practica de laboratorio cocos piogenos

practica de laboratorio cocos piogenos

Universidad de San Carlos de Guatemala
Facultad de Ciencias Médicas
Curso de Inmunología y Microbiología
Tercer año, Fase II
Instructivo de Laboratorio
Cocos Piógenos
Dra. Débora Esmeralda Aldana
Introducción:
El presente instructivo de laboratorio brinda los fundamentos teórico
prácticos para el estudio de algunas de las bacterias denominadas “cocos
piógenos”, tienen forma esférica o cocoide, son grampositivas y
conforman un importante grupo de patógenos para el ser humano que se
asocian a un amplio espectro de enfermedades. Tienen como característica,
que estimulan en el hospedero una reacción inflamatoria intensa llevada a
cabo principalmente por neutrófilos, que liberan accidentalmente o al
morir enzimas que producen licuefacción de células vecinas y junto con las
bacterias y sus productos metabólicos forman un residuo semilíquido
viscoso llamado pus, de ahí el nombre de piógenos.
Estos patógenos tienen una amplia distribución, siendo algunos de
ellos, parte de la microbiota indígena. Por su importancia clínica y sus
características epidemiológicas es indispensable conocer las características
microbiológicas de estos microorganismos y las pruebas de laboratorio que
permiten su identificación.
Objetivos:
Al finalizar la práctica el estudiante sea capaz de:
1. Reconocer las características morfológicas, estructurales y
metabólicas de Streptococcus pyogenes
y del Staphylococcus
aureus
2. Describir y aplicar las técnicas de laboratorio más frecuentemente
usadas para el diagnóstico microbiológico de enfermedades
asociadas a estos Cocos piógenos.
Material proporcionado por el Laboratorio:
1. Medios de cultivo:
2.
3.
4.
5.
a) Agar sangre de carnero sembrado con Streptococcus pyogenes
b) Agar sangre de carnero y Agar manitol sal sembrado con
Staphylococcus aureus
c) Caldo nutritivo con Streptococcus pyogenes
d) Caldo nutritivo con Staphylococcus aureus
Preparaciones con la prueba de la coagulasa
Peróxido de hidrógeno al 30%
Reactivos para la técnica de coloración de Gram
Mechero
Material proporcionado por el estudiante:
- Bata
- Asa bacteriológica (una por grupo)
- Lupa
- Portaobjetos
- Encendedor o fósforos
Actividades a realizar:
A. Identificación de Estreptococos
1. Observe los medios de cultivo de agar sangre y describa las
características morfológicas de las colonias.
2. Describa en el medio de cultivo la presencia o ausencia de
hemólisis (alfa, beta, no hemólisis). Discuta con su profesor (a) las
razones que explican los diferentes tipos de hemólisis y su
importancia clínica.
3. Seleccione con un asa bacteriológica una colonia beta-hemolítica,
una alfa-hemolítica y una no hemolítica, realice un frote, fíjelo a la
llama y coloréelo con la Técnica de Gram, obsérvelo al microscopio
con objetivo 100x e identifique y describa los hallazgos encontrados
(forma, tamaño, tipo de coloración, tipo de agrupación)
4. Realice la prueba de la catalasa (ver anexo)
B. Identificación de Estafilococos
1. Observe los medios de cultivo de agar sangre y describa las
características morfológicas de las colonias.
2. Describa el medio de cultivo manitol sal
observando la
fermentación de manitol (ver anexo)
3. Seleccione con un asa bacteriológica una colonia beta-hemolítica,
una alfa-hemolítica y una no hemolítica, realice un frote, fíjelo a la
llama y coloréelo con la Técnica de Gram, obsérvelo al microscopio
con objetivo 100x e identifique y describa los hallazgos encontrados
( forma, tamaño, tipo de coloración, tipo de agrupación)
4. Observe la prueba de la coagulasa en tubo, discuta con su profesor
(a) los hallazgos y la importancia de esta característica en las
infecciones asociadas a estafilococos (ver anexo)
5. Efectúe la prueba de la catalasa
Bibliografía:
- Staphylococcus, Murray et al, Microbiología Médica, Séptima Edición
capítulo 18
- Streptococcus, Murray et al, Microbiología Médica, Séptima Edición
capítulo 19.
Anexo
1. Hemólisis:
Los estreptococos producen dos hemolisinas, la estreptolisina S, que
es estable en presencia de oxígeno, no inmunogénica y ligada a la célula
que puede lisar hematíes, leucocitos y plaquetas. Esta se produce en
presencia de suero y es la responsable de la ß- hemólisis. La estreptolisina
O es lábil al Oxígeno, capaz de lisar hematíes, leucocitos, plaquetas y
células cultivadas. La hemólisis puede ser inhibida ante un aumento de la
tensión de CO2, ya que puede producirse peroxidasa. Existen distintos tipos
de hemólisis, la hemólisis alfa, es incompleta, aquí los glóbulos rojos que
rodean las colonias son parcialmente dañados pero no lisados, se observa
un enverdecimiento del medio debido a la salida de la célula oxidada de
compuestos del tipo biliverdina, la lisis completa, sí ocurre en las
reacciones beta hemolíticas, en las que hay un aclaramiento completo del
medio.
2. Fermentación de Manitol:
El agar manitol sal es un medio selectivo para el aislamiento de
estafilococos patógenos. Al utilizar este medio se inhibe el crecimiento de
bacterias que no pueden crecer en medios salinos y se aprovecha la
capacidad de los estafilococos de crecer en presencia de cloruro de sodio al
7.5% y de manera específica, la capacidad del Staphylococcus aureus de
fermentar manitol. Las colonias se forman en el medio formando un halo
amarillo en el agar circundante que indica la producción de ácido a partir
del manitol.
3. Prueba de la Catalasa:
El peróxido de hidrógeno se acumula durante el metabolismo celular
o durante la fagocitosis, para protegernos de las bacterias. Todos los
estafilococos producen una enzima llamada catalasa, que cataliza la
conversión del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.
Procedimiento:
1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de H2O2 al 30%
2. Con un palillo estéril transferir una pequeña cantidad del cultivo
puro sobre la gota de agua oxigenada
3. Observar el aparecimiento de burbujas
4. Prueba de la Coagulasa:
Las cepas de S. aureus producen una enzima que tiene una actividad
semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina
insoluble, provocando la formación de un cóagulo visible. Estas bacterias
poseen dos formas de coagulasa: la ligada y la libre. Se cree que la
coagulasa ligada in vivo se une a la pared del estafilococo forzando la
agregación de los estafilococos, formando así una barrera en el sitio de la
infección. La coagulasa libre logra el mismo resultado al reaccionar con un
factor del plasma (una globulina) para originar la estafilotrombina, un
factor semejante a la trombina que cataliza la conversión del fibrinógeno en
fibrina insoluble.
Se utilizan en el laboratorio clínico dos formas de la prueba:
a. Coagulasa en lámina
b. Coagulasa en tubo
Procedimiento de Coagulasa en lámina:
1. Colocar una gota de plasma sobre un portaobjetos limpio y seco
2. Colocar una gota de agua destilada o solución salina cerca de la gota
de plasma (se usará como control)
3. Transferir con un palillo una cantidad de colonia a cada gota,
inoculando primero la gota control. Debe observarse turbio y
homogéneo
4. Observar las preparaciones para evaluar la aparición de pequeños
coágulos
Procedimiento de la Coagulasa en Tubo (procedimiento realizado
previamente en el laboratorio):
1. En un tubo de ensayo colocar 0.5 ml de una dilución 1:4 del plasma
humano
2. Agregar una buena cantidad de colonia al tubo
3. Leer en 1, 2 y 4 horas, incubando a 35ºC