Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009

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Prácticas: Configuración de los seres vivos. Curso académico 2009-2010
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Práctica 2. Preparación de extensiones celulares
Introducción
Se entiende por extensión o frotis celular, a la formación de una fina película de células sobre un
portaobjetos, de tal manera que las células no se superpongan entre sí. Se utilizan para la visualización de
células en suspensión (p. ej., células sanguíneas), para lo cual tras la extensión de la muestra
procederemos a su tinción; entendiendo por tal, la coloración diferencial de las distintas células presentes
en la suspensión celular. Un diagnóstico válido no puede ser establecido más que sobre frotis
perfectamente extendidos y teñidos.
Las preparaciones de extensiones celulares se utilizan fundamentalmente para el estudio
morfológico de las células y la obtención de fórmulas de recuento celular.
Fundamento
El uso de suspensiones celulares de sangre entera permite observar de forma rápida, fácil,
económica y nítida diferentes tipos celulares con características morfológicas peculiares y con una notable
heterogeneidad nuclear y citoplásmica. Estos tipos celulares se ponen fácilmente de manifiesto con técnicas
histológicas de microscopía óptica, que por su metodología y sistemática suponen un entrenamiento ideal
para el estudio de suspensiones celulares de cualquier tipo; ya que raramente se trabaja con suspensiones
celulares con una diversidad celular tan elevada.
Para teñir las extensiones de sangre se emplean compuestos derivados de anilina, por los que
tienen una gran afinidad los distintos orgánulos de las células sanguíneas. Según la naturaleza química de
estos colorantes, distinguimos tres tipos: ácidos, básicos y neutros.
Los colorantes ácidos tiñen estructuras celulares básicas, tales como la hemoglobina, los gránulos
de los eosinófilos, etc.; los elementos celulares que se tiñen se denominan acidófilos o eosinófilos (un
colorante ácido típico es la eosina). Los colorantes básicos por el contrario, tiñen estructuras celulares
ácidas, tales como el ADN nuclear y el ARN; denominándose las estructuras así teñidas basófilas (entre los
más utilizados está el azul de metileno).
Finalmente, los colorantes neutros son los más utilizados en hematología, están formados por la
combinación de un colorante ácido y otro básico y su afinidad tintorial es el resultado de la combinación de
los anteriores.
La sangre es un tejido que posee diversas células suspendidas en un medio fluido denominado
plasma. Las células sanguíneas son fundamentalmente de tres tipos: Células rojas, eritrocitos o hematíes,
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células blancas o leucocitos y plaquetas o trombocitos. Que con microscopía óptica muestran la siguiente
apariencia:
•
Eritrocitos: Esta célula anucleada (en la mayoría de mamíferos) se tiñen de color rosado debido a su
alto contenido en hemoglobina. La zona central pálida, escasamente teñida, es el resultado de su forma
de disco bicóncavo, poco frecuente. Es el componente celular mayoritario de la sangre, 4-6 millones/ml.
•
Neutrófilos: Son el tipo de leucocito más frecuente en sangre. El detalle más característico es su
núcleo multilobulado. En los neutrófilos maduros existen generalmente 5 lóbulos conectados por finas
bandas de materia nuclear, pero en los neutrófilos inmaduros el núcleo generalmente es poco lobulado.
En los neutrófilos de las hembras, el cromosoma X inactivo o cuerpo de Barr aparece formando un
pequeño apéndice en forma de palillo de tambor, condensado, en uno de los lóbulos del núcleo. Se ve
en el 3% de los neutrófilos de las hembras. El citoplasma de los neutrófilos está ligeramente punteado
con gránulos de color púrpura que se denominan gránulos azurófilos, que se corresponden con
lisosomas primarios grandes.
•
Eosinófilos: Son menos frecuentes que los neutrófilos. Los eosinófilos poseen, como dato morfológico
característico, un núcleo bilobulado y un citoplasma repleto de granos grandes, eosinófilos (de color
rosado oscuro) y de tamaño uniforme.
•
Monocitos: Son los elementos mayores de todas las células de la serie blanca. Se caracterizan porque
poseen un gran núcleo, situado excéntricamente, que se tiñe menos intensamente que los otros
leucocitos. El núcleo generalmente es dentado haciéndose más dentado a medida que la célula madura
y adopta finalmente una morfología de herradura o aspecto bilobulado. El amplio citoplasma está
ocupado por pequeños lisosomas que con microscopía óptica, le dan el típico aspecto de “vidrio mate”.
•
Basófilos: Son los leucocitos menos frecuentes. En general el núcleo bilobulado está eclipsado por
numerosos gránulos grandes, intensamente basófilos (azul oscuro).
•
Linfocitos: Son las células más pequeñas de la serie blanca, presentando un tamaño ligeramente
mayor que los hematíes. Se caracterizan porque tienen un núcleo redondeado, muy teñido, y un
pequeño anillo de citoplasma agranular, ligeramente basófilo. La cantidad de citoplasma varía según el
estado de actividad de la célula; así, se observan linfocitos pequeños, medianos y grandes.
•
Plaquetas: Son pequeñas células anucleadas (en el hombre), que se forman en la médula ósea a partir
de los megacariocitos, su número varía de 150.000-400.000/ml. Son discos biconvexos redondos u
ovales. En los frotis sanguíneos suelen aparecer agrupadas y el citoplasma teñido de púrpura, tiene
aspecto granular debido a la gran cantidad de orgánulos que se disponen en el centro de la célula, el
citoplasma periférico se tiñe muy poco y por eso es apenas visible.
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Material
•
Microscopio.
•
Suspensión celular de sangre entera con anticoagulante.
•
Portaobjetos.
•
Extensor o portaobjetos esmerilado.
•
Cubreobjetos.
•
Cubetas de tinción.
•
Capilares.
•
Metanol.
•
Colorante de tinción.
•
Medio de montaje.
•
Papel de filtro.
Procedimiento
Se distinguen tres etapas:
A. Preparación de los portaobjetos
Antes de su empleo, los portaobjetos deben ser tratados para eliminar posibles impurezas de su
proceso de fabricación y manipulación (desengrasado) aplicando el siguiente tratamiento:
1. Lavar con agua y detergente.
2. Una vez aclarado con agua corriente, se depositará en un recipiente que contenga una de las tres
soluciones:
-
Mezcla sulfocrómica.
-
Etanol.
-
Etanol-eter (1:1).
3. Se mantienen 10-15 minutos, tras lo cual, si hemos usado mezcla sulfocrómica los aclararemos con
agua destilada, mientras que con las otras simplemente dejaremos evaporar el disolvente.
4. Finalmente, los secaremos con papel de filtro o en estufa.
B. Confección de las extensiones
1. Colocamos los portaobjetos sobre una superficie plana y con ayuda de un capilar depositamos una
gota de suspensión celular en un extremo (aproximadamente a 0,5 cm).
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2. Con los dedos pulgar e índice de la mano izquierda, se sostiene los dos ángulos de la parte
izquierda del portaobjetos. Con la mano derecha, se coge el portaobjetos esmerilado, colocamos el
pulgar en uno de los bordes y el índice sobre el otro. Situar este último portaobjetos esmerilado
delante de la gota de sangre, de forma que ambos portaobjetos formen un ángulo de 45º
aproximadamente. El grosor de la preparación depende del ángulo (a menor ángulo menor espesor,
y viceversa). El portaobjetos esmerilado nunca debe pasar por encima de la muestra al hacer la
extensión.
Figura 2.1. Esquema de la realización de un frotis sanguíneo por el método de los dos portaobjetos. La
flecha indica la dirección en la que debe deslizarse el portaobjetos esmerilado.
Punto de colocación
de la muestra .
3. Se hace retroceder el portaobjetos esmerilado en dirección a la gota de la suspensión celular. Tan
pronto como ambos entren en contacto, la sangre comenzará a extenderse sobre el borde del
portaobjetos esmerilado.
4. Cuando la sangre, por capilaridad, llega hasta aproximadamente 2 mm de los bordes del
portaobjetos esmerilado, efectuar un movimiento suave y rápido de éste sobre toda la longitud del
portaobjetos horizontal.
5. Dejar el frotis secar a temperatura ambiente y en posición horizontal durante un mínimo de 10
minutos.
6. Fijar las extensiones introduciendo el portaobjetos en alcohol metílico durante 5 minutos y dejar
secar a temperatura ambiente.
7. Teñir durante 30 minutos con una solución de Giemsa al 10% en agua destilada (preservar de la
luz).
8. Lavar las extensiones celulares con abundante agua destilada.
9. Dejar secar a temperatura ambiente y montar con medio de montaje.
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C. Examen de la extensión celular
Como es lógico el examen microscópico variará dependiendo de la muestra procesada.
Seguidamente, describiremos el examen de una extensión sanguínea, por ser un tipo de muestra que con
frecuencia se tiene que realizar y de gran aplicación en diferentes áreas científicas. Además, sirve de
referencia para el estudio microscópico de otros tipos de suspensiones celulares; por estar normalizada su
realización y examen microscópico.
1. En primer lugar examinaremos la preparación mediante el objetivo de 4x ó 10x. Las células deben
estar homogéneamente distribuidas en el frotis, de lo contrario lo desecharemos.
2. Seguidamente pasamos a examinar la muestra a 40x. Realizaremos un recorrido por la preparación
tal y como se indica en la figura 2.2 dentro de las zonas ideales de la extensión; identificando
correctamente los distintos tipos celulares que aparecen en la preparación, con ayuda de la
descripción morfológica (ver introducción). Estudiando con detalle su morfología.
Figura 2.2. Esquema de un frotis sanguíneo de las diferentes áreas que lo componen y la distribución
celular de las mismas. La líneas punteada indica la dirección a seguir en el recuento diferencial de
leucocitos (n=100).
Origen
Zona de linfocitos
Sentido de la extensión
Zona de neutrófilos y
monocitos
Zona ideal de recuento
3. Una vez identificados los distintos tipos celulares proceder a realizar la fórmula leucocitaria de la
muestra. Esta fórmula consiste en un recuento diferencial de los leucocitos o células de la serie blanca
de la sangre. Para ello realizar un recuento de 100 leucocitos, moviéndonos por la preparación, buscar
en la región ideal del frotis (tal y como se indica en la figura 2.2), identificar cada uno de los tipos y
anotar su número. Para poder determinar el porcentaje de cada tipo de leucocito en el total de la
muestra. Indicando su porcentaje en la tabla 2.1.
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Suponiendo que la población total de leucocitos de la muestra analizada es de 9.170 leucocitos/ml.
¿Cuántas células/ml de cada unos de los tipos de leucocitos hay en la muestra?. Indicar los resultados
en la tabla 2.1.
4. Responder a las siguientes preguntas:
a. ¿Qué función tiene el baño previo de metanol a la tinción con Giemsa en las extensiones de
sangre?
b. ¿Las estructuras basófilas son de naturaleza ácida o básica?
c.
¿Qué función tiene el mantener los portaobjetos en un baño de etanol-éter antes de usarlos para
realizar extensiones celulares?
d. ¿Qué es el cuerpo o corpúsculo de Barr?
e. ¿A que orgánulo corresponde la ligera granulación púrpura citoplásmica de los neutrófilos?
f.
Ordena de menor a mayor espesor los siguientes frotis según el ángulo de inclinación aplicado al
portaobjetos esmerilado con el que se hizo la extensión: a) 45º; b) 30º; c) 55º; d) 35º; e) 60º.
g. En la raza humana en estado de salud normal los eritrocitos son anucleados. ¿Existen especies con
eritrocitos nucleados, en caso afirmativo enunciarlas?. ¿Si existen, que significados funcional y/o
evolutivo puede tener la presencia de núcleo en los eritrocitos?
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Tabla 2.1. Esquema de los distintos tipos celulares característicos de sangre humana.
Tipos celulares
Tamaño (µ m)
Plaquetas
2-3
Monocitos
14-17
Linfocitos
7-8
Basófilos
9-10
Eosinófilos
10-12
Neutrófilos
10-12
Eritrocitos
6-8
Recuento
leucocitario
Células/ml

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