Ritmos Circadianos

Ritmos
Circadianos
IFM 2014
Nara I. Muraro
Que les voy a contar:
1- Qué son? Por que existen?
2- Como se hace un experimento circadiano
3- Donde está el reloj a nivel anatómico
4- Como funciona el reloj a nivel molecular
5- Como se entrena el reloj (como se pone en hora)
6- Hay un solo tipo de reloj circadiano?
7- Relojes en humanos
8-Sueño
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Ritmos Biológicos, hay muchos tipos!
~año
infradianos
hibernación
~día
circadianos
actividad/reposo
~mseg
pulso
cardíaco
ultradianos
tiempo
Los ritmos biológicos ocurren con distintas frecuencias
Tipo de ritmo
Período
Ejemplo
Ultradiano
0.1 seg
Actividad cerebral
1 seg
Ritmo cardíaco
6 seg
Ritmo respiratorio
60 min
Secreciones hormonales
90 min
Alternancia de estados
de sueño
Circadiano
24 h
Actividad- reposo
Temperatura corporal
Infradiano
28 días
Ciclo menstrual
365 días
Hibernación
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Ritmos Circadianos
Circa (alrededor de) diano (día): ritmos de alrededor de 24hs
Permiten anticipar los cambios en la luz y
la temperatura generados por la rotación
de la Tierra…
…y esto permite ajustar la fisiología y el
comportamiento a éstos cambios.
Esto confiere un indudable valor adaptativo.
Se encuentran en todos los seres vivos, son
ubicuos.
Se manifiestan a todo nivel de organización:
desde el celular al poblacional.
El ABC de los Ritmos Circadianos:
Inputs
Oscilador
central
Osciladores
periféricos
Outputs
Otros inputs:
e.g.:
agudeza
visual
Temperatura
Mareas
Enmascaramiento
Disponibilidad de alimento
Actividad social
e.g.: secreción
de melatonina
Ciclos de actividad y reposo
Expresión génica
Actividad neuronal
Secreción hormonal
Presión Arterial
Temperatura Corporal
…y muchas mas!!!
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Para que un ritmo sea circadiano debe:
-Manifiestarse con un período cercano al ambiental (~24h)
-Manifiestarse en ausencia de información del ambiente
(ser endógeno)
-Tener la capacidad de responder a una variable externa
(zeitgeber), sincronizando las condiciones internas a las
del exterior (ser entrenable)
-No ser afectado por cambios de temperatura (exhibir
compensación por temperatura, Q10~1.0) (pero no
insensibles a ella)
El primer experimento circadiano:
-De Mairan, astrónomo Francés
-Observa que sus plantas de Mimosa pudica
pliegan sus hojas por la noche y diseña el
primer experimento circadiano:
Para estudiar el reloj endógeno
hay que eliminar las claves
ambientales. De esta manera se
puede observar el período de
curso libre (free running
period=FRP).
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¿Cómo se hace un
experimento circadiano?
Muestreo en ciclos
alternados de luz
y oscuridad (L:O)
día 1
día 2
día 1
día 2
Entrenamiento o
sincronización (L:O)
Muestreo en
oscuridad
constante (O:O)
día subjetivo-noche subjetiva
Medición automatizada de la actividad locomotora
B
Moscas:
Roedores:
Humanos:
Actividad de cada individuo por unidad de
tiempo
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Cómo se construye un actograma?
oscuridad constante
Parámetros que se pueden medir:
Periodicidad (de cada organismo)
Ritmicidad (de la población)
Período
wild type
Período
corto
Período
largo
Arrítmico
Caracterización de las oscilaciones

A
 = período
1/  = frecuencia
A = amplitud
El FRP es una
característica fija de
un individuo.
Los miembros de una
misma especie
tienden a tener FRPs
similares
 = fase
 =ángulo de fase
o cambio de fase

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Los núcleos supraquiasmáticos del hipotálamo son el
marcapasos circadiano de los mamíferos:
Primeras evidencias:
1972: NSQ
es necesario
Comportamiento
de bebida
-Reimplantes de NSQ en individuos arrítmicos (porque se
les había extirpado el NSQ) devuelven los ritmos.
-Cortar los axones que salen del NSQ o agregar TTX con
una cánula en el NSQ, producen arritmicidad.
-Reimplantes de NSQ de individuos mutantes con período
corto en individuos arrítmicos (porque se les había
extirpado el NSQ) devuelven los ritmos con el período
mutante del donante.
Lean el paper!
1972-1990: NSQ es suficiente
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El Núcleo Supra Quiasmático (NSQ):
-Recibe input directo del tracto retino-hipotalámico (eso dió la idea
inicialmente de que podrían ser el marcapasos central).
-Red de aprox. 10.000 neuronas (ratón).
-Las neuronas del NSQ exhiben patrones rítmicos de actividad (tanto
metabólica como neuronal).
-Este patrón rítmico de actividad persiste en células aisladas del NSQ.
-Si se impide la comunicación entre las diferentes neuronas se pierde la
sincronización entre ellas (se desfasan).
-El período que se ve en el comportamiento de
un animal, corresponde al del período de la
oscilación de la actividad del NSQ.
Como se puede medir la actividad del NSQ?
días
Electrofisiológicamente
Reportero: gen reloj::luciferasa
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Neurotransmisión en el NSQ
- No está muy claro como es la comunicación dentro de NSQ.
- El tracto RHT libera Glutamato en la zona ventral del NSQ.
- Una proporción de neuronas del NSQ ventral producen VIP
(péptido vasoactivo intestinal), el VIP sirve para sincronizar las
oscilaciones entre neuronas.
- La información viaja desde el NSQ ventral hacia el dorsal vía
transmisión peptidergica (VIP, AVP (Arginina Vasopresina), GRP
(Gastrin Releasing Peptide) y más! (quizás mas de 100)
- También vía neurotransmisores clásicos
en particular casi todas las neuronas del
NSQ producen GABA, pero en algunas es
excitatorio y en otras inhibitorio!
- También cumplen un rol las uniones
estrechas y la glia (la glia del NSQ tiene
relojes!).
Al NSQ le gustan los neuropéptidos
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Propiedades del NSQ dependen de la red neuronal
-El NSQ esta compuesto por osciladores
que son autónomos de célula.
- Aisladamente las neuronas del NSQ
oscilan, pero se desfasan entre sí y su
amplitud es menor.
-Es la sincronización entre sus diferentes
neuronas lo que le permite tener
oscilaciones con una fase coherente entre
ellas y una amplitud considerable.
-La variabilidad entre los diferentes
osciladores le daría plasticidad a la red
para adaptarse a diferentes situaciones.
Welsh et al (2010)
-La sincronización se lograría mediante
transmisión neuropeptidérgica y circuitos
neuronales (que no se conocen!).
Como dirige el NSQ los ritmos circadianos de
los diferentes parámetros fisiológicos?
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Outputs del NSQ son una combinación de:
- Conexiones sinápticas
- Regulación homonal (melatonina/cortisol)
- Regulación mediada por el sistema autónomo
Melatonina = Noche
Challet (2007)
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Melatonina
- Correlaciona con la fase nocturna tanto en especies diurnas como
en especies nocturnas.
- Se libera de la glándula pineal al torrente sanguíneo.
- Sirve para conferir información de la hora del día a órganos
periféricos y sincronizarlos.
- En algunas aves la glándula pineal es el marcapasos central (no
el NSQ) y recibe directamente claves ambientales de luz (está bien
pegada al techo del cráneo y hay un adelgazamiento óseo justo en
esa región).
- El receptor de melatonina (un R acoplado a proteína G) se
expresa en la periferia y también en el NSQ (feedback loop)
- La oscilación de la secreción de melatonina se debe a la expresión
circadiana de las enzimas que la producen.
Como se logran los ritmos endógenos en las
neuronas marcapasos?
Existe un reloj molecular!!!
El reloj molecular circadiano está establecido por ciclos de
feedback negativo de transcripción y traducción de genes y
proteínas reloj que son autosostenidos, cada ciclo dura ~24hs.
, 2008
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En los años ’70 Seymour Benzer cambia radicalmente
el uso de Drosophila como organismo experimental
-Antes, Drosophila era usada mayoritariamente en estudios
de desarrollo y genética.
-El objetivo de Benzer era encontrar una conexión entre
genes individuales y comportamientos “simples”, concepto
revolucionario 1gen = 1comportamiento
-Usaron genética directa para encontrar mutantes deficientes
en diferentes comportamientos como fototaxis, locomoción,
aprendizaje y memoria y ritmos circadianos.
-En 1971 Benzer y su estudiante Ron Konopka descubren el gen period, un trabajo
fundacional en el descubrimiento de los mecanismos moleculares que dirigen los ritmos
circadianos.
Para ver que quiero decir con
genética directa y contarles lo
genial que es la mosca…
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Genética Directa
vs
Genética inversa
Gen favorito
Y después encuentro cual es el
gen que causa el fenotipo
Y después busco si la modificación de la
expresión de mi gen favorito produce un
fenotipo anteriormente hipotetizado
Que hace que Drosophila sea un organismo modelo tan útil?
-Ciclo de vida corto
-Barata de mantener en el laboratorio
-Y por lo tanto se pueden mantener una gran cantidad de animales: es
posible realizar screens genéticos a gran escala
-Tiene solo 4 cromosomas y tiene la posibilidad de “balancear” las
mutaciones con cromosomas especiales para mantenerlas
-Genoma secuenciado
-Existen herramientas genéticas que permiten la manipulación de casi
todos los genes en patrones espaciotemporales definidos
-Existen centros repositores que mantienen y distribuyen mutantes
-La comunidad mosqueril tiende a compartir reactivos
-60% de los genes humanos relacionados a patologías tienen ortólogos en
Drosophila
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Pero…
…la mayoría de los genes centrales del reloj
han sido descriptos primero en Drosophila
y luego se encontraron los genes homólogos
de mamífero
Alto grado de conservación en
los genes reloj de animales!
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El reloj molecular “TTFL” (simplificado) …
minutos
a
pocas horas!
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Algo clave para que el ciclo dure ~24hs:
-Retardos dados por las fosforilaciones y ubiquitinaciones de PER
y TIM
-Esto regula la acumulación y localización intracelular de
PER/TIM:
13hs
19hs
1hs
7hs
Fernandez et al (2007)
Entonces, los componentes básicos del
reloj molecular son:
-Dos factores de transcripción del tipo basic Helix Loop Helix que
se unen a la secuencia consenso: CACGTG (E-box) (CLK y CYC,
CLK y BMAL)
-Dos proteínas que inhiben la acción de CLK y CYC y cuyos genes
tienen promotores que contienen E-boxes (PER y TIM, PER1,2,3 y
CRY1,2)
-Una serie de kinasas y ubiquitin-ligasas que retrasan el ciclo
ajustándolo a ~24hs, esto lo hacen regulando la localización
intracelular y estabilidad de PER y TIM
-Proteínas que conforman un segundo ciclo estabilizador que
ayudan a dar robustez al primero
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Gallego and Virshup Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 139–148 (February 2007) | doi:10.1038/nrm2106
Como se pone en hora el reloj?
Diferentes de
otras células
ganglionares
en que
detectan luz
directamente,
tienen
fotopigmento:
Melanopsina
Reppert and Weaver (2002)
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En la mosca la luz afecta al reloj directamente:
Como se construye una curva de respuesta de fase
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Distintas claves ambientales pueden
sincronizar diferentes osciladores
Oscilador
Marcapasos
Oscilador
Esclavo o
Periférico
Se refiere a que no es el
marcapasos, no a que
está en la periferia!
Reppert and Weaver (2002)
Distintas claves ambientales pueden
sincronizar diferentes osciladores
Silver et al (2011)
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Es el NSQ el único reloj????????
Existe un reloj circadiano independiente del NSQ!
Silver et al (2011)
MASCO: Methanphetamine Sensitive
Circadian Oscilator
-La administración crónica del psicoestimulante
metanfetamina induce la aparición de ritmos
circadianos en animales sin NSQ.
-El período del ritmo correlaciona con la dosis
de metanfetamina.
-La metanfetamina aumenta la neurotransmisión
mediada por Dopamina, Noradrenalina y
Serotonina ya que inhibe su transporte
presináptico.
-Los genes canónicos del reloj molecular no
están involucrados en el MASCO.
-Es posible que los ritmos inducidos por
restricción de comida y de metanfetamina estén
relacionados.
Rata ciega y sin NSQ
Honma and Honma (2009)
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No todos los relojes funcionan igual!
Como empezaron? Que presión de selección había?
Teoría del “escape de la luz”:
como no había atmósfera y la
luz UV daña al DNA se
favoreció la evolución de un
reloj circadiano, de hecho…
…los mecanismos de
reparación de DNA exhiben
oscilaciones diarias!
Y, después? Great Oxidation Event
- Aparición de organismos fotosintéticos crea atmósfera oxidativa.
- El ozono protege de una parte importante de la radiación UV.
- Reloj circadiano: útil para
regular el momento de dos
procesos incompatibles, la
fotosíntesis durante el día y
la fijación de nitrógeno
durante la noche.
- Que sabemos del reloj
circadiano de las
cianobacterias?
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-Exhiben ritmos circadianos en diferentes
parámetros incluso en condiciones en las que
la división celular es menor a 24hs! (5-6hs)
- En 1995, Liu y col. hacen un screen para
encontrar mutantes arrítmicos o con
período anormal usando un reportero de
luciferasa sin promotor.
Synechococcus elongatus
PCC7942
- Descubren los genes kaiA, kaiB y kaiC. Que constituyen el reloj
central de las cianobacterias.
- KaiC: proteína que forma hexámeros y tiene un dominio de unión
a ATP. KaiA y KaiB interactúan físicamente con KaiC.
- Sin embargo pasa algo raro: la inhibición de la transcripción y
traducción no alteran la ritmicidad!
- 2005: Nakajima y col. mezclan KaiA, KaiB y KaiC purificadas y
agregan ATP y obtienen oscilación in vitro!
Transcriptional
Translational
Feedback
Loops
Oscillator
TTFL vs PTO
Post
Translational
Oscillator
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TTFL + PTO
En cianobacterias: se pudo comprobar
directamente que el reloj circadiano confiere un
valor adaptativo!
Ouyang et al (1998)
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Un reloj común a todos?
- Los eucariotas no tenemos proteínas Kai.
- Ni las bacterias tienen Per, Tim, etc…
- Existe algún reloj común conservado en todos los organismos
vivos?
- Esto esta recién salidito del horno! En 2011/2012:
- Las peroxiredoxinas son proteínas presentes en virtualmente
todos los organismos y muy conservadas.
- Su estado de oxidación oscila circadianamente desde las
cianobacterias hasta los humanos.
- Aunque el reloj TTFL y el ritmo de las peroxiredoxinas están
relacionados (por ejemplo, mutaciones que dan período largo
también producen oscilaciones de peroxiredoxinas con período
largo) también pueden ser independientes, evidencias:
O’Neill and Reddy (2011)
Edgar et al. (2012)
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Loudon (2013)
Relación entre los Ritmos
Circadianos y la Salud Humana
-Trabajo a contraturno
-Cambios frecuentes de
huso horario
-Cáncer
-Enfermedades cardiovasculares
-Obesidad
-Depresión
-Mutaciones en genes reloj
-Síndrome de fase de sueño
avanzada/retrasada
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Relación entre los Ritmos
Circadianos y la Salud Humana
II
-Diferentes tipos de
disrupción del sueño
-Parkinson
-Huntington
-Alzheimer
-Depresión
-Esquizofrenia
-Envejecimiento
Los humanos tenemos relojes!
- En los años ’60 experimentos de libre curso en humanos
comprueban que también nosotros, como era de esperarse,
tenemos un oscilador circadiano.
- En humanos se habla de diferentes
cronotipos: sos alondra o lechuza?
- Con la industrialización y la electricidad
las condiciones de vida humanas
cambiaron radicalmente, de trabajar en el
campo y estar expuesto al ciclo de luzoscuridad a vivir en grandes ciudades y
exponernos a una gran cantidad de luz
artificial.
Bunker en Andechs
- Qué sincroniza a los relojes humanos? Qué es más fuerte, la luz
(como en otros mamíferos) o las pautas sociales?
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http://www.thewep.org/chronotype-study
Estudio de los ritmos
circadianos humanos
en condiciones de
entrenamiento.
La clave para
estudiar el
comportamiento
humano en la
vida diaria: hacer
la pregunta
adecuada.
Cuestionario:
Cronotipo: Mid-sleep on
free days (MSF)
Validado con otros
parámetros fisiológicos.
Sigue una distribución
normal en la población:
n=60.000
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El cronotipo cambia con
la edad:
hombres
Alemania se extiende
en 9 grados de latitud,
hay 36min de
diferencia entre la
puesta del sol entre el
este y el oeste, pero un
solo huso horario!
mujeres
>500.000 hab
300.000500.000
hab
<300.000 hab
n=21.600
La luz es el principal sincronizador
de nuestro reloj circadiano, y no la
pautas sociales.
Jet lag
- Cuando uno se des-sincroniza con el
ambiente (jet-lag) uno se siente mal.
- Estudios poblacionales demuestran que la
mayor parte de la población sufre jet-lag
social crónico:
-Sufrir jet-lag social
correlaciona con el
consumo de tabaco/
alcohol/cafeína y
obesidad.
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Ritmos circadianos en humanos
- Concientización en el ámbito laboral.
- Concientización en la escolaridad.
- Concientización en el ámbito hospitalario.
- La administración de drogas terapéuticas es mas efectiva en
momentos del día específicos: cronofarmacología.
Sueño
Como definirlo?
- Acompañando de un estado de quiescencia.
- Aumento del umbral de respuesta a estímulos externos.
- Regulado Circadianamente (C).
- Regulado Homeostáticamente (S).
Por que dormimos?
- No se sabe.
- Vital.
- Hipótesis de la homeostasis sináptica.
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Mensaje para llevar a casa:
-Los ritmos circadianos son oscilaciones de alrededor de 24hs
endógenas, autosostenidas e independientes de la temperatura.
-Son sincronizables por diferentes claves ambientales (zeitgebers).
-Existen diferentes modelos de relojes.
-Molecularmente algunos dependen mayoritariamente de loops de
transcripción y traducción de genes que inhiben su propia
expresión (TTFL) y otros de ciclos de fosforilación y
desfosforilación de proteínas (PTO). La oscilación del estado de
oxidación podría constituir otro tipo de reloj.
-En mamíferos el oscilador central se encuentra en el NSQ, en
otros animales en la glándula pineal, o en circuitos neuronales en
el cerebro o el ojo.
-Probablemente todas las funciones celulares estén en mayor o
menor medida reguladas circadianamente (ténganlo en cuenta
para su próximo experimento!).
Gracias!
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