desarrollo de un inóculo con diferentes sustratos mediante

Transcripción

DESARROLLO DE UN INÓCULO CON DIFERENTES SUSTRATOS
MEDIANTE FERMENTACION SOLIDA SUMERGIDA
POR:
M en C. Daniel Díaz Plascencia
Correo: [email protected]
Facultad de Zootecnia y Ecología
Universidad Autónoma de Chihuahua, Chih., México.
Chihuahua, Chih., México
Junio, 2009
CONTENIDO
Página
LISTA DE GRAFICAS……………………………………………………….
iv
LISTA DE FIGURAS…………………………………………………………
vi
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………
1
OBJETIVO GENERAL……………………………………………………….
3
Objetivos Específicos……………………………………………….
REVISION DE LITERATURA……………………………………………….
3
3
La creación de la Manzarina………………………………………..
3
La Manzarina en la Alimentación Animal………………………….
4
Fermentación Solida…………………………………………………
5
Procesos de la Fermentación en Estado Sólido………………..
9
Fermentación Semi Sólida………………………………………….
11
Fermentación Sumergida…………………………………………...
12
Fermentación Liquida……………………………………………….
13
Principales Características del Cultivo Microbiano
14
Condiciones de Crecimiento de Saccharomyces Cerevisiae….
14
Ventajas y desventajas de la fermentación en estado sólido
16
Comparada con el cultivo sumergido en líquido………………...
Optimización de Medios de Cultivo……………………………….
18
Metabolismo Aeróbico……………………………………………...
19
Uso de las levaduras obtenidas de la manzarina en la
20
alimentación animal……………………………………………………
ii
MATERIALES Y METODOS………………………………………………...
22
Tratamientos…………………………………………………………...
23
Mediciones en Muestras Líquidas………………………………….
25
Análisis Estadístico…………………………………………………..
29
RESULTADOS Y DISCUSION..........................................................
31
pH……………………………………………………………………….
31
Temperatura……………………………………………………………
37
Conteo de Levaduras………………………………………………...
42
Nitrógeno Amoniacal…………………………………………………
43
Azucares Solubles……………………………………………………
52
CONCLUSIONES………………………………………………………………
59
LITERATURA CITADA……………………………………………………….
60
iii
LISTA DE GRAFICAS
Gráfica
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Página
Comportamiento del pH de los diferentes sustratos con la
levadura A durante la FSS………………………………………….
33
levadura B durante la FSS………………………………………….
34
levadura C durante la FSS………………………………………….
35
levadura D durante la FSS…………………………………………..
36
Comportamiento de la temperatura en los diferentes sustratos
con la levadura A durante la FSS…………………………………..
38
con la levadura B durante la FSS…………………………………..
39
con la levadura C durante la FSS………………………………….
40
con la levadura D durante la FSS…………………………………..
41
Producción de levaduras en los diferentes sustratos con la
levadura A durante la FSS………………………………………….
44
levadura B durante la FSS………………………………………….
45
levadura C durante la FSS………………………………………….
46
levadura D durante la FSS…………………………………………..
47
Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura A
durante la FSS………………………………………………………
48
iv
14
15
16
17
18
19
20
Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura B
durante la FSS………………………………………………………..
49
Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura
C durante la FSS…………………………………………………….
50
Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura
D durante la FSS……………………………………………………
51
Comportamiento de azucares solubles
en los diferentes
sustratos con la levadura A durante la FSS……………………..
54
en los diferentes
sustratos con la levadura B durante la FSS………………………
55
en los diferentes
sustratos con la levadura C durante la FSS……………………..
56
en los diferentes
sustratos con la levadura D durante la FSS…………………….
57
v
LISTA DE FIGURAS
Figura
1
Página
Cuadricula de hematocímetro (Cámara de Neubauer)………….
vi
27
INTRODUCCIÓN
La fermentación en estado sólido (FES), la fermentación líquida (FL) y la
Fermentación solida sumergida (FSS) son un proceso que permite el
aprovechamiento de fuentes no convencionales de carbohidratos para la
alimentación animal mediante el uso de microorganismos.
Levadura es un nombre genérico que agrupa a una variedad de
organismos unicelulares, incluyendo especies patógenas para plantas y
animales, y especies no solamente inocuas sino de gran utilidad (González y
Valenzuela 2003), Saccharomyces cerevisiae es una levadura que constituye el
grupo de microorganismos más íntimamente asociado al progreso y bienestar
de la humanidad; su nombre deriva del vocablo Saccharo (azúcar), myces
(hongo) y cerevisiae (cerveza) (Hernández 1999).
El
proceso
de
producción
de
proteína
unicelular
es
una
vía
biotecnológica adecuada para el aprovechamiento de desechos industriales
ricos en carbohidratos. El principal factor limitante en la generación de proteína
unicelular es el alto costo de las fuentes de carbono, por lo que el uso de
subproductos es ideal (Duran, 1989). El emplear manzana de desecho o
pomasa de manzana que es el residuo generado en el proceso de extracción de
jugo de manzana y representa entre 15 y 20% de la fruta procesada (Díaz,
2006). Así como emplear el suero de leche en este proceso permitiría darle
valor agregado, al obtenerse proteína de calidad para la alimentación animal, y
a la vez disminuir su demanda biológica de oxigeno (DBO), (Ghaly y Kamal
2004).
1
2
La manzarina es un producto fermentado obtenido a partir de manzana o
de subproductos de manzana (Malus domestica), este producto fermentado
tiene un valor proteico mayor que el que tienen los productos de los que se
obtiene (bagazo de manzana o manzana de desecho; Becerra, 2006; Díaz,
2006).
El proceso de obtención de Manzarina se desarrollo con base en el
aplicado para la producción de Saccharina (Díaz, 2006), el cual es el producto
de la FES de la caña de azúcar limpia y sin cogollo, en ese proceso, se
presenta un incremento en la calidad nutritiva del sustrato debido al incremento
de la concentración de proteína además de ciertos cambios que se presentan
en los carbohidratos estructurales (Elías et al., 1990). En otros trabajos se ha
mostrado como la FES es utilizada para la mejora de la calidad nutritiva de otro
tipo de subproductos agroindustriales (Peñaloza et al,. 1985; Reíd, 1985).
La manzana (Malus domestica) tiene propiedades benéficas para el
organismo que lo consume como alimento. Esto se ha atribuido principalmente
a su contenido de polifenoles (Alberto et al., 2006). Considerando que la
Manzarina es obtenida por fermentación en estado sólido a partir de
subproductos de la cadena productiva de la explotación del manzano, teniendo
una mejora en la calidad nutritiva resultado del incremento de proteína (Becerra,
2006; Díaz, 2006) generado por el proceso de FES, la Manzarina podría
conservar alguna de las propiedades benéficas de la manzana.
El interés por producir proteína unicelular fue estimulado por agencias
internacionales relacionadas con la salud, alimentación y agricultura ante la
3
evidencia de una escasez de proteína a nivel mundial (Bu'Lock y Kristiansen
1991), es por esto que la búsqueda de fuentes proteicas es vital (Chacon 2004).
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la fermentación solida sumergida (FSS) de cuatro sustratos con
tres levaduras comerciales y una sepa de levadura de manzarina todas del
genero
Saccharomyces cerevisiae, mediante su desarrollo en condiciones
aérobicas utilizando la fermentación solida sumergida.
Objetivos Específicos
Monitorear el comportamiento de los sustratos, para el cultivo de S.
cerevisiae en medio líquido. Verificar la funcionalidad de los fermentadores para
el cultivo del microorganismo. Evaluar y monitorear el crecimiento de levadura
S. cerevisiae en distintos sustratos. Evaluar y monitorear el crecimiento de S.
cerevisiae a temperatura ambiente. Evaluar y monitorear el pH, Temperatura y
su comportamiento en la producción de S. cerevisiae. Evaluar la producción de
Azucares solubles, Evaluar la producción de Nitrógeno Amoniacal (NH3).
Evaluar la producción de levaduras y su conteo de UFC.
REVISION DE LITERATURA
La creación de la Manzarina
Becerra, (1998), Díaz, (2006) desarrollaban un proceso biotecnológico
del cual obtuvieron un producto que llamaron Manzarina (Becerra y Díaz, 2006)
el cual usan en la alimentación animal, que se obtiene de la fermentación en
estado sólido de la manzana. En este proceso la energía de los carbohidratos
4
disponibles y la urea como fuente de nitrógeno son utilizadas para el
crecimiento de la microbiota epifita de la manzana.
El crecimiento microbiano es el factor principal en la obtención de la
Manzarina, es un fenómeno complejo por el número de variables que se
involucran y por la interacción de especies que se origina en este ecosistema.
Para la obtención de Manzarina, se requiere un molino de martillos o un
extrusor, superficie de asfalto o cemento para la fermentación y secado y
disponer de urea y sales minerales para su enriquecimiento. En los últimos
años ha cobrado gran importancia el enriquecimiento proteico de residuos
agroindustriales y subproductos ricos en celulosa mediante sistemas de
fermentación en fase sólida con destino a la producción de proteína microbial.
La creación de la Manzarina como alimento alternativo para consumo
animal, está llamada a constituir un elemento importante en el desarrollo de la
producción animal en el Estado de Chihuahua, demostrando la factibilidad de
aprovechar los recursos alimenticios de bajo valor nutritivo, como son los subproductos de manzana a través de la fermentación en estado sólido.
El uso de la fermentación en estado sólido de subproductos de manzana
constituye una alternativa para el aprovechamiento de estos, evitando la
contaminación ambiental provocada por la rápida descomposición de los
mismos (Díaz, 2006).
La Manzarina en la Alimentación Animal
La manzarina ha sido utilizada como ingrediente en la elaboración de
bloques multinutricionales (Rodríguez et al., 2006a) los cuales fueron evaluados
en la alimentación de becerros en engorda (Rodríguez et al., 2006c). Se ha
5
obtenido a mediana escala en condiciones rusticas para utilizarla y evaluarla
como ingrediente en dietas para rumiantes. Se encontró que puede sustituir
parte de los ingredientes en dietas de vacas lecheras, con incrementos en la
producción láctea (Gutiérrez, 2007) y beneficios en la salud del animal
(Gallegos, 2007). Han sido evaluadas como ingrediente en la dieta para la
alimentación de borregos en engorda (Hernández, 2008) y como parte del
suplemento en alimentación de bovinos de carne (Rodríguez et al., 2006a y
Rodríguez et al., 2006b). Se encontró que puede disminuir el costo de las
raciones.
Rodríguez et al., (2006c) reportaron que becerros en engorda,
alimentados con bloques multinutricionales, elaborados con un 14.6% de
manzarina como ingrediente puede tener ganancias diarias de peso de 0.570 kg
d-1 ; la dieta se baso en el uso de forraje verde picado, ensilaje y rastrojo de
maíz y como concentrado proteico, mineral y energético, se utilizaron los
bloques multinutricionales. El consumo de bloque fue de 1.52 Kg a -1 d-1, el costo
de la materia prima para la elaboración de los bloques fue menor al utilizar la
manzarina (Rodríguez et al., 2006a), comparado con el costo de la materia
prima que se requiere para elaborar bloques multinutricionales con harinolina
como principal fuente de proteína. Los minerales consumieron cerca de 0.222
kg d-1 de manzarina. La manzarina puede disminuir los costos de alimentación.
Fermentación Solida
La fermentación sólida puede ser definida como un cultivo de
microorganismos adheridos a un soporte sólido poroso y humedecido en el cual
el medio líquido está extendido en una capa muy fina en contacto con una
6
interface aérea. Las bacterias, levaduras y hongos son los microorganismos
que pueden crecer en fermentación sólida, pero la mayoría de las
investigaciones se llevan a cabo con hongos filamentosos. El crecimiento en
forma de micelio y su tolerancia a bajas actividades de agua y condiciones de
alta osmolaridad hacen que los hongos sean la microflora natural más
adecuada para la fermentación sólida.
Pandey et al., (2001) define como fermentación en estado sólido al
crecimiento de microorganismos en un material solido y húmedo, siendo el
material solido la fuente energética, el sustrato también puede estar formado
por un material solido inerte y húmedo, al cual se le adiciona una fuente
energética. A este proceso, por sus iníciales se le conoce como FES.
En un proceso de FES, generalmente no se requiere agregar agua si el
sustrato tiene un contenido alto de humedad (Pandey et al., 2001) y no
necesariamente se tiene que inocular con alguna especie de microorganismo, si
existe la posibilidad de potencializar el crecimiento de algunas de las especies
microbianas de las que se encuentran de manera natural en los sustratos;
algunos de estos tienen una amplia diversidad de microorganismos, en este
caso se tiene un sistema heterogéneo (Valiño et al., 2002).
El modelo de crecimiento miceliar da una ventaja adicional los hongos
filamentosos sobre los microorganismos unicelulares en la colonización de la
matriz sólida y en la utilización de los nutrientes del medio de cultivo. El modelo
básico de crecimiento de los hongos es una combinación del crecimiento apical
con la generación de nuevas hifas por ramificación. Mientras que el crecimiento
apical se lleva a cabo de manera lineal, la ramificación se lleva a cabo de
7
manera exponencial y como resultado se logra una alta velocidad de
crecimiento y una gran capacidad de cubrir eficientemente la superficie de
cultivo.
La estructura de la pared celular unida al crecimiento por las puntas y la
ramificación da a los hongos una estructura sólida y firme que les permite
penetrar en el interior de la matriz sólida. Las enzimas hidrolíticas son
excretadas por las puntas de las hifas sin que se diluyan como en el caso de la
fermentación líquida lo que hace la acción de las enzimas hidrolíticas muy
eficiente y les permite penetrar en la mayoría de los substratos sólidos, lo que
aumenta la disponibilidad de los nutrientes del interior de los substratos
(Raimbault, 1998).
Existe un gran interés en la utilización de S. cerevisiae para transformar
desechos agroindustriales en productos bioquímicos de valor comercial, por
medio de la fermentación sólida (FS), porque se ha encontrado que durante la
FS se manifiestan características fisiológicas diferentes en los microorganismos
en comparación con la Fermentación liquida (FL). Entre los productos
comerciales más importantes, se encuentran algunas enzimas que son
excretadas al medio y cuya producción por FL se presenta en forma muy
disminuida debido a los fenómenos de represión catabólica (Ramesh y
Lonsane, 1991a; Solís-Pereira et al., 1993). A veces, las enzimas producidas
por FS tienen características modificadas, como un aumento en su termo
resistencia,
menores
tiempos
de
producción
y
mayor
actividad
(Hesseltine,1972; Moo-Young et al., 1983; Tengerdy, 1985; Grajek y Gervais,
8
1987; Pandey, 1992; Shankaranand et al., 1992; Solís-Pereira et al., 1996;
Acuña-Argüelles; 1995).
Los efectos que se derivan de la utilización de FS sobre los
microorganismos son múltiples como modificaciones en el transporte de
azúcares, la composición de la pared, la membrana celular y en la actividad
enzimática (Grajek y Gervais, 1987; Pandey, 1992). Mientras que las bacterias
y las levaduras requieren de alta actividad de agua (A, > 0.98), los hongos
filamentosos pueden crecer con valores de Aw tan bajos como 0.85, y por esta
razón, son microorganismos muy bien adaptados para la fermentación sólida.
Pandey, (1992) sugiere incluso que un bajo nivel de Aw favorece la germinación
y el crecimiento miceliar de los hongos (Pandey, 1992; Raimbault, (1998).
De acuerdo con Raimbault (1998) el soporte de la fermentación sólida
debe cumplir con varios requerimientos como son: Poseer una matriz porosa
que puede ser biodegradable o inerte, y requiere presentar una gran superficie
de área por volumen dentro del rango de l03 o l06 cm2/cm3 que permita el
crecimiento microbiano en la interface sólido-líquido. Debe absorber agua en
una o varias veces su propio peso con una actividad de agua relativamente
grande en la interface sólido-líquido para poder permitir una alta velocidad de
los procesos bioquímicos.
La mezcla de oxígeno con otros gases y aerosoles deben pasar a través
del cultivo con relativa facilidad, la superficie sólido-líquido debe ser un buen
hábitat
para
permitir
el
crecimiento
de
microorganismos que
crecen
rápidamente como bacterias y hongos. La matriz sólida debe resistir la
compresión y un mezclado suave que podría requerir cada tipo de
9
fermentación. Esto requiere partículas pequeñas y granulosas que no tiendan a
unirse unas a otras.
La matriz sólida debe estar libre de contaminantes y de inhibidores del
crecimiento de los microorganismos y debe ser capaz de absorber o contener
substratos para el crecimiento microbiano como carbohidratos, fuentes de
nitrógeno y sales minerales. Estas condiciones son cumplidas por la mayoría de
los soportes naturales utilizados en la fermentación sólida como el bagazo de
caña, el salvado de trigo, etc. Existen también soportes inertes que cumplen
con estos requerimientos y que se han utilizado para la fermentación sólida
como la amberlita y especialmente, el poliuretano.
Procesos de la Fermentación en Estado Solido
Existe gran variedad de sustratos susceptibles de ser utilizados en
procesos de fermentación en estado sólido (FES), como la remolacha forrajera
(Beta vulgaris) también se puede obtener etanol, inoculando con levaduras
Saccharomyces cerevisiae (Gibbons y Westby, 1986). En este trabajo no se
menciona si existe la posibilidad de obtener algún subproducto solido para la
alimentación animal.
Del procesado del grano de café (Coffea arábiga o Coffea canephora),
durante el descascarado para la obtención del grano de café verde se obtiene
un subproducto llamado cascarilla. Este puede ser procesado por FES al
inocularlo con Aspergillus niger (Peñaloza et al., 1985). El beneficio es el
incremento de la calidad nutritiva del producto fermentado debido al aumento en
la concentración de aminoácidos. En la alimentación de pollos en crecimiento
con dietas que incluyen hasta un 10% de cascarilla de café fermentada, se
10
puede obtener una conversión alimenticia similar a la de pollos alimentados con
una ración preparada con ingredientes comúnmente utilizados (Peñaloza et al.,
1985). Los costos de producción se pueden disminuir con este tipo de raciones.
Incluso, las camas de pollinaza con cascarilla de café pueden ser expuestas a
la FES (Calderón et al., 2005). El resultado de este proceso es la mejora en la
calidad nutritiva del producto fermentado debido a incrementos en la
concentración de proteína verdadera (PV). Durante la FES de los subproductos,
parte de la materia seca disponible y de los carbohidratos estructurales son
utilizados como fuentes de energía para el crecimiento de la población de
microorganismos, mismos que originan el incremento en la concentración de
proteína verdadera en el subproducto.
La Sacchaharina es un producto obtenido por FES de la caña de azúcar,
limpia y sin cogollo. Este proceso biotecnológico utilizado en Cuba, aprovecha
la población de microorganismos y el alto contenido de azucares fermentables
presentes de manera natural en la caña de azúcar (Saccharum officinarum). La
ventaja de la Sacchaharina es que tiene un valor proteico mayor a la caña de
azúcar de la cual se obtuvo (Elías et al., 1990). La Sacchaharina puede sustituir
parte del concentrado en la dieta en la alimentación animal.
Valdivie et al., (1990), evaluaron la respuesta productiva de pollos de
engorda al ser alimentados con dietas que incluían 0,5 y 10% de Sacchaharina,
ellos recomiendan incluir como máximo un 10% de Saccharina en ese tipo de
dietas, debido a que este producto fermentado tiene una alta concentración de
fibra. Para obtener Sacchaharina se agrega urea como fuente de NNP para la
síntesis de proteína y sales minerales para potencializar el crecimiento de
11
poblaciones de levaduras y bacterias presentes en el sustrato (caña de azúcar).
El proceso es sencillo, de bajo costo y no necesita equipo sofisticado la
(Sacchaharina rustica).
También se puede producir Sacchaharina a nivel industrial en
condiciones controladas (Sacchaharina industrial), lo que requiere de inversión
económica alta en equipo lo que puede hacerlo incosteable. No se requiere la
adición de agua, no se generan residuos y el producto fermentado se retienen
las vitaminas, aminoácidos y enzimas producidos por los microorganismos, los
cuales son de utilidad para el animal que los consume vivos (Vivas y Carbajal,
2004). En Cuba, con un proceso tecnológico similar al que se utiliza para la
obtención de Sacchaharina, se obtiene otro producto al que se le llama bagazo
rico en proteína o Bagarip (Pedraza, 2000). Para producirlo se prepara una
mezcla de cachaza, miel final (melaza) de la industria del azúcar, bagazo de
caña, fuentes de nitrógeno no proteico (NNP) y fosforo. Esta mezcla se inocula
con levaduras para su fermentación. El Bagarip, tiene un contenido de fibra
cruda más bajo (FC, <15% en base ceca) que los valores que se observan en la
mezcla de cachaza, miel y bagazo sin fermentar. Este producto puede incluirse
en dietas para no rumiantes como sustituto parcial de los ingredientes
tradicionalmente usados y como suplemento en la dieta de rumiantes
alimentados con forrajes.
Fermentación Semi Sólida
Es este tipo de fermentación, utilizada básicamente para hongos, el
microorganismo se desarrolla en la superficie húmeda de un material sólido, el
cual generalmente es algún grano de cereal procesado, aunque se han
12
realizado intentos para utilizar materiales de desecho. Esto permite al hongo
crecer en condiciones similares a las encontradas en la naturaleza; las esporas,
los propágulos infectivos mediante los cuales el hongo sobrevive e infecta
insectos, son producidas en el aire. Aunque las fermentaciones semi sólidas
son relativamente fáciles de desarrollar en pequeña escala, el escalado de las
mismas a las proporciones necesarias para productos comerciales es bastante
difícil (Tavorsky, 1992). En el caso de los hongos entomopatógenos, los países
en vías de desarrollo han aplicado métodos de fermentación en sustrato sólido,
pero estos presentan muchas restricciones para la producción a nivel comercial.
Por un lado, el escalado se dificulta por problemas asociados con la
esterilización del sustrato, intercambio gaseoso, control de la temperatura,
mantenimiento de cultivos puros y recuperación del producto a partir del
sustrato. Por otra parte, el tiempo de fermentación necesario para la
esporulación en sustratos sólidos (generalmente requiere semanas), la cantidad
de personal y la infraestructura (grandes espacios físicos), son factores que
aumentan los costos de gran manera en este tipo de metodologías (Deshpande,
1999; Jackson, 1997; Jackson et al., 2004).
Fermentación Sumergida
Frente al panorama descrito antes para la fermentación semi sólida, la
fermentación sumergida se perfila como el método más económico para la
producción de agentes biocontroladores. Se trata, como su nombre lo indica,
del crecimiento de microorganismos en sistemas totalmente líquidos (Tavorsky,
1992). Existen gran cantidad de ventajas que hacen de esta metodología más
efectiva, entre las que se destaca la necesidad de menos mano de obra para
13
operar el fermentador y manejo del producto. Se cuenta además con la
posibilidad de controlar de manera más sencilla factores ambientales como la
temperatura, aireación y pH, manteniendo más estable el medio de crecimiento,
cuya homogeneidad favorece las etapas de procesamiento posteriores
(Jackson, 1997; Tavorsky, 1992).
Fermentación Liquida
Se puede definir a la fermentación líquida (FL) o sumergida como un
cultivo de células microbianas dispersas en forma homogénea en un recipiente
agitado que puede no ser aireado por medios mecánicos.
La forma de fermentación liquida más utilizada en los laboratorios de
investigación es el matraz agitado. El desarrollo de esta técnica ha sido
importante porque ha permitido el cultivo de organismos aeróbicos en
condiciones homogéneas con una densidad moderada de la biomasa y ha
simplificado el estudio de la fisiología de los organismos. A su vez, el cultivo de
suspensiones de células en fermentadores agitados ha evolucionado a gran
escala, pues no es raro ver fermentadores con volúmenes superiores a 10 mil
litros, en los cuales se producen todo tipo de compuestos derivados del
metabolismo microbiano. En estos sistemas, la agitación mecánica permite
aumentar la transferencia del gas a la biomasa de tres formas básicas: 1)
Dispersa el gas en burbujas más pequeñas incrementando el área de interface
gas-líquido. 2) Incrementa el tiempo de contacto de líquido con las burbujas de
gas. 3) Disminuye el grueso de la capa estacionaria del líquido al aumentar la
turbulencia del cultivo. Además, la agitación mezcla el cultivo manteniéndolo
homogéneo. Esto es particularmente importante para la dispersión de la
14
biomasa y la transferencia de calor (Henzler y Schedel, 1991). Los productos
metabólicos y el calor se dispersan fácilmente, por lo que, no son un factor
limitante para el crecimiento del microorganismo. La barrera principal de
transferencia del O2 en la FL, es su baja solubilidad en el agua y, al hacerse
mayor la capa de agua que debe cruzar, aumenta la dificultad para que llegue a
la célula. Gran parte del gasto energético que debe realizarse en la FL está
relacionado con la necesidad de satisfacer la demanda de oxígeno en el
crecimiento de los microorganismos, esto es muy claro en el caso de
Aspergillus niger, que es un organismo aeróbico estricto y necesita una alta
tasa de transferencia de oxígeno para mantener su crecimiento y producir
muchos de los metabolitos de interés (Righelato, 1975; Solomon, 1975;
Raimbault, 1998).
Principales Características del Cultivo Microbiano
Hubert (1987), Jones y Thomas (1987) mencionan que los cultivos de
levadura presentan varias características importantes: 1) No son patógenos, ni
tóxicos, 2) No se absorben en el tracto digestivo, 3) No dejan residuos en los
tejidos animales, 4) Se utilizan en pequeñas cantidades, 5) Proliferan in vivo e
in vitro, 6) Promueven el crecimiento de bacterias celulolíticas, 7) Son estables
a temperaturas elevadas y 8) No causan mutación.
Condiciones de Crecimiento de Saccharomyces Cerevisiae
Las levaduras requieren para su óptimo crecimiento un ambiente acuoso,
pH con rango de 3.5 a 5.0, posiblemente debido a que la actividad de las
proteínas plasmáticas de las levaduras en los límites de su membrana se da en
estos valores de pH (Rose 1987a); en estas condiciones de pH requerido para
15
el crecimiento de la levadura, levadura, la actividad bacteriana a nivel ruminal
tendría consecuencias detrimentales para los microorganismos y para los
rumiantes.
Las levaduras mantienen su actividad metabólica y resisten el estrés
físico asociado con el secado, calentamiento y exposición al pH ácido en
condiciones anaeróbicas (Dawson 1989). No obstante, se ha demostrado que
S. cerevisiae presenta crecimiento limitado bajo esas condiciones (Andreasen y
Stier 1953) y es incapaz de mantener una población productiva dentro del ecosistema ruminal (Dawson y Newman 1987; Arambel Y Rung-Syin 1987), no
pueden mantener una población viable en el rumen y son incapaces de
establecerse permanentemente (WiIliams et al. 1990); por tal motivo, no es
común que desarrolle crecimiento a nivel ruminal, en forma adicional a lo
anterior el crecimiento de las levaduras se ve afectado por la presencia de
ácidos grasos insaturados, tales como el colesterol y el ácido nicotínico (Rose
1987b); sin embargo, se ha observado cierto grado de viabilidad ruminal
(Dawson et al. 1990; Hession et al. 1992), que se puede explicar en parte por
los estudios in vitro realizados por Cobos (1996) en condiciones anaeróbicas y
con una concentración de bacterias similar a la esperada en el rumen, donde se
observó que la viabilidad de las diferentes cepas de levadura S. cerevisiae es
mínima después de 12 h; por lo tanto, se estima una alta tasa de degradación
de las levaduras por parte de las bacterias rumínales.
El rango de temperatura óptima para el crecimiento de las levaduras es
de 28 a 30ºC, con sobrevivencia a 37ºC por medio de la formación de
ascosporas (Dengis et al. 1995), aunque a 39ºC que es la temperatura del
16
ambiente ruminal, se ve afectado su crecimiento y disminución de la viabilidad
de la levadura a 48 h de incubación (Mendoza 1993).
Ventajas y desventajas de la fermentación en estado sólido comparada
con el cultivo sumergido en líquido
Doelle et al., (1992) consideran como ventajas los siguientes aspectos:
Los medios de cultivo son simples, generalmente subproductos agrícolas que
presentan un alto contenido de los nutrientes necesarios. La baja actividad del
agua es de gran ayuda para evitar las contaminaciones, especialmente de
bacterias y levaduras. La concentración natural del sustrato permite utilizar
reactores más pequeños en comparación con los utilizados en otro tipo de
fermentación. Tienen mayor productividad volumétrica. La aireación forzada es
facilitada por la porosidad del soporte, lo que permite una alta transferencia de
oxígeno al microorganismo. Pueden emplearse, frecuentemente conidios como
inóculo en los procesos de crecimiento de hongos, lo cual disminuye los costos
y las manipulaciones en la preparación del inóculo. Los conidios de los hongos
que se producen son mucho más resistentes y tienen mejor adaptabilidad a las
condiciones en las que se aplican como agente de biocontrol. El proceso de
recobrado es simplificado. Algunos productos son utilizados integralmente,
como alimento animal, productos para el control biológico. Los procesos se
consideran generalmente como tecnologías limpias.
Entre las principales desventajas se encuentran: Su aplicación se limita a
microorganismos que crecen en bajos contenidos de humedad. La extracción
del calor metabólico puede ser un problema, sobre todo cuando se trabaja a
gran escala y no se controla el proceso. La naturaleza sólida del sustrato trae
17
problemas al medir los parámetros de la fermentación tales como el pH, la
temperatura, el contenido de humedad y la concentración de sustrato y
productos. Los procesos de transferencia de masa son limitados por la difusión.
Muchos aspectos ingenieriles como el diseño de reactores y el escalado están
muy poco caracterizados. El tiempo de fermentación es mayor debido a que
generalmente se utilizan microorganismos que presentan bajas velocidades
específicas de crecimiento.
Es bueno recalcar que algunas de estas desventajas son relativas, por
ejemplo, el tiempo de fermentación ya que actualmente se están empleando
bacterias en los procesos de FES. Se realizan grandes esfuerzos en la
búsqueda de soluciones parciales a las dificultades antes mencionadas,
algunos como Gervais y Bazelin (1986) experimentaron con un reactor que
permitía la regulación de la humedad relativa del aire y su temperatura en
circulación, ya que según Ballio et al., (1964) y Richard-Molard et al., (1985),
demostraron que durante el desarrollo del hongo, la variación de la actividad del
agua (H2O) en el medio, puede influir en el crecimiento micelial o en la
germinación de las esporas y esto puede ser útil para optimizar la producción
de conidios en fermentadores con sustrato sólido, donde la suplementación de
oxígeno y la cosecha de conidios, resulta más fácil que en fermentaciones
líquidas.
Para el caso específico del control biológico, en la producción de hongos
por fermentación sumergida, en determinados casos, se obtienen blastosporas,
que si bien son estructuras infectivas, resultan poco resistentes a los cambios
de las condiciones climáticas (temperatura, radiación, humedad, etc.), a
18
diferencia de los conidios que se producen en las fermentaciones en fase
sólida. Se caracterizan las primeras por presentar cubiertas delgadas y lisas,
que influyen negativamente en cuanto a su eficiencia y persistencia después de
las aplicaciones dificultando, además, la formación de epizootias.
Optimización de Medios de Cultivo.
Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativa la optimización
de los medios de cultivo (Ertola y et al., 1994). Entre ellas podemos mencionar
las siguientes: La no existencia de información respecto a coeficientes de
rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo
determinado. La existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente
de microelementos y factores de crecimiento. El uso de medios de cultivo
conteniendo elementos en exceso respecto de los requerimientos nutricionales
del microorganismo en cuestión, que pueden causar inhibición del crecimiento.
El ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento
y formación del producto. El empleo de fuentes nutricionales no convencionales.
Acerca de esto existen en la literatura diferentes ejemplos sobre técnicas que
hacen posible la optimización de los medios de cultivo. La mayoría de estas,
basan la formulación de los mismos en la composición elemental del
microorganismo a estudiar o de otros similares que puedan servir de referencia
para realizar un balance de materia apropiado. (Dreyer et al., 2000).
La optimización de los medios de cultivo con fines industriales, en la
mayoría de los casos ha sido efectuada mediante procedimientos empíricos de
ensayo y error, no solo en la formulación del medio de cultivo, sino también en
las condiciones de operación. De cualquier manera es probable que el medio de
19
cultivo original pueda ser optimizado, modificando el porcentaje de los
componentes del mismo y las materias primas utilizadas, siendo factible en
muchos casos optimizar un medio de tal manera que no sea solamente más
productivo, sino de menor o igual costo que el original, para lo cual se requiere
del uso de varios métodos de optimización (Dreyer et al., 2000).
Un aspecto relevante en la optimización de un medio de cultivo de interés
industrial no es sólo el logro de una formulación racional del mismo, sino
también la posible inclusión de materias primas de bajo costo que hagan
rentable el proceso. Ello ha llevado a la búsqueda de subproductos de bajo
valor comercial que puedan sustituir componentes costosos y que puedan ser
utilizados como fuentes de carbono o nitrógeno (Dreyer et al., 2000).
Metabolismo Aeróbico
En
base
a
sus
requerimientos o
sensibilidad
al
oxígeno
los
microorganismos pueden ser clasificados como anaerobios, aerobios estrictos y
aerobios facultativos. Para los microorganismos aeróbicos, la presencia del
oxígeno juega un papel muy importante en la regulación de sus actividades
metabólicas.
Los microorganismos aeróbicos necesitan oxigeno para obtener la
energía de los alimentos, y la concentración del oxigeno en el medio de cultivo
juega un papel central en la regulación metabólica por ello, en el cultivo de este
tipo de microorganismos, el aire debe ser distribuido al Interior del liquido de
fermentación para pasar al interior de las células por difusión simple, tras esto
debe cruzar el citoplasma hasta el lumen mitocondrial de este modo, el oxigeno
consumido por los microorganismos debe pasar a través de varias barreras
20
antes de alcanzar la matriz mitocondrial donde se usará como aceptor de
protones al final de la fosforilacion oxidativa. La concentración de 02 que es
ligeramente superior al 21% en el aire llega a ser casi nula en la matriz de la
mitocondria. El proceso de transferencia de oxígeno se debe a su gradiente de
concentración entre las diferentes fases del cultivo. La concentración y la
velocidad de transporte del oxigeno del aire a la biomasa puede modificar de
manera importante el comportamiento del microorganismo en el cultivo al
controlar la producción de ATP y con ello todo la producción energética de los
microorganismos (Pirt, 1975; Righelato. 1975).
Uso de las levaduras obtenidas de la manzarina en la alimentación animal
Becerra (2006), Hang et al. (1981) y Joshi y Sandhu (1996) coinciden en
que durante la FES del BM, el producto obtenido se ve enriquecido
nutricionalmente y esto es resultado del incremento de la cantidad de levaduras
con que se inoculó o de la potencialización del desarrollo poblacional de
aquellas que se encuentran presentes de manera natural en el BM; esto genera
que en el caso de la manzarina, se pueda asumir que además de ser un
alimento rico en PV, sea un alimento con un aporte importante de levaduras,
debido a la alta cantidad de levaduras que contiene, ya sea obtenida del BM
(Becerra, 2006) o de MD (Díaz, 2006).
Una célula de levadura puede llegar a pesar 7.922*10 -11 g (Haddad y
Lindegren, 1953), tomando esto en cuenta, las levaduras pueden representar
una fracción importante de la MS de la manzarina, considerando que se han
obtenido conteos de hasta 4.5*108 ufc ml-1 (Rodríguez et al., 2006b), en base
seca esa cantidad puede ser hasta 10 veces mayor.
21
En la alimentación de rumiantes, las levaduras agregadas en la dieta
influencian el metabolismo microbiano ruminal (Miller-Webster et al., 2002); se
ha reportado que al agregar cultivos de levaduras en dietas con una alta
proporción de concentrado, se puede reducir la producción de lactato e
incrementar un poco el pH en el rumen (Moya et al., 2008); incluso la adición de
cultivos de levaduras en la dieta de vaquillas lecheras puede incrementar la
cantidad total de bacterias viables en el rumen (Lascano y Heinrichs, 2008).
Sin embargo, aún y cuando algunas levaduras son anaerobias
facultativas, debido a su hábitat natural aerobio (requieren oxígeno para el
desarrollo normal de sus poblaciones), 24 h después de suspender su
suplementación en la dieta, la cantidad de levaduras viables en condiciones
ruminales puede ser indetectable (Kung et al., 1997).
Cuando se incluyen en dietas para ganado lechero, las vacas alimentadas
muestran tendencias a tener menor concentración de ácidos grasos no
esterificados en la circulación sanguínea periférica, después del parto
(AlIbrahim et al., 2008); tienden a incrementar el porcentaje de grasa en la
producción de leche (Putnam et al., 1997; Wang et al., 2001), tienden a
incrementar la producción de leche (Bitencourt et al., 2008; Putnam et al., 1997;
Wohlt et al., 1998; Wang et al., 2001), pueden incrementar el consumo de
materia seca (Dann et al., 2000; Wohlt et al., 1998) e incluso pueden disminuir
la pérdida de condición corporal antes del parto (Robinson, 1997).
Se han utilizado en dietas para crías de ganado lechero en un 1% de la
dieta en BS, aparentemente esto reduce la susceptibilidad a las infecciones
(Seymour et al., 1995).
22
En no rumiantes, productos obtenidos de las levaduras, tienen un efecto
benéfico en la ecología microbiana del conducto gastrointestinal; disminuyen la
población de Clostridium perfringens (Hernot et al., 2008); pueden capturar
bacterias patógenas en el conducto gastrointestinal, esto debido a que esas
bacterias se unen a las paredes celulares de levaduras (Ganner et al., 2008),
permitiendo tener un efecto de modulación en la concentración microbiana en el
intestino de cerdos destetados (Weedman et al., 2008).
Los cultivos vivos de levaduras permiten la estabilización de la microflora
normal del ciego cuando se ofrecen en la dieta a cerdas gestantes y lactantes
(Walker et al., 2008), existiendo la posibilidad de incrementar su productividad,
debido a incrementos en la ganancia de peso de las camadas y reducción del
número de días del destete al empadre exitoso (Kim et al., 2008).
MATERIALES Y METODOS
Esta investigación se llevó a cabo en la Facultad de Zootecnia de la
Universidad Autónoma de Chihuahua, en el laboratorio de Nutrición Animal. La
precipitación media anual es de 336 mm. La temperatura media anual es de
18.6 ºC, con un periodo libre de heladas de 223 d (INEGI, 2001). Esta
investigación se llevo acabo de marzo a mayo de 2009.
23
Tratamientos
Ingredientes
Extracto de
Malta
Manzana Molida
Melaza de Caña
Suero de Leche
Lev. A
Lev. B
Lev. C
Lev. D
Urea
Minerales
Sulfato de
amonio
Agua destilada
Ingredientes
Extracto de
Malta
Manzana Molida
Melaza de Caña
Suero de Leche
Lev. A
Lev. B
Lev. C
Lev. D
Urea
Minerales
Sulfato de
amonio
Agua destilada
T1
T2
T3
%
Lev. A
Malta
Lev. A
Manzana
Lev. A
Melaza
2
30
10
50
0,1
0,1
0,1
0,1
1
0,5
20
T4
Lev. A
Suero
300
100
1
1
1
500
1
1
0,5
1
0,5
1
0,5
1
0,5
0,2
CBP
0,2
977.3
1000
0,2
697.3
1000
0,2
897.3
1000
0,2
497.3
1000
%
Lev. B
Malta
Lev. B
Manzana
Lev. B
Melaza
Lev. B
Suero
2
30
10
50
0,1
0,1
0,1
0,1
1
0,5
20
0,2
CBP
300
100
500
1
1
1
1
1
0,5
1
0,5
1
0,5
1
0,5
0,2
977.3
1000
0,2
697.3
1000
0,2
897.3
1000
0,2
497.3
1000
24
Ingredientes
Extracto de
Malta
Manzana Molida
Melaza de Caña
Suero de Leche
Lev. A
Lev. B
Lev. C
Lev. D
Urea
Minerales
Sulfato de
amonio
Agua destilada
Ingredientes
Extracto de
Malta
Manzana Molida
Melaza de Caña
Suero de Leche
Lev. A
Lev. B
Lev. C
Lev. D
Urea
Minerales
Sulfato de
amonio
Agua destilada
%
Lev. C
Malta
2
30
10
50
0,1
0,1
0,1
0,1
1
0,5
20
Lev. C
Manzana
Lev. C
Melaza
Lev. C
Suero
300
100
500
1
1
1
1
1
0,5
1
0,5
1
0,5
1
0,5
0,2
CBP
0,2
977.3
1000
0,2
697.3
1000
0,2
897.3
1000
0,2
497.3
1000
%
Lev. D
Malta
Lev. D
Manzana
Lev. D
Melaza
Lev. D
Suero
2
30
10
50
0,1
0,1
0,1
0,1
1
0,5
20
0,2
CBP
300
100
500
1
1
0,5
1
1
0,5
1
1
0,5
1
1
0,5
0,2
977.3
1000
0,2
697.3
1000
0,2
897.3
1000
0,2
497.3
1000
25
Se prepararon cuatro sustratos, tratamientos (t) para evaluar la
fermentación en estado sólido sumergido. T1) 20 gr de Extracto de malta (EM)
más 1 g de levadura, T2) 300 ml de Manzana molida (MA) mas 1 g de levadura,
T3) 100 ml de Melaza de caña (ME) más 1 g de levadura, T4) 500 ml de Suero
de leche (SL) más 1 g de levadura. Todos los tratamientos contaron con la
adición de 1% de Urea, 0.2% de sulfato de amonio, 0.5% de premezcla de
vitaminas y minerales traza para favorecer el crecimiento de levaduras y se
aforo a 1,000 ml con agua destilada todos los matraces. Sus combinaciones
fueron evaluadas en 12 Matraces de vidrio de 1,000 ml, cada tratamiento consto
de 3 repeticiones consistentes en matraces de vidrio de 1,000 ml, a cada
matraz se le adapto un oxigenador con la finalidad de inyectar el oxigeno
necesario para la producción de las levaduras ya que es una fermentación
aeróbica, solida sumergida.
Durante el periodo de fermentación de las
muestras, fueron tomadas 3 muestras por tratamiento en diferente tiempos (0,
2, 4, 8, 16, 32, 64 y 128 h). Durante los cuales se determinó el pH, temperatura,
carbohidratos, conteos de levaduras y amoniaco.
Mediciones en muestras líquidas
De la hora 0 a la 128 se tomo una muestra de cada repetición de 30 ml, en
frascos de platico y se congeló a -5°C para detener el proceso de fermentación
y posteriormente, se descongelaron a temperatura de refrigeración 4°C para
determinar Amoniaco y conteos de levaduras como se describe a continuación.
pH. Se midió directamente en los matraces a la hora mencionada de cada
muestreo, se determinó el pH midiéndolo con un potenciómetro digital de una
precisión de ±0.1 unidades, se tomo como base la metodología descrita por
26
Rodríguez et al. (2001a). Temperatura, se midió directamente con la ayuda de
un termómetro digital de una precisión de ±0.1. Carbohidratos, se tomo la
lectura con la ayuda de un Refractómetro HI 96801 digital de una precisión de
±0.2. Para este análisis se utilizo 2 gotas de muestras para su lectura y se
utilizo 3 gotas de agua destilada para su calibración. Conteo de levaduras (CL).
Para este análisis se tomó como base, la metodología descrita por Díaz (2006)
y Rodríguez et al. (2001a). Se realizó en todas las muestras en las diferentes
horas de muestreo, las muestras de 30 ml fueron depositadas en frascos de
plástico con tapa de 50 ml; en cada muestra, se agregaron dos agotas de
solución de formalina al 10% para preservarla en refrigeración hasta realizar el
conteo.
El CL se realizó por microscopía; con una pipeta de volumen variable con
un rango de 100 a 1000 µl y puntas desechables se tomó 1 ml de muestra
líquida y se preparó una dilución serial utilizando agua destilada como diluyente;
con una pipeta de volumen variable con un rango de 0.5 a 10 µl y puntas
desechables se tomaron 10 µl de la dilución -3 o -4 de cada muestra, y se
colocaron en un hematocímetro (cámara de Neubauer) para el conteo.
La solución de muestra más agua destilada preparada inicialmente, se
consideró la dilución -1; la cámara de Neubauer se lavó con alcohol etílico
desnaturalizado después de cada CL. Cada célula o grupo aglomerado de
células identificadas como levaduras se consideró como una unidad formadora
de colonias (ufc), estas se contaron en las cuatro esquinas del hematocímetro
(4 cuadrantes de 1 mm2 cada uno; ver Figura 1). Se calculó el promedio de ufc
por cuadrante y se multiplicó por 10,000 para obtener la cantidad de ufc*ml -1
27
28
Figura 1. Cuadrícula de un hematocímetro (cámara de Neubauer). a, b, c
y d, fueron los cuatro cuadrantes utilizados para el conteo de levaduras, su
superficie suma un total de 4 mm2, el espacio entre un cubre objetos y la
superficie de la cámara de Neubauer, utilizando los límites de cada cuadrante
como
guía
tiene
0.1
mm3
de
volumen.
Imagen
disponible
en
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/contajecelular.htm
Nitrógeno amoniacal (N-NH3). De las muestras líquidas obtenidas del la
h0 a la h128 se tomaron 30 ml de la solución, se colocaron en recipientes de
plástico, se agregaron dos gotas de ácido ortofosfórico y se congelaron (-5°C)
para su conservación hasta el momento de la determinación de N-NH3
al
momento de la determinación, las muestras se descongelaron a temperatura de
refrigeración, (4°C) la concentración de N-NH3 de las muestras líquidas se
determinó por colorimetría según el procedimiento de Taylor (1996), en un
espectrofotómetro Coleman Junior ® II modelo 6|20. Fue necesario diluir las
muestras líquidas con agua destilada, a una concentración de 80 µg de la
muestra.
La ecuación de predicción para calcular la concentración de N-NH3 en las
muestras líquidas, se obtuvo del análisis por triplicado de soluciones estándar
con concentraciones de 0, 5, 10, 15, 20 y 25 µg de N-NH3 *ml-1; se utilizó H2Od
como blanco (estándar con concentración de 0 µg*ml -1).
El procedimiento para medir la absorbancia de las muestras líquidas
diluidas, de las soluciones estándar y de los blancos (0 µg*ml -1), se realizó por
triplicado y consistió en lo siguiente: en tubos de ensayo se agrego 920 µg de
agua destilada y 80 µg de la muestra concentrada para completar 1 ml, se
29
mezclaron en vórtice (Vortex Genie II) posteriormente se tomo 50 µg de la
muestra diluida para cada repetición y se deposito en tubos de ensayo, a lo que
se le agrego 2.5 ml de fenol y se mezclo en un vórtice, posteriormente se
agrego 2 ml de hipoclorito y se mezclo nuevamente, para el estándar o del
blanco,
se agrego 50 µg de agua destilada, 2.5 ml de fenol y 2 ml de
hipoclorito, las soluciones obtenidas se mezclaron en un vórtice y se incubaron
por 5 minutos en baño de agua caliente (temperatura de 95~100°C).
Posteriormente, las muestras se dejaron enfriar por 5 minutos a
temperatura ambiente para después tomar la lectura de la absorbancia del
contenido de cada muestra, se midió a una longitud de onda de 630 nm;
previamente el valor de la absorbancia fue ajustado a 0 utilizando los blancos
como referencia. Este procedimiento se describe brevemente por Madrid et al.
(1999), ellos utilizaron 6 ml de solución de H2SO4 concentrado y 1 ml de
muestra líquida para el análisis, en este trabajo se modificó a 3 ml de H 2SO4 y
0.5 ml de muestra debido al tamaño de las celdas del espectrofotómetro. Con
los resultados de la absorbancia de las muestras líquidas diluidas, la ecuación
de predicción obtenida con las soluciones estándar y el porcentaje de dilución
de las muestras líquidas en agua, se calculó la concentración de N-NH3 en
miligramos por gramo de muestra (mg*g -1) en base húmeda (BH).
Análisis Estadístico
El diseño para este experimento se hizo con un arreglo completamente
aleatorio, considerando efectos fijos los niveles sustrato y levadura; el efecto
aleatorio del matraz dentro de cada tratamiento (parcela), el efecto de tiempo, el
efecto de las interacciones de sustrato, levadura y tiempo, para el último el
30
efecto de la interacción triple de factor tiempo, factor sustrato y factor levadura;
los datos se evaluaron con el procedimiento (Proc Mixed) del programa (SAS
2002), para un diseño al azar con arreglo factorial 4x4 en parcelas. Las
variables de respuesta fueron pH; temperatura; azucares solubles; Ufc y
Amoniaco, el modelo propuesto fue:
Yijke = μ + Li + Sj + (SL) ij + Rk (ij) + Ti + (TS) ie + (TL) je + (SLT) ije + εijke
Donde:
Yijke
= Variable respuesta
μ
= Media general
Si
= Efecto del i sustrato
Lj
= Efecto del j nivel de levadura
(SL)ij
= Efecto de la Interacción de i nivel sustrato j nivel de levadura
= Error de matraz (parcela) k en el tratamiento i nivel de sustrato
Rk(ij)
y j nivel de levadura
Ti
= Efecto de e timpo
(TS)ie
= Efecto de la Interacción de e tiempo e con i nivel de sustrato
(TL)je
= Efecto de la Interacción de e tiempo con j nivel de levadura
= Efecto de la Interacción de e tiempo con i nivel de sustrato y j
(SLT)ije
nivel de levadura
εijke
= Error residual de tratamiento con i nivel de sustrato con j nivel
de levadura, en la parcela k y e tiempo
31
RESULTADOS Y DISCUSION
El objetivo de este experimento fue evaluar 4 tipos de sustratos diferentes:
1) Extracto de Malta (EM); 2) Manzana molida (MA); 3) Melaza de caña (ME);
Suero de leche (SL) y 4 tipos de levaduras comerciales, A, B, C y D usando la
fermentación solida sumergida (FSS) en condiciones aeróbicas, para obtener
un punto de referencia y comparar las posibles interacciones de los diferentes
tratamientos, con la presencia de oxigeno en los medios de cultivo, utilizando
una temperatura ambiente de 18 a 27°C en condiciones de laboratorio
pH. Es una condición química que refleja la concentración de productos
acidificantes o alcalinizantes en un medio, este indicador representa una
condición química, cuando se encuentra a un nivel bajo, inhibe la proliferación
de ciertas bacterias, su nivel alto o bajo es dependiente de la presencia de
asidos y otros compuestos como el NH3. El pH de los sustratos fermentados se
observa en las Graficas 1 a la 4.
Esta variable mostro un comportamiento similar para todos los sustratos
con efecto cuadrático (P<0.001) durante el proceso; así también, mostro una
interacción (P<0.001) de tratamiento por el efecto cuadrático de la hora,
indicando que ese incremento fue distinto entre tratamientos.
Según los valores estimados, de la h 0 a la h 128 de FSS, el pH del
sustrato de t1 puede incrementarse de un valor de 3.01±0.95 (h8) hasta un
5.86±0.95 (h128). El pH del sustrato de t2 puede incrementarse desde
3.06±0.95 (h4) hasta 5.59±0.95 (h64). En el sustrato t3 puede incrementarse
desde 5.37±0.95 (h16) hasta 5.81±0.95 (h8) y en el sustrato t4 puede ir desde
4.48±0.95 (h16) hasta 6.60±0.95 (h2). En la FES y en la FSS de algunos
32
sustratos, la disminución de pH está relacionada con el incremento de la
concentración de ácidos orgánicos; la producción de ácidos orgánicos es el
resultado del consumo de carbohidratos de fácil fermentación (Calderón et al.,
2005). El incremento de pH está relacionado directamente con la producción de
NH3 y con una menor producción de ácidos orgánicos (Elías et al., 2001;
Rodríguez et al., 2001b).
El incremento de pH también está relacionado con el incremento del
contenido total de aminoácidos y productos alcalinizantes (Peñaloza et al.,
1985). Rodríguez et al. (2001b), en el proceso de FES de mezclas de bagazo
de caña y boniato, observaron que el pH se incremento después de 72 h de
fermentación.
33
Tiempo (horas)
Grafica 1. Comportamiento del pH de los diferentes sustratos con la levadura A
durante la FSS.
pH Levadura A
EM
MA
ME
SL
0
4,65
4,04
5,75
4,73
2
3,47
3,96
5,66
6,58
4
3,15
3,60
5,59
5,13
8
3,01
3,48
5,54
4,61
16
3,06
3,66
5,37
4,38
32
3,21
3,77
5,39
4,26
64
3,31
4,71
5,68
4,40
128
3,62
4,64
5,71
4,22
34
Tiempo (horas)
Grafica 2. Comportamiento del pH de los diferentes sustratos con la levadura B
durante la FSS.
pH Levadura B
EM
MA
ME
SL
0
5,32
4,06
5,77
4,73
2
5,43
4,10
5,77
6,54
4
5,49
4,14
5,76
5,71
8
5,55
4,14
5,73
5,72
16
5,51
3,99
5,75
4,48
32
5,63
3,30
5,69
4,36
64
5,71
4,35
5,24
4,40
128
5,86
4,36
5,04
4,48
35
Tiempo (horas)
Grafica 3. Comportamiento del pH de los diferentes sustratos con la levadura C
durante la FSS.
pH Levadura C
EM
MA
ME
SL
0
5,13
3,99
5,68
4,73
2
5,12
4,02
5,77
6,60
4
4,94
4,07
5,74
5,84
8
4,57
4,07
5,72
4,72
16
3,63
3,68
5,68
4,46
32
3,15
3,66
5,45
4,32
64
3,42
5,41
5,41
4,46
128
3,85
5,50
5,23
4,37
36
Tiempo (horas)
Grafica 4. Comportamiento del pH de los diferentes sustratos con la levadura D
durante la FSS.
pH Levadura D
EM
MA
ME
SL
0
5,35
3,96
5,75
4,75
2
5,85
3,98
5,81
6,58
4
5,37
4,01
5,75
5,77
8
4,51
3,97
5,74
4,76
16
3,73
3,84
5,68
4,48
32
3,72
3,81
5,26
4,34
64
4,82
4,42
5,54
4,28
128
5,67
4,26
5,56
4,38
37
Temperatura (T). Los organismos que consumen oxigeno, producen
calor debido a su actividad metabólica, por esta razón esta variable es un
indicador de actividad metabólica y es importante en la FES y en la FSS ya que
indica si existe o no este tipo de actividad biológica. Esta variable tuvo un
comportamiento (P<0.001), el efecto de la interacción del sustrato tratamiento,
por el efecto de levadura durante la FSS (hora) fue significativo (P<0.001).
La temperatura se incremento (P<0.001) de la h0 a la h128 en todos los
tratamientos, posteriormente disminuyo (P<0.001) para mantenerse cerca de la
temperatura de incubación a partir de la h8.
Los valores estimados de las medias en la h0 de la FSS fueron
26.00±0.14 en t1, 25.60±0.14 en t2, 19.23±0.14 en t3 y 23.90±0.14. Las T más
altas se observaron en la h128 para t1, (Grafica 5) para t2 en la h8 (Grafica 6)
para t3 en la h64 y (Grafica 7) y para t4 en la h128 (Grafica 8). El calor
acumulado en sustratos fermentados es el resultado de la actividad metabólica
de los microorganismos; la T también puede ser afectada por la conductividad
del material biológico fermentado (Ibarra et al., 2002).
En el proceso de obtención de la Saccharina que es (similar al de
manzarina), la T interna tiende a mantenerse constante a pesar de los cambios
de T ambiental; aun así, esta puede influenciar ligeramente la T del sustrato
(Ruiz et al., 2002). Según los datos estimados, en todos los tratamientos, la T
se comporto de una manera similar en los diferentes tiempos y con los
diferentes sustratos, indicando una actividad biológica como lo menciona Ibarra
et al., (2002).
38
Tiempo (horas)
Grafica 5. Comportamiento de la temperatura en los diferentes sustratos
con la levadura A durante la FSS.
Temperatura Levadura A
EM
MA
ME
SL
0
26,00
24,86
19,23
23,90
2
25,46
24,60
19,20
23,26
4
25,93
25,26
19,53
23,76
8
26,13
26,33
20,06
24,00
16
26,66
25,86
21,16
24,60
32
26,56
25,60
20,56
24,50
64
27,40
26,26
23,06
24,13
128
27,00
25,60
23,16
24,96
39
Tiempo (horas)
Grafica 6. Comportamiento de la temperatura en los diferentes sustratos con la
levadura B durante la FSS
Temperatura Levadura B
EM
MA
ME
SL
0
26,00
24,60
19,23
23,80
2
25,53
24,33
18,76
23,33
4
25,43
24,66
18,86
23,5
8
25,80
25,33
19,40
24,10
.
16
25,83
25,66
19,83
23,90
32
26,36
24,73
20,43
23,26
64
26,56
25,30
22,46
23,93
128
26,80
25,10
22,66
24,70
40
Tiempo (horas)
levadura C durante la FSS.
Temperatura Levadura C
EM
MA
ME
SL
0
25,60
24,56
19,23
23,90
2
25,20
24,06
19,03
23,26
4
25,16
24,43
19,00
23,33
8
25,70
25,23
19,26
23,73
16
25,60
24,83
19,76
24,43
32
26,06
24,96
20,56
23,93
64
26,60
25,43
22,66
23,63
128
26,36
24,80
22,80
24,03
41
Tiempo (horas)
levadura D durante la FSS.
Temperatura Levadura D
EM
MA
ME
SL
0
25,50
24,46
19,20
23,50
2
25,30
24,13
18,86
23,33
4
25,76
24,83
18,86
23,66
8
25,96
25,40
19,30
23,63
16
26,53
25,93
19,80
24,06
32
26,33
24,80
21,60
23,90
64
27,13
25,83
23,06
24,00
128
27,40
24,80
22,80
24,83
42
Conteo de Levaduras (CL). Se ha demostrado que el BM expuesto a
FES es específicamente con levaduras, mejora su calidad nutritiva (Hang et al.,
1981; Joshi y Sandhu, 1996), por esto, la evaluación de esta variable en las
condiciones de FES de los sustratos utilizados en este trabajo es importante.
Se observo un efecto (P<0.001) de interacción de tratamiento con
levaduras y tiempo, esto indica que hubo diferencias en la cantidad de
levaduras y su comportamiento fue fluctuante en los distintos sustratos con las
diferentes levaduras A, B, C y D (Graficas 9 a 12). La concentración más alta de
levaduras se observo en el t2 y t3 siendo así de 8.6*10 8 cel*ml/L en el t1 en la
h2 con la levadura A, para el t2 de 4.4*108 cel*ml/L en la h32 con la levadura
B, para el t3 5.6*108 cel*ml/L en la h128 con la levadura C y para el t4 1.7*109
cel*ml/L en la h128 con la levadura D.
El crecimiento de algunos microorganismos que se encuentran presentes
de manera natural en diferentes tipos de sustratos, se ve potencializado por la
presencia de carbohidratos fermentables, iniciando así con el proceso de FSS
cuando hay condiciones de presencia de oxigeno disuelto en el medio y otros
nutrientes como el NNP. En este caso las levaduras son más favorecidas en el
NNP fue aportado por la urea y el sulfato de amonio (Elías et al., 1990;
Rodríguez et al., 2001b; Becerra, 2006; Díaz, 2006).
El incremento en la calidad nutritiva de algunos sustratos fermentados,
se puede atribuir en gran parte al incremento de la población de levaduras, es
conocido desde hace décadas que su valor proteico es alto y debido a esto,
como concentrado, las levaduras pueden ser comparables a la pasta de soya,
aun y cuando su contenido de metionina es bajo (Klose y Fevold, 1945).
43
En este trabajo, la población de levaduras se incremento en mayor
proporción en los sustratos de melaza y de manzana con las levaduras A y D
basado en esto, el producto fermentado y en combinación con las demás
levaduras puede tener un valor nutritivo potencialmente mayor, según las
condiciones en que se llevo este experimento.
Nitrógeno Amoniacal (NH3). La urea añadida a los sustratos en
procesos de FSS, es transformada a NH3 por efecto de especies microbianas
ureoliticas (Valiño et al., 2002; Calderón et al., 2005), si el sustrato tiene un
aporte energético bajo, los microorganismos no pueden incorporarlo en la
formación de aminoácidos para su crecimiento o lo hacen en una proporción
baja. Cuando se tiene un pH bajo, el NH3 producido es retenido en el sustrato
(Rodríguez et al., 2001b). El NH3 también puede producirse por actividad
desaminativa (Calderón et al., 2005).
Esta variable se incremento cúbicamente (P<0.001), se observo
diferencia (P<0.001) entre tratamientos y levaduras (Graficas 13 a 16). En este
trabajo, de la h0 a la h128 de la FSS, la concentración de NH 3 en los sustratos
se incremento (P<0.001) de 0.10±0.01 a 0.78±0.01mM/ml en el t1 con la
levadura A, para el t2 de 0.02±0.01a 0.89±0.01 mM/ml con la levadura B, para
el t3 de 0.00±0.01a 0.81±0.01 mM/ml con la levadura C y para el t4 de
0.00±0.01 a 0.88±0.01 mM/ml con la levadura D, indicando actividad de los
microorganismos ureoliticos. El NH3 como compuesto puede ser utilizado por
ciertos microorganismos que no hidrolizan la urea agregada, como resultado de
esto, la cantidad de algunos microorganismos presentes en los sustratos
fermentados se puede incrementar (Valiño et al., 2002).
44
Tiempo (horas)
Grafica 9. Producción de levaduras en los diferentes sustratos con la levadura A
durante la FSS.
Ufc Levadura A
EM
MA
ME
SL
0
8,1E+07
5,2E+07
7,5E+07
5,8E+07
2
8,6E+08
7,2E+07
7,1E+07
5,8E+07
4
1,4E+08
1,2E+08
1,2E+08
7,8E+07
8
1,2E+08
3,2E+08
2,2E+08
7,9E+07
16
2,2E+08
3,3E+08
5,2E+08
9,3E+07
32
2,5E+08
3,2E+08
3,9E+08
2,5E+07
64
3,1E+08
3,5E+08
8,2E+08
1,8E+08
128
3,0E+08
4,3E+08
4,4E+08
2,6E+08
45
Tiempo (horas)
Grafica 10. Producción de levaduras en los diferentes sustratos con la levadura
B durante la FSS.
Ufc Levadura B
EM
MA
ME
SL
0
0,0E+00
0,0E+00
0,0E+00
0,0E+00
2
0,0E+00
0,0E+00
0,0E+00
0,0E+00
4
0,0E+00
0,0E+00
0,0E+00
1,0E+07
8
0,0E+00
0,0E+00
1,0E+06
2,2E+07
16
8,4E+06
5,0E+07
2,0E+06
2,8E+07
32
6,8E+06
4,4E+08
7,1E+07
1,3E+07
64
1,6E+07
3,0E+08
7,4E+08
6,3E+07
128
5,0E+06
4,6E+08
7,1E+08
4,3E+07
46
Tiempo (horas)
C durante la FSS.
Ufc Levadura C
EM
MA
ME
SL
0
4,6E+06
4,8E+06
2,4E+06
7,6E+06
2
8,0E+06
1,1E+07
9,0E+06
2,6E+07
4
1,1E+07
8,4E+06
1,1E+07
3,5E+07
8
1,0E+07
2,0E+07
8,5E+06
3,2E+07
16
2,5E+07
2,3E+08
7,0E+07
1,9E+07
32
6,9E+07
3,8E+08
5,2E+07
1,2E+07
64
2,9E+08
3,4E+08
4,6E+08
1,1E+08
128
5,6E+08
4,6E+08
5,1E+08
1,4E+08
47
Tiempo (horas)
D durante la FSS.
Ufc Levadura D
EM
MA
ME
SL
0
1,6E+07
6,4E+06
1,0E+07
1,1E+07
2
2,0E+07
1,2E+08
1,4E+07
4,8E+07
4
4,9E+07
4,5E+07
1,6E+07
5,6E+07
8
1,1E+08
6,8E+07
1,1E+07
4,7E+07
16
3,8E+08
1,7E+08
1,3E+08
3,8E+07
32
3,7E+08
3,0E+08
3,1E+08
5,6E+07
64
2,6E+08
3,8E+08
1,4E+09
8,4E+07
128
1,3E+08
3,7E+08
1,7E+09
4,0E+08
48
Tiempo (horas)
Grafica 13. Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura A
durante la FSS.
Nitrógeno Amoniacal Levadura A
EM
MA
ME
SL
0
0,071
0,051
0,058
0,064
2
0,053
0,073
0,081
0,032
4
0,016
0,053
0,096
0,072
8
0,021
0,006
0,078
0,068
16
0,009
0,008
0,030
0,076
32
0,010
0,006
0,015
0,065
64
0,016
0,010
0,014
0,075
128
0,010
0,016
0,034
0,072
49
Tiempo (horas)
Grafica 14. Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura B
durante la FSS.
Nitrógeno Amoniacal Levadura B
EM
MA
ME
SL
0
0,062
0,069
0,072
0,072
2
0,077
0,082
0,089
0,039
4
0,070
0,073
0,050
0,072
8
0,070
0,078
0,055
0,076
16
0,013
0,077
0,052
0,076
32
0,049
0,005
0,054
0,077
64
0,042
0,001
0,015
0,008
128
0,043
0,002
0,025
0,073
50
Tiempo (horas)
Grafica 15. Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura
C durante la FSS
Nitrógeno Amoniacal Levadura C
EM
MA
ME
SL
0
0,078
0,050
0,063
0,075
2
0,074
0,056
0,069
0,029
4
0,012
0,072
0,047
0,067
8
0,076
0,083
0,037
0,080
16
0,059
0,011
0,070
0,081
32
0,042
0,033
0,018
0,078
64
0,023
0,012
0,013
0,074
128
0,017
0,000
0,016
0,066
51
Tiempo (horas)
Grafica 16. Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura
D durante la FSS
Nitrógeno Amoniacal Levadura D
EM
MA
ME
SL
0
0,067
0,050
0,072
0,081
2
0,078
0,056
0,082
0,043
4
0,015
0,072
0,068
0,065
8
0,081
0,088
0,047
0,077
16
0,084
0,011
0,059
0,068
32
0,032
0,033
0,051
0,077
64
0,026
0,012
0,018
0,054
128
0,053
0,000
0,015
0,081
52
Calderón et al., (2005) sugieren que tanto lactobacilos como levaduras
son capaces de captar NH3 para sintetizar proteína unicelular. Rodríguez et al.,
(2001a) mencionan que no todo el NH3 producido es utilizado, ya que la
producción de NH3 es más rápida que su utilización para la síntesis de
aminoácidos.
Es importante señalar que en los tratamientos los incrementos de pH
coinciden con el incremento del NH3 y con una mayor cantidad de levaduras, al
parecer, la disponibilidad de NH3 en el sustrato, puede llegar a facilitar el
desarrollo de las levaduras. Las levaduras son capaces de captar NH 3
produciendo como resultado proteína unicelular (Calderón et al., 2005), sin
embargo, no todo el NH3 producido es utilizado, debido a que su producción es
más rápida que su asimilación, permitiendo que una parte se pierda en el
ambiente (Rodríguez et al., 2001a).
Azucares Solubles (AS). Los azucares y el oxigeno son para las
levaduras lo que el oxigeno para la vida del hombre, de su vitalidad depende la
conversión de los azucares solubles fermentables en alcohol. La levadura de
cerveza contiene 17 vitaminas, todas las del grupo b, 14 minerales y 46% de
proteínas.
Las células de levaduras en crecimiento rápido ofrecen varias vacuolas,
pero las maduras, normalmente, sólo muestran una. Dentro de su membrana
única,
se
encuentran
partículas
densas,
de
polifosfato,
a
las
que
tradicionalmente se denomina gránulos de velutina. Cuando crecen en
condiciones aeróbicas, y en especial si la concentración de glucosa es escasa
se observan varias mitocondrias en el interior de cada célula. Cada mitocondria
53
está rodeada por una doble membrana. Las mitocondrias albergan a los
citocromos a las enzimas respiratorias y al sistema responsable de la
biosíntesis de adenosin trifosfato (ATP). Son, por tanto, las responsables del
metabolismo oxidativo de los azúcares, que se degradan a dióxido de carbono y
agua; el ATP que sintetizan almacena la energía química derivada de estas
reacciones. En condiciones anaeróbicas, o cuando las concentraciones de
glucosa son altas, las mitocondrias.
Los grados Brix se miden en el cociente total de sacarosa disuelta en un
líquido. Una solución de 25 ° grados brix tiene 25 g de azúcar (sacarosa) por
100 g de líquido o, dicho de otro modo, hay 25 g de sacarosa y 75 g de agua en
los 100 g de la solución.
En este trabajo la finalidad de la variable azucares disueltos, nos brinda
información muy útil ya que al observar el comportamiento de los azucares
disponibles en el medio liquido, entendemos mejor como es el comportamiento
de las levaduras en los diferentes sustratos, y en los diferentes tiempos que se
multiplican las levaduras (Graficas 17 a 20).
54
Tiempo (horas)
Grafica 17. Comportamiento de azucares solubles en los diferentes
sustratos con la levadura A durante la FSS
Azucares Solubles en Levadura A
EM
MA
ME
SL
0
1,80
2,23
8,10
0,00
2
1,73
2,00
8,40
3,56
4
1,70
1,06
7,80
3,63
8
1,46
0,90
6,36
3,60
16
1,53
0,80
6,26
3,60
32
1,66
0,90
6,03
3,46
64
1,46
0,70
5,63
3,20
128
1,43
0,66
5,80
2,20
55
Tiempo (horas)
Grafica 18. Comportamiento de azucares solubles en los diferentes sustratos
con la levadura B durante la FSS
Azucares Solubles en Levadura B
EM
MA
ME
SL
0
2,26
2,56
9,23
0,00
2
2,30
2,60
9,43
3,76
4
2,26
2,56
9,46
3,93
8
2,26
2,63
9,53
3,83
16
2,20
0,80
9,46
3,76
32
1,86
1,86
8,86
3,83
64
1,30
0,53
5,90
2,83
128
1,26
0,53
5,26
2,30
56
Tiempo (horas)
con la levadura C durante la FSS
Azucares Solubles en Levadura C
EM
MA
ME
SL
0
2,23
2,73
9,16
0,00
2
2,20
2,73
9,20
3,70
4
2,20
2,86
9,16
3,90
8
2,20
2,80
9,00
4,00
16
1,83
0,83
8,90
3,80
32
1,70
1,76
5,70
3,73
64
1,60
0,73
5,30
2,96
128
1,60
0,60
5,06
2,36
57
Tiempo (horas)
con la levadura D durante la FSS
Azucares Solubles en Levadura D
EM
MA
ME
SL
0
2,23
3,40
8,76
0,00
2
2,20
3,40
8,76
3,60
4
2,20
3,46
8,60
3,83
8
2,20
3,06
8,53
3,86
16
2,20
1,03
7,83
3,60
32
2,13
1,90
5,16
3,36
64
2,13
1,00
5,00
2,80
128
2,13
0,76
4,76
2,26
58
En este trabajo la finalidad de la variable azucares disueltos, nos brinda
información muy útil ya que al observar el comportamiento de los azucares
disponibles en el medio liquido, entendemos mejor como es el comportamiento
de las levaduras en los diferentes sustratos, y en los diferentes tiempos que se
multiplican las levaduras (Graficas 17 a 20). Se observo en las graficas la
disminución en la concentración de azucares solubles conforme avanza el
tiempo y aumentaba la biomasa.
En la medición de azucares solubles, se observa como se presenta la
disminución de los azucares en los sustratos con las diferentes levaduras
mientras avanza la fermentación, este comportamiento es normal debido a que
conforme avanza el tiempo, se incrementa el número de células lo cual provoca
la disminución de los azucares.
59
CONCLUSIONES
Se define la fermentación en estado sólido sumergido (FSS), como un
proceso en el cual se desarrollan microorganismos en materiales líquidos,
utilizando de un 10 a un 30% de materia solida. La producción de alimento
animal por medio de la fermentación en estado sólido sumergido de residuos
agroindustriales, fundamentalmente, de la producción azucarera y manzanera,
han alcanzado notables avances a pesar de las limitaciones que aun se
señalan, tanto por los resultados en el incremento de la masa microbiana como
por la formación de productos. En la actualidad, múltiples investigaciones en
nuestro país están dirigidas a dar un importante aporte a esta tecnología, que
permitirá su integración al desarrollo diversificado de la industria de la caña de
azúcar y de la utilización de manzana o residuos de las jugüeras como lo es el
bagazo de fruta o la pomasa, que permitan producir y dar respuesta a la gran
demanda de proteína para uso animal, de una manera amigable con el medio
ambiente.
El proceso de producción de proteína unicelular por medio de la (FSS) es
una vía biotecnológica adecuada para el aprovechamiento de desechos
industriales ricos en carbohidratos. El principal factor limitante en la generación
de proteína unicelular es el alto costo de las fuentes de carbono, por lo que el
uso de subproductos es ideal.
60
LITERATURA CITADA
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