ηi(s) = I0 El efecto NOE I
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ηi(s) = I0 El efecto NOE I
EFECTO NOE (Nuclear Overhauser Effect) RMN H1 H3 4 H4 H2 3 2 H2 1 H1 H3 NOESY H4 H2 H1 H4 H3 El efecto NOE NOE (Nuclear Overhauser Effect) Cambio de intensidad de una señal correspondiente a un espín i cuando se perturba la señal de un espín s. ηi(s) = I-I0 I0 x 100 (%) El cambio de intensidad puede ser positivo o negativo La perturbación utilizada es la aplicación de una radiofrecuencia adicional y selectiva sobre el espín i provocando su “saturación” ¿Por qué se produce? El NOE es la consecuencia de la respuesta del sistema a la perturbación (intentos de recuperar la situación de equilibrio) El spin I y el S deben tener un mecanismo de relajación común (acoplamiento dipolar) Qué factores influyen en el NOE ? Distancia de los spins ( < 5 Å) Movilidad de la molécula y/o grupos que la constituyen Procesos de relajación que puedan competir con el que origina el NOE FUNDAMENTOS RMN m = -1/2 Núcleo de hidrógeno Número cuántico espín nuclear I= 1/2 m= -I…+I m = +1/2 -1/2 ∆E = h υ υ = Β0γ/2π m = 1/2 Condiciones de equilibrio estado de menor energía ligeramente más poblado EL EFECTO NOE Si consideramos un sistema de dos espines I1 e I2 podemos emplear el diagrama de energía: N-δ δ N I2 H H I1 N N+δ δ poblaciones en el estado de equilibrio Existen tres tipos de transiciones: W1 cambio de estado de un único espín por relajación longitudinal (T1) W0 cambio simultáneo del estado β α para un espín y del estado α β para el otro. W2 cambio simultáneo de los dos espines en la misma dirección β α W0 y W2 requieren interacción dipolar entre los núcleos EL EFECTO NOE H El NOE es la consecuencia de la respuesta del sistema a una perturbación H I2 (intentos de recuperar la situación de equilibrio) I1 Invertimos las transiciones de I1 N-1/2δ δ W1 no afecta I2 N+1/2δ δ N-1/2δ δ relajación longitudinal N+1/2δ δ (T1 espín-red) poblaciones I1 saturado Transiciones W1 originan señales en el espectro W0 y W2 requieren interacción dipolar entre los núcleos Transiciones W0 y W2 no producen señales en el espectro pero afectan a las poblaciones y dan lugar a NOE Procesos de relajación cruzada N-1/2δ H I2 N-1/2δ+∆ H I1 N+1/2δ−∆ la transición W0 disminuye la diferencia de población entre los niveles α y β de I2 y después de un pulso 90 esto resultará en una disminución de la señal I2 NOE negativo N+1/2δ N-1/2δ-∆ N-1/2δ N+1/2δ N+1/2δ+∆ la transición W2 aumenta la diferencia de población entre los niveles α y β de I2 y después de un pulso 90 esto resultará en aumento de la señal I2 NOE positivo El signo e intensidad del NOE depende del balance entre las velocidades de cada una de estas rutas Ejemplo: Sistema de 2 núcleos I, S de espín I =1/2 en la misma molécula La población de cada nivel depende de su energía de acuerdo con distribución de Boltzmann. Si γS distinto de γI NOE heteronuclear η Intensidad del NOE observado σ = W2-W0 constante de velocidad de relajación cruzada ρ = 2W 2 1+W2+ W0 velocidad de relajación dipolar longitudinal Determina el signo y la magnitud del NOE observado Depende de los movimientos moleculares EFECTO NOE Y MOVIMIENTOS MOLECULARES Las transiciones W0 y W2 requieren campos magnéticos con la frecuencia adecuada. W0 diferencia de frecuencias de los núcleos ωI1-ω ωI2 unas pocas ppms (100-1000 Hz) W2 suma de las frecuencia de los dos espínes ωI1+ ωI2 (1000 MHz) Estos campos magnéticos pueden ser generados por el movimiento de los espines. Por tanto existe relación entre los proceso de relajación de las magnetizaciones de RMN y los movimientos moleculares porque entre ambos procesos puede tener lugar intercambio de energía. B0 olo di p lu sf dip o lo s nte a u ct dipolos fluctuantes sf lu c tu a nte s En solucion, (τc, tiempo de correlación ) significa rotación de la molecula (tiempo que tarda en girar un radian). Los espines quedan alineados con el campo Bo externo mientras la molecula rota, y esto genera campos magnéticos (dipolos fluctuantes) a la frecuencia de la rotacion que permiten que el sistema libere o intercambie energía magnética. Si los movimientos moleculares son muy rápidos (moléculas pequeñas) tendrán preferencia las transiciones de tipo W2 (frecuencias del orden de la suma de las frecuencia de los dos espínes ωI1+ ωI2 (?1000 MHz). Si los movimientos moleculares son lentos (macromoléculas) tendrán preferencia las transiciones de tipo W0 (frecuencias del orden de la diferencia de las frecuencia de los dos espínes ωI1- ωI2 (?1000 Hz). FUNCIÓN DE CORRELACIÓN 1 volteo rápido FT (transformada de Fourier) volteo lento C(t) 0 FUNCIÓN DE DENSIDAD ESPECTRAL J(ω ω) tiempo C(t)= e –t/τ c τc tiempo de correlación τc ps moléculas pequeñas τc ns moléculas grandes frecuencia τc J(ω)= 1+ω ω2 τc2 • Como la probablilidad de que una transicion ocurra depende de las distintas frecuencias que el sistema tenga (o densidad espectral), los terminos W son proporcionales a J(ω). • Igualmente, como se necesitan una interacción dipolar entre los espines, el NOE es proporcional a rIS-3(distancia entre los espines) ya que la intensidads de la interacción entre dipolos depende del inverso del cubo de la distancia entre estos. Por tanto las probabilidades de transición W van a depender de rIS-6 : El NOE va a decaer muy rápido a medida que los espines se separen. Para protones el NOE solo será observable cuando estén a distacias inferiores a 5-6 Angstroms) J (0) J(2w) volteo rápido J(ω)= J(ω ω) τo volteo lento 1+ω ω2 τo2 frecuencia NOEs positivos Se requieren valores altos de la función de densidad espectral a la frecuencia ω = 2 ω0 se dan para τ0 cortos moléculas pequeñas < NOEs negativos Cuando Los efectos de las mecanismos W0 y W2 se cancelan y no se observa efecto NOE NOE max Para τ0 largos domina el mecanismo W 0 y tendremos NOEs negativos moléculas grandes 6 0.5 4 2 0.0 0 -2 -4 -6 -8 -1.0 - 10 - 12 0 5 10 ωτc ωτ 15 OBSERVACION EXPERIMENTAL DEL NOE NOE estacionario NOE transitorio Experimentos monodimensionales bidimensionales saturación EXPERIMENTOS NOE estacionario 1H 1D 90° ∆ τm 2D NOESY τm 1D NOESY Selective 90° or 270° NOE transitorio Selective 180° τm 1D transient NOE inversión 1H Selective 180° τm 1D DPFGSE NOE PFG 1H 90° * ∆ Selective 90° or 270° τm SL τm SL * 2D ROESY 1D ROESY 2D LAS DISTANCIAS INTERPROTÓNICAS ¿Pueden deducirse cuantitativamente? ¿Cómo se deducen? HAY MUCHOS PROBLEMAS: flexibilidad escala de tiempos de movimientos locales Steady-state NOE • In small, rigid molecules the following relationships are valid: (ω ωωI --ωωS))**ττc<< 1 (ω I S c<< 1 ωωS **ττc<< <<11 S c ωωS **ττc << 1 S c << 1 (ω ωωI ++ωωS))**ττc<< (ω <<11 I S c •They move really fast. There is a simplification of the probability equations, and we end with a simple dependency for the NOE enhancement: ηI = 0.5. •We had the rIS-6 dependency there and now it’s gone. The problem is that we have only two spins, and this basically means no ‘geometry’. This is normally the case for 1H-13C. • Fortunately, when we look at the proton enhancements in a molecule, we are always looking at more than one proton. This means that if we irradiate a proton, it will be dipolarly coupled to several protons at the same time. b c a rba rac Steady-state NOE (continued) • What happens is that we have competing relaxation mechanisms for the proton we are saturating (two or more protons in the surroundings). Now the rates of the relaxation with the different protons becomes important (the respective Ws). • The equations get really complicated, but if we are still in the extreme narrowing limit, we can simplify things quite a bit. In the end, we can establish a ‘simple’ relationship between the NOE enhancement and the internuclear distances: fIf{S} {S}==ηηmax ** I max rrIS-6-6--ΣΣX fXf {S} * rIX-6-6 IS X X{S} * rIX rrIS-6-6++ΣΣX rrIX-6-6 IS X IX • In order to estimate distances between protons in a molecule we can saturate one nuclei and analyze the relative enhancements of other protons. This is know as steady-state NOE. • We take two spectra. The first spectrum is taken without any irradiation, and the second with. The two are subtracted, and the difference gives us the enhancement from which we can estimate distances... NOE difference spectroscopy • If our molecule has three protons, two of them at a fixed distance (a CH2), we have: Hb C Ha Hb Hc Ha Hc _ ηηab ∝∝rrab-6-6 ab ab = ηab ηac rrac ==rrab **((ηηab / /ηηac ))-1/6 -1/6 ac ab ab ac ηηac ∝∝rrac-6-6 ac ac • Since we have a reference pair of protons (Ha and Hb) for which we know the distance, we can establish a reference NOE effect for it, and then calculate the distance between the other protons (Ha and Hc in this example): • The sizes of the peaks are measured by integration. Since the effect is not symmetric, we usually do the I S and then the S I enhancement and take an average value. Transient NOE • One of the problems of steady-state NOE is that we are continuously giving power to the system (saturation). This works well for small molecules, because W2 processes (double-quantum) are dominant and we have few protons. • However, as the size and τc increase, other processes are more important (normal single-quantum spin-spin relaxation and zero-quantum transitions). • Additionally, there are more protons in the surroundings of a larger molecule, and we have to start considering a process called spin diffusion: I S • Basically, the energy transferred from I to S then diffuses to other nuclei in the molecule. We can see an enhancement of a certain proton even if it is really far away from the center we are irradiating, which would give us ambiguous results. • Therefore, we need to control the amount of time we saturate the system. The longer we irradiate, the more spin diffusion… Transient NOE (continued) • There are also some technical difficulties if we try to do this by selective saturation. Since what we need is to see how a system returns to equilibrium through crossrelaxation, we can selectively invert one transition and then see how the NOE grows with time: (∗∗∗∗) αβ ββ (∗∗) W1I W2IS W0IS W1S βα () W1I αα (∗∗) W1S • A pulse sequence to do this could be the following: 90 180s tm selective inversion • The last π / 2 pulse is usually called a read pulse, and its only job is to convert whatever magnetization is in <z> after tm into <xy> magnetization (detectable). All the equations are the same, but the NOE will also depend on the mixing time, tm. Transient NOE (…) ηmax • If we do it for different tm values, we get NOE build-up curves, which in the case of two isolated protons and ideal conditions are exponentials that grow until they reach ηmax. tm • If we also take into account the T1/T2 ηmax relaxation, the NOE grows and then falls to zero (all the magnetization returns to the <z> axis…): tm Transient NOE and NOESY • If we had more spins and spin diffusion, the curve (for three spins, I, S, and X) would look like this: ηmax Diffusion to X tm • If we want to measure distances more or less accurately, we have to find a compromise between the mixing time tm that we use and the spin-diffusion we may have. • Doing one proton at a time takes forever, so we obviously use a 2D experiment in which we study all protons at the same time. The sequence is called NOESY (NOE SpectroscopY), and it’s shown below: 90 90 t1 “inversion” 90 tm 1H 90° ∆ 2D NOESY τm ∆ 90 90 etiquetado de frecuencias τ inversión 90 m evolución efecto NOE PARÁMETROS EXPERIMENTALES -Calibración del pulso de 90º -Elección del tiempo de mezcla adecuado: macromoléculas τm < 200 ms moléculas pequeñas τm 600 , 700 ms hasta 1s relajación cruzada NOESY (continued) • The first two pulses (with the t1 variable time) are basically an inversion for all protons, in which we label everything with chemical shifts and couplings (no refocusing). • What ends up in the <-z> axis evolves during the tm mixing time, and dipolarly coupled spins will suffer NOE cross-relaxation according to all the equations we’ve seen. • The 2D spectrum after 2D FT has chemical shifts in both f1 and f2 (t2 has all the chemical shifts also) and cross-peaks for systems that are dipolarly coupled: δ (f1) Hc Hb Ha C Ha Hc Hb δ (f2) • The size of the cross-peak will depend on the internuclear distances. These are measured relative to a cross-peak for which we know a distance, using the crosspeak volumes. Efecto NOE : determinación de distancias experimentales Aproximación de 2 espines en el límite de tiempos de mezcla cortos: La velocidad inicial sólo depende de la relajación cruzada del par de espines. Si no hay variación en el tiempo de correlación la velocidad inicial sólo depende de la distancia internuclear. A = exp [-R τm] R= ρi σij σik ... σji ρj aij = -σij τm ∝ 1/ rij6 σij 2 espines σjk ... Tiempo de mezcla σki σkj ρk ... ... ... ... ... aij = -σij τm + Σσ ik σkj τm2 + .... Las distancias: Aproximación de spines aislados Isolated spin pair aproximation (ISPA) HO OH HO HO HO OH O OH H O H H r H1’-H4 = 1,5 1,0 0,0 NOE H1’-H4 0 250 500 750 1000 1250 1500 Tiempo de mezcla (ms) σ H1’-H4 σ H1’-H3’ 2,0 0,5 OH NOE H1’-H3’ 2,5 NOE(%) O = r-6 H1’-H4 r-6 H1’-H3’ r H1’-H3’ σ H1’-H3’ σ H1’-H4 distancia conocida 2 espines 1/6 σij M (0)= P0*P1 Tiempo de mezcla Tratamiento de la Matriz de Relajación R= ρ1 σ12 σ13 ... σ21 ρ2 σ23 ... σ31 σ32 ρ3 ... ... ... ... ... Ecuación de Solomon d η=- R. η dt NOEs directos e indirectos H Σσ ik σkj τm2 + .... H Matriz A de Intensidades NOE A = exp [-R τm] En general se debe considerar toda la red de espines aij = -σij τm + H j i k Efecto NOE : Determinación de distancias experimentales NOE ∝ r -6 Difusión de spín: Efectos a 3 ó más espines pueden causar errores importantes en la distancia NOESY problemas identificación : moléculas grandes picos indirectos igual signo picos directos moléculas pequeñas distinto signo 2 espines 3 espines Efectos a 3 espines pueden distinguirse por la pendiente de la curva de crecimiento de NOE. Pendiente positiva a Tm cortos. Empleo de experimentos ROESY OH HO HO O D OH O HO O H OH H C H H B OH A rAB=rAC NOEAB>NOEAC OH HO HO O OH O HO O H3 OH H2 H1 HB OH NOESY ROESY Cuando Los efectos de las mecanismos W0 y W2 se cancelan y no se observa efecto NOE NOE max 6 0.5 4 2 0.0 0 -2 -4 -6 -8 -1.0 - 10 - 12 0 5 10 15 ωτc ωτ σΝΟΕ = C . <r -3>2 . [ 6 J(2ω) - J (0) ] σROE = C . <r -3>2. [ 2 J(0) + 3 J (ω) ] ROESY: Siempre + ROE(τc) 0.5 0.0 NOEmax ROEmax -0.5 Magnetización confinada en el plano xy mediante la aplicación de un pulso largo de potencia intermedia. Relajación dipolar conduce al efecto Overhauser en el sistema rotatorio. NOE(τc) -1.0 1x10-11 1x10-10 1x10-9 1x10-8 τc [s] Picos ROESY distinto signo que picos diagonales Artefactos TOCSY del mismo signo que la diagonal σΝΟΕ = C . <r -3>2 . [ 6 J(2ω) - J (0) ] σROE = C . <r -3>2. [ 2 J(0) + 3 J (ω) ] Flexibilidad A rAB A B NOE AB = f (r-6 AB ) B A NOE AB = f ( <r-6 AB> ) B “virtual” Conformación de alta energía Intercambio ‘virtual’ H H2N 2.7-3.0 A RO OH O O φ/ψ 0/− 0/−60 OH H NH2 H OH O 2.5 A R E (kcal/mol) 180 350 4 120 300 5 60 250 -150 -100 d15=2.5A 83% g) 0 5 ψ( d e -50 -60 0 Φ( d eg 50 ) -120 100 150 -180 d14=2.3A 17% 4 Conformación y flexibilidad Ψ NOEs exclusivos NOE H1´-H4 ‘syn’ 90-95% AMBER mapa de energía Ψ ‘anti’ 5-10% NOE H1´-H3 <r-6> = χa <r-6 A> + χb <r-6 B> <r’-6> = χa <r’-6 A> + χb <r’-6 B> NOE ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL Búsqueda conformacional Estructuras generadas Simulación de NOE: programa NOEPROM Características: • • • • NOE estacionario, 2D NOESY y 2D ROESY Equilibrio conformacional Simulación simultánea de toda la red de protones Flexibilidad: modelos dinámicos Distancias modelo/s Matriz de relajación Intensidades NOE Cálculos de NOE con matriz de relajación completa El NOE teórico puede calcularse a partir de la/s conformación/ones A = exp [-Rteór. τm] NOEPROM: R = -ln[Ateór. ] / τm Tratamiento de múltiples conformaciones: Mapas de Energía, MD, SA, -180-120 -60 0 180 120 120 60 y 60 % NOEteór. 60 120 180 180 0 0 -60 -60 -120 -120 -180 -180-120-60 0 f -180 60 120 180 El problema inverso: DEDUCCIÓN DE LA ESTRUCTURA A PARTIR DE LOS NOE Problemas con NOE Ambigüedades en la asignación: quiralidad, pro-quiralidad, solapamiento de señales → Considerar un conjunto de posibles asignaciones del NOE. Falta de asignación, asignación incorrecta, ruido, equilibrio conformacional, solapamiento en pico diagonal Distancias imprecisas → Introducir un cierto margen de error en la distancia permitida produce imprecisión en la estructura. Su efecto no es demasiado crítico si se tiene un número suficiente de restricciones en esa zona de la molécula. Matriz de distancias incompleta Matriz R incompleta Introducción de restricciones NOE en cálculos moleculares MM Metodo I Restricciones de distancia fijas previamente deducidas a partir de la intensidad del NOE se introducen en el cálculo de la energía Intensidad NOE restricción distancia A Optimizar geometría B dA-B < dmax La optimización de la geometría se realiza mediante MM incluyendo un término de pseudo-energía basado en las distancias NOE calculadas E = EMM + Edist. + ... Edist. = Σ f (rij-rij0) funcion biharmónica f (rij-rij0) = Otras posibilidades de f : funcion cuadrada, cuadrada suavizada ó simétrica 0 (r - r0)n Si r ≤ r0 Si r > r0 r0 valor deseado de distancia Cálculo de estructuras 1028 NOES 234 intrarresiduo 405 corto alcance 101 medio alcance 288 largo alcance 1185 NOES 249 intrarresiduo 434 corto alcance 133 medio alcance 369 largo alcance 20 estructuras RMSD 2,22 Å 20 estructuras RMSD 1,66 Å 1407 NOES 261 intrarresido 472 corto alcance 185 medio alcance 489 largo alcance 20 estructuras RMSD 1,03 Å Introducción de restricciones NOE en cálculos moleculares MM Metodo II Se simula el propio efecto NOE con matriz R durante el refinamiento Intensidad NOEteórica/exp. restricción distancia Optimizar geometría E = EMM + ENOE + ... Esquema de algoritmos iterativos: Estructura de partida Espectros NOESY a varios τm Matriz A teórica Matriz A experimental Matriz A mezclada Matriz R A = exp [-R τm] Restricciones de distancia Estructuras refinadas Programas: IRMA, MARDIGRAS, CANDID, DINOSAUR, HADDOCK ... Güntert et al., J. Mol. Biol., 2002, 319, 209-227 Dominguez, C. et al. J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 1731 - 1737 NOESY discodermolida TR-NOESY disodermolida/tubulina Conformación enlazada