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Universidad de La Habana
Facultad de Biología
TESIS DE DIPLOMA
Utilidad de antígenos especie-específicos
autóctonos para el serodiagnóstico de la
infección por Helicobacter pylori
Autor: Frans Nghihepavali Nghoshi
2015
Universidad de La Habana
Facultad de Biología
TESIS DE DIPLOMA
en opción a la Licenciatura en Biología
Utilidad de antígenos especie-específicos
autóctonos para el serodiagnóstico de la
infección por Helicobacter pylori
Autor: Frans Nghihepavali Nghoshi
Tutores: Lic. Onelkis Feliciano Sarmiento, MSc.
Lic. Rosabel Falcón Márquez, DrC.
Asesor: Dr. Rafael Llanes Caballero, MSc.
Instituto de Medicina Tropical
“Pedro Kourí”
La Habana, 2015
“Pelix Qui Potuit Rerum Cognoscere
causas.”-“Happy is the person who can learn the
nature of things.”
Virgil
A mi familia
Por enseñarme que la unidad, la perseverancia y el
esfuerzo son el camino para lograr objetivos.
Agradecimientos
A Tresia y Joseph, mis padres, quienes le debo todo lo bueno que he
querido ser.
A mis hermanos y hermanas por su apoyo incondicional sobre mis
decisiones buenos y malas y no de dejar de pensar sobre mi nunca.
Dejo constancia de mi profundo y sincero agradecimiento a la
Universidad de La Habana, a todos mis profesores durante la carrera,
porque de cada uno de ellos aprendí mucho.
Deseo agradecer a la Profesora Dra. Rosabel Falcón Márquez todas las
atenciones prestadas, su sabia dirección y sus siempre acertados
consejos y orientaciones, que han permitido el desarrollo de este trabajo.
Por su paciencia, dedicación y por enseñarme siempre hacer las cosas
bien, apoyándome en cada momento. Me considero afortunado por haber
podido estar bajo su tutoría.
A la Profesora MSc. Onelkis Feliciano Sarmiento, quisiera darle las
gracias por todo el tiempo que me ha dedicado, por sus opiniones,
comentarios y correcciones.
Al Dr. Rafael Llanes le agradezco toda la ayuda prestada para la
finalización de este trabajo.
He de extender también mi agradecimiento a buena parte de las técnicas
del Laboratorio de Proteínas y Proteomicas, que siempre me han
facilitado la labor al realizar este trabajo. Muchas gracias Tatiana y Ceci
Torres por aguantar mi mandadera. A Celia por su apoyo durante mis
tiempos de estrés.
A mi amiga Huong Nguyen Thi ‘Huongcillo’ por su amistad gradezca,
inestimable ayuda y consejos para seguir adelante durante la carrera.
Mis compañeros de aula, G. Peréz, Susana, Elizabeth, Amanda,
Sandra, Jorge Félix, Naylin, Olivia, Saymé, Tania, Tony, Emma y
Laura que me ayudaron con el español tanto con los estudios desde primer
año de la carrera y por los tiempos divertidos que pasamos juntos durante
mi estancia en Cuba. Les agradezco enormemente por sus amistad y
generosidad.
A mi mejor amiga de la vida Hendrina, por no dejar de llamarme a pesar
de la larga distancia que estuvimos durante los últimos 6 años. Me siento
afortunado por conocerte en mi vida.
A mi amiga Julia por ser mi punto de apoyo, por acompañarme,
aconsejarme y por sus motivaciones en todos los momentos.
Mis compañeros de mi país que vinieron junto conmigo, los que encontré
aquí así como los que vinieron después de nosotros. Gracias por estar
junto conmigo en todos los momentos buenos y difíciles que tuvimos que
pasar y por ser mis amigos que puedo contar con hoy, mañana y para
siempre.
La viabilidad de este trabajo no habría sido posible sin la colaboración de
todos ustedes.
A todos mi más sincero agradecimiento.
Resumen
La inmunotranferencia (Western blot), es una herramienta útil para el diagnóstico de
la infección por Helicobacter pylori basada en la detección de antígenos reconocidos
diferencialmente por los anticuerpos de pacientes con síntomas gastroduodenales.
El presente trabajo, tiene como propósito la normalización de un Western blot propio
para el serodiagnóstico de H. pylori empleando antígenos autóctonos y de
referencia. Cultivos de H. pylori provenientes de las cepas ATCC 43504, 196A y
113A se trataron por sonicación para la obtención del lisado celular. Los extractos
se caracterizaron según su perfil proteico mediante SDS-PAGE. Se determinaron
por análisis densitométrico las cantidades óptimas de antígeno y anticuerpo
primario. El desempeño del sistema propio se comparó con un sistema ELISA
comercial frente a sueros de tres grupos de pacientes. La variabilidad en tallas
moleculares y densidades de las proteínas intracelulares de H. pylori autóctonas y
de referencia permitió contar con una fuente valiosa de antígenos para el sistema
propio de inmunodetección. Diluciones de 1:20 para el antisuero primario y 5 µg del
extracto lisado garantizaron los análisis densitométricos confiables. Los antígenos
mayoritariamente reconocidos por los sueros de pacientes infectados con H. pylori
fueron 31, 35-39, 46, 48, 85, 96 y el agrupamiento de 110-120 kDa y por los sueros
de pacientes no-infectados: 40-41, 43-44, 58-61 kDa. La capacidad diagnóstica del
sistema Western blot propio exhibió parámetros de desempeño superiores
(sensibilidad 96,5% y especificidad 90,0%) en comparación al sistema ELISA
comercial (sensibilidad 86,2% y especificidad 80,0%). El empleo de preparaciones
antigénicas obtenidas a partir de cepas autóctonas sugiere que el sistema Western
blot propio puede ser una prueba valiosa para el diagnóstico de H. pylori en Cuba.
Índice
I. Introducción…………………………………………………………………………………..1
II. Revisión Bibliográfica………......................................................................................4
II. 1 Generalidades de Helicobacter pylori…………………………………………………4
II. 1.1 Morfología y estructura de la pared celular…………………………………………….4
II. 1.2 Hábitat……………………………………………………………………………………..4
II. 1.3 Cultivo microbiológico……………………………………………………………………5
II. 2 Epidemiología……………………………………………………………………………..6
II. 3 Aspectos clínicos…………………………………………………………………………7
II. 4 Principales factores implicados en la virulencia…………………………………….9
II. 4.1 Flagelina…………………………………………………………………………………..9
II. 4.2 Ureasa……………………………………………………………………………………10
II. 4.3 Proteínas de choque térmico (HspA y HspB)………………………………………...11
II. 4.4 Catalasa………………………………………………………………………………....11
II. 4.5 Fosfolipasa y lipasa……………………………………………………………………..11
II. 4.6 Adhesinas y proteínas de membrana externa………………………………………..11
II. 4.7 Proteína activadora de neutrófilos (NAP)...............................................................12
II. 4.8 Citotoxina vacuolizante (VacA)………………………………………………….........13
II. 4.9 Citotoxina asociada a antígeno (CagA)................................................................13
II. 4.10 Antígeno inducido por contacto con el epitelio (IceA)………………………………14
II. 4.11 Gen A promotor de ulcera duodenal (dupA)………………………………………...14
II. 5 Inmunología………………………………………………………………………………15
II. 6 Diagnóstico de la infección por H. pylori…………………………………………….18
III. Materiales y Métodos……………………………………………………………………..24
III. 1. Selección de las cepas y sueros……………………………………………………..24
III. 1.1 Cepas……………………………………………………………………………………24
III. 1.2 Sueros…………………………………………………………………………………..24
III. 2. Condiciones de cultivo………………………………………………………………..25
III. 2. 1. Medio sólido…………………………………………………………………………...25
III. 2.2. Medio líquido…………………………………………………………………………..25
III. 3 Preparación del extracto de proteínas totales intracelulares……………………26
III. 3.1 Obtención de las células de H. pylori…………………………………………………26
III. 3.1.1 Ruptura celular por ultrasonido……………………………………………………..26
III. 4 Determinación de la concentración de proteínas………………………………….26
III. 4.1 Microensayo de BCA…………………………………………………………………..26
III. 5 Resolución de los extractos proteicos………………………………………………27
III. 5.1 Electroforesis SDS‐PAGE…………………………………………………………….27
III. 5.2 Coloración con nitrato de plata………………………………………………………..27
III.
6
Normalización
de
la
muestra
y
anticuerpo
primario
para
la
inmunoelectrotransferencia (Western blot)……………………………………………...28
III. 6.1 Determinación del rango dinámico de linealidad……………………………………28
III. 6.2 Revelado de las membranas………………………………………………………….29
III. 6.3 Determinación de la dilución adecuada de los sueros……………………………...29
III. 7 Análisis por densitometría…………………………………………………………….29
III. 8 Inmunodetección de antígenos de H. pylori………………………………………..30
III. 8.1 Criterios para la interpretación de los resultados……………………………………30
III. 9 ELISA……………………………………………………………………………………...30
III.11 Análisis de los resultados…………………………………………………………….31
IV.
RESULTADOS…………………………………………………………………………….......33
IV. 1 Obtención de extractos de proteínas totales intracelulares de H. pylori……...33
IV. 2 Perfil de proteínas de los extractos de H. pylori…………………………………...33
IV. 3 Rango dinámico de linealidad y dilución óptima del anticuerpo primario para
la inmunoelectrotransferencia…………………………………………………………..…37
IV. 4 Reconocimiento de antígenos de H. pylori por el sistema de Western blot..…39
IV. 5 Desempeño diagnóstico del sistema de Western blot propio…………………..44
V. Discusión…………………………………………………………………………………...48
VI. Conclusiones……………………………………………………………………………...58
VII. Recomendaciones……………………………………………………………………….59
VIII. Referencias Bibliográficas…………………………………………………………….60
I. INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
I. Introducción
Helicobacter pylori es una bacteria Gram negativa, microaerofílica, flagelada, que
puede adoptar una morfología bacilar o cocoide mientras coloniza la mucosa
gastrointestinal de su hospedero (Citterio et al., 2004). La infección por esa bacteria
es común a nivel mundial y se ha estimado que más del 50% de la población mundial
se encuentra infectada por este microorganismo (Thomson et al., 2010).
Catalogada como un carcinógeno humano de tipo I (Bauer y Meyer, 2011), H. pylori
se ha asociado a múltiples enfermedades gastroduodenales como gastritis crónica,
úlcera péptica, linfoma de tipo MALT y carcinoma gástrico (Ando et al., 2006).
A pesar de las elevadas tasas de prevalencia de la infección por H. pylori
encontradas a nivel global, menos del 10% de las personas infectadas presentan
síntomas relacionados con las enfermedades gastroduodenales (Azevedo et al.,
2009). El riesgo de desarrollar la enfermedad se ha asociado a múltiples factores
entre los que se encuentran la interacción específica entre el huésped-hospedero, las
variaciones en la respuesta inmunológica del hospedero y las diferencias en la
expresión de proteínas especie-específicas (Bernardini et al., 2007).
Varios factores de virulencia de H. pylori juegan un papel importante en la
patogénesis de las enfermedades causadas por este microorganismo. Entre los
principales determinantes proteicos identificados se encuentran: las adhesinas,
proteínas de membrana externa e interna, antígeno inducido por contacto con el
epitelio (IceA), toxinas: citotoxina asociada a antígeno (CagA), citotoxina vacuolizante
(VacA), proteína activadora de neutrófilos (NAP) y la enzima ureasa (Hosseini et al.,
2012).
Investigaciones que abordan la búsqueda de nuevos y mejores métodos para el
diagnóstico, se han focalizado en el estudio de los determinantes de virulencia y
proteínas específicas de los compartimentos sub-celulares (Zanotti y Cendron,
2014; Gutiérrez y Bayona, 2014).
1
INTRODUCCIÓN
Hasta el momento se han desarrollado múltiples métodos de diagnóstico clasificados
como invasivos y no invasivos. Los métodos invasivos aunque permiten la
observación de la bacteria y de las lesiones ocasionadas en el hospedero, tienen el
inconveniente de las molestias que producen al paciente, especialmente los niños, a
quienes en ocasiones se hace imposible la toma de la muestra. Por otra parte, el
diagnóstico de la infección por H. pylori usando métodos no invasivos posee las
ventajas que son herramientas de fácil uso, reproducibles, económicas y
ampliamente empleadas en estudios epidemiológicos (Mohammadi et al., 2008).
Dentro de ellas, la inmunoelectrotransferencia (Western blot, del inglés) y el ensayo
de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, de sus siglas en inglés) representan
valiosas alternativas para la evaluación de la respuesta inmune humoral frente
antígenos específicos de H. pylori (Megraud y Lehours, 2007), las cuales
contribuyen a dilucidar las tasas poblacionales de infección y su distribución
territorial.
El western blot es un método sensible y útil para el serodiagnóstico de la infección
por H. pylori que emplea antígenos especie-específicos reconocidos por los
anticuerpos séricos de pacientes adultos y niños con sintomatología gastroduodenal
(Klaamas et al., 1996; Lepper et al., 2004). Este método, permite identificar
novedosos antígenos que pueden constituir blancos putativos en el diagnóstico de H.
pylori (Khalilpour et al., 2013) y que además puedan reaccionar con anticuerpos de
baja abundancia en el suero del paciente.
La identificación de los principales antígenos bacterianos adquiere especial
significación, máxime cuando los sistemas de diagnóstico comerciales disponibles
sólo contemplan preparaciones antigénicas compuestas de cepas de referencia y
cepas aisladas en países de baja incidencia de la infección (Krah et al., 2004;
Treepongkaruna et al., 2006). Estudios previos en Cuba evalúan antígenos
obtenidos a partir de cepas de referencia y no de aislamientos autóctonos frente a
sueros de pacientes cubanos (Valmaseda et al., 2002; Roblejo et al., 2005; Torres
2
INTRODUCCIÓN
et al., 2008). Por tal motivo se carece de un sistema serológico de producción
nacional que nos permita profundizar en el comportamiento de la respuesta inmune
humoral de los pacientes cubanos que padecen o están expuestos a la infección por
H. pylori.
El Laboratorio de Referencia Nacional para Neisserias patógenas y Helicobacter, así
como de Proteínas y Proteómica del IPK han abordado la temática evaluando la
eficacia de métodos para la extracción de mezclas proteicas a partir de cepas
autóctonas y su posterior evaluación frente a una pequeña muestra de sueros de
pacientes infectados o no por H. pylori (Silega, 2011; Ramírez, 2013). Los trabajos
realizados resultaron en la obtención de antígenos autóctonos (intracelulares y subcelulares) especie-específicos, con uso probable en un sistema diagnóstico para
evaluar sueros de pacientes con síntomas gastroduodenales y sospecha de infección
por H. pylori.
La necesidad de contar con diagnosticadores oportunos en el Sistema Nacional de
Salud y de alcanzar el conocimiento adecuado de las características de la infección
en el entorno cubano, ha motivado la realización del presente estudio, para lo cual
nos propusimos los siguientes objetivos:
1. Caracterizar los perfiles proteicos de las cepas de referencia y autóctonas de
Helicobacter pylori.
2. Normalizar un sistema de inmunotransferencia empleando antígenos útiles en
el diagnóstico de la infección por Helicobacter pylori
3. Evaluar el reconocimiento de antígenos específicos de Helicobacter pylori
frente a sueros de pacientes clasificados por las pruebas de referencia.
4. Evaluar el desempeño de la inmunotransferencia en el diagnóstico serológico
de la infección por Helicobacter pylori.
3
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
II. Revisión Bibliográfica
II. 1 Generalidades de Helicobacter pylori
II. 1.1 Morfología y estructura de la pared celular
Helicobacter pylori es una bacteria Gram negativa, que mide aproximadamente 3.5
μm de largo por 0.5 μm de ancho con morfología curva, bacilar o espiral, que posee
de cuatro a seis flagelos unipolares cubierta por una membrana (envainado) y con
terminación bulbar, que la hacen altamente móvil (Warren y Marshall, 1983). Este
microorganismo posee una morfología espiral en forma de sacacorchos cuando se
encuentra en la mucosa gástrica y menos espiral cuando crece en medios artificiales.
Esta forma se puede perder en los cultivos más viejos o sometidos a situaciones
desfavorables para su crecimiento adoptando la forma cocoide (Amieva y Omar,
2008).
Estudios acerca de la superficie externa de H. pylori usando ácido tánico, han
revelado que presenta una estructura de glicocálix de unos 40 nm de grosor y pilli de
2 nm, que permiten la adherencia a las microvellosidades del epitelio gástrico
(Goodwin y Worsley, 1993). La pared celular posee un número variable de
proteínas de membrana, con tamaños que oscilan entre márgenes estrechos según
la técnica utilizada para su extracción y visualización. La electroforesis de estas
proteínas en geles de poliacrilamida revela 3 bandas principales de 54-57, 61-62 y 64
kDa y otras secundarias de 24.5, 28, 33 y 84 kDa. Asimismo, la pared celular
presenta un lipopolisacárido con diferentes conformaciones debido a la variabilidad
en los componentes polisacáridos (de Rafael et al., 1995).
5
II. 1.2 Hábitat
H. pylori es una bacteria que posee una capacidad única, la de poder persistir dentro
del ambiente extremadamente ácido del estómago, una barrera efectiva para impedir
la colonización gástrica por la mayoría de las especies bacterianas (Peek, 2003).
Estos microorganismos se encuentran primordialmente libres en el moco gástrico,
localizándose también en la superficie de las células epiteliales o en el intersticio
celular. Predomina la localización antral y suelen alcanzar una densidad de 106
unidades formadoras de colonias por gramo de tejido (Cover, 1997). Si bien la
mucosa gástrica es su lugar de asentamiento habitual, también se han aislado de
saliva, placa dental, heces, recto, sangre y secreciones respiratorias en caso de
neumonía post-aspiración (de Rafael et al., 1995).
El análisis genético ha permitido, comprobar que un individuo puede albergar en su
estómago cepas distintas pues el 14% de los infectados poseen múltiples genotipos
(Scholte et al., 2002).
II. 1.3 Cultivo microbiológico
El éxito en el cultivo de H. pylori está influenciado por el manejo de las muestras,
generalmente biopsias gástricas. Diversos agentes usados durante la endoscopía
pueden ser tóxicos para el microorganismo, como la benzocaína, la simeticona y el
glutaraldehído (Goodwin y Worsley, 1993). H. pylori es sensible a las condiciones
ambientales, por lo que el procesamiento de las muestras debe realizarse con
rapidez o en su defecto utilizar un medio de transporte. Los microorganismos
permanecen viables durante unas 5 horas cuando la muestra se conserva en suero
salino a 4ºC, o durante más de 24 horas si se emplean medios de transporte como
caldo de tioglicolato, infusión de cerebro-corazón, caldo de Brucella o el medio
6
Stuart. También se ha obtenido éxito remitiendo las biopsias en un tubo en seco para
que sean procesadas en menos de una hora (Gisbert, 2000).
Para obtener el crecimiento de los microorganismos se pueden utilizar medios de
cultivo no selectivos como agar infusión cerebro-corazón, Columbia agar o Brucella
agar, con algún suplemento, como un 5-10% de sangre de caballo o carnero,
hemoglobina, albúmina o emulsión de yema de huevo. Algunos autores recomiendan
emplear a la vez dos medios diferentes, uno selectivo y otro no selectivo, por ser
superiores los resultados obtenidos (de Rafael et al., 1995). Se requieren
condiciones de microaerofilia (5-7% de oxígeno y 5-10% de CO 2 ) y una temperatura
óptima de 35-37ºC, a un pH del 5,5 al 8,5 dependiendo del medio. Son necesarios al
menos tres días de incubación para obtener crecimiento en medio sólido, aunque se
recomienda que el período de incubación sea al menos de 7 días. Se obtienen
colonias circulares (1-2 mm) de aspecto convexo y translúcido (Goodwin y Worsley,
1993). La confirmación del diagnóstico se establecerá por las características del
microorganismo: Gram-negativo y catalasa, oxidasa y ureasa positivos (On et al.,
2005).
II. 2 Epidemiología
H. pylori es una bacteria cosmopolita y se estima que cerca de la mitad de la
población mundial está infectada. La prevalencia de esta muestra grandes
variaciones geográficas. En varios países en vías de desarrollo más del 80% de la
población es positivo a H. pylori, incluso en edades jóvenes (Bonyadi et al., 2010), a
diferencia de los países desarrollados donde la prevalencia en general se mantiene
por debajo del 40% y es considerablemente menor en los niños y adolescentes que
en los adultos y las personas mayores. Dentro de las áreas geográficas, la
prevalencia de H. pylori se correlaciona inversamente con el estatus socioeconómico
y cultural, en particular en relación con las condiciones de vida en la infancia
7
(Mohammadi et al., 2008) y a la vez que se correlaciona de forma significativa con la
edad (Ables et al., 2007).
La prevalencia de la infección en Cuba en pacientes pediátricos según estudios
realizados oscila entre un 30-40% (Rivas et al., 2008; Escobar y Pereira, 2003),
mientras que en adultos oscila entre un 40-78% (González- Carbajal et al., 2004;
Monner et al., 2013). La diferencia entre la prevalencia determinada en los
diferentes investigaciones se debe a los métodos de diagnósticos empleados así
como la combinación de cada uno de ellos para definir un caso.
II. 3 Aspectos clínicos
El descubrimiento de H. pylori ha supuesto una revolución en la Gastroenterología.
En el corto período de tiempo transcurrido desde su descubrimiento, el avance
experimentado en el conocimiento de la biología y la fisiopatología de la bacteria ha
sido enorme, habiéndose demostrado que constituye la principal causa de la gastritis
crónica y es un factor necesario para el desarrollo de otras enfermedades digestivas
(Boixeda, 1995).
En prácticamente todos los infectados se desarrolla una gastritis crónica, que no se
acompaña de síntomas y solamente en una pequeña proporción de los mismos
aparecerán enfermedades como la úlcera péptica, el adenocarcinoma gástrico o el
linfoma gástrico. Posiblemente, además de la infección como factor iniciador de la
inflamación en la mucosa gástrica y de la presencia de diferentes factores de
virulencia del microorganismo, sea necesaria la participación de factores del
hospedero y/o del ambiente, de manera que como resultado de su interacción
puedan surgir estas diferentes manifestaciones clínicas (van Amsterdam et al.,
2006). Entre los factores del hospedero, podrían ser importantes aquellos que
participasen en la distribución de los microorganismos dentro del estómago. Así,
podrían influir el polimorfismo genético de los receptores de las células epiteliales
8
gástricas a las que se adhieren los microorganismos y también el nivel de producción
de ácido. Si la secreción ácida fuese normal o alta, se facilitaría la colonización de
predominio antral asociada a la úlcera de duodeno. Si fuese baja, se facilitaría una
colonización proximal, con el desarrollo de pangastritis, favoreciéndose la aparición
de atrofia y en algunos casos, adenocarcinoma (Scholte et al., 2002).
Al colonizar la mucosa gástrica, la bacteria es capaz de producir una gastritis
superficial que permanece durante años; hasta convertirse en úlcera péptica
(duodenal o gástrica) o la gastritis atrófica, como antecedente para el desarrollo del
cáncer gástrico o linfoma gástrico de células B del tejido linfoide asociado a mucosa
(MALT) (Cho et al., 2008). La infección puede transcurrir de forma sintomática o
asintomática, estimándose que más del 70% de las infecciones son asintomáticas
(Crowe, 2005).
La gastritis aguda, que se origina posterior a la infección por H. pylori, puede
desarrollarse sin manifestaciones clínicas o bien estar acompañada de dolor
epigástrico, náuseas y vómitos (Cho et al., 2008). El diagnóstico y la descripción de
esta enfermedad, es poco frecuente, su curso es de 7 a 10 días y puede evolucionar
a la eliminación espontánea de H. pylori o más frecuentemente, a su cronicidad
(Kinderman y Lopes, 2009). La gastritis crónica se caracteriza por una infiltración
persistente de linfocitos y células plasmáticas, con la degeneración de la superficie
epitelial.
Esta enfermedad está determinada por el nivel de secreción ácida de las células
epiteliales y el sitio de colonización de la bacteria. En individuos donde la secreción
ácida se mantiene estable y carecen de células parietales, la colonización predomina
en el antro gástrico; mientras que una secreción irregular, involucra una colonización
en antro y cuerpo (Batista et al., 2009). La úlcera gástrica, se encuentra
particularmente en la transición de la mucosa del cuerpo al antro, desarrollándose en
individuos con secreción ácida disminuida; mientras que la úlcera duodenal se
9
desarrolla en el bulbo duodenal, una de las zonas más expuestas al ácido gástrico
(Fromm, 2009). Según algunos estudios, es probable que los individuos infectados
por H. pylori, tengan un riesgo de 3 a 10 veces mayor a padecer la enfermedad
ulcerosa (Azevedo et al., 2009).
La dispepsia funcional no ulcerosa, comprende entre sus signos más relevantes, la
distensión, regurgitaciones, reflujo ácido e incluso náuseas. La sintomatología puede
asemejarse a la úlcera en presencia de dolor abdominal y vómitos, aunque no son
identificadas anomalías estructurales en la mucosa gástrica mediante la endoscopía
digestiva superior (Sheu et al., 2010).
El desarrollo de la inflamación crónica por H. pylori, induce la destrucción de
glándulas gástricas y la deposición de tejido fibroso y nuevo epitelio intestinal. El
patrón y distribución de la inflamación, determinan el rápido progreso hacia la atrofia
(Franceschi et al., 2009); mientras que el grado de severidad y su extensión en
pacientes asintomáticos, incrementa el riesgo de 5 a 90 veces a padecer cáncer
gástrico (Ota et al., 2009). Estudios demuestran que el desarrollo secuencial de la
atrofia gástrica y la metaplasia intestinal, producto a la reducción de la secreción
ácida, aumenta el riesgo a padecer cáncer gástrico. Se estima por esto que la
colonización incrementa 10 veces las posibilidades de padecer cáncer gástrico
(Caselli et al., 2001).
El linfoma de tipo MALT aparece ante la colonización por H. pylori, aunque en menos
del 1% de los individuos infectados por la bacteria; una población de células B,
puede permanecer y proliferar para la formación del linfoma de células MALT (Hsu et
al., 2008).
10
II. 4 Principales factores implicados en la virulencia
Se han identificado diversos factores implicados en la patogenicidad y virulencia del
microorganismo así como en su prolongada persistencia, de entre los que destacan
la motilidad, las actividades ureasa y catalasa, la adhesión al moco y epitelio gástrico
y las toxinas VacA y CagA (Elizalde, 2004; Clyne et al., 2007).
A continuación enfatizaremos en las características de los principales determinantes
antigénicos de H. pylori por la relevancia que revisten en el estudio de este
microorganismo, sus implicaciones y diagnóstico de las enfermedades que ocasiona
y entre los que se encuentran:
II. 4.1 Flagelina
La motilidad es un factor fundamental para la colonización de la mucosa gástrica,
conseguida gracias a la morfología espiral y a la presencia de flagelos polares,
habiéndose comprobado en cerdos gnotobióticos que las variantes no flageladas no
son capaces de realizar tal colonización. Además su estructura espiral similar a un
sacacorchos, le permite introducirse a través de la capa de moco gástrico lo cual
favorece el acercamiento a las células epiteliales gástricas (Salamonte et al., 2010).
Los flagelos, se hallan constituidos por unidades proteicas nombradas flagelinas y
éstas están codificadas por los genes fla A para la flagelina A y fla B para la flagelina
B, con pesos moleculares de 53 y 54 kDa, respectivamente. Se han descrito
variantes alélicas en los genes que codifican la flagelina, lo que podría comportar
diferencias en motilidad entre distintas cepas. Se han descrito hasta 40 proteínas
relacionadas con la regulación, la secreción y el ensamblaje de la estructura flagelar
de H. pylori (Elizalde, 2004).
11
II. 4.2 Ureasa
La enzima ureasa, localizada en el citosol y la membrana bacteriana, es capaz de
generar amonio a partir de la hidrólisis de la urea y lo que permite crear un medio
relativamente alcalino que protege a las bacterias de la agresividad de la secreción
del ácido gástrico, hasta lograr sus ubicaciones entre la superficie celular y la capa
de moco que las cubren. Además, posee una elevada capacidad inmunogénica y
podría actuar como quimiotáctico para los leucocitos y activar los monocitos y los
neutrófilos, promoviendo la formación y liberación de radicales libres de oxígeno que
contribuirían a amplificar y perpetuar la respuesta inflamatoria local (Arenillas et al.,
2002).
La enzima ureasa está conformada por tres subunidades, Ure A, Ure B y Ure C, de
26.5, 61 y 13 kDa, respectivamente estabilizadas por níquel, siendo su peso
molecular de 550 kDa aproximadamente (Mégraud y Lehours, 2007). La subunidad
B tiene capacidad para ligarse con el receptor CD74, situado en la superficie de las
células epiteliales gástricas, una interacción que activa la producción de interleucina
(IL)-8 e induce el factor nuclear-kappa β (NFK-β) (Beswick et al., 2006).
II. 4.3 Proteínas de choque térmico (HspA y HspB)
La HspA es una proteína de 13 kDa y juega un papel en la integración de níquel en la
molécula de ureasa funcional mientras que HspB tiene un peso molecular de 58kDa
y funciona como una chaperona molecular de la ureasa. La expresión conjunta de
hspA y hspB en H. pylori incrementa la actividad de ureasa mediante
complementación funcional.
II. 4.4 Catalasa
La enzima catalasa, con un peso molecular aproximado de 50 kDa, confiere
capacidad de protección ante la acción de radicales libres de oxígeno, especialmente
12
peróxido de hidrógeno, generado por los neutrófilos en la mucosa gástrica. Está
compuesta por cuatro subunidades y habitualmente se localiza tanto en el espacio
periplasmático como en el citosol aunque existen evidencias de su expresión en la
superficie celular (Alfonso-Prieto et al., 2009).
II. 4.5 Fosfolipasa y lipasa
Estos factores, liberados por la bacteria en el sitio de colonización, son capaces de
degradar los fosfolípidos del mucus, que origina la pérdida gradual de la viscosidad,
lo cual debilita la función del moco como barrera protectora e incrementa la
retrodifusión de iones hidrógeno hacia la mucosa, afectando su integridad como
consecuencia de sus fuerte actividad lipolítica, de ahí sus importancia en la
ulcerogénesis (Langton y Cesareo, 1992). Las fosfolipasas A2 y C son proteínas de
bajo peso molecular entre 12–18 kDa. Su bajo peso molecular lo confiere la
capacidad de difundir o ser secretada externamente por la bacteria en
concentraciones suficiente para hidrolizar los fosfolípidos de la membrana celular del
huésped e iniciar el proceso inflamatorio visto en gastritis (Lumb et al., 1990).
II. 4.6 Adhesinas y proteínas de membrana externa
La adhesión se ve favorecida por varias moléculas, incluyendo lípidos, gangliósidos y
carbohidratos sulfatados, entre ellos sobresalen las proteínas BabA, SabA y OipA
que pertenecen a la familia de las proteínas Hop (“Helicobacter outer protein”, por
sus siglas en inglés).
La adhesina BabA una proteína de 75-78 kDa aproximadamente codificada por el
gen babA, el cual presenta dos alelos babA1 y babA2, pero debido a una inserción
de 10 pb en el extremo 3´, solo babA2 puede codificar para una proteína
completamente activa. Esta proteína media la unión de la bacteria a los antígenos
fucosilados Lewis-b de grupo sanguíneo presentes en la mucina gástrica MUC5AC y
en las células gástricas epiteliales (Lindén et al., 2002). Estudios revelan que esta
adherencia constituye un paso importante en la patogénesis, pues posibilita, el envío
13
de los factores de virulencia de H. pylori al interior celular (Maeda, 2009). En este
sentido, las cepas con codificación genética para la expresión de la adhesina activa
se han asociado, con el incremento en la inflamación y con el riesgo a desarrollar
úlcera duodenal y adenocarcinoma gástrico (Paniagua et al., 2009).
La adhesina SabA se liga a los antígenos Lewis-x expresados durante la inflamación
crónica (Dhar et al., 2003) y la adhesina OipA es una proteína de 34 kDa fue
identificada
originalmente
como
una
proteína
que
induce
la
respuesta
proinflamatoria. El gen que codifica esta proteína (gen oipA), está presente en todas
las cepas de H. pylori, pero su expresión esta modulada por un número de
repeticiones de dinucleótidicos CT en la región 5’ de este (Yamaoka et al., 2010). La
proteína media la unión de la bacteria al epitelio celular y conlleva la aparición de
modificaciones en el citoesqueleto de las células epiteliales e induce la secreción de
IL-8, que desempeña un papel importante en la respuesta inflamatoria asociada a la
colonización por H. pylori (Matteo et al., 2010).
II. 4.7 Proteína activadora de neutrófilos (NAP)
La proteína activadora de neutrófilos (NAP, por su sigla en el inglés), se libera al
medio en forma de oligómero con un peso molecular de 150 kDa. Al ser liberada,
actúa como una adhesina, mediando la unión de la bacteria a las mucinas presentes
en las células epiteliales (Montecucco y Bernard, 2003). Constituye uno de los
componentes más importantes en el daño que ocasiona H. pylori al epitelio gástrico
pues: induce la adhesión de neutrófilos al endotelio celular, a su vez, promueve la
producción y liberación de radicales libres de oxígeno y citocinas proinflamatorias en
los fagocitos y neutrófilos (Kusters et al., 2006). Además, estimula en las células
mononucleares la expresión coordinada de un pro-coagulante con actividad
antifibrinolíticas, que contribuye a la deposición de fibrina y por consiguiente a la
reacción inflamatoria.
14
II. 4.8 Citotoxina vacuolizante (VacA)
La citotoxina vacuolizante (VacA) está codificada por el gen vacA, presente en todas
las cepas de H. pylori, existiendo variantes alélicas para la región s (codifica el
péptido señal) y para la región m (media). VacA es una proteína de 87kDa, capaz de
reconocer y unirse a diferentes receptores de las células epiteliales en la membrana
plasmática en forma de hexámero, creando poros capaces de liberar entre otros
iones; el bicarbonato y la urea procedentes del interior celular (Kusters et al., 2006).
Aproximadamente la mitad de las cepas de H. pylori sintetizan esta toxina, que
induce la vacuolización citoplasmática de las células epiteliales, pudiendo también
causar apoptosis de las mismas, así como alteración en las uniones intercelulares y
en la activación de los linfocitos T (Dhar et al., 2003).
II. 4.9 Citotoxina asociada a antígeno (CagA)
La proteína CagA es codificada por el gen cagA, incluido en un segmento de unos 40
Kb conocido como isla de patogenicidad (PAI) constituida por más de 30 genes que
proporcionan mayor virulencia a las cepas que lo poseen, causando mayor infiltrado
inflamatorio en la mucosa gástrica.
Esta isla de patogenicidad ha sido adquirida por transferencia horizontal,
desconociéndose la procedencia y mantiene un contenido en guanina y citosina
distinto al de H. pylori como etiqueta del microorganismo donante. Se conoce que
codifica un sistema de secreción tipo IV que se deriva de una estructura flagelar
antigua, que constituye un túbulo a través del cual la proteína CagA se transfiere a la
célula epitelial del hospedero, para que una vez en su interior altere su citoesqueleto
y con ello refuerce la adhesión y supervivencia de H. pylori (Marshall, 2002; Kim et
al., 2006).
15
La expresión del gen cagA en cepas de H. pylori, así como la detección en suero de
anticuerpos anti-CagA, está claramente asociado a la progresión y desarrollo, de la
úlcera y cáncer gástrico. Este hecho evidencia la alta inmunogenicidad de la proteína
y su aplicación como biomarcador del riesgo a padecer cáncer gástrico (Shiota et
al., 2012).
II. 4.10 Antígeno inducido por contacto con el epitelio (IceA)
El IceA está asociado con un incremento de la inflamación gástrica. Se han descrito
dos variantes alélicas para este gen que son el iceA1 y el iceA2. La asociación de la
proteína IceA con el incremento del riesgo a desarrollar una gastritis o una úlcera
duodenal varía según la región geográfica en que se realice el estudio (Kidd et al.,
2001). Este antígeno también favorece el incremento de la concentración de IL-8 en
la mucosa gástrica (Figueiredo et al., 2000). En contraste, el alelo iceA2 no tiene
significación homologa a ninguna proteína conocida mientras que la expresión de
iceA1 se regula a partir del contacto que se establezca entre la bacteria y las células
epiteliales humanas. Las cepas portadoras de la variante alélica iceA2 son más
prevalente en los pacientes con gastritis asintomática y dispepsia no-ulcerosa (van
Doorn et al., 1998).
II. 4.11 Gen A promotor de ulcera duodenal (dupA)
El gen dupA es localizado en la zona de plasticidad y participa en la formación del
sistema de secreción tipo 4 (T4SS, por sus siglas en inglés). Se ha encontrado
relación significativa entre dupA y la ulcera duodenal y su presencia se relaciona con
la infiltración neutrófilica y alto nivel de producción de IL-8 por las células epiteliales.
Interesantemente, es que, las cepas que poseen este gen parece ser que son
incapaces de causar adenocarcinoma gástrico (Lu et al., 2005). Sin embargo, este
gen es altamente polimórfico (Cid et al., 2013).
16
De manera general, ninguno de estos factores ha demostrado ser un fiel marcador
para ayudar a identificar a los individuos en riesgo de padecer complicaciones
asociadas a la infección por H. pylori, más bien parece ser la presencia de varios de
estos factores actuando sinérgicamente, los que apuntarían a individuos en situación
de mayor o menor riesgo (Zambon et al., 2003). El genotipo de H. pylori parece ser
también importante para la aplicación de la terapia, pues según algunos estudios, las
cepas menos virulentas, son más difíciles de erradicar y podrían requerir de una
duración más prolongada del tratamiento (Scholte et al., 2002).
II. 5 Inmunología
En cuanto a la influencia ejercida por H. pylori, en la respuesta inmune del hospedero
es importante relatar que al colonizar el estómago, este microorganismo induce una
fuerte inmunidad humoral sistémica y local específica caracterizada por la infiltración
del epitelio gástrico por neutrófilos, linfocitos, macrófagos; además de la inmunidad
mediada por células, produciendo un daño tisular permanente de diversa magnitud
(Kusters et al., 2006). Como H. pylori rara vez, o nunca, invade la mucosa gástrica,
la respuesta del hospedero se desencadena principalmente por la unión de la
bacteria a las células epiteliales. El patógeno puede unirse a las moléculas del
complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC-II) en la superficie de las
células epiteliales gástricas, provocando la inducción de sus apoptosis (Rahn et al.,
2004). Los cambios adicionales en las células epiteliales dependen de la
translocación de la proteína CagA hacia el interior de las células gástricas epiteliales.
La enzima ureasa y las porinas de H. pylori pueden contribuir a la extravasación y la
quimiotaxis de los neutrófilos (Tufano et al., 1994).
H. pylori activa las moléculas de transducción de señales en las células epiteliales e
induce la sobreexpresión de IL-8, activando directamente el reclutamiento de los
neutrófilos (Innocenti et al., 2002). Además de esta vía, se producen elastasas por
17
parte de los neutrófilos, potenciando los niveles de la IL-8 y estimulando de nuevo la
activación de los neutrófilos. La inmunidad innata mediada por neutrófilos y
macrófagos está implicada en los procesos inflamatorios locales en la fase aguda de
la gastritis, mientras que la inmunidad adaptativa mediada por la infiltración de
células T y B tiene un papel importante en la fase crónica de la gastritis y respuestas
humorales específicas (Gascoyne et al., 2005).
Las cepas portadoras PAI inducen una respuesta de IL-8 mucho más fuerte que las
cepas no portadoras, y esta respuesta depende de la activación del NFK-β y el factor
de transcripción de respuesta temprana de la proteína 1 (AP-1) (Naumann et al.,
1999). La proteína NAP de H. pylori puede contribuir a la activación de fagocitos,
aunque su relación con el cuadro clínico no está bien definida (Evans et al., 1995).
Durante la respuesta inmune emergen diferentes subgrupos de células T, que
participan en la protección de la mucosa y ayudan a distinguir las bacterias
patógenas de comensales. Las células T auxiliadoras inmaduras (Th o células T
helper, del inglés) que expresan CD4 pueden diferenciarse en dos subtipos
funcionales: las células Th1, que secretan IL-2 e interferón gamma (IFNγ), y las
células Th2, que secretan IL-4, IL-5, e IL-10, estimulando a las células B que son
responsables de eliminar patógenos extracelulares (Suerbaum y Michetti, 2002).
Debido a que H. pylori no es invasiva e induce una fuerte respuesta humoral, se
esperaría una respuesta de células tipo Th2. Paradójicamente, las células T
específicas a H. pylori en la mucosa gástrica generalmente presentan un fenotipo
Th1 (Harris et al., 2000).
A pesar de que la infección por H. pylori induce una extensa infiltración de
neutrófilos, macrófagos y de linfocitos B y T el resultado final en zonas de alta
prevalencia es el establecimiento de una infección crónica y una pobre o nula
erradicación de la bacteria, así como también una alta tasa de reinfección a pesar de
tratamientos antibióticos agresivos (Ernst y Gold, 2000).
18
La infección persistente no incrementa la respuesta de las células T de memoria; al
contrario, los estudios realizados sugieren que disminuye dicha respuesta cuando se
compara con las células T de sujetos no infectados por H. pylori (Raghavan et al.,
2004). Este planteamiento se ha reproducido con la depleción de las células T
CD4+CD25+ de tejidos infectados con H. pylori o con la adición de IL-2 en los
cultivos de células T de memoria para H. pylori. El resultado ha sido la proliferación
de la respuesta celular contra la bacteria, que no ocurre en presencia de células T
reguladoras. En un estudio realizado se sugiere que las células T reguladoras tienen
la capacidad de suprimir la respuesta contra H. pylori y la subpoblación de estos
linfocitos se expande en el contexto de una infección crónica (Lundgren et al.,
2003).
Las células productoras de la IL-10 parecen ser cruciales en el control de la
inflamación inducida por H. pylori y permiten la persistencia de la bacteria en la
mucosa gástrica. Por ejemplo, H. pylori es incapaz de persistir en los ratones IL-10
knockout (Ismail et al., 2003). Probablemente las células T reguladoras CD25 juegan
un papel clave en este, como los ratones que carecen las células CD25 desarrollan
gastritis más severa después de haber reducido la carga bacteriana en la mucosa
gástrica (Raghavan et al., 2003). Del mismo modo, la eliminación de las células
CD25 en los voluntarios positivo a H. pylori dieron como resultado un aumento en la
proliferación y la producción de interferón gamma in vitro, lo que indica que la
infección por H. pylori resulta en la regulación negativa de la respuesta inmune a
través de interacción con las células T reguladoras (Stromberg et al., 2003).
Además de los daños asociados con la translocación de las proteínas mediadas por
Cag-PAI, las lesiones epiteliales que se relacionan con la infección por H. pylori son
consecuencias de varios mecanismos entre los que resaltan las especies reactivas
de oxígeno o de nitrógeno producidas durante la activación de los neutrófilos (Zhang
19
et al., 1996). La inflamación crónica también aumenta la renovación y la apoptosis de
células epiteliales, y esto puede deberse al efecto combinado de los contactos
directos entre las células epiteliales, la respuesta Th1 e IFNγ mediados por Fas (Rudi
et al., 1998).
La inmunoglobulina A (IgA) es la principal molécula secretada, por lo tanto, se podría
pensar que es la inmunoglobulina detectada con más frecuencia en el jugo gástrico
de pacientes infectados indicando una posible fase aguda de la enfermedad, aunque
existe dificultad para cuantificar estos anticuerpos en el jugo gástrico, puesto que su
concentración fluctúa, impidiendo que se convierta en un marcador de diagnóstico
(Shunji et al., 1998).
Algunos pacientes infectados por H. pylori tienen una respuesta de auto-anticuerpos
dirigidos contra la H+K+ ATPasa, una adenosina trifosfatasa (ATPasa) localizada en la
membrana celular de las células parietales gástricas que se correlaciona con mayor
atrofia del cuerpo del estómago (Negrini et al., 2000).
En sueros de pacientes donde los niveles de IgA e IgG anti-H. pylori son elevados,
estos parámetros se usan para la determinación de la prevalencia de infecciones
agudas y crónicas (Andersen et al., 1996). No obstante, en la actualidad otros
métodos son utilizados para el diagnóstico certero de las enfermedades asociadas
con esta bacteria.
II. 6 Diagnóstico de la infección por H. pylori
En la actualidad existen numerosos métodos para diagnosticar la presencia de H.
pylori, los cuales se han agrupado en 2 categorías: los métodos directos o invasivos
(prueba rápida de la ureasa, cultivo e histología de muestras tomadas de la mucosa
gástrica o duodenal) y los métodos indirectos o no invasivos, a través de los cuales
se realiza la identificación de productos metabólicos de la bacteria o la detección de
20
anticuerpos dirigidos contra proteínas específicas de su envoltura. Entre estas
pruebas se encuentran las serológicas (aglutinación bacteriana, fijación de
complemento, inmunofluorescencia indirecta, inmunoelectrotransferencia, ELISA) y la
prueba de aliento o determinación de urea marcada con C13, así como la detección
de antígenos en heces, orina o saliva. (Leal et al., 2008).
En años recientes han suscitado gran interés los métodos de diagnóstico molecular,
entre ellos la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), dirigida a
identificar el gen de la ureasa o 16S del ARN ribosomal, así como el análisis de
fragmentos de restricción (Vaira et al., 2000). Se han diseñado determinaciones de
ADN de H. pylori en sangre periférica, encontrando que el análisis por PCR es más
rápido y sensible para la detección de la bacteria que el cultivo en sangre (Huang et
al., 2006). Otros estudios novedosos, son la determinación de niveles séricos de
pepsinógeno I (sPGI) y pepsinógeno II (sPGII) que reflejan la cantidad de
pepsinógenos producidos en el estómago e indirectamente las alteraciones
morfológicas de la mucosa gástrica. Los niveles de sPGII representan un buen
marcador de inflamación gástrica, en antro y cuerpo y de infección por la bacteria.
Además una disminución de los niveles de sPGII después de erradicación de H.
pylori sugiere una terapia exitosa.
Los métodos invasivos a pesar de que permiten la visualización de las lesiones
ocasionadas en el hospedero, tienen el inconveniente de recurrir a endoscopías
digestivas que aunque es un procedimiento efectivo, de bajo costo y riesgo provocan
molestias indeseables a los pacientes y llegan a ser de práctica escabrosa en niños
con sintomatología gastroduodenal.
Por lo tanto el desarrollo de métodos no invasivos ocupa un lugar cimero en la
detección de H. pylori. Entre ellos, la prueba del aliento con urea marcada con C13 ó
C14 es una prueba global y no se ve sometida al sesgo que pueden tener otras
21
pruebas por la distribución parcheada de la bacteria en la cavidad gástrica, además
de ofrecer mayor sensibilidad y especificidad que otros estudios no invasivos.
Por otro lado, la prueba de detección de antígenos en heces podría resultar muy útil
en la población pediátrica (Gisbert y Pajares, 2004), en la cual la recogida de las
muestras para la prueba del aliento con urea marcada es difícil (Kindermann y
Lopes, 2009).
Alentadoras también han sido las pruebas serológicas para el diagnóstico de la
infección por H. pylori. Caracterizadas por su simplicidad, reproducibilidad,
economía, alta sensibilidad y especificidad, se basan en detectar la presencia de
anticuerpos específicos frente a antígenos de este microorganismo que aparecen
como consecuencia de la respuesta inmunitaria, tanto local como sistémica, que se
produce tras la infección por H. pylori. La principal desventaja de las pruebas
serológicas es que no son capaces de discriminar entre personas con infección
activa y personas sanas previamente expuestas a la infección. Por su bajo costo,
sensibilidad y carácter no invasivo, la serología resulta muy útil para el diagnóstico y
la realización de estudios epidemiológicos y determinar la prevalencia y la edad de
adquisición de la infección por H. pylori en diferentes poblaciones (Mohammadi et
al., 2008).
Dentro de los métodos serológicos para la detección de H. pylori existen la
aglutinación
bacteriana,
fijación
de
complemento,
hemoaglutinación
pasiva,
inmunofluorescencia indirecta, aglutinación mediante partículas de látex marcadas
con antígeno bacteriano, inmunoelectrotransferencia o inmunodetección y técnicas
de inmunoenzimoanálisis, siendo la técnica de ELISA la más sensible y más
empleada.
22
En la actualidad existen disponibles varios sistemas comerciales de ELISA para la
detección de anticuerpos específicos frente a H. pylori, con lo cual se ha disminuido
la reactividad inespecífica y por tanto se ha aumentado la especificidad de los
ensayos hasta un 98% (Megraud et al., 2007).
El grado de sensibilidad y especificidad de los sistemas ELISA depende de la
preparación antigénica empleada, del punto de corte utilizado, de las diferentes
diluciones del suero empleada y también del método utilizado como patrón oro o
referencia para decidir que un paciente está realmente infectado por H. pylori
(Negrini et al., 1992). Las diversas técnicas de ELISA desarrolladas emplean
preparaciones de antígenos específicos de H. pylori obtenidas por diversos métodos,
pero generalmente estos antígenos se preparan a partir de las cepas de referencia
(Cavazza et al., 2001).
Por otro lado, la inmunodetección en membrana de nitrocelulosa (-del inglésWestern Blot), es muy útil para evaluar la respuesta inmune contra antígenos
específicos, como VacA y CagA (Bermúdez et al., 2008). Mediante esta técnica, se
logra realizar un diagnóstico primario; además del monitoreo del tratamiento (Harris
et al., 2005), lo cual permite establecer relaciones entre el desarrollo de patologías
más severas y la presencia de determinados antígenos de H. pylori (Vilaichone et
al., 2003). Poseen una alta sensibilidad dada fundamentalmente por el hecho de que
cualquier proteína inmunorreactiva se concentra en una línea muy fina de la
membrana y pueden usarse mezclas antigénicas provenientes de cepas autóctonas.
Una de sus grandes utilidades es que puede diferenciarse la respuesta inmunitaria
con respecto a las diferentes clases de inmunoglobulinas mediante el empleo de
anticuerpos secundarios específicos de clase (Von Wulffen, 1992). Es la mejor para
identificar y caracterizar bioquímicamente las preparaciones antigénicas y sus
variaciones (Steward y Male, 1991) y permite conocer también si existe o no
23
proteínas con reacción cruzada en las diferentes preparaciones antigénicas (Lera,
2011).
Son muy utilizados sistemas comerciales para la detección de antígenos, la principal
limitación de estos estuches comerciales está dada por las mezclas antigénicas que
emplean se obtienen a partir de cepas de referencia y cepas aisladas en países de
baja incidencia (Mohammadi et al., 2008). Debido a la heterogeneidad de las cepas
que circulan en las diferentes zonas geográficas se hace necesario validar cada
juego comercial en la población particular donde se pretenda hacer extensivo su
empleo y de preferencia se recomienda el uso de sistemas caseros estandarizados a
partir de antígenos propios u autóctonos de la región donde se ensaya.
24
III. MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
III. Materiales y Métodos
III. 1. Selección de las cepas y sueros
III. 1.1 Cepas
Se seleccionaron dos cepas autóctonas de H. pylori 196A y 113A, aisladas de
pacientes cubanos con patologías gastroduodenales y conservadas a -80 °C en
caldo triptona soya más glicerol al 20% en el Laboratorio Nacional de Referencia de
Neisserias patógenas del Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí (LNRNP-IPK).
Estas cepas fueron previamente clasificadas como genotipos vacAs1m1/cagA+/iceA1
y vacAs1m2/cagA+/iceA2, respectivamente (Feliciano et al., 2015). También se
utilizó la cepa de referencia de H. pylori ATCC 43504, donada por la Dra. Eleonora
Altman, del Instituto de Investigaciones Biológicas de Ottawa, Canadá, clasificada
con el genotipo vacAs1m1/ cagA+/iceA2 (Altman et al., 2008).
III. 1.2 Sueros
Se seleccionaron 67 sueros conservados en la seroteca del Laboratorio Nacional de
Referencia de Neisserias Patógenas-IPK (LNRNP-IPK) provenientes de igual número
de pacientes con sintomatología dispéptica. Un primer grupo de 29 sueros fueron
obtenidos de pacientes clasificados como positivos a H. pylori (Grupo 1 positivo)
por tres métodos invasivos (histología, PRU y cultivo) (datos del LNRNP-IPK).
También se emplearon 20 sueros de pacientes con resultados negativos a las
pruebas invasivas (Grupo 2 negativo) y 18 sueros de pacientes denominados en
nuestro estudio como sueros incógnitas (Grupo 3 sin clasificación) de los cuales se
desconocían los resultados de las pruebas invasivas anteriormente mencionadas.
Como controles positivo y negativo se usaron mezclas de sueros clasificadas por un
ensayo de ELISA comercial cuyo valor índice (COI, de sus siglas en inglés) fue
mayor que 1,2 para el control positivo y menor que 1,2 para el control negativo
según Duquesne, 2013. El COI se calculó usando las lecturas de absorbancia
25
registradas para el sistema ELISA comercial de IBL INTERNATIONAL (Alemania)
siguiendo las recomendaciones del fabricante.
III. 2. Condiciones de cultivo
III. 2. 1. Medio sólido
Las cepas de H. pylori, se subcultivaron en medio agar chocolate Columbia (Biolife,
Italia), suplementado al 10% con sangre de carnero, al 1% con suero fetal bovino
(Biochrom AG, Alemania) y como suplemento inhibidor VCNT (vancomicina, colistina,
nistatina y trimetropim) (Biolife, Italia). Posteriormente las placas se incubaron en
condiciones de microaereofília (10% CO 2 , 5% O 2 , y 85% N 2 ) (sobres Campy Packs,
Oxoid) en una jarra de 2.5L (Oxoid, Inglaterra) durante 72 horas a 37ºC. La reidentificación de las colonias de H. pylori se realizó por las pruebas de oxidasa,
catalasa, ureasa y coloración de Gram.
III. 2.2. Medio líquido
A partir de los cultivos puros se realizó una suspensión del microorganismo, con una
turbidez en correspondencia con el tubo No. 3 de la escala de McFarland (9x108
ufc/mL), en 3mL de Caldo Cerebro-Corazón (Biolife, Italia), con suplemento
enriquecedor Vitox (Biolife) e inhibidor VCNT (Biolife). Los tubos inoculados se
incubaron en condiciones de microaereofília (sobres Campy Packs, Oxoid) en una
jarra de 2,5L (Oxoid), a 37ºC con agitación constante de 120 rpm (Infors AG CH4103 Bottmingen, Alemania) durante 24 horas. Posteriormente se realizó el escalado
en 30mL de cultivo siguiendo las mismas condiciones descritas anteriormente. La
pureza se comprobó mediante la identificación morfológica (Coloración de Gram) y
las pruebas bioquímicas catalasa, oxidasa y ureasa.
26
III. 3 Preparación del extracto de proteínas totales intracelulares
III. 3.1 Obtención de las células de H. pylori
Las suspensiones celulares obtenidas del cultivo en medio líquido, se centrifugaron a
5000 x g (Jouan, Francia) durante 30 minutos a 4ºC. El sobrenadante de H. pylori se
descartó y el precipitado se lavó con agua estéril, se centrifugó nuevamente y
almacenó a -80°C.
III. 3.1.1 Ruptura celular por ultrasonido
El precipitado obtenido a partir de la centrifugación, se resuspendió en 3 mL de
tampón lisis compuesto por PBS (140 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de
Na 2 HPO 4 , 1,8 mM de KH 2 PO 4 , pH 7,3), ADNasa (50 µg/mL) (Sigma, Alemania) y
coctel de inhibidores de proteasas (dilución 1:200) (Sigma) y se incubó a 4°C durante
10min. Posteriormente se adicionó lisozima (0,2 mg/mL) (Sigma) y se incubó durante
10 min a 4°C. Finalmente las muestras mantenidas en hielo se sometieron a 10
ciclos de 24Hz de ultrasonicación, 10 segundos de encendidos con intervalos de 10
segundos de apagados usando el equipamiento Soniprep 150 (Inglaterra) y se
verificó que el sobrenadante se tornó traslúcido (Rosenberg, 2005). El sobrenadante
se colectó después de la centrifugación a 10 000rpm durante 30min (Eppendorff
5417R, Alemania) y se conservó a -20°C hasta su uso.
III. 4 Determinación de la concentración de proteínas
III. 4.1 Microensayo de BCA
Se determinó la cuantificación de proteínas del extracto proteico totales
correspondiente a cada extracto proteico mediante el ensayo del ácido bicinconínico
(BCA siglas en inglés), siguiendo las recomendaciones del fabricante (BCA™ Protein
27
Assay Kit Pearson, EE.UU). Como variante en nuestro estudio se utilizó el
procedimiento descrito para el microensayo cuyas lecturas de absorbancia a una
longitud de onda de 560nm se realizaron en placas de 96 pocillos (Costar, Alemania),
con un lector para placa de ELISA (MRX Revelation, Dinex Technologies, Alemania).
III. 5 Resolución de los extractos proteicos
III. 5.1 Electroforesis SDS‐PAGE
Para la evaluación del perfil de antígenos proteicos, se realizó una electroforesis
desnaturalizante en gel de poliacrilamida al 10% con SDS (SDS-PAGE), se aplicaron
8µL de concentraciones decrecientes (10 µg-0.3 µg/pocillo) de los extractos proteicos
obtenidos en el acápite III. 3.1.1, preparadas con el tampón muestra 5X. Las
muestras se calentaron a 100°C durante 5 minutos y se centrifugaron a 13 000 rpm
durante 5 minutos a 4°C (Eppendorff 5417R). La corrida electroforética en el sistema
Mini-Protean® II Cell (Bio-Rad, EE.UU) se procedió siguiendo el protocolo descrito
en el Manual de Operaciones (MOP) del Laboratorio de Proteínas y Proteómica-IPK
(LPP-IPK). Se utilizó un voltaje constante de 200 V (amperaje liberado) y la corrida
se detuvo cuando el frente de corrida alcanzó el borde inferior del gel. En cada gel,
se aplicó 5 μL del patrón de peso molecular de amplio rango Thermo Scientific
SpectraTM Multicolor (Thermo Fisher Scientific, Inc., EE.UU), cuyo espectro de tallas
moleculares se encontraron entre 10-260 kDa.
III. 5.2 Coloración con nitrato de plata
Los geles fueron teñidos con nitrato de plata (BDH, Inglaterra), siguiendo el protocolo
descrito en el MOP del LPP-IPK. Para ello, los geles fueron colocados en solución de
fijación (ácido acético al 12%, etanol al 50% y formaldehído al 37%) durante una
hora. Posteriormente se realizaron tres lavados de cinco minutos en una solución de
etanol al 50%. Los geles fueron sensibilizados en una solución de pre-tratamiento
(tiosulfato de sodio al 0,02%) durante un minuto. Seguidamente se llevaron a cabo
tres lavados con agua destilada durante 20 segundos cada uno y se les añadió una
28
solución de impregnación (nitrato de plata 0,2% y formaldehído 37%), preparada
momentos antes de su uso, durante 20 minutos a oscuras. Luego se realizaron tres
lavados con agua destilada, los geles se pusieron en contacto con una solución
reveladora (carbonato de sodio al 6%, formaldehído 37% y tiosulfato de sodio al
0,0004%) hasta el desarrollo de color y observación de las bandas de proteínas. La
tinción se detuvo con una solución de bloqueo (metanol 50% y ácido acético al 12%).
III.
6
Normalización
de
la
muestra
y
anticuerpo
primario
para
la
inmunoelectrotransferencia (Western blot)
III. 6.1 Determinación del rango dinámico de linealidad
Réplicas de geles de SDS-PAGE conteniendo diluciones seriadas de los extractos
proteicos (10 µg-0.3 µg /pocillo) se sometieron a la transferencia usando el sistema
en cámara húmeda Mini Trans-Blot® Cell (Bio-Rad, EE.UU) y tampón de
transferencia 1X (25 mM de Tris, 192 mM de glicina y metanol al 20%). La
transferencia a membranas de nitrocelulosa (Protran® BA 83, Schleicher &
Schleicher, Alemania), se realizó siguiendo el procedimiento descrito por Ramírez,
2013. En resumen, la transferencia se realizó a 50 V durante toda la noche a 4ºC y
se confirmó su efectividad mediante la tinción de las membranas con rojo Ponceau
1X (Merck, EE.UU) y la tinción con plata de los geles sometidos a la transferencia.
Luego, las membranas se lavaron tres veces de 10 minutos cada ciclo con agua
destilada y se bloquearon con solución de bloqueo (leche descremada al 0.5%, en
tampón 100 mM de Tris-HCl, 1,5M de NaCl (TBS) y Tween 20 al 0.02%), durante una
hora a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron con sueros control
positivo y negativo (dilución 1:20) en solución de bloqueo, durante cuatro horas a
4ºC. El suero se decantó y las membranas se lavaron con TBS-Tween al 0,02%
durante tres ciclos de diez minutos cada uno. Las membranas se incubaron durante
una hora con un anticuerpo anti-IgG humano conjugado con peroxidasa (Sigma,
EE.UU) diluido 1/3000 en solución de bloqueo, siguiendo la recomendación del
29
fabricante para su uso en técnicas de inmunodetección. Finalmente, las membranas
se lavaron con tres ciclos de lavados cortos usando tampón TBS-Tween 20 al 0,02%.
III. 6.2 Revelado de las membranas
La presencia de antígenos en las membranas, se detectó mediante la tinción con el
sustrato Tetrahidrocloruro de 3,3’-diaminobencidina (DAB) (Sigma) en solución de
TBS 1X y 30 µl H 2 O 2 al 30%. Cuando aparecieron las bandas, la reacción se detuvo
con la adición de agua corriente.
III. 6.3 Determinación de la dilución adecuada de los sueros
Ocho microlitros de los extractos proteicos de las cepas de H. pylori en la
concentración óptima de antígeno se aplicaron en gel SDS-PAGE según acápite
III.5.1 y transfirieron a las membranas de nitrocelulosa (acápite III.6.1) y luego se
enfrentaron a diluciones seriadas (1:10, 1:20, 1:40) de suero control positivo y
negativo. Las membranas se lavaron, e incubaron durante una hora con un
anticuerpo anti-IgG humano conjugado con peroxidasa (1:3000) (Sigma), se lavaron
nuevamente y finalmente, se revelaron (acápite III. 6.2).
III. 7 Análisis por densitometría
Los geles y membranas fueron escaneadas usando el densitómetro GS – 800
(Calibrate Densitometer, BioRad Laboratories EE.UU). A partir de las bandas
visualizadas se calcularon los pesos moleculares, intensidades de la señal y
densidades de las bandas usando el programa informático QuantityOne® (BioRad).
III. 8 Inmunodetección de antígenos de H. pylori
30
Para la detección de antígenos inmunorreactivos por Western blot, se prepararon
extractos proteicos de H. pylori empleando la concentración y dilución óptima
determinadas en los acápites III. 6.1 y III. 6.3 y se enfrentaron a sueros de pacientes
de los grupos 1, 2 y 3 (acápite III.1.2). La inmunoelectrotransferencia se llevó a cabo
siguiendo la metodología descrita por Ramírez, 2013.
III. 8.1 Criterios para la interpretación de los resultados
A partir del análisis de reconocimiento antigénico por los sueros de pacientes
procedentes de los grupos 1 y 2, se establecieron los criterios de positividad o
negatividad para el Western blot en función del por ciento de reactividad de
antígenos reconocidos con respecto al total de sueros analizados. Estos criterios
sirvieron de base para clasificar los sueros pertenecientes al Grupo 3 sin
clasificación.
III. 9 ELISA
Se empleó un sistema ELISA comercial perteneciente a la compañía IBL
INTERNATIONAL (Alemania) para determinación de anticuerpos IgG anti-H. pylori.
Se determinaron los valores de absorbancia a 620 nm de cada uno de los sueros
correspondientes a los grupos 1, 2 y 3 y se procedió a calcular los valores índice COI
según recomendaciones del fabricante.
Para interpretar los resultados obtenidos se tuvo en cuenta el valor de corte
establecido por el sistema según Duquesne, 2013, para la cuantificación cualitativa
de IgG siguiente:
Tipo de determinación
Negativo Dudoso
Positivo
Cualitativa
<0,8
>1,2
0,8-1,2
31
III.11 Análisis de los resultados
Los datos obtenidos a partir del análisis por densitometría fueron almacenados y
agrupados en el sistema Excel, versión 2007 de Microsoft Windows®.
Para el análisis comparativo de los perfiles de proteínas obtenidos por SDS-PAGE
para cada uno de los extractos de H. pylori obtenidos en cepas de referencia y
autóctonas se construyó una curva de densidad (en unidades de absorbancia, UA)
versus pesos moleculares (kDa).
Durante la normalización del ensayo de Western blot, se determinaron los
parámetros de rango dinámico de linealidad, concentración óptima y dilución
apropiada de antisuero primario a usar, basándose en el análisis a partir de las
curvas densidad versus concentraciones de proteínas y pesos moleculares.
La eficacia del Western blot se determinó calculando las densidades promedio de las
bandas proteicas reconocidas por el suero control positivo. La curva de linealidad se
confeccionó con los valores de densidad relativa correspondiente a cada
concentración
de
la
banda
proteica
cuyas
densidades
aumentaron
proporcionalmente a la concentración de proteínas.
El procesamiento de la información se realizó mediante el paquete estadístico Epidat
3.1 para evaluar el desempeño de los sistemas serológicos Western blot y ELISA
utilizando los indicadores (Sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor
predictivo negativo, razón de verosimilitud positiva y negativa, así como el índice
Youden) con un nivel de significación de 0,05 y un 95% de intervalo de confianza.
Para determinar la asociación entre la frecuencia de reconocimiento de los antígenos
de las cepas en estudio y los grupos de sueros de pacientes se realizó el test no
paramétrico U de Mann-Whitney y se empleó el paquete estadístico GraphPad Prism
5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). En todos los casos la diferencia
estadística se consideró significativa para p<0.05.
32
IV. RESULTADOS
RESULTADOS
IV. RESULTADOS
IV. 1 Obtención de extractos de proteínas totales intracelulares de H. pylori
Los cultivos de las cepas de H. pylori ATCC 43504, 113A y 196A fueron obtenidos
satisfactoriamente y se evidenció su pureza mediante pruebas bioquímicas de
catalasa, oxidasa, ureasa y la observación microscópica de bacilos Gram-negativos
espirilados teñidos por coloración de Gram.
La metodología de la ultrasonicación permitió recuperar 2 mL de los extractos
proteicos intracelulares con valores de concentración de proteínas de 1,940 mg/mL
(cepa ATCC 43504), 1,012 mg/mL (cepa 113A) y 3,250 mg/mL (cepa 196A), siendo
más elevada la concentración de proteínas aportada por la cepa 196A.
IV. 2 Perfil de proteínas de los extractos de H. pylori
Los perfiles electroforéticos obtenidos por SDS-PAGE a partir de los extractos
proteicos de las tres cepas de H. pylori estudiadas mostraron una diversidad de
proteínas con pesos moleculares entre 12-253 kDa, siendo las bandas más
representativas las de talla molecular por debajo de 60 kDa (Fig. 1).
33
RESULTADOS
Figura 1. Perfil electroforético de los extractos (10 µg/ pocillo) proteicos obtenidos
por SDS-PAGE al 10% en condiciones no reductoras y revelado con tinción de plata
en las cepas de H. pylori tratadas con ultrasonido. Carriles 1, 3 y 5: patrón de peso
molecular de 10-260 kDa; carril 2: cepa ATCC 43504; carril 4: cepa 196A y carril 6:
cepa 113A.
El análisis por densitometría del perfil electroforético permitió constatar la presencia
de bandas proteicas comunes a las tres cepas de H. pylori evaluadas en las tallas
moleculares relativas de 12-15, 20, 26, 27, 34, 35, 45 y 63 kDa, así como proteínas
diferenciales exclusivas de cada una de las cepas (Tabla 1).
34
RESULTADOS
Tabla 1. Pesos moleculares relativos de las proteínas expresadas diferencialmente
por las cepas de Helicobacter pylori ATCC 43504, 113A y 196A.
Cepa
Pesos moleculares relativos (kDa)
113A
253 58 32
196A
112 52 47 43 38 22
ATCC 43504
54 48 40 39 30 28 17
La amplia gama de tallas moleculares observadas en la electroforesis para cada una
de las cepas estudiadas permitió corroborar mediante densitometría que a pesar de
la similitud entre los perfiles densitométricos, se observaron diferencias entre las
cepas de H. pylori (Fig. 2), siendo la cepa 196A (Fig. 2B) la que mostró mayor
densidad de las bandas proteicas (UA promedio=0, 268) en comparación con las
densidades promedios de la cepa 113A (UA=0, 219) y ATCC 43504 (UA= 0,247)
(Figs. 2A y C). El perfil densitométrico arrojó como bandas proteicas con mayor
densidad las de talla molecular 12, 14-15, 23-24, 26-30, 32, 34, 35, 38-41, 46, 52 y
58 kDa.
35
RESULTADOS
A)
B)
C)
Figura 2. Perfil densitométrico de los extractos proteicos obtenidos en las cepas de
H. pylori por ruptura celular con ultrasonido. UA: unidad de absorbancia. A) cepa
ATCC 43504, B) cepa 196A y C) cepa 113A.
El análisis del perfil proteico de las cepas de H. pylori por densitometría reveló que
las cepas autóctonas mostraron un espectro de bandas más amplio y denso que el
observado en la cepa de referencia (Figura 3).
36
RESULTADOS
Figura 3. Densidades promedios de las bandas proteicas presentes en las cepas de
H. pylori de referencia y autóctonas. UA: unidad de absorbancia.
IV. 3 Rango dinámico de linealidad y dilución óptima del anticuerpo primario
para la inmunoelectrotransferencia
Al ensayar en el Western blot, diferentes concentraciones (0,3-10 µg) del extracto
proteico de la cepa de H. pylori 196A, que mostró la mayor densidad promedio, frente
a un suero control positivo anti-H. pylori se observaron antígenos especie específicos
con densidades diferentes (Fig. 4). La curva de linealidad se diseñó a partir de la
banda proteica de 0,52 UA (Fig. 4A).
37
RESULTADOS
A
B
Figura 4. Ensayo de rango dinámico de linealidad para la determinación de la
concentración óptima de proteínas. (A) Western blot de las diluciones seriadas del
extracto proteico de la cepa 196A frente al suero control positivo anti-H pylori. (B)
Curva de linealidad de las densidades relativas calculadas para cada concentración
de antígeno. R2- coeficiente de regresión.
El análisis anterior permitió determinar que el rango dinámico de linealidad (Fig. 3B)
se encontraba entre 1,2-10 µg de proteína con un excelente coeficiente de regresión
(R2= 0.99). Se seleccionó 5 µg/pocillo como concentración óptima de extracto
proteico para la prueba de Western blot.
38
RESULTADOS
El experimento realizado para determinar la dilución óptima a utilizar con los
antisueros primarios en el ensayo de Western blot reveló que una amplia gama de
antígenos presentes en las cepas de estudio fueron reconocidos por las tres
diluciones (1:40, 1:20 y 1:10) del anticuerpo anti-H. pylori control positivo (Fig. 5A).
Por el contrario, fue muy baja la señal de reconocimiento cuando los extractos se
enfrentaron al suero control negativo (Fig. 5B). Se seleccionó la dilución 1:20 como la
dilución de antisuero adecuada en todos los experimentos posteriores usando la
técnica de Western blot.
A
B
Figura 5. Ensayo para determinar la dilución del antisuero primario en el Western
blot usando antígenos (5µg/ pocillo). Cepas ATCC 43504 (carriles 1, 5 y 8 en A; 2, 5
y 8 en B), 113A (carriles 2, 6 y 9 en A; 3, 6 y 9 en B) y 196A (carriles 3, 7 y 10 en A;
4, 7 y 10 en B) de Helicobacter pylori. Revelación con DAB y peróxido de hidrógeno.
A)suero control positivo dilución 1:10 (carriles 1-3); dilución 1:20 (carriles 5-7);
dilución 1:40 (carriles 8-10); patrón de peso molecular (carriles 4 y 11); B) suero
control negativo dilución 1:10 (carriles 2-4); dilución 1:20 (carriles 5-7); dilución 1:40
(carriles 8-10); patrón de peso molecular (carriles 1 y 11).
IV. 4 Reconocimiento de antígenos de H. pylori por el sistema de Western blot
El ensayo de Western blot reveló patrones de reconocimiento diferentes para los
sueros de pacientes infectados (Grupo 1) y no infectados (Grupo 2) por H. pylori
(Figura 6).
39
RESULTADOS
A
B
Figura 6. Reconocimiento antigénico de proteínas de H. pylori por sueros de
pacientes infectados (A) y no infectados (B) por esta bacteria mediante Western blot
(I) Revelación con DAB y peróxido de hidrógeno. Patrón de peso molecular (carril 1);
H. pylori ATCC 43504 (carril 2); H. pylori 113A (carril 3); H. pylori 196A (carril 4). (II)
Análisis densitométrico de pesos moleculares y (III) de densidades.
40
RESULTADOS
Los pesos moleculares de los antígenos comunes a las tres cepas de H. pylori
estudiadas que fueron reconocidos por los sueros de los pacientes del Grupo 1 son:
168, 121, 119, 112, 111, 109, 105, 102, 99, 78-88 kDa (excepto 82 y 85 kDa), 10-75
kDa (excepto 65 kDa). Los sueros de pacientes del Grupo 2 reaccionaron con los
antígenos de 83, 82, 79, 78, 66-64, 62, 29-60, 25 y 16 kDa.
En la tabla 2 se muestra la frecuencia de reconocimiento (expresada como porciento
de reactividad) de los principales antígenos reconocidos por los sueros de pacientes
infectados (Grupo 1) y no infectados (Grupo 2) por H. pylori.
Tabla
2.
Peso
molecular
y
porciento
de
reactividad
de
los
antígenos
inmunorreactivos comunes a las tres cepas de Helicobacter pylori con mayor
reconocimiento por sueros de pacientes de los Grupos 1 y 2.
Sueros
Grupo 1 (n=29)
Grupo 2 (n=20)
Peso molecular de antígenos
Porciento de
de H. pylori (kDa)
reactividad (%)
36 y 38
72
35, 37 y 39
66
48
52
31 y 46
48
59
45
60, 58, 40
40
44, 43, 41
35
La mayor respuesta de anticuerpos IgG (>50% de positividad) en los pacientes
infectados por H. pylori estuvo asociada a los antígenos con tallas moleculares de
35-39 y 48 kDa. El porciento de reconocimiento para las bandas de alto peso
molecular señaladas anteriormente como coincidentes entre las cepas de referencia
y autóctonas tuvo una positividad por debajo del 50% (datos no mostrados).
41
RESULTADOS
La respuesta de anticuerpos IgG en los pacientes no infectados frente a antígenos de
H. pylori estuvo por debajo del 45% de reconocimiento.
Existió un reconocimiento diferencial de antígenos de H. pylori por los sueros de
pacientes de los Grupos 1 y 2. En la tabla 3 se muestran los pesos moleculares de
las bandas proteicas reconocidas sólo en la cepa de referencia ATCC 43504 o
exclusivas de cepas autóctonas 113A y 196A. Las proteínas reconocidas
diferencialmente por los sueros de pacientes infectados resultaron ser de alto peso
molecular (77- 198 kDa). Sin embargo, los sueros de pacientes no infectados
reconocieron antígenos diferenciales de alto y bajo peso molecular.
Tabla 3. Antígenos diferenciales de Helicobacter pylori en las cepas ATCC 43504,
113A y 196A reconocidos por sueros de pacientes de los Grupos 1 y 2.
Sueros
Peso molecular de bandas inmunorreactivas (kDa)
Cepa de H. pylori ATCC
Cepas de H. pylori
autóctonas
188, 179, 158, 153, 114,106, 198, 195, 176, 171, 169, 151,
Grupo 1 (n=29)
96, 94
143-142, 129, 127, 122, 118115, 110, 104,100, 98, 89, 85,
82, 77
Grupo 2 (n=20)
184, 90, 74, 72-70, 63, 61, 183, 112, 99, 88, 80, 27, 26,
24, 22, 20,13
23, 21, 19, 17, 15 ,14
De manera general, la frecuencia de reconocimiento de la mayoría de los antígenos
diferenciales resultó ser baja (datos no mostrados). Sin embargo, dentro de estos
antígenos los de mayor frecuencia de reconocimiento por el grupo de sueros de
pacientes infectados por H. pylori correspondieron a las proteínas de 85, 96 y
42
RESULTADOS
aquellas agrupadas de 110-120 kDa, mientras que la proteína de talla molecular de
61 kDa resalta como la de mayor frecuencia de reconocimiento por los sueros de
pacientes no infectados (datos no mostrados).
La Fig. 7 muestra la frecuencia de reconocimiento de antígenos proteicos en cepas
de H. pylori de referencia y autóctonas frente a sueros de pacientes de los grupos 1 y
2.
Figura 7: Frecuencia de reconocimiento (%) de antígenos proteicos de H. pylori en
cepas de referencia y autóctonas frente a los sueros de pacientes de los Grupos 1 y
2.
Los antígenos provenientes de las cepas de H. pylori autóctonas fueron más
reconocidos por sueros de los pacientes de los Grupos 1 y 2, con relación a aquellos
43
RESULTADOS
obtenidos en la cepa de H. pylori de referencia, a pesar de que no se obtuvieron
diferencias significativas entre los datos (p= 0,36).
Este resultado permitió definir los criterios de positividad y negatividad para el ensayo
de Western blot propio, siendo considerado un resultado positivo cuando el perfil de
inmunorreacción contenía una de las combinaciones siguientes:
a) Una o más bandas en la zona de alto peso molecular (110-120 kDa, 66-75
kDa, 53-55 kDa, 34-50 kDa, excepto la de 40 kDa) y al menos una banda en la
zona de bajo peso molecular (10 – 33 kDa).
b) Una o más bandas en la zona de alto peso molecular (110-120 kDa, 66-75
kDa, 53-55 kDa, 34-50 kDa), y no observar bandas con pesos moleculares 40
kDa, ni 57-62 kDa, consideradas exclusivas del criterio de negatividad.
IV. 5 Desempeño diagnóstico del sistema de Western blot propio
El análisis por Western blot de los sueros correspondientes a los Grupos 1 y 2 reveló
una coincidencia de 97% (28/29) para el grupo de pacientes infectados y de 90%
(18/20) para el grupo de pacientes no infectados. Sin embargo, para el ELISA
comercial los valores de coincidencia fueron inferiores 86% (25/29) y 80% (16/20),
respectivamente (Tabla 4).
44
RESULTADOS
Tabla 4. Resultados de la serología en pacientes de los Grupos 1 y 2 empleando
Western blot propio y un sistema de ELISA comercial.
Resultados por serología
Grupo 1
(n=29)
Grupo 2
(n=20)
ELISA comercial positivo
25
4
ELISA comercial negativo
4
16
Western blot positivo
28
2
Western blot negativo
1
18
Grupo 1: Pacientes positivos por pruebas invasivas
Grupo 2: Pacientes negativos por pruebas invasivas
En la tabla 5 se observan los valores de sensibilidad, especificidad, valor predictivo
positivo y negativo, índice de Youden y reacción de verosimilitud positiva y negativa
obtenidos con los sistemas serológicos de Western blot propio y ELISA comercial en
sueros de pacientes infectados o no por H. pylori.
45
RESULTADOS
Tabla 5. Parámetros de desempeño de los sistemas diagnósticos Western blot
propio y ELISA comercial en sueros de pacientes infectados o no por Helicobacter
pylori.
Western blot propio
ELISA comercial
(%)
(%)
Sensibilidad
96,5
86,2
Especificidad
90,0
80,0
Valor predictivo +
93,3
86,2
Valor predictivo −
94,7
80,0
Índice de Youden
0,87
0,66
RV +
9,7
4,31
RV −
0,04
0,17
Parámetros
Técnica tomada como referencia: histopatología. RV: razón de verosimilitud, +positivo/negativo
Todos los parámetros de desempeño evaluados mostraron mejores resultados con el
sistema Western blot propio en relación con el ELISA comercial.
Al analizar los sueros de pacientes del Grupo 3 en estudio, de un total de 18 sueros,
siete resultaron positivos y cinco fueron negativos a H. pylori por ambos ensayos.
Como se observa en la tabla 6, cuatro sueros resultaron positivos por el sistema
Western Blot propio y negativos por el ELISA comercial. Por otro lado, dos sueros
negativos por Western blot fueron detectados positivos por el sistema ELISA.
46
RESULTADOS
Tabla 6. Resultados del diagnóstico serológico a pacientes del Grupo 3 empleando el
sistema Western blot propio y un ELISA comercial.
Pruebas serológicas
Western blot
positivo
Western blot
negativo
Total
ELISA comercial positivo
7
2
9
ELISA comercial negativo
4
5
9
Total
11
7
18
47
V. DISCUSIÓN
DISCUSIÓN
V. Discusión
Dada la elevada incidencia a nivel mundial de la infección por H. pylori, numerosos
grupos de investigación han enfocado sus estudios en el desarrollo de técnicas de
diagnóstico eficaces para detectar este microorganismo (Go, 2002; Zanotti y
Cendron, 2014; Gutiérrez y Bayona, 2014). Dentro de ellas, se encuentra la
serología que tiene como principales ventajas el carácter no invasivo, la facilidad de
realización y un costo bajo y permite realizar estudios epidemiológicos de
seroprevalencia de la infección por H. pylori (Mohammadi et al., 2008). No obstante,
la interpretación de los resultados debe ser cautelosa y acompañarse de los datos
clínicos del paciente, ya que las pruebas serológicas no logran diferenciar la
infección activa de la exposición previa al microorganismo (De Mascarel et al., 2008;
Staoch et al., 2008).
Los sistemas de diagnóstico serológico disponibles comercialmente tienen como
principal dificultad que emplean preparaciones antigénicas procedentes de cepas de
H. pylori de referencia o de aislamientos autóctonos obtenidos en países con una
baja incidencia de la infección (Treepongkaruna et al., 2006). Esto pudiera resultar
en un sub-diagnóstico de la infección, y justifica la importancia de utilizar antígenos
proteicos obtenidos a partir de cepas autóctonas de H. pylori.
Estudios previos realizados en los LNRNP y LPP del IPK lograron estandarizar
metodologías para la extracción de proteínas a partir de cepas autóctonas de H.
pylori (Silega, 2011; Ramírez, 2013), que fueron caracterizadas mediante técnicas
moleculares (Feliciano et al., 2015). Sin embargo, el número de sueros de pacientes
con sintomatología gastroduodenal empleados en la evaluación de los extractos fue
bajo.
48
DISCUSIÓN
La presente investigación, aborda la estrategia de obtención de proteínas específicas
de cepas de H. pylori autóctonas y de referencia para evaluar su utilidad como
antígenos y su potencial para el serodiagnóstico en un ensayo de Western blot
propio.
Los perfiles electroforéticos de los extractos proteicos intracelulares de las tres cepas
de H. pylori empleadas (una de referencia y dos autóctonas) obtenidos por el método
de ultrasonicación evidencian la presencia de un amplio espectro de proteínas,
siendo las mayoritarias aquellas con tallas moleculares relativas de 12, 14-15, 23-24,
26-30, 32, 34, 35, 38-41, 46, 52 y 58 kDa.
Perez-Perez y Blaser (1987) encontraron que las principales proteínas de diferentes
cepas de H. pylori caracterizadas según perfil proteico tenían pesos moleculares de
26, 29, 56 y 62 kDa, mientras que Wullfen y colaboradores (1988) detectaron bandas
predominantes en las tallas de 24, 26, 30, 50, 55, 60, 63, 65 y 67 kDa. Por otra parte
Faulde et al., 1993, identificaron bandas especie-específicas en los pesos de 16, 18,
24, 28, 33, 43, 51, 63, 65 y 67 kDa.
Se constató que a pesar de la variabilidad proteica encontrada al comparar nuestros
resultados con los obtenidos por estos autores, probablemente debido a
heterogeneidad entre las cepas de H. pylori utilizadas así como, el uso de
procedimientos diferentes para la extracción, las tallas moleculares que predominan
en los perfiles son de mediano y bajo peso molecular (15-67 kDa). Por lo tanto, se
considera de gran importancia la caracterización de cada una de las cepas que
aporta los antígenos a evaluar.
Diferencias en cuanto a los niveles de expresión de proteínas (Faulde et al., 1993;
Haas et al., 2002) se evidencian también al comparar las cepas de estudio. El
análisis por densitometría mostró un perfil proteico de bandas que abarcan un
49
DISCUSIÓN
intervalo más amplio de tallas moleculares y de mayor densidad en las cepas
autóctonas que el observado para el extracto a partir de la cepa de referencia. Las
diferencias cualitativas y cuantitativas en cuanto a la expresión de proteínas en este
estudio pudieran deberse a la variabilidad genética que existe entre las cepas de H.
pylori (Ng et al. 1999) lo que además explicaría la presencia o ausencia de algunos
determinantes de virulencia y proteínas marcadores que han sido asociadas con
diferentes patologías gastroduodenales, y que pudieran ser de gran utilidad para el
diagnóstico y seguimiento de la infección inducida por este microorganismo (Ir et al.,
1996; Herbrink y van Doorn, 2000).
Dado que la infección por H. pylori provoca una fuerte respuesta inmune humoral
polimórfica y sistémica (Herbrink y van Doorn, 2000), los ensayos serológicos han
sido empleados con éxito para el diagnóstico de la infección. Entre ellos, los sistemas
comerciales ELISA se han utilizado en la detección de respuesta de la
inmunoglobulina IgG contra preparaciones de células enteras de H. pylori en sueros
y secreciones humanas, tales como heces, orina y saliva (Granström et al., 1997).
Estos ensayos son muy atractivos en comparación con otros métodos no invasivos
por su simplicidad, bajo costo, mínimo de molestia para el paciente y beneficio para
evaluar grandes poblaciones (Kabir, 2003). Estos sistemas serológicos tienen el
inconveniente de incluir preparaciones de antígenos que pueden exhibir reacción
cruzada con otras especies bacterianas, lo que resulta en una disminución de la
especificidad por debajo del 90%, inclusive en un sistema ELISA de segunda
generación que emplea componentes reactivos altamente purificados (Trautmann et
al., 1994). Además como fue mencionado antes, los sistemas disponibles
comercialmente sólo contemplan preparaciones antigénicas compuestas de cepas de
referencia y autóctonas procedentes de países con baja incidencia de la infección
(Krah et al., 2004; Treepongkaruna et al., 2006).
50
DISCUSIÓN
Algunos autores han demostrado que a pesar de que el ELISA es una prueba muy
conveniente, la inmunotransferencia resulta más sensible para detectar la infección
reciente por H. pylori (Mitchell et al., 1996; Sörberg et al., 1997), especialmente en
sueros con bajos niveles de anticuerpos (Nilsson et al., 1997). Además, el Western
blot como técnica de diagnóstico serológico, tiene como ventaja fundamental que
permite establecer asociaciones entre la presencia de determinantes de virulencia y
el desarrollo de patologías más severas (Vilaichone et al., 2003), así como
identificar proteínas inmunorreactivas con elevado valor diagnóstico (Voland et al.,
2002).
En nuestro estudio, la obtención de proteínas totales intracelulares a partir de cepas
de H. pylori autóctonas y de referencia, permitió contar con una fuente de antígenos
potenciales para su evaluación frente a grupos de sueros predeterminados como
positivos o negativos a la infección por H. pylori por técnicas invasivas, que incluyó
dos pruebas confirmatorias, como el cultivo y la histopatología (Llanes, et al., 2014).
El éxito del uso de dichas proteínas en el Western blot depende en gran medida de la
optimización de los parámetros para lograr resultados confiables (Mini et al., 2006).
Este estudio emplea condiciones de transferencia estandarizadas anteriormente en
el laboratorio como fue descrito por Ramírez, 2013. Sin embargo resulta
imprescindible normalizar la cantidad de proteína óptima a cargar y la sensibilidad del
anticuerpo primario, debido a que la relación entre la cantidad de proteína y la señal
en la membrana de Western blot varía de un anticuerpo primario a otro (Welinder y
Ekblad, 2011).
La evaluación del incremento o disminución de la señal en el Western blot es eficaz
una vez que se ha realizado la calibración adecuada. Para ello, se recomienda el uso
de controles para la normalización de la concentración de proteína adecuada y son
las proteínas de mantenimiento (del inglés, housekeeping) altamente conservadas en
51
DISCUSIÓN
cada especie las ideales, no obstante, se ha detectado como limitante de que las
mismas
pudieran
variar
su
expresiónen
dependencia
de
las
condiciones
experimentales que se apliquen (Welinder y Ekblad, 2011). Al no contar con esta
valiosa herramienta, se aplicó el análisis densitométrico a la totalidad de las bandas
obtenidas al enfrentar el extracto de la cepa 196A frente a un suero control positivo
determinado por el sistema ELISA comercial.
Los resultados de este estudio muestran que es posible mejorar el rango dinámico de
linealidad usando bajas concentraciones del extracto lisado y verificando se cumpla
la relación lineal entre la densidad de la banda y la cantidad de proteína. Del análisis
cuantitativo se deriva un rango lineal entre 1,2-10 µg de proteína con un excelente
coeficiente de regresión (R2=0,99), y el uso de diluciones de 1:20 para el antisuero
primario cuando la proteína cargada y transferida contiene 5 µg del extracto lisado.
Estas condiciones aseguran que los análisis densitométricos derivados del ensayo
de western blot sean confiables.
Existen varios estudios que abordan la respuesta inmune humoral contra H. pylori
empleando el método de Western blot (Andersen y Espersen, 1992; Czinn et al.,
1989; Faulde et al., 1992; Klaamas et al., 1996; Lelwala-Guruge et al., 1990;
Lelwala- Guruge et al., 1992; von Wulffen et al., 1986). No obstante, sólo se
encontraron cinco publicaciones internacionales donde se proponen criterios para la
interpretación de esta metodología (von Wulffen et al., 1986; Faulde et al., 1993;
Nilsson et al., 1997; Trautmann et al., 1994; Lepper et al., 2004).La mayoría de
estos autores incluyen como criterio de positividad a las proteínas UreB (66 kDa),
VacA (87 kDa) y CagA (110-136 kDa y además a las proteínas de 24, 26, 30 y 33
kDa, las cuales aseveran que son altamente específicas para H. pylori.
Un estudio realizado en Cuba con un método serológico propio de Western blot
basado en una preparación antigénica a partir de la cepa de referencia de H. pylori
52
DISCUSIÓN
CCUG-17874, evaluó en pacientes dispépticos la eficacia del ensayo para el
diagnóstico de la infección por H. pylori (Torres et al., 2008). Este método establece
como criterio de positividad las bandas inmunorreactivas de tres zonas: alta, con
bandas por encima de 70 kDa; intermedia, con bandas entre 45 y 70 kDa y baja, con
bandas por debajo de los 45 kDa y como criterio de negatividad la banda de 59 kDa.
Basado en los criterios de positividad y negatividad determinados a través del
presente trabajo, se pudo corroborar una elevada diversidad en el reconocimiento de
antígenos de H. pylori (Andersen y Espersen, 1992; Bazillou et al., 1994). El perfil
de los antígenos reconocidos por los sueros de los pacientes positivos a H. pylori por
las pruebas invasivas (Grupo 1) es amplio y supera el número de antígenos
reconocidos por los sueros de los pacientes con pruebas invasivas negativas (Grupo
2). Las proteínas inmunorreactivas con mayor frecuencia de reconocimiento por los
sueros de pacientes del Grupo 1 fueron las de 31, 35-39, 46 y 48 kDa (>50%). De
ellas, las proteínas de tallas moleculares 35, 38 y 39 presentan una elevada
densidad en el perfil proteico mostrado en este estudio. En los sueros de pacientes
del Grupo 2, el mayor reconocimiento se observó para la proteína de 59 kDa (45%).
Con respecto a esta proteína, varios autores (Nilsson et al., 1997; Lepper et al.,
2004) han descrito un complejo de proteínas flagelares de 57-59 kDa que están
presentes en las bacterias flageladas y pueden mostrar reacción cruzada entre varias
especies, por lo que sugieren excluir dichas bandas de los criterios de positividad
para el serodiagnóstico de H. pylori (Lee et al., 1987; Newell, 1987).
De igual manera, se ha sugerido que proteínas de tamaño medio entre los 50-70 kDa
pueden exhibir reactividad cruzada con otras especies bacterianas y específicamente
las del intervalo 43-66 kDa deberían ser excluidas de las preparaciones antigénicas
para mejorar la especificidad de las mismas (Bazillou et al., 1994; Nilsson et al.,
1997). No obstante en el estudio que presentamos los análisis densitométricos
53
DISCUSIÓN
mostraron que las proteínas de 46 y 48 kDa exhibían elevada frecuencia de
reconocimiento por los sueros de pacientes del Grupo 1.
Adicionalmente, dentro de los criterios de negatividad propusimos la inclusión de la
proteína de 40 kDa, la cual fue detectada con una frecuencia de reconocimiento de
40% por los sueros de pacientes del Grupo 2. En la literatura consultada, otros
autores que evalúan métodos de diagnóstico serológico con criterios de
interpretación derivados de los análisis del reconocimiento de antígenos de H. pylori,
no incluyen a la proteína de 40 kDa como marcador proteico de negatividad (von
Wulffen et al., 1986; Faulde et al., 1993; Nilsson et al., 1997; Trautmann et al.,
1994; Lepper et al., 2004). La reactividad con la proteína 26 kDa fue baja a pesar de
que ha sido una proteína especie específico de H. pylori descrita por O’Toole y
colaboradores, 1991.
Es relevante señalar que a pesar de que no se obtienen diferencias estadísticamente
significativas en el reconocimiento de los antígenos provenientes de las cepas
autóctonas y de referencia por los grupos de sueros de pacientes infectados y no
infectados, estudios futuros deberán incluir un mayor número de muestras de sueros
para validar el empleo de estos antígenos en el diagnóstico serológico de la infección
por H. pylori.
Los
criterios
de
interpretación
adoptados
en
el
presente
trabajo
fueron
particularmente útiles para evaluar la capacidad diagnóstica del Western blot propio y
clasificar a los sueros de pacientes del Grupo 3 (diagnóstico desconocido de H. pylori
por pruebas invasivas). Al comparar los resultados del Western blot y el ELISA
comercial con sueros de pacientes de los Grupos 1 y 2, se constata que la
sensibilidad y especificidad obtenida por el Western blot propio fue alta (96,5% y
90,0%, respectivamente), lo que permite detectar como positivos los pacientes que
realmente están enfermos. En cambio, la sensibilidad y especificidad lograda por el
54
DISCUSIÓN
ELISA comercial se puede considerar como moderadamente baja (86,2% y 80, 0%,
respectivamente).
La menor eficacia del ELISA comercial empleado en este trabajo puede deberse a
diferencias entre las cepas empleadas para preparar el sistema diagnóstico
comercial versus las cepas autóctonas utilizadas en nuestro estudio. Sin lugar a
dudas el empleo de cepas locales en el diagnóstico serológico aumenta la
sensibilidad y especificidad de la prueba lo cual se constata al emplear el Western
blot propio. Por tal motivo, se utilizó en el presente estudio un lisado total de
proteínas intracelulares. Treepongkaruna recomienda la validación de cada juego
serológico
comercial en la
población
específica donde
se quiera utilizar
(Treepongkaruna et al., 2006).
En general, los parámetros de desempeño del sistema western blot propio fueron
mejores que en el caso del sistema ELISA comercial. Un estudio reciente realizado
en La Habana, evalúa el desempeño de un Western blot comercial (HELICO BLOT
2.1) para el diagnóstico de la infección por H. pylori en 60 pacientes con
sintomatología gastroduodenal. Los resultados de sensibilidad y especificidad fueron
inferiores (93% y 62% respectivamente) a los obtenidos empleando el Western blot
propio (Duquesne, 2015).
En Vietnam al usar un sistema de Western blot propio con tamaño muestral similar al
nuestro, se obtienen parámetros de desempeño equivalentes al del presente estudio,
sin embargo en Tailandia el sistema de Western blot empleado mostró una menor
especificidad (75,3%) que el nuestro (Hoang et al., 2006; Deabkanob et al., 2006).
Los resultados del diagnóstico serológico realizado en Costa Rica por Western blot y
ELISA (Quintana et al., 2000) reveló sensibilidades diagnósticas del 89,0% y el
88,0% y especificidades diagnósticas del 73,0% y el 71,0%, respectivamente,
55
DISCUSIÓN
comparados con el estudio histológico. Ambos parámetros se encuentran por debajo
de los obtenidos para el sistema de Western blot propio en nuestra investigación.
La existencia de resultados falsos negativos mediante Western blot son poco
frecuentes (Sox, 1986); en nuestro estudio el suero negativo por Western blot y
positivo por los métodos invasivos, pudiera explicarse porque el paciente tenga una
infección reciente por H. pylori, en la que la respuesta de anticuerpos IgG aún es
imperceptible; también pudiera adjudicarse a una posible deficiencia en la producción
de anticuerpos del paciente (Quintana et al., 2000; Azuma et al., 2006).
Por otra parte, por Western blot propio se clasificó como positivo dos sueros que
resultaron negativos por las pruebas invasivas, lo que pudiera deberse a que H.
pylori no fue recuperado de la muestra de biopsia estudiada debido a su distribución
parcheada o también porque el paciente haya ingerido antibiótico o inhibidores de la
bomba de protones que inhiben la recuperación de H. pylori (Sufi et al., 2008). Por
tales motivos, actualmente se aboga por tomar hasta 4 ponches de biopsias en
distintas localizaciones gástricas para disminuir los errores de muestreo por esta
causa (Petgerson et al., 1998).
En el presente estudio, cuatro sueros del grupo de pacientes en los que se
desconocía si estaban infectados o no por H. pylori, fueron positivos por el sistema
de Western blot propio y negativos por el sistema de ELISA comercial. La
inmunotransferencia se considera un sistema altamente sensible (capacidad de
detectar verdaderos positivos), lo cual se demuestra en los resultados obtenidos en
la evaluación del desempeño. Sin embargo dos sueros clasificados como positivos
por ELISA comercial resultaron negativos por el Western blot propio. Esto podría
deberse a que los valores de corte de los sistemas comerciales se establecen según
la incidencia de la infección en países de baja prevalencia, por lo que su capacidad
56
DISCUSIÓN
de discernir verdaderos negativos no es la más adecuada. Según los indicadores
evaluados el sistema de Western blot propio mostró mejores valores predictivos
negativos que el sistema de ELISA comercial.
La serología es útil en el estudio de poblaciones seleccionadas, sin embargo no es
capaz de diferenciar la infección activa de la exposición previa al microorganismo
(Staoch et al., 2008). A pesar de esta limitante estas técnicas se consideran de gran
utilidad porque identifica proteínas inmunodominantes reconocidas por los sueros de
pacientes con síntomas gastroduodenales. Dichos antígenos serán de utilidad para el
diseño de un sistema de detección de antígeno en heces útil para la confirmación de
la infección activa, especialmente en pacientes pediátricos, en los cuales las pruebas
serológicas son menos confiables (Silega, 2011). Además, nos proporcionaría un
diagnóstico oportuno de la infección por H. pylori, agente causal de 372 fallecidos en
Cuba (año 2013) debido a cáncer gástrico y úlceras digestivas (Llanes R. et al.,
2014).
El desarrollo de una prueba diagnóstica que emplea preparaciones antigénicas
obtenidas a partir de cepas locales y que además posee alta sensibilidad y
confiabilidad constituye una herramienta valiosa para el Sistema Nacional de Salud.
57
VI. CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
VI. Conclusiones
1. El análisis por densitometría evidencia mayor densidad y amplitud en el
reconocimiento de bandas específicas en las cepas autóctonas de H. pylori
por sueros de pacientes cubanos, lo que refuerza su empleo como antígenos
en un sistema serológico propio
2. La optimización de la cantidad de antígeno y anticuerpo primario aseguran la
confiabilidad del sistema western blot propio, y proporciona una herramienta
valiosa y robusta para el serodiagnóstico de H. pylori.
3. El reconocimiento diferencial de bandas específicas por sueros de pacientes
infectados o no por H. pylori permite el establecimiento de las regiones
proteicas de positividad y negatividad útiles para el serodiagnóstico por el
sistema de Western blot propio.
4. El sistema de Western blot que emplea antígenos propios revela valores de
desempeño superiores que el sistema ELISA comercial, lo que sugiere su
validación y futura utilización en estudios sero-epidemiológicos en Cuba.
58
VII. RECOMENDACIONES
RECOMENDACIONES
VII. Recomendaciones
1. Validar el sistema de Western blot propio empleando un mayor número de
muestras de pacientes con sintomatología gastroduodenal.
2. Emplear los antígenos especie-específicos de cepas autóctonas en la
evaluación de un futuro sistema de detección de antígeno en heces para el
diagnóstico de la infección activa por H. pylori.
59
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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