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Revista científica trimestral del Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal ISSN (impreso): 1562-3009 ISSN (digital): 1818-1686 VOL UMEN 16 VOLUMEN NÚMERO 2 MA YO-A GOSTO 2012 -AGOSTO MAY COMITÉ EDITORIAL PRESIDENTE Dr. Luis Pérez Vicente MIEMBROS Dra. Elina Massó Villalón Dra. María Elena Márquez Gutiérrez Dra. Gloria González Arias Dr. Emilio Fernández Gonzálvez Dr. Luis Vázquez Moreno Lic. Arquímedes Bécquer Portuondo Lic. Santiago Jiménez Jiménez M.Sc. Ricardo García Castillo Ing. Ana Ibis Elizondo Silva Ing. Mercedes Sáenz Díaz EDICIÓN Y CORRECCIÓN Lic. Fermín Romero Alfau Lic. Gladys Armas Sánchez IMPRESIÓN Téc. Román Lazo Rabaza Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, Cuba VOL UMEN 16 VOLUMEN NÚMERO 2 JUNT A DE ARBITRAJE JUNTA MA YO-A GOSTO 2012 MAY -AGOSTO Árbitros externos Dr. Armando Aguilera Castro Dra. Lérida Almaguel Rojas Dr. Orlando Borrás Hidalgo Dr. Alejandro Barro Cañamaro Dra. Ileana Fernández García Dra. Orietta Fernández-Larrea Dra. Hortensia Gandarilla Basterrechea Lic. Armando García Suárez Dra. Gilda Guerra Rivera Dr. Carlos González Muñoz Dr. Horacio Grillo Ravelo Dra. Mayra Heydrich Pérez Dra. Annia Hernández Rodríguez Dr. Lidcay Herrera Isla Dr. Leopoldo Hidalgo Díaz Dr. Benedicto Martínez Coca Dr. Jesús Mena Campos Dr. Julio Mena Portales Dra. Ileana Miranda Cabrera Dr. René Novo Sordo Dra. Nilda Pérez Consuegra Dr. Elio del Pozo Núñez Dr. Miguel Ramos Leal Dr. Héctor Rodríguez Morell Dra. Mayra Rodríguez Hernández Centro de Investigaciones Químicas, Cuba Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, Cuba Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, Cuba Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba Instituto de Ecología y Sistemática, Cuba Consultora, Cuba Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal, Cuba Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal, Cuba Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba Universidad Agraria de La Habana, Cuba Universidad Central Marta Abreu, Villa Clara, Cuba Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba Universidad Central Marta Abreu, Villa Clara, Cuba Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Cuba Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Cuba Centro de Ingeniería y Biotecnología La Habana, Cuba Instituto de Ecología y Sistemática, Cuba Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Cuba Universidad Agraria de La Habana, Cuba Universidad Agraria de La Habana, Cuba Universidad Agraria de La Habana, Cuba Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Cuba Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Cuba Árbitros internos Dr. Luis Pérez Vicente M.Sc. Ángela Porras González Dra. Marusia Stefanova Nalimova Dr. Luis Vázquez Moreno Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, Cuba Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, Cuba Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, Cuba Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, Cuba Árbitros internacionales Dra. Edith Estrada Venegas Dr. Benoit Farinas Dr. Mauricio Guzmán Quesada Dr. Aristóteles Pires de Matos Dr. Guillermo Mondragón Pedrero Dr. Miguel Nájera Rincón Dr. Renato de Oliveira Resende Dr. Abelino Pitty Cano Dr. Benito Reséndiz García Dr. Dorian Rodríguez Dr. Eduardo Salazar Solís Dr. Alexandre Specht Dra. Mariana M. Viscarret Dr. Elliot Watanabe Kitajima Dra. María de Jesús Yáñez Morales Colegio de Posgraduados. Instituto de Fitosanidad, México UMR AGAP CIRAD, Guadalupe Corporación Bananera Nacional de Costa Rica Empresa Brasileña de Investigación Agropecuaria, Brasil Universidad Autónoma de Chapingo, México Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias, México Departamento de Biología Celular, Universidad de Brasilia, Brasil Escuela Agrícola Panamericana El Zamorano, Honduras Universidad Autónoma de Chapingo, México Universidad Centro Occidental Lisandro Alvarado, Venezuela Universidad Guanajuato, México Empresa Brasileña de Pesquisa Agropecuaria (EMBRAPA), Brasil Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola (INTA), Argentina Escuela Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidad de Sao Paulo, Brasil Colegio de Postgraduados Campus Montecillo, México Contenido Diagnóstico fitosanitario Hospedantes alternativos de Phakopsora pachyrhizi en campos de soya (Glycine max) de la provincia de Ciego de Ávila, Cuba Yasmiany Santana Torres, Einar Martínez de la Parte, Luis Pérez Vicente, Elio Rodríguez Bustamante y Roxany Sánchez Marín 69 Ecología Fluctuación poblacional de Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae), vector de la leprosis de los cítricos en Tabasco, México Prisciliano Méndez Méndez, Saúl Sánchez Soto, Jesús Romero Nápoles y Carlos Fredy Ortiz García 73 Afectaciones causadas por Colletotrichum gloeosporioides en genotipos de Dioscorea alata en el municipio de Santo Domingo, Cuba Yuniel Rodríguez García, Dariel Cabrera Mederos, Maryluz Folgueras Montiel y Lilián Marisol Morales Romero 79 Epidemiología Escala logarítmica diagramática de severidad de la antracnosis (Colletotrichum gloeosporioides) en papaya (Carica papaya) Manuel Jesús Zavala León y Jairo Cristóbal Alejo 83 Comunicación corta Registro de plagas de albahaca blanca (Ocimum basilicum) bajo condiciones de cultivo protegido Blanca Bernal Areces, Rafael Deroncelé Caigñet y Tomás Díaz Pérez 87 Identificación de aislados de Bacillus spp. mediante cromatografía gaseosa de los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) Yamilé Baró Robaina, Marcia M. Parma, Itamar Soares de Melo y Deise M. Fontana Capalbo 91 Primera detección en Cuba de Hemicriconemoides mangiferae Hortensia Gandarilla Basterrechea y Orlando Rivas Bofill 95 Diversidad de nematodos del suelo en una selva tropical mexicana Horacio Salomón Ballina Gómez, Esther Herrera Canto, Cindi Kantun Pat, José Tun Suárez y Esau Ruiz Sánchez 97 Reseña RNA-seq: herramienta transcriptómica útil para el estudio de interacciones planta-patógeno Johana Carolina Soto Sedano y Camilo Ernesto López Carrascal 101 Contents Phytosanitary diagnosis Alternative Hosts of Phakopsora pachyrhizi in Soybeans Fields (Glycine max) of Ciego de Ávila Province, Cuba Yasmiany Santana Torres, Einar Martínez de la Parte, Luis Pérez Vicente, Elio Rodríguez Bustamante and Roxany Sánchez Marín 69 Ecology Population Fluctuation of Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae), Vector of Citrus Leprosis in Tabasco, México Prisciliano Méndez Méndez, Saúl Sánchez Soto, Jesús Romero Nápoles and Carlos Fredy Ortiz García Damages Caused by Colletotrichum gloeosporioides in Genotypes of Dioscorea alata in Santo Domingo Municipality, Cuba Yuniel Rodríguez García, Dariel Cabrera Mederos, Maryluz Folgueras Montiel and Lilián Marisol Morales Romero 73 79 Epidemiology Diagrammatic Logarithmic Scale of Severity for Anthracnose (Colletotrichum gloeosporioides) in Papaya Fruit (Carica papaya) Manuel Jesús Zavala León and Jairo Cristóbal Alejo 83 Short communication Pests and Diseases that Affect White Basil (Ocimum basilicum) Growing under Protected Conditions Blanca Bernal Areces, Rafael Deroncelé Caigñet and Tomás Díaz Pérez 87 Identification of Bacillus spp. Isolates by Gas Chromatographic of Fatty Acids Methyl Esters (FAME) Analysis Yamilé Baró Robaina, Marcia M. Parma, Itamar Soares de Melo and Deise M. Fontana Capalbo 91 First Detection of Hemicriconemoides mangiferae in Cuba Hortensia Gandarilla Basterrechea and Orlando Rivas Bofill 95 Soil Nematodos Diversity in a Mexican Tropical Forest Horacio Salomón Ballina Gómez, Esther Herrera Canto, Cindi Kantun Pat, José Tun Suárez and Esau Ruiz Sánchez 97 Review RNA-seq as a Transcriptome Useful Tool for the Studies of Plant Pathogen Interactions Johana Carolina Soto Sedano and Camilo Ernesto López Carrascal 101 Diagnóstico fitosanitario Fitosanidad 16(2) agosto (2012) 69-72 Hospedantes alternativos de Phakopsora pachyrhizi en campos de soya (Glycine max) de la provincia de Ciego de Ávila, Cuba Yasmiany Santana Torres,1 Einar Martínez de la Parte,2 Luis Pérez Vicente,3 Elio Rodríguez Bustamante1 y Roxany Sánchez Marín1 Laboratorio Provincial Sanidad Vegetal Ciego de Ávila. Carretera Central, Extremo Oeste, Ciego de Ávila, Cuba 2 Centro Nacional de Sanidad Vegetal. Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal. Ayuntamiento 231 e/ San Pedro y Lombillo, Plaza de la Revolución, La Habana micologí[email protected] 3 Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, La Habana, C.P. 11600 [email protected] 1 RESUMEN ABSTRACT La presencia de la roya asiática de la soya causada por Phakopsora pachyrhizi, fue informada en Cuba en 2009. Se ha encontrado posteriormente en plantaciones de soya o habichuela en municipios de las provincias de Matanzas, Villa Clara, Cienfuegos y Ciego de Ávila. Internacionalmente se han informado diferentes especies de leguminosas silvestres como hospederos alternativos de P. pachyrhizi, pero en Cuba no se habían identificado hasta el presente estos hospederos silvestres del patógeno. En enero de 2011 se desarrolló un brote de la enfermedad en el municipio de Venezuela en Ciego de Ávila, y se encontraron síntomas de roya con uredosoros y uredosporas tipo Malupa, cuyas características morfológicas se corresponden con las descritas para P. pachyrhizi en Desmodium sp. (amor seco) subfamilia Faboideae; Cassia occidentalis L. (yerba hedionda) subfamilia Cesalpinioideae y Macroptilium lathyroides (L.) Urb. (maribú) familia Fabaceae. Se analizaron muestras de plantas afectadas de las tres especies con el empleo de tiras inmunocromatográficas con un anticuerpo específico contra P. pachyrhizi y se obtuvo una reacción positiva en todos los casos. Estas malezas constituyen hospederos alternativos de P. pachyrhizi en Cuba, pueden mantener la enfermedad en los períodos intercosechas de soya en el campo y constituir las fuentes de inóculo en ciclos sucesivos de la enfermedad. Este trabajo constituye el primer informe de la presencia en Cuba de malezas leguminosas hospedantes alternativos de la roya asiática de la soya. Soybean rust, caused by Phakopsora pachyrhizi was reported in Cuba in 2009. Since then, it has been found affecting soybean fields in municipalities of Matanzas, Villa Clara, Cienfuegos and Ciego de Ávila provinces. Wild leguminous species have been reported internationally as alternative hosts of this rust, but these hosts had not been so far identified in Cuba. During a new outbreak of the disease occurred in Venezuela municipality in Ciego de Avila in January 2011, rust symptoms containing anamorphic sori and uredospores (Malupa-type) with morphological characteristics matching with those described for P. pachyrhizi, were found on Desmodium sp. (clover) subfamily Faboideae; Cassia occidentalis L. (coffee senna) subfamily Cesalpinioideae and Macroptilium lathyroides (L.) Urb. (wild bushbean) family Fabaceae. Positive reactions were obtained when samples of these three species affected plants were analyzed with inmunocromatographic strips with a specific antibody against P. pachyrhizi. These plants are alternative hosts of P. pachyrhizi in Cuba and can maintain the disease under favorable conditions between soybean cropping seasons, and could serve as potential inoculum sources for successive diseases cycles. This is the first report of alternative host in Cuba for Asian soybean rust. Key words: Phakopsora pachyrhizi, alternative hosts, Glycine max Palabras claves: Phakopsora pachyrhizi, huéspedes alternativos, Glycine max INTRODUCCIÓN La roya de la soya es causada por dos especies de hongos, Phakopsora pachyrhizi Syd. & P. Syd. y P. meibomiae (Arthur) Arthur [Ono et al., 1992], conocidos como las royas asiática y americana de la soya, respectivamente. La roya asiática se encuentra entre las diez enfermedades de mayor riesgo para la sostenibilidad alimentaria a nivel mundial [Pennisis, 2010], y está considerada como la enfermedad más devastadora que afecta a la soya [Rodríguez et al., 2009]. Ha sido asociada a importantes pérdidas de rendimiento, variables entre el 10 y el 70 % en función de la etapa del ciclo del cultivo en que se presenta la enfermedad, las condicio- Recibido: 9/5/2011 Aceptado: 5/11/2011 69 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Santana et al. nes climáticas imperantes y la eficacia de las medidas de manejo implementadas a nivel de campo [CABI, 2007]. En Asia las pérdidas informadas oscilan entre el 15 y el 70 % [CABI, 2007], en Sudáfrica entre el 31 y el 60,9 % [Jarvie, 2009] y en Brasil entre el 30 y el 75 % [Maciel et al., 2010]. Como otras especies de royas, P. pachyrhirizi es un patógeno obligado biotrófico, y los ciclos infecciosos en campos de soya se inician a partir del inóculo del hongo que persiste entre cosechas en hospedantes leguminosas vivas silvestres [Gevens et al., 2008], o es transportado a grandes distancias desde focos en campos de soya y otros hospedantes desde otras regiones [Krupa et al., 2006]. P. pachyrhizi y P. meibomiae son capaces de infectar a un amplio rango de especies de plantas. P. pachyrhizi puede infectar naturalmente plantas de 31 especies de leguminosas pertenecientes a 17 géneros [Sinclair y Hartman, 1996; CABI, 2007], mientras que P. meibomiae puede infectar plantas de 42 especies de leguminosas correspondientes a 19 géneros, y además, 24 especies de plantas en 19 géneros son hospedantes para ambos patógenos [Frederick et al., 2002]. Los principales hospedantes naturales de P. pachyrhizi son Glycine max (L.) Merrill (soya), G. soja Siebold & Zucc. (soya silvestre), Pachyrhizus erosus (L.) Urban., Pueraria montana var. lobata (Willd.) Maesen & Almeida (kudzú) y Vigna unguiculata (L.) Walp (habichuela), mientras que para P. meibomiae los principales hospedantes naturales son Aeschynomene americana L., Canavalia villosa Benth., Crotalaria anagyroides Kunth, G. max, Lablab purpureus (L.) Sweet, Phaseolus lunatus L. y P. vulgaris L. [CABI, 2007]. La relevancia de las numerosas posibilidades de hospedantes que presentan estos patógenos es que pueden servir como reservorio de inóculo de un ciclo de cultivo al siguiente [Jarvie, 2009]. La presencia de P. pachyrhizi en Cuba fue informada en 2009 [Pérez et al., 2010]. Desde entonces, y como parte del programa de vigilancia fitosanitaria para este patógeno, el Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal ha confirmado su presencia en cuatro oportunidades al afectar plantaciones de soya en los municipios de Venezuela en Ciego de Ávila, Santo Domingo en Villa Clara, Jovellanos en Matanzas y de habichuela en Cienfuegos; sin embargo, en Cuba todavía se desconocen las malezas que le pueden servir como hospedantes secundarios a este patógeno. El objetivo del presente trabajo fue la búsqueda de hospedantes naturalmente 70 infectados, entre las leguminosas silvestres presentes como malezas en los campos de soya en la provincia de Ciego de Ávila. MATERIALES Y MÉTODOS Durante un brote de P. pachyrhizi en campos de soya de la empresa Cubasoy, ocurrido a finales de 2010, se realizaron muestreos en el municipio de Venezuela, provincia de Ciego de Ávila, donde existían informes previos de brotes de P. pachyrhizi. Se colectaron leguminosas silvestres, presentes como malezas, con síntomas de roya. Las especies de malezas fueron identificadas según los criterios taxonómicos de Acuña (1974) y Rodríguez et al. (1988), y por comparación con material de referencia presente en el Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal de Ciego de Ávila. Las muestras con síntomas de roya fueron trasladadas al Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal para la determinación de la especie de roya presente. A partir de ellas se realizaron preparaciones fijas, las cuales fueron observadas bajo el microscopio óptico (Axioskop 40, Carl Zeiss a 40X). Los especímenes de roya presentes en las diferentes especies de malezas se caracterizaron morfológicamente y se identificaron de acuerdo con los criterios de Cummings (1959) y los de Anahosur y Waller (1978). Producto de la similitud morfológica entre ambas especies de Phakopsora, para la confirmación de la presencia de P. pachyrhizi se utilizaron tiras inmunocromatográficas con un anticuerpo específico contra esta especie (QuickStix, EnviroLogix, Portland, Estados Unidos), y se utilizó el protocolo descrito en el kit diagnóstico. La especificidad de este kit fue previamente comprobada en los ensayos realizados para la determinación de la presencia por primera vez para Cuba de P. pachyrhizi [Pérez et al., 2010], en los cuales las muestras fueron analizadas en paralelo con las tiras inmunocromatográficas de este kit y mediante real-time PCR según el protocolo descrito por Frederick et al. (2002). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se encontraron síntomas de roya en Desmodium sp. (amor seco) familia Papilionaceae (Fig. 1); Cassia occidentalis L. (yerba hedionda) familia Caesalpinia, y Macroptilium lathyroides (L.) Urb. (maribú) familia Fabaceae. Las hojas en todos los casos contenían Fitosanidad 16(2) agosto (2012) uredosoros tipo Malupa, anfígenos, pulverulentos, diminutos, con paráfisis clavadas 25-45 μm, engrosadas en su ápice hasta 18 μm y uredosporas sésiles, obovoides a elipsoidales, (25-35 x 17-22,5 μm), densamente equinuladas, pálidas a pardo amarillentas (Figs. 2 A y B). Estas características coinciden con las descritas para Phakopsora sp. [Cummings, 1959; Anahosur y Waller, 1978]. Figura 1. Síntomas de P. pachyrhizi en Desmodium sp. presentes en campos de soya de la provincia de Ciego de Ávila. Figura 2. Paráfisis (A) y uredosporas (B) de P. pachyrhizi. Bar = 30 μm. Las muestras de las tres especies de plantas afectadas, al ser analizadas con las tiras inmunocromatográficas del kit QuickStix, dieron reacción positiva en todos los casos, por lo que se confirmó la presencia en ellas de P. pachyrhizi. Este trabajo constituye el primer informe de la presencia en Cuba de malezas leguminosas silvestres, hospedantes alternativos de la roya asiática de la soya. Estas leguminosas pueden mantener la enfermedad bajo condiciones favorables, y garantizar su supervivencia en los períodos cuando no hay soya en producción, y constituir las fuentes de inóculo potencial en ciclos sucesivos de la enfermedad. Se requiere en el futuro continuar la identificación de nuevas especies de malezas que sirvan de hospedantes alternativos para esta roya, y estudiar el comportamiento estacional de estas malezas en los campos para determinar su importancia epidemiológica como fuentes de inóculo del patógeno. CONCLUSIONES • Se confirmó la presencia de P. pachyrhizi en Desmodium sp., Cassia occidentalis y Macroptilium lathyroides, lo que constituye el primer informe de la presencia en Cuba de malezas leguminosas silvestres hospedantes alternativos de la roya asiática de la soya. • El monitoreo de la presencia de P. pachyrhizi en estas especies de malezas debe ser tenido en cuenta en los programas de manejo de la enfermedad. 71 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Santana et al. REFERENCIAS Acuña, J.: Plantas indeseables de los cultivos cubanos, Instituto de Investigaciones Tropicales. Academia de Ciencias, La Habana, 1974. Anahosur, K. H.; J. M. Waller: «Phakopsora pachyrhizi. Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria» Set 59, No. 589. Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane, Kew, Surrev, Inglaterra, 1978. CABI: Crop Protection Compendium. Wallingford, Inglaterra, 2007. Cummings, G. B.: Illustrated Genera of Rust Fungi, Burguess Publishing Company, Minneapolis, Minnesota, EE. UU., 1959. Frederick, R. D.; C. Snyder; G. L. Peterson; M. R. Bonde: «Polymerase Chain Reaction Assays for the Detection and Discrimination of the Soybean Rust Pathogens Phakopsora pachyrhizi and P. meibomiae», Phytopathology 92: 217-227, EE. UU., 2002. Gevens, A. J.; N. Nequi; A. Vitoreli; J. J. Marois; D. L. Wright; C. L. Harmon; P. F. Harmon: «First Report of Soybean Rust Caused by Phakopsora pachyrhizi on Erythrina herbacea (Coral Bean)», Plant Disease 92: 1472, EE. UU., 2008. Jarvie, J. A: «A Review of Soybean Rust from a South African Perspective», South African Journal of Science 105: 103-108, República de Sudáfrica, 2009. Krupa, S.; V. Bowersox; R. Claybrooke; C. W. Barnes; L. Szabo; K . Harlin; J. Kurle: «Introduction of Asian soybean Rust 72 Urediniospores into the Midwestern United States-a Case Study», Plant Disease 90: 1254-1259, EE. UU., 2006. Maciel, T. E. F.; M. C. Menezes; A. M. R. de Almeida; L. O. de Oliveira: «Molecular Characterization of Beta-Tubulin from Phakopsora pachyrhizi, the Causal Agent of Asian Soybean Rust», Genetics and Molecular Biology 33 (2): 354-358, Brasil, 2010. Ono, Y.; P. Buritica; J. F. Hennen: «Delimitation of Phakopsora, Physopella, and Cerotelium and Their Species on Leguminosae», Mycological Research 96: 825-850, EE. UU.,1992. Pennisis, E: «Armed and Dangerous», Science 327: 804-805, EE. UU., 2010. Pérez, L.; E. Martínez; M. Pérez; E. L. Martín; O. Borrás; I. Hernández: «First Report of Asian Rust of Soybean Caused by Phakopsora pachyrhizi in Cuba», Plant Pathology 59: 804, Inglaterra, 2010. Rodríguez, F. A.; H. S. S. Duarte; G. P. Domiciano; C. A. Souza; G. H. Korndörfer; L. Zambolim: «Foliar Application of Potassium Silicate Reduces the Intensity of Soybean Rust», Australasian Plant Pathology 38: 366-372, Australia, 2009. Rodríguez, S.; J. I. Rodríguez; L. Pérez: Plantas indeseables en el cultivo de la caña de azúcar, Ed. Científico-Técnica, La Habana, 1988. Sinclair, J. B.; G. L. Hartman (Edts.): Proceedings of the Soybean Rust Workshop, National Soybean Research Laboratory, J. B. Sinclair& G. L. Hartman (Edts.) Publication No. 1, EE. UU., 1996. Ecología Fitosanidad 16(2) agosto (2012) 73-77 Fluctuación poblacional de Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae), vector de la leprosis de los cítricos en Tabasco, México Prisciliano Méndez Méndez,1 Saúl Sánchez Soto,1 Jesús Romero Nápoles2 y Carlos Fredy Ortiz García1 Colegio de Postgraduados, Campus Tabasco. A.P. 24, 86500, H. Cárdenas, Tabasco, México, [email protected] 2 Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo. Km 36.5, carretera a México-Texcoco, 56230, Montecillo, Texcoco, México 1 RESUMEN ABSTRACT La leprosis de los cítricos se detectó en el estado de Tabasco, México en 2006. El objetivo de este trabajo fue determinar la fluctuación poblacional del ácaro vector de esta enfermedad, Brevipalpus phoenicis (Geijskes). De octubre de 2009 a septiembre de 2010 se realizaron muestreos quincenales de hojas en una plantación de 1 ha de naranja Valencia (Citrus sinensis L. Osbeck) en la zona citrícola de Tabasco (17°42'00" Norte, 93°28'26" Oeste). El ácaro se presentó durante los doce meses considerados con mayor densidad de población en octubre y noviembre de 2009 y de abril a septiembre de 2010. La población presentó un descenso bien marcado que inició en noviembre de 2009 y finalizó en enero de 2010, el cual coincidió con la disminución de la temperatura y un aumento de la precipitación; asimismo, presentó un incremento bien notable de febrero a abril que concordó con el aumento de la temperatura y la escasez de lluvias. De mayo a septiembre la fluctuación poblacional no varió notablemente, al igual que la temperatura; sin embargo, en este período la precipitación aumentó marcadamente, cuando se presentaron los niveles más elevados. El análisis de Pearson indicó una correlación alta de la fluctuación poblacional con la temperatura (r = 0,7878, P = 0,0023) y una correlación muy baja con la precipitación (r = 0,1339, P = 0,6781). Se deduce que la fluctuación poblacional de B. phoenicis en la zona de estudio depende más de los cambios de la temperatura que de la precipitación. Citrus leprosis was detected in the State of Tabasco, Mexico in 2006. The aim of this study was to determine the mite population fluctuation, vector of this disease, Brevipalpus phoenicis (Geijskes). Leaves were sampled biweekly from October 2009 to September 2010 in a plantation of 1 ha planted with Valencia orange (Citrus sinensis L. Osbeck) in the citric area of Tabasco (17°42’00"North, 93°28’26" West). Mite was present during the 12 considered months, with the highest population density in October and November 2009, and from April to September 2010. Population presented a well marked descent that began in November 2009 and finalized in January 2010, which coincided with the temperature decrease and the precipitation increase; likewise, it presented a well marked increase from February to April that matched the temperature increase and rainfall scarcity. From May to September population fluctuation did not varied considerably as same as temperature. However, in this period precipitation increased markedly showing the highest levels. Pearson analysis indicated a high correlation of population fluctuation with temperature (r = 0.7878, P = 0. 0023) and a very low correlation with rainfall (r = 0.1339, P = 0 6781). It infers that population fluctuation of B. phoenicis in the study area depends more on temperature than precipitation changes. Key words: Citrus sinensis, leprosis, Brevipalpus phoenicis Palabras claves: Citrus sinensis, leprosis, Brevipalpus phoenicis INTRODUCCIÓN La leprosis de los cítricos es una enfermedad viral transmitida por ácaros del género Brevipalpus, la cual afecta de forma severa hojas, ramas y frutos de naranja [Citrus sinensis (L.) Osbeck], y reduce la producción y el valor comercial del cultivo, con pérdidas económicas que pueden ascender a varios millones de dólares al año y provocar la muerte de plantas cuando no se toman medidas de control del ácaro vector [Rodríguez, 2000; Goes et al., 2002; Bastianel et al., 2010]. Por ejemplo, en Brasil, principal país productor de cítricos en el mundo, la enfermedad causa pérdidas anuales de 60 millones de dólares, y el costo de control del vector Recibido: 6/3/2012 Aceptado: 27/7/2012 73 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Méndez et al. Brevipalpus phoenicis (Geijskes), mediante productos acaricidas, se estima en alrededor de 75 millones de dólares al año [Rodrigues, 2000; Bastianel et al., 2006]. La leprosis de los cítricos se detectó por primera vez en México en 2004, en ocho municipios del sur del estado de Chiapas. En el estado de Tabasco se detectó en 2006 en algunas plantas de naranja del municipio de Huimanguillo, donde fue erradicada oportunamente; sin embargo, la aparición de varios brotes en 2007 en toda la zona citrícola de este municipio condujeron a declarar a dicho estado bajo cuarentena [Robles, 2010]. Se conocen diez especies de ácaros del género Brevipalpus Donnadieu asociadas a plantas de cítricos en el mundo, de las cuales tres, B. californicus (Banks), B. obovatus Donnadieu y B. phoenicis (Geijskes) se citan como vectores de la leprosis de los cítricos, pero solamente B. phoenicis ha probado ser un vector eficaz [Childers et al., 2001; Mesa et al., 2009]. Esta última especie es la que transmite la leprosis de los cítricos en el estado de Tabasco [Izquierdo et al., 2011], donde se cultivan 8172 ha de naranja [SIAP, 2012], y donde las acciones en contra de esta enfermedad estuvieron orientadas hacia su erradicación para evitar su propagación y proteger la superficie nacional sembrada con este frutal, que abarca alrededor de 334 000 ha [Estrada, 2010]. El control de B. phoenicis es fundamental para el manejo de la leprosis de los cítricos [Goes et al., 2002], por lo cual es importante contar con información básica acerca de la biología y ecología de este ácaro con el fin de implementar medidas racionales para su control [Oliveira, 1986; Kennedy et al., 1996; Solano et al., 2008; Childers y Rodríguez, 2011]. Debido a que en el estado de Tabasco la presencia de esta enfermedad es relativamente reciente y no se cuenta con información local para su manejo, se consideró relevante determinar la fluctuación poblacional del vector B. phoenicis en el cultivo de naranja durante las diferentes épocas del año y la relación que tiene con la temperatura y precipitación en esta zona de México. MATERIALES Y MÉTODOS El trabajo se realizó en una plantación de naranja Valencia de 1 ha constituida por 238 plantas en producción con cinco años de edad, distribuidas en marco real de 6 m x 7 m, la cual se localiza en la ranchería Tierra Nueva 3.ª Sección del municipio de Huimanguillo, Tabasco, dentro de las coordenadas 17°42'00" Norte y 93°28'26" Oeste, a una altura de 40 msnm. El clima en 74 esta zona es cálido húmedo con lluvias en verano; la temperatura media anual es de 26,1 oC y la precipitación acumulada es de 2,2 mm al año [Toledo y Etchevers, 1988]. El suelo es franco arcilloso-arenoso en los dos primeros horizontes y arcilloso en los horizontes más profundos, con pH moderadamente ácido [Zetina et al., 2002]. Se realizaron 27 muestreos quincenales del 13 de octubre de 2009 al 29 de septiembre de 2010. Para ello se seleccionaron al azar 35 árboles de naranja, los cuales se marcaron con pintura vinílica roja. De acuerdo con la información sobre la distribución espacial de B. phoenicis en plantas de naranja Valencia [Solano et al., 2008], la parte media de la copa de cada árbol se dividió en cuatro cuadrantes (norte, sur, este y oeste), y se recolectaron al azar cuatro hojas por cuadrante, para un total de 16 hojas por árbol en cada fecha de muestreo y un total de 15 120 hojas durante los doce meses estudiados. Las hojas se colocaron en bolsas de polietileno de 30 cm x 25 cm, y se depositaron en una hielera para su transporte al laboratorio, donde se guardaron en un refrigerador. Al siguiente día se analizaron y se contabilizaron los ácaros en estado de larva, ninfa y adulto, con ayuda de un microscopio estereoscópico. Muestras de ácaros se enviaron al doctor Gabriel Otero Colina, del Programa de Entomología y Acarología del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, municipio de Texcoco, estado de México, quien identificó a la especie como B. phoenicis. Los datos de temperatura y precipitación se tomaron de la estación meteorológica del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, localizada en la misma zona fisiográfica donde se ubica dicha plantación. Para realizar el análisis de correlación de Pearson entre la fluctuación poblacional de B. phoenicis con los datos de temperatura y precipitación se utilizó el paquete estadístico SAS (2002). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se colectaron 4911 individuos de B. phoenicis con un promedio de 0,33 ácaros por hoja y 5,3 ácaros por planta. Con respecto a este último dato, Czermainski et al. (2007) registran 6,9 individuos de B. phoenicis por planta en naranja Valencia en Brasil, donde esta especie se presenta todo el año en el cultivo, aunque su densidad poblacional se considera normalmente baja [Anónimo, 2005]. Fitosanidad 16(2) agosto (2012) B. phoenicis se presentó durante los doce meses en la plantación de estudio y fue más abundante en octubre y noviembre de 2009 y de abril a septiembre de 2010, meses en los cuales el promedio de ácaros varió entre 200 y 218; la densidad poblacional más baja se registró de diciembre a marzo, con promedios de 92 a 154 individuos (Fig. A). Fluctuación poblacional de B. phoenicis (A), temperatura promedio en °C (B) y precipitación acumulada en mm (C), de octubre de 2009 a septiembre de 2010 en Huimanguillo, Tabasco, México. 75 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Méndez et al. La comparación gráfica de la fluctuación poblacional de B. phoenicis con la fluctuación de los factores climáticos en la zona estudiada (Figs. A-C) revela una similitud entre la fluctuación poblacional del ácaro (Fig. A) con la fluctuación de la temperatura, la cual presentó valores promedios desde 20 hasta 30 °C (Fig. B). El valor del coeficiente de correlación de Pearson entre la fluctuación poblacional de B. phoenicis y la temperatura fue r = 0,7878 (P = 0,0023) y, de acuerdo con Bisquerra (2004), indica una correlación alta. Según Solano et al. (2008), temperaturas entre 24 y 33 °C favorecen el desarrollo poblacional de B. phoenicis, lo que concuerda con el presente trabajo, donde la mayor densidad de población se registró a temperaturas de 26 a 30 °C; contrariamente, la menor densidad poblacional coincidió con la temperatura más baja registrada en enero (Figs. A, B). El descenso de la temperatura afecta la biología de B. phoenicis prolonga su ciclo de vida y ocasiona que las hembras coloquen menor cantidad de huevos [Anónimo, 2004]. En otras regiones citrícolas se considera que la temperatura tiene poca influencia sobre la población de este ácaro, y que su fluctuación depende más de la fenología de las plantas y del tipo de tejido disponible por épocas a lo largo del año [Czermainski et al., 2007]. Con respecto a la precipitación, el análisis de correlación de Person presentó un coeficiente r = 0,13397 (P = 0,6781) que indica una correlación muy baja [Bisquerra, 2004]. Estudios al respecto en otras regiones han demostrado que la fluctuación poblacional de B. phoenicis es inversamente proporcional a la precipitación, ya que este factor climático afecta el desarrollo poblacional de la especie, la que es más abundante en el período más seco del año [Oliveira,1986; Chiavegato y Kharfan, 1993; Solano et al., 2008], cuando las plantas están sometidas a períodos de estrés hídrico [Anónimo, 2005]. La comparación gráfica de la fluctuación poblacional del ácaro con la de este factor climático (Figs. A, C) muestra que B. phoenicis incrementó su población entre febrero y mayo, período en el cual las precipitaciones fueron escasas; no obstante, al aumentar las lluvias a partir de junio hasta alcanzar su máximo nivel en agosto, se observa que la población no decayó, sino que presentó un ligero aumento en coincidencia con altas temperaturas (Fig. B). El descenso drástico de su población solo se registró de noviembre a enero en concordancia con el descenso de la temperatura y con un aumento de las precipitaciones, a pesar de que estas últimas no fueron tan intensas como las de julio a septiembre (Figs. A, C). 76 Lo anterior sugiere que de los dos factores climáticos considerados, la temperatura tuvo mayor influencia en la fluctuación poblacional de B. phoenicis en la zona estudiada, y aunque sus valores fluctuaron en un rango aproximado de 10 °C (Fig. B), demuestran que los cambios, aunque aparentemente mínimos comparados con los de la precipitación, influyen significativamente en el desarrollo poblacional de la especie. De acuerdo con Kennedy et al. (1996), el ciclo de vida completo de B. phoenicis criado en hojas de té a 26 °C es de 41,68 ± 5,92 días, y el tiempo de generación es de 27,6 días. En consideración a lo anterior, es probable que este ácaro presente cerca de 13 generaciones al año en la zona citrícola de Huimanguillo, cuya temperatura media anual es de 26,1 °C [Toledo y Etchevers, 1988]. Los resultados de este trabajo constituyen un aspecto básico que puede ser útil para el combate de esta plaga en la región citrícola del estado de Tabasco, donde es necesario realizar más estudios con el fin de establecer un programa de su manejo integrado. El conocimiento de la densidad poblacional de B. phoenicis es el principal indicador para la toma de decisión de medidas de control de la leprosis de los cítricos [Czermainski et al., 2007]. En este contexto, las recomendaciones para el muestreo de este ácaro en plantaciones de naranja en Brasil indican que en el período de mayor crecimiento poblacional los muestreos deben intensificarse con una frecuencia de siete a diez días, y en las épocas de menor abundancia cada quince días; asimismo, cuanto antes se determine el momento del crecimiento de la población de B. phoenicis se tendrá mayor oportunidad para el control de la enfermedad leprosis de los cítricos [Anónimo, 2005]. CONCLUSIONES • B. phoenicis se presentó durante los doce meses estudiados en la zona citrícola del estado de Tabasco. • El aumento y disminución de su población estuvieron asociados notablemente con el incremento y descenso de la temperatura. • La fluctuación poblacional de la especie presentó correlación alta con la temperatura y correlación muy baja con la precipitación. AGRADECIMIENTOS Agradecemos al doctor Gabriel Otero Colina por su gran apoyo en la identificación del ácaro Brevipalpus phoenicis. Fitosanidad 16(2) agosto (2012) REFERENCIAS Anónimo: Manual de leprose, Fondo de Defesa da Citricultura, Brasil, 2004. C) in Southern Mexico», Tropical Plant Pathology 36 (6): 400-403, Brasil, 2011. Anónimo: Manual de leprose. Fondo de Defesa da Citricultura, Brasil, 2005. Kennedy, J. S.; G. Van Impe; T. H. Hance; P. H. Lebrun: «Demecology of the False Spider Mite, Brevipalpus phoenicis (Geijskes) (Acari: Tenuipalpidae)», Journal of Applied Entomology 120: 493-499, EE. UU., 1996. 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La antracnosis, causada por Colletotrichum gloeosporioides, es la enfermedad foliar de mayor importancia en el género Dioscorea y produce afectaciones severas en esta especie. Este trabajo tuvo como objetivo evaluar seis genotipos de D. alata ante las afectaciones producidas por C. gloeosporioides en en la región central de Cuba. Con este propósito se calculó el índice de afectación producido por este agente patógeno, hasta los doscientos cuarenta días posteriores a la plantación (dpp). Para evaluar el índice de afectación se empleó una escala evaluativa de 0 a 5 grados. Los primeros síntomas visibles producidos por C. gloeosporioides se observaron a los 120 dpp, en el genotipo Blanco o Pelú, con el 20 % de severidad. Aunque todos los genotipos fueron afectados a los 240 dpp, se constató menor afectación en el genotipo INIVIT Ñ 2008, seguido por Pacala Duclos y Belep. Los genotipos Blanco o Pelú y Ñame de Agua alcanzaron el 100 % de severidad. Estos resultados constituyen una valiosa herramienta para la selección de genotipos menos susceptibles a C. gloeosporioides como una alternativa de manejo de este agente patógeno. Dioscorea alata is a species of economic importance in many countries worldwide and is widespread in the Caribbean area. Anthracnose disease caused by Colletotrichum gloeosporioides is the most important foliar disease in Dioscorea genus and produces severe damages to this species. This study aimed to assess damages caused by C. gloeosporioides in six genotypes of D. alata in the central Cuban region. The damage rate caused by this pathogen was calculated 240 days after planting (dap) in order to do so. To assess the damage rate, a 0-5 grading scale was used. The first visible symptoms caused by C. gloeosporioides were observed on Blanco o Pelú genotype 120 dap, with 20 % severity. Although all genotypes were affected after 240 dap, less damage was noticed in the INIVIT Ñ 2008 genotype, followed by Pacala Duclos and Belep. Blanco o Pelú and Ñame de Agua genotypes reached 100 % severity. These results constitute a valuable tool to select genotypes which are less susceptible to C. gloeosporioides, as an alternative way for managing this pathogen agent. Key words: Colletotrichum gloeosporioides, Dioscorea alata, genotype Palabras claves: Colletotrichum gloeosporioides, Dioscorea alata, genotipo INTRODUCCIÓN Dioscorea alata L. constituye una de las especies de mayor importancia económica a nivel mundial, y se comercializa por su buen rendimiento y fácil propagación mediante bulbillos [Asiedu et al., 2003]. La antracnosis, causada por Colletotrichum gloeosporioides Penz., es una de las enfermedades más destructivas en esta especie [Emehute et al., 1998], y puede producir daños que alcanzan el 90 % en genotipos susceptibles [Winch et al., 1984; Egesi et al., 2009]. La identificación de genotipos tolerantes a esta enfermedad constituye una táctica de manejo que se ha desarrollado para disminuir los costos en la aplicación de agroquímicos e incrementar los rendimientos [Onyeka et al., 2006]. En Cuba las investigaciones relacionadas con C. gloeosporioides en genotipos de ñame han sido insuficientes, a pesar de presentarse condiciones favorables para el desarrollo de epífitias de este agente patógeno. Este trabajo tuvo como objetivo evaluar las afectaciones Recibido: 26/6/2012 Aceptado: 29/7/2012 79 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Rodríguez et al. causadas por C. gloeosporioides en genotipos de D. alata en condiciones de campo, en el municipio de Santo Domingo, Villa Clara, Cuba. MATERIALES Y MÉTODOS Los experimentos fueron conducidos en áreas experimentales del Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales, municipio de Santo Domingo, Cuba. Los genotipos de D. alata evaluados fueron Pacala Duclos, IRAT 72, Belep, Ñame de Agua, Blanco o Pelú, INIVIT Ñ 2008. El trasplante se realizó en parcelas de 1 m x 1 m y se evaluaron 16 montículos de cuatro plantas por cada genotipo. Las plantas evaluadas fueron sometidas a la infección natural por C. gloeosporioides. Para determinar la severidad producida por C. gloeosporioides a los doscientos cuarenta días después de plantadas (ddp) se empleó la fórmula de Townsend y Heuberger (1943). Además, se utilizó una escala evaluativa de 0 a 5 grados, según el porcentaje de área foliar necrosada, donde 0 = planta sana, 1 = hasta 10 %, 2 = 11-30 %, 3 = 31-50 %, 4 = 51-75 % y 5 = 76-100 % [Nwankiti, 1984]. El análisis estadístico de los datos se realizó mediante el paquete estadístico Statgraphics Centurión versión XV-II de 2006. La severidad final y grado de afectación de la enfermedad se analizaron mediante la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los primeros síntomas producidos por C. gloeosporioides se identificaron a los 120 ddp, en el genotipo Blanco o Pelú, con el 20 % de severidad. En este momento, los demás genotipos evaluados no presentaron síntomas de la infección. A los 255 ddp, aunque todos los genotipos fueron afectados por C. gloeosporioides, se constató menor severidad en el genotipo INIVIT Ñ 2008, con el 35 %, seguido por Pacala Duclos, Belep e IRAT 72. Los genotipos Blanco o Pelú y Ñame de Agua alcanzaron el 100 % de severidad (Tabla). Severidad de C. gloeosporioides en genotipos de D. alata en Santo Domingo, Villa Clara, Cuba Genotipos Pacala Duclos IRAT 72 Belep Ñame de Agua Blanco o Pelú INIVIT Ñ 2008 Categoría Medias reales (grados) Rangos medios MT S MT S S T 2,5 3,0 2,8 5,0 5,0 1,8 31,5 c 46,5 b 39,0 bc 80,5 a 80,5 a 13,0 d Severidad Medias reales (%) 50,0 60,0 55,0 100,0 100,0 35,0 EE (±) 2,58 0,00 2,24 0,00 0,00 2,24 Valoración de genotipos de ñame a la severidad de la enfermedad con una escala de 1 a 5, donde valores < 3 expresan tolerancia y≥ 3 susceptibilidad; T= tolerante; MT: Moderadamente tolerante; S: Susceptible. Rangos medios con letras desiguales en una columna difieren según Kruskal Wallis a p < 0,05. Los resultados en cuanto a la tolerancia observada en el genotipo Belep coinciden con lo informado por Green y Simons (1992), quienes sugieren el uso de genotipos menos susceptibles para su extensión y cultivo en el Caribe, e incluyen este genotipo. Resultados similares en cuanto a la tolerancia de este genotipo fueron señalados por McDonald et al. (1998) y Ano et al. (2005). Además, Onyeka et al. (2006) evaluaron la reacción de 50 genotipos de D. alata a la infección por C. gloeosporioides en condiciones semicontroladas y determinaron la tolerancia del genotipo Belep a C. gloeosporioides. En con80 sideración al potencial de propagación del genotipo Belep y su tolerancia a C. gloeosporioides, es recomendable extender su cultivo en Cuba, unido al resto de los genotipos tolerantes y moderadamente tolerantes. CONCLUSIONES • Los genotipos con menor severidad, de tolerante y moderadamente tolerante a la infección por C. gloeosporioides, fueron INIVIT Ñ 2008, Pacala Duclos y Belep. Fitosanidad 16(2) agosto (2012) REFERENCIAS Ano, G.; J. Gelabale; P. Marival: «L’igname D. alata, la genetique et l’anthracnose», Phytoma 584: 36-39, España, 2005. McDonald, F. D.; A. T. Alleyne; L. W. Ogarro; A. J. 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UU., 1984. 81 Epidemiología Fitosanidad 16(2) agosto (2012) 83-86 Escala logarítmica diagramática de severidad de la antracnosis (Colletotrichum gloeosporioides) en papaya (Carica papaya) Manuel Jesús Zavala León1 y Jairo Cristóbal Alejo2 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias-CIRSE, Campo Experimental Mocochá Km 25,5, antigua carretera a Mérida-Motul, Mocochá, Yucatán, México, C.P. 97454 [email protected] 2 Instituto Tecnológico de Conkal, Km 16.3, antigua carretera a Merida-Motul, Conkal, Yuc. México, C.P. 97345 1 RESUMEN ABSTRACT La antracnosis, causada por Colletotrichum gloeosporioides, representa la enfermedad fungosa que más afecta la calidad de los frutos de papaya en poscosecha. Se desarrolló un trabajo con el objetivo de elaborar y validar una escala logarítmica diagramática de severidad para el patosistema papaya-antracnosis. Para ello se inocularon 130 frutos de papaya con conidios de C. gloeosporioides a una concentración 1 x 10 6 conidios/mL. Los frutos inoculados al madurar manifestaron diferentes grados de severidad, la cual se estimó con ayuda de programas computacionales. Posteriormente se fotografió cada cara de los frutos y algunas imágenes con diferentes grados de daño que se proyectaron a un grupo de 18 evaluadores sin experiencia, para que estimaran la severidad con la escala previamente elaborada. Los datos generados por cada evaluador se sometieron a un análisis de regresión lineal simple. Se generó una escala de seis clases, que abarcaban frutos sin daño hasta frutos con la mayor severidad calculada. El rango de precisión fluctuó entre 0,66-0,81 y la exactitud entre 0,78-0,95; sin embargo, la precisión y exactitud mejoraron o al menos se mantuvieron durante la segunda evaluación. La escala logarítmica generada para el patosistema papaya-antracnosis puede emplearse como una herramienta confiable, pues es fácil de usar, resulta aplicable a un amplio rango de condiciones y, además, proporciona resultados reproducibles, rápidos y exactos. Anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides represents the fungal disease that affects the quality of papaya fruits in postharvest. A study was realized with the objective of develops and validates a logarithmic scale for severity diagrammatic papaya anthracnose pathosystem. This was inoculated with 130 conidia papaya fruits C. gloeosporioides at concentration of 1 x 10 6 conidia per mL. The inoculated fruits when ripe expressed different degrees of severity, which was estimated using computer programs. Subsequently, each face photographed fruit and some images with different degrees of damage were projected to a group of 18 inexperienced evaluators to estimate the severity scale developed previously. The data generated by each evaluator were subjected to a simple linear regression analysis. It generated a scale consisted of six classes, covering fruit without damage to fruits with the highest severity calculated. Precision range varied from 0.66 to 0.81 and accuracy from 0.78 to 0.95, however, precision and accuracy were improved or at least maintained during the second evaluation. The logarithmic scale generated for papaya pathosystem anthracnose, can be used as a reliable tool, it is easy to use, is applicable to a wide range of conditions and further provides reproducible, rapid and accurate. Key words: anthracnose, papaya fruit, fungal diseases, postharvest decay Palabras claves: antracnosis, papaya, enfermedades fungosas, enfermedades poscosecha INTRODUCCIÓN Las pérdidas poscosecha en papaya fluctúan entre 18 y el 30% [Flórez et al., 2009]; sin embargo, la antracnosis, causada por Colletotrichum gloeosporioides Penz., constituye la principal enfermedad en esta etapa. El síndrome característico de la antracnosis inicia con una emisión de látex sobre la superficie del fruto, seguido de una aparición de lesiones de color rojizo, que conforme avanzan se tornan circulares, acuosas y con los márgenes claros y translúcidos. En una severidad avanzada de la enfermedad, en el centro de la lesión se producen masas de esporas de color salmón [Álvarez y Nishijima, 1987]. En la actualidad se conoce poco acerca de la relación e intensidad de la enfermedad (severidad o incidencia) y pérdidas en los cultivos. Una de las razones es debido a Recibido: 18/6/2012 Aceptado: 16/7/2012 83 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Zavala y Cristóbal lo costoso que resulta su medición y también porque los métodos de medición son arbitrarios, de manera que la información obtenida resulta imprecisa e inexacta para la toma de decisiones de control. Una opción son los métodos visuales que resultan ampliamente utilizados por su simpleza y costos. De estos métodos, el uso de escalas logarítmicas basadas en el principio de WeberFechner resultan los más adecuados, ya que permiten la asignación de clases con base en un sistema logarítmico; además se incluye una representación fotográfica para cada clase o categoría de la enfermedad [Tovar et al., 2002; Sherwood et al., 1983]. En este contexto se han implementado con éxito escalas logarítmicas diagramáticas en varios patosistemas agrícolas [Cristóbal et al., 2006; Martins et al., 2004; Spósito et al., 2004; Tovar et al., 2002]. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo consistió en elaborar y validar una escala logarítmica diagramática de severidad para el patosistema papaya-antracnosis (Carica papayaColletotrichum gloeosporioides). MATERIALES Y MÉTODOS Elaboración de la escala logarítmica diagramática Se colectaron 130 frutos de papaya cv. Maradol en madurez fisiológica de un huerto del municipio de Tekax, Yucatán, México. Después de un acondicionamiento bajo condiciones de laboratorio por 24 h, se procedió a lavar los frutos con agua potable para eliminar polvo y residuos de campo, luego se desinfestaron con alcohol y agua estéril, y por último se dejaron secar. Posteriormente se preparó una concentración de conidios de C. gloeosporioides a 1 x 106 conidios/mL, que se asperjó sobre los frutos con ayuda de un atomizador de plástico de 500 mL, se esperó a que se secaran y se colocaron dentro de cajas plásticas con algodón húmedo, donde se mantuvieron bajo condiciones de laboratorio por un período de diez días, momento en que los frutos comenzaron a madurar, y se procedió a la estimación de la severidad de la antracnosis. Para ello, cada cara del fruto se fotografió con una cámara digital (Olympus), luego cada imagen se procesó con ayuda del programa Photo Magic (versión 1.0 de Micrografx Inc.), donde se diferenció la parte dañada con rojo y la parte sana con azul rey, después con el programa Image Tool (versión 1.28 de la Universidad de Texas). Cada imagen se redujo a blanco y negro para estimar el área sana y enferma de cada fruto. El máximo porcentaje de severidad obtenido se introdujo al programa 2 log, así como el número de clases, según el criterio de una distribución 84 normal de los porcentajes calculados y sin exceder un número no práctico de clases, y se procedió a validar la escala. Validación de la escala logarítmica diagramática Para la validación de la escala se realizaron dos evaluaciones con 18 evaluadores que emplearon la escala previamente elaborada para valorar 50 de los 130 frutos fotografiados. Catorce días después de la primera evaluación se proyectaron nuevamente las imágenes a los mismos evaluadores con la finalidad de evaluar la reproducibilidad de la escala. Análisis de los datos La precisión y exactitud visual estimada por cada evaluador se determinó mediante un análisis de regresión lineal simple, en el que se consideró a la severidad real como variable independiente, y a la severidad estimada como variable dependiente. La precisión y exactitud de cada evaluador correspondió al valor del coeficiente de determinación (r2) y pendiente (b1), respectivamente [Tovar et al., 2002, Nutter y Schultz, 1995; Campbell y Maden, 1990]. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La escala logarítmica diagramática generada para cuantificar la severidad de la antracnosis en frutos de papaya constó de siete clases o niveles de severidad, donde correspondió la clase 0 a frutos sin daño, y la 7 a frutos con el máximo porcentaje de daño o severidad estimado, que fue del 60,92 % (Figura). En la validación de la escala se formaron dos segmentos de evaluadores, uno comprendido por los evaluadores del 1-9 y otro del 10-18. Durante la primera evaluación, el segmento de evaluadores del 1-9 obtuvo un rango de precisión (r2) de 0,66-0,81, y una exactitud (b1) entre 0,78-0,95; sin embargo, la precisión y exactitud mejoró o al menos se mantuvo durante la segunda evaluación (Tabla). Esta tendencia de mejora entre evaluaciones resulta común en otros patosistemas [Cristóbal et al., 2006; Villanueva et al., 2005], y se debe principalmente al conocimiento acerca de los síntomas de la enfermedad y al uso de la escala adquirido en la primera evaluación [Tovar et al., 2002]. Por su parte, en los evaluadores del segundo segmento (10-18) se observó una tendencia contraria a los evaluadores del primero, ya que inicialmente lograron una precisión entre 0,68-0,84 y una exactitud entre 0,82-0,96; sin embargo, ambos atributos disminuyeron para la segunda eva- Fitosanidad 16(2) agosto (2012) luación. Al respecto, Sherwood et al. (1983) mencionaron que existen factores externos como el tamaño y color de la lesión, la intensidad de luz, la fatiga del evaluador al momento de la evaluación, que afectan la precisión y exactitud de las evaluaciones visuales. Además, es importante señalar que ambos segmentos de evaluadores mostraron una tendencia a subestimar positivamente la severidad de la enfermedad. Escala logarítmica diagramática para evaluar la severidad de la antracnosis en el patosistema Carica papayaColletotrichum gloeosporioides. Coeficiente de determinación y pendiente de la regresión lineal simple obtenidos entre la severidad de la antracnosis estimada por cada evaluador, con auxilio de la escala diagramática, y la severidad real Evaluador Primera evaluación Segunda evaluación r2 b1 R2 b1 1 0,73 0,78 0,80 0,83 2 0,70 0,86 0,82 0,90 3 0,81 0,82 0,81 0,84 4 0,75 0,90 0,79 1,00 5 0,81 0,95 0,81 0,88 6 0,76 0,80 0,76 0,80 7 0,66 0,81 0,81 0,82 8 0,75 0,79 0,87 0,80 9 0,66 0,84 0,78 0,83 10 0,76 0,82 0,67 0,71 11 0,68 0,84 0,65 0,91 12 0,82 0,82 0,78 0,85 13 0,84 0,88 0,83 0,88 14 0,78 0,83 0,70 0.80 15 0,80 0,94 0,72 0,87 16 0,80 0,92 0,74 0,90 17 0,72 0,87 0,71 0,79 18 0,82 0,96 0,79 0,96 85 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Zavala y Cristóbal Basado en estos resultados, la escala logarítmica generada para el patosistema papaya-antracnosis puede emplearse como una herramienta confiable, ya que proporciona resultados reproducibles, rápidos y exactos [Nutter et al., 1993]. CONCLUSIONES • La escala diagramática propuesta para la evaluación de la severidad de la antracnosis en papaya en poscosecha demostró ser de fácil uso y confiable, cumple con las condiciones de facilidad de uso y es capaz además de proporcionar estimaciones rápidas de la enfermedad con una buena precisión, exactitud y reproducibilidad. • La escala se puede emplear como una guía en la toma de decisiones en los esquemas de certificación de calidad de las empacadoras; también puede ser usado por asesores y profesionales fitosanitarios encargados de realizar pruebas de efectividad biológica de plaguicidas para verificar niveles de control de la enfermedad. AGRADECIMIENTOS Esta publicación es producto del proyecto «Estrategias para el mejoramiento de la papaya» con número SINASO: 159570287. REFERENCIAS Alvarez, A. M.; W. T. Nishijima: «Postharvest diseases of papaya», Plant Disease 71 (8): 681-686, EE. UU., 1987. 86 Campbell, C. L.; L. V. 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Carretera a Bejucal Km 33½, Quivicán, Mayabeque, Cuba, [email protected] RESUMEN ABSTRACT La albahaca (Ocimun bacilicum L.) pertenece a la familia de las labiadas, hierba aromática anual nativa de la India y otras regiones tropicales de Asia, que lleva más de cinco mil años de cultivada. Con el objetivo de determinar las plagas y enfermedades que inciden sobre el cultivo de la albahaca en condiciones protegidas, se desarrolló un experimento en una plantación de albahaca blanca variedad Genovesa en el Instituto de Investigaciones Hortícola Liliana Dimitrova, del municipio de Quivicán, provincia de Mayabeque, de marzo a junio de 2009. Semanalmente, a partir del trasplante, se muestrearon raíces, hojas, tallos y flores que se revisaron mediante observaciones al microscopio estereoscópico y microscopio óptico. Las enfermedades observadas en la albahaca blanca, bajo condiciones protegidas, correspondieron a los patógenos fúngicos Peronospora sp., Rhizoctonia sp. y Fusarium oxysporum Sch., y los artrópodos plagas Pachnaeus litus Germar, Atta insularis Guer. y Polyphagotarsonemus latus Banks. Se informa por primera vez el picudo verde azul (Pachnaeus litus Germar) como insecto fitófago en O. basilicum en el país. Basil (Ocimum bacilicum L.) belongs to Labiatae family, is an annual herb native from India and other tropical regions of Asia, with more than 5000 years of cultivation. In order to identify the pests and diseases that affect the basil growing in protected conditions, an experiment was developed in white basil planting of Genovesa variety, in the Horticultural Research Institute Liliana Dimitrova (IIHLD), in the municipality of Quivicán, from Mayabeque province, during the months of March to June 2009. Samples of roots, leaves, stems and flowers were taken weekly from transplantation, and were reviewed by observations with stereomicroscope and light microscope. Diseases observed in white basil under protected conditions corresponded to the fungal pathogens Peronospora sp. Rhizoctonia sp. and Fusarium oxysporum Sch., and arthropod Pachnaeus litus Germar, Atta insularis Guer. and Polyphagotarsonemus latus Banks. Blue green weevil (Pachnaeus litus Germar) was reported for the first time as phytophagous insect on O. basilicum in the country. Key words: pests, white basil, protected crop Palabras claves: plagas, albahaca, cultivo protegido La albahaca pertenece a la familia de las labiadas, hierba aromática anual nativa de la India y otras regiones tropicales de Asia, que lleva más de cinco mil años de cultivada. En muchos países este vegetal tiene uso medicinal, culinario y religioso. Se piensa que fue una de las primeras plantas introducidas por los colonizadores en el Nuevo Mundo. El crecimiento de las variedades de la albahaca es diferente de una a otra especie; las hojas son opuestas de un verde lustroso, ovales u ovadas, dentadas, de textura sedosa. Toda la planta despide un intenso olor aromático. Existe un gran número de cultivares de diferentes tamaños, forma, color y olor. Se considera que hay más de ciento cincuenta especies [Deroncelé et al., 2009]. En las condiciones de Cuba la albahaca se desarrolla bien en suelos ferralíticos rojos de La Habana y Matanzas. Las enfermedades foliares y vasculares registradas en este cultivo en el país son ocasionadas por hongos de los géneros Cercospora, Curvularia, Alternaria y Fusarium [Marrero et al., s/a]. Con el objetivo de determinar las plagas y enfermedades que inciden sobre el cultivo de la albahaca en condiciones protegidas se desarrolló un experimento en una plantación de albahaca blanca variedad Genovesa en el Instituto de Investigaciones Hortícola Liliana Dimitrova, del municipio de Quivicán, provincia de Recibido: 2/5/2012 Aceptado: 31/6/2012 87 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Bernal et al. Mayabeque, en un suelo ferralítico rojo compactado [Hernández et al., 2000] en una instalación de cultivo protegido Averirit (GBM-Israel), de marzo a junio de 2009. Semanalmente, a partir del trasplante, se muestrearon raíces, hojas, tallos y flores las que posteriormente se revisaron mediante observaciones al microscopio estereoscópico y microscopio óptico, en el laboratorio de Fitopatología de IIHLD para aislar e identificar los agentes nocivos (patógenos y artrópodos plagas). Para la determinación de los géneros se utilizaron manuales y claves de descripciones publicadas al respecto. En la tabla se pueden apreciar los diferentes agentes nocivos registrados. En las plantas con cincuenta días de edad se visualizaron diferentes manchas foliares de aspecto clorótico, distribuidas por el haz de las hojas; tres días después se presentó por el envés un crecimiento polvoriento de color pardo grisáceo, el cual provocó una abundante defoliación. Por sus características morfológicas y patogénicas el microorganismo se identificó como Peronospora sp. de la clase Oomycetes, orden Peronosporales, de acuerdo con lo planteado por Martínez et al., (2009) para esta patología, como una nueva enfermedad del O. basilicum en Cuba. Con sesenta días de establecido el cultivo se detectaron síntomas en tallos y raíces (desde el cuello de la raíz) en forma de manchas pardo oscuras con zona atizonada. El agente causal de esta enfermedad fue identificado por sus características etiológicas como el hongo Rhizoctonia sp. [Mordue, 1974]. Durante el mismo período también se presentaron en algunas plantas clorosis foliar, marchitamiento y muerte prematura; esta infección fue ocasionada por el hongo fitopatógeno Fusarium oxysporum Schl. [Booth, 1977], enfermedad señalada con anterioridad en el país [Armas et al., 2001]. Posterior a las patologías antes mencionadas, a los sesenta y cinco días también se observaron daños de hojas masticadas y plantas cortadas, cuyos insectos causantes se identificaron como picudo verde azul (Pachnaeus litus Germar) (Coleóptero: Curculionidae) [Blackwelder, 1947] y bibijagua (Atta insularis Guer.) (Formicidae: Hymenóptera) [Bruner y Valdés, 1949]. La primera plaga se presentó ocasional y por primera vez en la albahaca blanca, por lo que este resultado representa el primer registro de este organismo en Cuba; otras infestaciones fueron el encrespamiento en las hojas y brotes deformados ocasionados, según reconocimiento visual y manuales de descripciones, por el ácaro blanco (Polyphagotarsonemus latus Banks) (Acari: Tarsonemidae) [Krantz, 1978]. Las plagas observadas en la albahaca blanca bajo condiciones protegidas fueron tres enfermedades fúngicas y tres artrópodos. Se informa por primera vez el picudo verde azul como insecto fitófago en O. basilicum en el país. Registro de las plagas en la albahaca blanca Síntomas y daños Agente causal Aparición (días) Situación Mildiu Peronospora sp. 50 Hojas Tizón Rhizoctonia sp. 60 Cuello de la raíz y tallo Marchitez Fusarium oxysporum 60 Toda la planta Brotes deformados y encrespamiento en las hojas Polyphagotarsonemus latus 65 Brotes vegetativos y hojas Hojas cortadas Pachnaeus litus 65 Hojas Planta cortada Atta insularis 65 Planta REFERENCIAS Armas, Georgina de; B. Ramos; R. Ramos; Y. Hernández; J. Miguel; M. O. López: «Primer reporte en Cuba de Fusarium oxysporum Schelecht en albahaca verde», Fitosanidad 5 (3): 45-46, Cuba, 2001. Blackwelder, R. E.: «Checklist of the Coleopterous Insects of México, Central America, the West Indies and South America. Part 5, 88 Curculionidae», Bull. USA National Museum No 185: 791-921, EE. UU., 1947. Booth, C.: Fusarium. Laboratory Guide to the Identification of the Major Species, CMI. Commonwealth Mycological Institute Kew, Surrey, Inglaterra, 1977. 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Rodovia Sp 340 Km 127,5 – Taquinho Velho, Caixa Postal 69 13820-000, Jaguariúna SP, Brasil 1 RESUMEN ABSTRACT Se determinó el perfil de los ácidos grasos de seis aislados de Bacillus spp. mediante cromatografía gaseosa. El análisis permitió identificar dos de los aislados como B. subtilis, otro se agrupó en el género Bacillus y los restantes aislados se agruparon dentro del grupo de B. cereus. Aunque el análisis FAME no permitió identificar taxonómicamente todos los aislados, sí posibilitó confirmar el espectro bacteriano. Aun cuando el análisis FAME permite la identificación a nivel de especie en unos casos y en otros no, la técnica es utilizada frecuentemente por diversos laboratorios en el mundo por sus potencialidades en la diferenciación bacteriana, y es muy útil como sistema de identificación de primera línea. Fatty acids profiles from six Bacillus spp. isolates were determined by gas chromatographic. The fatty acids methyl esters (FAME) analysis let identified two isolates as B. subtilis, another one was grouped in Bacillus genus and the rest were included into B. cereus group. Although FAME analysis did not allowed species differentiation, it facilitated the bacterial spectrum classification of isolates. Even though the FAME analysis allows identification at species level in some cases and not for others, the technique is used by numerous laboratories for routine based identifications of bacteria, because it has a potential for species differentiation within the genus Bacillus and it is very useful as first line identification system. Palabras claves: Bacillus, cromatografía gaseosa, ácidos grasos, taxonomía Keys words: Bacillus, gas chromatographic, fatty acids, taxonomy El género Bacillus está constituido por un grupo diverso de bacterias ampliamente distribuidas en el suelo y en otros ecosistemas naturales. Debido a su habilidad de formar esporas resisten un rango variable de condiciones ambientales, por lo que se adaptan fácilmente a diversos hábitats. La identificación de las especies pertenecientes a este género se realiza comúnmente mediante pruebas bioquímicas. En algunos casos una identificación segura resulta difícil debido a que comparten propiedades bioquímicas y morfológicas importantes [Kwon et al., 2009]. Actualmente las técnicas de identificación empleadas con más frecuencia incluyen el análisis de los ácidos grasos totales, la electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE), los perfiles genómicos y las técnicas de microarreglos [Parvathi et al., 2009]. La primera evidencia de que los ácidos grasos celulares podían utilizarse para la identificación de bacterias la informó Abel et al. (1963), y el primer análisis del género Bacillus lo realizó Kampfer (1994), quien concluyó que este análisis tiene potencial para la diferenciación de especies de este género. Slabbinck et al. (2008) plantearon que el objetivo de una herramienta de identificación de primera línea como el análisis FAME no es lograr una identificación exacta, sino obtener el espectro bacteriano del aislado en cuestión. El análisis de los perfiles de los ésteres metílicos de los ácidos grasos totales (FAME) es una herramienta de identificación fácil, automatizada, que se emplea rutinariamente en la investigación microbiológica por Recibido: 15/5/2012 Aceptado: 27/6/2012 91 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Baró et al. varios laboratorios en el mundo, la cual es cada vez más importante en la identificación bacteriana, y es lo suficientemente sensible y confiable para agrupar al género Bacillus a nivel de especies [Kwon et al., 2009]. La selección de nuevos aislados bacterianos con fines industriales biotecnológicos, efectivos en el control de plagas entre otras aplicaciones, es una práctica que se realiza en numerosos laboratorios y centros de investigación. El Laboratorio de Desarrollo de Bioplaguicidas del Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal dispone de aislados de Bacillus spp., que se han identificado y caracterizado por métodos bioquímicos y moleculares. En este trabajo se realizó la identificación y cuantificación del perfil de los ácidos grasos de seis aislados de Bacillus pertenecientes a esta institución, nombrados E4, 4, 21, LBT 87, LBT 99 y LBT 111. La preparación y el análisis de las muestras se realizó según el protocolo descrito en el manual del fabricante (Sherlock Microbial Identification System version 5.5 MIDI, Inc., Newark, DE, USA). Los aislados bacterianos se desarrollaron en medio de cultivo caldo triptona soya a 28 ± 2 °C durante 24 h. Transcurrido el tiempo de crecimiento se tomaron cuatro asas de crecimiento bacteriano del tercer cuadrante de la placa de Petri y se trasvasaron a tubos de cultivo específicos de cromatografía gaseosa. A continuación se realizó el proceso de saponificación, para lo cual se adicionó 1 mL de una solución de NaOH 15 % en metanol 50 %. Seguidamente se realizó la metilación con la adición de 2 mL de una solución de HCl 6N en metanol 50 %, y se realizó la extracción de los ácidos grasos formados con la adición de 1,25 mL de hexano o metil terc-butil éter (MTBE). Finalmente se realizó el lavado de la fase orgánica con 3 mL de una solución de NaOH 1,2 %, y las muestras se trasvasaron para viales específicos de cromatografía gaseosa. Se utilizó un cromatógrafo gaseoso Agilent modelo 6850 con columna Ultra 2 [25 m de longitud, ID (diámetro interno) 0,2 mm y Film (recubrimiento interno) 0,33 μm], 5 % fenil metil siloxano, detector FID, gas portador hidrógeno (30 mL/min), nitrógeno (30 mL/min), volumen inyectado automáticamente 2 μL (inyector automático serie 7683), modo de inyección split (liner 19251-60540), temperatura del inyector 250 °C, temperatura del detector 300 °C, programa de temperatura del horno: 170 °C inicial, rampa 5 °C/min hasta 260 °C durante 18 min, rampa 40 °C hasta 310 °C durante 1,5 min. La biblioteca de comparación empleada fue la Sherlock TSBA versión 6. Para las cepas 4, E4 y 21 se obtuvo una alta proporción de ácidos 15:0 iso y 15:0 anteiso, composición característica para la especie B. subtilis, contrariamente a lo que ocurrió en las cepas LBT87, LBT99 y LBT111, donde hubo una menor proporción de ácidos grasos 15:0 anteiso típico de la especie thuringiensis. En la Tabla se pueden apreciar los índices de similitud relacionados con cada cepa estudiada. Índices de similitud obtenidos en el análisis FAME Cepa 4 92 Índices de similitud 0,833 Bacillus subtilis E4 0,622 Bacillus subtilis 0,490 Paenibacillus macerans (Bacillus) 0,410 Bacillus atrophaeus 21 0,488 Paenibacillus macerans (Bacillus) 0,472 Bacillus atrophaeus 0,451 Virgibacillus pantothenticus (Bacillus) 0,424 Bacillus subtilis 0,383 Paenibacillus larvae pulvifaciens (48 h, Bacillus) LBT87 0,449 Bacillus cereus GC subgroup B 0,350 Bacillus cereus GC subgroup A LBT99 0,521 Bacillus cereus GC subgroup B 0,410 Bacillus cereus GC subgroup A LBT111 0,354 Bacillus cereus GC subgroup B 0,308 Bacillus cereus GC subgroup A Fitosanidad 16(2) agosto (2012) El análisis del perfil de los ácidos grasos permitió identificar con precisión los aislados E4 y 4 dentro de la especie B. subtilis. En ambos aislados los porcentajes de similitud estuvieron por encima de 0,6; valor a partir del cual se considera válida la identificación. Aunque el aislado 21 se agrupó dentro del género Bacillus no se pudo determinar la especie de manera precisa. Sosa et al. (2006) identificaron los aislamientos E4, 4 y 21 como B. subtilis mediante pruebas bioquímicas y el minikit API 50 CHB (Biomérieux). Los aislamientos LBT 87, 99 y 111 tuvieron índices de similitud bajos que los ubicaron dentro del grupo de B. cereus. Probablemente en estos aislados no se pudo discernir la especie porque los ácidos grasos presentes en la pared celular son muy similares, por lo que hay que emplear otros métodos para la identificación. El perfil FAME de B. cereus y B. thuringiensis es muy similar, por lo que es necesario el análisis del cristal parasporal producido solamente por B. thuringiensis para su diferenciación. Carreras (2009) identificó estos tres aislados como B. thuringiensis, principalmente por la presencia del cristal parasporal. El género Bacillus contiene dos grupos de especies muy relacionadas: el grupo B. cereus en el cual se incluyen las especies anthracis, cereus, mycoides, thuringiensis, pseudomycoides y weihenstephanensis [Euzeby, 2007], y el grupo B. subtilis, que contiene las especies amyloliquefaciens, licheniformis, atropheus, axarquensis, mojavensis, pumilus, sonarensis, subtilis, tequilensis, vallismortis y velezensis. La resolución taxonómica del FAME debe determinarse para cada taxón separadamente, ya que en algunos géneros permite la identificación a nivel de especies y en otras no. No obstante, las diferencias en la longitud de las cadenas, posición de los dobles enlaces y la unión de los grupos funcionales hacen a los ácidos grasos un marcador taxonómico muy útil [Slabbinck et al., 2008]. REFERENCIAS Abel, K.; H. Deschmertzing; J. 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Carretera Central vía Holguín 371, Granma, Cuba. 1 RESUMEN ABSTRACT A partir del programa de recuperación de frutales en la provincia de Granma, como parte de la protección fitosanitaria, se evaluaron los nematodos parásitos asociados a Persea americana Mill. var. Americana en el vivero de frutales del municipio de Buey Arriba. Para el procesamiento de las muestras del suelo adherido a las raíces se utilizó el método de extracción decantación más tamices y embudos Baermann. Como resultado se observó la presencia de Hemicriconemoides Chitwood & Birchfield. Los especímenes poseían una característica doble cutícula. El cuerpo de las hembras, cilíndrico, afinado en los extremos, ligeramente arqueado, con 132-140 (133,8) anillos cuticulares; pequeño, con una longitud entre 0,48-0,53 (0,50) mm; estilete de 79-81 (79,9) μm con las protuberancias basales dirigidas anteriormente, en forma de ancla; región labial aplanada anteriormente; poro excretor situado en los anillos 34-35 (34,2); vulva en los anillos 11-12 (11,6) y ano en los anillos 7-8 (7,2) a partir del término de la cola, con una distancia de 4-5 (4,4) anillos entre uno y otro. Estas características coinciden con las descritas para Hemicriconemoides mangiferae Siddiqi. Es el primer registro de esta especie en Cuba. As part of phytosanitary protection for an improvement program of fruit crops in Granma province, plant parasitic associated nematodes have been evaluated on Persea americana Mill. var. Americana, from a nursery located at Buey Arriba municipality. Nematodes of Criconematidae family were observed in the samples received. Specimens had a cuticular sheath which is characteristic of Hemicriconemoides Chitwood & Birchfield genus. Female with small cylindrical body, tapering towards ends, slightly arcuate, cuticular annuls 132-140 (133,8); length 0,48-0,53 (0,50) mm; spear 79-81 (79,9) μm long with basal knobs anteriorly directed, anchor-like shaped; lip region anteriorly flattened; excretory pore on annuli 34-35 (34,2); vulva on annuls 11-12 (11,6) and anus on annuls 7-8 (7,2) from tail terminus, with 4-5 (4,4) annuls between both. These characteristics corresponded with Hemicriconemoides mangiferae Siddiqi. This is the first report of the species in Cuba. Key words: Persea americana, Hemicriconemoides mangiferae, crop fruits Palabras claves: Persea americana, Hemicriconemoides mangiferae, frutales Una de las prioridades del Ministerio de la Agricultura de Cuba es el incremento de la producción frutícola a partir del rescate de los espacios actuales y el fomento de nuevas áreas, lo que incluye además la incorporación de un movimiento popular de siembra que abarque una gama extensa de especies frutales en todo el país. Como parte de esta actividad, en la provincia de Granma se elaboró el programa de desarrollo de los frutales [Minag, 2010], el cual plantea una estrategia que permita lograr la recuperación de las plantaciones afectadas y desarrollar acciones encaminadas al desarrollo integral y diversificado de los frutales en todos los municipios de la provincia. Entre las amenazas para el óptimo desarrollo y rendimiento de estas plantas, fundamentalmente durante la etapa de viveros, se encuentran los fitonematodos, que son uno de los factores involucrados en las pérdidas económicas en las plantaciones de frutales [Castellano et al., 2004]. A partir de estas premisas, en el Laboratorio de Sanidad Vegetal de la provincia de Granma se procesaron muestras de aguacatero (Persea americana Mill. var. Recibido: 13/6/2012 Aceptado: 15/7/2012 95 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Gandarilla y Rivas Americana) procedentes del vivero del Poder Popular en el municipio de Buey Arriba para determinar los fitonematodos presentes. El suelo adherido a las raíces se procesó mediante el método de decantación más tamices. El procedimiento se repitió hasta aumentar la transparencia del recobrado, que luego se depositó en embudos Baermann. Los nematodos se colectaron en un tubo de ensayo, colocado en baño de María a 55 °C durante 3 min, y posteriormente se fijaron en una solución de formaldehído, agua y trietanolamina (TAF) según indicaciones de García (1979). La identificación se realizó en el Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal (donde se conservaron los especímenes) por la morfología de 11 hembras, en base a los criterios respecto al género de Hunt et al. (2005) y para la especie los criterios de Siddiqi (1977), Germani y Anderson (1991), Rhaman y Ahmad (1995), CABI (2007). Fue distintiva la presencia de una doble cutícula semejante a la del género Hemicriconemoides Chitwood & Birchfield. Las características principales observadas en los especímenes fueron el cuerpo cilíndrico, afinado en los extremos, ligeramente arqueado, de tamaño pequeño; región labial aplanada anteriormente con dos anillos, de los cuales el anterior presentó forma angular, dirigido hacia fuera, y el otro redondeado de forma similar a los anillos del cuerpo; las protuberancias basales del estilete dirigidas anteriormente, en forma de ancla; vulva en forma de hendidura transversa abierta, sin la presencia de cubierta vulvar; y cola conoide con término redondeado y anillo terminal liso. La longitud del cuerpo fue de 0,48-0,53 (0,50) mm; estilete 79-81 (79,9) μm; número de anillos cuticulares en el cuerpo 132-140 (133,8); anillos del extremo anterior al poro excretor 34-35 (34,2); anillos del término de la cola a la vulva 11-12 (11,6); anillos del término de la cola al ano 7-8 (7,2); anillos entre la vulva y el ano 4-5 (4,4). Estas características coinciden con las descritas para Hemicriconemoides mangiferae Siddiqi y es la primera vez que se registra esta especie en Cuba. Esta especie se considera importante en frutales tropicales y subtropicales y casi cosmopolita en las áreas cálidas del mundo [Mac Gowan, 1984]. Otros frutales hospedantes de este nematodo son Ananas comosus, Carica papaya, Citrus spp., Cocos nucifera, Litchi chinensis, Manguifera indica, Manilkara zapota, Musa paradisiaca, Psidium guajava y Vitis vinifera [CABI, 2007]. 96 H. mangiferae es una especie generalmente asociada con el mango (M. indica), donde se ha demostrado su patogenicidad; no obtante, su importancia económica no está esclarecida [El-Borai y Duncan, 2005]. Hasta el momento los nematodos asociados al aguacatero en Cuba eran Criconemoides sp., Helicotylenchus sp., Longidorus sp., Pratylenchus sp., Rotylenchulus sp., Rotylenchus sp., Tylenchorhynchus sp., Tylenchus sp. [Fernández y Ortega, 1986] y Meloidogyne sp. [Hernández et al., 2006]. No se observaron daños relacionados con H. mangiferae en las plantas analizadas, por lo que esta detección constituye un aporte al conocimiento de la diversidad de especies de fitonematodos presentes en los frutales de Cuba, y da a conocer como nuevo hospedante el aguacatero. REFERENCIAS CAB International: Crop Protection Compendium, CAB International, Wallingford, Inglaterra, 2007. Castellano, G.; O. Quijada; N. Jiménez; E. Briceño: «Nematodos fitoparasíticos asociados con merey, tamarindo y semeruco en el estado de Zulia y respuesta de dos cultivares de merey ante el nematodo agallador Meloidogyne incognita», Fitopatol. Venez. 17: 6-8, 2004. El-Borai, F.; L. W. Duncan: «Nematode Parasites of Subtropical and Tropical Fruit Tree Crops», Plant Parasitic Nematodes in Subtropical and Tropical Agriculture, 2.a ed., sección 11, CABI Publishing, Inglaterra, 2005, pp. 467-492. Fernández, M.; J. Ortega: Lista de nemátodos fitoparasitos de Cuba, Ed. 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Se realizó un estudio de la estructura comunitaria del suelo a nivel de género en dos sitios de selva: > 50 y < 15 años de conservación. Se determinó la densidad de plantas (≥ 100 cm de altura), y la diversidad, dominancia y riqueza de géneros de nematodos. La densidad vegetal y la diversidad de nematodos fueron mayores en la selva más conservada, resultado opuesto a su dominancia. En > 50 años abundaron Helicotylenchus y Mononchus, y en < 15 años Aphelenchus y Rhabditis. Los grupos funcionales más abundantes fueron el cp-2 (micófagos) y cp-3 (fitoparásitos) que difirieron por la edad de la selva. Este es un primer estudio preliminar sobre la diversidad de nematodos del suelo en selvas tropicales de México. Despite importance of soil nematodes in ecosystemic process such as organic matter decomposition and plant-parasitic interactions, the knowledge of their biodiversity in rainforest is lack. It was explored the community assemblage at genera level of soil nematodes of subhumid tropical forest in two different successional age forests: > 50 and < 15 years old. Plant density (≥ 1 height), Shannon-Wiener diversity (H’), Simpson dominance (D) and genera community richness (Bootstrap) were determined in each site. The most abundant genera in > 50 years old successional age forest were Helicotylenchus and Mononchus; while Aphelenchus and Rhabditis were in < 15 years old. Plant density was higher in > 50 than < 15 years old. Genera community richness was estimated in 85 %, explained mainly by the nematodes genera found in oldest forest. Major functional groups were c-p2 and c-p3 varying by forest age. This is a primary study about soil nematodes diversity in a Mexican tropical forest. Palabras claves: biodiversidad, nematodos, bosque tropical Key words: biodiversity, nematodes, tropical forest Los nematodos constituyen los más numerosos metazoas del suelo y se ubican en cinco grupos funcionales: cp-1, cp-2, cp-3, cp-4 y cp-5 [Bongers y Bongers, 1998]. Se correlacionan con estados sucesionales de la vegetación como respuesta a los cambios físicos y químicos del ambiente edáfico [Hu y Cao, 2008]. Hay los de estrategias r o colonizadores, que son pequeños, numerosos, capaces de sobrevivir bajo condiciones edáficas extremas; y los k o persistentes, de mayor tamaño, escasos, incapaces de sobrevivir en ambientes extremos [Bongers y Bongers, 1998]. A pesar de su alta abundancia en los suelos de las selvas, se desconoce en gran medida su diversidad en México. Se analizó la diversidad de géneros de la comunidad de nematodos en suelos de una selva alta perennifolia en Calakmul, Campeche, México. El estudio se realizó durante marzo de 2011, en la temporada de secas en la selva alta perennifolia de la Reserva de la Biosfera de Calakmul (18º18’47" N y 89º51’48" O, 240 m altitud) Campeche, México. La precipitación y la temperatura media anual son de 1400 mm y 25 °C, respectivamente. La riqueza de especies de plantas estimada es de 1569 a 1600 [Ballina et al., 2008]. En dos selvas con > 50 y < 15 años de conservación se trazó un par de transectos de 20 m y se colectaron 10 muestras de suelo separadas cada 5 m. Se registró la densidad de plantas ≥ 100 cm de altura dentro de 1 m2, donde también se colectaron 200 g de suelo a una profundidad de 10-20 cm. Se obtuvieron cuatro submuestras homogeneizadas para asegurar la colecta de nematodos, ya que algunas veces los espacios del suelo de las plantas no sostienen altas densidades de ellos. La extracción de nematodos se realizó mediante el método de extracción tamizado-centrifugado, luego se Recibido: 13/4/2012 Aceptado: 11/6/2012 97 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Ballina et al. mataron y fijaron, y se identificaron a nivel de género [Desgarennes et al., 2009]. Se realizaron pruebas de T para analizar la densidad de plantas, la diversidad de Shannon-Wiener (H’) y la dominancia entre selvas (D), todas con SPSS 20 y Species Diversity & Richness. Se corroboró que se cumplieran los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas. La riqueza de géneros con el procedimiento no paramétrico Bootstrap, con EstimateS 7.5.2. Se realizó un análisis de tablas de contingencia de 5 x 2, usando los grupos funcionales como filas y las edades (selva > 50 y < 15 años) como columnas, con SPSS 20. La densidad de plantas fue mayor en la selva > 50 años de conservación (media ± e.e.) 5 ± 0.8 que en la < 15 años, 2,4 ± 0,61 (gl = 18; t = 2,56; P = 0,01). Se encontraron 259 nematodos pertenecientes a siete géneros de seis familias (Tabla). En la selva > 50 años los más abundantes fueron Helicotylenchus, Mononchus y Tylenchus. Por su parte, en la selva <15 años fueron Aphelenchus, Rhabditis y Helicotylenchus. En áreas cultivadas se encontró que géneros de nematodos fitoparásitos como Aphelenchus y Mononchus son más abundantes conforme el tiempo de conservación de un área es menor, a diferencia de Helicotylenchus y Rhabditis, encontrados en la selva con mayor tiempo de conservación [Gallegos et al., 2009]. Interesantemente solo Helicotylenchus (de hábitos fitoparásitos) se ha reportado previamente para selvas tropicales en Costa Rica, aunque no como género dominante [Powers et al., 2009]. Nematodos registrados en una selva alta perennifolia de Campeche, México Género Familia Abundancia/selva (años) > 50 < 15 Actinolaimus Dorylaimidae 5 0 Aphelenchus Aphelenchoididae 9 Dorylaimus Dorylaimidae Helicotylenchus Grupo alimenticio Grupo funcional Depredadores** cp-4 121 Micófagos* cp-2 7 0 Omnivoros* cp-4 Hoplolaimidae 53 10 Fitoparásitos* cp-3 Mononchus Mononchidae 21 0 Depredadores* cp-4 Rhabditis Rhabditidae 0 18 Bacteriófago** cp-1 Tylenchus Tylenchidae 16 0 Asociados a plantas* cp-2 111 149 Total * : Yeates et al. (1997), ** : Azpilicueta et al. (2008). La diversidad de géneros de nematodos fue mayor en la selva > 50 años 1,02 ± 0,02 en comparación a la de < 15 años con 0,38 ± 0,1 (gl = 6; t = 5,96; P = 0,001). El índice de dominancia de Simpson fue mayor en la selva > 50 años que en la de < 15 años con 2,84 ± 0,14 y 1,38 ± 0,19, respectivamente (gl = 6; t = 6,3; P = 0,001) (Fig.), lo cual indicó un incremento de la dominancia de géneros en la selva < 15 años (valores cercanos a 1 indican baja diversidad y alta dominancia) [Magurran, 2009]. Los resultados de la nematofauna por sí mismos concuerdan con registros previos de mayor diversidad en selvas más conservadas [Eisenhauer et al., 2011], y no cuando se analizan en conjunto con la densidad de plantas. Esto llama la atención, ya que comúnmente selvas muy conservadas presentan menor densidad de árboles debido al incremento en la dominancia vegetal, y como resultado, una disminución en la riqueza de especies de plantas [Moreno y Halfter, 2000]; sin embargo, habría que tener en cuenta que úni98 camente se registraron las plantas > 100 cm de altura, anulando la densidad de plantas menor a esta altura, que generalmente se encuentran en alta proporción en selvas con menor tiempo de conservación. Los grupos funcionales fueron dependientes de la edad de la selva (gl = 3, x2 = 140,9; P < 0,0001), y fueron los más abundantes el cp-2 de los micófagos con el 50 % y el cp-3 de los fitoparásitos con el 24 % de la abundancia total en ambos sitios de selva (Tabla). La riqueza específica estimada fue de 8,27, lo que indica un adecuado esfuerzo de muestreo del 85 % [Moreno y Halfter, 2000]. No obstante, son necesarios más muestreos y abarcar otros posibles hábitats como la hojarasca y el sotobosque; asimismo, considerar la temporada de lluvias por la importancia que podría implicar. Este trabajo presenta un primer estudio sobre la diversidad de nematodos del suelo en selvas tropicales de México. Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Diversidad de Shannon-Wiener (H’) (A) y dominancia de Simpson (D) (B) para los géneros de presentes en dos sitios de selva de diferente edad en una selva alta perennifolia, Campeche, México. (**: Indican diferencias significativas a p = 0,001). REFERENCIAS en la zona productora del Cofre de Perote, Veracruz, México», Revista Mexicana de Biodiversidad 80: 611-614, México, 2009. Azpilicueta, C. V.; M. C. Arauni; P. D. Reeb; E. E. Sánchez: «Estructura de la comunidad de nematodos del suelo bajo dos niveles de fertilización nitrogenada en alto valle de Río Negro, Argentina», Nematropica 38 (1): 75-86, EE.UU., 2008. Eisenhauer, N.; V. Migunova; M. 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Facultad de Ciencias, departamento de Biología [email protected] 1 RESUMEN ABSTRACT El conocimiento del transcriptoma y su regulación es fundamental para la interpretación articulada de los diversos constituyentes moleculares que integran la red de respuesta génica ante un determinado evento inductor, como los que se presentan en interacciones planta-patógeno. La actual tecnología de secuenciación ha llevado al desarrollo del RNA-seq como herramienta transcriptómica que permite el secuenciamiento masivo de ADNc o ARN, y hace posible obtener perfiles de expresión génica de las respuestas de defensa, lo cual ofrece grandes posibilidades para profundizar en el entendimiento de los mecanismos que se activan durante las respuestas inmunes en plantas. El RNA-seq ha cambiado la manera de cómo se estudian los transcriptomas, y ha permitido identificar y cuantificar nuevos y conocidos transcriptos relacionados con defensa vegetal. Aquí se presenta el principio, aplicaciones y ventajas del RNA-seq; además se discuten trabajos recientes que revelan la importancia y utilidad de esta herramienta en estudios de interacciones planta patógeno. The knowledge gained from transcriptome and its regulation is essential to articulate the constituents that make up the molecular network of response gene induction for a certain event, such as those occurring in plant pathogen interactions. The current sequencing technology has led to the development of RNA-seq as a tool that enables mass sequencing of cDNA or RNA, making possible to obtain gene expression profiles for defense responses, which offers great potential to deepen the understanding of mechanisms that are activated during immune responses in plants. RNA-seq is changing the way of how we used to study the transcriptome and has helped identify and quantify new and known plant defense related transcripts. Here, it has present the basis, applications and advantages of RNA-seq, also are discussed recent studies that have revealed the importance and usefulness of this tool for studies of plant pathogen interactions. Key words: cDNA, sequencing, phytopathology Palabras claves: secuenciación, ADNc, fitopatología INTRODUCCIÓN Celularmente la información genética cifrada en el ADN y contenida en los genes se expresa a través de los mecanismos de transcripción y traducción, a partir del cual se producen moléculas de ARNm y proteínas, respectivamente. Eventos celulares tales como la replicación, la diferenciación y la división celular y otros caracteres macroscópicos tales como rasgos fenotípicos, morfológicos, funcionales y de respuesta ante estímulos son producto de la expresión diferencial de genes. En plantas, el control de la respuesta frente a estados de estrés biótico y abiótico está dado por la actividad transcripcional de activación o represión de genes [Proudfoot et al., 2002]. La transcripción es un proceso nuclear cuya activación depende de estímulos intra o extracelulares que activan cascadas de señalización para determinar cuáles genes deben expresarse o reprimirse de acuerdo con el tipo de estímulo inicial. La regulación de la transcripción depende de la unión de activadores o represores en los elementos del promotor ubicados en la región 5’ de la secuencia codificante. Los activadores o represores dictaminan la tasa de síntesis de ARNm que debe producir la ma- Recibido: 6/3/2012 Aceptado: 31/7/2012 101 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Soto y López quinaria basal de transcripción, la cual está constituida por los factores de transcripción generales (GTFII) y la ARN polimerasa II [Proudfoot et al., 2002]. La cantidad de moléculas producidas de determinado ARNm depende de la función que este tenga en un proceso celular específico. Así, cuando se requiera dar respuesta a una condición determinada en la cual un gen tiene una participación importante, más moléculas de este transcrito se producirán. De manera similar, bajo ciertas circunstancias particulares hay genes que permanecen apagados, pero un estímulo hace que se expresen y se inicia entonces la transcripción. De esta manera la determinación de dónde, cómo y cuándo es generado un transcripto, bajo una condición dada, es fundamental para el entendimiento de la actividad biológica de un gen. Más aún los niveles de ARNm pueden dar no solo una visión clara de patrones de expresión, sino también cuantificaciones altamente correlacionadas entre cambios en la abundancia de ARNm con cambios en la abundancia de proteínas [Lockhart y Winzeler, 2000]. En conjunto, todos los transcriptos derivados de genes que se producen en una célula en un momento y bajo una condición fisiológica determinada se denomina transcriptoma. El estudio y análisis del transcriptoma es esencial para el entendimiento de la función de genes. De manera general se puede establecer que si un gen se expresa en una condición o célula determinada es porque cumple allí una función. El estudio global del transcriptoma permite también establecer patrones de regulación génica coordinada, lo que contribuye no solo a dilucidar la función y agrupamiento de varios genes bajo un estímulo o condición específica, sino también a identificar elementos promotores comunes a varios genes. En la década de los noventa, los northern blots, los microarreglos de ADNc (ADN complementario obtenido por transcriptasa inversa a partir de ARNm), los cDNAAFLP y el análisis serial de expresión de genes SAGE (del inglés serial analysis of gene expression), entre otras técnicas, permitieron el desarrollo y generación de conocimiento en transcriptómica, al estudiar la expresión de genes relacionados con respuestas a estímulos o a condiciones particulares, así como para determinar cambios en los patrones de expresión génica en tratamientos y cinéticas de expresión [Shalon et al., 1996; Schena et al., 1998; Meyers et al., 2004; Marguerat y Bahler, 2010]; sin embargo, estas estrategias resultan limitantes al estar basadas en hibridación, tener baja cobertura, y en algunos casos necesitar algún conocimiento previo 102 de la secuencia del genoma para su implementación [Ward et al., 2012]. Actualmente, y gracias a los avances en las técnicas de secuenciación del ADN, a través de tecnologías de nueva generación, NGS (del inglés Next Generation Sequencing), se han revolucionado campos como los de la genómica y la transcriptómica. Estas tecnologías han permitido no solo generar información con altos rendimientos y a bajo costo, sino también abrir nuevos horizontes para el entendimiento detallado y global de procesos de expresión génica [Mochida y Shinozaki, 2011; Schneeberger y Weigel, 2011; Ward et al., 2012]. La caracterización completa y el análisis global de la expresión génica en una célula o tejido, aun sin ninguna información genómica previa, es ahora posible a través de la implementación de la secuenciación de ADNc, o más recientemente de la secuenciación directa de ARN, tecnología conocida como RNA-seq [Wang et al., 2009; Garber et al., 2011; Egan et al., 2012; Ward et al., 2012]. Esta herramienta transcriptómica cambia la manera de cómo se analizan y comprenden los transcriptomas [Wang et al., 2009]. Además, el RNAseq da una cobertura completa de transcriptos, genera información no solo de la secuencia, sino también de la estructura de exones y posibles eventos de splicing alternativo [Lister et al., 2009; Gulledge et al., 2012]. La información de esta manera puede ser integrada e interpretada, y se constituye de gran utilidad para vislumbrar procesos biológicos y mecanismos de coexpresión. En el poco tiempo que esta tecnología se encuentra disponible se han desarrollado un grupo relativamente amplio de investigaciones dirigidas a caracterizar y a cuantificar transcriptomas, así como a comprender los mecanismos de la variación de la expresión génica. Las aplicaciones de RNA-seq se han llevado a cabo en especies eucariotas tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster, el ratón y el humano [Nagalakshmi et al., 2008; Mortazavi et al., 2008; Maher et al., 2009; Pickrell et al., 2010; Gan et al., 2010; Daines et al., 2011; Peng et al., 2012], lo que ha demostrado la alta aplicabilidad que el RNAseq ha tenido en estudios de especies modelo. Recientemente la tecnología de RNA-seq también se ha implementado para estudios de transcriptomas vegetales. Los estudios de RNA-seq en plantas ha permitido, por ejemplo, la identificación de genes expresados frente a tratamientos de vernalización y respuesta a Fitosanidad 16(2) agosto (2012) giberelinas en remolacha azucarera [Mutasa-Gottgens et al., 2012] y en respuesta a estrés hídrico y calor [Gulledge et al., 2012]. La información generada por RNA-seq también se ha explotado para la identificación de SNP (del inglés single nucleotide polimorphism) en uva y arroz [Zenoni et al., 2010; Lu et al., 2010] y para la detección de variantes de splicing alternativo durante el desarrollo del fruto de uva y en Arabidopsis [Zenoni et al., 2010; Gulledge et al., 2012]. También se ha constituido en una herramienta fundamental para ayudar en la anotación de genes [Lu et al., 2010]. Lo anterior muestra la utilidad y posibilidades que esta herramienta transcriptómica tiene y su aplicación bajo diferentes enfoques investigativos. Tecnología RNA-seq El RNA-seq es una herramienta transcriptómica actual que está fundamentada en la secuenciación de ADNc basada en los desarrollos NGS. En esta tecnología se captura el ARN total o ARNm, el cual se fragmenta y convierte en una librería de ADNc. Uno de los pasos fundamentales es la obtención de un ARN de buena calidad que represente todos los transcritos que se producen en la condición y tejido de estudio. Para el aislamiento del ARN con frecuencia se emplean kits de extracción de ARNm, que aplican la captura a partir de la cola poly(A) [Ward et al., 2012]. La fragmentación del ARN o del cDNA se realiza o bien por nebulización, por digestión con enzimas de restricción o a través del uso de cationes divalentes bajo condiciones de presiones elevadas [Wang et al., 2009]. Generalmente el fraccionamiento se realiza posteriormente a la síntesis de ADNc. Esta síntesis se realiza con procedimientos estándares bien establecidos para la mayoría de organismos que hacen uso de la enzima transcriptasa reversa. Una vez obtenido el ADNc se ligan adaptadores de tal forma que cada fragmento generado contendrá un adaptador ligado en sus extremos 3´y 5´. Las secuencias de estos adaptadores se conocen y serán necesarias para que cada fragmento pueda ser secuenciado, y en algunos casos pueden emplearse para diferenciar otros grupos de fragmentos obtenidos a partir de muestras de ADNc diferentes; sin embargo, no en todos los casos se requiere la ligación de adaptadores, lo cual dependerá de la plataforma de secuenciación a emplear. Los adaptadores se pueden ligar directamente a la muestra de ARN, previa síntesis de ADNc [Core et al., 2008; Marguerat y Bahler, 2010], o alternativamente se pue- den adicionar directamente a la cadena sencilla de ADNc [Maher et al., 2009; Marguerat y Bahler, 2010]. En cuanto a la cantidad y concentración del ARNm que se requiere para la tecnología RNA-seq, el rango está actualmente entre 5 y 10 μg, con una concentración alrededor de 500 ng/μl [Ryan Kim, UC Davis Genome Center; Nong Chen, Business Development Director, BGI Americas, comunicación personal]. Por otro lado, dentro de las aplicaciones y ventajas que tiene la tecnología RNA-seq está que da una cobertura completa de transcriptos, genera información tanto de la secuencia como de la estructura de exones y sitos de splicing alternativo [Lister et al., 2009; Gulledge et al., 2012]. Asimismo, los datos arrojados por RNA-seq tienen una alta precisión con respecto a los niveles de expresión génica que se obtienen a través de PCR (del inglés polimerase chain reaction) cuantitativa (qPCR) [Nagalakshmi et al., 2008; Wang et al., 2009; Ward et al., 2012]. Además, también se ha mostrado que los resultados son altamente reproducibles [Wang et al., 2009]. Plataformas y estrategias de secuenciación para RNA-seq La tecnología RNA-seq actualmente está disponible comercialmente en las compañías Roche/454, Solexa/ Illumina, SOLiD/Life Technologies y Helicos/ BioSciences; sin embargo, de las tecnologías de NGS disponibles las más aplicadas son Roche/454 y Solexa/ Illumina [Strickler et al., 2012]. No obstante, estas compañías y otras no cesan en la búsqueda de mayores rendimientos de secuenciación, obtención de lecturas más largas que se lleven a cabo en tiempo real y cada vez a costos más bajos [Metzker, 2010; Mardis, 2011]. Roche/454 Roche/454 es una tecnología que emplea el secuenciador 454-Genome-Sequencer FLX, desarrollado en 2005. Este fue el primer sistema comercial de NGS. Su principio se basa en la piro-secuenciación o detección de pirofosfato descrita en la década de los ochenta [Nyrén y Lundin, 1985]. En esta tecnología se incorporan adaptadores a los extremos de los fragmentos de cadena simple de ADN o ADNc, los cuales serán adheridos a microperlas que contienen en la superficie oligonucleótidos complementarios a las secuencias de los adaptadores. Posteriormente se lleva a cabo una PCR en emulsión para la amplificación de los fragmentos. El objetivo de esta amplificación es la obtención de un 103 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Soto y López gran número de moléculas idénticas que producirán altas intensidades de señal en cada lectura (Fig.) [Ansorge, 2009; Mardis, 2011; Egan et al., 2012]. Al finalizar la amplificación se lleva a cabo una denaturación, y las microperlas son transferidas a pozos en un chip de fibra óptica, en donde se incuban con las enzimas ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa, así como con los sustratos luciferina y adenosin-5-fosfosulfato (APS). Posteriormente sobre el chip se adiciona un deoxinucleótido particular (dNTP); así cuando la ADN polimerasa incorpore el dNTP a la cadena naciente se liberará pirofosfato. Este pirofosfato proviene de la formación del enlace fosfodiéster y es convertido a adenosin trifosfato (ATP), en presencia de la APS. El ATP así producido reaccionará con la enzima luciferasa en presencia de luciferina para generar oxiluciferina y producirse luz en proporciones equivalentes a las cantidades de ATP producidas. La emisión de luz será detectada por una cámara CCD (dispositivo de carga acoplada, del inglés charge coupled device). Finalmente, la apirasa removerá el ATP y dNTPs no incorporados. Una vez realizado esto, se repite el ciclo con un nuevo dNTP [Nyrén y Clifton 2007; Ansorge, 2009; Egan et al., 2012]. Actualmente Roche/454 ofrece el servicio de secuenciación para RNA-seq con su más reciente secuenciador, el sistema SG FLX+. Con esta tecnología es posible obtener lecturas de hasta 1000 nucleótidos; sin embargo, la cobertura es baja, alrededor de 2,5 millones de lecturas o reads por corrida (454/Roche sequencing contact, comunicación personal). Illumina Por su parte, Solexa/Illumina se basa en el principio de amplificación en puente y el uso de marcaje por fluorescencia de nucleótidos modificados como terminadores reversibles (Fig.) [Metzker, 2010]. En esta tecnología, uno de los adaptadores de los extremos de los fragmentos de ADN o ADNc se liga complementariamente a oligonucleótidos adheridos a una superficie sólida o flow cell. Estos oligonucleótidos harán las veces de primers o cebadores sentido o antisentido, y crean puentes que favorecen la amplificación. Los amplicones permanecerán adheridos y luego de una denaturación formarán otro puente para permitir la amplificación. Estos pasos se repiten hasta generar millones de grupos o clusters de un fragmento determinado. Una vez formados estos grupos se desnaturalizarán nuevamente para iniciar la polimerización o 104 síntesis de cada fragmento, y se introduce esta vez en la mezcla de síntesis cuatro nucleótidos marcados 32 O –azidometil o terminadores reversibles [Ju et al., 2006; Guo et al., 2008; Metzker, 2010]. Los terminadores reversibles (dideoxinucleótidos) detendrán la síntesis de ADN una vez la ADN polimerasa integre a la cadena naciente el nucleótido correspondiente. Seguido de la síntesis, los fluoróforos de los terminadores reversibles integrados a la cadena naciente son activados por un láser. La emisión de luz será diferencial de acuerdo con el nucleótido incorporado. La información será registrada y almacenada. Una vez hecha la detección, un lavado retira los dideoxinucleótidos no integrados y enzimáticamente es cortado el terminador para que así un nuevo ciclo permita la incorporación del siguiente nucleótido [Metzker, 2010; Egan et al., 2012]. Cada flow cell de Illumina contiene ocho carriles o lanes. Cada uno de ellos en la actualidad tiene un rendimiento de 150 millones de lecturas o reads. La longitud de las lecturas generadas es pequeña, del rango de 50-100 nucleótidos, las cuales pueden ser lecturas sencillas desde un solo extremo, SE (del inglés single end sequencing reads) o bien lecturas desde ambos extremos PE (del inglés pair end sequencing reads) [Wang et al., 2009; Garber et al., 2011]. Aunque las longitudes sean cortas, el alto número de lecturas generadas incrementarán la cobertura y permitirá extender la secuencia hasta poder, en algunos casos, obtener la secuencia de todo el transcripto. Además, cada lane tiene una capacidad para 24 muestras o librerías de ADNc; sin embargo, entre mayor es el número de muestras que se ubiquen en cada lane de Illumina, los millones de lecturas por muestra disminuirán. En el caso en el que se desee potencializar la técnica a través de la obtención de un mayor número de lecturas por muestra, el uso de réplicas biológicas es adecuado [Ryan Kim, UC Davis Genome Center y Veridiana Cano, Illumina, comunicación personal]. El número de millones de lecturas deseables dependerá de varios factores. Uno de ellos es la disponibilidad de un genoma de referencia que facilitará el ensamblaje de las lecturas. Otro factor importante es la información sobre el número de genes de la especie, pues lo que se busca es tener representado en miles de lecturas cerca de la totalidad de genes expresados. Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Secuenciación directa de ARN-Tecnología Helicos Helicos/BioScience fue el primer sistema comercial en disponer de una tecnología de secuenciamiento por síntesis capaz de secuenciar una molécula sencilla [Harris et al., 2008; Thompson y Milos, 2011]. Más aún, esta compañía ha desarrollado un método de secuenciación directo de ARN o DRS (del inglés direct RNA sequencing), sin necesidad de la previa conversión de ARN a ADNc, método que fue reportado por primera vez en transcriptos de Saccharomyces cerevisiae y que aún está en perfeccionamiento [Ozsolak et al., 2009; Lipson et al., 2009; Levin, et al., 2010; Ozsolak y Milos, 2011]. La secuenciación directa de ARN podría disminuir alguno de los inconvenientes que se pueden presentar durante la conversión de ARN a ADNc. Uno de los problemas más frecuentes es la obtención de ADNc quimérico, en donde la cadena naciente se puede disociar del molde ARN y posteriormente realinear a una cadena diferente de ARN con una secuencia similar, e iniciar la síntesis de nuevo [Mardis, 2011; Ozsolak y Milos, 2011]; sin embargo, hasta que la tecnología DRS no se establezca ampliamente, la obtención de librerías ADNc para RNA-seq seguirá de líder. Secuenciamiento masivo de ADNc, RNA-seq, por las tecnologías NGS Illumina y 454. a: Tecnología de secuenciación 454, basada en el principio de PCR en emulsión y piro-secuenciación; b: Tecnología de secuenciación Illumina basado en el principio de amplificación en puente y uso de marcaje por fluorescencia de terminadores reversibles. 105 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Soto y López Estrategias y consideraciones para experimentos RNA-seq Independiente de la plataforma de secuenciación a usar, es recomendable que cada muestra o librería contenga patrones de reconocimiento llamados códigos de barra o barcodes, lo que permitirá maximizar el número de muestras a ubicar en un solo lane. Esta estrategia es conocida como barcoding o multiplex. Cada barcode es una secuencia corta, alrededor de cinco o seis nucleótidos, que caracteriza cada muestra o librería de ADNc. Esta secuencia generalmente está ubicada contigua a la secuencia del adaptador en el fragmento de ADNc [Strickler et al., 2012]. Los barcodes son muy útiles, ya que permiten no solo diferenciar las muestras, sino también que hacen más eficiente el uso de cada lane. Los barcodes deben diseñarse uno por cada muestra o librería de ADNc. Aunque las compañías de secuenciación ofrecen secuencias prediseñadas y probadas, el diseño debe ser cuidadoso. Algunas de las recomendaciones es que los dos primeros nucleótidos no pueden ser iguales de un barcode a otro; además, un barcode no puede ser la secuencia reversa complementaria del otro, ni tampoco pueden ser secuencias palíndromas. Al hacer uso del barcoding se debe tener en cuenta que el tamaño de cada lectura de los transcriptos se reducirá en aproximadamente 18 nucleótidos, pues en el ensamblaje de estas se eliminarán tanto las secuencias de los adaptadores como las de los barcodes [Strickler et al., 2012]. Una vez revisadas de manera general las tecnologías de secuenciación para RNA-seq, surge la pregunta de cómo escoger la plataforma de secuenciación apropiada para un proyecto RNA-seq. A partir de la premisa de similitud en cuanto a rendimiento, precisión y capacidad de las lecturas desde ambos extremos del ADNc (3´y 5´), y que actualmente las tecnologías con mayor demanda son Roche/454 y Solexa/Illumina, el punto crítico para la respuesta dependerá de cuál es la longitud de las lecturas que se desea obtener, así como si se cuenta o no con un genoma referencia e indudablemente del presupuesto con el que se disponga, pues en términos generales, el costo por base es menor con la tecnología Illumina. Un lane de Solexa/Illumina para RNA-seq en la actualidad tiene un costo cercano a los 3000 dólares. Como se mencionó anteriormente, Roche/454 produce lecturas más largas con respecto a Solexa/Illumina; sin embargo, cuando el propósito es realizar ensamblaje de Novo, es decir, sin genoma de referencia, lo más reco106 mendable es obtener lecturas más largas con el fin de facilitar el ensamblaje. En este caso Roche/454 sería de gran utilidad; no obstante, es necesario considerar que el número de lecturas obtenidas no será muy alto. Si se dispone de un presupuesto cuantioso se puede realizar un elevado número de lecturas, lo que facilitará el ensamblaje. Alternativamente, si se cuenta con un genoma referencia, las lecturas cortas obtenidas con Illumina pueden ser la mejor opción, ya que no es necesario ensamblar el transcriptoma completo y el alto número de lecturas que se generan darán mayor confiabilidad a los datos para la cuantificación de la expresión y para otros fines como la detección de polimorfismos [Ozsolak y Milos, 2011]. Para el ensamblaje de las lecturas existe una amplia diversidad de programas bioinformáticos disponibles. Hay programas especializados en la eliminación de barcodes, eliminación de ruido, etc. Si se trata de un ensamblaje de Novo, las lecturas serán ensambladas a partir de contigs, es decir, en secuencias sobrelapadas, de allí la importancia de tener secuencias más largas. Algo importante de este tipo de ensamblaje es que es posible encontrar transcriptos que pueden no estar representados en el genoma, como por ejemplo eventos de splicing alternativo o genes que no se expresan bajo la condición de estudio [Strickler et al., 2012]. Dentro de los programas bioinformáticos aplicados al ensamblaje y análisis de RNA-seq se encuentra por ejemplo Scriptuture, desarrollado en el Massachusetts Institute of Technology. Este se ha empleado para el estudio del transcriptoma de ratones [Guttman et al., 2010]. Trinity es otro programa ampliamente usado, el cual fue desarrollado por Broad Institute y la Hebrew University of Jerusalem, que permite la reconstrucción de transcriptos, reconoce eventos de splicing alternativo y es especializado en análisis de muestras que no tienen genoma de referencia [Grabherr et al., 2011]. El programa R ya ha diseñado un paquete estadístico, denominado DEGseq, dirigido al análisis de la expresión diferencial entre muestras y tratamientos [Wang et al., 2010]. Además de estos, actualmente existen muchos otros programas útiles, probados y de acceso gratuito [Ward et al., 2012]. Uno de los objetivos al emplear la tecnología de RNAseq no es solo identificar la presencia de transcriptos, sino la de cuantificar el nivel de expresión de cada uno. En este sentido aquellas lecturas que se encuentren en alta proporción representarán niveles altos de expre- Fitosanidad 16(2) agosto (2012) sión de determinado gen y aquellos transcriptos ausentes, o con un bajo número de lecturas, serán aquellos que o no se expresan o lo hacen a niveles muy bajos [Schenk et al., 2012]. En algunos casos se realizan normalizaciones químicas en las librerías ADNc con el fin de igualar su abundancia. De esta manera aquellos transcriptos altamente expresados no serán los únicos para los que se obtengan lecturas en la secuenciación [Ward et al., 2012]. Para este fin existen comercialmente diferentes kits, y por lo general están asociados con cada plataforma de secuenciación. En otras situaciones lo que se desea es comparar el perfil de expresión génica entre diferentes muestras que pueden corresponder a tratamientos, tejidos o condiciones. Para los análisis de las lecturas generadas por RNAseq es muy frecuente el uso de varios parámetros estadísticos. Uno de ellos es el RPKM (del inglés reads per kilobase of exon per million mapped reads). Con este parámetro es posible cuantificar niveles de transcriptos, y facilita la comparación entre muestras [Mortazavi et al., 2008]. Otro parámetro útil y muy usado es el fold change de las lecturas que corresponde a la división del número de lecturas generadas para un gen particular en una muestra vs. el de la otra. Al estimar este parámetro es posible correlacionar la expresión de un gen en dos condiciones distintas, así como establecer radios de expresión génica diferencial entre tratamientos [Auer y Doerge, 2010]. RNA-seq y sus aplicaciones enfocadas al estudio de interacciones planta-patógeno Dentro de los retos de la fitopatología están el detallar cómo los patógenos son reconocidos por sus hospederos y cómo se establecen interacciones de resistencia y susceptibilidad. En este sentido la biología molecular y la bioinformática, así como el estudio de la expresión génica en eventos de patogenicidad han contribuido de manera importante [Verhage et al., 2010; Lodha y Basak, 2012; Schenk et al., 2012]. Actualmente el entendimiento molecular que se tiene de las interacciones planta-patógeno ha permitido desarrollar un modelo de la función y evolución de la inmunidad vegetal [Jones y Dangl, 2006]. Según este modelo denominado zigzag, el primer evento o fase de la respuesta de resistencia consiste en la capacidad de reconocimiento de moléculas conservadas en los microorganismos conocidas como PAMP (del inglés pathogen associated molecular patterns) o MAMP (del inglés microbe-associated molecular patterns). Dentro de las moléculas reconocidas de este tipo, las más estudiadas son la flagelina (flg22) [Felix et al., 1999; Chinchilla et al., 2006], el factor de elongación Tu (EF-Tu) [Zipfel et al., 2006], los lipopolisacáridos (LPS) y la quitina [Kaku et al., 2006]. El reconocimiento de PAMP depende de proteínas denominadas PRR (del inglés pathogen recognition receptors), las cuales son proteínas de reconocimiento ubicadas generalmente en la membrana plasmática de la célula vegetal [Gómez-Gómez y Boller, 2000; He et al., 2007; Boller y Yang He, 2009; Zipfel, 2009; Thomma et al., 2011]. El primer PRR identificado y más estudiado es el receptor de flg22, denominado FLS2, el cual es una proteína transmembranal con un dominio extracelular rico en repeticiones de leucinas (LRR, leucine rich repeats) y un dominio serina/treonina kinasa intracelular, posiblemente encargado de la comunicación de la señal. La proteína FLS2 es clasificada como un receptor con actividad kinasa (RLK, Receptor-Like Kinase) [GómezGómez y Boller, 2000; Asai et al., 2002]. No fue hasta el 2006 cuando se hizo posible la clonación del receptor EFR que reconoce al PAMP EF-Tu, el cual también es de tipo RLK [Zipfel et al., 2006]. Esta primera respuesta basada en la interacción entre PAMP-PRR es denominada como inmunidad mediada por PAMP o PTI (PAMP triggered immunity). Este tipo de inmunidad generalmente detiene la infección antes de que el microorganismo comience su multiplicación y es suficientemente efectiva contra patógenos potenciales no adaptados [Chisholm et al., 2006]. Una vez que se da la percepción del ligando por parte de los PRR se desencadena una cascada de señalización mediada principalmente por MAP Kinasas (del inglés mitogen associated protein kinase) [Gohre y Robatzek, 2008; Colcombet y Hirt, 2008; Beckers et al., 2009], que finaliza con la activación de factores de transcripción, lo que conlleva a una reprogramación en la expresión génica. Por ejemplo, en Arabidopsis se ha establecido que la inducción de la expresión de los genes FRK, At2g17740 y WRKY22/29 es un criterio diagnóstico de la activación de la PTI [Asai et al., 2002; Shan et al., 2008]. Adicionalmente estas respuestas están asociadas con eventos de apertura de canales iónicos en la membrana plasmática, producción de especies reactivas de oxígeno y fortificación de paredes celulares a través de la deposición de callosa [Buchanan et al., 2000; Zipfel, 2008; 2009]. Durante la evolución, un grupo particular de patógenos desarrolló un tipo especial de proteínas denominadas 107 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Soto y López efectoras, que al ser inyectadas al interior de las células de las plantas hospederas bloquean la PTI y logran una colonización exitosa [Jones y Dangl, 2006]. Este tipo de interacciones se denominan compatibles, y el resultado para la planta es el desarrollo de la enfermedad. Según el modelo zigzag propuesto, este tipo de interacciones cae bajo el concepto de ETS (del inglés effector triggered susceptibility); sin embargo, las plantas frente a esta situación desarrollaron una segunda rama de la inmunidad basada en el reconocimiento de proteínas efectoras del patógeno, tercera fase del modelo zigzag. Esta inmunidad es denominada como ETI (del inglés effector triggered immunity). La ETI depende de la presencia de proteínas de resistencia que pueden reconocer, de manera directa o indirecta, efectores. Este reconocimiento desencadena una reacción de incompatibilidad o resistencia [Chisholm et al., 2006; Jones y Dangl, 2006; Dodds y Rathjen, 2010]. De manera similar a la PTI, parte de las respuestas desencadenadas durante la ETI incluyen la reprogramación de la expresión génica. El estudio de esta reprogramación permite conocer los mecanismos moleculares de respuesta, y es susceptible de ser estudiada mediante la técnica RNA-seq. La inducción de varios genes importantes para la defensa vegetal se ha identificado durante las respuestas ETI. Producto de la expresión de estos genes se encuentran las proteínas PR (del inglés pathogenesis-related proteins) [Loon y Strien, 1999]. Algunas proteínas codificadas por estos genes PR tienen actividad quitinasa y glucanasa. En la cascada de señalización que lleva a la transcripción de estos genes, el ácido salicílico SA (del inglés salycilic acid) y el etileno desempeñan una función reguladora y sinérgica. Asimismo, se ha encontrado que la activación de grupos de genes PR puede ser mediada por patógenos a través de un mecanismo llamado resistencia sistémica adquirida o SAR (del inglés systemic acquired resistance). Para que este mecanismo ocurra, la infección inicial debe resultar en una lesión necrótica, como parte de una respuesta hipersensible o HR (del inglés hypersensitive response). La activación de SAR produce una reducción de los síntomas de la enfermedad ante un siguiente ataque del patógeno e incluso algunos otros tipos de patógenos no relacionados con el de la primera infección [Durrant y Dong, 2004]. Las proteínas PR son una gran familia, y aunque muchas de ellas fueron inicialmente encontradas en tabaco y en Arabidopsis, su inducción por patógenos se ha reportado en diversas especies vegetales [Loon y Strien, 108 1999]. Más aún, su reconocida actividad de defensa ante eventos de patogénesis ha convertido a estos genes PR en genes marcadores de defensa, y ha hecho que la medición de los niveles de su expresión sea ampliamente utilizada en estudios de interacciones planta-patógeno [Slaughter et al., 2012; Zhang et al., 2012]. La reprogramación de la expresión génica durante las reacciones de PTI, ETS y ETI ha sido bastante estudiada en diferentes patosistemas a través de la aplicación de microarreglos o cDNA-AFLP (del inglés amplified fragment length polymorphism). En el modelo Arabidopsis, a través del estudio de perfiles de expresión de ARNm con microarreglos y frente a interacciones con P. syringae, fue demostrado que las respuestas entre interacciones compatibles (bacteria virulenta), incompatibles (bacteria avilurenta) y no hospedero (P. syringae pv. phaseolicola), son similares, y que las diferencias en expresión encontradas son cuantitativas en cuanto a la intensidad y en la rapidez con la que se producen; sin embargo, la respuesta vegetal en la interacción incompatible es robusta en términos de altos niveles de expresión de los genes de resistencia RPS2 y RPM1, los cuales activan la respuesta mediada por los genes avr avrRpt2 y avrB, avrRpm1 de P. syringae [Tao et al., 2003]. Asimismo, el empleo de microarreglos contribuyó a la identificación del receptor EFR que reconoce el PAMP Ef-Tu [Zipfel et al., 2006]. También recientemente esta técnica permitió profundizar en el entendimiento de la actividad de las citoquininas en la inmunidad vegetal, y puso en evidencia que este fitorregulador regula positivamente el incremento de las respuestas de defensa mediada por ácido salicílico y más aún, que este último tiene una retroalimentación negativa al inhibir la señalización de citoquininas [Argueso et al., 2012]. De manera más general los microarreglos han permitido el estudio de la reprogramación génica en Arabidopsis en respuesta a virus [Whitham et al., 2003], a hongos [Ramonell et al., 2002] e incluso a nematodos [Puthoff et al., 2003]. También se han empleado microarreglos de papa para el estudio de las interacciones incompatibles con Phythophtora [Avrova et al., 1999], pero también durante la interacción compatible [Restrepo et al., 2005]. En arroz los perfiles de expresión por microarreglos se han estudiado frente a infección por patógenos como Xanthomonas oryzae pv. oryzae y Magnaporthe oryzae [Li et al., 2006]. En cuanto al uso de cDNA-AFLP para análisis de transcriptomas vegetales en patosistemas, esta ha sido Fitosanidad 16(2) agosto (2012) aplicada fundamentalmente para la búsqueda de perfiles polimórficos, relacionados con la expresión de genes frente al ataque por patógenos [Birch y Kamoun, 2000; Durrant et al., 2000]. También a través de cDNA-AFLP se han estudiado perfiles de expresión relacionados con respuesta hipersensible en tabaco y tomate [Vandenabeele et al., 2003; Gabriëls et al., 2006], así como en resistencia sistémica adquirida en Arabidopsis [Maleck et al., 2000]; sin embargo, como se mencionó antes, estas técnicas o bien requieren de pasos de hibridación como los microarreglos, o poseen una baja cobertura de transcriptos. Esto hace que la alternativa del uso de RNA-seq sea llamativa y muy prometedora. Antecedentes del uso de RNA-seq en interacciones planta-patógeno Los primeros trabajos de secuenciación de ADNc en plantas se llevaron a cabo en Medicago truncatula, Arabidopsis thaliana y Zea mays con la tecnología 454. En estos reportes se identificaron más de 17 000 genes de Arabidopsis, 25 000 secuencias genómicas en maíz que no estaban anotadas ni tenían similitud alguna con otras especies, y 400 SSR (del inglés simple sequence repeats) en M. truncatula [Cheung et al., 2006; Emrich et al., 2007; Weber et al., 2007]. Desde entonces el RNAseq mostró ser altamente sensible y prometedor para el análisis profundo de transcriptomas en plantas. Dado lo novedoso de la técnica, los estudios en interacciones planta-patógeno, en donde se hace uso de RNA-seq, son escasos. A la fecha se han reportado estudios en Arabidopsis thaliana, algodón y soya, pero en otras especies como yuca y maíz las investigaciones están en desarrollo. Uno de los trabajos más recientes enfocado al análisis de múltiples genomas y transcriptomas en Arabidopsis con el uso de RNA-seq reveló que la variación en los niveles de expresión génica es mucho mayor en genes que están involucrados en respuestas a estrés biótico. Asimismo, que los genes de resistencia de las subfamilias NB-LRR (del inglés nucleotide binding leucine rich repeat), coiled-coil, receptores Toll interleuquina-1 y genes relacionados con defensa codifican para proteínas más variables que aquellas codificadas por genes del metabolismo basal [Xiangchao et al., 2011]. En el patosistema algodón-Verticillium dahliae se reportó inicialmente, mediante microarreglos, cambios transcriptómicos en las respuestas de defensa de 211 genes, así como la activación de la respuesta de defensa basal correspondiente a la PTI y a la rápida produc- ción de fitoalexinas, terpenoides y felipropanoides [Cui et al., 2000]. No obstante este conocimiento, el entendimiento de las respuestas de defensa del algodón ante V. dahliae era limitado. Recientemente, a través de la aplicación de RNA-seq y la plataforma Illumina, se logró obtener el primer análisis global del transcriptoma de defensa en algodón. En este estudio se pudo monitorear los perfiles de expresión en raíces a las 4, 12, 24 y 48 h posinoculación (hpi), se detectó expresión diferencial en más de 3000 genes, lo que permitió enriquecer el entendimiento de cómo los genes involucrados en actividad enzimática, especialmente en la ruta metabólica fenilpropanoide, están involucrados en eventos de respuesta [Xu et al., 2011]. También se reportaron niveles de lignificación y actividad enzimática contrastante, así como expresión génica diferencial en plantas resistentes y susceptibles al hongo. En soya, con RNA-seq, fueron mapeados más de 43 000 genes con el genoma referencia de esta especie, y se estudiaron expresiones diferenciales de más de 1000 genes en líneas casi isogénicas a las 0, 6 y 12 hpi con Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag), agente causal de la BPL (del inglés bacterial leaf pustule) de la soya. Asimismo, bajo este enfoque, se detectó la sobrexpresión de PRR y genes que son inducidos por estos en líneas resistentes a Xag [Kim et al., 2011]. En esta investigación se unieron tres réplicas biológicas de cada tiempo 0, 6 y 12 hpi, se corrió un lane de Illumina para cada uno de ellos y se obtuvo más de 125 millones de reads. También en soya y con la tecnología Illumina, pero en un estudio de la roya, otra de las enfermedades más limitantes de este cultivo, recientemente se analizaron patrones de expresión de genes con el objetivo de dilucidar los eventos moleculares que ocurren tras la infección por parte del hongo Phakopsora pachyrhizi [Tremblay et al., 2011]. En plantas susceptibles y en etapas avanzadas de infección, un alto porcentaje de genes involucrados en el metabolismo de síntesis de aminoácidos, carbohidratos y lípidos fueron detectados con regulación negativa. Por el contrario, muchos otros genes relacionados con rutas metabólicas implicadas en defensa se sobrexpresaron en etapas iniciales de la infección. De acuerdo con los autores, muchos de los genes encontrados en este trabajo han dado luces para el desarrollo de un programa de mejoramiento genético enfocado a lograr resistencia amplia contra la roya de la soya a través de sobrexpresión o silenciamiento génico [Tremblay et al., 2011]. El RNA-seq también ha sido aplicado para análisis de perfiles transcriptómicos en fitopatógenos. Es el caso 109 Fitosanidad 16(2) agosto (2012) Soto y López de Phytophthora phaseoli, agente causal del mildeo velloso en lima bean, Phaseolus lunatus. Poco se conoce de la base molecular de la interacción de este oomycete con su hospedero. En esta investigación con la tecnología Illumina para RNA-seq se compararon los transcriptomas de tres tratamientos: el primero P. phaseoli creciendo bajo condiciones de cultivo, el segundo P. phaseoli infectando a P. lunatus tres días posinoculación (dpi), y el tercero a los seis dpi. Se trabajaron dos réplicas biológicas por tratamiento y un total de 150 millones de reads fueron obtenidos. Los resultados mostraron similitud en 10 427 genes de P. phaseoli con el genoma de P. infestans, de los cuales 318 son genes putativos de virulencia, y que mostraron ser sobrexpresados en los transcriptomas del patógeno en interacción con la planta [Kunjeti et al., 2011]. Este reporte muestra que esta herramienta también tiene un gran potencial en investigaciones direccionadas hacia el estudio de transcriptomas en fitopatógenos. Sin duda la implementación de RNA-seq está dentro de las actuales y futuras proyecciones de investigación en diversos patosistemas. A modo de ejemplos está el maíz (Zea mays-Aspergillus flavus) y la yuca (Manihot esculentaXanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam)). En maíz se planea encontrar genes expresados diferencialmente entre líneas susceptibles y resistentes, así como integrar esta información del transcriptoma con la presencia de QTL (del inglés quantitative trait loci), ya reportados de resistencia a la acumulación de aflatoxinas producidas por el patógeno [Kelley et al., 2010]. En yuca actualmente se desarrolla una estrategia en donde se combinará la información arrojada por RNAseq de líneas resistentes y susceptibles a Xam y el genoma referencia, con el fin de asignar funciones putativas a muchos de los 35 000 genes de la yuca. Asimismo se busca identificar los genes que se inducen o reprimen frente al ataque de la bacteria, y finalmente realizar identificación de SNP con el fin de establecer relaciones entre estos marcadores y QTL para resistencia [López y Bernal, 2012]. Este enfoque contribuirá de manera determinante no solo en el mejor entendimiento de la interacción molecular de este patosistema, sino también aportará información para incrementar el número de marcadores presentes en el mapa genético de yuca, lo que facilitará la clonación de genes R contra la bacteriosis vascular de yuca. De igual forma, hoy por hoy es factible la posibilidad de profundizar en preguntas como ¿cuáles son aquellos 110 genes que son expresados en el hospedero ante el ataque de un fitopatógeno?, incluso, ¿cuáles son aquellos genes que son expresados en una planta dentro de un sistema heterólogo no hospedero?, ¿cuáles son aquellos genes que se expresan en el patógeno frente a la interacción con su hospedero?, ¿cuál es el nivel de esta expresión?, ¿en qué momento después de iniciada la interacción ocurre?, ¿de manera temprana o tardía?, ¿cuáles son esos nuevos transcriptos que no pudieron ser identificados con previas técnicas para análisis de transcriptoma?, ¿cómo en determinado patosistema la estructura génica en cuanto a exones y sitios de splicing alternativo están relacionados con activaciones de respuestas de defensa? Las respuestas a estos y otros cuestionamientos pueden encontrarse bajo el enfoque de RAN-seq. Conclusiones, retos y perspectivas futuras • El secuenciamiento masivo de ADNc permite ampliar los rangos de detección de transcriptos que se lograron en su momento bajo la herramienta de microarreglos. Es evidente el gran potencial que tiene el RNA-seq en cuanto a reconocimiento de genes relacionados con defensa, factores de transcripción involucrados en activaciones de respuesta génica y determinación de expresión diferencial, incluso cuando el conocimiento del genoma es escaso o incluso nulo. • Asimismo, el conocimiento generado por el RNA-seq contribuirá de manera importante dentro de programas de fitomejoramiento. Con la información generada será posible la identificación de nuevos genes blancos para su uso en transformación genética, en búsqueda de expresión génica que se traduzca en el desarrollo de plantas resistentes a patógenos. Con seguridad, en el futuro cercano la literatura enfocada a interacciones planta-patógeno contendrá un sinnúmero de reportes alrededor de esta herramienta transcriptómica. Más aún, las tecnologías de NGS avanzarán, y en esa medida la herramienta se volverá cada vez más poderosa, mejorarán sus rendimientos, se podrán obtener lecturas más largas en un menor tiempo, y por supuesto a menores costos. • El secuenciamiento directo de ARN es uno de los mayores retos que presenta la técnica; sin embargo, las investigaciones, desarrollos y comprobaciones al respecto están en marcha, y pronto la alta oferta de esta tecnología será una realidad [Ozsolak et al., 2009; Ozsolak y Milos, 2011]. Asimismo, el reto computacional es grande, el análisis de millones de lecturas Fitosanidad 16(2) agosto (2012) que generan archivos de tamaños enormes requiere del desarrollo de herramientas bioinformáticas cada vez con mayor capacidad de análisis, rendimientos más altos, procesos de ensamblaje más sencillos, así como con capacidad de caracterización precisa de estructura y dinámica de transcriptoma. Estos son otros de los retos que tiene esta poderosa herramienta transcriptómica para los próximos años. • El reto para la fitopatología es explotar la utilidad de esta herramienta transcriptómica y a través de ella profundizar en el entendimiento de las complejas interacciones planta-patógeno, así como revelar eslabones moleculares involucrados que hasta hoy no habían podido ser revelados. Colcombet, J.; H. Hirt: «Arabidopsis MAPKs: A Complex Signaling Network Involved in Multiple Biological Processes», Biochemical Journal 413: 217-226, Francia, 2008. REFERENCIAS Durrant, W.; O. 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Zhang: «Lignin Metabolism Has a Central Role in the Resistance of Cotton to the Wilt Fungus Verticillium dahliae As Revealed by RNA-Seq-Dependent Transcriptional Analysis and Histochemistry», Journal of Experimental Botany 62: 5607-5621, China, 2011. Zenoni, S.; A. Ferrarini; E. Giacomelli; L. Xumerle; M. Fasoli; G. Malerba; D. Bellin; M. Pezzotti; M. Delledonne: «Characterization of Transcriptional Complexity during Berry Development in Vitis vinifera Using RNA-Seq», Plant Physiology 152: 1787-1795, Italia, 2010. Zhang, Z.; Y. Wu; M. Gao; J. Zhang; Q. Kong; Y. Liu; H. Ba; J. Zhou; Y. Zhang: «Disruption of PAMP-Induced MAP Kinase Cascade by a Pseudomonas syringae Effector Activates Plant Immunity Mediated by the NB-LRR Protein SUMM2», Cell Host & Microbe 11: 253-263, China, 2012. Zipfel, C.; G. Kunze; D. Chinchilla; A. Caniard; J. Jones: «Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation», Cell, 125: 749-760, Suiza, 2006. Zipfel, C.: «Pattern-Recognition Receptors in Plant Innate Immunity», Current Opinion in Immunology 20: 10-16, Inglaterra, 2008. Zipfel, C.: «Early Molecular Events in PAMP-Triggered Immunity», Current Opinion in Plant Biology 12: 414-420, Inglaterra, 2009. 113 Normas editoriales Objetivos y alcance Fitosanidad se dedica a la publicación de artículos originales básicos y aplicados, comunicaciones cortas y revisiones, investigaciones biológicas y tecnológicas relacionadas con la sanidad vegetal en las especialidades de entomología, micología, virología, bacteriología, fitopatología, malezas, taxonomía, biología de plagas, métodos de diagnóstico, nuevos reportes de plagas, protección de cultivos; control químico y biológico, tecnologías de reproducción de especies benéficas, antagonistas y metabolitos con actividad biológica; en los campos de cuarentena vegetal; interacción patógeno-hospedante y resistencia genética; prácticas culturales; eficacia química, impacto ambiental y residuos de plaguicidas, ecología, epidemiología y pronóstico de plagas, medios y métodos de aplicación de plaguicidas, manejo de plagas y biología molecular. Tipos de contribuciones 1. Artículos originales de investigación (artículos científicos). Deben informar los resultados de investigaciones originales. Los materiales no deben haber sido publicados previamente excepto en forma preliminar. Los trabajos tendrán la estructura siguiente: título, autor(es), afiliación de los autores, resumen y palabras claves (abstract y key words), introducción, materiales y métodos, resultados y discusión, conclusiones, agradecimientos (excepcionalmente si los hubiera) y referencias. 2. Comunicaciones cortas. Son notas de investigación cortas que tienen uno o dos resultados de interés y novedad particular, pero no todo el cuerpo de trabajo esperado de un artículo completo. Deben ser temas de interés inmediato por su novedad o porque su impacto tiene importancia en relación con el tiempo, y serán publicados en un tiempo tan corto como sea posible. Se espera que los autores mantengan las Notas de investigación muy concisas con título, autor(es), afiliación de los autores, con un Resumen e Introducción muy concisos, Métodos referenciados siempre que esto sea posible, Resultados y Discusión combinados y un mínimo de referencias. La longitud no debe ser mayor de cuatro páginas impresas en total, y debe adherirse a los estándares científicos de la revista. 3. Artículos de revisión. Su contenido debe estar dentro del ámbito del alcance de la revista y cubrir temas con un interés actual. Pueden someterse a consideración para su publicación por los autores o por invitación mediante consulta con uno de los editores de la revista. 4. Notas al editor. Son bienvenidos comentarios o críticas útiles de materiales publicados que se espera permitan un intercambio de puntos de vista que sean beneficiosos para la revista o los lectores. La decisión de la publicación de las cartas sometidas descansa puramente en la decisión del editor principal. Envío de artículos en línea o por correo electrónico El envío de un artículo implica que el trabajo descrito no ha sido publicado (excepto en la forma de un resumen como parte de una tesis académica o memoria de evento), que no ha sido sometido a consideración para publicación en otro lugar y que su publicación esté aprobada por todos los autores, y tácitamente por las autoridades responsables donde el trabajo se desarrolló, y que después de publicado, no lo será con el mismo formato en otro lugar, en inglés o en otro idioma sin el consentimiento de Fitosanidad. El envío de los artículos será totalmente por vía electrónica, usando la guía presente para preparar el artículo. Le será enviada una carta al autor a cargo de la correspondencia, confirmando su recepción. Una vez aceptado, a los autores se les solicitará una transferencia de los derechos de autor antes de pasar a arbitraje. Requerimiento de formato electrónico El formato electrónico es Word en cualquiera de las variantes de Windows, en letra Arial, con 11 de puntaje. Se debe mantener siempre una copia de resguardo del fichero electrónico para referencia y seguridad, y salvar el fichero con la extensión.doc. Documentos de W or d Wor ord Los textos deben estar en formato de una sola columna y mantener ese formato del texto lo más sencillo posible. Pueden utilizarse cursivas, negritas, subscritos, exponentes, etc. No incluir o adjuntar ecuaciones o tablas diseñadas gráficamente, y prepararlas utilizando las utilidades del procesador Word o del Excel. De usar divisiones al preparar tablas, debe usarse una sola rejilla para cada tabla individual, y no una para cada línea o columna. Si no se usa rejilla, usar el tabulador y no espacios para alinear las columnas. No importar las figuras dentro del fichero de texto; en cambio, indicar la posición aproximada de la figura en el texto electrónico. Preparación de manuscritos 1. Se aceptarán manuscritos en español o inglés. 2. Los artículos deben prepararse en papel tamaño carta 28 x 21,5 con márgenes de 2,5 cm completamente, a 1,5 espacios (incluyendo resumen, notas al pie y referencias). Cada línea del texto debe estar numerada (utilizar el formato de página del Word la opción de numerado de líneas con reinicio en cada página). Con las opciones de formato de páginas descritas anteriormente, cada página incluye 25 líneas. Deben numerarse las páginas del manuscrito, incluida la del título, referencias y las tablas; sin embargo, en el texto no deben realizarse referencias al número de la página, si fuese necesario referirse a secciones del texto. No subrayar palabras. Evitar el uso de excesivo de cursivas (itálicas) para enfatizar partes del texto. 3. El estilo de escritura debe ser totalmente impersonal (tercera persona), con criterio de exactitud, brevedad y párrafos cortos. Debe utilizarse el sistema métrico decimal. Los nombres científicos se escribirán completos, incluso el del autor, en su primera mención (ejemplo: Leucoptera coffeella Guerin Meneville). Si es necesario utilizarlos en va- rias partes del texto, entonces se escribirán completos la primera vez que aparezcan y luego se abreviarán (ejemplo: L. coffeella). Se escribirán en cursiva o se subrayan. 4. Los manuscritos deberán en general organizarse en el siguiente orden: • Título (debe ser claro, descriptivo y no muy largo). • Nombre(s) y dos apellidos de autor(es). • Dirección postal completa o afiliaciones. • Dirección electrónica del autor correspondiente. • Resúmenes en español e inglés. • Palabras claves (términos de indexación), normalmente de tres a seis siguiendo el tesauro de la FAO. • Introducción. Debe definir claramente el problema por el que se hizo el trabajo investigativo, y tener una breve referencia actualizada de los antecedentes específicos del trabajo que se relacionan con el tema que se presenta y cómo se ha abordado por otros investigadores. Debe redactarse en pasado. También se incluirá el alcance y el objetivo del trabajo. • Materiales y métodos(material estudiado, descripción de métodos, técnicas). Deben ser claros y concretos, expresar la cantidad y calidad de los materiales usados y describir en detalle los métodos y condiciones experimentales. Se redactarán según un orden lógico. De igual forma, se escribirán claramente los procedimientos analíticos y estadísticos utilizados. Se pueden citar los métodos y procedimientos siempre que se hayan publicado en revistas científicas de amplia circulación. No incluir marca comercial alguna de equipos o agroquímicos. En este caso se utilizará el del ingrediente activo. • Resultados. Se pueden expresar apoyados en tablas y figuras o gráficos, con una discusión a partir de referencias actualizadas, de manera lógica, interpretando las conclusiones. Las figuras se deben elaborar solamente en Word, Excel u otro programa compatible, nunca como imágenes ni en colores. • Discusión. Los resultados deben discutirse en relación con su impacto, novedad e implicaciones de tipo científico-técnico, y en apoyo o contraposición al conocimiento previo existente. • Conclusiones. Deben ser breves y concretas y estar en relación con la hipótesis experimental y los principales objetivos descritos. • Reconocimiento o cualquier información adicional concerniente a financiamiento de la investigación, etc. • Tablas. • Pies de grabado de las figuras. 5. Al escribir el manuscrito, los títulos y subtítulos se harán en líneas independientes en minúsculas. Resúmenes y abstracts Deben ser claros, descriptivos y con no más de 300 palabras. Contendrán los aspectos fundamentales y relevantes del contenido del tema, materiales y métodos y los resultados, con énfasis en la novedad y el impacto teórico-práctico de las conclusiones. Fórmulas 1. Los subíndices y los exponentes deben ser claros y no muy pequeños. 2. Brindar el significado de cada símbolo inmediatamente después de la ecuación en que se utilicen. 3. Los niveles de significación estadística que pueden mencionarse sin posterior explicación son: *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001. 4. En las fórmulas químicas las valencias de los iones deben ser dados como Ca2+ y no como Ca++. 5. Los números de isótopos deben preceder el símbolo: Ej.: 18O. Nomenclatura 1. Los autores y editores están obligados a seguir los códigos internacionales que gobiernan la nomenclatura biológica (International Code of Botanical Nomenclature, International Code of Nomenclature of Bacteria, International Code of Zoological Nomenclatura, Index Fungorum, etc.). 2. Todos los grupos bióticos (cultivos, plantas, insectos, pájaros, mamíferos, etc.) deben identificarse por sus nombres científicos. 3. Todos los biocidas y otros compuestos orgánicos deben identificarse por su nombre de Ginebra cuando se nombran por primera vez en el texto. Los ingredientes activos de todas las formulaciones incluidas en los reportes deben igualmente identificarse. 4. Para la nomenclatura química se deben seguir las convenciones de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada, y las recomendaciones de la Comisión Combinada IUPAC_IUB sobre nomenclatura bioquímica. para los mejores estándares, con seguridad de la claridad, precisión y alto nivel de detalles. Puntos generales 1. Siempre suministrar ediciones de alta calidad de los dibujos. 2. Comprobar que se emplean letras y tamaños uniformes en todas las ilustraciones originales. 3. Salvar el texto dentro de las ilustraciones como gráfico o adjuntar el tipo de letra. 4. Evitar gráficas tridimensionales siempre que la estructura de los datos así lo permita. 5. Numerar las ilustraciones de acuerdo con su secuencia en el texto. 6. Usar una convención lógica para los ficheros de figuras y suministrar una lista separada de los ficheros y el programa utilizado. 7. Suministrar las ilustraciones como ficheros separados y una impresión en hojas separadas. 8. Hacer una lista separada de los pies de figura. 9. Producir las imágenes con el tamaño aproximado de la versión impresa. 10. Las imágenes fotográficas al microscopio deben venir acompañadas de una barra escala (en la imagen, no debajo de ella), y brindar en la leyenda el factor de aumento de la imagen. Formato de las imágenes Salvar los formatos de sus ilustraciones con uno de los siguientes formatos y resoluciones: TIFF: fotografías en gris (tonos medios). Usar siempre un mínimo de 300 dpi. TIFF: dibujos con líneas mapa de bits. Usar un mínimo de 1000 dpi. JPG: fotografías en gris (tonos medios). Utilizar siempre un mínimo de 500 dpi. DOC, XLS, o PPT. Si se han creado las ilustraciones con una de las aplicaciones de Microsoft Office, suministrarlas tal como son. Tablas o cuadr os cuadros Por favor NO NO: 1. Las tablas o cuadros deben elaborarse de acuerdo con las limitaciones de tamaño y diseño de la revista. Siempre que sea posible se evitarán grandes tablas. Las columnas y líneas reversas frecuentemente reducirán las dimensiones de la tabla. 2. Si deben presentarse muchos datos, se recomienda dividirlos en varias tablas. 3. Deben numerarse de acuerdo con su secuencia en el texto. El texto debe contener referencias a todas las tablas. 4. Cada tabla o cuadro del manuscrito debe presentarse en una página independiente. 5. Cada una debe tener un título breve y explicativo por sí mismo. 6. Los encabezamientos de las columnas deben ser breves, pero suficientemente explicativos. Se añadirán entre paréntesis las abreviaturas estándares de las unidades de medida. 7. No colocar líneas verticales para separar las columnas. Dejar un espacio entre ellas. 8. Las explicaciones esenciales para entender el contenido de las tablas se deben colocar como una nota al pie al final de ella. • Suministrar los gráficos dentro de su procesador de texto. • Suministrar ficheros que se hayan optimizado para utilizarlos en pantalla (GIF, BMP, PIC, WPG) debido a que su resolución es muy baja. • Suministrar gráficos que sean desproporcionadamente grandes para el contenido. Posición en el texto Preparación de ilustraciones electrónicas El envío de los dibujos y esquemas en un formato electrónico ayuda a producir el artículo Marcar en el texto la posición aproximada de la figura en el artículo. Referencias 1. Se tratará que el número de referencias se mantenga en el mínimo indispensable para el soporte de las informaciones (ser más selectivo que inclusivo). Todas las referencias en el texto serán presentadas en una lista de referencias en orden alfabético de los autores al final del manuscrito. A cada cita en el texto le corresponderá una referencia en la lista. 2. Las referencias solo serán de publicaciones adecuadas al tema, todas necesarias, y al menos el 60 % de los últimos cinco años y listadas correctamente. 3. En el texto las referencias de publicaciones hasta de dos autores se realizarán con los apellidos y el año de la cita entre paréntesis (ej.: Stover (1970); Stover y Mulder (1978)). Las citas de artículos donde hay más de dos autores, se citará el primero y añadirá et al. (ej.: Stover et al. (1996)). 4. Las referencias citadas conjuntas en el texto deben escribirse en orden cronológico. Las publicaciones de un mismo autor estarán en orden cronológico, y de haber coautores por orden alfabético del segundo autor. Las publicaciones de los mismos autores en un mismo año deben listarse con el año y letras (ej.: 1974 a, 1974 b, etc.). 5. En el listado de referencias, evitar las comunicaciones personales y las inéditas, así como el abuso de autocitas. Se colocará el primer apellido del autor principal y luego las iniciales de los nombres. para el resto de los autores, primero la inicial y luego el primer apellido, en todos los casos separados por punto y coma. Cuando una obra tenga más de tres autores, se pondrá el apellido y nombre de todos, a continuación el título del artículo, el nombre de la revista en cursiva, así como volumen, número, páginas, país de la publicación y año. 6. En el caso de los libros y folletos, después del título escribir número de la edición, lugar de la publicación (ciudad o país), casa editorial y páginas. 7. Los títulos de los artículos y ponencias se pondrán entre comillas, mientras que los referidos a libros y publicaciones periódicas, en cursiva o subrayados. 8. Las referencias de internet deben estar bien escritas para poder acceder a ellas, y poner la fecha de actualización del sitio y de consulta. 9. Para citar reuniones, simposios, congresos, etc. se escribirá el nombre del evento (número, días, mes, lugar donde se realizó y año de realización). Año de la publicación. Título. Mención del editor (es). Ciudad y país de publicación. Casa editorial. Páginas o volúmenes. Envío de manuscritos Los manuscritos se enviarán a: Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, La Habana, Cuba. También pueden enviarse por correo electrónico a Revista Fitosanidad: [email protected] No se aceptan manuscritos que no estén acompañados de la Declaración de Originalidad y del Formato de Cesión de Derechos Patrimoniales de Autor. Arbitraje Los trabajos enviados al Comité Editorial serán sometidos al proceso de dictaminación por pares académicos, con la participación de evaluadores externos, utilizando el sistema de doble ciego. Los árbitros evaluarán las contribuciones de acuerdo con el formato de dictamen utilizado por la revista. Los resultados del proceso serán enviados a los autores, quienes dispondrán de no más de 15 días para enviar la versión corregida. El Comité Editorial se reserva el derecho de aprobar o rechazar los trabajos propuestos, lo cual será notificado oportunamente a los interesados. Editorial standards Objectives and scope Fitosanidad journal is dedicated to the publication of basic and applied original articles, short communications and reviews, of biological and technological researches related to plant health, in the specialties of entomology, mycology, virology, bacteriology, phytopathology, weeds, taxonomy, pests biology, diagnosis methods, new pests reports, crops protection, chemical and biological control, reproduction technologies of benefic species, antagonist species and metabolites with biological activity, in the fields of plant quarantine, pathogenic-host interaction and genetic resistance, cultural practices, chemical efficacy, environmental impact and pesticide residues, ecology, epidemiology and pests prognosis, means and methods of pesticides application, pests management and molecular biology. Types of contributions. 1. Original investigation articles (scientific articles): they must inform the results of primary investigations. These materials should not have been published previously, except in preliminary form. The works will have the following structure: title, author(s), affiliation of the authors, abstract and key words, introduction, materials and methods, results and discussion, conclusions, acknowledgements (exceptionally if any), references. 2. Short communications: they are short investigation notes that have one or two results of interest and particular novelty, but not the whole body of work expected from a finished article. They must be subjects of immediate interest because to their novelty or because their impact in relation to the time and they will be published in at the earliest time. It is expected that the authors should keep the Investigation Notes very concise, with title, author(s), affiliation of the authors, with very concise abstract and introduction, referenced methods whenever possible, combined results and discussion, and a minimum of references. The length should not be greater than four pages printed on the whole and must adhere to the scientific standards of the magazine. 3. Review articles: their content should be inside the scope environment of the magazine and cover subjects with a present-day interest. They can be subject to consideration for their publication by the authors or by invitation through consultation with one of the editors of the magazine. 4. Notes to the editor: comments or useful critics of published materials are welcome, which are expected to allow an exchange of view points that may be beneficial for the magazine or the readers. The decision of publishing the submitted letters lies purely on the Main Editor’s choice. Sending of articles online or by e-mail The mailing of an article implies that the described work has not been published (except in the form of an abstract as part of an academic thesis or event memory), not submitted to consideration for publication in any other place and that its publication is approved by all the authors and tacitly by the responsible authorities where the work was developed, and that after having been published, it will not be published with the same format in another place, in English or in another language without the plant health department consent. Sending of the articles will be completely by electronic way, using the present guide for preparing the article. A letter will be sent to the author in charge of the mail, confirming its reception. Once accepted, transference of the copyright will be requested from the authors, before going on to arbitration. Electronic format requirement The electronic format is Word in any of the variants of Windows, in Arial font type with a size of 11. It is always necessary to keep a safety copy of the electronic file for reference and safety, and save the file with the extension .doc. Wor d documents ord The texts should have one column format. Keep the text format as simple as possible. Italics, bolds, subscripts, superscripts, etc. can be used. Do not include or attach equations or tables designed graphically; prepare them using the tools of Word or Excel processor. If you use divisions when preparing tables, a single cell for each individual table must be used, and not one for each raw or column. If cells are not used, then use the tabulator and spaces not to align the columns. Do not import figures inside the text file; instead indicate the approximated position of them in the electronic text. Preparation of manuscripts 1. Manuscripts in English or Spanish will be accepted 2. The articles should be prepared with a page size letter 28 x 21.5 with margins of 2.5 cm, with a line and paragraph spacing of 1.5 (including abstract, footnotes and references). Each line of the text should be numbered (use in the page layout of Word the line numbers option of restart each page). With the page layout options described previously, each page includes 25 lines. The pages of the manuscript should be numbered, including the title page, references and tables. Nevertheless, references to the page number should not be made in the text, if making reference to sections of the text is required. Do not underline words in the text. Avoid the excessive use of italics to emphasize parts of the text. 3. The document should be completely impersonal (3rd person), with accuracy criterion, conciseness and short paragraphs. The metric system should be used. Scientific names will be written completely, even the one of the author, in his first mention (e.g: Leucoptera coffeella Guerin Meneville). If it is necessary to use them in several parts of the text, then they will be written completely the first time that they appear and afterwards they will be abbreviated (e.g: L. coffeella), they will be written in italics or underlined. 4. The manuscripts should generally be organized in the following order: • Title (must be clear, descriptive and not very long. • Name(s) and two surnames of author(s) • Complete mailing address or affiliations • E-mail address of the corresponding author. • Abstracts in Spanish and English. • Key words (indexing terms), normally from three to six following the Multilingual Thesaurus of the FAO. Agrovec.. FAO. Rome. 2000. Available in: http:// aims.fao.org/es/pages/472/sub • Introduction: it should clearly define the problem originating the research work, and having a brief up-to-date reference of the specific antecedents related to the subject shown and how it has been approached by other investigators. It should be drafted in past tense. The objective and scope of the work will also be included. • Materials and methods: (studied material, description of methods, techniques): they should be clear and exact, expressing the amount and quality of the used materials and describing in detail the experimental methods and conditions; they will be written according to a logical order. Likewise, the used analytical and statistical procedures will be written clearly. The methods and procedures can be mentioned provided that they have been published in scientific magazines of broad-coverage. Do not include trademarks of equipment or agrochemical, in this case the name of the active ingredient will be used. • Results: They can be shown aided by tables and diagrams or graphs, with a discussion from up-to-date references, in a logical way, interpreting the conclusions. The figures should only be drawn up in Word, Excel or any other compatible program, never as images, or with colors. • Discussion: Results should be discussed in relation to their impact, novelty and implications of scientific-technical type, and in support of or against the prior knowledge. • Conclusions: They should be brief and exact, and be in relation with the experimental hypothesis and the main objectives described. • Acknowledgments or any additional piece of information concerning financing of the investigation, etc. • Tables • Engraving feet of figures 5. When writing the manuscript, the titles and subtitles are written in independent lines, in small letters. Abstracts Preparation of electronic illustrations They must be clear, descriptive and not greater than 300 words. They must contain the fundamental and outstanding aspects of subject, materials and methods and results content, with emphasis in the novelty and the theoretical-practical impact of the conclusions. Sending drawings and diagrams in an electronic format helps to produce the article for the best standards, assuring the clearness, precision and high level of details. Formulas 1. Subscripts and exponents should be clear and not too small. 2. Provide the meaning of each symbol after the equation in which they are used. 3. The statistical significance levels that can be mentioned without later explanation are: *p<0.05, **p< 0.01 and *** p<0.001 4. In the chemical formulas, the valence of ions must be given as Ca2+ and not as Ca++. 5. The numbers of isotopes must precede the symbol e.g.: 18O. Nomenclature 1. The authors and publishers are obliged to follow the international codes that rule the biological nomenclature (International Code of Botanical Nomenclature, International Code of Nomenclature of Bacteria; International Code of Zoological Nomenclature; Index Fungorum, etc.). 2. All the biotic groups (crops, plants, insects, birds, mammals, etc.), must be identified by their scientific names. 3. All the organic biocides and other compounds must be identified by their Geneva’s name when they are named for the first time in the text. The active ingredients of all the formulations including in the reports, must also be identified. 4. For the chemical nomenclature the conventions of the International Union of Pure and Applied Chemistry must be followed and the recommendations of the IUPAC-UB Combined Commission on Biochemical Nomenclature. Tables or Charts. 1. The tables or charts should be drawn according to the size and design limitations of the magazine. Whenever possible, great tables will be avoided. The reverse columns and lines will frequently reduce the dimensions of the table. 2. If plenty of data should be shown, it is recommended to split them in several tables. 3. The tables must be numbered according to their sequence in the text. The text should contain references to all the tables. 4. Each table or chart of the manuscript must appear in an independent page. 5. Each one should have a brief and selfexplanatory title. 6. The headings of the columns should be brief, but sufficiently explanatory. The standard abbreviations of the units of measurement should be added between parentheses. 7. Do not place vertical lines to separate the columns. Leave a space between the columns. 8. The essential explanations to understand the content of the tables should be placed as a footnote at the end of the table. General points 1. Always provide high-quality editions of the drawings. 2. Verify that uniform fonts and sizes are used in all the original illustrations. 3. Save the text inside the illustrations as a graph or enclose the font type. 4. Avoid three-dimensional graphs whenever the structure of the data allows it. 5. Number the illustrations according to their sequence in the text. 6. Use a logical convention for the files of figures and provide a separated list of the used files and programs. 7. Provide the illustrations as separate files and a print in separate sheets of paper. 8. Make a separate list of the figures feet. 9. Produce images with a size similar to the printed version. 10.Thephotographicimagesunderthe microscope should be accompanied by a scale-bar (in the image, not underneath it) and offer in the legend the image magnification factor. Format of the images Save the formats of its illustrations with one of the following formats and resolutions: TIFF: gray photographs (middle tones) always use a minimum of 300 dpi. TIFF: drawings with bitmapped lines: use a minimum of 1000 dpi. JPG: gray photographs (middle tones) always use a minimum of 500 dpi. DOC, XLS, or PPT. If the illustrations have been created with one of the Microsoft Office applications provide them as they are. Please DO NOT NOT: - provide the graphs inside thetext processor. - provide files that have been optimized to use them in screen (GIF, BMP, PIC, WPG) because their resolution is very low. - provide graphs that are disproportionately big for the content. Position in the text. Mark in the text the approximated position of figures in the article. References 1. The amount of references most be the minimum essential for the support of the investigations (be rather selective than inclusive). All the references in the text will be presented in a list of references in alphabetical order of authors at the end of manuscript. Each author cited in the text may have a reference in the list. 2. References will only be of publications in agreement with the subject, all of them necessary, at least the 60% from the last five years, and correctly listed by. 3. In the text, the references of publications of up to two authors will be made using the last names and the year of the citation between parentheses e.g.: Stover (1970); Stover y Mulder (1978); the article citation where there are more than two authors, the first author will be mentioned and add et al. E.g: Stover et al. (1996). 4. The joint references cited in the text should be written in chronological order. The publications of a same author should have a chronological sequence and if they have coauthors should appear by alphabetical order of the second author. The publications of the same authors in a same year should be listed with the year and letters, e.g: 1974 a, 1974 b, etc. 5. In the listing of references, avoid the personal communications and the unpublished ones, and avoid the misuse of self-citations. The last name of the main author will be placed first then the initials of the names; for the other authors, it should be first the initial of the names and then the last name; all the cases will be separated by semicolon. When a work has more than three authors, it will be written the last name and names of all of them, then the title of the article, the name of the magazine in italics, as well as volume, number, pages, country of publication and year. 6. In the case of books and leaflets, after the title should be written the edition number, place of the publication (city or country), publishing house and pages. 7. The titles of articles and communications will be placed in quotation marks, whereas those referring to books and periodic publications will be written in italics, or underlined. 8. The Internet site references should be well written in order to access to them, and place the site maintenance and consultation date. 9. For citations of meetings, symposiums, congresses, etc., write the name of the event (number, year in which it took place, location where it was carried out). Year of publication. Title. Mention of the publisher (s). City of the publication and country, publishing house. Pages or volumes. Sending of manuscripts The manuscripts will be sent by mail to Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, La Habana. Cuba. CP 11600. They can also be sent by e-mail to Fitosanidad magazine: [email protected] Manuscripts that are not accompanied with the Declaration of Originality shall not be accepted. Arbitration The works sent to the Publishing Committee will be subject to a review in academic pairs, with the participation of external evaluators, using the double-blind system. Arbiters will assess the contributions according to the judgment format used by the magazine. Results of the process will send back to the authors who will have not more than 15 days to send the correct version. The Publishing Committee reserves the right to approve or reject the proposed works, which will be notified opportunely to the interested parts. (Incluye costo de envío) Suscripción anual y envío al exterior: América: $45.00 Europa: $50.00 Resto del Mundo: $55.00 Envío de ejemplar suelto al exterior: América: $ 15.00 Europa: $ 20.00 Resto del Mundo: $25.00 Distribución nacional: Ejemplar MN: $10.00 – USD: $10.00 Anual MN: $40.00 – USD: $40.00 Nota: Envíe por correo postal / Cada suscripción tendrá un acuse de recibo Nombre y Apellidos/Name and Surname...................................................................................................................................................... Institución/Institution .................................................................................................................................................................................... Profesión/Profession ...................................................................................................................................................................................... Dirección/Address .......................................................................................................................................................................................... Código Postal/Zip Code ..................................................................... Ciudad/City .................................................................................... País/Country ..................................................................... Telef./Telephone ………………………………. Telefax ……………………… Email …………………………………………………………. 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