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Análisis citológico y molecular de los cromosomas X y B
V Seminario de Citogenética- Cádiz 2008 Análisis citológico y molecular de los cromosomas X y B microdiseccionados en dos especies de saltamontes Teruel M (1), Cabrero J (1), Acosta MJ (2), Sánchez A (2) (1) Departamento de Genética, Universidad de Granada, 18071 Granada (2) Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén Introducción Cromosomas B Eyprepocnemis plorans B24 ADN satélite ADNr Cabrero et al. 1999 Locusta migratoria B DAPI negativa DAPI positiva DAPI negativa Camacho et al, 1991 Objetivo Profundizar en la naturaleza molecular y el origen de los cromosomas B de las especies Eyprepocnemis plorans y Locusta migratoria E. plorans: Cromosomas X Cromosomas B (López-León et al., 1994) 1. Microdisección de los cromosomas B y X 2. Probar la presencia de varias secuencias de ADN en los microdiseccionados, mediante PCR Material y Métodos Material 2 especies de saltamontes de la familia Acrididae (Orthoptera) portadores de cromosomas B - Eyprepocnemis plorans Torrox (Málaga): B24 - Locusta migratoria Las Gabias (Granada): B Tejido: Folículos testiculares fijados en etanol: acético (3:1) y guardados a -20ºC en etanol al 70% Método Microdiseccion Manual Microscopio invertido, Zeiss Axiovert 200, acoplado a un micromanipulador electrónico, Eppendorf TransferMan NK 2 Células en meiosis: diplotene y/o paquitene B24 2B X X E. plorans L. migratoria Método Microdiseccion Manual Amplificación del ADN cromosómico microdisecciondo GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification Kit (wga4-Sigma) Reamplificación del ADN cromosómico microdisecciondo GenomePlex® WGA Reamplification Kit (wga3-Sigma) Generar Sonda Nick translation Chromosome Painting Amplificación por PCR de varias secuencias Localización por FISH Análisis de la secuencias GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification Kit (wga4-Sigma) Ventajas - Poca cantidad de ADN inicial - Mayor representación del genoma Inconvenientes -Fragmentación del ADN - Ligación de adaptadores -Tamaño medio de los fragmentos amplificados es de 400pb Gribble et al., 2004 http://www.biocompare.com/technicalarticle/1548/ Método Microdiseccion Manual Amplificación del ADN cromosómico microdisecciondo GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification Kit (wga4-Sigma) Reamplificación del ADN cromosómico microdisecciondo GenomePlex® WGA Reamplification Kit (wga3-Sigma) Generar Sonda Nick translation Chromosome Painting Amplificación por PCR de varias secuencias Localización por FISH Análisis de la secuencias Amplificación de Secuencias por PCR Secuencias Cebadores Secuencia Oligonucleótidos ADNr 18S (ITS-1 e ITS-2) its4 ATA TGC TTA AAT TCA GCG GG 5S-nRNA.F1 AAC GAC CAT ACC ACG CTG AA 5S-nRNA.R1 AAG CGG TCC CCC ATC TAA GT ADN 5S GCT TTT GTA CAC ACC GCC CGT CGC Histona H3 H3aF ATG GCT CGT ACC AAG CAG ACV GC (Juan J. Pasantes) H3aR ATA TCC TTR GGC ATR ATR GTG AC Histona H4 H4F2s (Pineau et al. 2005) TSC GIG AYA ACA TYC AGG GIA TCA C Tm Tamaño 56ºC 9001000pb 52ºC 90pb 48ºC 400pb - - H4F2er CKY TTI AGI GCR TAI ACC ACR TCC AT 210 pb H4F2ir GTI ACI GTC TTS CKY TTG GCG TGC TC 180pb Resultados GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification Kit (wga4-Sigma) Chromosome Painting Eyprepocnemis plorans Microdisección de B24 Hibrida con los bloques de heterocromatina de los cromosomas B y A B24 X B24 X B24 X Chromosome Painting Eyprepocnemis plorans Microdisección de B24 Hibrida en todo el cromosoma B1 También hibrida con el cromosoma B que aparece en la poblaciones de Turquía B1 B Chromosome Painting Eyprepocnemis plorans Microdisección del X 1ª microdisección: región heterocromática de los cromosomas A y B No hibrida con el todo cromosoma X, solamente con la región paracentromérica X B24 B24 B24 B24 X Chromosome Painting Eyprepocnemis plorans Cromosoma X 2ª microdisección: igual resultado, que en el caso anterior. Pinta el brazo corto del B24 X B24 B24 Amplificación de secuencias Eyprepocnemis plorans Ribosómico ITS-1 18S ITS-2 5,8S 28S E. plorans ADN Ribosómico amplificado a partir del microdiseccionado Señal de FISH ADNr μB (NORs primarias) S10 X región paracentromérica B24 región distal S9 S9, S10, S11 banda paracentromérica S9 S11 S11 X X S10 B24 B24 Amplificación de secuencias Eyprepocnemis plorans ADN 5S E. plorans ADN 5S Señal de FISH X sin señal B24 sin señal X L1, L2, L3 sin señal M4, M5 banda intersticial M7 sin señal M6, M8, S9, S10, S11 banda proximal B24 Amplificación de secuencias Eyprepocnemis plorans Genes de las histonas: H3 y H4 Cluster de los genes de las histonas en Drosophila melanogaster: h2b h2a h4 h3 h1 Los genes de las histonas H3 y H4 son las más conservadas E. plorans Histonas Colocalización de H3 y H4 Señal de FISH: X sin señal B24 sin señal L2 región distal H3 X H4 B24 B24 L2 Amplificación de secuencias Resultados Eyprepocnemis plorans Genes ADNr PCR gDNA FISH X B As X B Homología 956 si si S9, S10, S11 (a) si si ADNr Chorthippus parallellus ADN 5S 90 si si no ADN 5S Mytilus edulis H3 400 si si M4, M5, M6, no S9, S10, S11 L2 no no H4‐er 210 no si ‐ no no H3 Locusta migratoria μX‐ H3 Graphocephala atropunctata H4 Mus musculus H4‐ir 180 si si L2 no no a NORs primarias Chromosome Painting Locusta migratoria Microdiseccionado del B Pinta los cromosomas B y la región paracentromérica del X y de algunos As X B B B X X B B B Chromosome Painting Locusta migratoria Microdiseccionado del X Pinta la región paracentromérica del X y los cromosomas B B B X B X X X B B B Amplificación de secuencias Locusta migratoria ADNr ADNr 5S L. migratoria ADNr amplificado a partir de microdiseccionado Señal de FISH: X sin señal L2, M6 región distal B sin señal S9 región paracentromérica L2 B S9 M6 M6 L2 S9 B L. migratoria ADN 5S Señal de FISH: X sin señal M4 región intersticial B sin señal M8 región proximal S9, S11 región proximal X B X X B Amplificación de secuencias Locusta migratoria Genes de las histonas: H3 y H4 L. migratoria Histonas: H3 B M8 L. migratoria Histonas: H3 y H4 Colocalización de la H3 y H4 Señal de FISH: X sin señal B con señal B M8 señal proximal H3 H4 Amplificación de secuencias Resultados Locusta migratoria FISH PCR gDNA X B 956 si si L2, M6, S9(a) no ADN 5S 90 si si no no aun no secuenciado H3 400 si si M8 no si H4‐er 210 no si ‐ ‐ ‐ H4‐ir 180 si si M8 no Genes ADNr a NORs primarias As X B Homología no ADNr Chorthippus parallellus H3 Locusta migratoria μX‐ H3 Graphocephala atropunctata H4 Mus musculus si H4 Mus musculus Conclusiones Eyprepocnemis plorans Chromosome painting - El cromosoma X y el B24 comparten secuencias de ADN entre ellos y con la mayoría de los autosomas (ADNsat y ADNr) Amplificación de secuencias: - En el cromosoma X y B24 están presentes los genes ADNr 45S, y también el gen 5S y los genes para las histonas aunque estos dos tipos génicos no se observan por FISH. Por tanto no podemos descartar la hipótesis inicial del origen intraespecifíco del B a partir del X. Esperamos que el análisis comparativo de las secuencias amplificadas a partir de los microdisecionados X y B proporcionen información mas decisiva para esclarecer el origen del B. Conclusiones Locusta migratoria Chromosome painting: -X y B comparten secuencias repetidas que también están presentes en muchos de los autosomas. Amplificación de secuencias: - Los cromosoma X y B parecen contener secuencias de los genes ADNr 45S y 5S, así como genes para las histonas H3 y H4, aunque en este caso las H3 y H4 se observan por FISH en el cromosoma B pero no en el X. - La presencia mayoritaria de H3 y H4 en los cromosomas 8 y B postula a este autosoma como posible origen del B. Grupo de Genética Evolutiva. UGR Gracias por su atención
