior a la velocidad con la que se estaba
circulando por gravedad, con lo que el agua permanece en el baño termostatizado por más
tiempo durante el cual puede elevar su temperatura. La flecha 2 en la Figura 9-2 indica el
punto en el que la velocidad se aumenta hasta 140 rpm, con la cual se alcanza la
temperatura que tenía la cámara inicialmente.
En las condiciones normales de trabajo hay que cuidar de tener la bomba ya purgada y de
tener la velocidad establecida en el valor adecuado (aprox. 140 rpm). De esta manera se
trata de minimizar la variación de las condiciones que tiene la cámara en el estado previo a
la recirculación.
9.2 Sistema mecánico
El sistema mecánico, constituido por la mesa antivibratoria y los sistemas de soporte del
preparado y el micromanipulador, fueron ensayados mediante pruebas relativamente
sencillas. El ensayo de estructuras mecánicas antivibratorias requiere de complejos
equipamientos, capaces de producir una entrada adecuada y medir la respuesta producida
en la estructura. Por ejemplo, para obtener la curva de transmisibilidad habría que mover el
piso con una fuerza de variación sinusoidal, con la que se realiza un barrido de frecuencias
y se mide el desplazamiento de la superficie de trabajo.
Para medir en forma práctica el desempeño de la estructura construida, se recurre al
siguiente ensayo : Se coloca un preparado biológico en la cámara y se registra el potencial
de reposo. En estas condiciones normales de medición el sistema mecánico se excita con
un “impulso”. Este impulso se provoca arrojando un peso de 70kg desde una altura de 10
cm. en el suelo, 15 cm por delante y en el centro de las patas de la mesa antivibratoria. Las
mediciones se realizan con la estructura en condiciones normales (superficie desacoplada
del suelo a través de las cámaras de aire) y con la estructura acoplada al suelo (colocando
tacos de madera en reemplazo de las cámaras). A continuación se muestran los resultados
obtenidos en cada caso, registrados de la pantalla del programa de adquisición.
105
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
potencial (V)
0,00
-0,01
-0,02
-0,03
-0,04
-0,05
-0,06
-0,07
-0,08
-0,09
-0,10
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
tiempo (seg)
Figura 9-3 : Respuesta de la estructura en estado normal (desacoplado) ante la excitación descripta en el
párrafo. El microelectrodo (R=22MΩ) está insertado en el interior de una célula, la que no presenta
potenciales de acción por estar el estimulador apagado. La flecha indica el instante en el que se arroja el
peso. No existe ningún efecto perceptible sobre el registro.
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
potencial (V)
0,00
-0,01
-0,02
-0,03
-0,04
-0,05
-0,06
-0,07
-0,08
-0,09
-0,10
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
tiempo (seg)
Figura 9-4 : Respuesta de la estructura, cuando se encuentra acoplada la superficie al suelo, ante la
excitación descripta en el párrafo. Las demás condiciones son idénticas a las de la figura anterior. La flecha
indica el instante en el que se arroja el peso. Puede verse el efecto sobre el potencial de reposo.
106
A continuación se muestran los efectos indeseables de la vibración mecánica, producidos
sobre el registro de los potenciales de acción por el movimiento de la superficie de trabajo.
En el primer caso (Figura 9-5) se muestra la rotura del microelectrodo durante la
realización de un registro de potenciales de acción sinusales. Esta situación resulta
sumamente indeseable, ya que hay que recambiar el microelectrodo y buscar otro sitio de
inserción, lo que representa una pérdida de tiempo considerable. El segundo caso ()
representa el “desempalamiento” de una célula durante un registro de potenciales de acción
auriculares. No se llega a la rotura del microelectrodo pero el registro debe interrumpirse
hasta reacomodar el mismo.
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
potencial (V)
0,00
-0,01
-0,02
-0,03
-0,04
-0,05
-0,06
-0,07
-0,08
-0,09
-0,10
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
tiempo (seg)
Figura 9-5 : Rotura del microelectrodo producida por la vibración mecánica del la superficie. Puede
observarse que en el momento de producirse la interferencia (indicado por la flecha) se interrumpe el registro
y el potencial tiende bruscamente a cero por la rotura de la punta del electrodo.
107
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
potencial (V)
0,00
-0,01
-0,02
-0,03
-0,04
-0,05
-0,06
-0,07
-0,08
-0,09
-0,10
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500 0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
0,700
0,800
0,900
1,000
tiempo (seg)
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
potencial (V)
0,00
-0,01
-0,02
-0,03
-0,04
-0,05
-0,06
-0,07
-0,08
-0,09
-0,10
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
tiempo (seg)
Figura 9-6 : Pantallas sucesivas mostrando una secuencia de “desempalamiento”, producida por la vibración
mecánica del la superficie. En el momento de producirse la interferencia (indicado por la flecha) el registro
cambia : el potencial se hace más positivo y los potenciales de acción disminuyen de amplitud. Este registro
debe descartarse.
9.3 Sistema electrónico de registro
108
En este apartado se describen las pruebas realizadas al circuito amplificador. En primer
lugar se analizan las características de microelectrodos fabricados con diferentes
parámetros, para determinar las condiciones óptimas de registro. Luego se analizan las
características relativas al ruido presente en los registros.
9.3.1 Microelectrodos
Como se mencionó en el apartado 6.1.3, el estirador de micropipetas posee una variedad de
parámetros ajustables, los que se usan para determinar las propiedades de los
microelectrodos fabricados (en especial su resistencia eléctrica y la forma de la punta).
Hasta encontrar el valor aceptable para estos parámetros se realizaron varias pruebas, las
que a su vez produjeron microelectrodos con valores diferentes de resistencia mecánica y
eléctrica. Las propiedades mecánicas pueden deducirse a partir del valor de resistencia,
teniendo en cuenta que electrodos con puntas más finas y flexibles tienen resistencias
mayores que los que poseen puntas mas cortas y rígidas. En las siguientes figuras se
muestran tres registros llevados a cabo con microelectrodos de diferente forma y
resistencia. En las gráficas, el valor de resistencia puede determinarse midiendo la altura
del pulso producido por la inyección de la corriente de prueba, a razón de 1 mV/MΩ.
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
potencial (V)
0,00
-0,01
-0,02
-0,03
-0,04
-0,05
-0,06
-0,07
-0,08
-0,09
-0,10
0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000
tiempo (seg)
Figura 9-7 : Medición de la resistencia de un microelectrodo de aproximadamente 47 MΩ.
109
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
potencial (V)
0,00
-0,01
-0,02
-0,03
-0,04
-0,05
-0,06
-0,07
-0,08
-0,09
-0,10
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
tiempo (seg)
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
potencial (V)
0,00
-0,01
-0,02
-0,03
-0,04
-0,05
-0,06
-0,07
-0,08
-0,09
-0,10
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
tiempo (seg)
Como puede observarse, el ruido presente en el registro es proporcional a la resistencia del
microelectrodo empleado. A partir de las propiedades observadas en estos microelectrodos
(y en otros que produjeron resultados no mostrados aquí), tales como el nivel de ruido
presente en el registro y sus propiedades mecánicas, se determinaron los parámetros de
fabricación que se muestran en la tabla Tabla 6-I.
110
9.3.2 Amplificador y sistema de eliminación de interferencias
En este punto se evalúan las características de ruido presente en el sistema de registro para
diferentes condiciones experimentales. Los registros fueron obtenidos con microelectrodos
de 5 MΩ sumergidos en la cámara sin la presencia del preparado. En la Figura 9-10 se
observa la pantalla normal de registro con tres condiciones diferentes de ruido presente en
el sistema .
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
potencial (V)
0,00
-0,01
-0,02
-0,03
-0,04
-0,05
-0,06
-0,07
-0,08
-0,09
-0,10
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500 0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
tiempo (seg)
Figura 9-10 : Observación cualitativa del nivel de ruido presente en el sistema. De arriba hacia abajo: 1)
iluminación y baño termostatizado apagados, 2) iluminación encendida y baño apagado y 3) ambos
encendidos. El trazo superior y el inferior presentan un offset para poder comparar los registros entre sí
La siguiente figura es un detalle ampliado de la misma situación representada en la Figura
9-10.
111
0,02
0,01
0,00
-0,01
-0,02
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
tiempo (seg)
Figura 9-11 : Vista ampliada de los niveles de ruido presentes en el sistema en las mismas condiciones que
la figura anterior : trazo negro - iluminación y baño termostatizado apagados, trazo rojo - iluminación
encendida y baño apagado y trazo azul - ambos encendidos. Obsérvese que en el peor de los casos el ruido
llega a tener un valor de 1mV pico a pico.
Se puede concluir que el ruido introducido en el peor de los casos no representa una
interferencia significativa sobre los registros, aunque idealmente el ruido a la salida
debería ser menor a la resolución de la placa de adquisición que en este caso es de 0,1 mV.
112
10. CAPÍTULO DIEZ : VERIFICACIÓN DEL SISTEMA MEDIANTE
UN EXPERIMENTO “IN VITRO”
10.1 Uso del sistema completo
Finalmente se detalla el desarrollo de un día de experimentación, donde se muestran los
registros obtenidos en el transcurso del mismo
Para realizar una evaluación del sistema completo se describirá su utilización a lo largo de
un día de experimentación y luego se mostrarán los registros obtenidos.
10.1.1 Preparación del experimento
Para comenzar se realiza el accionamiento de la llave principal de alimentación de energía
eléctrica. Luego se procede al encendido de todos los equipos: PC, osciloscopio, control de
temperatura, amplificador, termómetro digital y bomba de vacío, accionando las llaves
correspondientes. También se fija el valor de temperatura deseado para el baño
termostatizado en el panel del control de temperatura..
Se comienza a circular agua destilada para lavado por el sistema de tuberías y a través de
la cámara. Para tal fin, se acciona una llave de tres vías del tablero destinado al control de
la perfusión de líquido y gas, llevándola a la posición “lavado”.
El sistema permanece en este estado por aproximadamente una hora, mientras alcanza su
estado de régimen. Mientras tanto se preparan 4 litros de solución de Tyrode para la
perfusión, para lo cual se pesan las sales correspondientes (ver apartado 3.1) y se realiza la
dilución en agua destilada. También se aprovecha para estirar el vidrio para fabricar varios
microelectrodos (unos 10 ó 16).
Una vez preparada la solución, se controla el pH para ajustarlo, si es necesario, a un valor
entre 7,3 y 7,4. Se coloca el frasco de solución en el estante superior del sitio destinado a la
perfusión de líquido y gas. Se cambia la llave de tres vías del tablero a la posición “por
gravedad” y con esto se da comienzo a la circulación de solución a través de la cámara. Se
acciona además las llaves del tablero que dan comienzo al burbujeo del oxígeno en el
reservorio y en la cámara.
Luego se lleva a cabo la disección del tejido del animal de experimentación. Para la
realización del experimento se utilizan conejos neocelandeses de aproximadamente 30 días
de edad. Se suministra un anestésico (pentobarbital sódico) en una dosis de 70 mg/kg de
peso del animal, en forma intraperitoneal. Se inyecta además heparina, como
anticoagulante, a razón de una unidad por gramo de peso. Luego de 10 a 15 minutos,
cuando se produce la anestesia profunda, se toracotomiza el animal y se le extrae el
corazón. Bajo lupa, se realiza la disección de los tejidos de interés. Esta operación la
realiza sentado y trabajando sobre una mesada cercana al set-up. Una vez finalizada la
disección, se lleva el tejido hasta la cámara que ya tiene la solución circulando a
temperatura controlada. Se coloca el tejido en la cámara y se lo fija mediante agujas de
entomología para evitar una excesiva contracción mecánica. Si el tejido no presenta
automatismo, habrá que encender el estimulador y para comenzar la estimulación. Hay que
verificar que el tejido efectivamente se esté estimulando, de lo contrario el preparado se
deteriora y puede fracasar el experimento.
113
A continuación se espera aproximadamente una hora para que el tejido se adecue a las
condiciones experimentales de la cámara. A partir de ese momento se puede comenzar con
los registros, que se describen en el siguiente apartado.
10.1.2 Realización de los registros
Se llena un microelectrodo y se coloca en el holder que lo conecta al cabezal del
amplificador. Luego, observando a través de la lupa binocular, hay que acercarse con el
microelectrodo al tejido que está en la cámara mediante el micromanipulador. Una vez que
el electrodo está sumergido en la cámara se observa la presencia de señal en el
osciloscopio. Se ajusta el control de offset del amplificador hasta llevar el voltaje a cero.
Luego se comprueba la integridad del microelectrodo midiendo su resistencia.. Si se
encuentra dentro de los límites aceptables (5 a 10 MΩ), se puede iniciar el proceso de
inserción. En caso contrario, se debe cambiar el microelectrodo.
Una vez que se logró ubicar un sitio de interés a través de la lupa, se realiza una
aproximación “gruesa” del microelectrodo. Luego, con el movimiento fino del eje X del
micromanipulador se realiza una segunda aproximación, denominada “a ciegas” ya que no
se mira a través de la lupa sino que se observa la señal en la pantalla del osciloscopio.
Cuando el registro en la pantalla es el esperado para un potencial de acción normal, se
puede dar comienzo a la adquisición de datos a través de la PC.
Siempre al comienzo de cada experimento se realiza un registro de las condiciones basales.
Se debe colocar el nombre del archivo donde se desean guardar los datos y se debe
accionar (mediante el mouse) la tecla que indica la operación GRABAR en el programa de
adquisición. Una vez que se adquirieron los datos necesarios, se vuelve a oprimir la tecla
GRABAR, y el programa continúa mostrando los datos pero sin guardarlos en el disco.
Luego, la secuencia posterior depende del tipo de experimento que se desee realizar. Por lo
general los experimentos tienen en común la siguiente operativa:
1. Se accionan las llaves de tres vías del tablero destinado a la perfusión de líquido,
llevándolas a la posición indicada como “recirculación”.
2. Se enciende la bomba de recirculación.
3. Se realiza la maniobra correspondiente, por ejemplo echar un volumen de alguna
sustancia dentro de la cámara y se espera un tiempo para estabilización.
4. Luego de la estabilización (aprox. 10 a 15 minutos) se procede a realizar los registros
5. Luego de realizar los registros, se apaga la bomba y se vuelve a colocar las llaves en la
posición “normal”.
Esta última secuencia de cinco pasos se repite varias veces durante el día de trabajo,
siempre con el mismo preparado. Lo que se va cambiando es tipo de sustancia que se echa
al preparado, de la cual se quiere estudiar el efecto sobre el potencial de ación del tejido.
En el caso del proyecto al que está destinado este sistema, se utilizan diversos agonistas y
antagonistas de los receptores beta-adrenérgicos. En particular se está estudiando el efecto
de fracciones séricas purificadas obtenidas de pacientes chagásicos.
Al finalizar el día de experimentos se retira el tejido de la cámara y se realiza un lavado de
la misma con agua destilada. Posteriormente se apagan todos los equipos.
114
10.1.3 Registros obtenidos
A continuación se muestran registros de potenciales de acción de tejidos de diferentes
zonas del corazón de conejo, los que fueron obtenidos utilizando el sistema desarrollado en
el presente trabajo. Se puede realizar una comparación con los registros indicados en la
bibliografía para el corazón de mamíferos en general (Figura 2-4).
Los registros se muestran tal como se observan en la pantalla del programa de adquisición.
Todos ellos fueron obtenidos de diferentes corazones en condiciones normales, es decir en
circulación de Tyrode por gravedad, sin el agregado de ninguna sustancia cardioactiva.
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
potencial (V)
0,00
-0,01
-0,02
-0,03
-0,04
-0,05
-0,06
-0,07
-0,08
-0,09
-0,10
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600 0,700
0,800
0,900
1,000
tiempo (seg)
Figura 10-1 : Registro del potencial de acción espontáneo del nódulo sinusal. Temperatura de la cámara
33.1±0,1oC, resistencia del microelectrodo 10 MΩ, frecuencia de muestreo 1kHz.
115
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
potencial (V)
0,00
-0,01
-0,02
-0,03
-0,04
-0,05
-0,06
-0,07
-0,08
-0,09
-0,10
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
tiempo (seg)
Figura 10-2 : Registro del potencial de acción espontáneo en el músculo auricular, generado desde el nódulo
sinusal.. Temperatura de la cámara 31.5±0,1oC, resistencia del microelectrodo 25 MΩ, frecuencia de
muestreo 1kHz.
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
potencial (V)
0,00
-0,01
-0,02
-0,03
-0,04
-0,05
-0,06
-0,07
-0,08
-0,09
-0,10
0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000
tiempo (seg)
Figura 10-3 : Registro del potencial de acción del músculo ventricular. En este caso se trata de tejido
endocárdico de ventrículo izquierdo. Temperatura de la cámara 32.5±0,1oC, resistencia del microelectrodo
116
10 MΩ, frecuencia de muestreo 1kHz. Estimulado a 70 ppm, con un pulso de 4 mA de amplitud y 4 mS de
duración.
Como puede verse, en cada caso se obtuvieron morfologías de los potenciales de acción
esperados, coincidentes con lo observado en la bibliografía :
¾ En el nódulo sinusal un potencial espontáneo con una fase cero inexistente y una
despolarización sostenida en fase 4. Además, un potencial diastólico máximo de
alrededor de -60 mV y un potencial de pico de aproximadamente 0 mV.
¾ En el músculo auricular un potencial también espontáneo, debido a la presencia del
nódulo sinusal en el preparado, y las fases características de este tipo de potencial, con
una duración del mismo de unos 100 mseg. Un potencial de reposo de
aproximadamente -70 mV y un potencial de pico de unos 30 mV.
¾ En el músculo ventricular un potencial estimulado (ver artefactos del estimulador) y las
fases características de este tipo de potencial, con una duración del mismo de unos 200
mseg. Un potencial de reposo de aproximadamente -80 mV y un potencial de pico de
unos 20 mV.
A partir de los resultados obtenidos se puede decir que se han alcanzado en forma
satisfactoria los objetivos planteados al comienzo del trabajo: se ha dejado en
funcionamiento, en el Laboratorio de Bioelectricidad de la FI-UNER, el sistema completo
de registro de los potenciales de acción con microelectrodos intracelulares.
Adicionalmente cabe destacar que los experimentos realizados con este sistema (o partes
del mismo) han dado lugar a dos presentaciones a congresos por parte del grupo de
investigación del Laboratorio de Bioelectricidad :
• En el mes de marzo de 1998 se ha presentado el trabajo “Frecuencia del latido sinusal:
dependencia con la temperatura” en el 8o Congreso Argentino de Ciencias
Morfológicas, realizado en Tandil, provincia de Bs. As. El trabajo fue realizado
haciendo uso del control de temperatura en un sistema de registro con electrodos de
superficie.
• En el mes de diciembre de 1998 se presentó el trabajo “Efecto de sueros de individuos
con serología positiva para Chagas, sobre el potencial de acción cardíaco” en el 18o
Congreso de la Sociedad Argentina de Biofísica, realizado en La Plata, provincia de Bs.
As. En este trabajo se estudiaron los potenciales de acción de músculo ventricular de
conejos mediante el uso del sistema de registro completo.
117
Sección 4 : Aspectos Económicos
118
11. CAPÍTULO ONCE : ANÁLISIS DE COSTOS
En la primera parte de este capítulo se analizan los costos involucrados en la etapa de
investigación y desarrollo del sistema de registro implementado. En una segunda parte se
analizan los costos de producción relativos al proyecto, a fin de poder estimar el precio de
venta del mismo. Debido a que el sistema representa un desarrollo destinado al área de
investigación, resulta difícil evaluar el tamaño del mercado potencial que podría utilizarlo,
por lo que se consideró el costo unitario de producción.
Antes de comenzar con la descripción de los costos en particular, cabe realizar una
definición muy importante, que será mantenida a lo largo de todo el capitulo. Dentro del
rubro Equipamiento, se ha considerado conveniente definir dos subgrupos :
A) Un subgrupo A, en el que se incluyen todos aquellos equipos diseñados y
desarrollados, (como por ejemplo el amplificador, el sistema de control de temperatura,
el software y la mesa antivibratoria).
B) Un subgrupo B, donde se consideran aquellos equipos que fueron comprados (como
ser por ejemplo la PC, el osciloscopio, la placa conversora, etc.)
11.1 Costos de Investigación y Desarrollo
Los costos de Investigación y Desarrollo (I+D) se valoraron a través de dos enfoques
diferentes. En el primero se calcularon los costos de I+D reales, es decir aquellos en los
cuales hubo que incurrir en la realización del presente proyecto. En el segundo enfoque se
consideraron los costos hipotéticos que hubiera insumido la implementación del proyecto a
precio de mercado de los factores. De esta forma es posible realizar un análisis
comparativo que muestre en términos económicos la ventaja de haber realizado este
proyecto con recursos de la Facultad.
11.1.1 Costo de I+D real
Considerando el desarrollo en el marco institucional de la Universidad, los costos de
personal se referirán a ella y se incluirán también los gastos involucrados en el
funcionamiento de un laboratorio de desarrollo en la institución.
11.1.1.1 Personal
El cálculo del costo de la hora de trabajo se realiza en base a la Beca de Iniciación a la
Investigación en la Universidad Nacional de Entre Ríos, a un valor de $3,10 la hora.
Item
Costo ($)
Diseño y desarrollo del equipamiento A (280 hs)
Evaluación, selección y compra del equipamiento B (80 hs)
Montaje del equipamiento A y B (250 hs)
Puesta a punto del sistema completo (120 hs)
Subtotal ($)
868,00
248,00
775,00
372,00
2263,00
119
En este ítem se consideran todos los bienes y equipos adquiridos o desarrollados para la
implementación del sistema completo. Se los clasificó en planillas de acuerdo a cada
subsistema en particular.
Sistema ambiental
Item
Costo ($)
Subtotal ($)
Perfusión de solución fisiológica
Mangueras de PVC transparente, tamaños varios
20,00
Acrílico para cámara
15,00
Elastómero ("Sylgard")
72,00
Llaves de tres vías
12,00
Bomba peristáltica
400,00
Manguera de tygon
80,00
Frasco para perfusión de solución fisiológica
100,00
Reservorio de PVC para agua destilada
80,00
779,00
Perfusión de gas
Tubo de carbógeno
350,00
Válvula reductora + Manómetro
140,00
20,00
Llaves de tres vías
12,00
522,00
Control de temperatura
Fuente de alimentación de 110V (CC)
120,00
Control de temperatura
125,00
Termómetro digital
65,00
Bloque de aluminio
6,00
Baño termostatizado
140,00
456,00
Sistema auxiliar de vacío
Bomba neumática
180,00
Frasco de vidrio para trampa
50,00
20,00
250,00
2007,00
Sistema mecánico
Item
Mesa antivibratoria
Estructura de soporte
Bases magnéticas
Micromanipulador Narishige
Micromanipulador Taurus
Costo ($)
Subtotal ($)
355,00
35,00
320,00
900,00
600,00
2210,00
120
Sistema óptico
Item
Fuente de alimentación
Lámpara + portalámpara
Lupa binocular
Cables, fichas de conexión
Costo ($)
Subtotal ($)
60,00
25,00
1200,00
5,00
1290,00
Sistema de registro analógico
Item
Agujas para llenado
Sujetador para el microelectrodo ("holder")
Amplificador
Estimulador
Osciloscopio digital
Jaula de Faraday
Materiales eléctricos varios
Costo ($)
Subtotal ($)
74,00
48,00
150,00
1100,00
4300,00
25,00
32,00
5729,00
Sistema de adquisición digital
Item
PC + impresora
Sistema operativo W indows 95
Software de adquisición (LabVIEW 3.00)
Placa de adquisición PC-LPM 16
Costo ($)
Subtotal ($)
1200,00
200,00
400,00
1200,00
3000,00
Accesorios varios
Item
Escritorio para PC
Silla de altura regulable
Material para el rack
Estantes de madera
Herrajes varios (tornillos, ménsulas, etc)
Costo ($)
Subtotal ($)
120,00
85,00
30,00
10,00
20,00
265,00
11.1.1.3 Materiales
En este apartado se detallan los insumos requeridos para la realización de los experimentos
de puesta a punto del sistema desarrollado. Cabe aclarar que se ha considerado un total de
cinco experimentos de puesta a punto.
Item
Drogas varias para el preparado de soluciones
1/3 de carga del tubo de carbógeno
Vidrio para microelectrodos
Baterías de 9V para estimulador
Costo ($)
Subtotal ($)
100,00
12,00
13,00
10,00
135,00
121
Item
Costo ($)
Subtotal ($)
Bibliografía
70,00
Comunicaciones (teléfono, fax, internet, correo)
40,00
Transporte
120,00
Fotocopias
25,00
Servicios del laboratorio (gas, luz)
25,00
280,00
Item
Personal
Equipamiento
Consumibles
Gastos preoperativos
Costo ($)
Total ($)
2263,00
14501,00
135,00
280,00
17179,00
84%
Personal
Equipamiento
Consumibles
13%
2%
1%
Figura 11-1 : Distribución relativa de los costos de I+D reales.
11.1.2 Costo de I+D a precio de mercado de los factores
En este apartado se considera el costo que hubiera insumido el proyecto a precio de
mercado de los factores. Se modifica únicamente el rubro personal, que se calcula a partir
del precio de mercado para la hora de trabajo de un ingeniero novel ($8,00) y de un técnico
($4,00).
11.1.2.1 Personal
Item
Costo ($)
Subtotal ($)
Ingeniero
Diseño y desarrollo del equipamiento A (280 hs)
2240,00
Evaluación, selección y compra del equipamiento B (80 hs)
640,00
Supervisión de las tareas del técnico (40 hs)
320,00
Técnico
1000,00
480,00
4680,00
Se mantiene igual que 11.1.1.2
122
11.1.2.3 Materiales
Item
Personal
Equipamiento
Consumibles
Costo ($)
Total ($)
4680,00
14501,00
135,00
280,00
19596,00
24%
Personal
Equipamiento
Consumibles
74%
1%
1%
Figura 11-2 : Distribución relativa de los costos de I+D a precio de mercado de los factores.
11.1.3 Comparación de los costos de I+D
En la siguiente figura se han representado los costos de I+D reales y los costos de I+D a
precio de mercado de los factores, a fin de poder realizar una comparación entre ellos.
20000
Total
Consumibles
5000
Equipamiento
10000
Personal
costo ($)
15000
0
costo I+D real
costo I+D a precio de mercado
Figura 11-3 : Diagrama de barras representando los componentes de los costos de I+D descriptos
previamente
Tal como puede verse, los costos reales del proyecto fueron menores a los costos a precio
de mercado. Esto se debe a una economía en el valor de la mano de obra utilizada para el
123
proyecto. Se puede ver entonces que utilizando recursos humanos propios (becario) se
produjo un ahorro importante, de aproximadamente un 15% del costo total.
11.2 Estimación del precio de venta
Como se mencionó previamente, dado que el presente proyecto constituye un desarrollo
para el área de investigación, resulta difícil estimar su demanda potencial. Por lo tanto se
considera el costo de producción unitario del proyecto, para poder estimar el precio de
venta del desarrollo a un posible comprador externo.
En primer lugar se calcula cuál sería el precio de venta del sistema desde la Universidad.
Luego se realiza un análisis del precio que tendría un sistema similar, constituido en su
totalidad por equipamientos comerciales.
11.2.1 Producción en la Universidad
Para la determinación del costo total de producción en la Universidad se consideraron
todos los recursos económicos e insumos que habría que desembolsar para la reproducción
del proyecto, desglosados en costos directos y costos indirectos. Entre los costos directos
se incluyeron los costos de personal, equipamiento y materiales. Entre los costos indirectos
se consideraron los servicios generales del laboratorio (luz, gas, teléfono, etc.), la
amortización y el mantenimiento de los equipos, etc. Para obtener un valor estimado del
precio de venta se consideró un porcentaje de utilidades sobre este costo total. Dado que el
desarrollo tuvo su origen en la Universidad, para el cálculo de dichas utilidades se utilizó
un criterio propuesto por la misma para este mecanismo[f]. Este indica que hay que
adicionar entre un 20 y un 25% al costo total de producción para establecer el valor final
del producto, en concepto de margen de beneficio universitario. El margen de beneficio
universitario corresponde a la utilidad económica en concepto del valor intrínseco que
contiene todo trabajo realizado en el seno mismo de la producción del conocimiento, que
es la Universidad.
En la planilla que se presenta a continuación se realizaron las siguientes consideraciones :
a) COSTOS DIRECTOS :
• Personal : La mano de obra se consideró de $1960, donde $1480 corresponden a
370 hs de trabajo de montaje y puesta a punto de un técnico y $480 a 60 hs de trabajo de
supervisión y tramitación de compras por parte de un ingeniero novel, ambos a precio
de mercado de los factores.
Item
Ingeniero
Tramites de compra (20 hs)
Técnico
Armado del equipamiento A (80 hs)
Costo ($)
Subtotal ($)
160,00
320,00
320,00
680,00
480,00
1960,00
f
Los datos fueron obtenidos a través de consultas con el Área de Vinculación Tecnológica de la UNER. Los
porcentajes establecidos pertenecen a criterios extraídos de un proyecto de normativa al respecto, el que en
estos momentos se halla en evaluación.
124
• Equipamiento : El costo del equipamiento se consideró igual al costo de los
apartados anteriores, aunque podría ser menor, debido a que habrá equipos (como por
ej. osciloscopio, estimulador, etc) que se podrán adquirir a menor precio.
• Materiales : Se consideró el mismo costo que en los casos anteriores en los
consumibles necesarios para la puesta a punto del sistema.
• Gastos Preoperativos : en este caso no se producen, por no haber involucradas
etapas de investigación y desarrollo.
b) COSTOS INDIRECTOS : Se estimó un total de $200 correspondiente a este ítem.
c) UTILIDADES : Se consideró un 25% del costo total en concepto de margen de beneficio
universitario.
Item
Costos directos
Personal
Equipamiento
Materiales
Costos indirectos
Utilidades (25%)
Valor ($)
Precio final ($)
1960,00
14501,00
135,00
200,00
4199,00
20995,00
Se puede estimar entonces un precio de venta de $ 20995 para un posible comprador de
este proyecto. Como se mencionó anteriormente este cálculo es aproximado.
11.2.2 Producción fuera de la Universidad
En este apartado se considera el precio que debería pagar un interesado externo por un
sistema similar al desarrollado en el presente proyecto. Cabe aclarar entonces que en este
caso no se desarrollaría ninguno de los equipos (subgrupo A) sino que se comprarían en su
totalidad.
La siguiente planilla detalla el costo total de los equipos e insumos requeridos para la
implementación de un sistema similar al desarrollado en el presente proyecto, donde se
realizaron las siguientes consideraciones :
• Personal : La mano de obra se consideró de $1320, donde $1000 corresponden a
250 hs de trabajo de montaje y puesta a punto de un técnico y $320 a 40 hs de trabajo de
supervisión y tramitación de compras por parte de un ingeniero novel, ambos a precio
de mercado de los factores. Cabe aclarar que en este caso se utilizan menos horas
porque, como se mencionó previamente, no se realiza el armado del equipamiento A,
sino que el mismo se compra.
Item
Ingeniero
Tramites de compra (20 hs)
Técnico
Costo ($)
Subtotal ($)
160,00
160,00
680,00
320,00
1320,00
• Equipamiento : Se han considerado los siguientes elementos comerciales en
reemplazo de los desarrollados :
125
- Control de temperatura TLC-MI de ALA Science (U$S 4000)[13]
- Mesa antivibratoria Newport LW-3048- OPT (U$S 8000)[40]
- Amplificador para microelectrodos Electro 705, de WPI (U$S 1073)[29]
- Software y placa de adquisición Digipack de Axon Instruments, compuesto por una
placa de adquisición Digidata 1200B y el software Axoscope 7.0 para adquisición de
señales electrofisiológicas. (U$S 3100)[35]
• Materiales : Se consideró el mismo costo que en los casos anteriores en los
consumibles necesarios para la puesta a punto del sistema.
• Gastos Preoperativos : en este caso no se producen, por no haber involucradas
etapas de investigación y desarrollo.
Los precios que se estimaron fueron obtenidos de catálogos, por lo que la valoración está
subestimada. Adicionalmente habría que valorar los costos de importación de los equipos
antes mencionados, lo que duplicaría el costo de los mismos.
Item
Personal
Equipamiento
Materiales
Valor ($)
Precio final ($)
1320,00
25612,00
135,00
27067,00
11.2.3 Comparación de precios
valores en la Universidad
Precio total
Utilidades
Costos
indirectos
Consumibles
Equipamiento
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
Personal
costo ($)
En la siguiente figura se han representado el precio de venta si el sistema es producido en
la Universidad y el precio que resulta al comprar todos los equipos comerciales, a fin de
poder realizar una comparación entre ellos.
valores comerciales
Figura 11-4 : Diagrama de barras representando los componentes de los precios descriptos previamente
Como se puede ver, tanto el precio estimado de venta ($20995) está por debajo del costo
que hubiera insumido el comprar todos los elementos para realizar el montaje ($27067). Se
puede decir entonces que se ha logrado realizar una disminución sustancial del costo del
sistema, con prestaciones de sus componentes que son similares y hasta superan a las de
los modelos disponibles en forma comercial.
126
Sección 5 : Apéndices
127
1. APÉNDICE UNO : CONCEPTOS TEÓRICOS ASOCIADOS CON
EL CONTROL DE LAS VIBRACIONES.
1.1 Caracterización de un sistema antivibratorio
Las fuentes de vibraciones están presentes en prácticamente todos los ambientes de
trabajo. Entre las más comunes podemos citar: acondicionadores de aire, heladeras,
bombas, caminos o rutas cercanas al laboratorio y hasta el movimiento de las personas
alrededor del puesto de trabajo, entre otras. Estas fuentes contribuyen a la aparición de un
ruido de fondo, que se halla acoplado a los cimientos y pisos de la construcción donde esté
instalado nuestro laboratorio. El ruido de fondo presente en la estructura de una
construcción se encuentra generalmente en un rango comprendido entre 0.1 y 500 Hz,
dependiendo del tipo de fuentes presentes en el sistema[40] (ver Figura 1-1). Las
vibraciones se hallan acopladas además a la superficie de trabajo a través de la atmósfera,
en forma acústica. Las vibraciones acústicas contribuyen con un ruido de fondo de
frecuencias superiores a los 20 Hz.
Figura 1-1: Algunas de las fuentes comunes de vibraciones en un laboratorio.
Una primera forma de controlar las vibraciones es reducir las vibraciones ambientales y las
acústicas. En principio hay que tratar de instalar el puesto de trabajo en un piso firme y
sólido, lo más alejado posible de las fuentes de ruido. Si existen equipos que contribuyen
con ruido capaz de acoplarse a través del piso, estos deben instalarse sobre soportes
especiales que atenúen las vibraciones antes de que sean transmitidas. Las fuentes de
vibración acústica deben alojarse dentro de recintos que disminuyan este tipo de
contribución. Sin embargo, aunque se tomen todos los recaudos posibles para tratar de
atenuar las fuentes de ruido, siempre existe un nivel de ruido de fondo que resulta excesivo
para la realización de los experimentos en cuestión.
Una segunda forma de controlar las vibraciones es aislar la superficie de trabajo del ruido
presente en el ambiente. Las vibraciones del piso pueden ser atenuadas apoyando la
128
superficie de trabajo sobre una variedad de sistemas de acoplamiento. Tales sistemas
pueden estar constituidos por estructuras de montaje de goma, aisladores neumáticos
pasivos o activos, etc. La elección del tipo particular de sistema de acoplamiento depende
de la aplicación en particular, del peso que debe ser soportado y del ruido ambiental
presente. Como se verá más adelante, el diseño de los sistemas de acoplamiento se
encuentra relacionado fundamentalmente con el concepto de transmisibilidad.
La tercera forma de atacar el problema de las vibraciones es maximizar la rigidez y las
características de amortiguamiento de la superficie de trabajo. Esta última debe estar
diseñada de manera tal que presente una respuesta mínima ante cualquier vibración
transmitida a través del sistema de acoplamiento. Para ello se utilizan superficies de trabajo
construidas con materiales que alcanzan una rigidez elevada sin aumentar de manera
excesiva la masa. Más adelante se discutirá este concepto, representado mediante la
relación rigidez/masa. Además se verá que el diseño de una superficie de trabajo
antivibratoria está íntimamente relacionado con el concepto de compliancia.
1.2 Fundamentos de vibración
Para comprender los fundamentos del control de las vibraciones, es necesario realizar una
breve descripción de algunos conceptos teóricos. Los conceptos de vibración y de aislación
de las vibraciones están ambos íntimamente relacionados con el movimiento armónico
simple y el fenómeno de resonancia.
1.2.1 Movimiento armónico simple
Un ejemplo sencillo de movimiento armónico simple es el de una masa colocada en una
viga flexible empotrada. Una fuerza externa, ya sea un impulso o una vibración periódica
aplicada en forma vertical, causará una oscilación del sistema que se mantendrá en forma
indefinida. En el caso de un sistema real en cambio, si el estímulo es un impulso, tal
oscilación se extinguirá al cabo de cierto tiempo debido al amortiguamiento del sistema,
que disipa la energía aplicada. (ver Figura 1-2)
Fuerza de excitación
F
y
desplazamiento y
tiempo
Figura 1-2 : Viga empotrada como ejemplo de movimiento armónico simple. En un sistema real la respuesta
y(t) a un impulso aplicado en el extremo libre es una oscilación que va disminuyendo de amplitud hasta
hacerse cero debido al amortiguamiento.
La respuesta y de este oscilador ante una excitación sinusoidal puede ser hallada
resolviendo la siguiente ecuación diferencial:
my&& + cy& + ky = F .sen(ωt )
En esta ecuación ÿ es la aceleración, ý la velocidad, y el desplazamiento, m la masa que
está siendo movida, c el amortiguamiento y k la rigidez. F es la fuerza de excitación que
varía en forma sinusoidal con frecuencia ω y amplitud máxima Fo.
129
1.2.2 Frecuencia natural
La frecuencia natural es la frecuencia a la cual el sistema entra en resonancia con el
estímulo aplicado. En el ejemplo del oscilador simple (sin amortiguamiento), la frecuencia
natural está determinada por la masa colocada en el extremo (se considera que la viga
posee masa despreciable frente a esta última) y por la rigidez de la viga. Como puede
observarse en la siguiente expresión, la relación es tal que una menor masa y/o una viga
más rígida incrementan la frecuencia natural y viceversa.
ωn = k m
El valor de k depende de la forma de la viga y del módulo de Young del material con el
que esté construida.
Para el caso de una estructura antivibratoria resulta deseable lograr que las frecuencias
naturales de la misma tengan valores elevados. Más adelante se discutirá más en detalle
este concepto.
1.2.3 Compliancia
Las fuerzas externas pueden ser estáticas o dinámicas y constituyen la entrada o excitación
de nuestro sistema. La compliancia representa la función de transferencia que relaciona a
la excitación con la respuesta de la estructura. En el caso de una fuerza estática la
compliancia es la relación entre el desplazamiento lineal o angular de una determinada
parte de la estructura y la magnitud de la fuerza aplicada a dicha estructura. En el caso de
un fuerza que varía en forma dinámica o vibración, la compliancia es la relación entre la
amplitud de la repuesta vibratoria y la magnitud de la vibración aplicada a la estructura. Un
valor de compliancia pequeño implica una estructura rígida, lo cual es altamente deseable
para una superficie de trabajo antivibratoria en condiciones estáticas[41].
La expresión general para la compliancia de un sistema con un grado de libertad, como lo
es el oscilador simple, es la siguiente :
1
1
y
compliancia = F =
=
2 2
2
(rigidez − efecto de la masa ) + amortiguamiento
( k − mω ) + (cω )
o expresado en otros té rminos:
1/ k
compliancia =
(1 − ω 2 / ωn2 )2 + (2ζω / ωn )2
donde ω es la frecuencia de la excitación, ωn es la frecuencia de resonancia natural del
sistema y ζ es el coeficiente de amortiguamiento, dado por la expresión :
ζ =
c
2 k. m
La siguiente figura muestra un gráfico de la compliancia en función de la frecuencia, de
acuerdo a la fórmula anterior. Como puede verse, la compliancia de un sistema con un
grado de libertad puede separarse en tres partes : una debida a los efectos de masa, otra a la
rigidez y la otra al amortiguamiento.
log compliancia
Pico de
resonancia
Altura del pico
determinada por el
amortiguamiento
(1/cω)
Región de
la rigidez
Región dominada
por la masa
(1/k)
(1/mω2)
130
Figura 1-3 : Gráfico de la compliancia en función de la frecuencia para un sistema con un grado de libertad.
Como se dijo anteriormente, en un oscilador simple la frecuencia a la cual se produce el
pico de resonancia puede hallarse mediante ωn = k m , donde la cantidad k/m es conocida
como relación rigidez/masa. Por lo tanto la frecuencia de resonancia de un sistema puede
alterarse si se modifica esta relación.
En una estructura real, donde se presentan muchas frecuencias de resonancia, esto
representa un concepto importante para el diseño de la misma. Así, el mayor objetivo en el
diseño de una superficie de trabajo antivibratoria es lograr que los picos de resonancia
de la misma se encuentren en frecuencias altas, mayores que las frecuencias de excitación
presentes en el sistema. Además, tales picos deben ser de baja amplitud, hecho que se logra
variando el amortiguamiento del sistema. Para llevar los picos de resonancia a frecuencias
mayores, se debe incrementar la rigidez de la superficie de trabajo, al mismo tiempo que se
debe tratar de minimizar su masa.
1.2.4 Transmisibilidad
En el caso del oscilador simple amortiguado con un grado de libertad se considerará ahora
que la excitación proviene del extremo empotrado de la viga. Esto puede interpretarse
como una fuerza o una vibración acoplada a través de la pared. La masa colocada en el
extremo libre de la viga tendrá entonces un desplazamiento debido a esta excitación.
Fuerza de excitación
desplazamiento y
Figura 1-4 : Esquema del oscilador simple amortiguado donde la excitación proviene del extremo
empotrado de la viga, que provoca un desplazamiento de la masa en el extremo libre.
El flujo de energía de vibración se expresa en términos de la transmisibilidad, que es la
función de transferencia que cuantifica con qué eficiencia la excitación es capaz de
producir la vibración de la masa. Así, la transmisibilidad es la relación entre la amplitud de
la vibración transmitida sobre la amplitud de la vibración ejercida.
La expresión para la transmisibilidad es la siguiente :
1 + ( 2 ζω / ω n ) 2
Transmisibilidad =
(1 − ω 2 / ω n2 ) 2 + ( 2ζω / ω n ) 2
131
donde ω es la frecuencia de excitación, ωn es la frecuencia natural del sistema y ζ el
coeficiente de amortiguamiento. Como puede observarse, existe una similitud entre las
funciones de transferencia de transmisibilidad y compliancia. Si se observa la gráfica que
representa la transmisibilidad (Figura 1-5) se puede ver que existen tres regiones.
pico de
resonancia
altura del pico
determinada por el
amortiguamiento
100
log
transmisibilidad
10
Región dominada por
la masa.
Región de aislación
las vibraciones
1
Región
de la
rigidez
0.1
0.1
1
10
100
log relación de frecuencias ω /ωn
Figura 1-5 : Curva de transmisibilidad de un oscilador armónico simple.
A bajas frecuencias, la masa en el extremo de la viga se mueve sincrónicamente con el
extremo empotrado y con igual amplitud. El sistema se comporta como si la viga fuera
perfectamente rígida. Esto significa que la transmisibilidad es igual a uno y no existe
aislamiento de las vibraciones. A medida que la frecuencia se incrementa, se aproxima a
las condiciones de resonancia, donde la amplitud de la respuesta se hace máxima y cuyo
valor depende del coeficiente de amortiguamiento. Finalmente, a frecuencias mucho
mayores que la frecuencia de resonancia, se tiene la región dominada por los efectos de la
masa. La transmisibilidad tiende a cero y la masa en el extremo de la viga permanece
inmóvil ante la excitación. Esta es la región donde se produce el efecto de aislación de las
vibraciones.
El concepto de transmisibilidad resulta importante en el diseño de los sistemas de
acoplamiento de la superficie de trabajo con el suelo y del microelectrodo con la
superficie de trabajo. De lo expuesto anteriormente puede decirse que dichos sistemas
deben poseer dos características fundamentales :
• Deben poseer frecuencias de resonancia (horizontal y vertical) que estén por debajo de
las frecuencias de vibración del ambiente.
• Debe poseer amortiguamiento para atenuar los picos de resonancia.
A continuación se discuten más en detalle las características deseables para estos dos
sistemas de acoplamiento
1.3 Estructura de acoplamiento entre soporte del microelectrodo
superficie de trabajo[42]
y la
132
A continuación se analizará un ejemplo simplificado de una estructura para registro,
consistente en una base, un micromanipulador y un brazo donde se sujeta el
microelectrodo. Por conveniencia, sólo se considerarán los movimientos verticales, ya que
los movimientos laterales pueden ser tratados de manera similar. La Figura 1-6 muestra el
esquema de un micromanipulador montado en una base rígida, con el microelectrodo en el
extremo
brazo
micromanipulador
base
l
M
C
superficie
de trabajo
x
microelectrodo
h
Figura 1-6 : Esquema representando una base rígida sobre la que se encuentra apoyado el micromanipulador
que soporta al microelectrodo.
Se considera que la masa M se encuentra concentrada en el cabezal y la compliancia C se
mide en el extremo del brazo. El objetivo es entonces minimizar las variaciones en la
distancia x cuando la base sufre de oscilaciones verticales, a causa, por ejemplo, de las
vibraciones transmitidas desde el piso donde se encuentra apoyada la superficie de trabajo.
En cualquier sistema práctico, la frecuencia de resonancia de la estructura
micromanipulador + microelectrodo es mucho mayor que las frecuencias de vibración de
la base. Bajo estas condiciones cuasi-estáticas, el desplazamiento ∆x en el extremo de la
estructura está dado por :
∆x = h&&. M . C
donde h&& representa la aceleración instantánea de la base. De aquí se puede ver que para
reducir el valor de ∆x se deberá tratar de hacer pequeños los valores de h&&, M y C.
La reducción de la masa M se logra sencillamente tratando de evitar la colocación de peso
excesivo en el extremo del cabezal. La reducción de la compliancia C, en cambio, requiere
del conocimiento de la teoría de vigas. La compliancia medida en el extremo libre de una
viga empotrada está dada por :
C=
l3
3. E. I
donde l es la longitud del brazo, E es el módulo de Young del material del brazo e I es el
momento de inercia del mismo. Para una barra de sección circular, I se incrementa con la
cuarta potencia del radio. De acuerdo a esto, para disminuir la compliancia, el brazo debe
ser corto, grueso y debe estar construido de un material rígido. Sin embargo, el grosor del
brazo no puede aumentarse indefinidamente ya que esto implicaría un aumento de la masa
del brazo, que dominaría la masa de la estructura (lo mismo ocurriría si se quisiera
eliminar la masa M del cabezal). La deflexión en el extremo de una barra de sección
transversal uniforme de masa m por unidad de longitud es :
h&&. m. l
∆x =
8. E. I
133
Esto sugiere que el brazo debe estar construido con un material con elevada rigidez
específica (módulo de Young dividido por la densidad). De los materiales más comunes el
aluminio, el vidrio y la madera poseen aproximadamente el mismo valor de rigidez
específica. Cabe aclarar que si bien hasta aquí no se han considerado las características del
micromanipulador, está claro que una mínima compliancia en la estructura implica una
baja compliancia en el mismo. Más adelante se discutirán en detalle sus características.
1.4 Estructura de acoplamiento entre la superficie de trabajo y el suelo[42]
Por último, para reducir el valor de ∆x, hay que minimizar la aceleración h&& de la base, que
se halla unida solidariamente a la superficie de trabajo, en respuesta a las vibraciones del
piso. La Figura 1-7 muestra una superficie de trabajo de masa M’ apoyada sobre soportes
con compliancia C’.
M’
C’
Figura 1-7: Esquema representando una superficie de trabajo de masa M’ apoyada sobre soportes de
compliancia C’.
No se realizará un análisis dinámico completo, pero se obtiene una aproximación bastante
buena si se considera que para pequeñas aceleraciones del piso h&& es inversamente
proporcional a (M’.C’)½ . El objetivo es por lo tanto hacer que M’ y C’ sean lo más grande
posible. Un límite superior para C’ es el inconveniente que presenta un soporte
excesivamente flexible. La máxima compliancia tolerable oscila alrededor de los 100
µm/N. Tampoco es posible incrementar excesivamente la masa, ya que hay limitaciones
impuestas por el costo, el espacio y la resistencia de los soportes, por ejemplo. Está
recomendado el uso de masas del orden de los 50 a 100 Kg.
134
2. APÉNDICE DOS : DESCRIPCIÓN DEL PROGRAMA REALIZADO
EN LABVIEW
Este apéndice tiene como finalidad brindar detalles más específicos del programa de
aplicación desarrollado con el LabVIEW.
Se explicará el programa haciendo referencia al diagrama de bloques del mismo. Antes de
comenzar con la explicación es importante mencionar la convención de colores empleada
por el LabVIEW para la representación de cada tipo de dato en el diagrama de bloques.
Así, el flujo de datos de números enteros se dibuja con líneas finas azules, el de los
números reales con líneas finas naranja, el de los operadores booleanos con líneas finas
verdes, el de las cadenas de caracteres por líneas finas rosadas, el de las matrices por líneas
dobles con el color de acuerdo al tipo de sus elementos y el de las estructuras que poseen
más de un sólo tipo de dato (“clusters”) en líneas gruesas rosadas.
Para comprender la estructura general del programa de adquisición es necesario guiarse
por las figuras II-2 y II-3 que representan el panel frontal y el diagrama en bloques del
instrumento virtual (VI) respectivamente. A continuación se resume el funcionamiento
general del mismo.
El VI Analog-Input Continuous Scan (AI-CS) se colocó dentro de una estructura
condicional tipo WHILE-DO, (MIENTRAS (condición) HACER (acción)), representada
en el diagrama de bloques por una flecha que describe un bucle rectangular.
(acción)
parámetros de
configuración
de la placa
condición de
terminación
(condición)
VI que detecta
cuando se produjo
un error
contador de
iteración
Bucle
WHILE
Figura II-1 : Diagrama del VI desarrollado, mostrando sus diferentes componentes.
La finalización de la adquisición (condición de terminación del bucle verdadera) puede
ocurrir debido a que se accionó el botón del panel frontal que posee la leyenda DETENER
o se produjo un error en la ejecución del programa.
En la iteración número cero, el AI-CS llama a otros sub-VI’s para configurar en la placa
conversora (dispositivo):
• El canal o grupo de canales seleccionado
• El hardware necesario para la ubicación del buffer intermedio.
• La frecuencia de muestreo
Cuando se da comienzo a la adquisición, en cada iteración sucesiva, el AI-CS toma el
número de datos especificado en la variable número de muestras y, de acuerdo al rango
135
en el que está configurada la placa, devuelve un vector con los valores de voltaje
correspondientes. En la última iteración (condición de terminación del bucle verdadera), el
AI-CS “limpia” el buffer intermedio.
El panel frontal (figura II-2) está compuesto por un gráfico utilizado para mostrar la señal
de entrada (la de los potenciales de acción). El gráfico posee su contraparte, rotulada bajo
el nombre POTENCIAL DE ACCIÓN en el diagrama de bloques, la que se halla
conectada a la salida del AI-CS, luego de realizado un proceso de escalado y conformación
del vector de datos. Posee además un “nodo de atributos”, también rotulado bajo el nombre
POTENCIAL DE ACCIÓN, que permite establecer las propiedades tales como valores
mínimos y máximos de la escala X, incremento en X y cantidad de cifras significativas en
la representación.
En el panel frontal se cuenta además con una serie de botones e indicadores luminosos.
Los botones permiten acceder a las funciones de grabar, detener el programa y marcar la
presencia de un evento. Los indicadores luminosos son el verde para indicar que el
programa está corriendo, y que se encuentra a la derecha de la leyenda VER, el rojo que se
enciende mientras está activa la función de grabar y que se halla ubicado a la derecha del
botón GRABAR, el rojo a la derecha del botón DETENER, que indica la finalización del
programa, y el azul que se enciende cuando es pulsado el botón marcador de eventos. La
utilidad del marcador de eventos permite introducir un comentario en el archivo durante el
proceso de grabación del mismo, para indicar la ocurrencia de algún suceso en particular
durante el experimento.
El programa permite guardar en un archivo de texto una secuencia determinada de los
datos que se están adquiriendo. Para ello, en el panel frontal del programa, basta con
colocar el nombre del archivo en donde se desean almacenar los datos en el recuadro
NOMBRE DEL ARCHIVO y posteriormente presionar el botón rotulado GRABAR. A
partir de ese instante y hasta que el botón vuelva a ser apretado o se detenga la ejecución
del programa, el VI envía cada barrido que realiza de la placa de adquisición al archivo
mencionado.
Adicionalmente, el programa posee dos indicadores numéricos. Uno brinda el valor de la
frecuencia de muestreo real, calculada por el AI-CS, la que a veces puede diferir de la
prestablecida por el programa debido a retardos en la ejecución de las operaciones. El otro
indicador muestra un valor aproximado de la frecuencia cardíaca promedio, calculada a
partir de multiplicar el número de latidos detectados en un segundo por 60. La detección
del número de latidos ocurridos en un segundo se lleva a cabo mediante un VI detector de
picos, al que se le pasan los parámetros umbral y ancho de pico válido y devuelve el
número de picos detectados en una ventana dada, la que en este caso fue de un segundo.
Esta utilidad accesoria sirve para controlar la frecuencia promedio cuando se realizan
mediciones de latidos espontáneos, como por ejemplo en el nódulo sinusal. No brinda sin
embargo una información precisa, ya que el cálculo es aproximado.
136
137
Sección 6 : Bibliografía
1
Pfizer.
“El Corazón” Laboratorios Pfizer. (folleto)
2
Nicola Siri, LC.
“Las bases iónicas de la actividad eléctrica del corazón”. Capítulos de Cardiología.
Arritmias. IV (1) : 9-44. (1994).
3
Katz, AM.
PHYSIOLOGY OF THE HEART. Second Edition. Raven Press. New York - USA
(1992).
4
Patton, DE ; Fuchs, S ; Hille, B ; Scher, S; Steiner, AJ.
TEXTBOOK OF PHYSIOLOGY. EXCITABLE CELLS AND NEUROPHYSIOLOGY.
Vol. II. 21a Edition. Saunders WB. USA (1989)
5
Ponce Zumino, A ; Gambarte, AJ.
“Conceptos actuales sobre electrogénesis del nódulo sinusal”. Revista de la Federación
Argentina de Cardiología. 26 (2) : 201-207. (1997).
6
Walker, MJA ; Pugsley, MK.
METHODS IN CARDIAC ELECTROPHYSIOLOGY. CRC Press. USA. (1998).
7
Hille, B.
IONIC CHANNELS OF EXCITABLE MEMBRANES. Sinauer Associates Inc. USA
(1984)
8
Casco, VH.
Apuntes del Curso teórico-práctico de postgrado: “Procesamiento de Especímenes
Biológicos para Microscopía Electrónica de Transmisión” Laboratorio de Microscopía
Electrónica. Facultad de Ingeniería. UNER (1996)
9
Selkurt, EE.
FISIOLOGÍA. Tercera Edición. Editorial El Ateneo. Barcelona - España (1981)
10
Terra.
“Laboratory Equipment Catalog 1996”. Terra Universal Inc. USA. (1996)
11
Physitemp.
“Thermal Microscope Stage. TS-4”. Physitemp Instruments. USA (folleto)
12
Techne Cambridge
“Microscope Thermal Stage Model MTS-1”. Techne Cambridge Ltd. England (folleto)
138
13
Adams & List Associates.
“Thermal Liquid Coupled Microincubator System TLC-MI”. Adams & List Associates,
LTD. ALA Scientific Instruments. USA. (folleto)
14
Intracel.
“Quick Reference Guide to Products for Electrophysiology and Microinjection”. Intracel.
UK (1997)
15
Geddes, LA ; Baker, LE.
PRINCIPLES OF APPLIED BIOINSTRUMENTATION. Second Edition. John Wiley &
Sons. New York - USA (1975)
16
Axon Instruments
THE AXON GUIDE FOR ELECTROPHYSIOLOGY AND
LABORATORY TECHNIQUES. Axon Instruments. USA. (1993)
BIOPHYSICS
17
Carpman, R.
“La Ergonomía como herramienta preventiva da las patologías de la columna vertebral”.
Apuntes de la Cátedra de Ergonomía. Facultad de Ingeniería -UNER (1995)
18
Mc.Cormick, EJ.
ERGONOMÍA. Editorial Gustavo Gili S.A. - Barcelona - España (1980).
19
Tougas, G ; Nordin, MC.
“Seat features recommendations for workstations”. Applied Ergonomics. 18(3) : 207-210.
(1987)
20
Kaplan, HN.
THE RABBIT IN EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY Second Edition. Scholar’s Library.
New York - USA (1962)
21
Cole Parmer.
“Catálogo de productos 97-98”. Cole Parmer Instrument Company. USA (1998)
22
López Aparicio, D.
ELECTRÓNICA: ENCICLOPEDIA PRÁCTICA Ediciones Nueva Lente. Madrid España (1983)
23
Motorola
OPTOELECTRONICS DEVICE DATA. Motorola Inc. USA (1995)
24
Analog Devices.
AMPLIFIERS REFERENCE MANUAL. Analog Devices . USA (1992)
25
National Semiconductor
LINEAR DATABOOK. National Semiconductor Corporation - USA (1995)
139
26
Narishige.
“General Catalog” Narishige Group. Japan. (1997)
27
Flaming, KT ; Brown, DG.
ADVANCED MICROPIPETTE TECHNIQUES FOR CELL PHYSIOLOGY. IBRO
Handbook Series. John Wiley & Sons. New York - USA (1986)
28
Sutter
“Instruction Manual : Model P-97 Micropipette Puller”. Sutter Instrument Company.
(1997)
29
World Precision Instruments.
“Laboratory Equipment for the Life Sciences”. WPI Inc. USA (1997)
30
Burr Brown
INTEGRATED CIRCUITS DATA BOOK. LINEAR PRODUCTS Burr Brown. USA.
(1996).
31
GALIX.
“Estimulador transesofágico portátil multiprogramable para estudios electrofisiológicos :
Manual de uso”. GALIX, Instrumentación Biomédica SRL. Buenos Aires - Argentina
(1990)
32
Hitachi.
“Digital Storage Oscilloscope Model VC-6041(Z): Operation Manual” Hitachi Denshi Ltd.
Japan.
33
Warner
“Research Instrument Catalog: Tools for Research in Biology”. Warner Instrument Corp.
USA (1996)
34
FHC
“X-Cell3 Microelectrode Amplifier” FHC. USA (folleto)
35
Axon Instruments
“Product Catalog 1998 : Analysis for the Life Sciences”. Axon Instruments Inc. USA
(1998)
36
National Instruments
“Instrumentation Reference and Catalogue 1997” National Instruments. USA. (1997)
37
National Instruments.
LabVIEW FOR WINDOWS : USER MANUAL. National Instruments. USA. (1993)
38
National Instruments.
LabVIEW FOR WINDOWS : DATA ACQUISITION VI REFERENCE MANUAL.
National Instruments. USA. (1993)
140
39
Lázaro, AM.
LabVIEW.
PROGRAMACIÓN
GRÁFICA
PARA
EL
INSTRUMENTACIÓN. Editorial Paraninfo. Madrid - España (1997)
CONTROL
DE
40
Newport.
“Vibration Control”. Catálogo 1998. Newport Corp. USA. (1998)
41
Melles Griot.
“Optical Products Catalog”. Melles Griot. USA. (1995)
42
Purves, RD.
MICROELECTRODE METHODS FOR INTRACELLULAR RECORDINGS AND
IONOPHORESIS. Academic Press. Londres - UK (1981).
141

Sistema para el registro del potencial de acción de células

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