Matrices libres de ácidos nucleicos: regeneración de
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Matrices libres de ácidos nucleicos: regeneración de
Laboratorio clínico y biotecnológico 19 Matrices libres de ácidos nucleicos: regeneración de columnas de extracción de ADN El coste de la purificación de ácidos nucleicos ha sufrido un incremento en el curso de los últimos años. Durante más de dos décadas se han ido desarrollando sistemas de purificación de ADN y ARN más eficientes y focalizados a aplicaciones concretas [1,2]. El polvo de cristal (“glass milk”, “batch procedure” [3]), o columnas de silica, permite protocolos rápidos y eficientes. Este logro técnico se correlaciona con un incremento de costes en los procedimientos de purificación puesto que las columnas de silica utilizadas hoy en día son de alta tecnología. El hecho de que no todos los ácidos nucleicos son eliminados de la matriz de silica después de su primer uso, hace que las columnas no se puedan reciclar. Normalmente, entre el 5-10% de los ácidos nucleicos purificados queda atrapado en la matriz de silica. Este ADN residual contiene tanto moléculas libres como moléculas complejas con partículas proteicas o fragmentos bacterianos (Figura 1). Por tanto, incluso reutilizando las columnas para la preparación del mismo plásmido, la capacidad de retención de ADN se reduce. Además, las columnas que se han utilizado con moléculas de ADN recombinante deben ser autoclavadas antes de desecharse par evitar peligros ecológicos. Como resultado, los laboratorios que utilizan este tipo de columnas para la purificación de ácidos nucleicos no tan sólo están utilizando productos de alto coste, sino que, además, se tienen que hacer cargo de los costes del manejo de residuos potencialmente peligrosos. Aquí presentamos el novedoso sistema de regeneración de columnas para el uso de purificación de ADN MAXXBOND. Tanto la electroforesis con geles de agarosa [2] como el análisis con PCR [4] demuestran que las columnas regeneradas están libres de ácidos nucleicos al 100%. Palabras clave: columnas de retención de ADN, regeneración, potencial de ahorro, MAXXBOND. Pronosticamos que el uso de columnas regeneradas puede llevar a la reducción del coste del aislamiento y purificación de ácidos nucleicos en más del 70%. Para que un producto de regeneración sea efectivo, debe cumplir algunos requisitos: • debe ser rápido y sencillo • debe eliminar completamente todos los ácidos nucleicos (tanto los libres como los atrapados) • no debe dañar la matriz de sílice • debe regenerar por completo la capacidad de unión de la columna • debe ser asequible Estos requisitos son cumplidos por los dos componentes del sistema MAXXBOND, que son el buffer de regeneración 1 (RG1) y el buffer de regeneración 2 (RG2). El proceso de regeneración es análogo al usado en el aislamiento de ADN mediante columna, y permite una regeneración eficiente de las columnas en aprox. 30 minutos (ver figura 2). En primer lugar, RG1 se pipetea en el interior de la columna y se incuba durante 30 minutos. Durante este paso, todas las moléculas residuales de ADN (tanto las libres como las atrapadas en partículas) son degradadas y liberadas de la columna. Tests de incubaciones durante 24 horas demuestran que la columna y la matriz de sílice no son dañadas por RG1. RG1 se elimina mediante una centrifugación de 1 minuto. Después, se aplica RG2 en la columna para eliminar e inactivar cualquier resto de RG1 y regenerar la capacidad original de unión de la columna. Existe también la posibilidad de reunir un número mayor de columnas usadas y regenerarlas después al mismo tiempo. Sistema de regeneración de columnas de extracción de ADN MAXXBOND Kit de reciclaje en cuestión de aprox. 30 minutos absolutamente exento de ADN ● inagresivo para el material de la columna ● biodegradable y no tóxico ● ● El nuevo procedimiento de regeneración MAXXBOND ha sido probado en varios laboratorios de referencia durante varios meses y no se ha detectado ningún artefacto contaminante. Para verificar que las columnas regeneradas mediante MAXXBOND no contienen trazas de ADN procedentes de las muestras anteriores, dichas columnas fueron tratadas con 50 µl del tampón de elución adecuado y las muestras eluidas fueron analizadas. Se utilizaron análisis en geles de agarosa y análisis de PCR para verificar que en las muestras eluidas no ¡Borde especialmente ancho para el manejo rápido y seguro así como para su rotulación – sólo en nuestras columnas! Además ofertamos: XMORE – Juego de recarga del buf- ● MAX ● Moléculas ADN libres Inclusión en partículas protéicas fer, para los componentes del kit de espín Kits de espín Plas/midi & Plas/mini para la separación de plásmidos de alto y mediano número de copias mediante minicolumnas de espín, apropiadas para clonificaciones, secuenciaciones y PCR. Inclusión en fragmentos bacterianos Figura 1: Principio y problemas asociados con la purificación de ADN plasmídico utilizando columnas. Después de que las moléculas de ADN se atrapen en la matriz de silica, el ADN es purificado con lavados y eluido. Dicha elución se lleva sólo el 90-95% de las moléculas de ADN de la matriz de silica. El ADN residual permanece atrapado en la matriz en forma de moléculas libres, inclusiones en partículas proteicas y/o fragmentos bacterianos. Las moléculas de ADN residual contaminan la columna y reducen la capacidad de retención de ADN. Biochemica Chemica Synthesis Service Darmstadt tiene otra casa de primera: AppliChem GmbH, Ottoweg 4, 64291 Darmstadt Teléfono: 06151/9357-0, Fax: 06151/9357-11, [email protected], www.applichem.com Laboratorio clínico y biotecnológico Regeneración de las columnas ADN en aprox. 30 minutos 1er paso: eliminación de los 5-10% de ADN residuales 2° paso: Eliminación de los resíduos de RG1 y regeneración de la capacidad original de retención de la columna 20 Columna: Plásmido: Uso: Incubación por 30 min. Centrifugación Plásmido X Centrifugación directa Figura 2: Esquema del procedimiento de regeneración de columnas de extracción de ADN mediante el nuevo MAXXBOND. Se aplican a la columna sucesivamente 750 µl de las soluciones de regeneración RG1 y RG2. El proceso completo de regeneración se realiza en tan aprox. 30 minutos. Producto PCR Oligonocleótidos era posible detectar moléculas de ADN residual procedentes del primer aislamiento (ver figura 4A). Una misma columna de extracción puede ser reutilizada hasta 20 veces para el aislamiento de nuevas muestras de ADN. El aislamiento de ADN plasmídico mediante columnas regeneradas con MAXXBOND cumple todos los estándares de calidad para Biología Molecular y resulta idéntico al aislamiento de ADN plasmídico mediante columnas nuevas. El ADN obtenido con las columnas regeneradas con MAXXBOND fue probado con éxito en varias aplicaciones de Biología Molecular como screening de ADN plasmídico, clonaje, digestiones de restricción, aislamiento de fragmentos de ADN, ligamientos, transformaciones, etc. Como consideraciones adicionales al desarrollo y éxito del nuevo sistema de regeneración MAXXBOND, destacan las características innovadoras de las soluciones que propone: • Todos los componentes de MAXXBOND son biodegradables, inofensivos o no tóxicos para los seres humanos Columna: Plásmido: Uso: Figura 3: Demostración de la capacidad de retención regenerada después de 20 ciclos de uso. Las columnas A o B se usaron y regeneraron durante 20 ciclos de purificación de ADN plasmídico originado a partir de cultivos celulares de E. Coli. Las muestras de ADN eluidas se linearizaron mediante restricción enzimática y analizadas en gel de agarosa. El gel fue fotografiado tras su correspondiente tinción con Bromuro de Etidio. Figura 4 A Figura 4 B Figura 4 A y B: Demostración de que las columnas regeneradas con MAXXBOND no contienen moléculas de ADN residuales de purificaciones previas. Se utilizaron las columnas C y D para la purificación del plásmido X. Después de la regeneración de las columnas se purifica un segundo plásmido Y con las mismas columnas. Separación electroforética en gel analítico de agarosa (4A) de las alícuotas equivalentes a las purificaciones de ADN. La gran diferencia entre los pesos moleculares de X y Y permiten la rápida identificación de cualquier tipo de contaminación. La segunda purificación de la muestra Y no contiene ninguna traza de la primera muestra X. El ADN plasmídico fue linearizado mediante restricción enzimática antes de la electroforesis. El análisis por PCR (4B) no identificó ninguna molécula de ADN en la primera purificación. Previamente a la purificación de la muestra Y, las columunas C y D fueron tratadas con RG1 durante 24 horas y 5 minutos respectivamente. Entonces, se dispensaron 750 µl de RG2 en cada columna. Finalmente, se centrifugaron con 50 µl de buffer de elución (10 mM Tris, pH 8.0). De estos 50 µl eluidos, alícuotas de 2 µl se añadieron a 50 µl de mezcla de reacción PCR junto con los oligonucleótidos apropiados para el inserto X. (C1: Control con plásmido ADN X (1ng); 0: sin muestra; C2: Control con plásmido ADN X (1ng) y 2 µl de cada eluido posterior a la regeneración de la columna C y D; C: 2 µl de eluído de la columna C posterior a la purificación del plásmido X y regeneración (24h); D: 2 µl de eluido de la columna D posterior a la purificación del plásmido X y regeneración (5 min.). • No utiliza ni ácidos ni bases agresivas. No se detectan daños ni en el material ni el equipo, incluso durante incubaciones prolongadas • Las propiedades catalíticas y cooperativas de los componentes de la solución causan una rápida y eficiente eliminación o degradación de moléculas biológicas, como fragmentos de membrana, proteínas y ácidos nucleicos • Las soluciones permanecen activas incluso en rangos de pH de 6 a 8 El nuevo sistema de regeneración MAXXBOND puede ser aplicado a todas las columnas que contengan matriz de sílice disponibles en el mercado. Datos preliminares indican que otros materiales de unión como polvo de vidrio o partículas minerales pueden también ser regenerados mediante MAXXBOND. El nuevo producto MAXXBOND está ahora disponible para científicos tanto del campo académico como del industrial que intentan conseguir optimizar sus protocolos de aislamiento de ADN y reducir una parte sustancial de los costes. El sistema de regeneración MAXXBOND y las soluciones están pendientes de patente. Bibliografia: [1] Birnboim, H.C. & Doly, J. (1979) A rapid alkaline lysis procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, 1513-1522. [2] Sambrook, J. et al., eds (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. [3] Vogelstein, B. & Gillespie, D. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 615-619. [4] Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. & White, T.J. (eds) (1990) PCR Protocols – A guide to methods and applications. Academic Press, Inc., San Diego, California Anote el Dr. Karl-Heinz Esser, Prof. Dr. Thomas Lisowsky multiBIND biotec GmbH, Otto-Hahn-Str. 15, D-44227, Dortmund, Alemania Dr. Wolfram H. Marx AppliChem GmbH, Ottoweg 4, D-64291 Darmstadt, Alemania