CEN/TR 16338:2012 - J. AOAC International Vol.93 No 2

Transcripción

CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN
Centro Nacional
de Alimentación
CRITERIOS DE VALIDACION DE
METODOS INMUNOLOGICOS PARA LA
DETECCION DE ALERGENOS - ELISA
Mª Isabel Prieto Santos
Servicio de Biotecnología
JORNADAS DE REFERENCIA 2013. ANÁLISIS DE ALIMENTOS
Majadahonda,
5 alde7Alimentos,
de junio
Jornadas
de Referencia 2013. Análisis
Majadahonda 5 al 7 de junio
VALIDACION
Es la confirmación, a través del examen y el
aporte de evidencias objetivas, de que se
cumplen los requisitos particulares para un
uso especifico previsto (Norma UNE/IEC
17025: 2005)
Jornadas de Referencia 2013. Análisis de Alimentos, Majadahonda 5 al 7 de junio
VALIDACION de sistemas ELISA para detección
de alérgenos?
1.- VALIDACION – Parte del proceso de fabricación de los kits
 Garantizar que el método es adecuado para el fin
previsto
 Asegurar resultados comparables y reproducibles
entre diferentes laboratorios
2.- VALIDACION INTERNA- Implantación del método en el
laboratorio
 Garantizar que las especificaciones de los kits son
reproducibles en el laboratorio
GUIAS/ARMONIZACION:
Nivel Europeo: UNE-CEN/TR 16338 IN: 2012 . Productos
alimenticios. Detección de alérgenos alimenticios . Formato para
proporcionar información sobre métodos inmunológicos y de biología
molecular. (CEN/TC2/275/WG12 “Food allergens”)
• EN 15633-1:2009 Productos alimenticios- Detección de alérgenos mediante métodos
inmunológicos. Parte I: Consideraciones generales
• EN 15634-1:2009 Productos alimenticios- Detección de alérgenos mediante métodos biológicos
moleculares. Parte I: Consideraciones generales
• EN 15842:2010 Productos alimenticios- Detección de alérgenos –Consideraciones generales y
validación de los métodos.
• ISO 5725-1:1994 Exactitud (veracidad y precisión) de resultados y métodos de medición parte 1:
Principios generales y definiciones.
AOAC Presidential taskforce
Validation Procedures for Quantitative Food Allergen ELISA Methods:
Community Guidance and Best Practices (J. AOAC International Vol.93
No 2, 2010) ( Appendix M: 2012)
UNE-CEN /TR 16338: 2012 / AOCS, 2010
INFORMACIÓN QUE DEBEN CONTENER LOS MÉTODOS
INMUNOLOGICOS (ELISA)
Información general
Descripción detallada del método
Validación y criterios de funcionamiento
•
•
•
CEN/TR 16338:2012 / J. AOAC International Vol.93 No 2, 2010
Título
Descripción del propósito del análisis y su trasfondo científico
Objetivo y campo de aplicación
• Información sobre el anticuerpo
 Monoclonal o policlonal?
 Especificidad del anticuerpo
 Diana del Anticuerpo: una sola proteína? Varias
proteínas?
 Tipo de proteína utilizada: Fraccionada, modificada o
sintetizada?
• Información sobre el calibrante
 Debe estar claramente identificado
 Qué es ? Cómo ha sido preparado?
 Identificar como se expresa la concentración
 En que unidades
 Indicar si hace referencia al alimento completo o al
nivel de proteína.
• Información sobre la matrices
 Tipo de matrices a los que puede ser aplicado
 Estado de la matriz (cruda, procesada, ambos)
 Descripción de muestras y matrices en las que se ha
validado el método
• Información sobre la reactividad cruzada
 Tipos de alimentos en los que se ha testado
 Información sobre cualquier tipo de reactividad cruzada
CEN/TR 16338:2012
• Información suficiente sobre la forma de utilización,
reactivos y equipos necesarios
• Forma de preparación de los reactivos
• Forma de preparación de las muestras
• Descripción del procedimiento inmunológico
• Descripción de la curva estándar : modelo de ajuste
de la curva (ej: cuadrática, cubic spline, regresión
lineal)
• Forma de lectura e interpretación de resultados
• Cálculos: Describir con claridad los cálculos o
modelos matemáticos para la obtención de los
resultados
• Factores de conversión (ej.: de cantidad de proteína
total a cantidad de componente alergénico)
• Criterios de aceptación o rechazo
Estatus de Validación y criterios de
funcionamiento
Información sobre el proceso de validación
Resultados de procedimiento de
validación interna
Resultados de validación
(Inter-laboratorio)
Estatus de Validación y criterios de funcionamiento
Validación interna
Validación (Inter-laboratorio)
PRECISION
SENSIBILIDAD
EXACTITUD
ESPECIFICIDAD
ROBUSTED
Nº de laboratorios
Datos de eliminación de laboratorios
r ,Sr , RSDr
R, SR, RSDR
VALIDACION INTERNA: PRECISION ( Variación intra e
inter análisis)
CEN/TR 16338:2012
Variación intra-análisis
SD y RSD %
• Patrones (medidos con un número suficiente de
repeticiones)
• Muestras contaminadas artificialmente
Variación inter-análisis
SD y RSD %
• Patrones (medidos por duplicados): obtenido de un
número mínimo de seis repeticiones independientes
• Muestras contaminadas artificialmente
VALIDACION INTERNA : SENSIBILIDAD
• Límite de detección (LD):Cantidad o concentración mínima de analito que
se puede detectar con confianza, aunque no necesariamente cuantificarse, en la
muestra para análisis, demostrado mediante una prueba colaborativa u otro tipo
de validación adecuada (EN 15842:2010)
El LD y el intervalo de aplicación del método
– Indicado en términos de concentración (mg/kg) del analito en la
muestra
– Método utilizado para calcular el LD y matrices utilizadas
3 veces SD matriz blanco
Muestra fortificada a ese nivel
– Al menos 10 determinaciones en matrices relevantes
preparaciones / medidas en duplicado)
– LD un nivel de confianza del 95%, α y β se establecen en 0,05.
(10
VALIDACION INTERNA: SENSIBILIDAD
• Límite de cuantificación (LC):
Cantidad o concentración mínima de
analito que se puede detectar cuantitativamente en una muestra para análisis
con un nivel aceptable de precisión y exactitud, demostrado mediante una
prueba colaborativo u otro medio de validación adecuada. (EN 15842:2010)
- CEN/TR 16338:2012
• Calculado sobre muestras cargadas: (20 determinaciones
independientes en muestras conteniendo el analito al nivel
estimado)
• Determinado con un % de RSD aceptable
- J. AOAC International Vol.93 No 2, 2010
10 veces SD de matriz blanco
VALIDACION INTERNA: PRECISION EXACTITUD
CEN/TR 16338:2012
– Comparación con MRC
– Comparación con un Material suficientemente
caracterizado
– Comparación con un método de referencia
VALIDACION INTERNA: EXACTITUD
(J. AOAC International Vol.93 No 2, 2010)
• Exactitud indicada en % Recuperación
• Tiene en cuenta la dificultad en algunas
matrices (métodos ELISA)
– Ideal rango 80 -120 % (spiked sample)
– Admite 50 -150 % (incurred sample)
VALIDACION INTERNA: ESPECIFICIDAD / SELECTIVIDAD
CEN 16338:2012 / J. AOAC International Vol.93 No 2, 2010
•Determinar que el método es capaz de discriminar entre el analito
diana y otros componentes presentes en la muestra
•Testar entre 40 y 60 diferentes alimentos
•Indicar aquellos productos que puedan ocasionar interferencias en el
método tanto de forma positiva como negativa
•Información sobre posibles interferencias debido a mezclas de
matrices
J. AOAC International Vol.93 No 2, 2010 ( Ejemplos de matrices
que deben ser testadas)
VALIDACION INTERNA: ROBUSTEZ
• Capacidad de los métodos para resistir los cambios, en
las condiciones experimentales con la menor
desviación en el resultado
• Indicar parámetros críticos e incluso cambios que
influyen en el resultado final
– Cambios en las condiciones de trabajo ( cambios de temperatura 18ºC,
temperatura ambiente, 37ºC)
– Tiempos de incubación y volúmenes (J. AOAC ± 5 %)
– Temperaturas de incubación (J. AOAC ± 3 ºC )
– Estabilidad de los reactivos
– Cada lote debe ser comparado con nuevos lotes
VALIDACION INTERLABORATORIO
J. AOAC International Vol.93 No 2, 2010
• Número de laboratorios
>8
• Número de matrices, niveles
de concentración y replicas
• 2 matrices
• 4 niveles de concentración por
matriz
• dos replicas de matriz para cada
concentración
CEN/TR 16338:2012
•Número de laboratorios
•Número de laboratorios
eliminados y forma de
eliminación
•Valores medios
•repetibilidad (r, Sr, RSDr)
•Reproducibilidad (R, SR, RSDR)
VALIDACION INTERNA
(Implantación del método en el
laboratorio)
OBJETO: Comprobar si los resultados indicados por el
fabricante son reproducibles en el laboratorio
Planteamiento de validación:
• Comprobar la estabilidad del kit: Comportamiento
de la curva de calibrado respecto a la curva certificada
•
•
•
•
Determinación experimental del LD y LC
repetibilidad y Reproducibilidad interna
Exactitud en distintas matrices
Opcional: Comprobación de especificidad
•
Comprobar la estabilidad del kit : Comportamiento de la
curva de calibrado respecto a la curva certificada
Curvas: “cubic spline” , polinomial, etc
CURVA CERTIFICADO
CURVA ENSAYO
NORMALIZACION CURVA
(B/Bmax)
120
B/Bmax
Curva
Curva
certificado
ensayo
Normalización DO %
100
80
60
40
13
13
23
20
42
39
70
66
curva Certificado
curva Ensayo
20
0
0
50
mg/kg de alérgeno
100
Variación permitida
± 20 % - 25%
Curvas Log/logit (regresión lineal)
Log (ppm)
-0,20
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
3,50
3,00
2,50
1,50
1,00
0,50
0,00
-0,50
-1,00
Standards
Samples
Lineal (Standards)
Logit
2,00
CURVA
Coefic. Correlación 0,9987
Pendiente
-2,4255
Intersección Y
2,7507
• Determinación experimental del LD y LC
El LD y LC de los kits : Determinado en base al estándar
de menor concentración
Norma UNE EN 15842: 2010 . El LD debería expresarse en referencia a la muestra para
análisis. Como mínimo, el LD debe expresarse en relación al material de referencia y un
valor relativo basado en matrices definidas.
Comprobar el LC y LD experimental en muestras cargadas :
 Efecto de la matriz sobre el LD y LC
 Comprobar en diferentes matrices
 Criterio de recuperación
LC/LD: Planteamiento del ensayo ?
ENSAYO CUALITATIVO
•
•
•
Punto de corte : SLD/LC
Establecer un criterio de tolerancia (± DO. SLC/LD )
Comprobar detección en distintas matrices (≥ 5)
ENSAYO CUANTITATIVO
•
•
Establecer un criterio de exactitud (% Recuperación)
Comprobar detección en distintas matrices (≥ 5)
• Repetibilidad y Reproducibilidad interna
repetibilidad
• RSD % entre replicas
• < 15 % en valores de DO
• < 20 % en valores de concentración
• (EN 15633-1:2009)
Reproduciblididad
• RSD % entre ensayos
• ( < 25 % , < 35 %)
• Exactitud
Comprobar en 3 niveles del rango de trabajo : (Bajo, medio, alto)
 Número de matrices significativo (≥ 5)
 Matrices representativas
 Preparación de muestras cargadas con MR
 Criterio optimo 80-120% (más permisivos con
determinadas matrices)
EXPRESION DE RESULTADOS (EN 15842:2010)
• CUALITATIVOS:
– Sin ambigüedades ( +/-)
– DETECTADO/NO DETECTADO (Incluyendo el
Límite de detección del ensayo)
• CUANTITATIVOS:
– mg de analito por kg de muestra ( mg/kg)
Centro
Nacional de
Alimentación
MUCHAS GRACIAS
Servicio de Biotecnología
Mª Isabel Prieto Santos [email protected] 913380688
Mª del Camino Martín Forero
Silvia Gil Alcalde
Josefina Gangoso Herreras
Mercedes Fernández de la Puebla
Mª Isabel Rodríguez Pérez
Mª Luisa Salvador Pulgar
Esther Rico Cañada
Jornadas
de Referencia
2013 . Análisis deMartín
Alimentos. Majadahonda, 5 al 7 de junio
Miriam
Gómez

CEN/TR 16338:2012 - J. AOAC International Vol.93 No 2

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