1. Tesis Introducción Material y Métodos
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1. Tesis Introducción Material y Métodos
beSEG boletín electrónico de la Sociedad Española de Genética beSEG22 1. 1.1. XXXXX 2008 Tesis Evaluación toxicológica de poblaciones humanas expuestas a fuel del Prestige 1.1.1. Tesis Doctoral presentada por Beatriz Pérez Cadahía el 24 de Noviembre de 2006 en el Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, Universidade da Coruña, dirigida por las Doctoras Josefina Méndez Felpeto y Blanca Laffon Lage. Introducción que se encargan del mantenimiento general del genoma. Son relativamente poco frecuentes en la población humana las mutaciones que afecten a la función de las enzimas de reparación (Au et al., 2003), debido a la gravedad de sus consecuencias. Sin embargo, se han ido encontrando polimorfismos en varios de estos genes que pueden provocar diferencias en la eficacia de estos mecanismos. Por todo ello, en este trabajo se realizó una determinación de la exposición ambiental a compuestos orgánicos volátiles en cada uno de los grupos. Además, se evaluaron los efectos genotóxicos inducidos por la exposición a fuel del Prestige durante las labores de limpieza en una población de de 240 individuos [60 voluntarios (VP) expuestos 5 días 4h/día, 60 trabajadores que recogieron manualmente el fuel (TR) durante 4 meses 6.5h/día y 60 trabajadores con hidrolimpiadoras (TH) expuestos 3 meses 6.5h/día y 60 controles]. Por otra parte se determinaron las características genotípicas referentes a ciertos polimorfismos presentes en las principales enzimas que participan en la detoxificación de los compuestos del fuel (CYP1A1, CYP1B1, EPHX1, GSTP1, GSTM1 y GSTT1) y en los procesos de reparación del ADN (XRCC1, XRCC3 y XPD). Debido al elevado número de vertidos de fuel que se han producido en los últimos 50 años en aguas de todo el mundo (más de 377765 toneladas desde 1960 (Vieites et al. 2004)), resulta sorprendente la ausencia a nivel internacional de estudios que contemplen los posibles efectos que la exposición a fuel puede ejercer sobre la salud humana. Como consecuencia de los vertidos existe una amplia población humana expuesta al fuel de diversas maneras y durante diferentes periodos de tiempo. Además, debido fundamentalmente a la conmoción social desencadenada por este tipo de eventos y la premura de la reacción ante la catástrofe, las medidas adoptadas en cuanto a organización, implementación de medidas de protección, etc. no suelen ser las adecuadas. El buque Prestige constituyó el último de ellos rompiendo su casco a 310 millas de las costas de Galicia el 19 de Noviembre de 2002. El fuel transportado (fuel pesado nº6) fue clasificado como posible carcinógeno humano (Grupo 2B, IARC). En su composición destacan por su carácter nocivo los VOC, los PAH y los metales pesados, propuestos por normativa comunitaria europea como principales grupos en los que se debe centrar la evaluación del riesgo del fuel (Directiva 93/67/CEE, Reglamento 793/93 del Consejo y Reglamento 1488/94 de la Comisión). A la vista de sus características y de las principales formas de interacción de sus componentes con el material biológico, resultan especialmente relevantes los fenómenos de genotoxicidad tomados como biomarcadores de efectos biológicos precoces. Muchos de los compuestos integrantes del fuel adquieren su potencial genotóxico tras procesos de activación metabólica, siendo ya conocida la existencia de numerosos polimorfismos en genes que codifican para enzimas que participan en ellos y presentando alguno de ellos consecuencias funcionales que podrían repercutir sobre la eficacia de la ruta y los niveles internos de metabolitos intermediarios. Los mecanismos de reparación del ADN desempeñan un papel crucial en relación a los niveles de daño genético ya Material y Métodos Determinación ambiental de compuestos orgánicos volátiles (VOC) Se emplearon 66 dosímetros pasivos individuales repartidos entre los tres grupos de expuestos (28 VP, 19 TR y 19 TH) para determinar las concentraciones ambientales de 13 compuestos, que son los más característicos de ambientes relacionados con combustibles derivados del petróleo: benceno, n-heptano, tolueno, n-octano, etilbenceno, m+p-xileno, o-xileno, estireno, 1,3,5-trimetilbenceno, 1,2,4trimetilbenceno, 1,2,3-trimetilbenceno y n-decano. El análisis se llevó a cabo según lo indicado por Fernández-Villarrenaga Martín et al. (2000). Biomarcadores de efecto Se desarrollaron los ensayos del cometa ((Singh et al. 1 1988) con modificaciones (Pérez-Cadahía et al. 2006)) mi- necesidad de un período de exposición largo para que el efecto cronúcleos (Pérez-Cadahía et al. 2006) e intercambios entre citotóxico se manifieste. cromátidas hermanas (Pérez-Cadahía et al. 2006). Biomarcadores de susceptibilidad Se determinaron los polimorfismos presentes en la región 3’UTR del gen CYP1A1 (Laffon et al. 2003a), codón 432 de CYP1B1 (Pérez-Cadahía et al. 2007a) codones 113 (Laffon et al. 2003b) y 139 (Laffon et al. 2006) de EPHX1, codón 105 de GSTP1 (Saarikoski et al. 1998) y poliimorfismos de deleción GSTM1 y GSTT1 (Laffon et al. (2003b). Con respecto a los genes de reparación se analizaron los polimorfismos presentes en los codones 194 y 399 de XRCC1 (Laffon et al. 2006), codón 241 de XRCC3 (Hu et al. 2001) y codón 751 de XPD (Pérez-Cadahía et al. 2007b) La edad de los individuos suele influir en los resultados de los tests de genotoxicidad. El incremento de la edad en los individuos del estudio parece asociado a una disminución en los niveles de roturas de cadena. Su explicación puede residir en el tipo de daño que pone de manifiesto el ensayo del cometa, de modo que el incremento en la tasa de roturas de cadena encontrado en los grupos de menor edad puede no representar mayores niveles de daño, sino un incremento en la actividad de reparación por escisión. De hecho, los datos procedentes de los ensayos citogenéticos reflejan incrementos en los niveles de daño en los individuos de mayor edad, resultando concordante con lo descrito en diversos estudios (Barale et al. 1998; Bolognesi et al. 1997; Fenech et al. 2003). Asociado de manera especial al tipo de exposición aquí evaluada se encuentra el tabaco, debido a la cantidad de compuestos que comparte con el fuel. En este caso, es únicamente el ensayo del cometa el que detecta influencias significativas de este factor (Figura 2), que parece ejercer un efecto de reducción del daño en el ADN en las subpoblaciones con una exposición más prolongada, lo que podría apuntar nuevamente a una respuesta adaptativa a medio plazo. Así, los individuos fumadores poseerían una maquinaria más activa tanto metabólica como de reparación debido a la constante inducción de la misma (Garaj-Vrhovac and Kopjar 2005). Por otra parte, en este estudio se ha evaluado la eficacia de las medidas de protección empleadas por los individuos, consistentes en mascarillas para evitar la exposición por vía respiratoria y traje completo que evitaría el contacto dérmico. Sin embargo, el efecto sobre los niveles de daño ocasionados no ha resultado determinante, lo que indica que las mismas no ejercieron una protección suficiente frente a esta exposición. Atendiendo a la posible influencia de polimorfismos en genes metabólicos o de reparación sobre los niveles de daño cabe destacar que el descenso de la actividad epóxidohidrolasa generada por la presencia del alelo variante del codón 113 del gen EPHX1 se asocia en general con disminuciones en la tasa de daño. Paralelamente, mayores niveles de daño se obtuvieron en individuos portadores del alelo variante del codón 139, que provoca una aumento en la actividad de la enzima. El efecto observado resulta previsible debido a que los compuestos más reactivos y considerados últimos carcinógenos de la exposición a PAH son los diol-epóxidos (Pavanello and Clonfero 2000), generados tras la acción de esta enzima, por lo tanto una reducción en su tasa de actividad dará lugar a menores niveles de exposición interna. Resulta también destacable el efecto de los polimorfismos estudiados en los genes GSTP1 (principal enzima implicada en la detoxificación de estos compuestos (Sundberg et al. 1998)) y Resultados y Discusión Resultados y Discusión Estudios previos realizados en poblaciones expuestas a vertidos de fuel describen irritaciones en la piel y ojos, dolores de cabeza, problemas de carácter respiratorio y alteraciones de índole psicológico (Liu et al. 1998; Morita et al. 1999). No obstante, dado el carácter potencialmente carcinogénico asignado a muchos de los componentes del fuel, resulta necesaria una evaluación desde el punto de vista genotóxico de la población para determinar de manera incipiente el posible daño ocasionado. La fracción de fuel integrada por los VOC constituye una de las principales fuentes de exposición tanto por el carácter genotóxico de sus integrantes como por su elevada tasa de volatilidad. Los valores medios obtenidos fueron más elevados (con un P≤0.05) para el grupo VP, seguido de TR y por último TH (Figura 1). Estos niveles resultan similares a los de ciudades altamente contaminadas como Atenas y Méjico y más elevados que los detectados tras el vertido del buque Nakhodka en Japón (Morita et al. 1999). Los tres tipos de ensayos de genotoxicidad empleados, evalúan de forma diferencial no sólo del tipo de lesión en el ADN sino también su alcance. El ensayo del cometa refleja lesiones primarias, fundamentalmente roturas de cadena y procesos incompletos de reparación por escisión, poniendo por lo tanto de manifiesto un daño relativamente reciente (Sul et al. 2003). Incrementos en los niveles de daño en el ADN se han asociado con todos los grupos de exposición, resultando más acusado el incremento en VP, de acuerdo con los mayores niveles de exposición ambiental a VOC (Tabla 1). Este hecho apuntaría a un posible fenómeno de respuesta adaptativa ante una exposición prolongada, propuesta hoy en día en diversos estudios (Fenech et al. 2003; Gourabi and Mozdarani 1998). Los ensayos citogenéticos MN y SCE reflejan incrementos en el daño genético en los grupos de exposición más prolongada, TR y TH respectivamente. Los resultados, por lo tanto, parecen indicar que la mayor parte de las roturas de cadena detectadas mediante el ensayo del cometa fueron reparadas o procedían de procesos de reparación por escisión, ya que no alcanzaron a convertirse en alteraciones citogenéticas estables. Incrementos en las tasas de ambos parámetros debidos a la exposición hidrocarburos se encuentran reflejados en diversos estudios (Çelik et al. 2003; Siwinska et al. 2004). El índice CBPI (Cytokinesis Blocked Proliferation Index) refleja a su vez un retardo del ciclo celular en los grupos TR y TH. Dicho efecto no se ha observado en los VP, lo que sugiere la 2 GSTT1, presentando en general los individuos que poseen las Bibliografía isoformas con mayor actividad menores niveles de roturas de cadena y MN, probablemente debido a la mayor actividad de Barale R et al. 1998. Environ Mol Mutagen 31:228-242. detoxificación de las enzimas. Bolognesi C et al. 1997. Environ Mol Mutagen 30:396-402. No obstante, desde una perspectiva genética es poco probable que un solo polimorfismo en un único gen altere la expresión o la función de proteínas específicas para llegar a producir un fenotipo patológico (Matullo et al. 2001). Teniendo en cuenta además que diferencias en las tasas de actividad en distintos niveles de las rutas metabólicas poseen influencia sobre los adyacentes hemos realizado un análisis combinado centrándonos de manera especial en los fenotipos esperados que pudieran resultar especialmente desfavorables en cuanto a acumulación de especies reactivas (Figura 3). Sabiendo que los compuestos más reactivos, y causantes en mayor medida de la carcinogenicidad de los PAH, son los diolepóxidos, generados tras la acción sucesiva de las enzimas CYP y EPHX1, cabría esperar que los individuos con mayores tasas de actividad para ambas resultasen expuestos a una mayor dosis interna de dichos compuestos. Así, en los resultados se aprecian incrementos en la tasa de roturas de cadena asociado a los individuos portadores de los alelos variantes para los genes CYP1A1 y EPHX1 (codón 139). En cuanto a los procesos de interacción entre los distintos pasos de la ruta se observa que el genotipo más desfavorable resulta ser el portador del alelo GSTT1 nulo en homocigosis junto con al menos un alelo variante de EPHX1 para el codón 113. Esto probablemente sea debido a un bloqueo relativo de la detoxificación de los compuestos intermedios, al tener mermadas las dos vías principales de metabolización. Çelik A et al. 2003. Mutagenesis 18(5):417-421. Fenech M et al. 2003. Mutat Res 534:65-75. Fernández-Villarrenaga Martín V et al. 2000. Analusis 28:737-742. Garaj-Vrhovac V, Kopjar N. 2005. Appl Toxicol 25:184-192. Gourabi H, Mozdarani H. 1998. Mutagenesis 13:475-480. Hu JJ et al. 2001. Carcinogenesis 22(6):917-922. Laffon B et al. 2003. Toxicology 186:131-141. Laffon B et al. 2006. Environ Int 32:342-348. Liu Y et al. 1998. Mutat Res 413:39-45. Matullo G et al. 2001. Carcinogenesis 22(9):1437-1445. Morita A et al. 1999. Environ Res 81:185-194. Pavanello S, Clonfero E. 2000. Mutat Res 463:285-308. Pérez-Cadahía B et al. 2006. TheScientificWorldJOURNAL 6:12211237. Pérez-Cadahía B et al. 2007. Toxicol Sci. (In review) Pérez-Cadahía B et al. 2007. Basic Clin Pharmacol Toxicol. (In review) Saarikoski ST et al. 1998. Int J Cancer 77:516-521. Singh NP et al. 1988. Exp Cell Res 175:184-191. Siwinska E et al. 2004. Occup Environ Med 61. Sul D et al. 2003. Mutat Res 538:109-119. En cuanto a la influencia de variaciones en las actividades Sundberg K et al. 1998. Carcinogenesis 19(3):433-436. de reparación del ADN derivadas de polimorfismos en genes Vieites DRN-R, S et al. 2004. Naturwissenchaften 91:535-538. que codifican para las proteínas participantes en dichos proLos resultados del presente trabajo han dado lugar a cesos hemos observado que el descenso en la actividad de las siguientes publicaciones: reparación determinado por la presencia del alelo XRCC1T rp 194 lleva consigo una disminución en la cantidad de ro1. Pérez-Cadahía, B., Laffon, B., Pásaro, E., Méndez, J. turas de ADN y un incremento en la frecuencia de MN, lo (2006) Genetic damage induced by accidental environque sugiere que muchas de las roturas detectadas mediante el mental pollutants. TheScientificWorldJournal. 6: 1221primer ensayo son resultantes de de procesos de reparación 1237. por escisión incompletos. La presencia del alelo XRCC3M et 241 da lugar en general a un incremento en la tasa de 2. Pérez-Cadahía, B., Lafuente, A., Cabaleiro, T., Pásaro, daño, probablemente debido a la reducción en la actividad de E., Méndez, J., Laffon, B. (2007). Initial study on the reparación. effects of Prestige oil on human health. Environ Int. 33: 176-185. Considerando las serias propiedades nocivas de los compuestos integrantes del fuel, la amplia población humana ex3. Pérez-Cadahía, B., Pásaro, E., Méndez, J., Valdiglesias, puesta tras la catástrofe y la ausencia a nivel internacional de V., Laffon, B. (2007) Genetic Polymorphism in Cyestudios que contemplen los efectos crónicos derivados de la tochrome P450 1B1 in a Spanish Population. Basic Clin exposición a fuel, en este estudio se ha llevado a cabo una dePharmacol Toxicol. 101:70-72. terminación de la exposición ambiental y los niveles de daño genético presentes en los individuos. La gran cantidad de re4. Laffon, B., Pérez-Cadahía, B., Pásaro, E., Méndez, J. sultados obtenidos en este trabajo ha permitido concluir que (2007) Human health: the great forgotten after accidenlos parámetros seleccionados han demostrado ser buenos intal oil spills. Environmental Research Advances. Nova dicadores de los procesos de toxicidad derivados de la exposiScience Publishers. (En imprenta). ción a fuel procedente del buque Prestige, así como la influen5. Pérez-Cadahía, B., Laffon, B., Porta, M., Lafuente, cia de otros factores asociados o la existencia de diferencias A., Cabaleiro, T., López, T., Caride, A., Pumarega, J., en la susceptibilidad individual a los efectos. Por todo ello, Romero, A., Pásaro, E., Méndez, J. Título: Relationconsideramos que para evaluar los riesgos que comporta una ship between blood concentrations of heavy metals and catástrofe de este tipo se deben realizar estudios que contemcytogenetic and endocrine parameters among subjects plen detalladamente el tipo de variables a tener en cuenta y involved in cleaning coastal areas affected by the “Prespermitan establecer un protocolo de actuación concreto para tige” tanker oil spill. Chemosphere. (En imprenta) minimizar el posible daño ocasionado. 3 6. Pérez-Cadahía, B., Lafuente, A., Cabaleiro, T., Pásaro, La realización del mismo ha sido posible gracias a la asigE., Méndez, J., Laffon, B. (2007) Biomonitoring of hu- nación de una Beca de Formación para Personal Investigador man exposure to Prestige oil: effects on DNA and en- (Fundación MAPFRE–Universidade da Coruña (2003-2004)) docrine parameters. Occup Environ Med. (En revisión). y una Beca Predoctoral de la Universidade da Coruña (20052007). 7. Pérez-Cadahía, B., Laffon, B., Pásaro, E., Méndez, J. (2007) Cytogenetic effects induced by Prestige oil on human populations: roles of metabolic and DNA repair Miembros de Tribunal polymorphisms. Mutat Res. (En revisión). Dr. Verea (Jefe del Servicio de Neumología. Complejo Hospitalario-Universitario Juan Canalejo), Dr. Porta (Catedrático de Medicina Preventiva y Salud Pública de la UniverAgradecimientos sidad Autónoma de Barcelona), Dr. Marcos (Catedrático de El presente trabajo fue realizado en el marco de los Genética. Departamento de Genética y Microbiología. Uniproyectos de investigación “Recogida y limpieza de fuel del versidad Autónoma de Barcelona), Dra. Mayan (Directora del Prestige. Evaluación de la exposición y daños a la salud Departamento de Salud ambiental y Toxicología del Instituen voluntarios y trabajadores” financiado por la Fundación to Nacional de Salud Dr. Ricardo Jorge. Porto. Portugal) y Arao y “Evaluación de poblaciones humanas expuestas a Dra. Lafuente (Catedrática de Toxicología. Departamento de carcinógenos o mutágenos potenciales” (Xunta de Galicia, Química Analítica y Alimentaria. Universidad de Vigo). PGIDT04PXIB10602PR). Calificación obtenida: Sobresaliente cum laude. 4