high purity realplasmid kit

Transcripción

04/10
RBMEPS04/RBMEPS05
HIGH PURITY REALPLASMID KIT
Ref. RBMEPS04 MIDIPREP KIT 25 Preps.
Ref. RBMEPS05 MAXIPREP KIT 10 Preps.
1. INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCTION
HIGH PURITY REALPLASMID Midi/Maxiprep
Kit offers a simple method for isolating plasmid
DNA from 25-100 ml of recombinant E.coli
cultures.
HIGH PURITY REALPLASMID
Midi/Maxiprep Kit ofrece un método simple para
la extracción de ADN plasmídico a partir de
cultivos recombinantes de E.coli desde 25ml hasta
100 ml.
This kit combines a modified alkaline lysis method
with the convenience of anion-exchange columns
to isolate high purity transfection grade plasmid
DNA from bacterial cell lysates.
Este kit combina un método modificado de lisis
alcalina conjuntamente con columnas de
intercambio aniónico para aislar ADN plasmídico
de elevada pureza con un grado para transfección
a partir de lisados bacterianos.
During the cell lysis step, both chromosomal and
plasmid DNA are denatured. Potassium acetate is
added to form a neutralized precipitate containing
chromosomal DNA and other cellular components.
Plasmid DNA remains in the solution, reverts to its
native supercoiled structure, and is then loaded
onto an equilibrated anion-exchange column. The
plasmid DNA becomes bound to the anionexchange resin and is then eluted from the column
with washing steps. Eluted DNA is precipitated and
easily dissolved in TE buffer or nuclease-freewater.
Durante el paso de lisis, tanto el ADN
cromosómico con el plasmídico son
desnaturalizados. Se añade acetato potásico para
formar un precipitado neutralizado que contiene el
ADN cromosómico y otros componentes celulares.
El ADN plasmídico permanece en solución pasando
a su forma nativa “superenrollada”, y luego es
pasado a través de una columna equilibrada de
intercambio aniónico.. El ADN plasmídico se une a
la resina de intercambio aniónico y luego es eluido
de la columna después de varios lavados. El ADN
plasmídico eluido es precipitado y fácilmente
resuspendido en TE o agua libre de nucleasas.
The purified plasmids are suitable for use in the
most demanding molecular biology applications,
including transfection, in vitro transcription,
automated or manual sequencing, cloning,
hybridization and PCR
El ADN plasmídico purificado es útil en la mayoría
de aplicaciones de biología molecular, incluyendo
transfección, transcripción “in vitro”, secuenciación
manual y automática, clonaje, hibridación y PCR.
Sistema de
producción
certificado
bajo norma
ISO
Production
system
certified
under ISO
1/7
REAL es una marca registrada por Durviz, s.l.u.
2. COMPONENTES DEL KIT
KIT COMPONENTS
Solución de Resuspensión
Resuspension Solution
Solución de Lisis
Lysis Solution
Solución de Neutralización
Neutralization Solution
Tampón de Equilibración
Equilibration Buffer
Solución de Lavado
Wash Solution
Tampón de Elución
Elution Buffer
RNasa A (50mg/ml)
RNase A (50 mg/ml)
Columnas Midi/Maxi
Midi/Maxi Columns
Filtros Plegados
Folded Filters
Ref.
Ref. RBMEPS04
25 Midipreps
Ref. RBMEPS05
10 Maxipreps
Tª
PM1
110 ml
110 ml
4ºC
PM2
110 ml
110 ml
RT
PM3
110 ml
110 ml
4ºC
PEQ
130 ml
130 ml
RT
PW
360 ml
360 ml
RT
PEL
220 ml
130 ml
RT
PRN
200 µl
200 µl
4ºC
PC
25 unid.
10 unid.
RT
PFF
25 unid.
10 unid.
RT
Equipos y reactivos necesarios no incluidos en
el kit:
Equipment and additional reagents required
* 70 % Ethanol
* Centrifuge and tubes for harvesting bacterial
cultures, and precipitate DNA, capable to spin
speed of >15.000 xg
* Tubes for collecting and precipitating eluted
plasmid DNA
* 100 % Isopropanol
* TE Buffer
* Etanol 70 %.
* Centrífuga y tubos para recolectar cultivos
bacterianos y precipitar ADN aptos para
velocidades > 15.000 xg
* Tubos para recoger y precipitar el ADN
plasmídico eluido
* Isopropanol 100%
* Tampón TE
3. PROTOCOLO GENERAL
GENERAL PROCEDURE
3.1 Consideraciones preliminares
3.1 Preliminary conditions
•
•
Varios factores pueden influir en la obtención
del ADN plasmídico. Estos incluyen el número
de copias de vector, el inserto de ADN, la cepa
huésped, condiciones de crecimiento y el
medio.
Capacidad de Unión.
Binding Capacity
Volumen de Cultivo para
plásmidos “High copy”
High-copy plasmids
culture volume
Volumen de Cultivo para
plásmidos “Low copy”
Low-copy plasmids
culture volume
Several factors can interfere in the plasmid
DNA obtaining. These include the number of
vector copies, the DNA insert, the host cell,
growing conditions and medium.
MIDIPREP
MAXIPREP
100 µg
500 µg
25 ml
100 ml
100 ml
500 ml
2/7
04/10
RBMEPS04/RBMEPS05
3.2 Preparaciones preliminares
3.2 Preliminary Preparations
•
•
•
Añadir la RNasa suministrada al Tampón de
Resuspensión PM1 y conservar a 4ºC.
Verificar que la Solución de Lisis PM2 no
tiene SDS precipitado debido a las bajas
temperaturas. Si es necesario, disolver el SDS
calentando a 37ºC.
•
Add provided RNase A to the PM1 Solution
and store at 4ºC.
Verify that the Lysis Solution PM2 does not
contain precipitated SDS due to the low
temperatures. If necessary, dissolve the SDS
heating at 37°C.
3.3. Protocolo de extracción de ADN plasmídico a partir de Plásmidos “HIGH-COPY”
( > 20 copias/célula). Midiprep (5-25 ml) / Maxiprep (25-100 ml)
1.
2.
3.
4.
Preparar un cultivo bacteriano: Empezar
aislando una colonia bacteriana a partir de una
placa e inocular un cultivo iniciador de 2-5 ml
de caldo LB que contenga el antibiótico
apropiado. Incubar durante aproximadamente
8h a 37ºC con agitación constante (aprox.300
rpm). Diluir el cultivo iniciador 1/500 o 1/1000
en un medio selectivo, crecer a 37ºC durante
12-16 horas con agitación constante (aprox.300
rpm).
Recolectar las células bacterianas
centrifugando a 6,000 x g durante 15 min at
4°C. Cuidadosamente descartar el
sobrenadante.
Lisis Celular:
3.1. Resuspender el pellet bacteriano en 4 ml /
10 ml de Tampón de Resuspensión
(+Rnasa A), (PM1) asegurándose de la
completa resuspensión de las células. Una
incompleta resuspensión en este paso
producirá un bajo rendimiento de ADN.
Utilizar un tubo de centrífuga capaz de
soportar altas velocidades.
3.2. Añadir 4 ml / 10 ml de Tampón de Lisis
(PM2) a la suspensión . Suavemente
invertir el tubo 8-10 veces hasta que la
mezcla aparezca clara y viscosa. No
utilizar vortex. Se puede incubar 3
minutos, pero nunca más de 5 minutos.
3.3. Añadir 4 ml / 10 ml de Tampón de
Neutralización (PM3) (4°C) a la
suspensión . Suavemente invertir el tubo
8-10 veces hasta que se forme una
suspensión homogénea que contenga un
floculado blanco. Se recomienda la
incubación durante 10-15 minutos en
hielo. Equilibrar la columna durante este
periodo de tiempo.
Equilibrar la columna: Equilibrar una MIDI
/ MAXI Columna con 5 ml / 10 ml de
Tampón de Equilibración (PEQ). Permitir
que la columna se llene por gravedad y
5.
6.
7.
8.
3/7
eliminar el líquido que fluye a través de la
columna.
Clarificar el lisado, siguiendo una de las dos
opciones, Opción 1 u Opción 2, descritas a
continuación. Este paso es extremadamente
importante; un exceso de flóculos en la
suspensión puede obturar la columna en los
siguientes pasos.
5.1. Opcion 1: Filtrar la suspensión.
Colocar un filtro plegado (PFF) en un
pequeño embudo, humedecer el filtro con
algunas gotas de Tampón de equilibración
o agua libre de nucleasas. Añadir el lisado
bacteriano y recoger el líquido que fluye
en un tubo libre de nucleasas. Este
método produce un lisado limpio pero el
rendimiento de ADN plasmídico puede
ser menor que con el método de
centrifugación aunque es un método más
rápido y sin flóculos residuales.
5.2. Opcion 2: Centrifugar la suspensión.
Centrifugar a >15,000 x g durante 30
min / 40 min a 4°C. Si la suspensión
contiene floculados residuales después de
la primera centrifugación, repetir este
paso.
Unir el ADN plasmídico a la columna:
Añadir el lisado clarificado del paso 5 a la
columna equilibrada. Permitir que el líquido
fluya por gravedad.
Lavar la columna con 12 ml / 36 ml de
Tampón de Lavado (PW). Eliminar el líquido
que fluye a través de la columna.
Eluir el ADN plasmídico con 8 ml / 12 ml de
Tampón de Elución (PEL) y recolectar la
muestra por gravedad en un tubo de
centrifugación libre de nucleasas. Precipitar el
eluido tan pronto como sea posible, de todas
formas, puede ser almacenado a 4ºC durante
varias horas. En este caso, es muy importante
que el eluido alcance la temperatura ambiente
antes de la precipitación del ADN plasmídico
Precipitar el ADN: Añadir 6 ml / 9 ml de
isopropanol para precipitar el ADN
plasmídico. Mezclar con cuidado y centrifugar
a 15,000 x g durante 30 min a 4°C.
Cuidadosamente eliminar el sobrenadante para
no perder ADN plasmídico.
10. Lavar y secar el pellet de ADN: Añadir 2 ml
/ 5 ml de 70% etanol a temperatura
ambiente al pellet. Agitar mediante vortex
brevemente y centrifugar a 15,000 x g durante
10 min . Cuidadosamente eliminar todo el
etanol del tubo con una punta de pipeta. Dejar
secar el pellet 10-20 min a temperatura
ambiente (20-25°C). No sobresecar el pellet
ya que sino el ADN será difícil de resuspender.
11. Resuspender el ADN: Redisolver el pellet de
ADN plasmídico en una cantidad apropiada de
TE o agua libre de nucleasas con constante y
suave agitación durante 10-60 minutos o
redisolver el pellet lavando las paredes para
recuperar todo el ADN plasmídico,
especialmente si se utilizan tubos de vidrio
para centrifugar.
9.
3.3 Protocol for plasmid DNA extraction from HIGH-COPY PLASMID (> 20 copies/cell).
Midiprep (5-25 ml) / Maxiprep (25-100 ml)
1.
2.
3.
4.
5.
Prepare an overnight culture: Begin with an
isolated bacterial colony from a fresh plate and
inoculate a starter culture of 2-5 ml LB
medium containing the appropriate
antibiotic(s). Incubate for approx. 8 h at 37ºC
with vigorous shaking (approx.300 rpm).
Dilute the starter culture 1/500 to 1/1000 into
selective medium, grow at 37ºC for 12-16 h
Harvest bacterial cells from an LB culture by
centrifugation at 6,000 x g for 15 min at 4°C.
Carefully discard the supernatant.
Cell Lysis:
3.1. Resuspend the pellet of bacterial cells in
4 ml / 10 ml of Resuspension Buffer (+
RNase A) (PM1) .
3.2. Add 4 ml / 10 ml of Lysis Buffer (PM2)
to the suspension. Mix gently by inverting
the tube 6-8 times. Incubate the mixture at
room temperature (20-25°C) for 3 min
(max 5 min). Do not vortex since this will
release contaminating chromosomal DNA
from the cellular debris into the
suspension.
3.3. Add 4 ml / 10 ml of pre-cooled
Neutralization Buffer (PM3) (4°C) to the
suspension . Immediately mix the lysate
by gently inverting the tube 6-8 times
until a homogeneous suspension
containing an off-white flocculate is
formed. Incubate the suspension on ice
for 10-15 min. Equilibrate the column
during this time.
Equilibrate the column: Equilibrate a MIDI /
MAXI Column with 5 ml / 10 ml of
Equilibration Buffer (PEQ). Allow the
column to empty by gravity flow. Discard the
flow-through.
Clarify the lysate: Clear the bacterial lysate by
following either Option 1 or Option 2
described below. This step is extremely
important; excess flocculate left in the
suspension may clog the Column in later steps.
5.1. Option 1: Filter the suspension. Place
Folded Filter (PFF) in a small funnel for
support and pre-wet the filter with a few
drops of Equilibration Buffer or nuclease-
free H2O. Load the bacterial lysate onto
the pre-wet filter and collect the flowthrough into a clean, nuclease-free tube.
This method produces a clean lysate but
the yield of plasmid DNA can be e smaller
than with the centrifugation method.
5.2. Option 2: Centrifuge the suspension.
Centrifuge at >15,000 x g for 30 min / 40
min at 4°C. If the suspension contains
residual flocculate after the first
centrifugation, repeat this step.
6. Bind plasmid to column: Load the cleared
lysate from Step 5 onto the equilibrated
Column. Allow the column to empty by gravity
flow.
7. Wash the column with 12 ml / 36 ml of Wash
Buffer (PW). Discard flow-through.
8. Elute the plasmid DNA with 8 ml / 12 ml of
Elution Buffer (PEL) and collect the sample
by gravity flow into a clean, nuclease-free tube.
Precipitate the elute as soon as possible,
however, it may be stored in a closed tube at
4°C for several hours. In this case, it is very
important to pre-warm the elute to room
temperature before the plasmid DNA is
precipitated.
9. Precipitate DNA: Add 6 ml / 9 ml of roomtemperature isopropanol to precipitate the
eluted plasmid DNA. Mix carefully and
centrifuge at 15,000 x g for 30 min at 4°C.
10. Wash and dry DNA pellet: Add 2 ml / 5 ml of
room-temperature 70% ethanol to the pellet as
indicated below. Vortex briefly and centrifuge
at 15,000 x g for 10 min. Carefully remove
ethanol from the tube with a pipette tip. Allow
the pellet to air dry 10-20 min at room
temperature (20-25°C), no less than the
indicated time. Do not over-dry the pellet as
the DNA will become difficult to resuspend.
11. Resuspend DNA in an appropriate volume of
TE Buffer or nuclease free H2O with constant,
gentle shaking for 10-60 min or redissolve the
DNA pellet by rinsing the walls to recover all
the DNA, especially if glass tube has been
used.
4/7
04/10
RBMEPS04/RBMEPS05
3.4 Protocolo de extracción de ADN plasmídico a partir de Plásmidos “LOW-COPY”
( < 20 copias/célula). Midiprep (10-100 ml) / Maxiprep (100-500 ml)
continuación. Este paso es extremadamente
importante; un exceso de flóculos en la
suspensión puede obturar la columna en los
siguientes pasos.
5.1. Opcion 1: Filtrar la suspensión.
Colocar un filtro plegado (PFF) en un
pequeño embudo, humedecer el filtro con
algunas gotas de Tampón de equilibración
o agua libre de nucleasas. Añadir el lisado
bacteriano y recoger el líquido que fluye
en un tubo libre de nucleasas. Este
método produce un lisado limpio pero el
rendimiento de ADN plasmídico puede
ser menor que con el método de
centrifugación aunque es un método más
rápido y sin flóculos residuales.
5.2. Opcion 2: Centrifugar la suspensión.
Centrifugar a >15,000 x g durante 30
min / 40 min a 4°C. Si la suspensión
contiene floculados residuales después de
la primera centrifugación, repetir este
paso.
6. Unir el ADN plasmídico a la columna:
Añadir el lisado clarificado del paso 5 a la
columna equilibrada. Permitir que el líquido
fluya por gravedad.
7. Lavar la columna con 12 ml / 30 ml de
Tampón de Lavado (PW) . Eliminar el
líquido que fluye a través de la columna.
8. Eluir el ADN plasmídico con 8 ml / 12 ml de
Tampón de Elución (PEL) y recolectar la
muestra por gravedad en un tubo de
centrifugación libre de nucleasas. Precipitar el
eluido tan pronto como sea posible, de todas
formas, puede ser almacenado a 4ºC durante
varias horas. En este caso, es muy importante
que el eluido alcance la temperatura ambiente
antes de la precipitación del ADN plasmídico
9. Precipitar el ADN: Añadir 6 ml / 9 ml de
isopropanol para precipitar el ADN
plasmídico. Mezclar con cuidado y centrifugar
a 15,000 x g durante 30 min a 4°C.
Cuidadosamente eliminar el sobrenadante para
no perder ADN plasmídico.
10. Lavar y secar el pellet de ADN: añadir 2 ml /
5 ml de 70% etanol al pellet, agitar mediante
votex brevemente y centrifugar a 15,000 x g
durante 10 min. Cuidadosamente eliminar
todo el etanol del tubo con una punta de pipeta.
Dejar secar el pellet 10-20 min a temperatura
ambiente (20-25°C). No sobresecar el pellet
ya que sino el ADN seré difícil de resuspender.
11. Resuspender el ADN: Redisolver el pellet de
Si se trabaja con vectores “low copy”, será
beneficioso incrementar el volúmenes de los
tampones para aumentar la eficiencia de la lisis
alcalina y de esta forma el rendimiento del ADN
palsmídico. Si se necesita cantidades adicionales
de tampones, sus composiciones se suministran
en el apéndice A.
1. Preparar un cultivo bacteriano: Empezar
aislando una colonia bacteriana a partir de una
placa e inocular un cultivo iniciador de 2-5 ml
de caldo LB que contenga el antibiótico
apropiado. Incubar durante aproximadamente
8h a 37ºC con agitación constante (aprox.300
rpm). Diluir el cultivo iniciador 1/500 o 1/1000
en un medio selectivo, crecer a 37ºC durante
12-16 horas con agitación constante (aprox.300
rpm).
2. Recolectar las células bacterianas,
centrifugando a 6,000 x g durante 15 min. a
4°C. Cuidadosamente descartar el
sobrenadante.
3. Lisis Celular:
3.1. Resuspender el pellet bacteriano en 8 ml /
24 ml de Tampón de Resuspensión
(+Rnasa A) (PM1), asegurándose de la
completa resuspensión de las células. Una
resuspensión incompleta en este paso
producirá un bajo rendimiento de ADN.
Utilizar un tubo de centrífuga capaz de
soportar altas velocidades.
3.2. Añadir 8 ml / 24 ml de Tampón de Lisis
(PM2) a la suspensión . Suavemente
invertir el tubo 8-10 veces hasta que la
mezcla aparezca clara y viscosa. No
utilizar vortex. Se puede incubar 3
minutos, pero nunca más de 5 minutos.
3.3. Añadir 8 ml / 24 ml de Tampón de
Neutralización (PM3) (4°C) a la
suspensión . Suavemente invertir el tubo
8-10 veces hasta que se forme una
suspensión homogénea que contenga un
floculado blanco. Se recomienda la
incubación durante 10-15 minutos en
hielo. Equilibrar la columna durante este
periodo de tiempo.
4. Equilibrar la columna: Equilibrar una MIDI
/ MAXI Columna con 5 ml / 10 ml de
tampón de Equilibración (PEQ). Permitir
que la columna se llene por gravedad y
eliminar el líquido que fluye a través de la
columna.
5. Clarificar el lisado siguiendo una de las 2
opciones, Opción 1 o Opción 2 descritas a
5/7
ADN plasmídico en una cantidad apropiada de
TE o agua libre de nucleasas con constante y
suave agitación durante 10-60 minutos o
redisolver el pellet lavando las paredes para
recuperar todo el ADN plasmídico,
especialmente si se utilizan tubos de vidrio
para centrifugar.
3.4 Protocol for plasmid DNA extraction from LOW-COPY PLASMID (< 20 copies/cell).
Midiprep (10-100 ml) / Maxiprep (100-500 ml)
5.1. Option 1: Filter the suspension. Place
Folded Filter (PFF) in a small funnel for
support and pre-wet the filter with a few
drops of Equilibration Buffer or nucleasefree H2O. Load the bacterial lysate onto
the pre-wet filter and collect the flowthrough into a clean, nuclease-free tube.
This method produce a clean lysate but
the yield of plasmid DNA can be e smaller
than with the centrifugation method.
5.2. Option 2: Centrifuge the suspension.
Centrifuge at >12,000 x g for 30 min / 40
min at 4°C. If the suspension contains
residual flocculate after the first
centrifugation, repeat this step.
6. Bind plasmid to column: Load the cleared
lysate from Step 5 onto the equilibrated
Column. Allow the column to empty by gravity
flow.
7. Wash the column with 12 ml / 30 ml of Wash
Buffer (PW) . Discard flow-through.
8. Elute DNA with 8 ml / 12 ml of Elution Buffer
(PEL) and collect the sample by gravity flow
into a clean, nuclease-free tube. Precipitate the
elute as soon as possible, however, it may be
stored in a closed tube at 4°C for several
hours. In this case, it is very important to prewarm the elute to room temperature before the
plasmid DNA is precipitated.
9. Precipitate DNA: add 6 ml / 9 ml of roomtemperature isopropanol to precipitate the
eluted plasmid DNA. Mix carefully and
centrifuge at 15,000 x g for 30 min at 4°C.
10. Wash and dry DNA pellet: add 2 ml / 5 ml of
room temperature 70% ethanol to the pellet.
Vortex briefly and centrifuge at 15,000 x g for
10 min. Carefully remove ethanol from the
tube with a pipette tip. Allow the pellet to air
dry 10-20 min at room temperature (20-25°C),
no less than the indicated time. Do not overdry the pellet as the DNA will become difficult
to resuspend.
11. Resuspend DNA: Redissolve the DNA pellet in
an appropriate volume of TE Buffer or
nuclease free H2O with constant, gentle
shaking for 10-60 min or redissolve the DNA
pellet by rinsing the walls to recover all the
DNA, especially if glass tube have been used.
If working with low-copy vectors, it may be
beneficial to increase the lysis buffer volumes in
order to increase the efficiency of alkaline lysis,
and thereby the DNA yield. In case additional
Buffers are needed, their compositions are
provided en Appendix A
1. Prepare an overnight culture: Begin with an
isolated bacterial colony from a fresh plate and
inoculate a starter culture of 2-5 ml LB
medium containing the appropriate
antibiotic(s). Incubate for approx. 8 h at 37ºC
Dilute the starter culture 1/500 to 1/1000 into
selective medium, grow at 37ºC for 12-16 h
2. Harvest bacterial cells from an LB culture by
centrifugation at 6,000 x g for 15 min at 4°C.
3. Cell Lysis:
3.1. Resuspend the pellet of bacterial cells in
8 ml / 24 ml of Resuspension Buffer (+
RNase A) (PM1) .
3.2. Add 8 ml / 24 ml of Lysis Buffer (PM2)
to the suspension. Mix gently by inverting
the tube 6-8 times. Incubate the mixture at
room temperature (20-25°C) for 2–3 min
(max 5 min). Do not vortex since this will
release contaminating chromosomal DNA
from the cellular debris into the
suspension.
3.3. Add 8 ml / 24 ml of pre-cooled
Neutralization Buffer (PM3) (4°C) to
the suspension . Immediately mix the
lysate by gently inverting the tube 6-8
times until a homogeneous suspension
containing an off-white flocculate is
formed .Incubate the suspension on ice
for 5 min. Equilibrate the column during
this time.
4. Equilibrate the column: Equilibrate a MIDI /
MAXI Column with 5 ml / 10 ml of
Equilibration Buffer (PEQ) Allow the column
to empty by gravity flow. Discard the flowthrough.
5. Clarify the lysate: Clear the bacterial lysate by
following either Option 1 or Option 2
described below. This step is extremely
important; excess flocculate left in the
suspension may clog the Column in later steps.
6/7
04/10
RBMEPS04/RBMEPS05
APENDICE A:
APPEDIX A:
Tampón de resuspensión: 50mM Tris-HCl, pH
8.0; 10 mM EDTA; 100 µg Rnasa A.
Disolver 6.06 gr Tris base, 3.72 gr Na2EDTA.2H20
en 800 ml agua destilada. Ajustar el pH a 8.0 con
HCl. Ajustar el volumen a un 1 litro con agua
destilada. Añadir 100 µg Rnasa A.
Tampón de Lisis: 200 mM NaoH, 1% SDS (w/v)
Disolver 8.0 gr NaOH pellets en 950 ml agua
destilada y añadir 50 ml de una solución de SDS
20% (w/v). El volumen final debería ser de 1 litro.
Tampón de Neutralización: 3.0 M acetato de
potasio, pH 5.5
Disolver 294.5 gr acetato potásico en 500 ml agua
destilada. Ajustar el pH a 5.5 con glacial ácido
acético glacial (aprox 110 ml). Ajustar el volumen
a 1 litro con agua destilada.
Resuspension Buffer: 50mM Tris-HCl, pH 8.0;
10 mM EDTA; 100 µg Rnase A.
Dissolve 6.06 gr Tris base, 3.72 gr Na2EDTA.2H20
in 800 ml distilled water. Adjust the pH to 8.0 with
HCl. Adjust the volume to 1 litre with distilled
water. Add 100 µg Rnase A.
Lysis Buffer: 200 mM NaoH, 1% SDS (w/v)
Dissolve 8.0 gr NaOH pellets in 950 ml distilled
water and add 50 ml of a 20% SDS (w/v) solution.
The final volume should be 1 litre.
Neutralization Buffer: 3.0 M potassium acetate,
pH 5.5
Dissolve 294.5 gr potassium acetate in 500 ml
distilled water. Adjust the pH to 5.5 with glacial
acetic acid (approx 110 ml). Adjust the volume to 1
litre with distilled water.
7/7

high purity realplasmid kit

Transcripción

Documentos relacionados

EXTRACCION DE ADN PLASMÍDICO

Hacia el conocimiento de la reparación del ADN