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(c) the ORIGINS team
asilar AND
Preparar 3 ml de H2O
para recoger células
mucosas
Centrifugar mediante
contrapeso durante
30 seg short spinning,
decantar lo que sobresale
y agregar 30 µl dd H2O
Sedimentar Chelex beads
mediante short spinning
durante 30 seg.
¡Nunca olvidar utilizar el
contrapeso exacto!
Masticar un poco las
mejillas interiores, luego
enjuagar con 10 ml de
solución de agua o NaCl
Agregar Chelex(R) para
quitar iones de Mg y para
desactivar los ADN
Quitar el sobrenadande
con cuidado.
¡No llevar Chelex beads!
Mezclar bien las células
enjuagadas de tipo
vórtex durante 30 seg
para obtener una
solución homogénea
Echar 1 ml de la solución
en un recipiente
Eppendorf
Agregar Chelex (R) y
resuspender pellet de
tipo vórtex
Alcance del choque de
calor durante 10 min a
99° en baño maría o
bloque de calefacción
Transferir el ADN
templado en el recipiente
Eppendorf y almacenarlo
a -20° o seguir
empleándolo
p.ej. como templado en
PCR. Tomar 2,5 µl de
ADN + 22,5 µl del
Mezclado PCR o H2O
en caso de utilizar
PCR-beads
Biotechnologisches Gymnasium Ettlingen (c)2008 mln/swe/comeniusteam
Montag, 3. Mai 2010
Preparación de un gel agarosis
Conc. de tampón(50x),
agarosis, balanza,
frasco Erlenmeyer
100ml, vaso de laboratorio 100/400ml,probeta (250ml), pipeta
ajustable
Formar un platillo de
la balanza de papel
de aluminio.
Marcar la línea de
relleno con un
rotulador o ajustar el
peso total de tara en
la balanza.
Preparar 300 m, 1x
buffer
.... añadir 6 ml del
buffer en la probeta.
Llenar a 150 ml con
agua destilada,
añadir la solución en
el vaso, añadir 150 ml
más del agua
destilada en el vaso.
Para obtener un 1 %
de gel de agarosis
pesar 400 mg de
agarosis.
Echar 40 g de la
solución de buffer en
un frasco Erlenmeyer
de 100 m.
Agregar la cantidad
pesada de agarosis
en la solución. ¡NO
agitar!
Poner el vaso por
encima del frasco
para limitar la pérdida
de agua.
Calentar con 400
vatios durante 3
minutos hasta que la
solución esté clara.
Repetir en caso
necesario.
Igualar la pérdida de
agua con agua
destilada. Evitar la
formación de
burbujas y mezclar.
Verter el gel a
temperatura corporal
Ajustar la pipeta a 3
ml, pipetear 2 veces
para ....
Biotechnologisches
Gymnasium
Ettlingen
(c)2008-10 mln/swe/comeniusteam
Biotechnologisches
Gymnasium
Ettlingen
(c)2008 mln
Sonntag, 2. Mai 2010
Pipetación
Para la pipetación se
necesitan pipetas inclusive el estante, así
como unas nuevas
puntas adecuadas
(¡observar el código
de color!).
La punta debe apuntar
hacia abajo, los dedos
hay que ponerlos
como demostrado
alrededor de la pipeta
La apertura de la caja
debe señalar al
sentido contrario del
cuerpo, para que no
entren gérmenes en la
caja
Para cambiar la
punta, hay que sacar
la nueva punta desde
arriba sin ejercer
mucha presión.
La cifra de abajo indica
el vol. máximo, la de
arriba el vol. mínimo.
Hay que elegir las pipetas de manera que el
volumen no esté en los
límites
El volumen de la
pipetación se ajusta
mediante las ruedas
negras. Cuidado: se
puede producir una
confusión con las
pipetas amarillas.
Presionar hasta que se
produza una
PRIMERA resistencia
y sumergir la punta.
Después disminuir
lentamente la presión
De esta forma se
absorba el volumen
ajustado del líquido en
la punta.
Así es la posición de
los dedos cuando el
líquido esté
absorbado.
Si se quiere añadir
más líquido hay
que observar que
la punta se
encuentre directamente encima del
líquido.
Cuando se alcance a
la primera resistencia, la punta todavía
no está completamente vaciada, pero
el volumen ajustado
se ha quitado ya.
Aquí la punta está
completamente vaciada.
Emplear si el volumen está
debajo de 20 µl a causa
del efecto de adhesión del
material de
puntas.
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Ettlingen
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Sonntag, 2. Mai 2010
PCR Rección en cadena de polimerasis Amersham beads
Procedure 1
Variant A
0,2 ml – concentración
sistema con calefacción con tapa
Amersham beads
con
tope/polimerasis
Procedure 2
0,5 ml – concentración
sistema con calefacción sin tapa,
opcional con cubierta
de aceite mineral
opcional:
adición del tope de
aplicación KR kresolrot en 6M Glc en agua
Variant B
pipetear todos los
reactivos
Programar el autómata
del laboratorio según
indicado o llamar el
programa instalada
Batch 1A
Batch 2A
2,5 !l Template
1 !l Primer forward
1 !l Primer reverse
20 !l dd H2O
= 2x concentración 1A
colocar las concentraciones sobre hielo
hasta el inicio de PCR
Batch 1B
2,5 !l Template
4 !l dNTP-Mix
13 !l dd H2O
1 !l Taq-Polymerase
1 !l Primer forward
1 !l Primer reverse
Batch 2B
colocar las concentraciones sobre hielo
hasta el inicio de PCR
95°C 60s Lead in
Cycle 1-35
XX°C 30s Annealing
72°C 90s Polymerize
95°C 30s Denature
XX°C 30s Annealing
72°C 3m Polymerize
95°C 5m Leadout
4°C store
XX= according to primer
= 2x Batch 1B
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Sonntag, 2. Mai 2010
Agarose-Gel-Electrophoresis
Electroforesis por geles de agarosa
Sacar el soporte del gel
y ponerlo hacia atrás
para que la peinilla
señale hacia el lado del
eléctrodo negativo
(negro)
Agregar (1X) el buffer
de electroforesis. Se
necesitan unos 260 ml.
Emplear una pipeta
(20200!) con
codificación
amarilla, ajustar a 30
µl para pruebas
y
a 5-8 µl para marcador.
Observar los consejos
de las instrucciones
durante la pipetación.
Emplear siempre una
nueva punta de pipeta.
Empezar con el
marcador en la
segunda pista, si se
emplean todas las
pistas posicionar el
marcador en la pista
media.
Después aplicar las
pruebas.
¡Cuidado! ¡NO penetrar
con el gel hacia abajo!
Observar
codificación
Be sure tolamatch
the
de
color
de
los
cables,
colors when plugging,
meter cada uno de los
e.g.
red lead
contactos
en into
las red
jack
plug.
Adjust
voltage
hembrillas del mismo
to 120V.
color.
Ajustar 120 V.
Start the
procedure
by
Iniciar
proceso
mediante
pressing
the
el símbolo
derunner
marcha.
symbol. Watch
out burfor
Observar
si suben
bujas
gas en
depórising de
bubbles
in el
the
sito
buffer.
¿La marcabuffer
chambers
and the
ción
de color
se mueve
reference
colors
moving
hacia
ladodirection.
rojo?
in the el
right
Según
el buffer
de used
Depending
on the
aplicación
empleado
se
stain, you see
a pattern
visualizan líneas de
of
different color bands.
color.
Ephoresis
El procesousually
durarátakes
unos
about
30 min
30
minutos.
Place
the la
lidtapa
tightly
on
Empujar
y fijarla
the camber
and plug
(¡contactos!)
Meter
cable
the
leadselinto
theen las
hembrillas
del bloque
resective jacks
of the de
alimentación
power supply
El gel debe estar
cubierto por el líquido.
El nivel del líquido tiene
que estar 5 mm por
encima de la superficie
del gel.
Después de añadir el
buffer se puede sacar
la peinilla con cuidado.
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Sonntag, 2. Mai 2010
Restriction
DNA - Restriction
de ADN
Pipettor(amarilla,
(20:200),20:200)
Pipeta
tips (yellow
code)
puntas
de pipetas
Eppendorf-tubes
recipientes
Eppendorf
soporte
rack
caja
de hielo
ice-box
cronómetro
lab timer
Label tubes for double
Marcar
recipientes
digest as:
E1,
E2,
C, H20,
reacciónE12,
de combinación
Buffer
for E12,
singleK,digest:
con:
E1,orE2,
H20,
Buffer:
H2O, B(uffer), E(nzym)
Hand
b(uffer), e(nzima)
2O, negative
C(ontrol)
y control negativo.
Pones
los vasos
Place reaction-tubes
into
Eppendorf
en el
rack,
Soporte
carefullyprevisto.
watch samples,
Sigue
orden.
do notelmix
them up.
Poner la punta
Adjust pipettor
adecuada
en lato
pipeta y
correct el
volume
and use
ajustar
volumen
correcto.
proper tip (color code!)
Llenar
los vasos
See piptting
scheme for
Eppendorf
proceeding.según
indicado – véase tabla.
Touch Epi-tube always at
¡Tocar el vaso en el
the brim only to avoid
cuello y NO tocarlo
warming of the contents.
como en la foto!
DO NOT act as shown!
¡También es posible de
Pipetting into the lid is an
pipetear en la tapa!
accepted procedure.
Recogida
de los amounts
reactivos
Collect pipetted
mediante centrifugación
of liquid by short spinning
utilizar ajuste shortspin
DO NOT15
forget
balance
durante
seg. to
Emplear
the rotor by an equal
contrapeso
counterweight
prepare H20 in Epi-tube
Echar H20 en el previsto
for use in restriction
vaso de Eppendorf.
reaction
Tener
Enzymes
preparadas
wait on ice
las
enzimas
for action!sobre hielo.
¡Utilizar
unaanueva
Always use
new tip!
punta para cada
pipetación!
Carefully comply with
¡Observar la
Labchart „ How
instrucción
para to
la do
pipetting
successfully“
pipetación!
Adjust
to 37°C
Poner incubator
a 37 grados
el
armario
de whole
incubación
prior
to the
o bloque de calefacción.
procedure
Duración de incubación
es
de unos 30
proceeding
or min.,
después
freeze at guardar
-20°C forsobre
l
hielo
ong o permanente
mentea
-20°C.
terrn stock
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