UNIVERSIDAD AU EFECTO DEL EXTRACTO

UNIVERSIDAD AU
fD M S I ~ N
MA METROPOLITANA-IZTAPALAPA
\
,
'
DE CIENCIAS BIOL~GICASY DE LA SALUD
I
/
EFECTO DEL EXTRACTO METANÓLICODE Solanum towum Sw.
SOBRE LA PROLIFERACI6N CELULAR
CCk3DlfJACi3N DE SEnVlCiOS
DOCUMENTALES BIBLIOTECA
-
L
ALUMNA : VICTORIACASTILLORODRIGUEZ
PROFESORES
M en C: RODOLFO VELASCO LEZAMA
Q. B. P: RAFAELA TAPIA AGUILAR
I
I
\
La médula bsea es elprincipalsitio
sistemahematopoyético,que
de proliferación y diferenciacibn del
se originadelacélulastem
o célulamadre
pluripotencial
hematopoyética,
con
restricción
progresiva
del
potencial
de
diferenciacibnamedidaquelacélula
se
precursoras de un solo linajecomo
comprometeyproduce
las células
son; La unidadformadora de colonias de
macrófagos/monocitos (GM-CFU), unidad formadora de brotes de eritrocitos (EBFU), unidad formadora de brotes de megacariocito (Meg-BFU), y línea
(1). La difer%.ciaciónterminaldecadaelemento
linfoide
sanguíneo origina; eritrocitos,
linfocitos, plaquetas, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos que
se liberan a
la circulaciónsanguínea (2).
S e ha postulado que bajolainfluencia
deagentesfísicos,químicos,
infecciosos o humorales, las dlulas hematopoykticas normal se transforman y
producen trastornos hematoldgicos como laleucemia,enfermedadmalignadel
tejidohematopoyéticocaracterizadaporelreemplazamientodeelementosde
medula ósea normal
por
células
'
neoplásicas
que
frecuentemente
esthn
presentes en la sangre periférica y que invaden
mononuclearparticularmente
#
otros tejidos u
órganos del sistema fagocitíco
el bazo, hígado y nódulos
linfdticos, ademásde
órganos corporales, eventualmente la' leucemia causa la muerte
(3,4). Otrostrastornoshematológicosproducidosporalteracionesen
lacélula
stem pluripotencial son; la anemia aplhstica, metaplasia mieloide y neutropenia
cíclica, los que finalmente causaran la muertede los adultos quelas padecen (5).
"
.
La diferenciación de las células stem hematopoyética sin autorrenovación
adecuada provocar deplesión de elementos sanguíneos, en tanto que
la falta de
diferenciación de la d u l a stem da lugar a un número insuficiente de plaquetas,
-x
eritrocitos o granulocitos
maduros(4).
En la medicina alopática las leucemias y la anemia aplhstica son tratadas
h
con radioterapia quimioterapia y transplantes de médula ósea, sin embargo estos
tratamientos particularmente el ultimo no están al alcance de la población, siendo
costosporelloalgunaspersonasrecurrenalamedicinaherbolariacomoun
tratamiento alternativo o complementario de la medicina alophtica para eliminar o
En nuestro país con una extensa variedad de plantas
se utilizan al menos
32 de ellas para el tratamiento de cáncer y10 leucemia aunque la gran mayoría de
ellas carecen de estudios que respalden su actividad. Para el presente estudio se
seleccionó Solanum fowurn Sw. Plantade la familiaSolanaceaerecomendada
comúnmente en Chiapas como antitumoral, antiespasmódico y contra infecciones
de genitales externos y heridas(6). Con base en que Solanum fowum es utilizada
comoantitumoralyque
laleucemiaesuntipodechncerdetejidoblandose
podría esperar que está planta pudiera contrarrestar la proliferación de las células
neoplhsicas.
JUSTIFICACI~N DEL TRABAJO Y DE LA
MODIFICACI~N DE
OBJETIVOS
Los objetivos planteados
inicialmente,sepropusieronconsiderando
una
posiblecolaboración con el grupodeinvestigacióndelDr.AlejandroMarchedel
Instituto
Nacional
de
Cancerología,
quien
aportaría
las
células transformadas
S. t o m .
(leucémias)quedeberíanserexpuestasalosextractosderivadosde
Quedandodeacuerdoque
estapartedeltrabajo
se realim'a en dichainstitucibn,
(S-254) del la U A "
debidoaqueelLaboratoriodeHematologíaExperimental
Iztapalapa no reunía las condiciones de seguridad para el manejo de células humanas
leucémicas .
Sin embargo,debidoadichogruponoobtuvo
l a s líneascelulares
requeridaspara el estudio, no se concretó la colaboración, ya queestegruposólo
contabaconcultivosprimarios
de lasangredepacientes
con leucemia meilocítica
crónica, pero heterogéneo respecto al a la fase de la enfermedad y a los tratamientos
recibidos previamente.
Porloanterior
y sobretodoporque
elrealizardichotrabajoennuestro
laboratoriorepresentaba gave riesgo para la alumnay
los demásintegrantesdel
grupode trabajo. Se modificaron los objetivos propuestos inicialmente y se decidió
obtener los extractosacuoso
y orgánicosde
la plantaparaevaluarsuactividad
hematopoyética en cultivo de células de bazo y de médula ósea de ratones sanos, lo
que complementa los estudios realizados por nuestro grupo,
ya que en esta ocasión
se modificó el método de obtención de los extractos, lo cual permitirá determinar cual
de los métodos de obtención preserva
la actividad biológica de los extractos.
Considerando que en estudios realizados por el grupo de trabajo S torvum ha
mostradoactividad
citotóxica encultivosdecélulashumanastransformadas,es
posible que esta planta tenga actividad antineoplásica y que la estrategia inicial para
el estudiode
los antineoplásicos es evaluarsu
efecto sobre la, proliferacibnde
modelos de estudio sencillos como bacterias y levaduras, en este trabajo
se planteó
también como objetivo conocer el efecto antimicrobiano de los extractos obtenidos,
utilizando cultivos deEscherichia coli, Bacillus subtilisy Candida albicans.
Es importantemencionarqueelinterésdeutilizar
células leucémicases
conocer la gama de células humanas transformadas para las cuales el extracto acuoso
de la planta es citotóxico, Ademáspermitiríaconocer
si existe algúngradode
especificidad respecto al tipo de leucemia que puede ser tratada
extractos.
con la planta 0
SUS
EFECTO DEL EXTRACTO METANdLlCODE Solanum fotvum Sw. SOBRE LA
PROLlFERACldN CELULAR.
ObjetivoGeneral
:
Determinar el efecto del extracto metanólico de Solanum Towum Sw. sobre la
proliferación de dlulas transformadas humanaso murínas.
Objetivos Específicos :
a) Obtención en extracto metanólico deSolanum towum.
b) Determinar el efecto del extracto metanólicode Solanum towum Sw sobre la
proliferación in vitrode c6lulas de bazo
y de medula ósea de ratdn sano.
c) Determinar el efecto del extracto metanólico de
Solanum tonrum Sw sobre la
proliferación in vivo.
c) Evaluación delefectodelextractometanólico
de Solanumtomum
sobre la
concentración delas c6lulas sanguineas de ratonessanos.
...
HIP~TESIS
Dado que la Sosa (Solanum fowum) es una de las plantas que se utilizan en
diversas regiones del país para el tratamiento de cáncer o leucemia, es posible
quelaplantacontengacompuestosqueinhibanlaproliferacióndecélulas
transformadas, que estimule la proliferación de &lulas normales
tanto el estudio de la actividad de
o ambas, por
sus extractos sobre la proiiferacibn c6lular
h
vivo e in vitro permitiría conocer si esta planta posee las propiedades curativas
que el conocimiento popular le atribuye.
METODOLOGíA
OBTENCIóN DE LOS EXTRACTOS:
S e pesaron 200 gramos de hojas secas de Solanum torvum Sw, se colocaron
en maceración en un matraz con 1200 ml de hexano, se dejaron en reposo al
resguardo de la' luz por 48 horas a
temperatura ambiente, al término de este
tiempo se filtró la mezcla, para recuperar el sobrenadante yse filtro. Los residuos
del solventes en las hojas se eliminaronporevaporación,substituyéndose
solvente del macerado por cloroformo,
el
se repitióel mismo procedimiento para
metano1 y agua. E n cada una de las fases de la extracción produjo los extractos
hexánico, clorofórmico, metanólicoy acuoso, los que fueron llevados a sequedad
por evaporación. Finalmente se prepararon las diluciones con O.O8g, 0.04, 0.02,
0.01 y 0.005 g/mlde los extractoscondimetilfullsóxido
(DMSO) al 10% y se
evaluó su efecto sobre la proliferación celularin vitro e in vivo.
ACTIVIDAD BlOLOGlCA IN VITRO.
S e obtuvieron cultivos de 24 horas de Escherichia coli, BacilZos subtilis en caldo
nutritivo, se sembraron por dispersión en placa en medios
Agar M,iüller-Hinton,
sobre el medio con bacteriasse colocaron discos de papel filtros impregnados con
diferentesconcentracionesde
testigos con
los extractosdeprueba,
peniciiina-estreptomicina IO5
pg/mly
se incluyeron discos
consoluciónal10%de
dimetilsulfóxido (DMSO)
como
testigos
de
inhibición
y no
inhibici6n
del
crecimiento bacteriano respectivamente.
222513
Para conocer el efecto de los extractos sobre la proliferaci6n de Candida albicans
se preparó un cultivo de 24 horas en caldo sabouraud,
se sembr6 en placas'de
agar Sabouraud-dextrosay se colocaron Jos discos impregnados de A n t h 1OX y
con soluci6n de dimetilsulf6xido (DMSO) al 10% como testigo positivo y negativo
de actividad antifúngica respectivamente. Todas las placas se incubaron a 37°C
durante 24horas.
La actividad antimicrobiana fue medida por el halo de inhibicibn del desarrollo en
los cultivos.
ENSAYOS DE ACTlVlDA HEMATOPOYÉTICA
In Vitro DE LOS EXTRACTOS
DE Solanum torvum Sw.
Cada extracto
fue
centrifugado
a
sobrenadante, se filtr6
3000 rpm/l5
minutos,
conmembranamilipore
se recuperó el
0.22 pm y se guardóen
congelaci6n hastasu uso.
CULTIVO DE BAZO: S e sacrificó por dislocaci6n cervical un ratón macho de la
cepa CD1 de 8-12 semanas de edad,se extrajo el bazo, se obtuvo una suspenci6n
de cklulas con
3 ml de medio a- MEM un 15% de suero de caballo
después decuantificar las dlulas totales y determinar su
( a-15 ),
viabilidadconazul
tripan, se ajust6 la concentraci6n a 2 X I O 5 cels./mL S e depositó por duplicado
0.01 ml de la suspensión celular en pozos de cultivo que contenían
medio a-15 y 0.1 ml del extracto de prueba (hex&&,
0.8 mldel
clorofórmico, metanólicoo
acuoso a las concentraciones 0.4, 0.2, 0.1, 0.05 g/ml),
se prepararon testigos
acuoso y oleoso,todos
los cultivos se incubarona37"C/48
horas
y se
cuantificaron las células en cámaras de Newbauer por microscopio de luz. Cada
extracto fueensayado por duplicado tres
veces.
QBTESJCl6N DE MÉDULA6SEA: . S esacrifEó por dislocación cervical un rat6n
macho de la cepa CDI, se extrajo el fémur, se ajustó la concentración a 2x1O5
cel/mL, después de cuantificar las células totales y determinar su viabilidad con
azul tripan.S e deposit6 par duplicado 0.1
mt de la suspensidn celular enpozos de
cultivo que contenían 0.8ml del medio de Leibovitz
( L-I 5) y 0.1ml del extracto de
prueba (hexánico, clorofórmico, metanólico o acuoso a las concentraciones 0.4,
0.2, 0.1, 0.05g/ml ), se prepararon testigos acuosos y oleoso. Todos los cultivos
se incubarona
37OCn2horas y se cuantificaron las célulasencamarasde
Newbauer por microscopia de luz.
ACTIVIDAD BIOLOGICASIN VIVO
Con el extracto metanólico se prepararon diluciones con
0.04, 0.02,0.01, 0.005
g/ml en solución salina fisiológica,
las diluciones fueron suministradas por vía oral
a 5 sendos grupos de ratones machos de
11 a 13 semanas de edad, en una
relacidn 0.01 mI/g. de peso corporal, durante tres días consecutivos, al quinto día
se sangraron, sacrificaron y se realizaron las siguientes determinaciones:
Cuantificación de plaquetas:
Los ratones se sangraron por vena caudal,después de eliminar la primera gota de
sangre se llenolapipeta
deThomashasta
Amonio se llevó hasta la marca de
lamarca
0.5 y conOxalatode
101, se agitó por 3 minutos y después de
desechar las primeras cinco gotas se llenó las cámaras de Newbauer para la
cuantificación directade plaquetas al microscopiocon objetivos de40X.
CUENTA DIFERENCIAL:
Se deposit6 una gota de sangre de la venaacaudal sobre un portaobjeto, se hizo
un frotis y se tiAo con colorante de Wright, se- realiz6 la cuenta diferencial por
observación directa al microscopio con objetivo Ide
OOX.
Para lacuantificacióndeleucocitos,eritrocitos,hematocrito,hemoglobina
y
reticulocitos,se utilizó sangre heparinizada obtenida por punción cardiaca.
Parahematocrito: se absorbi6 la sangre porcapilaridadtapandounode
los
extremos del tubo capilar con plastilina, se centrifugó a 3000 rpm por 5 minutos y
se midió el paquete globular.
Parareticulocitos: En un criotubo se adicionó una gota del colorante azul de
cresilo brillante y una gota de sangre, se incubo a 37"C/15 minutos. Realizando
frotis para el conteo de eritrocitosy reticulocitos en diez
campos.
Parahemoglobina: se prepar6unacurvapatr6nconreactivasdeDrabkin
y
Cianometahemoglobina , adicionalmente se prepararon las disoluciones problema
porduplicadocon
4.98 ml dereactivodeDrabkin
y 0.02ml de sangre. Se
mezclaron perfectamente dejandolos a temperatura ambiente durante
5 minutos
para el desarrollo de la reacción, posteriormente
se ley6 la absorbanciaa.540nm.
Paraeritrocitos
y Leucocitos: se cuantificaronenelcontador
de partículas
COULTER Z1 , los eritrocitos se diluyeron 1:I
O00 y los leucocitos 1500 con la
disolucidn lsoton II.
8/
.
I
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I
OBTENC16N
DE EXTRACTOS A PARTIR DE LAS HOJAS DE Solanum tuwum Sw.
Reposopor 48 h.
I
Reposo por 48 h.
a temp. ambiente
a temp.ambiente
Recuperacidny
secado del
Concentracidnpor
evaporacidn hasta
sequedad
I
DISEÑO EXPERIMENTAL
evaporacidn hasta
Recuperacidn y
secado del
sedimento
evaporaci6n hasta
sequedad
I
I
PRUEBASDEACTIVIDADBIOL6GICA
"IN VIVO" E 3 VITRO"
"
Reposopor48h.
a temp. ambiente
J
evaporaci6n hasta
t
ESQUEMA DE INOCULACIóN DEL EXTRACTO
METAN~LICO
'
1
2
3
4
PANGRADO
5
días
LOTE I 0.4 g/mL
LOTE 5
LOTE 2
0.2 g1mL
LOTE 3
0.1 g/mL
LOTE 4
0.05 g/mL
SoluciónSalinaFisiológica
RESULTADOS
I
EFECTO DE LOS EXTRACTOS DE S. torvum SOBRE LA
PROLIFERACIóN DE MICROORGAN1SMOS
Escherichiacoli
Bacillus subtilis
Candida albicans
1
I
cn
a
I
3
I
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PL
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O
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0
W
L
W
O
.
r
O
I. EFECTO DE S. torvum SOBRE CÉLULASDE MÉDULA
ÓSEA
Acuoso
I
Metandico
Clorofórmico
Hexdnico
EXTRACTOS
T. Acuoso
S.
DEtowurn
T. Oleoso
Hoja3 Chart 1
RATONES TRATADOS CON EXTRACTO METANÓLICODE
Solanum torvum Sw.
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
O
0.1
i
0.4
SS
0.05
0.2
CONCENTRACIóN DEL EXTRACTO EN g/mL.
~-
PBgina 1
~.
RATONES TRATADOS CON EXTRACTO METANÓLICO DE
Solanum towum Sw
0.4
0.2
0.1
0.05
I
CONCENTRACIóN DEL EXTRACTOEN g/mL.
i
SS
RATONES TRATADOS CON EXTRACTO METANÓLICO DE
Solanum torvum3w.
t
I
I
i
0.4
0.2
o. 1
I
I
I
0.05
CONCENTRACIóN DEL EXTRACTO ENg/mL
SS
RATONES TRATADOS CON EXTRACTO METANÓLICO DE
Solanum towum Sw.
0.4
0.2
o. 1
0.05
CONCENTRACIóN DEL EXTRACTO EN g/mL
L
SS
RATONES TRATADOS CON EXTRACTO METANÓCICO DE
Solanum torvum Sw.
0.4
0.21
o. 1
0.05
CONCENTRACIóN DEL EXTRACTO EN g/mL.
SS
RATONES TRATADOS CON EXTRACTO METANÓLICO DE
Solanum torvum Sw.
20
16
12
8
4
O
0.4
0.2
o. 1
0.05
CONCENTRACIóN DEL EXTRACTO EN glmL.
SS
"
ps
Iv
6n
)Ir
m
d
Hoja7 Chart I
RATONES TRATADOS CON EXTRACTO-METANÓLICO DESolanum torvum
sw
M0.4
M0.2
00.1
00.05
MSS
Monocitos
Linfocitos
Basdfilos
Eosin6filos
N.banda
N.meta
N. Segmentados
DISCUSI~N
Enlaactividadantimicrobianade
los extractosdeSolanumtorvum
Sw. Sobre
Escherichia coli observamos que tanto el extracto metan6lico como el hexhico
presentaronhalosdeinhibici6nenrelaci6ndirectaconlaconcentraciones
probadas,mientrasque
el extractoacuosoúnicamentealaconcentraci6nde
0.08 g/ml y el extracto clorof6rmico no present6 ningún efecto inhibitorio, por su
parte el testigo positivo de inhibici6n ( mezcla penicilina/estreptomicina)presento
un halo de 16 a 17.5 mm de dihmetro y el testigo negativo ( DMSO al 10%) no
Bacillus subtiMs lapresent6
present6inhibicibn.Laactividadinhibitoriasobre
principalmente el extracto acuoso en las mas altas, seguido del extracto hexhnico
conlasdosprimerasconcentracionesyfinalmente
concentraci6nde
0.08 g/ml . Ningunode
el extractometan6licoala
los extractos
presentoactividad
antifúngica sobre Candida albicans .
Al probar la actividad de
Bazo
de
rat6n,
observamos
que
concentraci6nde
los extractos Solanum fowum en cultivo de &lulas de
los extractos
acuoso
metan6lico
y
a
la
0.4 g/mlpresentaronactividadinductoradelaproliferacidn
significativa(desviacibn
esthdar de 2.82X104 cel/ml ) mientrasquealas
concentraciones de0.2, 0.1 y 0.05 g/ml disminuyo tal efecto.
Por
otro
lado,
significativosobre
los extractos
clorof6rmico
hexsnico
y
presentaron
efectos
la inducci6ndelaproliferaci6n,
tal vezdebidoasupobre
solubilidad en los constituyentes del medio de cultivo.
Encultivodemedula&ea
los extractosprobadosnopresentaronefectos
significativos sobrela proliferaci6n celular.
"
-
"
"
"
-
En los ratones
tratados
con
extracto
metan6lico
se
indujo
un
incremento
significativo en eritrocitos
con
concentraci6n
la
de 0.4,
plaquetas
en
la
concentraci6n de 0.2 y 0.1 g/ml y leucocitos en 0.2 g/ml.
Porotrolado
los reticulocitos,hematocrito,concentracibn
cuenta diferencial no presentan variacibn significativo.
Nota: Las conclusionesse presentarhn durante la exposici6n.
de hemoglobina y
CONCLUSIONES
Los extractosacuoso,metanólico
y
hexánico.de Solanum torvum inhiben la
proliferación
de
Escherichia coli y
Bacillus subtilis
Ningunode
los extractos
inhibió
proliferación deCandida albicans
la
La
concentración
0.4 g/ml
de
los
extractos
acuoso
y
metanólico
estimuló
plenamente
la
proliferación
in vitro
de células de bazo
222513
CONCLUSIONES
EXTRACTO METANÓLICO
Bajo
las
condiciones
de
experimentación
0.4 g/mL
únicamente
la
concentración
de
provoco
un
aumento
significativo
en
la
concentración
eritrocitos,
de
sin
originar
de
hematocrito,
cambios en los valores
hemoglobina y reticulocitos.
Ninguna de lasconcentracionesensayadas
modificósignificativamentelaconcentración
absoluta y relativa de leucocitos.
Las
concentraciones
de
0.2 y 0.1 g/mL
indujeron aumento significativo enla cuenta de
plaquetas.
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