EFECTO DE LA BETAHISTINA SOBRE LA ACTIVIDAD ELÉCTRICA

Transcripción

BENEMERITA
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE PUEBLA
INSTITUTO DE FISIOLOGÍA
EFECTO DE LA BETAHISTINA SOBRE LA
ACTIVIDAD ELÉCTRICA DE LAS NEURONAS
AFERENTES DE LOS CANALES
SEMICIRCULARES DEL AXOLOTL (Ambystoma
tigrinum).
TESIS PROFESIONAL
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS
PRESENTA:
HORTENCIA CHÁVEZ OSEKI
Asesores: Dr. Enrique Soto y MC Rosario Vega.
Puebla, Pue.
Septiembre del 2000
Efecto de la betahistina en los canales semicirculares
RESUMEN
La betahistina (BH), es un análogo de la histamina, y se ha reportado como agonista débil H1 y
H2 y como potente antagonista H3. Se usa en la clínica en desórdenes vestibulares centrales y
periféricos, en donde se ha demostrado su eficacia en reducir el vértigo, náuseas y vómito, y
como terapia de mantenimiento en el síndrome de Menière.
Su mecanismo de acción se ha asociado a la capacidad de la droga para aumentar el
flujo sanguíneo central, coclear y vestibular; también se ha sugerido que actúa a nivel del
núcleo vestibular. Sin embargo, muchos de los casos de vértigo son de origen periférico, y
recientemente se reportó que la betahistina disminuye la frecuencia de descarga de las
aferentes vestibulares, pero el mecanismo mediante el cual produce sus efectos en la periferia
vestibular se desconoce.
Para estudiar el efecto de la betahistina y tratar de dilucidar su mecanismo de acción
periférico, hicimos experimentos con registro extracelular multiunitario en el oído aislado del
axolotl (Ambystoma tigrinum). La preparación se estimuló con aceleraciones sinusoidales, a fin
de registrar la actividad basal y la respuesta a estímulos mecánicos.
Probamos el efecto de la betahistina en un rango de 10 µM a 10 mM, n=32; sobre la
descarga basal y la respuesta a estímulos mecánicos; encontramos que la betahistina
disminuye la frecuencia en la descarga basal, con una IC 50 de 600 µM y la respuesta a
estímulos mecánicos con una IC 50 de 10 mM. El efecto inhibitorio de la betahistina es
dependiente de la dosis y del tiempo de perfusión.
Existen reportes que indican que la histamina ejerce su efecto a través de los receptores
colinérgicos; nosotros encontramos que el bloqueo de los receptores colinérgicos con
antagonistas muscarínicos (atropina 10 µM, n=3) y nicotínicos (d-tubocurarina 10 µM, n=3), no
modifica el efecto de la betahistina. Sin embargo, encontramos que la betahistina 1 mM (n=5)
disminuye el efecto excitatorio del carbacol en un 30 ? 3.4%.
Para determinar si la betahistina produce su efecto a través de la sintetasa del óxido
nítrico (NOS) inhibimos a esta enzima con L-NOARG 3 µM (n=5), observamos que el efecto de
la betahistina se mantiene igual que en los controles.
Con el fin de determinar si la betahistina actúa a nivel postsináptico, estudiamos su
interacción (1 y 10 mM) con agonistas de los aminoácidos excitadores como es el ácido kaínico
1 µM (n=6); la betahistina reduce significativamente el efecto excitador del ácido kaínico en 45.5
? 9.8% y 67.5 ? 2.5, respectivamente. También probamos al ácido quiscuálico (QA), 1 ?M (n=2);
la betahistina 1 mM, redujo el efecto excitatorio del ácido quiscuálico en un 39.7 ? 1.8% con
respecto al control, aun cuando la liberación del neurotransmisor se bloqueó usando soluciones
con alto magnesio y bajo calcio; en estas condiciones, la perfusión de la betahistina (10 ?M a 10
mM, n=15) disminuye el efecto excitatorio del ácido quiscuálico 1 µM (n=15) de una manera
dependiente de la dosis.
Estos resultados indican que la betahistina tiene una acción inhibitoria sobre la
frecuencia de descarga de las aferentes vestibulares. Su efecto no parece involucrar la vía de la
producción del óxido nítrico, ni modificar la liberación de acetilcolina de las fibras eferentes,
pero la betahistina bloquea la respuesta excitadora inducida por el carbacol, lo que sugiere que
la betahistina pudiera actuar sobre la célula ciliada en lugares diferentes de los receptores
colinérgicos. Nuestros resultados también indican que existen receptores para la betahistina
ubicados sobre las neuronas aferentes; parte del efecto de la betahistina pudiera estar dado por
la activación de estos receptores que podrían afectar indirectamente a los receptores de los
1
Hortencia Chávez Oseki
aminoácidos excitadores, o bien por su acción sobre éstos mismos, ya que la inhibición de la
betahistina sobre el efecto excitador del QA es dependiente de la dosis y pareciera ser un
antagonismo competitivo sobre la inhibición de la respuesta a estímulos mecánicos producida
por la betahistina.
INTRODUCCIÓN
El aparato vestibular se localiza dentro del
oído interno y detecta los movimientos de la
cabeza y su posición en el espacio; para
realizar esta función cuenta con epitelios
sensoriales ubicados estratégicamente, que
permiten
detectar
las
aceleraciones
angulares y lineales de la cabeza (Wilson y
Peterson, 1980). El vestíbulo está formado
por un laberinto membranoso que se
encuentra alojado en un laberinto óseo que lo
delimita en toda su extensión. En el interior
del laberinto membranoso se encuentra la
endolinfa; ésta es un medio con alta
concentración de potasio, semejante a la del
líquido intracelular (Figura 1), el espacio
entre el laberinto membranoso y el óseo está
ocupado por la perilinfa, que corresponde al
líquido extracelular.
El oído interno de peces y anfibios
consta exclusivamente del sistema vestibular
que incluye a los canales semicirculares, a
los órganos otolíticos (sáculo, utrículo y
lagena) y a los órganos no otolíticos (papila
amphibiorum y papila basilar) (Pretch, 1976).
Canales semicirculares
El laberinto membranoso incluye tres canales
semicirculares de cada lado: anterior,
posterior y horizontal, conocidos también
como verticales los dos primeros y el último
como lateral; los canales son ortogonales
entre sí; esta posición les permite detectar
aceleraciones angulares en los tres ejes del
espacio. El canal anterior de un lado es
paralelo al canal posterior del oído opuesto, y
los canales horizontales de ambos lados se
encuentran en el mismo plano (Anniko,
1988).
Cada uno de los canales semicircula-
Figura 1. Esquema del neuroepitelio vestibular que
muestra la composición de la endo y la perilinfa. El
epitelio mantiene el gradiente iónico gracias a las
uniones estrechas entre las células que lo forman. La
corriente de transducción es acarreada principalmente
por iones K+ que producen una corriente entrante y
depolarizan la célula.
2
res presenta una dilatación llamada ámpula;
en el interior de ésta se encuentra un epitelio
sensorial formado por células sensoriales
mecanorreceptoras
(células
ciliadas)
dispuestas en forma de
cresta. En la
superficie apical de estas células se localiza,
excéntricamente, un solo kinocilio, que es un
cilio verdadero formado por microtúbulos en
el clásico arreglo de 9+2 (figura 2), así como
50
a
100
estereocilios,
que
son
microvellosidades formadas por actina, que
van disminuyendo en tamaño conforme se
alejan del kinocilio, formando hileras que se
unen entre sí y con el kinocilio a través de las
“uniones de punta”, las cuales se localizan en
la punta de un estereocilio y en la pared
lateral del estereocilio que le sigue en
tamaño; estas uniones se asocian a canales
iónicos mecanosensibles (Gillespie, 1995).
Los cilios están en contacto con una
masa gelatinosa conocida como cúpula, que
se extiende a través de la ámpula,
ocluyéndola. Los desplazamientos de la
endolinfa debidos a las aceleraciones
angulares de la cabeza, deforman la cúpula e
inclinan los cilios; cuando esta inclinación es
en dirección al kinocilio, se produce una
despolarización de las células ciliadas;
cuando la inclinación de los estereocilios es
en sentido contrario al kinocilio, se produce
una hiperpolarización (Hudspeth, 1983).
Cada canal semicircular se origina y
retorna a un saco común llamado utrículo.
Los epitelios sensoriales del utrículo y del
sáculo se conocen como máculas; por
encima de éstas se encuentra la membrana
otolítica que es una masa gelatinosa que
contiene numerosos otolitos formados por
biominerales en un arreglo complejo de
proteínas, carbohidratos y cristales de
carbonato de calcio (Anniko, 1988; Guevara,
1995). El utrículo está conectado al sáculo y
ambos se conocen como órganos otolíticos.
La ubicación de las máculas utricular y
sacular, permite detectar cambios en las
aceleraciones lineales y en la posición del
cuerpo con respecto a la gravedad.
Filogenéticamente la aparición de los
canales semicirculares y de los órganos
otolíticos, ocurre en los vertebrados; los
primeros son el Ostracodermo kieraspis y los
ciclostomos. Los análogos de los órganos
otolíticos en los invertebrados son los
estatocistos. Los canales semicirculares no
tienen equivalente en los invertebrados; sin
embargo, el principio de células ciliadascúpula, que sensa el desplazamiento de
fluido, sí existe en la línea lateral de los
animales inferiores (Gacek, 1974).
Nervio vestibular
En los anfibios, el nervio vestibular penetra
Figura 2. Microscopia electrónica de
transmisión tomada de una célula ciliada
de una anguila Moray eel, que muestra
un corte a nivel del kinocilio. Puede
apreciarse que éste tiene la estructura
típica de 9+2 microtúbulos que se
encuentra en todos los cilios móviles.
Tomado de Popper A. N. Web Page
http://www.life.umd.edu/biology/popperlab/
TEM-HC.html.
3
en el vestíbulo óseo y se bifurca en una rama
anterior gruesa, y una rama posterior más
delgada;
la
rama
anterior
corre
rostrolateralmente y se ramifica para inervar
varias áreas receptoras; la primera y más
grande ramificación se dirige hacia la mácula
del sáculo; posteriormente, esta rama
anterior se continúa rostrolateralmente a lo
largo de la superficie ventral del utrículo,
donde se fusiona con la pared del laberinto
membranoso posteriormente se ramifica para
inervar a las crestas de los
canales
semicirculares anterior y lateral (Honrubia y
cols., 1989; Guevara, 1995).
La rama posterior es más corta y se
ramifica
rápidamente
proyectándose
ventralmente a la lagena, dorsalmente a la
papila
amphibiorum,
y
se
continúa
lateralmente inervando a la papila basilar;
termina en el canal posterior, donde forma
una Y que penetra en el ámpula para inervar
a la cresta (Pretch, 1976).
La inervación está dada por axones
de neuronas sensitivas y axones eferentes
que inervan a la célula ciliada. Con base en
esta inervación, las células ciliadas que
forman los epitelios sensoriales se clasifican
en dos tipos: las células ciliadas tipo I, con
forma de ánfora, en las cuales la fibra
aferente primaria forma un cáliz que rodea la
superficie basolateral de la célula ciliada y la
fibra eferente establece contacto sináptico en
forma de botón con la fibra aferente; y las
células ciliadas tipo II, filogenéticamente más
antiguas, que tienen formas diversas:
cilíndricas, ánfora, coma, y redondas, en las
que la inervación aferente y eferente se
establecen sobre la superficie basolateral de
la célula ciliada en forma de botón. El epitelio
sensorial de los anfibios tiene exclusivamente
células ciliadas de tipo II (Wersäll, 1956;
Engström y Engström, 1981).
Inervación aferente
Los cuerpos de las neuronas aferentes
primarias en los anfibios no están
4
empaquetados formando un ganglio, como
en el caso de los mamíferos; sus somas se
localizan en la bifurcación del nervio
vestibular en las ramas anterior y posterior;
las
neuronas
aferentes
son
predominantemente bipolares (Pretch, 1976).
Los diámetros somáticos de las neuronas
aferentes en el axolotl muestran una
distribución que no es normal, agrupándose
en tres clases principales: pequeñas, con
diámetros que van de 8 a 15 µm (el 37%),
medianas de 16 a 25 µm (el 49%), y grandes
de 26 a 35 µm (el 14%) (Limón, 1998; Limón,
2000).
En el axolotl estas fibras aferentes
hacen contacto con células ciliadas de tipo II,
formando sinapsis químicas típicas con un
espacio sináptico de alrededor de 20 a 30 nm
y engrosamiento postsináptico. En la célula
ciliada
el
sitio
de
liberación
del
neutrotransmisor (zona activa), se caracteriza
por un engrosamiento de la membrana
plasmática y por la presencia de cuerpos
sinápticos de 0.20 a 0.30 µm rodeados por
vesículas sinápticas redondeadas en la
proximidad que afronta a la neurona aferente
(Guevara, 1992).
Transmisión sináptica
Existen evidencias que indican claramente
que la liberación del neurotransmisor
aferente en las células ciliadas es
dependiente de calcio extracelular (Pérez y
cols., 1991; Perin y cols., 2000). En las
células ciliadas saculares de la rana, se ha
reportado que los canales dependientes de
voltaje para calcio (VGCCs) se encuentran
agrupados específicamente en las zonas
activas, y también se ha encontrado la
presencia de canales de potasio activados
por calcio (BK) (Roberts y cols., 1990; Issa y
Hudspeth, 1994). Además, se encontró que
el influjo de calcio a través de los VGCCs
ocurre en “puntos calientes” que pueden
corresponder a un ensamblaje de los sitios
de liberación sinápticos (Tucker y Fettiplace,
1995). Se considera también que la
expresión e inserción de los canales
dependientes de voltaje para calcio están
determinadas por el tamaño y número de
zonas activas en cada célula ciliada. En el
pollo, la magnitud de la corriente de la célula
completa a través de los canales
dependientes de voltaje para calcio se
correlaciona con el área total de la zona
activa de las células ciliadas, las cuales
tienen grados variables de inervación
aferente (Martínez-Dunst, y cols., 1997).
La sinapsis aferente del sistema
vestibular de diferentes especies, tiene
propiedades peculiares, ya que la liberación
del neurotransmisor se produce de forma
continua, y la estimulación de la célula ciliada
aumenta o disminuye la cantidad del
neurotransmisor liberado por lo que las
neuronas aferentes presentan entonces una
descarga basal. La capacidad de las células
ciliadas para liberar continuamente el
neurotransmisor es una función en la que
participan el cuerpo sináptico y la ausencia
de la proteína de anclaje sinapsina; se ha
propuesto que las vesículas sinápticas
“maduran” en interacción con el cuerpo
sináptico y, a diferencia de otras sinapsis,
son liberadas sin pasar por un proceso de
anclaje al citoesqueleto -dependiente de
sinapsina- (Fuchs, 1996).
La liberación del neurotransmisor en
las aferentes vestibulares es un proceso
dependiente de calcio extracelular. Tanto la
actividad basal como la respuesta a
estímulos mecánicos desaparece cuando el
calcio extracelular se sustituye por magnesio
(Pérez y cols., 1991).
La entrada de calcio a la célula ciliada
se da a través de tres vías: 1) canales
mecanotransductores,
2)
receptores
colinérgicos, y 3) canales dependientes de
voltaje para el calcio.
Debido a la baja concentración de
calcio en la endolinfa, es muy poco probable
que por los canales mecanotransductores
ingrese una cantidad significativa de calcio a
la célula y que, además, alcance la región
sináptica (Tucker y Fettiplace, 1995). Existe
evidencia de la presencia de un receptor
colinérgico, el cual es un canal catiónico
dependiente de ligando por el que entra
calcio, éste activa canales de potasio
cercanos,
pero
no
logra
modificar
significativamente la concentración de calcio
en la región sináptica (Fuchs y Murrow,
1992). . El estímulo mecánico que flexiona el
haz de cilios de la célula ciliada en dirección
del kinocilio, produce la apertura de canales
catiónicos no selectivos ubicados en las
uniones de punta de los estereocilios; la
despolarización resultante aumenta la
probabilidad de apertura de los canales de
calcio dependientes de voltaje localizados en
la membrana basolateral de la célula ciliada;
éste aumento en la entrada de calcio
favorece la fusión de las vesículas sinápticas
y la liberación del neurotransmisor aferente,
considerándose ésta como una entrada
significativa de calcio.
Típicamente, las corrientes de calcio
de las células ciliadas se activan rápidamente
(con constantes de tiempo de menos de 1
ms) y no se inactivan; estos canales de calcio
dependientes de voltaje son sensibles a las
dihidropiridinas (DHP); esta sensibilidad y
sus características cinéticas, sugieren que se
trata de canales de calcio sensibles a DHP o
de tipo L (Perin y cols., 2000).
En relación con las características del
neurotransmisor aferente, existen evidencias
de que es una aminoácido excitador (AAE),
probablemente glutamato, aunque pudieran
liberarse
otros
aminoácidos
como
homocisteato o acetil-aspartil-glutamato
(Eybalin, 1993; Guth, 1998a). En los
sistemas de células ciliadas que incluyen a la
cóclea, el sistema vestibular y la línea lateral,
los antagonistas de los receptores a AAE
bloquean la transmisión sináptica entre las
células ciliadas y las neuronas aferentes
(Annoni y cols., 1984; Soto y Vega 1988;
5
Prigioni y cols., 1990; Eybalin, 1993; Soto y
cols., 1994a; Guth y
cols., 1998a). Diversos trabajos han
A
B
a
b
b
a
d
c
c
d
demostrado que en la sinapsis aferente
participan diferentes subtipos de receptores a
los AAE. Las aferentes vestibulares
responden a los agonistas de los receptores
a los AAE de los subtipos NMDA, activados
por N-metil-D-aspártico (NMDA), no NMDA,
activados por ? -amino-3-hidroxi-5-metil-4isoxasolpropiónico (AMPA) y ácido kaínico
(KA), así como receptores de tipo
metabotrópico (Eybalin, 1993; Puel, 1994;
Kataoka y Ohmori, 1996; Guth y cols.,
1998b). Sin embargo, hasta el día de hoy, no
se ha definido el papel exacto que tienen los
diferentes tipos de receptores a los AAE en la
transmisión aferente en el sistema vestibular.
En
las
neuronas
aferentes
vestibulares del axolotl coexisten tanto
receptores tipo NMDA como no NMDA (KA, y
AMPA); estos últimos parecen mediar la
descarga basal y principalmente, la
respuesta a la estimulación mecánica; es
decir, participan en respuestas rápidas y de
corta duración, mientras que los receptores
NMDA estarían participando en la descarga
6
basal y en la respuesta tónica y sostenida
que se presenta ante la aplicación de glicina
(Flores, 1993).
Figura 3. En A: reconstrucción de
terminaciones aferentes del canal
semicircular horizontal de un mono
ardilla, así como su localización
dentro de la cresta; a) una
terminación en forma de cáliz
simple; b) terminación compleja en
forma de cáliz; c) terminación
dimórfica y d) terminación en forma
de botón. En el inserto la
localización de las terminales
aferentes sobre un mapa estándar
de la cresta. En B: localización de
las fibras en las crestas con
tterminación en forma de cáliz
(arriba), dimórficas
(centro), botón (abajo) (modificado
de Fernández y cols., 1988).
Actividad eléctrica basal y provocada por
estímulos mecánicos de las aferentes
vestibulares
Los potenciales de acción se generan en las
neuronas aferentes por medio de la
sumación postsináptica espacial y temporal
de EPSPs (Rossi y cols., 1977), se originan
en el primer nodo de Ranvier en la región
donde las dendritas de las neuronas
aferentes dejan la membrana basal (Flock y
cols., 1973).
La respuesta de las aferentes
primarias de los canales semicirculares a la
estimulación natural se ha estudiado a través
de registros extracelulares multiunitarios
desde Ledoux en 1949, citado en Pretch,
1976. Una característica de estas aferentes
es su descarga basal o espontánea; ésta se
incrementa ante aceleraciones angulares en
una dirección, y disminuye al estimularse en
sentido opuesto (Pretch, 1976).
Con base en su respuesta a
vibraciones sinusoidales, Budelli y Macadar
en 1979 clasificaron a las aferentes del
utrículo de los elasmobranquios en tres tipos:
aferentes tipo I, que descargan espontáneamente, responden a inclinaciones de una
manera fásico-tónica y siguen la frecuencia
de estimulación aumentando o disminuyendo
su frecuencia de descarga cuando se
estimulan sinusoidalmente; aferentes tipo II
que siempre incrementan su descarga
cuando se estimulan con vibraciones,
independientemente de la frecuencia de
estimulación, y aferentes tipo III, que no
presentan descarga espontánea ni ante la
estimulación.
Se han identificado tres tipos de
terminaciones aferentes sobre las células
ciliadas de las crestas de los canales
semicirculares de los mamíferos (Figura 3A):
las unidades tipo cáliz que inervan a las
células ciliadas tipo I; las terminaciones en
forma de botón que conectan varias células
ciliadas tipo II, y las dimórficas que inervan
ambos tipos de células ciliadas (Fernández y
cols., 1988).
Las fibras aferentes del vestíbulo se
han clasificado por la regularidad de su
descarga, tomando en cuenta el coeficiente
de variación (CV) de los intervalos entre
espigas. El CV varía con el intervalo
promedio, por lo tanto, Goldberg y
colaboradores (1984) propusieron usar el
coeficiente de variación normalizado (CV*)
como una forma de clasificar la frecuencia de
descarga de las aferentes vestibulares.
Basándose en su CV* las neuronas aferentes
del vestíbulo fueron clasificadas en: regulares
(CV*<0.10), intermedias (0.10<CV*<0.20) e
irregulares (CV*>0.20).
Las neuronas aferentes que inervan a
los canales semicirculares y a los órganos
otolíticos presentan una frecuencia de
descarga espontánea que se relaciona con la
zona del neuroepitelio a la que inervan, el
diámetro axonal (Baird y cols., 1988), y la
zona de inicio del potencial de acción (Saidel,
1988), más que con el tipo de célula ciliada
con la que establecen sinapsis.
Originalmente se pensó que, en los
mamíferos,
las
fibras
gruesas
con
terminación tipo cáliz que inervan la zona
central de las crestas y a la estriola en las
máculas, podían responder irregularmente
debido a la sinapsis con la célula ciliada tipo
I, y que las fibras delgadas que inervan a la
periferia podían responder regularmente por
la sinapsis tipo botón con la célula ciliada tipo
II (Figura 3B); sin embargo, Honrubia y cols.
(1989), en sus estudios anatómicos y
fisiológicos de la rana toro, que solo tiene
células ciliadas tipo II, encontraron las
mismas relaciones que en los mamíferos: los
axones gruesos que inervan a la zona central
de la cresta de los canales descargan
irregularmente, los axones delgados que
proyectan hacia la periferia descargan de
forma regular, y los axones de tamaño
intermedio pueden descargar regular o
irregularmente.
En el canal horizontal se produce un
incremento en la frecuencia de descarga
basal con la desviación de la cúpula en
sentido utriculopetal, y disminución de esta
frecuencia cuando la cúpula se desvía en
sentido utriculofugal (Blanks y Pretch, 1976).
Las respuestas se invierten para los canales
anterior y posterior. Esta diferencia en la
direccionalidad de las respuestas entre los
canales verticales y horizontal, está dada por
la diferencia en la polarizacion morfológica de
las células ciliadas de estos canales; en el
caso del canal horizontal, los cilios se
orientan hacia el utrículo, y en los canales
verticales, en dirección opuesta. La máxima
respuesta se observa cuando el plano de
rotación coincide con el plano del canal.
En registros intracelulares, las
aferentes del canal semicircular horizontal del
pez sapo Opsanus tau se han clasificado en
tres grupos de acuerdo con su respuesta
ante la estimulación sinusoidal: i) aferentes
de baja ganancia que mantienen una
7
respuesta relativamente lineal, ii) aferentes
de alta ganancia que son sensibles a los
cambios de velocidad y iii) aferentes
sensibles a los cambios de aceleración. Las
aferentes de baja ganancia descargan de
manera regular de acuerdo al análisis de
intervalos entre espigas, mientras que las de
alta ganancia y las sensibles a los cambios
de aceleración son irregulares (Boyle y
Highstein, 1990).
Inervación eferente
Las neuronas eferentes periféricas que
inervan la porción vestibular del laberinto,
fueron inicialmente descritas por Gacek en
1960. Sin embargo, los estudios iniciales
sobre las fibras eferentes en el oído de los
vertebrados han sido controvertidos, ya que
en la identificación ultraestructural de las
fibras eferentes se han confundido a las
eferentes con sinapsis recíprocas, que
existen
en
muchos
vertebrados,
principalmente durante el desarrollo (Fritzsch
y cols.,1990; Fritzsch, 1996); con las técnicas
de degeneración se han identificado
falsamente a células de Purkinje cerebelares
como eferentes en el oído de la rana (Precht,
1976); y en el caso de algunos estudios
histoquímicos se han hecho falsas
suposiciones de la uniformidad histoquímica
de las neuronas eferentes (Fritzsch, 1996).
Con técnicas de peroxidasa de rábano,
inmunohistoquímica
y
análisis
ultraestructurales se han identificado las
fibras eferentes de los órganos sensoriales
vestibulares y receptores auditivos de
muchos vertebrados (Dechesne y cols.,
1984; Tanaka y cols., 1988; Sans y Highstein
1984). Los datos obtenidos muestran que las
neuronas eferentes están localizadas en
núcleos únicos que se asocian con
motoneuronas faciales en el tallo cerebral de
los vertebrados (Pellegrini y cols., 1985).
En los mamíferos, la inervación
eferente que llega a la cóclea tiene su origen
primordialmente en la oliva superior
8
(Rasmussen, 1953; Schukneht y cols., 1959).
En los anfibios, en cambio, las neuronas
eferentes se originan a nivel de los núcleos
de la formación reticular del bulbo raquídeo
(Strutz, y cols., 1980; Fritzsch, 1981; Prigioni
y cols., 1983).
Los nervios eferentes destinados al
laberinto, se localizan al mismo nivel del
núcleo vestibular en todos los vertebrados
estudiados (Goldberg y Fernández, 1980;
Schwartz y cols., 1981). En la rana, las
neuronas eferentes se originan de la parte
rostrolateral del núcleo vestibular (Strutz y
cols., 1980). Después de abandonar el SNC,
las fibras eferentes forman un pequeño haz
localizado en la parte ventrocaudal del nervio
vestibular en donde se ramifican para inervar
a los órganos terminales vestibulares. Los
diámetros de las fibras varían entre 2 y 3 ?m.
(Pretch, 1976).
Ahora bien, Precht y colaboradores,
en 1976, y Strutz y colaboradores, en 1980,
reportaron que la ubicación de las neuronas
eferentes en los anfibios es en la formación
reticular. En el cobayo y el conejo, Rossi y
Cortesina, (1965), usando histoquímica
contra la AchE, identificaron 3 haces
eferentes vestibulares ipsilaterales: el
primero originado de la sustancia reticular
cercana al rafé medio, el segundo se origina
en el núcleo vestibular lateral y el tercero en
el núcleo vestibular interpuesto localizado
dorsomedial al núcleo vestibular lateral (la
desventaja
es
que
la
localización
histoquímica de la actividad AchE no
distingue entre las neuronas colinérgicas y
las colinoceptivas). Avrim y Correia, en 1982,
inyectando HRP dentro del espacio
endolinfático del laberinto en palomas,
encontraron neuronas marcadas con HRP
ubicadas en 5 grupos: tres se localizaron en
el complejo nuclear vestibular ipsilateral
(lateral, tangencial y descendente), y dos
grupos bilaterales localizados en la formación
reticular.
En
1987,
Carpenter
y
colaboradores, trabajando en monos,
colocaron gelfoam con 50% de HRP en el
ámpula del canal semicircular horizontal a
través
de
pequeños
orificios
que
posteriormente se sellaron con cera para
hueso; en todos los casos se marcaron
neuronas
eferentes
vestibulares
bilateralmente; posteriormente, con métodos
de inmunocitoquímica, identificaron que las
neuronas eferentes vestibulares se localizan
en la parte rostral del núcleo abducens,
formando una región compacta de células
inmunorreactivas al antisuero contra ChAT
(enzima de síntesis de la acetilcolina),
mientras que las neuronas eferentes
cocleares se localizaron en la oliva superior
lateral. Podemos concluir que, con respecto
a los mamíferos, el origen de las neuronas
eferentes cocleares es la oliva superior, pero
el de las eferentes vestibulares es el núcleo
vestibular lateral y medial ipsi y contralateral,
además de la formación reticular (Rossi y
Cortisina, 1965; Pretch y cols., 1976; Strutz y
cols., 1980; Avrim y Correia, 1982; Carpenter
y cols., 1987).
Las neuronas eferentes vestibulares
en el axolotl hacen contacto directamente
con las células ciliadas de tipo II (Guevara,
1992), como ocurre en todos los anfibios; en
los mamíferos que además tienen células
ciliadas de tipo I, las sinapsis eferentes se
establecen sobre el cáliz de la aferente a
través de una sinapsis axo-dendrítica, y
sobre las células ciliadas de tipo II en forma
de botón; no obstante, en un estudio
contradictorio de Ohno y colaboradores en
1993, se reporta que, en la rata, las
terminales eferentes inervan exclusivamente
los cálices que rodean a las células ciliadas
vestibulares de tipo I, y no inervan a las
células ciliadas de tipo II. Sin embargo, por la
presencia de receptores colinérgicos sobre la
célula ciliada, tendría más sentido la
inervación eferente sobre la célula ciliada tipo
II; además, aunque se ha demostrado que se
expresa el ARNm para el receptor nicotínico
? 9 en los dos tipos de células ciliadas, éste
no se traduce como una proteína funcional
en las células ciliadas de tipo I,
probablemente a través de un control
postranscripcional (Lustig y cols., 1999).
Evidencia de este control postranscripcional
la presentan Maroni y Lisakowsky en 1998,
usando un anticuerpo de cobayo dirigido
contra el receptor nicotínico ? 9, encuentran
inmunorreactividad ? 9 en el polo sináptico
de las células ciliadas de tipo II, pero no en
las células ciliadas de tipo I, tanto en ratón
como en chinchilla.
Existe controversia acerca del tipo de
influencia que ejerce la activación eferente
sobre la descarga aferente. Desde 1965,
Sala reportó que, en el gato, la estimulación
del sistema vestibular eferente produce tanto
disminución como incremento en la
frecuencia de la descarga de las fibras
aferentes.
Goldberg y Fernández, en 1980,
encontraron que la activación eferente
produce facilitación aferente; lo mismo
reportaron Highstein y Baker en 1985. Otros
autores han encontrado que la respuesta de
las
aferentes
vestibulares
ante
la
estimulación de la vía eferente es inhibición
(Valli y cols., 1984), o respuestas mixtas
(Bernard y cols., 1985).
Se ha demostrado que el principal
neurotransmisor eferente es la acetilcolina
(Bobbin y Konishi, 1974; Housley y cols.,
1990; Sugai y cols., 1992); ésta actúa sobre
dos tipos de receptores: nicotínicos y
muscarínicos. El efecto mixto reportado en el
sistema vestibular sugiere que ambos tipos
de receptores contribuyen a la señalización
eferente. En el sistema eferente vestibular,
además de la acetilcolina, se coliberan otros
neurotransmisores y neuromoduladores entre
los que destacan el péptido relacionado con
el gen de la calcitonina (CGRP), ATP,
sustancia P, encefalinas, y neuroquinina A.
(Vega y cols., 1991; Aubert y cols., 1995;
Scarfone y cols., 1996; Andrianov y Ryzhova,
1999; Vega, 2000).
9
La aplicación de acetilcolina en el
laberinto aislado de la rana produce cambios
facilitatorios e inhibitorios en la descarga de
las
aferentes
vestibulares,
con
un
predominante
efecto
facilitatorio
aparentemente mediado por
receptores
muscarínicos, ya que el efecto se bloquea
con atropina y es remedado por muscarina
(Guth y cols., 1986). La estimulación eléctrica
del sistema eferente induce grandes
hiperpolarizaciones en las células ciliadas
saculares de la rana; similares hiperpolarizaciones se producen por acetilcolina
exógena, y se bloquean por concentraciones
micromolares de d-tubocurarina y concentraciones milimolares de atropina (Sugai y cols.,
1992). La aplicación directa de acetilcolina
produce
pequeños
incrementos
o
decrementos en la corriente saliente de
potasio en las células ciliadas aisladas de las
crestas de los canales semicirculares de la
rana; algunos de estos efectos son bloqueados con atropina (Housley y cols., 1990).
Existe evidencia de que el receptor de
acetilcolina de la célula ciliada es un canal
catiónico a través del cual puede entrar
calcio, activando a canales de potasio
cercanos, lo que explicaría el efecto
inhibitorio de la acetilcolina sobre las
aferentes vestibulares (Sugai y cols., 1994;
Guth y cols., 1990; Guth y cols., 1998b). Sin
embargo, también se sabe que la acetilcolina
induce respuestas facilitadoras sobre la
descarga aferente que estarían mediadas por
receptores muscarínicos ubicados sobre la
célula ciliada. Hay evidencia que en los
epitelios coclear y vestibular existe un
sistema de segundos mensajeros IP 3
asociados a receptores muscarínicos,
probablemente del tipo M1, ya que la
aplicación de carbacol induce la liberación de
IP3 que es antagonizada por la aplicación de
atropina (Ogawa y Schacht, 1993); estos
autores discuten que dicha vía de segundos
mensajeros se da por la activación de
receptores muscarínicos y purinérgicos.
10
Aubert
y
colaboradores,
en
1995,
demostraron la existencia de receptores
purinérgicos
P2y
en
los
canales
semicirculares de la rana, y muestran que el
efecto facilitador del carbacol no es afectado
por antagonistas P2y (metabotrópico); sin
embargo, la enzima nucleótido pirofosfatasa
(que usa ATP y NAD como sustrato para
formar AMP), sí disminuye el efecto
facilitador del carbacol, lo que indicaría que el
carbacol y el ATP no funcionan sobre el
mismo receptor.
Histamina
Barger y Dale, en 1910, fueron los primeros
en identificar a la histamina ?2-(4imidazolil) etilamina? en los extractos del
cornezuelo (parásito) de las espigas de
centeno, de las cuales se aisló y resultó ser
contaminación del cornezuelo por acción
bacteriana. Posteriormente, Dale y Laidlaw,
en el mismo año, la sometieron a un estudio
farmacológico intensivo y descubrieron sus
efectos contráctiles potentes sobre los
músculos lisos y la acción vasodepresora
intensa; reportaron también que los signos
inmediatos observados en un animal
sensibilizado, cuando se le inyectaba una
proteína normalmente inerte, se parecían
mucho a los de la intoxicación por histamina.
En 1927, Best y colaboradores,
aislaron a la histamina a partir de muestras
frescas de hígado y pulmón, estableciendo
que ésta es un constituyente natural del
organismo; de hecho, el nombre de la
histamina deriva del griego histos, que
significa tejido. Sin embargo, Dale fue
renuente en aceptar que la histamina
endógena pudiera funcionar como molécula
mensajera, liberarse por los tejidos y afectar
la actividad de células blanco, y fue
Felderberg quien claramente demostró que la
histamina se libera de los pulmones durante
la respuesta anafiláctica, y que induce una
marcada
broncoconstricción (Felderberg,
1927).
efectos de agonistas y antagonistas H1 y H2
indicaron la existencia de un receptor
diferente. El agonista altamente selectivo Ralfa metilhistamina y el antagonista
tioperamida definieron claramente al receptor
H3 (Arrang y cols., 1983, 1987a).
Molécula de histamina y sus derivados.
La
síntesis
de
los
primeros
antagonistas
para la histamina, las
difenhidraminas, como la mepiramina
(pirilamina), conocidos como antihistamínicos
clásicos, se realizó por Bovet y Staub, en
1936. Estos autores demostraron la
efectividad de tales antagonistas como
protectores en casos de broncoespasmos
provocados por anafilaxia, o al administrar
histamina en cobayos (Hill y cols. 1997). Pero
estos
antagonistas
no
bloquearon
uniformemente todas las acciones de la
histamina, ya que la secreción de ácido
gástrico inducida por la histamina no se
afectó (Ashford y cols., 1949). También se
demostró que el efecto vasodilatodor
producido por la histamina, fue reducido
parcialmente, sugiriéndose que la vasodilatación se produce por combinación de la
histamina con más de un receptor (Folkow y
cols., 1948). Los efectos mediados por la
histamina y que son bloqueados por los
antihistamínicos clásicos, se consideraron
producidos por la activación del receptor H1
(Ash y Schild, 1966).
Posteriormente, Black y colaboradores, en 1972, desarrollaron un antagonista
específico para el receptor H2 (burimamida)
que reduce la secreción de ácido gástrico,
así como la vasodilatación, acciones ambas
que no son bloqueadas por los antagonistas
H1 (Tabla 1).
Posteriormente se estableció que se
puede inhibir la síntesis y liberación de la
histamina en cortes de corteza cerebral, y los
Biosíntesis de la histamina
La histamina penetra pobremente la barrera
hematoencefálica, pero puede formarse
localmente en el cerebro, ya que se detectó
la formación en vivo de histamina después de
la administración de su precursor radioactivo
L- histidina (Schwartz y cols., 1991).
La biosíntesis de histamina requiere el
transporte de la L-histidina al interior de la
célula y su descarboxilación por la L-histidina
descarboxilasa, con una constante de
Michaelis (Km ) y una velocidad máxima (Vmax )
que cambian con el pH y con la fuerza iónica
del medio; a pH 7.0, en buffer estándar, la Km
de la L-histidina es de 0.1 mM, valor cercano
a la concentración plasmática. Esta enzima
es bloqueada irreversiblemente por el
inhibidor ? -fluorometilhistidina (Garbag y
cols., 1980). El transporte de la L-histidina es
saturable y dependiente de energía. El
sistema de transporte en cortes cerebrales y
en
sinaptosomas
es
parcialmente
+
+
independiente de Na y K , y los análisis
cinéticos
revelan
la
presencia
de
componentes de alta y baja afinidad. No hay
evidencia de la presencia de un sistema de
transporte de L-histidina en las neuronas
histaminérgicas (Hegstrand y Simon, 1985).
La L-histidina descarboxilasa se ha
purificado a partir de varios tejidos periféricos
con gran actividad catalítica, y se ha
reportado que, para su activación, se
requiere del fosfato de piridoxal como
cofactor. La L-histidina descarboxilasa
cerebral es similar a la de otros tejidos, pero
la administración del cofactor en extractos
cerebrales no produce una mayor actividad
catalítica de la enzima (Schwartz y
cols.,1991).
11
Funciones de la histamina endógena
La
histamina
desempeña
actividades
fisiológicas importantes; es uno de los
mediadores almacenados en las células
cebadas o mastocitos; su liberación como
consecuencia de la interacción del antígeno
con los anticuerpos IgE en la superficie de
dicha célula interviene en las respuestas de
hipersensibilidad inmediata y en las alergias;
tiene acción en el músculo liso de bronquios
y de vasos sanguíneos; interviene, además,
en la regulación de la secreción de ácido
gástrico, y se ha identificado también como
neurotransmisor en el sistema nervioso
central, en donde se han descrito los tres
tipos de receptores para histamina (Babe y
Serafin, 1996).
Receptor para histamina H1
El mecanismo primario por medio del cual los
receptores H1 producen la respuesta
funcional en las células, es la activación de la
vía de la fosfolipasa C, a través de una
proteína G que se relaciona probablemente
con la familia Gq/11, aumentando la
acumulación de inositol trifosfato y la
movilización de calcio en muchos tejidos y
tipos celulares (Hill, 1990; Leurs y cols.,
1995b).
La histamina, a través de los
receptores H1, puede estimular la actividad
de la sintetasa de óxido nítrico a través de
una vía dependiente de Ca2+/calmodulina y
de la posterior activación de la guanilato
ciclasa soluble, en estudios bioquímicos en
células endoteliales cultivadas (Schmidt y
Tabla 1. Receptores a la histamina
Mecanismo de
Transducción
Receptor
Histamina
H1
Histamina
H2
Histamina
H3
1 No selectivo
+ fosfolipasa C
Proteína
G
Asociada
(Gq/11)
+ Adenilato ciclasa (Gs)
-
Fosfolipasa C?
(Go)
Adenilato
(Gi)
ciclasa?
(*)>potencia agonista
(*) Kb baja
Agonistas
Antagonistas
Histamina (1)
2-[3-(trifluorometil)fenilhistamina] (*)
2 tiazolyletilamina (2)
2 piridiletilamina
2 metilhistiamina
Betahistina
Mepiramina (*)
Clorferinamina
Triprolidina
Temelastina
Difenihidramina
Tripelenamina
Prometazina
Histamina (1)
Amthamina (*)
Dimaprit
Impromidina (2)
Arpromidina (2)
Betahistina
Histamina (1)
R-(? )-metilhistamina
Imetit (*)
Immepip
N? -metilhistamina (1)
Cimetidina(*)
Ranitidina
Tiotidina
Zolantidina
Famotidina
Tioperamida (*)
Clobenpropit
Iodofenpropit
Iodoproxifan
Betahistina
2 antagonista H3
Los agonistas y antagonistas para los tres tipos de receptores aparecen en el orden de mayor potencia. Modificado de Hills, y Cols., 1997.
12
cols., 1990) y en una preparación de pulmón
aislado de cobayo (Leurs y cols., 1991a),
La estimulación del receptor H1 en las
células vasculares produce aumento de la
permeabilidad vascular - como resultado de
la contracción de las células endoteliales-,
síntesis de prostaciclinas, síntesis del factor
inhibidor de plaquetas, liberación del factor
von Willebrand y liberación de óxido nítrico.
En la médula adrenal produce liberación de
catecolaminas, y en las células cromafines
induce la liberación de leu-encefalina y
metencefalina (Hill y cols., 1997).
Hill y colaboradores desarrollaron la
?3H? mepiramina para el receptor H1, la cual
se ha usado exitosamente para detectar a los
receptores H1 en una gran variedad de
tejidos, entre los que se cuentan al cerebro
de mamíferos, músculo liso de vías
respiratorias, tracto gastrointestinal, sistema
genitourinario y al sistema cardiovascular; sin
embargo, la ?3H? mepiramina también se une
a sitios secundarios no H1 en músculo liso de
intestino (Hill y Young, 1980), o células He-La
(Arias-Montaño y Young, 1993); la quinina se
ha usado para inhibir la unión no específica
en hígado de rata (Liu y cols., 1992); sin
embargo, no todos los sitios de unión
secundarios se pueden inhibir por quinina
(Dickenson y Hill, 1994).
El papel fisiológico de los receptores
H1 en el sistema nervioso central no está
completamente clarificado. La primera
generación
de
antagonistas
H1
(antihistamínicos clásicos) estimula y deprime
al sistema nervioso central. A veces con
dosis terapéuticas se produce estimulación
en pacientes, que refieren inquietud y
dificultad para conciliar el sueño, pero el
embotamiento del estado de alerta, tiempos
más lentos de reacción y somnolencia son
las manifestaciones más comunes (Babe y
Serafin,1996).
Estos
antihistamínicos
clásicos cruzan rápidamente la barrera
hematoecefálica
(Schwartzy cols., 1981;
Leurs y cols., 1995b); mientras que los
antagonistas H1 de la segunda generación
(no sedantes), no atraviezan en grado
apreciable la barrera hematoencéfalica y en
la falta de sedación difieren notablemente de
los antihistamínicos clásicos, lo que podría
tener gran beneficio clínico (Sorkin y Heel,
1985).
Receptor para histamina H2
El receptor para la histamina H2 se acopla a
la adenilato ciclasa a través de la familia de
proteínas Gs y estimula la acumulación de
cAMP en varios tejidos, incluido el cerebro
(Hill, 1990; Leurs y cols., 1995b).
La activación de los receptores H2, a
diferencia de la de los receptores H1, inhibe
la liberación del ácido araquidónico (Hill y
cols., 1997).
Las funciones centrales de los
receptores
H2
no
han
sido
bien
caracterizadas; sin embargo, se han
identificado funciones antinociceptivas y en la
secreción de prolactina (Hill y cols., 1997).
Estos receptores tienen un potente
efecto sobre la secreción de ácido gástrico
(Black y Shankley 1985), y la inhibición de
una variedad de funciones dentro del sistema
inmune (Hill 1990). Sobre los basófilos y las
células cebadas, regulan negativamente la
liberación de histamina. En los linfocitos, la
activación de los receptores H2 inhibe la
síntesis de anticuerpos, la proliferación de las
células T, la citolisis mediada por células y la
producción de citoquinas (Melmon y cols.,
1974; Melmon y Khan 1987). En el SNC, la
activación de los receptores de histamina H2
disminuye
la
corriente
de
potasio
dependiente de calcio en las neuronas
piramidales del hipocampo (Hass y Konnerth
1983).
Receptores para histamina H3
El receptor H3 fue descrito inicialmente como
autorreceptor que regula la síntesis y
liberación de histamina en la corteza
13
cerebral, cuerpo estriado e hipocampo de
rata (Arrang y cols., 1983, 1987a, 1988a).
Diferencias en la distribución de los
sitios de unión de los receptores H3, y en los
niveles de histidina descarboxilasa sugieren
que los receptores H3 no están confinados a
las neuronas que contienen histamina dentro
del SNC (Arrang y cols., 1987a). Se ha
confirmado que los receptores H3 participan
también en la regulación de la liberación de
serotonina (Schlicker y cols., 1988),
acetilcolina (Clappham y Kilpatrick, 1992) y
dopamina (Schlicker y cols., 1993) en el
cerebro de mamíferos.
El mecanismo propuesto para los
receptores H3 es que la histamina, al unirse a
este receptor, activa a una proteína G
llamada Gi que inhibe a la adenilato ciclasa,
impidiendo la formación de AMP cíclico (Hill y
cols., 1997).
Histamina en el sistema nervioso central
Los estudios de lesión realizados por
Garbarg, en 1974, demostraron por primera
vez
la
existencia
de
neuronas
histaminérgicas en el cerebro de mamífero;
ésto se confirmó con estudios de
inmunohistoquímica al detectar la enzima de
síntesis, su origen y proyecciones, y se ha
establecido que puede ser liberada por
despolarización y que su liberación es
dependiente de calcio; la recaptura es rápida
y puede modificarse instantáneamente
(Psychoyos, 1978). Se detectó también la
formación in vivo de histamina después de
administrar su precursor radioactivo Lhistidina (White, 1960).
Los cuerpos celulares de las neuronas
histaminérgicas están concentrados en un
área muy pequeña del cerebro: el núcleo
tuberomamilar del hipotálamo posterior
(Figura 4). Se ha encontrado que los
Figura 4. Vías histaminérgicas ascendentes y descendentes que parten del núcleo
tubero mamilar del hipotálamo posterior. AH, área hipotalámica anterior; Cer, cerebelo;
CG, sustancia gris central; CX, corteza cerebral; DR, núcleo dorsal del rafé; f, fornix;
Hip, hipocampo; LS, septum lateral; MD, tálamo mediodorsal; OB, bulbo olfatorio; Sol,
núcleo del tracto solitario; VDB, núcleo de la banda diagonal; VMH, núcleo
hipotalámico ventromedial. Tomado de Schwartz, 1997.
14
receptores tipo H1 se localizan principalmente
en las células piramidales del hipocampo y
en las células de Purkinje del cerebelo
(Schwartz, 1997). El bloqueo de estos
receptores se produce durante la terapia con
algunos antihistamínicos, antipsicóticos y
antidepresivos, y da cuenta de parte de las
propiedades sedantes de estas drogas. En el
cerebro, los receptores tipo H2 se expresan
de forma abundante en el caudado putamen
y en la corteza cerebral; en menor
concentración se presentan también en las
células piramidales del hipocampo y en las
células granulares del cerebelo (Traiffort y
cols., 1992a). La activación de los receptores
H2 despolariza a las neuronas piramidales del
hipocampo, vía inhibición de la corriente de
K+ dependiente de Ca2+ (Hass y Konnerth,
1983). Los receptores H3 son los menos
estudiados; se propone que en el SNC
actúan
fundamentalmente
como
autorreceptores a nivel presináptico donde,
amén de inhibir la liberación de histamina,
pueden también influir la liberación de otros
neurotransmisores
como
acetilcolina
(Clappham y Kilpatrick 1992), serotonina
(Schlicker y cols., 1988), y dopamina
(Schlicker y cols., 1993). A nivel periférico
pueden
modificar
la
liberación
de
neuropéptidos de las fibras amielínicas de
tipo C (Schwartz, 1997).
Histamina en el sistema vestibular
La histamina y otras sustancias que
contienen imidazol, como la L-histidina, la
carnosina y la hormona liberadora de
tirotropina, aumentan la frecuencia de
descarga de las aferentes de los canales
semicirculares de la rana; la histamina ejerce
este efecto excitador sobre las aferentes
vestibulares con una IC 50 de 100 nM
(Housley y cols., 1988). Un inhibidor
irreversible de la histidina descarboxilasa, la
alfa-fluorometil
histidina,
produce
una
reducción dependiente de la concentración
en la actividad espontánea de las neuronas
aferentes, sugiriendo entonces que la enzima
de síntesis para la histamina se requiere para
la actividad espontánea de las aferentes
vestibulares (Housley y cols., 1988; Guth y
cols., 2000). Cuando se perfunde con bajo
calcio y alto magnesio o bien con 5 mM de
cadmio, iones que reducen la liberación del
neurotransmisor de las células ciliadas, la
histamina no produce su efecto facilitador
(Guth y cols., 2000).
En estudios realizados en el laberinto
de la rana, se ha encontrado que el
antagonista más selectivo para los
receptores H1, la pirilamina (10µM) reduce el
efecto excitador de la histamina; también los
antagonistas
H1,
difenhidramina
y
tripelenamina disminuyen la frecuencia de
descarga de las aferentes, pero a
concentraciones más altas (100µM); el
agonista H1, 2-3-trifluorometilfenilhistamina
(HTMT) produce facilitación de las aferentes
vestibulares. Por otra parte, el agonista
selectivo H2, dimaprit, produce una ligera
facilitación, y la cimetidina, un antagonista H2,
también reduce muy ligeramente la
frecuencia de descarga basal de las
aferentes vestibulares, indicando que los
receptores H2 no producen un efecto
significativo sobre la actividad de las
aferentes vestibulares. El agonista selectivo
H3, R alfa metilhistamina, induce una
facilitación dependiente de la dosis (1-10µM)
de
las
aferentes
de
los
canales
semicirculares en concentraciones tres
órdenes de magnitud superiores a su Kd, y
dos antagonistas H3, tioperamida y
clobenpropit, no producen ningún efecto
sobre la descarga basal de las aferentes en
dosis hasta de 10 µM. El efecto de la
histamina y del HTMT fue antagonizado por
la betahistina y los antagonistas H1
pirylamina y difenhidramina. En conjunto,
estos resultados indican que la histamina
tiene
un
papel
importante
en
la
neurotransmisión
en
los
canales
semicirculares, y que los receptores para la
15
histamina
presentes en las células del
vestíbulo de la rana son predominantemente
del tipo H1 (Norris y cols., 1988; Housley y
cols., 1988; Guth y cols., 2000).
Los
antagonistas muscarínicos
atropina y propilbenzililcolina, reducen el
efecto facilitador de la histamina, al igual que
los antagonistas H1 reducen el efecto
facilitador del carbacol, sugiriendo que la
histamina puede favorecer la liberación de la
acetilcolina de las fibras eferentes, o bien
activar a los receptores colínérgicos ubicados
en la célula ciliada; sin embargo, en
experimentos de deferentación, el efecto
facilitador de la histamina permanece (Norris
y cols., 1988; Guth y cols., 2000).
Tomoda y colaboradores, en 1997,
reportaron que en las células ciliadas
aisladas de la cresta ampular del cobayo,
existe un aumento significativo en la
concentración de calcio intracelular como
resultado de la aplicación de histamina en
presencia de calcio extracelular; observaron
también que, en ausencia de calcio
extracelular, se produce un ligero incremento
en la concentración de calcio intracelular;
estos autores proponen que esta respuesta
es mediada por receptores H1, H2 y H3, ya
que antagonistas H1 (prometazina), H2
(cimetidina) y H3 (tioperamida) bloquean
completamente la respuesta de calcio
inducida por la histamina.
Uno de los problemas aún no
aclarados respecto del papel de la histamina
en el sistema vestibular, es el de precisar el
origen de esta sustancia. Parece claro que
existen receptores para histamina en el oído
interno, pero no sabemos de dónde proviene
el ligando endógeno para estos receptores.
Miller y Schwartz, en 1983, demostraron que
la N-acetilhistidina puede liberarse de los
fotorreceptores de los anuros junto con el
glutamato,
aspartato,
putrescina
y
cadaverina. En 1991, Drescher y Drescher,
extrajeron, a través de HPLC, a la Nacetilhistidina en concentraciones milimolares
16
en una preparación de capa aislada de
células ciliadas del sáculo de la trucha;
además, obtuvieron glutamato, fosfoserina y
fosfoetanolamina; la fracción del nervio
sacular presentó un espectro diferente de
aminas primarias, en lo que concierne
principalmente a los dipéptidos de la histidina
carnosina y homocarnosina, en una razón de
1:10; en ambos extractos obtuvieron también
histidina.
La
N-acetilhistidina,
en
concentraciones micromolares, produce un
efecto facilitador sobre los canales
semicirculares de la rana (Drescher y
Drescher, 1991). Housley y cols., en 1988,
reportaron que la carnosina produjo
facilitación en las aferentes vestibulares.
Un antisuero que reacciona con
carnosina, homocarnosina y anserina,
produce un intenso inmunomarcaje en las
células ciliadas de los canales semicirculares
de la rana (Panzanelli y cols., 1994).
Existe la posibilidad, entonces, de
que el mediador endógeno no sea la
histamina en sí, sino una sustancia quím ica
cercana como la carnosina o la Nacetilhistidina, y que los efectos de los
antagonistas H1 y de la betahistina sobre la
actividad
basal
se
produzcan
por
antagonismo de estos análogos endógenos
de la histamina y no con la histamina per se.
Betahistina
La
betahistina
(N-alfa-metil-2-piridiletilamina), es un análogo de la histamina.
Evaluada con base en su capacidad para
competir con la mepiramina tritiada en el
cerebelo de cobayo y en cortes de corteza
cerebral de rata se ha reportado que tiene
actividad agonista parcial, débil, sobre el
receptor H1 (Arrang y cols., 1983, Wang y
Dutia, 1995). También se ha reportado su
acción como agonista parcial, débil, sobre
los receptores H2 con base en la
acumulación de AMPc estimulada por la
betahistina en cortes de hipocampo, acción
que fue antagonizada con cimetidina (Hill y
cols., 1997). Asimismo, se ha encontrado
que la betahistina tiene una potente acción
antagonista H3, ya que fue capaz de
bloquear completamente y en forma
dependiente de la concentración, la
estimulación de los autorreceptores por la
aplicación de histamina exógena en cortes
de corteza cerebral de rata (Arrang y cols.,
1985).
La betahistina fue introducida como
droga activa en el tratamiento de ciertos
desórdenes vasomotores (Horton y von
Leden, 1962), y desde entonces se ha
usado ampliamente y de manera eficaz en
la clínica en casos de
desórdenes
vestibulares centrales y periféricos, en los
que se reporta que la administración de
betahistina reduce significativamente la
incidencia y severidad del vértigo, y produce
una disminución en la incidencia de
náuseas y vómito (Wilmont y Menon, 1976;
Aataa, 1991; Oosterveld, 1984; Kingma,
1997; Gordon y Shupak, 1999; Lamm y
Arnold, 2000). También se ha reportado la
superioridad de la betahistina con respecto
de otras drogas usadas en casos del
síndrome de Mèniere, sobre todo en la
terapia de mantenimiento (Aantaa, 1991), y
su eficacia en casos de vértigo periférico sin
causa establecida (Canti y cols., 1981). Su
efecto clínico se ha atribuido al aumento del
flujo sanguíneo en los sistemas vestibular y
coclear en modelos animales (Martínez,
1972). Se ha reportado que la betahistina
aumenta el flujo sanguíneo regional en
pacientes con enfermedad cerebrovascular
(Meyer y cols., 1974), y que hay una
mejoría de la función mental en pacientes
ancianos, con efectos sedantes mínimos
(Fujino y cols., 1996).
En
experimentos
con
registro
extracelular de neuronas del núcleo
vestibular medial en rebanadas del tallo
cerebral de ratas, la aplicación de histamina
produce una excitación dependiente de la
dosis; la aplicación de la triprolidina,
antagonista H1, reduce el efecto excitador
de la histamina en esta preparación y la
betahistina produce una ligera acción
excitatoria; a pesar de su aparente poca
potencia,
la
betahistina
reduce
significativamente el efecto excitador de la
histamina (Horii y cols., 1993). Los efectos
de la betahistina corresponden a la acción
de un agonista parcial H1 sobre las
neuronas del núcleo vestibular medial,
presumiblemente
ocupando
sitios
receptores en competencia con la histamina
endógena (Wang y Dutia, 1995).
La ventaja de la betahistina sobre la
histamina en la terapia de vértigo es que la
administración de la histamina es
intravenosa y la duración del efecto es
corta, comparada con la administración oral
y el margen terapéutico amplio de la
betahistina (Aantaa, 1991).
Recientemente se ha observado que
la betahistina produce una disminución de
la frecuencia de descarga de las aferentes
vestibulares en el canal semicircular aislado
de la rana (Botta y cols., 1998). Estudios
farmacocinéticos muestran que, en el
hígado la betahistina se transforma en
aminoetilpiridina (M1), hidroxietilpiridina (M2)
y se excreta en la orina como ácido
piridilacético (M3). Estudios en que se ha
probado la acción de los metabolitos de la
betahistina sobre la actividad eléctrica de
las aferentes vestibulares de la rana,
demuestran que la M1 (1µM), reduce la
frecuencia en la descarga basal de las
aferentes vestibulares sin afectar la
respuesta a estímulos mecánicos; los otros
metabolitos estudiados no tuvieron ningún
efecto (0.1µM a 10mM); estos resultados
indican que, probablemente, la acción
antivértigo de la betahistina está también
presente en su metabolito aminoetilpiridina.
De hecho, se ha propuesto que la acción de
la betahistina estaría dada inicialmente por
este agente y sería sostenida a largo plazo
por su metabolito M1 (Botta y cols., 2000).
17
Figura 5. Esquema del oído interno
del axolotl por su cara ventral. Se
destacan las fibras que inervan a los
canales semicirculares anterior (AC) y
posterior (PC), el utrículo (u), el
sáculo (S), la lagena (L) y la papila
basilar
(BP).
Para
nuestros
experimentos aislamos las ramas
anterior y posterior y registramos de
la rama anterior.
La betahistina inhibe la respuesta
facilitatoria de un agonista específico H1, la
R-alfa metilhistamina (Guth y cols., 2000).
JUSTIFICACIÓN
Se desconoce el mecanismo mediante el
cual la betahistina produce sus efectos en la
periferia vestibular, razón por la que
decidimos estudiar su acción sobre la
actividad eléctrica de las neuronas aferentes
vestibulares y sus interacciones con
agonistas y antagonistas de las sinapsis
aferente y eferente.
HIPÓTESIS
Pensamos que la acción de la betahistina es
debida a que activa receptores específicos
ubicados en las fibras eferentes y en las
células ciliadas, modificando la liberación de
acetilcolina de las eferentes, la producción de
óxido nítrico por las células ciliadas y la
liberación del neurotransmisor aferente.
OBJETIVOS
?? Definir la acción y construir la curva
dosis-efecto de la betahistina sobre la
descarga basal y la respuesta a estímulos
mecánicos de las aferentes vestibulares.
?? Estudiar cómo se modifica el efecto de la
betahistina cuando se bloquean los
18
receptores colinérgicos con atropina y dtubocurarina.
?? Estudiar cómo se modifica el efecto de
agonistas colinérgicos con la aplicación
de betahistina.
?? Estudiar cómo se modifica el efecto de la
betahistina
cuando
se
perfunden
bloqueadores de la sintetasa de óxido
nítrico.
?? Estudiar si la betahistina es capaz de
modificar el efecto de agonistas a
aminoácidos excitadores.
MATERIAL Y MÉTODOS
Animal de experimentación
Se utilizó como animal de experimentación,
el ajolote (Ambystoma tigrinum). Éste es el
estado larvario de la salamandra. Se
eligieron de manera aleatoria, sin considerar
edad ni sexo, y entre 30 y 60 gramos de
peso.
Obtención de la preparación
Para obtener la preparación del oído interno
aislado del axolotl, se decapitó al animal
cortando por delante de las branquias;
posteriormente se separó el maxilar inferior
del superior; de este último se desprendió el
epitelio que cubre el paladar, se identificó el
oído interno por dos zonas blanquecinas a
cada lado de la línea media que
corresponden a los otolitos de los sáculos.
Se resecó la parte ventral de las cápsulas
óticas con un bisturí; la preparación se colocó
en una cámara con solución Ringer para
anfibio para continuar la disección bajo
microscopio estereoscópico (Nikon, SMZ10),
hasta
visualizar
las
diferentes
estructuras del oído. Se tuvo cuidado en
descubrir las ámpulas de los canales anterior
y lateral, así como las fibras nerviosas de
cada una de ellas. Se disecó el VIII par
craneal en todo su trayecto hasta su entrada
al tallo cerebral, donde se seccionó. Las
fibras provenientes de cada estructura se
separaron, de manera que la rama vestibular
quedó dividida en dos fascículos (Figura 5):
uno proveniente de los canales anterior,
lateral y del utrículo (rama anterior), y el otro
del sáculo, lagena, canal posterior y papila
amphibiorum (rama posterior). La región
ósea que comprende la cápsula ótica se
separó del resto del cráneo y se fijó con un
alfiler a la cámara de registro.
Sustancias utilizadas
La preparación fue perfundida con solución
Ringer para anfibio con la siguiente
composición (en mM): NaCl 111, KCl 2.5,
MgCl2 1, CaCl2 1.8, Hepes 5 y Glucosa 10.
Figura 6. Montaje de la preparación del vestíbulo aislado para la estimulación mecánica
en una plataforma rotatoria. La preparación se sometió a aceleraciones sinusoidales por
medio de un motor con servomecanismo cuya velocidad y características de giro fueron
controladas por un generador de funciones. En la plataforma se montó el amplificador, los
manipuladores, el electrodo de succión y el sistema de aplicación de drogas. Una vez
amplificada, la señal fue llevada por medio de un conector rotatorio a un osciloscopio, a
un discriminador de ventana y a una computadora para su análisis.
19
En algunos experimentos la preparación fue
perfundida con solución Ringer con bajo
calcio y alto magnesio (0.09 y 10 mM
respectivamente). El pH de la solución se
ajustó a 7.4 usando NaOH. La osmolaridad
de la solución fue de 240 mosm.
Los fármacos utilizados en esta
preparación
fueron
diclorhidrato
de
betahistina (Formenti, Italia), cloruro de
carbamilcolina (carbacol), cloruro de dtubocurarina, sulfato de atropina, N? -nitro-Larginina (L-NOARG), ácido kaínico, ácido
quiscuálico, L-argininina y glicina (Sigma
Chemical Co. USA).
Aplicación de las drogas
La preparación se colocó en una cámara de
registro con un volumen de 2 ml, y fue
perfundida con la solución Ringer con un flujo
de 1 ml por minuto, excepto durante la
estimulación mecánica. El carbacol, el ácido
kaínico y el ácido quiscuálico se aplicaron por
microperfusión, 20 µl cada vez, a través de
una micropipeta que se conectó a una jeringa
Hamilton. La punta de la micropipeta se
colocó en la cercanía de la sinapsis y la
droga se expulsó por presión. Esta técnica
tiene la ventaja de permitir aumentos
momentáneos en la concentración del
fármaco, sin embargo, impide conocer la
concentración final de la droga porque la
concentración inicial decae rápidamente de
manera exponencial. En este trabajo todas
las concentraciones se expresan como la
concentración originalmente contenida en la
pipeta. Los demás fármacos se aplicaron por
perfusión en el baño.
Estimulación mecánica
Para la estimulación mecánica, la cámara de
registro, los manipuladores y el amplificador
se colocaron sobre una plataforma rotatoria
construida con dos placas de acrílico
montadas sobre un servomotor (figura 6)
Aerotech, modelo 49179. La aceleración del
motor fue controlada por un generador de
20
funciones (Hewlett-Packard modelo, 8904A),
cuya señal pasó previamente por un
amplificador de corriente que sirvió para
alimentar el motor. La señal de comando del
generador de funciones y la salida del
tacómetro del motor se visualizaron en la
pantalla de un osciloscopio (Textronix, 2216).
La salida del tacómetro se llevó, además, a
un amplificador de AC (P15D, Grass) y, de
ahí, a un convertidor analógico digital de 12
bits (MBC metrabyte DAS-16). Se digitalizó la
señal a la frecuencia establecida por el bin de
conteo en el programa de análisis de
espigas. La señal del tacómetro se usó para
correlacionar la amplitud y fase de la
respuesta en función de la amplitud y
frecuencia del estímulo mecánico.
La preparación se estimuló con
aceleraciones sinusoidales a una frecuencia
de 0.2 Hz y con una aceleración angular pico
de 440 grados/seg. En estos experimentos
fue importante lograr que el canal
semicircular lateral quedara ubicado en el
plano horizontal, de manera que las
aceleraciones de la plataforma fueran un
estímulo ideal para el canal del cual
registramos.
Estos
experimentos
se
diseñaron de forma tal que el desplazamiento
(rotación) de la plataforma de registro, sería
equivalente a una flexión lateral del cuello del
axolotl.
Técnica de registro
La actividad eléctrica de las fibras aferentes
vestibulares se registró usando un electrodo
de succión (A-M Systems), cuya punta se
llenó con solución Ringer hasta hacer
contacto con un alambre de plata clorurada
que se encuentra en el interior del electrodo.
Mediante un manipulador se afrontó el
electrodo al extremo libre del nervio y se
succionó aplicando presión negativa; de esta
manera se forma un sello de alta resistencia
eléctrica entre el interior y el exterior del
electrodo, lo que determina que se puedan
registrar las variaciones de voltaje del nervio.
Esta técnica permite mantener registros
estables durante varias horas. El electrodo
de succión se conectó a una amplificador AC
(Grass, P-15) y, a través de un conector
rotatorio, se llevó a un osciloscopio
(Textronix, 2216) y un discriminador de
ventana (WPI, 121). La salida del
discriminador de ventana se llevó a una
computadora en la que, mediante un
programa específico de análisis desarrollado
en nuestro laboratorio, se construyeron las
gráficas de frecuencia de descarga de las
fibras aferentes (Soto y Vega, 1987).
Protocolo experimental
En todos los experimentos se hizo un registro
control antes de cualquier manipulación
farmacológica; este control consistió en el
registro de la descarga basal durante un
minuto y, posteriormente, la respuesta a 7
ciclos de estimulación sinusoidal con una
frecuencia de 0.2 Hz. Se realizaron también
controles para verificar que la perfusión no
produjera por sí misma ningún tipo de
respuesta mecánica con cambio ostensible
en la actividad de las neuronas aferentes
vestibulares.
Análisis estadístico
Para el análisis de los resultados, el registro
de la actividad eléctrica de las aferentes
vestibulares se llevó a un discriminador de
ventana y de ahí a una computadora para su
procesamiento en forma de gráficas de
frecuencia en función del tiempo (Soto y
Vega, 1987). Para analizar el efecto
producido por una droga, tanto sobre la
descarga basal como sobre la respuesta a
estímulos mecánicos, se utilizó la prueba
estadística no paramétrica U de Mann
Whitney (Soto y cols., 1989). Para comparar
los efectos de una droga entre varios
registros de la actividad basal, los resultados
se normalizaron como porcentaje con
respecto al control. En la respuesta a la
estimulación mecánica se midió el tamaño de
5 picos y se obtuvo la media.
A
Betahistina1 mM
Control
100 ips
30 s
B
125
% Descarga Control
evocada
basal
100
75
50
25
0.01
0.1
1
Log [betahistina] mM
10
Figura 7. En A, gráfica de frecuencia
en función del tiempo que muestra la
acción típica de la betahistina. La
perfusión de la betahistina decrementa
la descarga basal y la respuesta
producida por los estímulos mecánicos.
Los registros muestran el control, la
descarga basal y la evocada los 5 y 10
min. de perfusión de la betahistina. Las
barras grises corresponden a los
periodos de estimulación mecánica
(ips= impulsos por segundo). En B, la
curva dosis-efecto de la acción de la
betahistina sobre la descarga basal y la
evocada mecánicamente en las
aferentes de los canales semicirculares. La curva se construyó con
base en los registros a los 10 min de
perfusión de la betahistina. Cada punto
representa la media ± el error estándar
de cuando menos 5 experimentos.
21
RESULTADOS
Se registró la actividad basal y la respuesta a
estímulos mecánicos de las aferentes
vestibulares en un total de 149 experimentos.
Betahistina
La betahistina (BH) se probó inicialmente
aplicándola por microperfusión 20 µl en
concentraciones de 100 µM (n=2), 0.1 mM
(n=2), 1 mM (n=2) y 10 mM (n=2). En
ninguna de estas concentraciones se
encontró
un
efecto
significativo.
Posteriormente,
aplicamos
la
droga
perfundiendo la preparación con una
concentración de 100 µM; en este caso
observamos una disminución de la frecuencia
en la descarga basal y de la respuesta a los
estímulos mecánicos de las aferentes de los
canales semicirculares. Con base en este
resultado, y considerando el curso temporal
de la acción de la betahistina, se decidió que,
en adelante se tomarían registros de la
Control
d-T 10 µM, 10 min
actividad eléctrica de las aferentes
vestibulares luego de 1, 5 y 10 minutos de
perfusión de la droga. Perfundimos a la
betahistina por sustitución en el baño en
concentraciones de 0.01 a 10 mM (n=32) y
observamos una disminución en la frecuencia
de la descarga basal y, en menor proporción,
en la respuesta a estímulos mecánicos de las
aferentes de los canales semicirculares.
Encontramos que el efecto inhibitorio de la
betahistina es dependiente del tiempo de
perfusión y de la concentración. En todos los
casos el efecto de la betahistina fue
reversible con el lavado. En estas
concentraciones, la betahistina inhibió la
descarga basal de las neuronas aferentes de
los canales semicirculares vestibulares con
una IC50 de 600µM y produjo una inhibición
de la respuesta a estímulos mecánicanicos
con una IC 50 de 10 mM a los 10 minutos de
perfusión (Figura 7B). Cabe destacar que, a
la concentración más baja (0.01 mM), el
efecto de la betahistina sobre la actividad
basal mostró una excitación y no una
BH + d-T
Lavado 35 min
50 ips
Exp 355
1 min
Figura 8. Registros de la descarga en reposo y ante la estimulación mecánica de las
neuronas aferentes de los canales semicirculares. La aplicación de d-tubocurarina (d-T) 10
µM no produce un efecto por sí misma La aplicación de la betahistina 1 mM en presencia
de la d-T produce un efecto inhibidor semejante al que se presenta en la condición control.
22
inhibición (Figura 7B). En la figura 7A se
observa un registro de la actividad eléctrica
de las aferentes vestibulares, en el que la
betahistina 1mM disminuyó tanto la actividad
espontánea como la respuesta a estím ulos
mecánicos; su efecto revirtió a los 20 minutos
de lavado.
Atropina, d-tubocurarina y betahistina
Las concentraciones utilizadas de los
antagonistas colinérgicos se eligieron con
base en un reporte de la literatura que indica
que, con estas concentraciones, se bloquean
completamente
los
receptores
tanto
muscarínicos como nicotínicos (Sugai, y
cols., 1992).
Perfundimos atropina 10 ?M por
sustitución en el baño y no observamos
ningún cambio significativo en la descarga
basal de las aferentes vestibulares (n=18).
Perfundimos d-tubocurarina (d-T) 10
?M por sustitución en el baño y tampoco se
modificó ostensiblemente la actividad
eléctrica basal de las neuronas aferentes de
los canales semicirculares (n=18).
Posteriormente estudiamos
la
interacción
entre
estos
antagonistas
muscarínicos y nicotínicos con la betahistina.
Después del registro control, perfundimos
durante 10 minutos atropina 10 µM, luego de
este tiempo registramos la actividad eléctrica
de las aferentes vestibulares; posteriormente
el Ringer de la cámara fue sustituido por otro
que contenía atropina 10 µM más betahistina
1 mM (n=3); el efecto de la betahistina
permaneció como en el control.
Se sustituyó en el baño a la dtubocurarina 10 µM y se perfundió durante 10
minutos, añadiendo al Ringer la betahistina
1mM ( n=3); observamos que el efecto de la
betahistina se mantiene como en el control.
Los antagonistas colinérgicos no produjeron
cambios significativos en el efecto de la
betahistina. En la figura 8 se muestra el
registro de la frecuencia de descarga de las
neuronas aferentes de los canales
semicirculares; en donde se observa que no
se modifica la actividad basal ni la respuesta
a estímulos mecánicos después de 10
minutos de perfusión de d-tubocurarina 10
µM, con respecto al control; sin embargo, al
añadir betahistina durante 10 minutos, se
observa el efecto inhibitorio igual que en el
control.
Betahistina 1 mM
Carbacol 200 µM
Carbacol 200 µM
20 ips
1 min
Figura 9. Interacción entre betahistina y carbacol. La aplicación de betahistina inhibe el
efecto excitador del carbacol (n=5) en un 30%. Este efecto inhibidor de la betahistina
sobre las respuestas provocadas por el carbacol puede deberse a una acción pre o
postsináptica de la betahistina.
23
Carbacol
Con el fín de estudiar aún más las posibles
interacciones de la betahistina con los
receptores colinérgicos, decidimos usar el
carbacol. Probamos el efecto del carbacol
sobre la actividad eléctrica de las aferentes
vestibulares
y
lo
aplicamos
por
microperfusión 20 µl cada vez, en un rango
entre 10 y 300 µM (n=20); no tuvo un efecto
significativo sobre la respuesta a estímulos
mecánicos; en contraste, produjo un
incremento de larga duración (3-5 minutos)
en la descarga basal de las neuronas
aferentes de los canales semicirculares. El
efecto del carbacol en las concentraciones
usadas
fue
independiente
de
la
concentración (se obtuvo prácticamente el
mismo efecto a todas las dosis).
Carbacol y betahistina
Con el fin de definir si existe alguna forma de
interacción entre los receptores a histamina y
los mecanismos que median la respuesta a la
acetilcolina,
decidimos
perfundir
la
preparación con betahistina 1 mM durante 10
minutos. Una vez que se ha desarrollado el
efecto inhibidor de la betahistina, se aplicó
por microperfusión carbacol 200 µM (n=5).
Decidimos usar esta concentración de
Control
carbacol porque está reportado que produce
una activación inespecífica de receptores
tanto muscarínicos, como nicotínicos (Guth y
cols., 1986).
La betahistina redujo la acción
excitatoria del carbacol en un 30 ? 3.4 % con
respecto
al
control,
sin
modificar
significativamente su curso temporal (figura
9).
L-NOARG y betahistina
Para estudiar si la acción de la betahistina
sobre la descarga del nervio aferente está
relacionada con la generación de óxido
nítrico, perfundimos durante 10 minutos, un
antagonista de la sintetasa de óxido nítrico
(L-NOARG) en una concentración de 3 µM.
La concentración de 3 µM se eligió
considerando la IC 50 de este agente, del que
previamente hemos estudiado su acción
sobre la descarga de las aferentes de los
canales semicirculares (Flores y cols., 1996).
El L-NOARG produjo una disminución del 19
? 4.4% en la descarga basal y de 11.2 ?
4.4% en la respuesta a estímulos mecánicos
(n=5); posteriormente, al Ringer con LNOARG se añadió betahistina 1 mM (n=5). El
efecto inhibidor de la betahistina se mantiene
L-NOARG
L-NOARG + BH
25 ips
30 s
Figura 10. La administración previa de L-NOARG no modifica el efecto inhibitorio de la
betahistina. La figura muestra la actividad control, la actividad eléctrica después de 10
minutos de perfusión de L-NOARG 3 µM y el registro después de 10 minutos de añadir
betahistina 1 µM. Las barras grises representan los periodos de la estimulación mecánica.
24
como en el control (tabla 2). En el caso de la
perfusión con L-NOARG, el efecto de la
betahistina no se elimina completamente,
aún después de 60 minutos de lavado. En la
Figura 10, se muestran tres registros
consecutivos en los que se observa el efecto
del L-NOARG 3 µM y después el efecto
de las aferentes vestibulares. Posteriormente
se adicionó L-arginina (1 µM; n=4) al Ringer
normal por perfusión en el baño y no se
modificó la descarga basal de las neuronas
aferentes vestibulares. Medimos el pH de la
solución Ringer al adicionar la L-arginina,
obteniéndose un valor de 7.38. Es importante
Tabla 2. Efectos de la betahistina (BH) y L-NOARG sobre las aferentes vestibulares
Ringer normal
n basal
provocada
L-NOARG, 3 µM
5 19 ? 4.4 %
11.2 ? 4.4 %
BH, 1 mM
5 43 ? 8.8 %
28.2 ? 5.5. %
BH después de L-NOARG
5 46 ? 9.2 %
30.8 ? 8.2 %
Ringer con glicina y L-arginina
L-NOARG, 3 µM
4 37.3 ? 11.2 %
17 ? 4.7 %
BH, 1 mM
4 45.3 ? 6.2 %
29.8 ?4.7 %
BH después de L-NOARG
4 46 ? 6.9 %
26 ? 6.8 %
inhibitorio
de la betahistina 1 µM que
permanece como en el control.
Con el fin de analizar con mayor
detalle la posible influencia sobre la
producción de NO, decidimos estudiar el
efecto de la L-arginina, que es el sustrato
natural para la NOS, y que tiene un efecto
excitatorio sobre la actividad en reposo de las
neuronas del estatocisto del calamar y la jibia
(Tu y Budelmann, 1999). En nuestra
preparación,
la L-arginina se administró
inicialmente por microperfusión 1; n=2, 10;
n=2 y 100 ?M; n=2, y 10 mM (n=2,), y no se
considerar el hecho de que la solución Ringer
no cambie el pH después de administrar al
aminoácido L-arginina.
Se ha reportado que la glicina es un
coagonista de los receptores NMDA en el
sistema nervioso central y en el oído interno
(Johnson y Ascher, 1987; Soto y cols., 1994).
Al perfundir glicina 1 ?M, n=4, no se modifica
la descarga basal de las neuronas aferentes
vestibulares. Encontramos que la perfusión
de la preparación con una solución Ringer a
la cual se ha adicionado L-arginina 1 µM y
glicina 1 µM presenta una actividad más
Tabla 3. Efecto de la BH sobre el efecto excitador del KA
BH ?M?
1x10-3
1x10-2
% de disminución del efecto excitatorio n
del KA 10 µM
45.5 ? 9.8%
4
67.5 ? 2.5%
2
observaron cambios en la actividad basal de
las aferentes vestibulares; después se aplicó
por perfusion en el baño en concentraciones
de 100?M; n=2
y 10 mM; n=2; en la
concentración más alta se observó un
aumento en la frecuencia de descarga basal
estable a lo largo del tiempo. Curiosamente,
en estas condiciones, y a pesar de la falta de
un efecto excitador evidente de la L-arginina,
la aplicación de L-NOARG 3 µM produce un
efecto inhibidor mayor de un 18 % en la
actividad basal y de 5.8 % en la respuesta a
25
Betahistina 1 mM
KA
KA
50 ips
30 s
Figura 11. Interacciones entre la betahistina y el ácido kainico (KA). En la figura observamos
la respuesta control de las aferentes de los canales semicirculares a la aplicación de 20 µl
de KA 10 µM y, después, la disminución del efecto del KA luego de 10 minutos de perfusión
con betahistina 1 mM.
estímulos mecánicos con respecto al que se
produce en Ringer normal. En estas
condiciones, el efecto inhibidor de la
betahistina sobre la actividad eléctrica de las
aferentes vestibulares se mantiene como en
el control (tabla 2).
Acido kaínico y betahistina
Se aplicó por microperfusión 20 µl de
ácido kaínico (KA) 10 ?M (n=4); y
QA 1 µM
20 IPS
1 min
Figura 12. Interacción de la betahistina con el ácido quiscuálico (QA) en Ringer con bajo
calcio y alto magnesio. En la figura se observa la disminución (55 %) en el efecto
excitador del QA después de 10 minutos de perfusión de betahistina 1 mM (trazo en gris),
con respecto al control (trazo en negro).
26
observamos que induce un fuerte efecto
excitatorio en la descarga basal de las
semicirculares. La perfusión en el baño
durante 10 minutos de betahistina 1 mM
(n=4), reduce el efecto excitatorio del ácido
kaínico (10 ?M) en un 45.5 ? 9.8% con
respecto al control.Probamos también la
concentración de la BH 10 mM (n=2) por
perfusión en el baño durante 10 minutos;
esta concentración reduce el efecto
excitatorio del ácido kaínico (10 ?M) en un
67.5?2.5%) con respecto al control (tabla 3).
En la figura 11, se muestra el registro
de la frecuencia de descarga de las aferentes
vestibulares; en donde se observa la
disminución del efecto de la microperfusión
del ácido kaínico 10 ?M después de 10
minutos de perfusión de betahistina 1 mM.
Acido quiscuálico y betahistina
El ácido quiscuálico (QA), se aplicó a nuestra
preparación (20 ?l por microperfusión) 1 ?M
(n=5); este indujo un efecto excitatorio sobre
la descarga basal de las aferentes de los
canales semicirculares; cuando se perfundió
en el baño a la betahistina 1 mM, el efecto
excitatorio del ácido quiscuálico disminuyó en
un 39.7 ?.1.8% con respecto al control.
Con el fin de definir si el efecto
inhibidor de la betahistina sobre las
respuestas provocadas por el ácido
quiscuálico se produce a nivel postsináptico,
bloqueamos la liberación del neurotransmisor
aferente perfundiendo la preparación con
Ringer con bajo Ca y alto Mg (0.09 y 10 mM
respectivamente) en estas condiciones como
se ha reportado previamente en nuestro
laboratorio (Pérez y cols, 1993), la actividad
basal y la respuesta a estímulos mecánicos
desaparece. La microperfusión con ácido
quiscuálico (1 ?M, n=13) produce una
respuesta excitatoria muy poderosa de las
neuronas aferentes vestibulares (Figura 12) .
Cuando perfundimos a la betahistina (0.001-
10 mM), el efecto excitador del ácido
quiscuálico 1 µM disminuye de manera
dependiente de la concentración de
betahistina (tabla 4).
En la figura 12, podemos ver un
registro de la actividad eléctrica de las
aferentes vestibulares estimuladas por la
aplicación de ácido quiscuálico 1 µM, en
Ringer con bajo calcio y alto magnesio, antes
y después de la perfusión de betahistina 1
mM.
Cabe destacar que el efecto inhibidor
de la betahistina sobre la respuesta
provocada por el ácido quiscuálico cuando
se ha bloqueado la liberación de
neurotransmisor
produce
una
curva
concentración efecto que es paralela a la
curva de inhibición de la respuesta a
estímulos mecánicos producida por la
betahistina (Figura 13). Este hecho apunta
claramente a un efecto del tipo de
antagonismo competitivo.
DISCUSIÓN
Probamos varias hipótesis en relación con el
mecanismo de acción de la betahistina en la
periferia vestibular. La betahistina produce un
efecto inhibitorio significativo sobre la
descarga basal de las neuronas aferentes
vestibulares, como ha sido reportado
previamente (Botta y cols., 1998). También
establecimos que la betahistina ejerce un
ligero efecto inhibitorio sobre la respuesta a
estímulos mecánicos. El efecto inhibitorio de
la betahistina se observó después de que la
droga estuvo en contacto con la preparación
algunos minutos (5-10 minutos). La baja
potencia y la latencia de sus efectos apuntan
hacia el hecho de que la betahistina tiene
una
acción
compleja,
involucrando
probablemente a segundos mensajeros.
27
% de la respuesta control
125
evocada
basal
BH + QA
100
75
50
25
0.01
0.1
1
10
Log [betahistina] mM
Figura 13. Efecto inhibitorio de la betahistina sobre el efecto evocado por el ácido
quiscuálico en Ringer con bajo calcio y alto magnesio. La curva dosis efecto de la
betahistina sobre el QA (1 µM) tiene una cinética muy similar a la curva de inhibición de la
respuesta evocada mecánicamente producida por la betahistina (cada punto en la gráfica
corresponde a 3 experimentos, excepto a la dosis de 0.1 mM en donde son 4 experimentos.
Resultados previos de inmunohistoquímica en nuestro laboratorio indican que el
óxido nítrico es producido por las células
ciliadas, y que la producción de NO se da
bajo la influencia de las fibras eferentes
(Flores y cols., 1996). También se ha
postulado que la producción de NO de las
células ciliadas
pueda ser modulada a
través de un autorreceptor para el
neurotransmisor aferente ( Prigioni y cols.,
1990; Guth y cols., 1998b). El óxido nítrico
generado a nivel de las células ciliadas
podría afectar tanto a las neuronas aferentes
como a las eferentes, además de participar
en la regulación del flujo sanguíneo en el
oído interno en el axolotl (Flores y cols.,
1996).
Reportes previos han propuesto la
hipótesis de que la acción periférica de la
28
betahistina está dada por un aumento en la
microcirculación local en el laberinto
(Martínez,
1972).
Usando
flujometría
Doppler, se ha demostrado que la betahistina
aumenta el flujo sanguíneo vestibular en el
ámpula del canal posterior del cobayo
(Dziadzola y cols., 1999).
Nosotros estudiamos los efectos de la
betahistina en presencia de un antagonista
de la NOS, el L-NOARG. La hipótesis a
probar fue que la betahistina podría modular
la producción de NO en el oído interno y,
consecuentemente, inducir una modificación
local del flujo sanguíneo. Nuestros resultados
indican que el bloqueo de la NOS no modifica
significativamente la acción de la betahistina
sobre la descarga eléctrica de las neuronas
afererentes de los canales semicirculares,
por lo que podríamos considerar que, en lo
que respecta a la actividad eléctrica, la
betahistina no tiene influencia sobre la vía de
producción del NO. En nuestra preparación in
vitro no hay flujo sanguíneo, por lo que la
evaluación de las acciones del óxido nítrico
en este trabajo se basa exclusivamente en la
actividad eléctrica de las neuronas aferentes.
La probabilidad de que fuentes de NO que no
son capaces de influenciar la descarga de las
neuronas aferentes vestibulares podrían ser
afectadas por la betahistina y mediar algunos
de sus efectos clínicos permanece abierta.
De hecho, se ha descrito que la vasculatura
de la región de células oscuras de la cresta
ampular del cobayo está inervada por fibras
trigeminales que constituyen un sistema para
las
respuestas
vasadilatadoras
no
relacionadas con la inervación del VIII par en
la periferia vestibular (Vass y cols., 1998).
Se ha reportado, en estudios
bioquímicos, que la histamina, a través de los
receptores H1, estimula la actividad de la
sintetasa de óxido nítrico en células
endoteliales cultivadas, (Schmidt y cols.,
1990); y en muestras de tejido pulmonar
(Leurs y cols., 1991a).
En el vestíbulo de la rana se ha
demostrado la presencia de receptores H1,
así como la inhibición dependiente de la
dosis del efecto facilitador de la histamina al
aplicar betahistina (Guth y cols., 2000).
Nuestros resultados indican que el bloqueo
de la NOS con L-NOARG no modifica el
efecto de la betahistina, ya que de ser éste el
mecanismo de acción, no esperaríamos el
efecto inhibitorio de la betahistina.
También nos planteamos la hipótesis
de que la betahistina podría modificar la
liberación del neurotransmisor eferente, y de
esta manera modificar la entrada sensorial
vestibular al sistema nervioso central.
Estudiamos la interacción entre antagonistas
muscarínicos y nicotínicos con la betahistina;
el hecho de que tales antagonistas no
modifiquen el efecto inhibitorio de la
betahistina implica que esta droga no es
capaz de inducir la liberación de acetilcolina
de los axones eferentes seccionados en
nuestra preparación del oído aislado. En
estos experimentos, la influencia de otras
sustancias además de la ACh, que pueden
liberarse de las terminales eferentes, no fue
analizada, como el péptido relacionado con el
gen de la calcitonina (CGRP) que se ha
reportado que induce facilitación de las
aferentes en el órgano de la línea lateral
(Adams, y cols., 1987; Bailey y Sewell, 2000);
péptidos opioides, principalmente agonistas
del receptor kappa que disminuyen la
frecuencia de descarga de las aferentes de
los canales semicirculares del axolotl (Vega,
2000), y la leu-encefalina que también
disminuye la frecuencia de descarga de las
aferentes vestibulares de la rana (Andrianov
y Rhizova, 1999).
Se ha sugerido que la histamina
podría favorecer la liberación de acetilcolina
de las fibras eferentes, o activar a los
receptores colinérgicos (Housley y cols.,
1998). Nosotros demostramos que el bloqueo
de los receptores colinérgicos, nicotínicos y
muscarínicos con d-tubocurarina y atropina,
respectivamente, no modifica el efecto de la
betahistina; más bien encontramos que la
betahistina bloquea la respuesta excitadora
inducida por el agonista colinérgico
inespecífico, carbacol. Estos hechos sugieren
que la betahistina pudiera actuar sobre la
célula ciliada en lugares diferentes de los
receptores colinérgicos, pero que afectan la
activación de éstos. Permanece entonces
abierta la posibilidad de alguna interacción
indirecta entre los receptores de histamina y
los de ACh sobre la célula ciliada,
probablemente a través de la modulación de
segundos mensajeros.
El efecto excitador del carbacol se
podría explicar, por su unión a receptores
muscarínicos, cuya activación a través de
proteínas G favorece el aumento en el calcio
intracelular y la posterior liberación del
neurotransmisor aferente (Guth, 1990).
29
Encontramos que la excitación producida por
el carbacol se abole al perfundir atropina, y
se reduce con la aplicación de d-tubocurarina
(resultados no mostrados), lo que indica la
presencia de receptores muscarínicos en el
vestíbulo del axolotl. Sin embargo, Bailey y
Sewell (2000), proponen que la activación de
los receptores nicotínicos que son canales a
través de los cuales pasa calcio, podrían
activar a canales de potasio dependientes de
calcio, y producir hiperpolarización en las
células ciliadas, como la reportada en el
sáculo de la rana (Sugai y cols, 1992), y al
mismo tiempo, éste calcio ser capaz de
inducir la liberación del neurotransmisor
aferente. La presencia de proteínas que
capturan calcio en la célula ciliada,
sumamente
eficaces,
reducirian
ésta
posibilidad (Roberts y cols., 1990; Tucker y
Fettiplace, 1995).
Existe también la posibilidad de que
los receptores para la betahistina estén
ubicados sobre las neuronas aferentes. Para
probar esta hipótesis decidimos estudiar las
interacciones de la betahistina con agonistas
de receptores a aminoácidos excitadores
(ácido kaínico y ácido quiscuálico).
Encontramos que la betahistina disminuye el
efecto excitador del kaínico y del quiscuálico,
indicando que la betahistina podría
interactuar con receptores ubicados en las
neuronas aferentes, y que la activación de
éstos determina la reducción en la respuesta
a la aplicación exógena de agonistas a los
AAE. Otra posibilidad es que existan
receptores presinápticos histaminérgicos
sobre la célula ciliada cuya activación por la
aplicación exógena del ácido quiscuálico o
ácido kaínico module negativamente la
liberación del neurotransmisor, o bien, que la
betahistina interaccione con receptores
30
histaminérgicos sobre la célula ciliada y que
la activación de éstos active autorreceptores
a AAE sobre la célula ciliada, reduciendo así
la liberación del neurotransmisor aferente.
Para descartar esta última hipótesis,
perfundimos nuestra preparación con Ringer
con bajo calcio y alto magnesio, que, se
sabe,
bloquea
la
liberación
del
neurotransmisor, y tanto la actividad basal
como la respuesta a estímulos mecánicos
desaparecen (Pérez y cols., 1991). En estas
condiciones, la aplicación de betahistina
reduce el efecto excitador del ácido
quiscuálico, lo que indica que el efecto
inhibidor de la betahistina se produce
predominantemente sobre las neuronas
aferentes vestibulares a través de receptores
para la betahistina ubicados sobre las
neuronas aferentes; parte del efecto de la
betahistina estaría dado a través de la
activación de éstos receptores que podrían
afectar indirectamente a los receptores de los
aminoácidos excitadores, o bien actuar sobre
estos mismos, ya que la disminución del
efecto excitador del ácido quiscuálico es
dependiente de la dosis y la curva de
inhibición producida por la betahistina sobre
la disminución del efecto provocado por el
quiscuálico presenta una cinética similar a la
curva de inhibición a la respuesta a estímulos
mecánicos producida por la betahistina, lo
que
apunta
hacia
un
antagonismo
competitivo en esta respuesta mecánica y
parecería tener un mecanismo diferente para
la respuesta basal. Se ha reportado que la
betahistina atenúa significativamente la
rotación inducida por la microinyección de
ácido kaínico dentro del núcleo vestibular
medial (O´Neill y cols., 1999), indicando que
la betahistina reduce la excitabilidad de las
neuronas aferentes.
En el trabajo publicado que acompaña
a esta tesis (anexo I), en las conclusiones
apuntamos que una posibilidad que entonces
quedaba abierta era que la betahistina
actuara a nivel de receptores presinápticos
modificando la liberación de neurotransmisor,
y que, por algún mecanismo X, esta acción
presináptica pudiera a su vez modificar la
respuesta a la aplicación exógena de ácido
kaínico. Está claro que un mecanismo como
el propuesto implicaría que la aplicación
exógena de agonistas de los AEE no sólo
activara receptores postsinápticos sino que
además
actuara
sobre
receptores
presinápticos
(por
ejemplo
de
tipo
metabotrópico descritos por Guth y cols, en
1998, pero que en trabajos previos en
nuestro laboratorio no se encontraron en el
oído del axolotl (Flores, 1993), que
modificaran la liberación del neurotransmisor
aferente. Lo que estábamos realmente
pensando entonces al abrir esta posibilidad,
es que parte de la respuesta a la aplicación
de un agonista de AEE fuera debida a la
interacción con receptores postsinápticos, y
otra parte debida a modificaciones en la
liberación del neurotransmisor aferente, y
que por tanto, fármacos capaces de modificar
la liberación del neurotransmisor pueden
producir un aparente efecto postsináptico, ya
que modificarían también la respuesta a la
aplicación de agonistas de los receptores a
los AEE. Por eso consideramos que era
indispensable y muy importante realizar la
serie experimental en que bloqueamos
completamente
la
liberación
del
neurotransmisor aferente mediante el uso de
soluciones con alto Mg 2+ y bajo Ca2+, ya que
de esta manera la modificación en la
respuesta a la aplicación de un agonista de
los AEE no puede, en teoría, tener ningún
componente presináptico. Es por eso que, en
Figura 14. Hipótesis probadas acerca
del sitio de acción de la betahistina en la
periferia vestibular. Nuestros resultados
indican que la betahistina tiene su sitio
de unión sobre las neuronas aferentes,
lo que puede explicar su efecto
inhibitorio y la inhibición del efecto
excitatorio del KA y del QA aún en
condiciones en que se inhibe la
liberación del neurotransmisor aferente
en Ringer con alto Mg ++ y bajo Ca++. La
influencia de la betahistina en la
liberación del neurotransmisor eferente,
la generación del NO y la activación de
autorreceptores presinápticos aferentes
se descartó (sitios de unión cruzados).
La unión de la betahistina en sitios sobre
la célula ciliada que modifican el efecto
de la Ach no se descarta y se considera
como una posibilidad alternativa.
31
este trabajo, la figura14 en que se resumen
las conclusiones, es diferente a la que
publicamos en el trabajo que se incluye en el
anexo I, ya que hemos logrado excluir la
participación de receptores presinápticos a
los AEE en el efecto inhibidor de la
betahistina sobre las respuestas provocadas
por los agonistas de los AEE.
CONCLUSIONES
1.- La betahistina disminuye la frecuencia en
la descarga basal y, en menor proporción, la
respuesta a estímulos mecánicos de las
semicirculares.
2.- El efecto de la betahistina se mantiene
después de la perfusión con L-NOARG éste
efecto de la betahistina permanece aún
después de mantener activa a la NOS con Larginina y activados a los receptores NMD A
con glicina.
3.- Demostramos que el bloqueo de los
receptores
colinérgicos
nicotínicos
y
muscarínicos con d-tubocurarina y atropina,
respectivamente, no modifica el efecto de la
BH; más bien, la BH bloquea la respuesta
excitadora
inducida
por
agonistas
colinérgicos (carbacol), lo que indica que la
betahistina puede actuar sobre la célula
ciliada en lugares diferentes de los
receptores colinérgicos, pero que afectan la
activación de éstos.
4.- La BH disminuye el efecto excitador del
ácido kaínico, lo que indica que los
receptores para la BH están ubicados sobre
las neuronas aferentes.
5.- Probamos también que la betahistina
disminuye el efecto excitador del ácido
quiscuálico, aun en Ringer con bajo calcio y
alto magnesio que bloqua la liberación del
neurotransmisor aferente, lo que descarta la
posibilidad de que la betahistina esté
actuando a nivel de autorreceptores para
aminoácidos excitadores ubicados en la
célula ciliada.
32
Perspectivas de trabajo.
1.-Definir si otros fármacos como la
tioperamida (antagonista H3), tienen un
efecto semejante a la betahistina; y si la
betahistina reduce el efecto del agonista
específico H3 (R-alfa-metilhistamina).
2.- Definir si el metabolito de la betahistina, la
aminoetilpiridina (M1) reproduce los efectos
postsinápticos de la betahistina.
3.- Definir si la betahistina antagoniza la
respuesta de otros agonistas de los AAE más
específicos como el AMPA.
4.- En caso de tener una respuesta positiva
en la acción antagonista sobre los AAE, y
negativa con respecto al punto 1, proponer a
la betahistina como un antagonista de los
AAE.
5.- En caso contrario (positivo el punto 1, y
negativo el punto 3), tratar de definir el
mecanismo de acción por medio del cual los
receptores H3 inhiben la respuesta de los
AAE.
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EFECTO DE LA BETAHISTINA SOBRE LA ACTIVIDAD ELÉCTRICA

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