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2014 Volumen 6, No 12. Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila Cronobacter sakazakii: Un Patogeno Emergente Transmitido Por Alimentos Cronobacter sakazakii: A Food Borne Emergent Pathogen Gabriel Antonio Luján Medina 1, Araceli Loredo Treviño 2*, Cristóbal Noe Aguilar1 1 Departamento de Investigación en Alimentos. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Autónoma de Coahuila. 25280, Saltillo, Coahuila, México. 2 Instituto Politécnico Nacional – Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional Unidad Durango, México. *Autor de correspondencia: [email protected]; [email protected] Resumen El género Cronobacter es un grupo de bacterias nuevas o emergentes que se han relacionado con infecciones letales en recién nacidos porque se ha encontrado en las fórmulas lácteas con la que los infantes son alimentados y es capaz de sobrevivir en condiciones de desecación hasta por dos años. Esta bacteria produce infecciones gastrointestinales, septicemias y meningitis, por esto, por su letalidad y por su resistencia en condiciones que otras enterobacterias no sobreviven, es que es de importancia en la industria alimentaria. En los últimos diez años se han llevado a cabo reuniones internacionales para tomar medidas respecto a este tema y dar recomendaciones para disminuir su incidencia. Esta revisión toca temas como la importancia de Cronobacter, identificación, fuentes de contaminación, síntomas de la infección y algunas estrategias para evitar que esta bacteria prolifere. Palabras clave: fórmula láctea en polvo, meningitis, enterobacterias. Abstract The genera Cronobacter is a new group of bacteria that have been related with letal infection in new borns, because it has been found in diary formulas used to feed the babies, and it is capable of surviving in dry conditions up to two years. These bacteria causes gastrointestinal infections, septicemia and meningitis and because of this, their fatally rate and their resistance in conditions where other enterobacteria die, it’s important on food industry. In the last ten years there have been meetings to address this subject and provide recommendations to diminish their incidence. This paper reviews the importance of Cronobacter, its identification, contamination sources, symptoms of infection and some strategies to avoid the proliferation of these bacteria. Keywords: powdered infant formula, meningitis, enterobacteria. INTRODUCCIÓN Cronobacter, que se llamaba antes Enterobacter sakazakii, es una bacteria de la familia Enterobacteriaceae, relacionada con los géneros Enterobacter y Citrobacter (http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/17/9/11-0260_article.htm). Fue nombrada por el dios Cronos, uno de los titanes de la mitología y padre de Zeus, que se tragaba a cada uno de sus hijos tan pronto nacían. Esta bacteria causa infecciones letales en neonatos (Iversen y col., 2008) y se ha aislado frecuentemente del ambiente y de alimentos como trigo, arroz, hierbas y especias, así como varios productos alimenticios como alimentos con alto contenido de almidones y fórmula láctea deshidratada para bebés. Esta bacteria es muy resistente y puede vivir en lugares muy secos así como también se ha encontrado en aguas residuales (http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/17/9/11-0260_article.htm). Las infecciones por Cronobacter no son comunes, sin embargo, pueden ser muy serias para bebés y gente de la tercera edad o inmunocomprometida como gente con VIH, que tuvo algún transplante o enfermos de cáncer (http://www.cdc.gov/Cronobacter/definition.html). Cronobacter sakazakii es una bacteria nueva en las infecciones transmitidas por alimentos por lo cual se le ha considerado como un patógeno emergente y se ha asociado a infecciones infantiles, causando meningitis infantil, bacteremia y enterocolitis necrosante y es una causa de muerte entre los recién nacidos, los ancianos y adultos inmunocomprometidos (Forsythe, 2005; Kim y col, 2005; Lehner y col., 2005). La infección por lo general tiene una alta tasa de letalidad, que va de 10%-80%. Esto ha sido un 24 2014 Volumen 6, No 12. Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila peligro para la salud de los lactantes ya que las condiciones inapropiadas de manufactura y almacenamiento de la leche en polvo han sido los principales factores de contaminación, es por eso que las fórmulas lácteas infantiles han sido identificadas como una importante fuente de contaminación por esta bacteria. Los primeros informes de infección causado por Cronobacter fue en 1958 en Inglaterra (Urmenyi y col., 1961; Strydom y col., 2012). Simón y col., 2010 investigaron un caso de meningitis en una unidad de prematuros, donde encontraron la presencia de Enterobacter sakazakii en las heces y sangre del neonato y en las muestras del preparado en polvo de la cual se originó la infección, como resultado de una inadecuada preparación y conservación del producto una vez reconstituido. El conocimiento actual de la virulencia y de la epidemiología de este organismo es limitado. Sin embargo, debido a que los recién nacidos son alimentados frecuentemente con fórmulas lácteas en polvo, este producto ha sido el centro de atención para reducir el riesgo de infección para los neonatos (http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/17/9/11-0260_article.htm). IDENTIFICACIÓN Cronobacter es un bacilo gram negativo, móvil, con un tamaño de 1-3 µm aproximadamente, es anaerobio facultativo, no formador de esporas y generalmente tiene flagelos y es móvil (Farmer y col., 1980; Kucerova y col., 2010; Kucerova y col., 2011). Las colonias formadas por esta bacteria producen un pigmento de color amarillo en agar tripticasa de soya (Farmer y col., 1980). En las figuras 1 y 2 se puede ver el crecimiento en agar tripticasa soya. Las colonias pueden ser rugosas o lisas pero con el pigmento amarillo y consistencia viscosa. Figura 1. Cultivo de Cronobacter sakazakii en agar tripticasa soya después de 3 días de cultivo a 25 °C. Colonias rugosas. (http://www.emlab.com/m/media/Esakazakii_ER1107.jpg) El género da negativo para la prueba de oxidasa y positivo para catalasa, reduce nitrato, utiliza citrato, hidroliza esculina y arginina y da positivo para descarboxilación de Lornitinina. Produce ácido de D-glucosa, sacarosa, rafinosa, melibiosa, celobiosa, D-manitol, D-manosa, L-rhamnosa, Larabinosa, D-xilosa, trealosa, galacturonato y maltosa. Generalmente da positivo para producción de acetoína (reacción de Voges-Proskauer) y negativo para rojo de metilo, lo que indica una ruta de 2-3 butanodiol más que una fermentación ácida mixta. El crecimiento ocurre entre 6 y 45 °C en caldo infusión de cerebro-corazón y a pH 5 y 10 y se ha reportado, según lo medido por el equipo Biolog Phenoype MicroArray, que ninguna cepa de este género crece a menos de valores de 4.5 de pH. El crecimiento también se da en concentraciones de cloruro de sodio de hasta 7 % (w/v) y no se da en concentraciones de 10%. El crecimiento también es posible en concentraciones de hasta 100 mM de sulfato de amonio, nitrato de sodio y nitrito de sodio; en 200 mM de fosfato de sodio, en 5% de sulfato de sodio y en 20% de etilenglicol. La bacteria no crece en concentraciones mayores de 20 mM de benzoato de sodio. Diferentes especies pueden causar infección, pero la especie tipo es Cronobacter sakazakii, (ATCC 29544) que fue aislada de la garganta de un niño en 1980 por Farmer (Iversen y col., 2008). En 2002, la FDA ideó un método para la detección de Cronobacter en la fórmula en polvo para lactantes, que implicó el enriquecimiento en agua y el caldo de enriquecimiento para Enterobacteriaceae para luego cultivar en placas de agar de glucosa rojo violeta bilis y agar de soya tripticasa. Figura 2. Cultivo de Cronobacter sakazakii en agar tripticasa soya después de 3 días de cultivo a 25 °C. Colonias lisas. (http://www.rightdiagnosis.com/phil/images/3033.jpg) 25 2014 Volumen 6, No 12. Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila Cetinkaya y col., 2013 compararon métodos moleculares y no moleculares para la identificación de cepas de Cronobacter que habían sido aisladas recientemente a partir de ingredientes utilizados en la preparación de la fórmula infantil. Cetinkaya y col., 2013 demostraron que los métodos moleculares tales como 16S rADN, y la tipificación multilocus de secuencias (MLST) son mucho más fiables que los métodos no moleculares. la médula espinal y causa su inflamación, produciendo meningitis. La enfermedad por Cronobacter generalmente empieza con fiebre y poca hambre, llanto o muy poca energía y algunos presentan convulsiones. Los bebés son meningitis pueden desarrollar problemas serios o duraderos en el cerebro y hasta 4 de 10 bebés con meningitis causada por Cronobacter pueden morir. En el resto de la población, Cronobacter, puede causar problemas en cortadas, raspones o lugares en donde haya habido operaciones. Y también puede infectar el tracto urinario. La gente mayor o inmunocomprometida o que ya tengan alguna infección, puede tener Cronobacter en su sangre. Se han identificado siete especies del genero Cronobacter; C. sakazakii, C. malonaticus, C. muytjensii, C. turicensis, C. dublinensis, C. universalis y C. condimenti (Iversen y col., 2007; Cetinkaya y col., 2012; Cetinkaya y col., 2013). IMPORTANCIA EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA En la tabla 1 se muestran los resultados del estudio de Iversen y col, en el 2008, respecto a la diferenciación bioquímica que llevaron a cabo para 8 cepas de Cronobacter. Los valores positivos (+) son cuando más del 90% de las cepas probadas dan positivo para la prueba; V, cuando es del 20-80% de las cepas dan positivo y los valores negativos (-) son para cuando menos del 10% de las cepas dan negativo. Esto puede servir para diferenciarlos de otras bacterias de la familia Enterobacteriaceae. Cronobacter tiene gran importancia en la industria alimentaria ya que se considera como un patógeno (Pogotto y col., 2008). Se ha encontrado en alimentos de origen animal y vegetal ya sean crudos, frescos, congelados, fermentados o cocidos (Gurtler y col., 2005; Friedemann, 2007; Baumgartner y col., 2009; Arroyo y col., 2011). Las principales fuentes de contaminación de los alimentos son muy probablemente suelo, agua y hortalizas, además los roedores y moscas pueden servir como una vía secundaria de contaminación (Iversen y col., 2003). A diferencia de otras Enterobacterias, el organismo puede mantenerse en fórmula láctea en polvo hasta dos años (Caubilla-Barron y col., 2007). SÍNTOMAS DE INFECCIÓN POR CRONOBACTER La enfermedad se ve diferente dependiendo de la persona. En bebés, especialmente menores de dos meses, las bacterias entran en la sangre o llegan al recubrimiento del cerebro y de Tabla 1. Taxa. 1: C. sakazakii; 2: C. malonatus; 3: C. turicensis; 4: Cronobacter genomospecies1; 5: C. muytjensii; 6: C. dublinensis subsp. dublinensis; 7: C. dublinensis subsp. lactaridi; 8: C. dublinensis subsp. Lauannensis. Característica Producción de indol· Utilización de fuente de carbono Dulcitolǂ Lactulosa Malonato* Maltitol Palatinosa Putrescina Melezifosa Turanosa Myo-inositolǂ Cis-aconitato Trans-aconitato 1-0-metil-x-D-glucopiranósido 4-aminobutirato 1 - 2 - 3 - Cepas 4 5 + 6 + 7 + 8 V + + + + + V + + + + + + + V + V + + + + + + + + + + + + + + + + + + V + + V V + + + + V + + + + + + + + + + + + + + + + V + + + + + + V + + + + + + + V + V + V V + · Usando reactivo de Kovac’s después de cultivo en triptona. ǂ Datos adicionales del MicroArreglo de Fenotipos de Biolog. * Usando caldo malonato-fenilalanina. 26 2014 Volumen 6, No 12. Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila Principalmente, esta bacteria se ha asociado con bebidas infantiles a base de leche que provienen de fórmula infantil en polvo y de utensilios usados en la preparación de la formula (Lai, 2001; Lehner y col., 2011; Muytjens y col., 1988; Reich y col., 2010; Zeller-Péronnet y col., 2012). En relación a estos productos, se han realizado varios estudios y se ha identificado casos documentados de Cronobacter spp. por infección en niños menores de tres años de edad, en todo el mundo, algunos de los cuales terminaron en la muerte del paciente (Norberg y col., 2012), pero es importante hacer notar que estas infecciones son raras y además, no todas han estado asociadas con la ingestión de fórmula láctea reconstituida. De hecho a) la leche materna tampoco es estéril, b) C. malonaticus fue aislado de abscesos mamarios, c) Cronobacter ha sido aislado de leche materna de nodrizas, e) el organismo ha sido aislado de tubos de alimentación enteral de neonatos que están a dieta no láctea y f) la mayoría de las infecciones de Cronobacter, aunque son menos severas, son en la población adulta (Kucerova y col., 2011). Cronobacter demostró mayor tolerancia a la desecación en comparación con bacterias tales como E. coli y especies de Salmonella (Breeuwer y col., 2003). Cepas de Cronobacter pueden sobrevivir en sustancias con una actividad de agua (Aw) baja, tales como los cereales de arroz infantiles (Aw entre 0,3 y 0,69) y de leche para lactantes (Aw entre 0,25 y 0,5) (Strydom y col., 2012), por lo que constituye un riesgo de infección en caso de que los alimentos se preparen de manera descuidada. FUENTES DE CONTAMINACIÓN Algunas veces, las fórmulas lácteas se contaminan mientras son procesadas en la fábrica si los ingredientes usados están sucios o si la fórmula toca alguna superficie que tenga Cronobacter. Los fabricantes de estas fórmulas reportan que no es posible quitar todos los gérmenes de estos alimentos e incluso, la bacteria puede entrar en contacto con ellos cuando la fórmula es abierta en casa o en algún biberón sucio. No se sabe si este microorganismo puede ser pasado de persona a persona. Cronobacter tiene la capacidad de formar una cápsula de polisacárido que lo ayuda a resistir la desecación y a protegerlo contra agentes desinfectantes, además de que le confiere la propiedad de adherirse fácilmente a materiales como silicón, látex, policarbonato y en menor medida a acero inoxidable. También se ha encontrado que es capaz de formar biopelículas sobre vidrio y cloruro de polivinilo (Kuraceva y col., 2008). Todos estos materiales son comunes en la preparación de alimentos para bebés, además de que la composición de los alimentos lácteos ayuda a la resistencia contra los desinfectantes como se observó en un estudio en dónde se usaron 13 desinfectantes comunes en la preparación de fórmulas lácteas para infantes y no se obtuvo un descenso en el número de unidades formadoras de colonias de Cronobacter después de aplicarlos (Kim y col., 2007). Afortunadamente, un estudio de la FAO/WHO del 2008, encontró que sólo un 3% de un total de 91 muestras de fórmula láctea, contenían a la bacteria (Kucerova, y col., 2008). ESTRATEGIAS PARA COMBATIR A CRONOBACTER Debido a la atención que se le ha dado a este organismo por estar relacionado con infecciones infantiles, ha habido cambios en los criterios para preparar la fórmula que se les da a los recién nacidos pero aún se necesitan procedimientos regulativos y apoyo. Ha habido tres reuniones para cálculo de riesgo por la FAO y la WHO (Food and Agriculture Organiation; World Health Organization) en 2004, 2006 y 2008 relacionadas con la preparación de ese alimento. Las poblaciones con riesgo fueron los recién nacidos, especialmente los de bajo peso porque su alimentación se verá limitada a leche materna o fortificada o reemplazo de leche materna por lo que la preparación higiénica es de suma importancia debido al estado de inmadurez de sus sistemas inmunológicos. Las recomendaciones claves de estas juntas fueron: preparar la fórmula láctea con agua arriba de 70 °C, no preparar las fórmulas con tiempo para minimizar el tiempo de almacenamiento y, si el almacenamiento es necesario, hacerlo por debajo de 5 °C. El agua caliente disminuirá el número de células vegetativas presentes y reducir el tiempo de almacenamiento reducirá la multiplicación de organismos que sobrevivan. Estas recomendaciones se pueden consultar en el documento de la FAO “Guidelines for the safe preparation, storage and handling of powdered infant formula” (Kucerova, y col., 2011). Sin embargo, es de notarse que cuando varias especies de Enterobacter sakazakii fueron descritas, se incluyó una cepa aislada de leche en polvo, en 1960, por lo que es posible que Cronobacter haya estado presente en productos con leche en polvo por muchas décadas (Kucerova, y col., 2011). El calor ha sido uno de los métodos que ha garantizado la inocuidad de los alimentos. El problema principal del calor es su falta de especificidad, ya que al mismo tiempo que atenúa microorganismos, también se modifican y dañan el valor nutricional y las propiedades sensoriales de los alimentos. Los microorganismos expuestos a una temperatura subletal, la cual es la temperatura un poco más arriba de la temperatura de crecimiento del microorganismo, le confiere la capacidad de soportar el estrés por el calor que pueda ser letal para estos (Linton y col., 1992; Murano y col., 1992). Este fenómeno se conoce como la respuesta del choque térmico y ha sido observado en diversos patógenos transmitidos por alimentos como los son: Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes y Escherichia coli O157: H7 (Linton y col., 27 2014 Volumen 6, No 12. Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila 1992; Murano y col.., 1992; Lin y col.., 2004; Chang y col., 2004). tecnologías que permitan la elaboración de alimentos más seguros. Wan-Ling y col., 2010 estudiaron el comportamiento y supervivencia de Cronobacter sakazakii en dos bebidas fermentadas comerciales, en tratamientos de secado por aspersión y secado por aspersión por congelación y en la fermentación de leche descremada, donde demostraron el efecto del choque térmico, el cual le confirió a la cepa la capacidad de soportar condiciones adversas como el calor, pH, etanol y bacteriocinas de las bacterias lácticas presentes en las bebidas fermentadas. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Pina-Perez y col., (2013) estudiaron el efecto potencial de la combinación de cacao el cual contiene una gran cantidad de polifenoles, con el campo de pulsos eléctricos (PEF) y demostraron la inactivación de células de Cronobacter sakazakii inoculadas en la leche para lactantes. Ellos atribuyen este efecto a una mayor sensibilización de las células bacterianas a PEF como resultado de la exposición prolongada a los polifenoles del cacao que actúan sobre la estructura de la membrana celular bacteriana interfiriendo con la producción de ciertos aminoácidos necesarios para el crecimiento bacteriano. Esto demuestra la importancia de utilizar la tecnología para aumentar potencialmente la eficacia de inactivación de bacterias de gran importancia como lo es Cronobacter sakazakii en la industria alimentaria. Finalmente, Cronobacter es susceptible a antibióticos como ampicilina, gentamicina y cloramfenicol, sin embargo, se ha visto que algunas cepas desarrollaron resistencia contra ellos, por lo que se propuso cambiar a carbapenemos o cefalosporinas de tercera generación con aminoglucósidos o trimetroprim con sulfametoxazol (Lai, 2001). COMENTARIOS FINALES Cronobacter sakazakii se ha considerado como un nuevo patógeno en la industria alimentaria, por eso, es de importancia conocer sobre su morfología, las fuentes de infección y sobre todo las formas de combatirlo e identificarlo en productos alimentarios. Debido a que su presencia en fórmulas lácteas para niños ha llamado la atención, es necesario reforzar y promover las buenas prácticas de manejo de alimentos en todos los niveles, además de buscar nuevos tratamientos para la eliminación o inactivación de esta bacteria. Es importante también hacer notar que la frecuencia de la presencia de esta bacteria o de sus infecciones es baja, por lo que no es problema de salud inminente, sin embargo, la letalidad de Cronobacter en poblaciones susceptibles es muy alta por lo que la pronta identificación y tratamiento es de suma importancia, al igual que con otras infecciones. 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