XXXV Congreso Nacional SEI - San Sebastián

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XXXV Congreso Nacional SEI - San Sebastián

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Inmunología
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Miembro SEI:
Gratuitos
Médicos:
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MIR y Estudiantes:
30,05 euros
Organismos y empresas:
66,11 euros
Ejemplar suelto atrasado:
17 euros
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200 $
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Índice Médico Español, MEDES e IBECS.
Maria Luisa del Pozo, Departamento de Inmunología, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC,
Ramiro de Maeztu, 9, E-28040 Madrid, España. Tel: +34 91 837 3112; Fax: +34 91 536 0432;
E-mail: [email protected]
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SUMARIO
PROGRAMA CIENTÍFICO . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Vol. 29, Supl. 1, Junio 2010
Sesión 7: Células dentríticas . . . . . . . . . . . . . . . 33
Moderadores: Alberto Varas, David Sancho
COMUNICACIONES ORALES . . . . . . . . . . . . 11
Sesión 1: Autoinmunidad . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Sesión 8: Inmunogenética . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Moderadores: Carmen Gelpi, Ricardo Pujol-Borrel
Moderadores: M. Dolores de Juan, Manuel Muro
Sesión 2: Células B y alergia . . . . . . . . . . . . . . 15
Sesión 9: Inmunodeficiencias I . . . . . . . . . . . . 41
Moderadores: Jose Antonio Brieva Romero,
Julia Sequí Navarro
Moderadores: Manel Juan, Margarita López Trascasa
Sesión 10: Inmunoterapia . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Sesión 3: Células T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
Moderadores: Luis AlvarezVallina, Francisco Lozano
Moderadores: Ana Clara Carrera, Enrique Aguado
Sesión 11: Inmunodeficiencias II . . . . . . . . . . . 49
Sesión 4: Células NK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
Moderadores: Nuria Matamoros, José Ramón Regueiro
Moderadores: Raquel Tarazona, Rafael Solana
Sesión 12: Inmunología tumoral . . . . . . . . . . . 53
Sesión 5: Inmunidad e infección . . . . . . . . . . . 26
Moderadores: Ignacio Melero, Angel M. García Lora
Moderadores: Miguel López Botet, María Montoya
Sesión 13: Inmunidad y trasplante . . . . . . . . . 56
Sesión 6: Inmunidad innata e inflamación . . 29
Moderadores: José Luis Vicario, Eduard Palou
Moderadores: J.L. Rodríguez Fernández,
Francisco Sánchez Madrid
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SUMARIO
Vol. 29, Supl. 1, Junio 2010
PÓSTERS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Sesión 8: Inmunodeficiencias I . . . . . . . . . . . . 93
Sesión 1: Autoinmunidad . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Moderadores: Manel Juan, Margarita López Trascasa
Moderadores: Carmen Gelpi, Ricardo Pujol-Borrel
Sesión 9: Inmunodeficiencias II . . . . . . . . . . . 94
Sesión 2: Células B y alergia . . . . . . . . . . . . . . . 70
Moderadores: José Antonio Brieva Romero,
Julia Sequí Navarro
Moderadores: Nuria Matamoros, José Ramón Regueiro
Sesión 10: Inmunogenética . . . . . . . . . . . . . . . . 96
Moderadores: M. Dolores de Juan, Manuel Muro
Sesión 3: Células NK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
Moderadores: Raquel Tarazona, Rafael Solana
Sesión 11: Inmunoterapia . . . . . . . . . . . . . . . . 108
Moderadores: Luis AlvarezVallina, Francisco Lozano
Sesión 4: Células T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
Moderadores: Ana Clara Carrera, Enrique Aguado
Sesión 12: Inmunidad y trasplante . . . . . . . . 110
Moderadores: José Luis Vicario, Eduard Palou
Sesión 5: Inmunidad e infección . . . . . . . . . . 79
Moderadores: Miguel López Botet, María Montoya
Sesión 13: Inmunología tumoral . . . . . . . . . . 117
Moderadores: Ignacio Melero, Angel M. García Lora
Sesión 6: Inmunidad innata e inflamación . . 87
Moderadores: J.L. Rodríguez Fernández,
Francisco Sánchez Madrid
Sesión 7: Células dentríticas . . . . . . . . . . . . . . . 92
Moderadores: Alberto Varas, David Sancho
Índice de Autores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
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PROGRAMA CIENTÍFICO
MIÉRCOLES, 23 DE JUNIO
09.00-15.00
09.00-19.00
ENTREGA DE DOCUMENTACIÓN
COLOCACIÓN DE PÓSTERS (Sala 10)
1. Autoinmunidad (P-001-P-025)
2. Células B y alergia (P-026-P-032)
3. Células T (P-033, P-034, P-037, O-036, P-035, P-036)
4. Células NK (P-038-P-042 y P-044-P-051)
5. Inmunidad e infección (P-052-P-056, P-058 y P-060-P072)
6. Inmunidad innata e inflamación (P-073-P-086)
11.00-12.30
MESA REDONDA: INNOVACIÓN DOCENTE EN INMUNOLOGÍA Y CIENCIAS AFINES
(Sala 1)
Moderador: Francisco García Cozar (Universidad de Cádiz)
Enseñanza virtual de inmunología en el contexto del espacio europeo de educación superior
José Peña Martínez (Universidad de Córdoba)
Evaluación continuada y apredizaje basado en problemas como estrategia en la mejora
de resultados académicos en inmunología.
Pedro Aparicio Alonso (Universidad de Murcia)
Situación de la docencia especializada en inmunología en el contexto de la nueva estructura
de Grado y Posgrado
Rocío Álvarez López (Hospital Virgen de la Arrixaca, Murcia)
12.30
REUNIÓN JUNTA DIRECTIVA SEI (Sala 1)
15.00-17.00
TALLER AUTOINMUNIDAD (Sala Cámara)
Coordinadora: Carmen Gelpí (Hospital San Pau, Barcelona)
16.00-18.00
SIMPOSIUM NEUROINMUNOLOGÍA (Sala 1)
Patrocinado por: Bayer, Biogen, CLS-Behring, Serono-Teva
Moderador: Adofo López de Munain (Hospital Donostia, San Sebastián)
Encefalopatías sinápticas autoinmunes
Josep Dalmau (Universidad de Pensilvania, Filadelfia)
Anticuerpos en enfermedades neuromusculares: Su rol en el diagnóstico y en la patogenia
Isabel Illa (Hospital San Pau, Barcelona)
Papel de las inmunoglobulinas en la patogenia de la eclerosis múltiple
Luisa María Villar (Hospital Ramón y Cajal, Madrid)
Con la colaboración del Dr. Javier Olascoaga
(Servicio de Neuroinmunología del Hospital de Donostia)
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17.00-18.15
PAUSA CAFÉ
18.15
CONFERENCIA INAUGURAL (Sala Cámara)
Lymphocytes in tumor development and metastasis: Dr. Jekyll and Mr. Hyde
Michael Karin (Universidad de California, San Diego)
19.15
20.30
INAUGURACIÓN OFICIAL (Sala Cámara)
COPA DE BIENVENIDA
JUEVES, 24 DE JUNIO
08.30-10.00
COMUNICACIONES ORALES
• Autoinmunidad (Sala Cámara) (O-001-O-010)
Moderadores: Carmen Gelpi (Barcelona). Ricardo Pujol-Borrel (Barcelona)
• Células B y alergia (Sala 1) (O-011-O-020)
Moderadores: José Antonio Brieva Romero (Cádiz). Julia Sequí Navarro (Madrid)
• Células T (Sala 2) (O-021-O-031)
Moderadores: Ana Clara Carrera (Madrid). Enrique Aguado (Murcia)
08.30-10.00
• Autoinmunidad (P-001-P-025)
• Células B y alergia (P-026-P-032)
• Células NK (P-033-P-037)
• Células T (P-038-P-051)
• Inmunidad e infección (P-052-P-072)
• Inmunidad innata e inflamación (P-073-P-086)
10.00-11.30
SESIÓN PLENARIA: PATOLOGÍA VASCULAR E INFLAMACIÓN (Sala Cámara)
Moderador: Francisco Sánchez Madrid (Hospital de la Princesa, Madrid)
PANELISTAS
Bases moleculares de la respuesta inflamatoria: papel regulador de las tetraspaninas
Olga Barreiro (CNICV, Madrid)
Los múltiples beneficios de la deficiencia de MBL en inflamación y daño tisular
Francisco Lozano (Hospital Clínic, Barcelona)
Explorando el papel de la MMP-10 en inflamación y aterosclerosis: un ejemplo de
investigación trasnacional
José Antonio Páramo (Clínica Universitaria de Navarra, Pamplona)
Receptores tipo Toll (TLR) y de esfingosina 1-fosfato (S1P) en fisiopatología cardiovascular
Carmen García Rodríguez (Instituto de Biología y Genética Molecular,Valladolid)
11.30-12.00
CAFÉ Y VISITA A PÓSTERS
12.00-12.45
INFORME CONTROL DE CALIDAD DE LA SEI: GECLID (Sala Cámara)
12.45-14.15
• Células NK (Sala Cámara) (O-032-O-040)
Moderadores: Raquel Tarazona (Cáceres). Rafael Solana (Córdoba)
• Inmunidad e infección (Sala 1) (O-041-O-047)
Moderadores: Miguel López Botet (Barcelona). María Montoya (Barcelona)
• Inmunidad innata e inflamación (Sala 2) (O-048-O-056)
Moderadores: J.L. Rodríguez Fernández (Madrid). Francisco Sánchez Madrid (Madrid).
14.15-15.30
ALMUERZO DE TRABAJO (Sala Banquetes)
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Página X
15.30-17.00
SIMPOSIO BINDING SITE: INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS (Sala Cámara)
Moderadora: Nuria Matamoros (Hospital Son Dureta, Palma de Mallorca)
Inheritated defects in immunoglobulin class switch recombination
Ane Durandy (Hospital Necker, París)
Neutropenias hereditarias
Juan Ignacio Aróstegui (Hospital Clínic, Barcelona)
15.30-17.00
TALLER DE CITOMETRÍA DE FLUJO (Sala 1)
Coordinadores: Berta Sánchez (Hospital Virgen del Rocío, Sevilla)
Marta Riñón (Hospital de Cruces, Baracaldo)
15.30-17.00
REUNIÓN DEL GRUPO DE AUTOINMUNIDAD (Sala 2)
17.00-17.30
PAUSA CAFÉ Y VISITA PÓSTERS
17.30-19.30
SIMPOSIO: INMUNIDAD E INFECCIÓN
Patrocinado por ViiV
Moderador: José Antonio Iribarren (Hospital Donostia, San Sebastián)
Desarrollo de la respuesta inmunitaria innata frente a la infección por citomegalovirus
Miguel López Botet (Universidad Autónoma de Barcelona)
Aportación de la biología de sistemas a la inmunopatogenia de la infección por VIH
José Alcamí (Instituto Carlos III, Madrid)
New strategies in the design of human vaccines
Giusepe del Giudice (Novartis, Siena)
María Montoya (Centra Recerca en Sanitat Animal – UAB, Barcelona)
19.00-20.00
DISCUSIÓN DE PÓSTERS (Sala 2)
• Autoinmunidad
• Células NK
• Células T
• Inmunidad innata e inflamación
20.00
RECOGIDA DE PÓSTERS
VIERNES, 25 DE JUNIO
08.30-10.00
• Células dentríticas (Sala Cámara) (O-057-O-066)
Moderadores: Alberto Varas (Madrid). David Sancho (Madrid)
• Inmunogenética (Sala 1) (O-067-O-077)
Moderadores: M. Dolores de Juan (San Sebastián). Manuel Muro (Murcia)
• Inmunodeficiencias I (Sala 2) (O-078-O-087)
Moderadores: Manel Juan (Barcelona). Margarita López Trascasa (Madrid)
08.30-10.00
• Células dendríticas (P-087-P-088)
• Inmunodeficiencias I (P-089-P-091)
• Inmunodeficiencias II (P-092-P-095)
• Inmunogenética (P-096-P-129)
• Inmunoterapia (P-130-P-135)
09.15-14.00
VOTACIONES SEI
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10.00-12.00
SESIÓN PLENARIA: NUEVAS TERAPIAS INMUNOLÓGICAS (Sala Cámara)
Moderador: Luis Álvarez Vallina (Clínica Puerta de Hierro, Madrid)
Jose María García (Hospital de León)
Ensayos clínicos terapéuticos en enfermedad celiaca
Francisco León (Alba Ther, New York)
Tratamientos anti-linfocitos B en LES
Iñaki Sanz (URMC, Rochester)
Inmunoterapia dirigida con células dendríticas
David Sancho (CNICC, Madrid)
12.00-12.30
12.30-14.00
SIMPOSIO BECTON DICKINSON (Sala Cámara)
Células Th17 en la salud y en la enfermedad
Moderadora: Dolores Jaraquemada (UAB, Barcelona)
IL-17 en Autoinmunidad
Jose María García Ruiz (Hospital de León)
Balance Th17-Treg, su efecto sobre la evolución del injerto en transplante renal
Mª Jose Marín (Hospital de Valdecilla, Santander)
Células Th17 y otros fenotipos Th en respuesta a infecciones bacterianas
José Alberto García Sanz (Centro de Investigaciones Biológicas, Madrid)
12.30-14.00
• Inmunoterapia (Sala 1) (O-088-O-097)
Moderadores: Luis AlvarezVallina (Madrid). Francisco Lozano (Barcelona)
• Inmunodeficiencias II (Sala 2) (O-098-O-106)
Moderadores: Nuria Matamoros (Palma de Mallorca). Jose Ramón Regueiro (Madrid)
14.00-15.30
Almuerzo (Sala Banquetes)
15.30-17.30
TALLER DE HISTOCOMPATIBILIDAD (Sala Cámara)
Coordinadores: Eduard Palou y Dra. Maria Jose Herrero
LIRAD – Instituto de Investigación German Trías i Pujol (Laboratorio de Inmunobiología), Badalona
15.30-17.00
TALLER DE INMUNOQUÍMICA (Sala 1)
Coordinadora: Maria Luisa Villar (Hospital Ramón y Cajal, Madrid)
17.30-17.45
17.00-18.00
CONFERENCIA: LA INMUNOLOGÍA EN LAS NUEVAS TERAPIAS AVANZADAS
(Sala Cámara)
Augusto Silva (Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid)
18.30-19.15
DISCUSIÓN DE PÓSTERS (Sala 1)
• Células dendríticas
• Inmunogenética
• Inmunodeficiencias I
• Inmunodeficiencias II
19.30
RECOGIDA DE PÓSTERS
19.30-21.00
ASAMBLEA DE LA SEI (Sala Cámara)
21.30
CENA DE CLAUSURA
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SÁBADO, 26 DE JUNIO
08.30
• Inmunidad y trasplante (P-136-P-152)
• Inmunología tumoral (P-153-P-167)
09.00-10.30
COMUNICACIONES ORALES Y DISCUSIÓN DE PÓSTERS
• INMUNOLOGÍA TUMORAL (Sala Cámara) (O-0107-O-0115)
Moderadores: Ignacio Melero (Pamplona). Angel M. García Lora (Granada)
• INMUNIDAD Y TRASPLANTE (Sala 1) (O-0116-O-0123)
Moderadores: José Luis Vicario (Madrid). Eduard Palou (Barcelona)
10.45-12.30
SESIÓN PLENARIA: AUTOINMUNIDAD (Sala Cámara)
Moderadora: Fiona Powrie (Universidad de Oxford)
David Otaegui (Hospital Donostia, San Sebastián)
Ricardo Pujol-Borrel (UAB, Barcelona)
Linfocitos B en enfermedades autoinmunes
Iñaki Sanz (Rochester)
Searching for genomic signatures of antiphospholipid síndrome
Ana Zubiaga (Universidad País Vasco, Bilbao)
12.30-13.00
13.00-14.00
CONFERENCIA DE CLAUSURA (Sala Cámara)
Fiona Powrie (Universidad de Oxford)
14.00
RECOGIDA PÓSTERS
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FÉ DE ERRATAS
P-057
Inmunidad e Infección
Cambia a ORAL
24/06/2010
O-036
Células NK
Cambia a PÓSTER
24/06/2010
O-084
Inmunodeficiencias I
Cambia a PÓSTER
25/06/2010
O-116
Inmunidad y trasplante
Cambia a PÓSTER
26/06/2010
12:45-14:15
SALA 1
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Comunicaciones Orales
Inmunología
Vol. 29 / Supl. 1/ Junio 2010: 11-59
SESIÓN 1: AUTOINMUNIDAD
Moderadores: Carmen Gelpi (Barcelona)
Ricardo Pujol-Borrel (Barcelona)
O-001
UTILIDAD DE LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTIRECEPTOR DE ACETILCOLINA (ACHRAB) Y ANTI-MÚSCULO
ESTRIADO (SMAB) EN EL DIAGNÓSTICO DE MIASTENIA GRAVIS. D.M. Valero Hervás, M. Sevilla Sánchez, J.L. Peña, A. Alonso
Ortiz, V. Pérez Aradas, M. Talise Astier, P. Morales Pérez, E. Paz Artal,
A. Serrano Hernandez. Hospital Universitario 12 De Octubre, Madrid.
Objetivos. La Miastenia Gravis es una enfermedad autoinmune de etiología desconocida, caracterizada por la presencia de autoanticuerpos frente a los receptores de Acetilcolina situados en la
placa motora, bloqueando la función de la musculatura esquelética causando debilidad muscular generalizada. El diagnóstico temprano permite la atenuación de la sintomatología y mejora la calidad de vida, así como la adecuación al tratamiento farmacológico. La técnica de referencia actual es la determinación de anticuerpos frente a musculo estriado (SMAb) vía InmunofluorescenciaIndirecta (IFI), pero han aparecido nuevos métodos por ELISA para
la detección de anticuerpos anti-receptor de Acetilcolina (AchRAb)
en suero.
El objetivo del presente estudio fue comparar ambas técnicas para
su adecuación diagnostica, así como la búsqueda de posibles ventajas
que pueda aportar la técnica de ELISA en pacientes tanto no diagnosticados como diagnosticados.
Materiales y Métodos. Se incluyeron 99 pacientes bajo sospecha
clínica de diversas formas de Miastenia Gravis entre Febrero de 2009
y Febrero de 2010. A cada uno de ellos se le realizó la determinación
cuantitativa de Anticuerpos anti-Receptor de Acetilcolina en suero,
siguiendo las instrucciones del fabricante (RSR Limited).Además se
realizó la titulación de anticuerpos anti-músculo estriado en suero
mediante Inmunofluorescencia Indirecta sobre portas de músculo estriado (EUROIMMUN). Los resultados fueron analizados por el software informático SPSS v.12.
Resultados. Se diagnosticaron 19 pacientes de Miastenia Gravis
de los 99. De éstos, 4 (21%) presentaron ambos parámetros negativos, 3 (15.7%) sólo positivos para AchRAb, 1 (5.2%) positivo para
SMAb, y 11 (58.1%) ambos parámetros positivos. La comparación
entre técnicas mostro que la determinación de AchRAb presenta una
sensibilidad del 40%, especificidad 37%, VPP de 5% y VPN de 86%
comparado con éstos valores para SMAb de 12%, 77%, 66% y 85%.
Sin embargo el empleo de ambas técnicas conjuntamente, AchRAb
como cribaje y SMAb como confirmación mostró unos parámetros
significativamente óptimos para el diagnóstico (p= 0.038): E: 92%,
S: 73%, VPP: 61% y VPN: 95% comparado con el uso independiente de ambas.
En 6 (30%) de los pacientes el tratamiento con Piridostigmina redujo los niveles de AchRAb, en predominando la disminución en el inicio del tratamiento y volviendo a aumentar con el tiempo de tratamiento debido a la acomodación de la misma placa motora, sugiriendo la
necesidad de ajuste de dosis. Nuestro estudio mostró que ésta disminución en los niveles de AchRAb debida al tratamiento es estadísticamente significativa (p= 0.006).
Se observó que en pacientes sanos bajo sospecha, máximos niveles de AchRAb en los momentos en los que se desencadenó la sintomatología grave y el diagnóstico de Miastenia que fue estadísticamente significativa (p= 0.005).
Conclusiones. El uso conjunto de ambas técnicas es la estadísticamente más adecuada para el diagnóstico empleando AchRAb como
screening seguida de confirmación por SMAb.
El empleo como control de pacientes de Miastenia de niveles de
AchRAb parece ser un buen indicador de efectividad del tratamiento
y de necesidad de ajuste de dosificación farmacológica así como la
determinación de rutina de AchRAb podría actuar como marcador del
momento de aparición de la sintomatología clínica de Miastenia y de
su diagnóstico en pacientes bajo sospecha.
O-002
ESTUDIO DE SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS ENTRE DISTINTOS GRUPOS DE ENFERMOS DE ESCLERODERMIA. J.M.
López Cacho1, B. Cárdaba Olombrada1, A.M. Rabasco Álvarez2, M.L.
Fernández Rodríguez2, T. Mayayo3, M. Aguerri Moreno1, C. Lahoz
Navarro1, M. Posada De La Paz4, S. Gallardo Posada1. 1Iis Fundación
Jiménez Díaz, Madrid, 2Universidad De Sevilla. Facultad De Farmacia, Sevilla, 3Sanired, 4Instituto De Salud Carlos III, Madrid.
Objetivos. Detectar diferencias en subpoblaciones linfocitarias de
sangre periférica, así como su estado de activación y/o apoptosis entre
distintos grupos de pacientes de esclerodermia distribuidos según el
tipo (localizada, sistémica), años desde el diagnóstico, agravaciones
(cardiopatías, fibrosis e hipertensión pulmonar), tipo y tiempo de
tratamiento.
Materiales y métodos. Se analizaron 49 casos y 49 controles. Se
determinó el porcentaje de Linfocitos T (CD4, CD8), B (CD19), NK
(CD56), Monocitos (CD4/SSC), Apoptosis (Anexina V) y Activación
(CD25) por citometría de flujo utilizando un citómetro de 5 colores. El
análisis estadístico se realizó mediante un test de Wilconxon no pareado.
Resultados. Hemos encontrado diferencias significativas en algunas poblaciones celulares entre los distintos grupos de pacientes y con
respecto a sus controles, tanto en activación como en apoptosis.
En general, hay una disminución de la apoptosis en todas las subpoblaciones y en todos los grupos de enfermos comparados con los
controles, aunque este efecto tiende a normalizarse con la agravación
evolutiva de la enfermedad (fibrosis o hipertensión pulmonar, afectación cardiaca o en aquellos con más de diez años de evolución). En
11
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los linfocitos B y monocitos esta disminución se produce de manera
significativa en todos los grupos estudiados. También se produce una
disminución en la esclerodermia sistémica con respecto a la localizada.
Los monocitos aumentan en todas las agravaciones evaluadas y
en mayor medida en la sistémica, pero únicamente hemos encontrado
una disminución de su activación en enfermos tratados durante más
de cuatro años con corticoides.
Los linfocitos NK son los únicos que tienen aumentada su activación en los pacientes con más de cuatro años de evolución de la enfermedad.
Con respecto a los linfocitos B, hay una disminución en aquellos
pacientes con fibrosis e hipertensión pulmonar y en la esclerodermia
sistémica difusa con respecto a controles. La apoptosis disminuye significativamente en la sistémica con respecto a la localizada.
Conclusiones. Estos resultados pueden ser importantes para el
diagnóstico diferencial de la evolución de la enfermedad y pueden ser
útiles, no sólo para un mejor diagnóstico sino también para enfocar
futuros tratamientos más específicos.
O-003
LA SEÑALIZACIÓN EPH/EFRINA B REGULA LA MADURACIÓN
DEL EPITELIO TÍMICO. J. García-Ceca Hernández, D. Alfaro Sánchez, A. Zapata González. Universidad Complutense/Facultad de Biologia, Madrid.
Objetivos. Previamente hemos demostrado que la falta de
Eph/efrinas B generan profundas alteraciones histológicas y fenotípicas en la red epitelial tímica (TEC). En el presente trabajo profundizamos en algunas de estas alteraciones a fin de comprender el papel
de estas moléculas en la maduración del epitelio tímico.
Material y Métodos. Se han analizado mediante citometría de flujo e inmunofluorescencia la diferenciación y supervivencia de las TEC
durante las primeras etapas del desarrollo embrionario (13.5 y 15.5F)
en ratones WT y deficientes en EphB2. Además, la supervivencia y
diferenciación de las células epiteliales fueron estudiadas in vitro
mediante reagregados (RTOC), cultivos organotípicos (FTOC) o cultivos en monocapa de epitelio de lóbulos tímicos WT fetales (13,5F),
mantenidos en presencia (o no) de proteínas de fusión (efrinaB1-Fc y
EphB2-Fc).
Resultados. Nuestros resultados demuestran que la falta de EphB2
provoca un incremento de muerte en la fracción CD45-total y, fundamentalmente, en las TEC corticales CD45–Ly51+ a 13.5 y 15.5F. Además, la proporción de células CD45-apoptóticas incrementaba significativamente en RTOC tratados con proteínas de fusión, que bloqueaban las interacciones TEC-timocitos. Por el contrario, la estimulación
de las señales trasmitidas por Eph/efrinas B rescataba significativamente de la muerte las TEC. De nuevo, el porcentaje de TEC apoptóticas aumentaba en RTOC establecidos con TEC y/o timocitos deficientes en EphB2.
Por otro lado, nuestros resultados previos demostraban un retraso en la maduración de TEC en ratones EphB2–/– junto con una desorganización de la red epitelial que resultaba en la aparición de grandes
áreas carentes de queratinas. Un análisis fenotípico exhaustivo del contenido de estas áreas sugiere que en ellas está aconteciendo una transformación epitelio-mesénquima como consecuencia de la falta de
EphB2. Además, análisis a citometría de flujo de lóbulos tímicos 13,515,5F deficientes en EphB2 demuestran un aumento de la proporción
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de células progenitoras CD45–EpCAM+MTS20+ y una reducción de las
TEC medulares maduras CD45–EpCAM+UEA-1+. Este retraso en la
maduración del epitelio tímico se puso también de manifiesto con
FTOCs 13,5F WT cultivados en presencia de EphB2-Fc o efrinaB1-Fc
durante 5 días. De nuevo, se observó un incremento significativo en la
proporción de células CD45–EpCAM+MTS20+ y una reducción de las
células CD45–EpCAM+UEA-1+.
Conclusiones. Estos resultados demuestran la relevancia de
EphB2 y sus ligandos las efrinas B en la maduración del epitelio tímico.
O-004
RELACIÓN ENTRE CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES Y
CELULAS ENDOMETRIALES ESTROMALES HUMANAS: FENOTIPO ANTIGÉNICO Y SUSCEPTIBILIDAD A LA APOPTOSIS.
E. Leno Durán, R. Muñoz Fernandez, A. Prados Martin, E. García Olivares, M.D.C. Ruiz Ruiz. Universidad de Granada/CIBM, Armilla.
Objetivos. Las células más abundantes del endometrio son las
células endometriales estromales (ESC). Durante la fase secretoria del
ciclo menstrual y, sobre todo si el embarazo se produce, las ESC o sus
equivalentes en la decidua, las células deciduales estromales (DSC) se
diferencian (decidualizan) por el efecto de la progesterona. Aunque
las ESC proceden de las DSC, y ambas, de las células madre mesenquimales (MSC), al encontrarse estas células en un entorno citoquímico y hormonal diferente, es probable que estos dos tipos de células presenten diferencias fenotípicas y funcionales que podrían influir en
las actividades inmunorreguladoras de estas células. El objetivo de este
trabajo es comparar fenotipo antigénico, diferenciación por progesterona, susceptibilidad a la apoptosis y efecto sobre la apoptosis espontánea de los linfocitos.
Materiales y métodos. DSC proceden de abortos inducidos del
primer trimestre de mujeres sanas (20-30 años). ESC fueron recogidas de sangre menstrual de mujeres sanas entre 20-30 años.
Las células fueron cultivadas en OPTI-MEM y decidualizadas con
progesterona 300 nM y AMPc 500 µM durante 30 días. El medio fue
cambiado cada 3-4 días.Las células apoptóticas fueron detectadas por
citometría de flujo cuantificando las células en la fase sub-G1 del ciclo
celular. El fenotipo antigénico de las células fue medido por citómetría de flujo.
Proteínas implicadas en la apoptosis fueron detectadas mediante
western-blot.
Resultados. ESC y DSC presentan un fenotipo similar, prácticamente todas las células expresan CD10, CD73 y CD29, presentando
diferencias en el marcador CD21 y CD54. Las DSC decidualizadas producen altos niveles de prolactina (marcador de decidualización), mientras que las ESC producen unos niveles significativamente menores.
Al decidualizar, una proporción de DSC y ESC se encentra en apoptosis, aunque la proporción de células apoptóticas de las primeras fue
superior. Se observa que la apoptosis asociada a la decidualización
induce una disminución de proteínas antiapoptóticas como FLIP, BCLxL y XIAP. Además, ESC y DSC protegen de la apoptosis espontánea a
los linfocitos periféricos.
Conclusiones. Aunque las DSC y ESC presentan un fenotipo antigénico semejante y protegen a los linfocitos de la apoptosis espontánea, su susceptibilidad a la decidualización, medida por la secreción
de prolactina y por la tendencia a la apoptosis fue significativamente
superior en las DSC que en las ESC.
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INMUNOLOGÍA
O-005
TOLEROGENIC DENDRITIC CELLS AS A POTENTIAL TOOL
FOR TOLERANCE INDUCTION IN MULTIPLE SCLEROSIS. D.
Raïch Regué1, L. Grau López2, M. Naranjo Gómez1, C. Ramo Tello2, R.
Pujol Borrell1, E. Martínez Cáceres1, F.E. Borràs Serres1. 1Institut d'Investigació Germans Trias i Pujol, Barcelona. 2Hospital Universitari Germans
Trias i Pujol, Barcelona.
Multiple sclerosis (MS) is a chronic demyelinating autoimmune
disease of the Central Nervous System. Current MS therapies decrease
the frequency of relapses and modestly the accumulation of disability,
but do not prevent MS progression. Tolerance induction to myelin
antigens is a promising therapeutic strategy in MS. Dendritic cells (DC)
is the main antigen presenting cells. DC therapy in tumour and infection
immunology has been longly investigated as a potential tool to induce
the immunoresponse in those situations.
Objective. Our aim is the generation of tolerogenic dendritic cells
from autologous peripheral blood monocytes (MDDC) of MS patients,
as a tool for cellular therapy and tolerance induction.
Methods.Peripheral blood cells were obtained from donors
(n=8) and patients with relapsing-remitting MS (n=8). GM-CSF and
IL-4 were used to differentiate MDDCs; maturation was induced with
a proinflamatory cytokine cocktail, in the absence (mature DC [matDC])
or presence of 1α,25-dihydroxyvitamin D3 [tolDC]. The morphology,
viability, phenotype, cytokine production and the ability of MDDC to
induce T cell proliferation were evaluated.
Results. MDDC differentiation yield, viability and functionality were
similar in both healthy subjects and MS patients. tolDC exhibited a reduced
expression of CD83, CD86 and HLA-DR, produced low levels of IL-12/IL23, and showed a lower capacity to induce proliferation of allogeneic T
cells when compared to matDC. Supernatants from tolDC allostimulated
T cells revealed an impaired secretion of proinflammatory cytokines (IL6, TNF-α, IFN-γ). In addition, tolDC were resistant to a subsequent
maturation stimulus induced by LPS. Specific binding of myelin peptides
to MDDC was shown by competition binding assay. Myelin peptideloaded matDC induced proliferation of autologous T cells obtained from
MS patients, thus confirming the specificity of the assay.
Conclusions. Tolerogenic MDDC may be generated from monocytes
of MS patients, and loaded with myelin peptides might be an effective
tool to restore antigen-specific tolerance in MS. The generation of specific
T cell responding population (i.e. regulatory T cells) merits further
investigation.
O-006
EL ANÁLISIS MEDIANTE UNA APROXIMACIÓN DE PROTEÓMICA CUANTITATIVA COMBINADA REVELA UN INCREMENTO DE APOPTOSIS TRAS LA EXPRESIÓN DEL REGULADOR
AUTOINMUNE (AIRE) EN CÉULAS EPITELIALES. N. Colomé1, J.
Collado2, J.J. Bech-Serra1, I. Liiv3, L.C. Antón4, P. Peterson3, F. Canals1,
D. Jaraquemada2, I. Álvarez2. 1Institut dÓncologia. Vall d´Hebron, Bellaterra. 2Unitat dÍmmunologia. Institut de Biotecnologia i Biomedicina. 3Biomedicum, Tartu, Estonia. 4Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa", Madrid.
Objetivos. APECED es una enfermedad autoinmune recesiva multiorgánica que se asocia a la pérdida de función de un único gen llamado AutoImmune REgulator (AIRE). Ratones deficientes en este gen
desarrollan diversos procesos autoinmunes. AIRE se expresa principalmente en células epiteliales medulares tímicas (mTECs) y su ausencia
resulta en la pérdida de tolerancia a antígenos específicos de tejido (TRAs).
Experimentos con microarrays han demostrado que AIRE induce la
transcripción de TRAs en mTECs. Otra función que se ha descrito es su
papel de inductor de apoptosis en mTECs, que podría generar mayor
cross-presentation por parte de las células dendríticas medulares. Hasta
el momento no se ha estudiado el efecto de AIRE sobre la célula a nivel
proteico. El objetivo de este trabajo ha sido analizar el impacto sobre el
proteoma de la expresión de AIRE en células epiteliales humanas.
Material y Métodos. Se transfectó la línea epitelial humana HT93
con el gen de AIRE. Diversos extractos proteicos celulares se analizaron mediante una aproximación que combinó dos técnicas de proteómica cuantitativa (2D-DIGE e ICPL). Los datos se confirmaron por
western blot y por citometría de flujo. Finalmente se realizaron ensayos de apoptosis con anexina V y etopósido.
Resultados. Los resultados mostraron que algunas chaperonas
(HSC70, HSP27 y tubulin-specific chaperone A) se encontraban en
mayor abundancia en las células AIRE+, mientras que varias proteínas
relacionadas con el citoesqueleto (transgelin, caldesmon, tropomyosin
alpha-1 chain, myosin regulatory light polypeptide 9 y myosin-9) estaban en menor cantidad. Además se observaron cambios cuantitativos en diversas proteínas relacionadas con apoptosis. La diferencia de
abundancia de algunas proteínas se confirmó por Western blot y citometría de flujo. Estos datos sugerían que las células transfectadas con
AIRE presentan un perfil proteico compatible con un incremento de
apoptosis. Mediante experimentos con anexina V y etopósido se confirmó que las células que expresan AIRE sufren más apoptosis espontánea y son más sensibles a la inducción de apoptosis.
Conclusiones. El uso de técnicas de proteómica cuantitativa ha
permitido demostra que las células AIRE+ sufren más apoptosis que
las células AIRE-, lo que revela que AIRE puede jugar papeles diferentes de la regulación transcripcional en el control de la autoinmunidad.
O-007
ESTUDIO DE LA SÍNTESIS INTRATECAL DE ANTICUERPOS EN
LA ENCEFALITIS AUTOINMUNE EXPERIMENTAL. N. Marin1, M.J.
Mansilla2, J.C. Alvarez-Cermeño1, X. Montalban2, C. Guaza3, L. Villar4,
C. Espejo2. 1Unidad De Esclerosis Múltiple, Hospital Ramón Y Cajal, Madrid.
2Unidad De Neuroinmunología Clínica, Hospital Universitario Vall D´Hebron,
Barcelona. 3Instituto Cajal, Consejo Superior De Investigaciones Científicas,
Madrid. 4Unidad De Esclerosis Múltiple, Hospital Ramón Y Cajal, Madrid.
Objetivos. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es
una enfermedad desmielinizante que se induce en ratones mediante
inmunización con distintos antígenos de la mielina. Se utiliza como
modelo experimental para el estudio de la esclerosis múltiple. Nuestro objetivo fue estudiar la evolución de la síntesis intratecal de anticuerpos a lo largo del tiempo en la EAE inducida mediante inmunización de ratones SJL con la proteína proteolipídica (PLP).
Métodos. Se obtuvieron muestras de líquido cefalorraquídeo y suero a día 0, 7 14, 31 y 38 tras inmunización. Así mismo, se valoró diariamente la puntuación clínica de los signos neurológicos. Se determinó
el título de anticuerpos anti-PLP y frente a otras proteínas mayoritarias
de la mielina [proteína básica de mielina (MBP) y glicoproteína de la mielina del oligodendrocito (MOG)] mediante ELISA. Se estudió la síntesis
intratecal de IgG e IgM mediante isoelectroenfoque e inmunodetección.
Resultados. Síntesis intratecal de IgG: Aparece un patrón en espejo a partir del día 7 postinmunización, que se mantiene a lo largo del
seguimiento.
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Síntesis intratecal de IgM: Se detecta en las muestras de día 7 y 31
post inmunización coincidiendo con el primer y segundo brote de la
enfermedad. No se detectó en los periodos de remisión.
Anticuerpos anti-PLP, IgM: Alcanzan un máximo a los 14 días, a partir de ese punto, los títulos decrecen. IgG: Aumentan hasta los 14 días. A
partir de este punto se mantienen estables durante el seguimiento.
Anticuerpos anti-MBP: Se detecta un aumento a partir del día 31
que se mantiene durante el seguimiento.
Anticuerpos anti-MOG: Se detectan títulos muy bajos a partir
del día 31.
Conclusiones. Los ratones hacen una respuesta temprana a la PLP
que induce una diseminación de epítopos, detectándose anticuerpos
frente a otros antígenos de la mielina a partir del segundo brote de la
enfermedad.También se detecta la presencia de un patrón oligoclonal de IgG en suero, con la aparición de nuevas bandas a lo largo de
la evolución. La síntesis intratecal de IgM coincide con los periodos de
actividad de la enfermedad. Estos hallazgos pueden contribuir a dilucidar el papel de la síntesis de anticuerpos en la EAE.
O-008
EVIDENCIA DE ALTERACIONES EN LOS COMPARTIMENTOS
DE LINFOCITOS B Y DE LA ACTIVACION DE CÉLULA T EN EL
SÍNDROME ANTIFOSFOLÍPIDO TROMBÓTICO. J. Carbone Campoverde, A. Gallego López, N. Lanio Amador, C. Chean Pacheco, J.
Navarro Caspistegui, J. Dale, E. Sarmiento Marchese. Hospital Gregorio Marañón, Madrid.
Introducción. Existe evidencia de que el síndrome de anticuerpos
antifosfolípidos (SAAF) no sólo es una patología pro-trombótica sino
que también asocia un componente inflamatorio. Nosotros hemos descrito que en el SAAF obstétrico existe una mayor activación de linfocitos T CD4+ (J Rheumatol 2009; 36:1217).
Objetivos. Caracterizar alteraciones inmunofenotípicas de sangre
periférica en pacientes con SAAF trombótico.
Métodos. Pacientes: 13 pacientes con SAAF trombótico (diagnosticados según criterios de clasificación de Sidney) y 52 controles sanos
de edad similar. Las subpoblaciones linfocitarias T, B y NK se estudiaron en fresco, en sangre periférica, mediante citometría de flujo de tres
colores (sangre total), incluyendo distintas combinaciones de anticuerpos monoclonales anti: CD3, CD4, CD8, CD25, CD45RA, CCR7, CD38,
HLA-DR, CD19, CD27, IgD, CD5, CD40, CD16 y CD56. Estadística:
prueba T de Student con dos colas.
Resultados. En relación con los controles sanos, los pacientes con
SAAF trombótico tenían: mayor porcentaje de linfocitos B naive
(CD19+CD27-IgD+: 67 vs 58%, p= 0,04) y menor de linfocitos B de memoria con cambio de isotipo (CD19+CD27+IgD–: 14 vs 22%, p=0.009); aumento de la expresión de marcadores de activación tanto en células T CD4+
(CD4+CD25+DR+: 5 vs 3.7%, p=0.01) como CD8+ (CD8+DR+: 27 vs 21%,
p=0.03). En los pacientes con SAAF trombótico no observamos alteraciones en el porcentaje de células T CD4 o CD8 reguladoras (CD4+CD25high,
CD8+CD28–), ni en el porcentaje de células NK (CD3–CD16+CD56+).
Conclusiones. En pacientes con SAAF trombótico se observan distintas alteraciones inmunofenotípicas en linfocitos de sangre periférica, algunas de ellas potencialmente implicadas en la patogenia del síndrome, lo que aporta más evidencia al concepto de que este síndrome
se extiende más allá de la producción de autoanticuerpos. A la vista de
los resultados, un aumento de células B naive evidenciaría la posibilidad de que esta subpoblación no sólo puede participar en procesos
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de presentación antigénica sino en la misma producción de anticuerpos. El aumento de marcadores de activación sobre células T CD4+ se
podría enmarcar en la posible presencia de células T autoreactivas.
O-009
RECLUTAMIENTO DE SUBPOBLACIONES ESPECIFICAS DE LINFOCITOS T CD8+ REGULADORES EN LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO DE PACIENTES DE PACIENTES EN PRIMER BROTE DE
ESCLEROSIS MULTIPLE. M. Tejera Alhambra, R. Teijeiro, B. Alonso, C. De Andrés, E. Fernández-Cruz, S. Sánchez-Ramón. Hospital General Universitario Gregorio Marañón, Madrid.
La esclerosis múltiple (EM) es una grave enfermedad inflamatoria desmielinizante y progresiva del sistema nervioso central (CNS),
en la que diferentes subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ juegan un importante papel en el daño tisular y en la supresión de la respuesta efectora. Se desconoce la presencia y función de los linfocitos
T CD8+ reguladores (Ts) en la fisiopatología de la EM.
Objetivo. Estudiar la presencia de subpoblaciones de linfocitos Ts
(CD8+CD25+, CD8+CD28–, CD8+CD25+CD28–, CD8+CD25+FoxP3+ y
CD8+CD25+CD127lo) y efectores (CD8+CD45Ra+CCR7–) en el líquido
cefalorraquídeo (LCR) y sangre periférica (SP) de pacientes con primer brote de EM.
Materiales y Métodos. Se analizaron en paralelo mediante citometría de flujo multiparamétrica muestras de LCR y SP de pacientes
con EM (n= 13).
Resultados. Los porcentajes de linfocitos Ts CD8+CD28–,
CD8+CD25+CD28–, CD8+CD25+CD127– y CD8+CD25+FOXP3+ fueron
superiores en LCR que en SP (p= 0,05; p= 0,06; p= 0,004 y NS, respectivamente), indicando un reclutamiento específico de estas células en
el LCR en brote. Por el contrario, los linfocitos T CD8+CD25+ totales
fueron más abundantes en SP (p=0,03). Los porcentajes de células T
CD4 y CD8 naïve fueron menores en LCR (p<0,0001 y p=0,004, respectivamente) respecto a SP, mientras que las células T CD4 pre-efectoras
(p=0,004), memoria (p=0,002) y efectoras (p= 0,07) fueron mayores
en LCR. Las células CD8 pre-efectoras fueron mayores en LCR
(p=0,004), mientras que las células CD8+ memoria (p=0,04) en SP.
Conclusiones. En nuestra cohorte de pacientes en primer brote
de EM observamos un enriquecimiento específico de subpoblaciones
de Ts y de células T CD4+ y CD8+ pre-efectoras y CD4+ efectoras en el
LCR. Estos datos podrían sugerir el reclutamiento específico de Ts que
modulan a la baja la molécula CD28 y expresan el factor de transcripción FoxP3 para inhibir la respuesta efectora T CD4 y CD8 antígeno específica en un intento de controlar la enfermedad.
O-010
A ROLE FOR AIM, A MACROPHAGE SOLUBLE MEMBER OF THE
SRCR SUPERFAMILY, AS A PATTERN RECOGNITION RECEPTOR.
V.G. Martínez1, C. Escoda I Ferran1, C. Miró1, A. Castrillo2, F. Lozano3.
1Fundació Clínic per a la Recerca Biomèdica, Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Barcelona. 2Departamento de Bioquímica-Biología Molecular, Universidad de Las Palmas. 3Departamento de Biología Celular, Inmunología y Neurociencias, Universidad de Barcelona.
*Authors contributed equally to this work (Oral). No beca Inmunidad Innata.
Mouse AIM (Apoptosis Inhibitor expressed in Macrophages), a
homologue of human Spα, is a soluble member of the scavenger receptor
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INMUNOLOGÍA
cysteine-rich (SRCR) superfamily, a group of proteins involved in both
the innate and adaptive immune response. Pleiotropic functions have
been ascribed to AIM, from survival support of lymphocytes during
thymic selection to anti-inflammatory effects in autoimmune pathologies.
To further explore its functional capabilities we successfully expressed
a recombinant form of AIM (rAIM) using an episomal system in HEK293EBNA cells. We used rAIM to generate AIM-specific rat mAbs and to
identify conserved epitopes cross-reactive with anti-Spα mouse mAbs
previously generated by our group. Additionally, the pathogen-binding
properties of rAIM were also explored. The results obtained show
that rAIM binds to a number of Gram-positive as well as Gram-negative
bacterial strains. Furthermore, rAIM induced aggregation of both Grampositive and Gram-negative bacteria, which could imply the existence
of multiple bacterial binding domains. Bacterial binding and aggregation
was insensitive to EDTA, suggesting that divalent ions do not influence
binding of rAIM to bacteria. Interestingly, Interestingly, some of the rat
anti-AIM and mouse anti-Spα mAbs used in this study competed the
binding of both rAIM and rSpα to bacteria. Altogether, these data suggest
a role for AIM in innate immune defence against bacteria.
SESIÓN 2: CÉLULAS B Y ALERGIA
Moderadores: Jose Antonio Brieva Romero (Cádiz)
Julia Sequí Navarro (Madrid)
O-011
MODULACIÓN DE LA MIGRACIÓN DE CÉLULAS B NAIVE POR
LIGANDOS DE INTEGRINAS. J. Saez De Guinoa Corral, L. Barrio
Cano, M. Mellado, Y. R. Carrasco. FCSIC/Centro Nacional de Biotecnología, Madrid.
Las células B naive migran activamente dentro de los órganos linfoides secundarios (OLS) en busca de antígeno específico. Este movimiento está regulado principalmente por la quimioquina CXCL13 y,
en menor medida, la quimioquina CXCL12, ambas producidas por
células foliculares dendríticas (FDC) y otras células estromales presentes en los OLS. Datos obtenidos mediante técnicas de microscopía confocal y multifotón indican que las células B se desplazan siguiendo la
red de “caminos” formada por la superficie de las FDC. Poco se sabe
a cerca del posible efecto modulador del contexto molecular sobre el
cual la célula B migra. En este trabajo, hemos puesto a punto un modelo bidimensional de membranas artificiales donde podemos estudiar
la dinámica en tiempo real de células B naive en respuesta a CXCL13
y CXCL12 mediante técnicas de microscopía confocal. Con este sistema hemos analizado cómo las moléculas de adhesión ICAM-1 y VCAM1, ligandos de las integrinas LFA-1 y VLA-4, respectivamente, modifican la migración de las células B naive. Los resultados obtenidos indican que las quimioquinas CXCL13 y CXCL12 inducen la polarización de las células B naive en igual proporción, y de manera independiente a la presencia de ambos ligandos de integrinas. Por otra parte,
la migración sí requiere de la presencia de ICAM-1 y/o VCAM-1; además, su densidad juega un papel crítico en la modulación de los parámetros dinámicos de la célula B naïve. Es necesaria una densidad mínima de estos ligandos para promover la migración de la célula B; a densidades óptimas, los parámetros dinámicos alcanzan valores muy similares a los descritos in vivo por microscopía multifotón en ganglios linfáticos; altas densidades de ICAM-1 y/o VCAM-1 retardan, sin embar-
go, el movimiento de la célula B. Por último, también hemos observado que, a iguales densidades, ICAM-1 promueve una mayor velocidad de migración y, por tanto, una dinámica más activa, que VCAM1. En conjunto, estos datos ponen de manifiesto el importante papel
modulador de ambas moléculas de adhesión en la dinámica de las células B y, por tanto, en los procesos de búsqueda y reconocimiento del
antígeno específico en los OLS.
O-012
UTILIDAD DEL TEST DE ACTIVACIÓN DE BASÓFILOS EN EL
DIAGNÓSTICO DE LA ANAFILAXIA A FÁRMACOS. A. Marin
Sánchez, P. García Ortega, I. Salvador Corres, A. Teniente Serra, E.
Ruiz-Ortiz De Arrizabaleta, R. Pujol-Borrell, E. Martínez-Cáceres.
Hospital Germans Trias i Pujol, Badalona.
Objetivo. Evaluar la utilidad de la test de activación de basófilos
(TAB) en el diagnóstico de la alergia a fármacos en pacientes con anafilaxia grave en los que las pruebas in vivo se consideran de alto riesgo.
Materiales y Métodos.Se seleccionaron pacientes que consultaron después de una anafilaxia potencialmente mortal que se había producido en menos de una hora tras la administración de un sólo fármaco. Después de la anamnesis detallada, los pacientes con otras etiologías posibles fueron descartados por la historia clínica y/o pruebas
cutáneas. Entre 2 a 6 meses después de la reacción se realizaron tanto
el TAB (Basotest, Orpegen, Alemania) como la determinación de IgE
específica (ImmunoCAP, Phadia, Suecia). Las pruebas cutáneas se efectuaron sólo a pacientes con reacciones menos graves que aceptaron
el riesgo y que firmaron un consentimiento informado.
Resultados. Se recogieron 24 pacientes que cumplían las condiciones del estudio. La clínica fue de paro respiratorio (3 casos), shock
(10 casos), edema laríngeo (2 casos), pérdida de conciencia (4 casos),
disnea (4 casos) y obnubilación (1 caso). Los fármacos implicados fueron la amoxicilina en 14 pacientes, metamizol en 5, el ibuprofeno en
2 y cloxacilina, ácido pipemídico y diclofenaco en el resto. El TAB fue
positivo en 10 pacientes (42%), negativo en 12 (50%) y no evaluable en
2 (8%), estos últimos correspondientes a un paciente no respondedor
frente al control con anti-IgE y otro con menos del 5% basófilos activados frente al fármaco. La IgE específica fue positiva en sólo 3 / 17
pacientes (18%) con TAB negativo (n=1) o dudoso (n=2).
Conclusiones. A pesar de que las pruebas cutáneas siguen siendo la herramienta más fiable para determinar alergia a fármacos grave, cuando estas pruebas no se pueden realizar por razones éticas o
porque son rechazadas por los pacientes, la combinación del TAB y la
IgE específica puede identificar el fármaco responsable en más del 50%
de los pacientes con anafilaxia potencialmente mortal.
O-013
MECANISMOS REGULADORES IMPLICADOS EN LA RESPUESTA ALÉRGICA: MODELO DE RESPUESTA AL POLEN DE OLIVO.
M. Aguerri Moreno1, F. Florido2, J. Quiralte3, J. Delgado4, A. Miranda5,
J.M. López-Cacho1, S. Gallardo1, P. Palomino1, L. Carlos1, B. Cárdaba
Olombrada1. 1IIS-Fundación Jiménez Díaz-CIBERES, Madrid. 2Hospital
Universitario San Cecilio, Granada. 3Hospital Universitario Virgen del Rocío,
Sevilla. 4Policlínico, Sevilla. 5Hospital Civil, Málaga
Objetivo. La sensibilización y la tolerancia (natural o inducida)
a los alérgenos puede ser debida a diferentes mecanismos molecula-
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res. El objetivo del trabajo es analizar alguno de estos mecanismos,
usando como modelo la respuesta al polen de olivo.
Material y Métodos. Se seleccionaron 84 sujetos distribuidos en
5 grupos: Grupo 1 (no alérgicos, N=17), Grupo 2 (asintomáticos con
anticuerpos IgE frente a olivo, N=10), Grupo 3 (alérgicos no relacionados, N=20), Grupo 4 (alérgicos al olivo, no tratados, N=22) y Grupo 5
(alérgicos al olivo con inmunoterapia específica, N=15). Se obtuvo suero, plasma, PBMCs, ARN y ADN durante y fuera del periodo de polinización.
En el suero se determinaron los niveles de anticuerpos IgE total,
IgE, IgA e IgG4 específicos al polen de olivo mediante CAP, así como
citoquinas Th1 (IFN-γ), Th2 (IL-4, IL-5, IL-9, IL-13), reguladoras (IL-10,
TGF-β) e IL-17 y TNF-α mediante ensayos inmunoenzimáticos (ELISA).
El RNA se extrajo de las PBMCs por el método de Trizol y se analizó la expresión del mRNA del gen FOXP3 mediante RT-PCR.
Resultados. Los niveles más altos de anticuerpos IgE específicos
se observaron en los sujetos alérgicos al olivo (tratados y no tratados)
aunque los tratados mostraron los niveles más altos de anticuerpos
IgG4 específicos. El grupo de asintomáticos mostró los mayores niveles de IgE total.
El resultado más relevante del análisis de citoquinas fue el descenso significativo de los niveles de TGF-β en el grupo de alérgicos no tratados durante la polinización. En este mismo grupo encontramos un
descenso significativo en la expresión de FOXP3.
Conclusiones. Los resultados de la respuesta humoral junto al
descenso de TGF-β en suero y de FOXP3 en el grupo de sujetos alérgicos al olivo en el periodo de mayor exposición polínica, sugieren un
descenso de los mecanismos reguladores en los pacientes alérgicos, y
cómo la respuesta puede ser normalizada mediante la inmunoterapia.
O-014
DESCUBRIMIENTO DE BIOMARCADORES ÚTILES EN EL DIAGNÓSTICO PRECOZ DE LEUCEMIAS LINFOIDES B. M. Fuentes
García1, R. Bartolome Casado1, M. Gonzalez-Gonzalez1, R. Góngora2,
J.M. Sayagües2, F. Lund-Johansen3, A. Orfao1. 1Universidad de Salamanca-CSIC, Salamanca. 2Universidad de Salamanca, Salamanca. 3University of
Oslo, Oslo, Norway.
En este proyecto se ha desarrollado una estrategia metodológica
que permita relacionar el inmunfenotipo de células B neoplásicas individuales con sus niveles de expresión para un amplio abanico de proteínas. Para ello, se han combinado técnicas de purificación celular por
citometría de flujo y que permiten además una caracterización inmunofenotípica básica de las células B aberrantes, junto con la utilización
de arrays de proteínas (basados en esferas) para establecer patrones
de expresión proteica a nivel de las poblaciones celulares purificadas
subyacentes a los diferentes inmunofenotipos celulares encontrados.
Objetivos. 1. Diseño y desarrollo de un array de partículas magnéticas para la purificación mediante citometria de flujo de poblaciones de células B aberrantes de pacientes con leucemia linfoide B, de
subpoblaciones B neoplásicas muy minoritarias (pequeños clones de
significado incierto detectados en individuos aparentemente sanos)
y su contrapartida normal. 2.Rastreo dirigido hacia la detección de anticuerpos frente a proteínas potencialmente antigénicas de las líneas de
células B neoplásicas. 3. Análisis de arrays basados en anticuerpos para
la determinación de patrones proteicos de expresión, incluyendo la
cuantificación de proteínas individuales intracelulares, la evaluación
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de niveles de fosforilación, ... en células aberrantes B comparado con
células normales.
Metodología. Se incluirán un total de 100 individuos; n=50 LLCB u otros SLPC-B leucemizados (n=50). Inicialmente se les proporcionará a todos los individuos un cuestionario de salud y sobre sus muestras de sangre periférica obtenidas en ese momento, se realizará el rastreo diagnóstico de la presencia de células B clonales mediante citometría de flujo, con anticuerpos monoclonales en combinaciones cuádruples/séxtuples. En los casos en los que se detecte la presencia de
células B aberrantes se realizará una amplia caracterización de la/s
población/es B aberrante/s purificada/s: a) Caracterizacion inmunofenotipica completa y exhaustiva de dichas poblaciones de celulas B
por citometria de flujo. b) Rastreo de muestras de plasma de la presencia de Ac frente a una amplia gama de bacterias, virus y otros microorganismos mediante tecnicas inmunoenzimaticas; c) Estudios de expresión proteica diferencial mediante técnica de microarrays de proteinas.
Finalmente, se hara la integracion y analisis de los datos obtenidos y
correlacion con los hallazgos clinicos y biologicos.
Resultados y Conclusión. Se han obtenido resultados relevantes
y útiles mediante la comparación de los perfiles proteicos de expresión
diferencial de poblaciones de células B aberrante de pacientes con leucemia linfoide B, de subpoblaciones B neoplásicas muy minoritarias
(pequeños clones de significado incierto detectados en individuos aparentemente sanaos) y su contrapartida normal, como por ejemplo diferencias claras en la expresión de proteínas como AKT1, JAK-STAT, etc.
así como diferentes factores de transcripción incluyendo mutaciones
puntuales en p53 y Mdm2.
O-015
EXPRESIÓN DE HLA-G POR LAS CÉLULAS FOLICULARES DENDRÍTICAS HUMANAS. A. Prados Martín, E. Leno Durán, R. Muñoz
Fernandez, E. García Olivares. Universidad de Granada/CIBM, Armilla.
Objetivos. Las Células Foliculares Dendríticas (FDC, Folicular
Dendritic Cells) constituyen la fracción estromal de los centros germinales, los cuales se forman tras la activación de los linfocitos B en los
folículos linfoides. La función de las FDC consiste en capturar y retener antígenos nativos en su superficie, los cuales son presentados a las
células B para su selección positiva, durante la maduración de la afinidad. Además, durante la presentación del antígeno, las FDC les aportan señales de supervivencia y proliferación a estos linfocitos. El HLAG es una molécula perteneciente al MHC-I no clásica, implicada en
procesos de tolerancia inmunológica y capaz de formar dímeros a través de una cisteína en posición 42, característica inusual dentro del
MHC. Dichos dímeros presentan una elevada afinidad por el receptor
ILT-2, expresado en células B vírgenes y memoria, entre otras. El objetivo de este trabajo es determinar la expresión de HLA-G en líneas
de Células Foliculares Dendríticas humanas.
Material y Métodos. Se aislaron FDC humanas de amígdalas,
obtenidas de pacientes de entre 3 y 10 años con amigdalitis crónica, en
completa remisión antes de la intervención. Se realizo un análisis fenotípico y funcional mediante citometría de flujo de las líneas y la expresión de HLA-G fue determinada mediante Western-Blot.
Resultados. Nosotros aislamos líneas de FDC y las mantuvimos
en cultivo durante varios meses. Estas líneas expresaron CD10, CD21,
CD23, CD29, CD73, ICAM-1, BAFF, α-SM Actina y STRO-1, un fenotipo característico de FDC. Además, las líneas de FDC fueron capaces de rescatar de la apoptosis a linfocitos B de amígdalas, al ser co-
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INMUNOLOGÍA
cultivadas durante 72h. Finalmente, mostramos la expresión de dímeros de HLA-G1 mediante Western-Blot.
Conclusiones. En este trabajo, demostramos la expresión de dímeros de HLA-G en FDC. La expresión de esta molécula inhibidora brinda una nueva perspectiva sobre la función de las FDC, caracterizadas por transmitir señales activadoras. Los dímeros de HLA-G podrían impedir la proliferación de linfocitos B vírgenes o memoria, pues
estas células expresan el recetor ILT-2 hasta el momento de ser activadas vía BCR. Así, el HLA-G regularía el efecto que las citocinas producidas por las FDC pudieran tener sobre linfocitos no activados.
O-016
RELACIÓN ENTRE CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES Y
CÉLULAS FOLICULARES DENDRÍTICAS. R. Muñoz Fernández, A.
Prados Martín, E. Leno Durán, E. García Olivares. Universidad de Granada / CIBM, Armilla.
Objetivos. Las células deciduales estromales (decidual stromal cells,
DSC) se localizan en la decidua, tejido transitorio, que procede del endometrio gestante por efecto de la progesterona, y en íntimo contacto con
el trofoblasto (origen fetal). Estas células inhiben la apoptosis de linfocitos deciduales, ejerciendo un papel inmunorregulador en la interfase
materno-fetal. Las células foliculares dendríticas (follicular dendritic
cells, FDC) se encuentran en los folículos linfoides, donde captan y retienen antígenos nativos durante largos periodos de tiempo y cuya función principal es rescatar de la apoptosis a las células B foliculares. En
la diferenciación a FDC interviene el TNFα, mientras que las DSC se
diferencian por la progesterona. A pesar de que DSC y FDC son dos tipos
celulares aparentemente distintos, ambos han sido relacionados con las
células madre mesenquimales (mesenchymal stem cells, MSC). El objetivo de este trabajo es determinar la posible relación entre DSC y FDC
en cuanto a su fenotipo antigénico y funcionalidad.
Material y Métodos. Muestras: Las FDC se obtuvieron de amígdalas de pacientes con amigdalitis (3-10 años) y las DSC de decidua de
abortos inducidos del primer trimestre (6-11) de mujeres sanas (20-30
años). Las DSC y FDC fueron cultivadas en Opti-MEM y en su fase de
crecimiento se procedió al estudio del fenotipo antigénico y a la producción de la quimiocina CXCL-13, por citometría de flujo y E.L.I.S.A
respectivamente. Para el papel funcional, se realizaron co-cultivos de
DSC o FDC con células B y se determinó la apoptosis en células B cuantificando la fase sub-G1 por citometría de flujo. DSC fueron tratadas
con TNF y se estudio su efecto sobre el fenotipo antigénico de estas
células Por otra parte, las FDC fueron tratadas con progesterona y
AMPc, y se determinó la secreción de prolactina mediante E.L.I.S.A.
Resultados. DSC y FDC presentaron morfología fibroblástica in
vitro y fenotipo similar. Fueron positivas para CD10, CD29, CD54
(ICAM-1) y CD73, marcadores relacionados con MSC, y para CD21,
CD23, BAFF y secretaron CXCL-13 (quimiocina), marcadores propios de FDC. Funcionalmente, las DSC al igual que FDC, inhibieron la
apoptosis de células B, requiriendo contacto celular. El TNFα, aumentó la expresión ICAM-1 (CD54) tanto en DSC como en FDC. Cuando
las FDC fueron tratadas con progesterona y AMPc, se detectaron niveles de prolactina en el sobrenadante, aunque en niveles significativamente inferiores a los presentados por las DSC.
Conclusiones. Aunque las DSC y FDC son células aparentemente distintas y realmente distantes, y se encuentran en entornos funcionales muy diferentes, comparten unas características fenotípicas y funcionales semejantes.
O-017
EFECTO DE LA ADICIÓN DE CITOQUINAS SOBRE LA PROLIFERACIÓN Y SUPERVIVENCIA DE CÉLULAS PLASMÁTICAS
CIRCULANTES HUMANAS. B. Rodríguez-Bayona, A. Ramos-Amaya, J.A. Brieva. Hospital Universitario Puerta de, Cádiz.
Objetivos. Las células plasmáticas (CP) constituyen la fase final
de diferenciación del linfocito B, siendo las responsables de la respuesta inmune humoral. Las CP conforman un compartimento heterogéneo que engloba células con características fenotípicas y funcionales
distintivas dependiendo de su localización anatómica, mostrando un
gradiente de maduración en el sentido amígdala (A) - sangre periférica (SP) - médula ósea (MO). El objetivo del presente estudio consistió
en la identificación de los factores implicados en la transición de CP
circulantes a CP de larga vida.
Materiales y métodos. Se obtuvieron muestras de SP de voluntarios sanos 6 días después de inmunización convencional con toxoide
tetánico (tet). Esta vacunación induce una rápida respuesta frente a tet,
desencadenado la aparición de una oleada de CP circulantes que secretan IgG-tet, que es máxima a los 6 días de la inmunización. Sobre la
fracción mononuclear deplecionada de linfocitos T se analizaron la
incorporación de BrdU, la frecuencia de CP caspasa-3 activada positivas y la recuperación celular mediante citometría de flujo (CF), y la
producción de IgG-tet mediante ELISA en cultivos control y con la
mezcla de citoquinas.
Resultados. La adición de una mezcla de seis citocinas (SDF-1α,
IGF-I, IL-21, BAFF, VEGF121 y APRIL) provocaba un claro aumento de la producción de IgG-tet. Este efecto se debía a un incremento
de la proliferación inicial de las CP circulantes. Además se observó
una mayor recuperación celular y un aumento notable en la producción de Ac cuando se añadían estos factores, sin que se afectara la
tasa basal de apoptosis de las CP. Estos efectos potenciadores, sin
embargo, no se mantenían en el tiempo, como revelaban los estudios
cinéticos de recuperación celular y de acumulación de la IgG-tet secretada.
Conclusiones. La adición de la mezcla de factores descrita a cultivos de CP de SP da lugar a un aumento de su proliferación y, por tanto, del número de precursores que justifican la mayor recuperación
celular y producción de IgG-tet. No obstante, estos factores no producen mayor supervivencia de las CP.
O-018
UNA FASE DE PROLIFERACIÓN INICIAL Y SEÑALES MEDIADAS POR INTERLEUQUINA-6/STAT3 SON DOS REQUISITOS
PARA LA SUPERVIVENCIA DE LAS CÉLULAS PLASMÁTICAS
CIRCULANTES HUMANAS. A. Ramos-Amaya, B. Rodríguez-Bayona, J.A. Brieva. Hospital Universitario Pueta Del Mar, Ubrique.
Objetivos. El compartimento de células plasmáticas (CP) circulantes humanas contiene una fracción de células proliferantes no observado en CP de médula ósea (MO). Por otro lado, IL-6 es una citoquina implicada en los procesos de diferenciación y supervivencia de CP.
El objetivo de este estudio consistió en la caracterización de la cinética de formación, capacidad proliferativa, de desarrollar apoptosis, producción de Ac y respuesta a IL-6 de las CP circulantes.
Materiales y métodos. Se obtuvieron muestras de SP de voluntarios sanos 6 días después de inmunización convencional con toxoide tetánico (tet). Esta vacunación induce una rápida respuesta fren-
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O-020
te a tet, desencadenado la aparición de una oleada de CP circulantes
que secretan IgG-tet, que es máxima a los 6 días de la inmunización.
Sobre la fracción mononuclear deplecionada de linfocitos T se analizaron la incorporación de BrdU, la frecuencia de CP caspasa-3 activada positivas y la recuperación celular mediante citometría de flujo
(CF), y la producción de IgG-tet mediante ELISA en cultivos control
y en presencia de anti-IL6 y de hidroxiurea, como inhibidor de la proliferación.
Resultados. Los datos obtenidos en el trabajo indican que in vitro
existe una fase de proliferación temprana (primeras 24 horas de cultivo) de las CP circulantes tet-inducidas; esta fase parece importante en la biología de estas CP ya que, si es bloqueada, disminuye la
supervivencia de las células en cultivo, y disminuye aún en mayor
proporción la producción de IgG-tet por parte de las CP. También
se ha visto que existe una baja, pero continua, tasa de apoptosis en
los cultivos de CP circulantes lo que hace que la recuperación celular disminuya con el tiempo. La actividad apoptótica se ve fuertemente potenciada si se bloquea la IL-6 endógena con Ac anti-IL-6,
por lo que esta citoquina estaría implicada en procesos de supervivencia de las CP.
Conclusiones. Las CP circulantes inducidas tras una inmunización presentan una actividad proliferativa inicial y una baja pero continua tasa de apoptosis. La IL-6 es un factor de supervivencia para las
CP, ya que su bloqueo induce un aumento de apoptosis.
c-Myc, a member of the Myc family of transcription factors, is
involved in numerous biological functions including the regulation
of cell proliferation, differentiation and apoptosis in various cell
types. Of all its functions, the role of c-Myc in cell differentiation is
one of the least understood. We addressed the role of c-Myc in B
lymphocyte differentiation. We found that c-Myc is essential from
early stages of B lymphocyte differentiation in vivo, and regulates
this process by providing B cell identity via direct transcriptional
regulation of the ebf-1 gene. Our data show that c-Myc influences
early B lymphocyte differentiation by promoting activation of B cell
identity genes, thus linking this transcription factor to the EBF-1Pax-5 pathway.
O-019
O-021
CARACTERIZACION FENOTIPICA Y FUNCIONAL DE LA
POBLACION DE LINFOCITOS B CD19+CD45R–, SECRETORA DE
INMUNOGLOBULINAS IGG E IGA PRESENTE EN EL BAZO DE
RATONES ADULTOS. B. De Andres1, B. Palacios1, A.R. SánchezArchidona1, N. Serrano2, I. Cortegano1, C. Ruiz1, F. Martínez1, M. Alia1,
M.A. R. Marcos2, M.L. Gaspar1. 1Instituto De Salud Carlos III, Aranjuez. 2Centro De Biologia Molecular Severo Ochoa.
VIRAL LIGANDS, CONSERVED AMONG ORTHOPOXVIRUSES,
NATURALLY PRESENTED IN TAP-DEFICIENT VACCINIA
VIRUS-INFECTED CELLS. D. López1, E. Lorente1, S. Infantes1, E.
Barnea2, I. Beer2, R. García1, F. Lasala1, M. Jiménez1, C. Vilches3, A.
Admon2. 1Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III,
Majadahonda. 2Department of Biology, Technion-Israel Institute of Technology. 3Laboratorio de Inmunogenética-HLA, Hospital Universitario Puerta de Hierro, Madrid.
La población murina de linfocitos B, con fenotipo CD19+CD45R–
presente en bazo de individuos adultos, fue identificada por nosotros como secretora de forma espontánea de altos niveles de IgG e
IgA. Esta subpoblación se encuentra ya en edades tempranas de la
vida, y sus progenitores tienen un origen embrionario. En el estudio
actual caracterizamos de forma extensa su fenotipo por citometría
de flujo, identificándola como diferente de otras subpoblaciones de
células B presentes en el bazo, tales como: las transicionales (T, CD93+),
las células B foliculares (Fo, IgD+CD23+CD21+), las de zona marginal
(MZ, CD21++) y las células B1 peritoneales (B1, CD5+CD11b+). Además, mediante estudios de incorporación de BrdU in vivo y por transferencias adoptivas de la población purificada CD19+CD45R–, en animales inmunodeficientes RAG2.γchain–/–, hemos caracterizado su
recambio celular y sus tasas de supervivencia en condiciones homeostáticas. Hemos también analizado su participación en respuestas
T-dependientes y T independientes mediante activación in vivo e in
vitro con diversos estímulos. Finalmente, estamos caracterizando el
repertorio de las inmunoglobulinas que secretan estas células
CD19+CD45R–, mediante la amplificación por RT-PCR de las regiones VDJ de las inmunoglobulinas que se expresan y su secuenciación.
Finalmente, podemos concluir que la población CD19+CD45R–
representa un nuevo subset del tipo innato, adscrito dentro del sistema inmune adaptativo.
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B CELL COMMITMENT PROGRAM IS DRIVEN BY THE PROTOONCOGENE C-MYC. I. Moreno De Alborán, M. Vallespinós , D. Fernández, L. Rodríguez, J. Alvaro-Blanco, E. Baena, M. Ortiz, D. Dukovska, A. Rojas, M.R. Campanero. National Center for Biotechnology, Madrid.
SESIÓN 3: CÉLULAS T
Moderadores: Ana Clara Carrera (Madrid)
Enrique Aguado (Murcia)
The transporters associated with antigen processing (TAP) deliver
the products generated by the proteolytic activity of proteasomes in
the cytosol to the rough endoplasmic reticulum lumen. This classical
endogenous antigen processing pathway is the main source of
pathogen HLA ligands that are later specifically recognized by
cytotoxic T lymphocytes (CTL) on the surface of infected cells. Several
viral epitopes in individuals with non functional TAP complexes
and both TAP-deficient cell lines and mice models have been identified.
Except for Epstein-Barr virus, no systematic studies of pathogen
derived TAP-independent ligands have been reported. Using mass
spectrometry analysis of complex HLA-bound peptide pools isolated
from large amounts of TAP-deficient vaccinia virus-infected cells,
we identified six naturally processed either HLA-A*0201 or B*2705
class I molecules in the same infected cells. All sequences are conserved
in several vaccinia virus strains, variola virus and other orthopoxviruses.
In addition to two high-affinity ligands, one low-affinity peptide
restricted by each HLA class I molecule studied was identified. Both
high- and low-affinity ligands generate CTL long-term memory
response against vaccinia virus in an HLA-A*0201 transgenic mouse
model. These data have implications for the analysis of the CTL
response, for the vaccine development, and for the study of effectiveness
of early empirical vaccination with cowpoxvirus against smallpox
disease.
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INMUNOLOGÍA
O-022
ALTERACIONES EN LA DISTRIBUCIÓN DE LAS POBLACIONES
DE LINFOCITOS T Y EN SU PATRÓN DE SECRECIÓN DE CITOQUINAS SEGÚN LA EXPRESIÓN DE ZAP-70 EN PACIENTES CON
LLC-B. M.Á. Sánchez Luengo1, L. Ortega Moreno1, G. Parada Hermoza1, Z. Moreno Villegas1, D. Díaz Martín1, H. Barcenilla Rodríguez1, J.
Monserrat Sanz1, A. Prieto Martín1, E. Reyes Martín1, M. Álvarez De
Mon-Soto2. 1Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares. 2Hospital Universitario Príncipe de Asturias.
Introducción. Los nuevos criterios para definir el grado de activación de linfocitos T están basados en la expresión combinada de la
isoforma del antigeno CD45RA y del marcador CD27. En el caso de la
LLC-B se ha observado que existía un incremento de las células T
memoria y descenso de células novatas en pacientes categorizados en
morfología atípica o elevado número de linfocitos circulantes. ZAP-70
se muestra como un factor pronóstico de gran importancia para predecir la evolución de los pacientes con LLC-B.
Objetivos. Estudiar la distribución de los linfocitos T según su
grado de activación y el patrón de producción de citoquinas en pacientes con LLC-B según el valor pronóstico ZAP-70.
Materiales y métodos. Se utilizaron células mononucleares de
sangre periférica de 34 pacientes con LLC-B que se categorizaron por
citometría de flujo en dos grupos según la expresión de ZAP-70 (ZAP70+ y ZAP-70–) y de 18 controles sanos de edad y sexo pareado. Las
células fueron cultivadas durante 6 horas en presencia de PMA, ionomicina y nomensina. El estudio inmunofenotípico y de producción de
citoquinas se realizó por citometría de flujo de 8 colores utilizando anticuerpos frente a los antígenos de superficie CD3, CD8, CD27, CD28,
CD45RA, CD62L y anticuerpos para el marcaje intracelular de las citoquinas INFγ, TNFα, IL-2, IL-4 e IL-10.
Resultados. Los pacientes con LLC-B y de forma significativamente mayor en los ZAP-70+ que en los ZAP-70– presentaron una profunda redistribución del compartimento linfocitario T, tanto CD4+ como
CD8+, con incremento de los linfocitos T CD4+ efectores y T CD8+ memoria central así como descensos significativos de linfocitos T CD4+ y
CD8+ novatos. Por otra parte se observó diferencias en la producción
de citoquinas entre los diferentes grupos de pacientes con LLC-B según
la expresión de ZAP-70 además de mostrar diferencias significativas
con los controles sanos.
Conclusiones. Existe una profunda alteración en los pacientes con
LLC-B y en concreto en los ZAP-70+ en el compartimento de células
T tanto en su distribución como en su capacidad de producción y secrección de citoquinas que puede estar relacionado con el peor pronóstico
y evolución de estos pacientes.
O-023
AUMENTO DE LA ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS T Y CÉLULAS
REGULADORAS FOXP-3+ EN PACIENTES CON LLC-B ZAP-70+.
M.Á. Sánchez Luengo1, Z. Moreno Villegas1, G. Parada Hermoza1, L.
Ortega Moreno1, D. Díaz Martín1, H. Barcenilla Rodríguez1, J. Monserrat Sanz1, A. Prieto Martín1, E. Reyes Martín1, M. Álvarez De MonSoto2. 1Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares. 2Hospital Universitario Príncipe de Asturias.
Introducción. La patogenia de la LLC-B no sólo esta ocasionada
por las alteraciones existentes en los linfocitos B. Existen alteraciones
en otros compartimentos del sistema inmune incluidos los linfocitos
T, siendo estas alteraciones tanto a nivel de distribución poblacional
como también fenotípica y funcionalmente.
Objetivos. Estudiar la distribución de diferentes subpoblaciones
de linfocitos T y su estado de activación en pacientes con LLC-B según
la expresión de ZAP-70 por parte de las células B tumorales.
Materiales y métodos. Se realizó estudio inmunofenotípico por
citometría de flujo de 4 colores, para lo cual se obtuvieron PBMCs de
sangre periférica de 34 pacientes con LLC-B que se categorizaron en
ZAP-70+ (n=16) y ZAP-70– (n=18), y de 18 controles sanos. Para el estudio de las distribución y activación de las diferentes subpoblaciones
de linfocitos T se utilizaron anticuerpos frente a los antígenos de superficie CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD40L, CD62L, CD45RA, CD45RO,
CD95. También se estudio la distribución de células reguladoras
mediante el marcaje con anticuerpos frente a los antígenos CD4, CD25
y FOXP-3.
Resultados. Los pacientes con LLC-B ZAP-70+ mostraron incrementos significativos con respecto de los pacientes ZAP-70– y los
controles sanos del número absoluto de linfocitos T. Sin embargo si
bien los pacientes con LLC-B muestran incrementos importantes y
significativos tanto de linfocitos T CD4+ como CD8+ respecto de los
controles sanos, no hay diferencias significativas entre pacientes con
LLC-B según la expresión de ZAP-70. Los pacientes con LLC-B ZAP70+ además se caracterizan por un incremento significativo de los linfocitos T CD4+ y T CD8+ que expresan CD454RO, CD62L, CD95 y sin
embargo por una disminución significativa de los números absolutos y porcentajes de los linfocitos T CD4+ y T CD8+ que expresan CD28.
Por otra parte los pacientes ZAP-70+ mostraron un incremento significativo de células CD4+FOXP-3+ con respecto de los otros dos grupos estudiados.
Conclusión. Existe una importante alteración en la distribución
así como en la activación de los linfocitos T, tanto CD4+ como CD8+ en
los pacientes con LLC-B ZAP-70+, mostrando estos pacientes un mayor
grado de activación celular y una mayor proporción de células reguladoras FOXP-3+.
O-024
INCREMENTO DE LA APOPTOSIS DE LOS LINFOCITOS T EN
PACIENTES CON LLC-B ZAP-70+. M.Á. Sánchez Luengo1, G. Parada
Hermoza1, Z. Moreno Villegas1, L. Ortega Moreno1, D. Díaz Martín1, H.
Barcenilla Rodríguez1, J. Monserrat Sanz1, A. Prieto Martín1, E. Reyes
Martín1, M. Álvarez De Mon-Soto2. 1Universidad de Alcalá de Henares,
Alcalá de Henares. 2Hospital Universitario Príncipe de Asturias.
Introducción. La LLC-B se caracteriza por una acumulación lenta y progresiva de células B debido a un aumento anormal de su resistencia a la apoptosis. Sin embargo la apoptosis ha sido un fenómeno
poco estudiado en las células T en aquellos pacientes con LLC-B no
tratados, si bien hay algunos estudios atendiendo a la expresión de
moléculas relacionadas con los procesos de apoptosis.
Objetivos. Estudiar el grado de apoptosis de diferentes subpoblaciones de linfocitos T en pacientes con LLC-B según la expresión de
ZAP-70 y en comparación con controles sanos.
Materiales y métodos. Se obtuvieron células mononucleares de
sangre periférica por separación por gradiente de densidad con Ficoll
de sangre periférica de 34 pacientes con LLC-B que se categorizaron en ZAP-70+ (n=16) y ZAP-70– (n=18), y de 18 controles sanos de
edad y sexo pareados. El estudio de la apoptosis se realizó mediante el marcaje con Anexina-V en FITC y uso de citometría de flujo de
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8 colores. Los marcadores escogidos para la determinación de las
diferentes poblaciones celulares fueron: CD3, CD4, CD8, CD27,
CD28, CD62L y CD45RA. Se calculó el AI (Apoptotic index o porcentaje de células apoptoticas) a tiempo basal y tras cultivo de 24
horas.
Resultados. Observamos como el AI tanto en los linfocitos T CD4+
como CD8+ a tiempo basal son significativamente más bajos en los
pacientes con LLC-B ZAP-70+ respecto a los pacientes ZAP-70– y los
controles sanos, sin embargo tras 24 horas de cultivo la situación se
revierte siendo en los pacientes ZAP-70+ donde estás células presentan porcentajes significativamente superiores respecto a las células de
los otros dos grupos estudiados llegando a alcanzar valores superiores al 50%. Por otra parte existe en los pacientes con LLC-B ZAP-70+
una correlación significativa entre la coexpresión de CD45RO y CD95
y el porcentaje de apoptosis que presentan los linfocitos T CD4+ (r =
0,72 p < 0.01) y CD8+ (r = 0,80 p < 0.01) tras cultivo de 24 h.
Conclusiones. En los pacientes con LLC-B ZAP-70+ los linfocitos T muestran una alteración en su apoptosis que puede estar relacionada con el defecto de este compartimento en el control de la enfermedad.
O-025
CARACTERIZACIÓN ESPACIO-TEMPORAL DE LA SEÑALIZACIÓN POR NOTCH1 IN VIVO EN EL TIMO HUMANO. M.J. García Leon1, G. Del Monte Nieto2, J.L. de la Pompa2, M.L. Toribio García3.
1Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Madrid. 2Centro Nacional de
Investigaciones Cardiovasculares. 3Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa
El desarrollo T es un proceso mediado por gran variedad de tipos
celulares dispuestos en diferentes localizaciones en el timo. Estas células forman una organizada red estromal que proporciona una combinación precisa de interacciones celulares, citoquinas y quimioquinas que inducen la migración, proliferación y diferenciación de los
progenitores hematopoyéticos intratímicos (HPCs). El entendimiento y la caracterización de estas señales complejas es imprescindible
para aportar claves de cómo se regulan los procesos asociados al desarrollo de los distintos linajes intratímicos. Los diferentes ligandos
del receptor Notch1 expresados en el timo son esenciales para la proliferación y diferenciación de los HPCs, lo que sugiere la participación selectiva de diferentes ligandos en eventos concretos de la timopoyesis. Para validar esta hipótesis, hemos analizado, mediante inmunohistoquímica y microscopía confocal, la identificación in vivo en el
timo humano de los nichos intratímicos definidos por la activación
del receptor Notch1 y por la expresión de sus ligandos. Hemos mostrado la primera evidencia in vivo de que Notch1 se activa específicamente en HPCs CD34hi/+, en timocitos subcapsulares y, lo que es
más novedoso, en células epiteliales medulares (mTECs) y corticales
(cTECs) subcapsulares, sugiriendo la implicación de Notch1 en la
diferenciación y homeostasis de las células epiteliales tímicas. Asimismo, mostramos la existencia de microambientes especializados
en la presentación de ligandos específicos de Notch1. Además, observamos niveles variables de los ligandos de Notch en distintas regiones histológicas y tipos celulares, lo que sugiere un nivel de regulación funcional dependiente de la intensidad de la señal ligando-específica. En concreto, el ligando Delta-like-4, imprescindible para el desarrollo T, muestra una amplia y heterogénea distribución, con elevados niveles en endotelio y células mieloides y niveles más bajos en
timocitos y cTECs. Además, la expresión de los ligandos parece regu-
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larse con la edad, lo que podría contribuir a la degeneración funcional del timo asociada a la edad. Por tanto, la señalización por
Notch1 en el timo humano comprende una compleja regulación de
interacciones ligando-específicas entre timocitos y células estromales restringidas en el espacio y en el tiempo, con posibles implicaciones funcionales en la generación de linfocitos T y células no-T intratímicas.
O-026
ANÁLISIS DE LA FUNCIÓN DE DIVERSOS MOTIVOS NO BASADOS EN TIROSINA DEL ADAPTADOR LAT. A. García-Blesa1, M.
Martínez-Florensa2, J. Yélamos3, F. García-Cózar1, P. Aparicio4, A. Alonso5, E. Aguado5. 1Universidad de Cádiz, Puerto Real. 2Hospital Clinic, Barcelona. 3IMIM-Hospital del Mar, Barcelona. 4Universidad de Murcia, Murcia.
5Hospital Carlos Haya - Universidad de Málaga, Málaga.
La proteína adaptadora LAT (“Linker for Activation of T cells”)
tiene una función prominente en la transducción de señales intracelulares generadas a partir del complejo TCR/CD3. Tras la estimulación de linfocitos T a través de su TCR se produce la fosforilación de
varios residuos de tirosina del adaptador LAT. Esto permite el reclutamiento hasta la membrana plasmática de varias proteínas citosólicas, implicadas en etapas más tardías de la transducción de señales
intracelulares que conducen a la activación de las células T. Sin embargo, se sabe muy poco acerca del papel de otras secuencias consenso
no basadas en tirosina presentes en el adaptador LAT. En este trabajo presentamos evidencia de la función de varios motivos consenso basados en serinas presentes en la secuencia de aminoácidos de
LAT. Estos motivos son esenciales para la correcta transducción de
señales de activación dependientes del complejo TCR/CD3, ya que
su mutación impide en células Jurkat la correcta generación de flujos de calcio, la activación de la ruta de las MAP-kinasas y la producción de IL-2. Además, estos motivos basados en serina parecen tener
un papel de protección frente a la apoptosis, ya que las células Jurkat que expresan una forma mutante de LAT para esos motivos son
más propensas a la muerte celular inducida tras estimulación del
complejo TCR/CD3. La función de estos motivos no se reduce a señales intracelulares tardías, sino que parece afectar a eventos tempranos como la activación de la kinasa ZAP-70. En consecuencia, nuestro trabajo demuestra que secuencias consenso del adaptador LAT,
no basadas en tirosina, son esenciales para el desempeño de sus funciones.
O-027
EFECTO DIFERENCIAL DE CEPAS PROBIÓTICAS DE BIFIDOBACTERIUM EN LA POLARIZACIÓN DE CÉLULAS T CD4+. P.
López Suárez1, M. Gueimonde Fernández2, I. González Rodríguez2, A.
Margolles Barros2, A. Suárez Díaz3. 1Universidad de Oviedo/Instituto de
Productos Lácteos de Asturias – Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IPLA-CSIC), Oviedo. 2Instituto de Productos Lácteos de Asturias – Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IPLA-CSIC). 3Universidad de
Oviedo.
Objetivo. Estudiar el efecto de distintas cepas de Bifidobacterium
sobre la maduración de células dendríticas derivadas de monocitos
(Mo-DCs) y su papel en la polarización de linfocitos CD4+ hacia células efectoras o reguladoras.
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INMUNOLOGÍA
Material y métodos. El efecto de las bifidobacterias sobre los niveles de citocinas en cultivos de Mo-DCs, células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y co-cultivos de Mo-DCs con linfocitos T vírgenes se cuantificó mediante ensayos citométricos multianálisis. La
expresión de marcadores de maduración en Mo-DCs (HLADR/CD80/CD86/CD1a) y de células Treg (CD25/Foxp3/CD127) se
estudió mediante citometría de flujo.
Resultados. Todas las cepas de bifidobacterias estudiadas (n=20)
indujeron la maduración de Mo-DCs, pero mostraron importantes
diferencias en la producción de citocinas (IL-12p70, IL-10, TNFα, IL6, IL-8 e IL-1b). Así, B. bifidum LMG13195 y DSM20239 presentaron
una relación IL-1‚/IL-12 elevada y niveles bajos de TNFα/IL-10 e IL10/IL-12, lo que sugería su capacidad para inducir células Th17, mientras que B. breve BM12/11 y BM13/14 presentaron una relación
TNFα/IL-10 alta e IL-10/IL-12 baja, indicativo de perfil Th1. De acuerdo con estos resultados, el cultivo de PBMCs con las mismas cepas
mostró diferencias importantes en la capacidad de inducir citocinas.
En particular, B. bifidum IF10/10, A8, DSM20239 y LMG13195 indujeron los mayores niveles de IL-17, así como una baja producción
de IFNγ y TNFα, lo que sugería un perfil Th17. Por el contrario, B.
animalis Bb12, B. breve BM12/11 y B. bifidum KCTC5082 mostraron
mayor inducción de TNFα e IFNγ, indicativa de una polarización
Th1. Estos resultados se confirmaron analizando la producción de
citocinas por linfocitos CD4+CD45RA+ co-cultivados con Mo-DCs
madurados con 5 cepas seleccionadas de bifidobacterias. Sin embargo, el análisis de la población de células Treg inducidas tras los cocultivos, mostró que las cepas de B. bifidum que habían inducido
menor producción de TNFα e IFNγ, y mayor de IL-17, generaban un
elevado porcentaje de células CD25high/CD127low/Foxp3+, sugiriendo una respuesta reguladora.
Conclusiones. Bifidobacterium sp. es capaz de madurar Mo-DCs,
induciendo un perfil de citocinas específico de cepa que conduciría a
la polarización de linfocitos T hacia células efectoras o reguladoras,
potencialmente útiles en la selección de cepas probióticas con aplicación clínica o biotecnológica.
O-028
PAPEL DE LAS SUBUNIDADES CATALÍTICAS DE PI-3 CINASA
P11ALFA Y P110DELTA EN LA COESTIMULACIÓN POR ICOS
(INDUCIBLE COSTIMULATOR, CD278). Y.Y. Acosta1, M.P. Zafra1,
G. Ojeda2, P. Portolés2, J.M. Rojo1. 1Centro de Investigaciones Biológicas,
CSIC, Madrid. 2Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos
III, Majadahonda.
Objetivo. ICOS por linfocitos T activados. El motivo Y191MFM
de su región citoplasmica une subunidades reguladoras de PI3-cinasa
de clase IA (p85α, p50-55α, p85β). Aunque las células T expresan p110α
y p110δ, y se sabe que p110δ es importante en la activación de linfocitos T por TCR/CD3, ICOS coprecipita preferentemente la subunidad
catalítica p110α. Aquí se analiza en distintas células la asociación de
p110α a ICOS, y el papel de p110α y p110δ en la activación por
TCR/CD3, en la coestimulación por ICOS, y en señales exclusivas de
ICOS.
Material y métodos. Se ha analizado la co-precipitación de p110α
y p110δ con subunidades reguladoras de PI3-cinasa de clase IA en distintos tipos de linfocitos T CD4+, incluyendo linfocitos de bazo de ratón.
Además se ha estudiado mediante siRNA e inhibidores selectivos el
papel de p110α y p110δ en la coestimulación por ICOS de la activación
por TCR/CD3 y en los cambios morfológicos y en el citoesqueleto de
actina inducido por ICOS.
Resultados. La asociación selectiva de p110α a ICOS se debe a la
co-precipitación preferente de esta subunidad catalítica con las subunidades reguladoras en líneas de células T CD4+ o en linfocitos T CD4+
de bazo. El silenciamiento tanto de p110α como de p110δ inhibe parcialmente la activación (fosforilación) temprana de Akt/PKB inducida por anti-CD3, particularmente cuando se coestimula con anti-ICOS.
Curiosamente, el silenciamiento de p110α aumentó, y el de p110δ inhibió la activación de Erk. Los inhibidores de p110α o de p110δ bloquearon la activación por TCR, con o sin ICOS, de la fosforilación de Akt y
Erk o la secreción de IL-4. En cambio, sólo los inhibidores de p110α
inhibieron los cambios morfológicos (alargamiento) inducido por ligandos de ICOS en linfocitos T.
Conclusiones. Estos resultados confirman datos previos sobre el
papel de p110δ en la activación de linfocitos T, pero también muestran
que p110α es esencial para la activación óptima de linfocitos T. Además, la abundancia y actividad de las subunidades catalíticas de PI3cinasa regulan de modo diferente distintas vías de la señalización por
ICOSe s una molécula coestimuladora de la familia de CD28 expresada típicamente.
O-029
T REGULADORAS NATURALES COESTIMULADAS A TRAVÉS
DEL REGULADOR DE COMPLEMENTO CRRY/P65 MANTIENEN
SUS PROPIEDADES IN VITRO Y ATENUAN LA ARTRITIS INDUCIDA POR PROTEOGLICANO. P. Portolés1, G. Ojeda1, E. Pini1, C.
Eguiluz1, M. Montes-Casado1, F. Broere2, W. Van Eden2, J.M. Rojo3.
1Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda. 2Utrecht University, Utrecht, Netherlands. 3Centro de Investigaciones
Biológicas, CSIC, Madrid.
Las células T reguladoras (Treg) CD4+CD25+ contribuyen de forma importante a la tolerancia y a la homeostasis inmune; sin embargo, su potencial terapéutico está dificultado por sus propias características. Las señales emitidas por el regulador de complemento murino Crry/p65, homólogo funcional de CD46 humano, aumentan la proliferación de células CD4+ in vitro.
Objetivos. En este estudio, hemos investigado el efecto del coestímulo mediado por Crry/p65 sobre la expansión y función de células Treg naturales, y su capacidad para mejorar la artritis inducida por
proteoglicano (PGIA) en ratones Balb/c, un modelo de enfermedad
inflamatoria en el que el papel de las Treg naturales no está bien establecido.
Métodos. Treg naturales obtenidas de ratones Balb/c fueron activadas in vitro y coestimuladas a través de Crry/p65. Las células expandidas fueron caracterizadas por citometría de flujo y se ensayó su efecto supresor sobre la proliferación in vitro de células T. Se estudió el efecto terapéutico potencial de esta población comparada con la población
Treg natural en el modelo de PGIA en ratones Balb/c. Hemos analizado el grado de enfermedad, la histología y el isotipo de anticuerpos
Ag-específicos, la respuesta in vitro de células T y la presencia de Treg
en las extremidades de los animales.
Resultados. El coestímulo de Crry facilitó la expansión in vitro
de Treg naturales manteniendo su fenotipo y propiedades supresoras. Las células Treg naturales CD4+CD25+ coestimuladas in vitro
a través de Crry mantuvieron sus propiedades supresoras in vivo,
produciendo un efecto de mejoría de la inflamación en el modelo
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de PGIA que es mas duradero que el efecto de Treg naturales. La
transferencia de Treg expandidas a través de coestímulo de Crry
suprimió las respuestas T y B-dependientes en animales en los que
se había inducido artritis por proteoglicano, cambiando el patrón
de isotipo patogénico y disminuyendo la secreción Ag-dependiente de IFN-γ, IL-12, IL-17 y otras citoquinas implicadas en inflamación.
Se detectó un incremento de células Foxp3+ en las extremidades de animales tratados con Treg coestimuladas a través de Crry.
Conclusión. El coestímulo mediado por Crry facilita la expansión
in vitro de células Treg naturales purificadas, mientras mantiene sus
propiedades supresoras in vitro e in vivo en el modelo de artritis inducida por proteoglicano. Estos resultados resaltan el potencial de la molécula reguladora de complemento Crry/p65 para coestimular y expandir Treg naturales con la capacidad de suprimir enfermedad en condiciones de inflamación artrítica crónica.
O-030
ESTUDIO DE ALTERACIONES FUNCIONALES EN LAS CELULAS INKT ASOCIADO AL ENVEJECIMIENTO. M.D.C. Campos1,
I. Gayoso1, E. Peralbo1, A. Pera1, N. Rojas-Colonelli1, R. Tarazona2, R.
Solana1. 1Hospital Universitario Reina Sofia de Córdoba, Córdoba. 2Universidad de Extremadura.
La respuesta inmune se encuentra afectada con la edad, proceso
denominado inmunosenescencia. Existen estudios prévios que incluyen a las células “invariantes NKT” (iNKT) dentro de las poblaciones afectadas por la inmunosenescencia. Las células iNKT en humanos se caracterizan por la expresión del receptor NK CD161 y de un
receptor T (TCR) formado por una cadena Vα24JαQ y una cadena
Vβ11 que reconoce antígenos glucolopídicos presentados por un
MHC-I no clásico denominado CD1d. Existen 3 subpoblaciones de
células NKTi en función de la expresión de los receptores CD4 y CD8:
NKT-CD8+, iNKT-CD4+ e iNKT-Dobles Negativas. Tras la activación
las células iNKT proliferan liberando citoquinas tipo Th1 y Th2. Las
células iNKT actúan durante la respuesta innata del sistema inmune
y está implicadas en la eliminación de tumores y en enfermedades
autoinmunes.
Nuestro trabajo pretende estudiar ex vivo el fenotipo y función,
secreción de citoquinas y proliferación, de células iNKT procedentes
de donantes jóvenes y ancianos sanos.
Para ello se obtuvieron las PBMCs de donantes jóvenes (18-35
años) y ancianos (70-95 años) sanos. La identificación de las iNKT se
analizó mediante citometría de fujo. Se utilizaron AcMo anti-Vα24,
anti-Vβ11, CD8, CD4, y otros marcadores para identificar las células NKTi. Para analizar la secreción de citoquinas las PBMCs se incubaron con PMA, Ionomicina y Brefeldina durante 6 horas La capacidad proliferativa se determinó mediante el marcaje con CFSE, sembradas en medio de cultivo durante 5 días con IL-2 y KRN (estímulo específico de NKTi in vitro semejante al α-Galactosil Ceramida que
está identificado como un potente inductor de la activación de las
células iNKT vía TCR).
Cuando analizamos la secreción de citoquinas tras la estimulación
con KRN vemos una disminución de la secreción de IFN-γ en células
NKTi de ancianos. Este descenso es significativo en las subpoblaciones NKTi-CD8 y NKTi-CD4.
En cuanto al estudio de proliferación con CFSE, transcurridos 5
días de cultivo in vitro, observamos una mayor proliferación de las
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células iNKT de donantes jóvenes que en ancianos. Con respecto a las
diferentes subpoblaciones de iNKT, vimos como las células CD4-NKT
son las que principalmente proliferan en jóvenes y las únicas que proliferan en ancianos.
El descenso de la capacidad proliferativa de las células iNKT de
ancianos y el descenso de producción de IFN-γ indican que las células
iNKT se encuentran entre las poblaciones linfocitarias afectadas por la
inmunosenescencia. Y además dichos cambios podrían alterar la función y respuesta de las células NKTi en ancianos.
O-031
EL IFNα FOMENTA EL DESARROLLO DE CÉLULAS T CD8
MEMORIAS ALTAMENTE RESPONDEDORAS. S. Hervás-Stubbs,
M.D.C. Ochoa, J. Dubrot, A. Palazón, I. Martínez-Forero, U. Mancheño, I. Gabari, I. González, J.I. Riezu-Boj, E. Larrea, I. Melero. Centro de
Investigación Médica Aplicada (CIMA), Pamplona.
Objetivos. Estudios previos realizados en el modelo del ratón
han demostrado que las citoquinas pro-inflamatorias, tales como
la IL-12 y el IFN-α/β, actúan directamente sobre los linfocitos T
CD8 que han reconocido específicamente a sus antígenos, afectando aspectos cruciales de su diferenciación hacia células efectoras
y/o memorias. Recientemente hemos mostrado que el IFN-α proporciona también señales directas a linfocitos T CD8 humanos naïve favoreciendo su diferenciación a células efectoras. Nuestro
siguiente objetivo fue investigar sin el IFN-αpodría estar implicado en la diferenciación de los linfocitos T CD8 humanos a células
memorias.
Material y métodos. Se aislaron mediante autoMACS (selección
negativa) linfocitos T CD8 humanos totales a partir de PBLs y, tras tinción con anticuerpos frente a CD27 y CD45RA, se separaron linfocitos
T CD8 naïves (CD27+CD45RA+) mediante FACS. Los linfocitos purificados fueron teñidos con CFSE y estimulados con bolitas de látex que
llevaban unidos anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, en presencia o
ausencia de IFN-α. Tras 6 días de estimulación, las células que habían proliferado (CFSElow) se aislaron mediante FACS y se mantuvieron
en cultivo (20 días) en presencia de IL-15. Tras este periodo, los linfocitos fueron estimulados por segunda vez con antígeno (mimetizado
por las bolitas anti-CD3/CD28)
Resultados. Los linfocitos T CD8 humanos naïve estimulados
en presencia del IFN-α adquieren muchos de los marcadores fenotípicos típicos de los linfocitos T centrales memorias
(CD45RAlowCXCR3hi CD62LhiCCR7hiIL-7RαhiCD27hiCD28hi). El IFNα regula positivamente la expresión de IL-15Rα, Eomesodermin y
T-bet. Como consecuencia del incremento de la expresión de IL15Rα, y de IL-7Rα, los linfocitos estimulados en presencia de IFNα muestran una mayor capacidad proliferativa cuando se estimulan con IL-15 o IL-7. Tras la segunda exposición con el antígeno, los
linfocitos T CD8 inicialmente estimulados en presencia de IFN-α
proliferan más y muestran una mayor capacidad efectora (alta producción de IFN-γ, Granzima B y TRAIL) tras una segunda estimulación antigénica que aquellos linfocitos que habían sido estimulados en ausencia de IFN-α.
Conclusiones. Nuestros resultados solidamente sugieren que las
señales derivadas del reconocimiento del IFN-α durante el primer
encuentro de los linfocitos T CD8 humanos con el antígeno son críticas para el desarrollo y la calidad de la respuesta T CD8 memoria subsiguiente.
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INMUNOLOGÍA
SESIÓN 4: CÉLULAS NK
Moderadores: Raquel Tarazona (Cáceres)
Rafael Solana (Córdoba)
O-032
CÉLULAS NK DE TIMO HUMANO: ¿UNA SUBPOBLACIÓN DE
CÉLULAS NK DIFERENTES? L. Hidalgo1, A. Entrena1, V.G. Martínez1, J. Valencia1, M.N. Vázquez1, A. Zapata2, R. Sacedón1, C. Hernández-López1, A. Varas1, Á. Vicente1. 1Facultad De Medicina Universidad
Complutense, Madrid. 2Facultad De Biología Universidad Complutense,
Madrid.
Objetivos. Las células NK son las principales células efectoras de
la inmunidad innata y desempeñan un papel fundamental en las respuestas antivirales y antitumorales. Si bien tanto en humanos como en
ratón, se asume que la médula ósea es el principal sitio de maduración
de las células NK, diferentes órganos como timo, ganglio linfático,
intestino,o útero soportan su diferenciación, indicando que la producción de las células NK humanas tiene lugar en múltiples localizaciones anatómicas. En relación con el timo humano, son muy escasos
los datos existentes en la literatura. En el presente estudio se ahonda
en las características fenotípicas y funcionales de las células NK de
timo humano en comparación con las subpoblaciones de células NK
CD56LowCD16+ y CD56BrightCD16– de sangre periférica.
Material y Métodos. Los análisis fueron realizados en muestras
de timo humano, procedentes de niños sometidos a cirugía cardiaca
correctora, y en muestras de sangre periférica de donantes sanos. Las
células NK aisladas mediante separación electrónica por sorting o aislamiento inmunomagnético, fueron utilizadas para la determinación
del repertorio de receptores, perfiles génicos, capacidad citolítica y perfiles de producción de citocinas utilizando para ello técnicas de citometría de flujo, PCR cuantitativa, técnicas de citotoxicidad y ELISA.
Resultados. Las células NK tímicas activadas con IL-12 e IL-15
exhibieron una escasa capacidad citotóxica similar a la exhibida por
las células CD56Bright periféricas siendo a su vez, en ambos casos inferiores a los resultados obtenidos para la subpoblación CD56Low. En
correlación, el perfil de expresión de distintos marcadores de activación de las células NK fue similar a la de la subpoblación CD56Bright de
sangre periférica. Por el contrario, en el caso de la producción de IFNγ,
el comportamiento de las células NK de timo se asemejaba a aquél que
exhibían las células CD56Low de sangre. En correlación los niveles de
tránscritos para T-BET, fueron 3 veces inferiores a los de las células
CD56Bright de sangre.
Conclusión. A tenor de los resultados obtenidos, las células NK
de timo humano presentan características diferenciales respecto a las
dos subpoblaciones de células NK descritas en periferia, pudiendo
representar, una población con características funcionales distintas.
O-033
REGULACIÓN DE LA MIGRACIÓN DE CÉLULAS NK POR LA
ACTIVACIÓN DE NKG2D. E. Serrano Pertierra, E. Cernuda Morollón, C. López Larrea. Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo.
Objetivos. NKG2D es un receptor transmembrana expresado fundamentalmente en células Natural Killer (NK) y T CD8+. La liberación
de sus ligandos solubles resulta en un descenso en la expresión de
NKG2D, uno de los mecanismos propuestos de evasión de la respues-
ta inmune por células tumorales, aunque la existencia de mecanismos
alternativos no ha sido explorada. En el presente estudio analizamos
la regulación de la migración de las células NK por activación de
NKG2D, y exploramos el papel de las Rho-GTPasas en este efecto.
Métodos. Células NKL se preincubaron con anticuerpos antiNKG2D o ligandos o IgG como control. Los ensayos de migración fueron realizados en transwell recubiertos con ICAM-1 o fibronectina, en
presencia o ausencia de CXCL12 como quimioatrayente. La actividad de miembros de la familia de proteínas de las Rho-GTPasas como
Rac1, RhoA y Cdc42 fue analizada mediante ensayos de pull down y
posterior western blot. La implicación de la activación de Rac fue analizada mediante la inhibición farmacológica de la proteína.
Resultados. La activación de NKG2D inhibe la migración de las
células NK tanto en los ensayos de migración randomizada como de
quimiotaxis. Rac1 y Cdc42 se activan downstream NKG2D, mientras
que RhoA se inhibe. La estatmina, una proteína implicada en la regulación de la dinámica de microtúbulos, y MLC (Myosin Light Chain)
se fosforilan tras la activación de NKG2D. Se observa también una disminución en la fosforilación de ERM (Ezrin-Radixin-Moesin). Se ha
descrito que estas proteínas están implicadas en la regulación de la
polarización de linfocitos. La inhibición de la activación de Rac disminuye la fosforilación de estatmina pero no es capaz de rescatar la migración celular en las diferentes dosis estudiadas, aunque se observa un
incremento en la migración basal.
Conclusiones. La activación de NKG2D por anticuerpos específicos o ligandos inhibe la migración de las células NK. El entrecruzamiento con anti-NKG2D regula la actividad de miembros de las RhoGTPasas e inicia cascadas de señalización que pueden estar implicadas no sólo en la formación de la sinapsis inmunológica sino también en la migración y polarización celular.
O-034
MÚLTIPLES INTERACCIONES LIGANDO-RECEPTOR CONTROLAN EL RECONOCIMIENTO Y ELIMINACIÓN DE CÉLULAS DE
MELANOMA. S. Morgado1, J.G. Casado1, B. Sánchez-Correa1, I. Gayoso2, R. Solana2, G. Pawelec3. 1Facultad de Veterinaria. Universidad de Extremadura, Cáceres. 2Facultad de Medicina Universidad de Córdoba(3) Center for
Medical Research, University of Tübingen.
Objetivos. Las células Natural Killer (NK) son un componente del
sistema inmune innato que contribuyen a la respuesta inmune frente
a tumores, puesto que son capaces de matar células tumorales sin una
inmunización previa. El papel de las células NK en el reconocimiento y eliminación de células de melanoma es un importante punto de
estudio en la actualidad, dado que el melanoma es considerado la forma más letal de cáncer de piel. Por tanto, el conocimiento de las interacciones entre los ligandos presentes en células tumorales y los receptores activadores de las células NK, como NKG2D, NCRs y DNAM-1,
es esencial para introducir en la práctica clínica protocolos de inmunoterapia basados en células NK.
Material y métodos. Hemos analizado mediante citometría de
flujo, la expresión superficial de ligandos para los receptores activadores de las células NK en un amplio panel de líneas celulares (n=124)
procedentes de "European Searchable Tumour Cell Line and Data Bank"
(ESTDAB, http://www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/). Con objeto de analizar la activación de las células NK se realizaron ensayos de desgranulación, analizando la expresión de CD107a/b en la superficie de las
células NK después de la activación frente a células de melanoma. Los
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experimentos de bloqueo se realizaron incubando las células con anticuerpos monoclonales contra MICA/B o NKG2D. Por último, la detección de MICA soluble en el sobrenadante de cultivo de las líneas celulares de melanoma se realizó utilizando el kit DuoSet ELISA Development kit (R&D Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Resultados. El análisis de los ligandos para NKG2D en nuestro
panel de líneas celulares de melanoma muestra que más del 80% de
las líneas expresa MICA/B, y en menor porcentaje, ULBPs. Hemos
estudiado la contribución de NKG2D a la lisis de las células de melanoma utilizando la línea celular humana de NK, NKL, y células NK
policlonales. La lisis mediada por células NK de la mayoría de las líneas de melanoma fue dependiente de NKG2D, aunque la lisis de algunas de las líneas de melanoma, sin expresión o con baja expresión de
ligandos para NKG2D, fue independiente de NKG2D.
El uso de proteínas quiméricas de los receptores NCR para analizar la expresión de los ligandos para NCR en células de melanoma
mostró que las células de melanoma expresan bajos niveles de estos
ligandos, principalmente para el receptor NKp44, mientras que el análisis de los ligandos para otros receptores activadores y coestimuladores puso de manifiesto que el 95% expresa ligandos para DNAM-1,
la mayoría CD155, mientras que la expresión de CD112 fue menos frecuente. Esto concuerda con recientes hallazgos en el papel de los NCR
y DNAM-1 en el reconocimiento de las células de melanoma por parte de las NK.
Nuestros resultados utilizando la línea de melanoma ESTDAB067, negativa para ligandos de NKG2D, muestra que la línea de células NK, NKL se activa principalmente a través de NCR y DNAM1, manteniendo que NCRs y NKG2D son los principales receptores
que contribuyen a la lisis de melanoma mediada por NK. También
encontramos que en ausencia de señales inhibidoras de MHC clase
I, varios melanomas DNAM-1L+/NKG2DL+ son resistentes a la lisis
mediada por células NK sugiriendo la existencia de mecanismos de
inmunoescape como la liberación de ligandos para los receptores
activadores, lo que contribuiría a la activación deficiente de las células NK.
Conclusiones. La expresión de ligandos para los receptores activadores de células NK es variable en diferentes líneas de melanoma y la activación simultánea de varios receptores activadores contribuye a la lisis eficiente de las células de melanoma. Además, la
conexión entre DNAM-1 y NKG2D podría contribuir a la activación de las células T. Por tanto, la caracterización fenotípica de las
células de melanoma y el desarrollo de estrategias de inmunoterapia
para incrementar la expresión de ligandos para receptores activadores de NK contribuiría a la creación de terapias más efectivas para
pacientes individuales.
O-035
REGULACIÓN EPIGENÉTICA DEL RECEPTOR ACTIVADOR DE
NKS, NKG2D/DAP10. A. Fernández-Sánchez, B. Suárez-Álvarez, C.
López-Larrea. Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo.
Objetivos. NKG2D es un receptor activador expresado en células
NK, linfocitos T CD8αβ y γδ en humanos pero no en linfocitos T CD4.
Sin embargo, una población de linfocitos T CD4 NKG2D+ aparece en
determinadas situaciones patológicas tales como infecciones, enfermedades autoinmunes y en cáncer. La señalización intracelular mediada
por NKG2D así como su expresión en la membrana celular requiere
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exclusivamente de la molécula adaptadora DAP10 en humanos. La
caracterización de los factores que regulan la expresión de NKG2D
/DAP10 podría tener un gran interés por sus importantes aplicaciones terapéuticas. En este trabajo se han estudiado las modificaciones
epigenéticas de los promotores de NKG2D y DAP10 en líneas celulares (Jurkat, HUT78 y NKL) y en linfocitos de sangre periférica (CD4,
CD8 y NK).
Material y métodos. La metilación en los promotores de NKG2D
y DAP10 se ha estudiado mediante técnicas de modificación de ADN
genómico con bisulfito mientras que modificaciones de histonas activadoras (AcH4, AcH3, AcH3K9 y H3K4 3me) e inhibidoras (H3K27
3 me, H3K9 2me/3me) se han determinado mediante ensayos de
inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP). Se han analizado las
variaciones en los niveles de expresión de NKG2D / DAP10 mediante tratamiento con inhibidores de histonas deacetilasas (sirtinol, SB,
VPA y TSA) y con inhibidores de DNA metiltransferasas (5azaC y
DAC).
Resultados. Se han visto diferencias en el nivel de metilación de
la región proximal del promotor de NKG2D entre las posiciones -400
y -100, encontrándose metilado en linfocitos T CD4 pero no en CD8 y
células NK. Adicionalmente, hemos determinado que modificaciones
en las histonas H3 y H4 participan en la regulación de estos genes. Las
modificaciones asociadas a eucromatina transcripcionalmente activa
como son la AcH3K9 y la H3K4 3me parecen tener un papel destacado en la regulación de NKG2D puesto que tienen una presencia notable en linfocitos T CD8, mientras que en linfocitos T CD4 no esta presentes. Confirmando los resultados previos, el tratamiento con inhibidores epigenéticos conlleva un aumento en los niveles de expresión
de NKG2D y DAP10.
Conclusiones. En conclusión, determinamos que la expresión de
NKG2D/DAP10 puede estar regulada mediante mecanismos epigenéticos y esto puede emplearse como diana farmacológica.
O-036
LA EXPRESIÓN DE NKG2D EN LINFOCITOS T CD4+ ES UN MARCADOR DE LA SENESCENCIA DEL SISTEMA INMUNE. R. Alonso Arias1, M.A. Moro García1, I. Cuevas Pérez1, F.M. Suárez García2, J.J.
Solano Jaurrieta3, C. López Larrea1. 1Hospital Central de Asturias, Oviedo.
2Consejería de Salud y Servicios Sanitarios del Principado de Asturias. 3Hospital Monte Naranco.
Objetivos. El proceso de envejecimiento se caracteriza por una
serie de cambios en el sistema inmune. En los linfocitos T los cambios se producen fundamentalmente en el compartimento CD8+, mientras que no se dispone de marcadores de senescencia bien definidos
para los CD4+. La expresión “aberrante” de NKG2D en células CD4+
se ha descrito en determinadas patologías autoinmunes e infecciosas
caracterizadas por alto grado de inmunosenescencia. El objetivo de
este estudio fue analizar si la expresión de la molécula NKG2D se
encuentra incrementada en las células CD4+ de los individuos de edad
avanzada y puede considerarse un marcador de envejecimiento del
sistema inmune.
Material y métodos. Se analizó por citometría de flujo la expresión de NKG2D en un grupo de 100 ancianos y 50 individuos jóvenes.
Se realizó caracterización fenotípica (marcadores activación y diferenciación), funcional (respuesta a antígenos, producción de citocinas) y
ontogénica (cuantificación de TRECs por PCR “real-time”) de la subpoblación CD4+NKG2D+.
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INMUNOLOGÍA
Resultados. La mediana del porcentaje de CD4+NKG2D+ en ancianos fue significativamente mayor que en individuos jóvenes (5,3% [IR:
8,74%] vs 1.4% [IR: 1,7%], p=0,3x10–10). La expresión de CD28 distinguió dos subpoblaciones de células CD4+NKG2D+ claramente diferenciadas. Las CD28+ fueron células muy inmaduras, con alto porcentaje
de expresión de CD45RA y CD31. Las CD28null, mayoritarias en los
individuos de edad avanzada, presentaron características fenotípicas
de células CD4+ muy diferenciadas, con bajos niveles de CD25 y altos
de HLA-DR, perforina y granzima B. La respuesta específica de estas
células CD28nullNKG2D+ frente a CMV no presentó diferencias con respecto al resto de las células CD4+, sin embargo fueron significativamente menores frente a un antígeno de reciente contacto como la vacuna de la gripe estacional. Dentro de las células CD4+CD28null la expresión de NKG2D se asoció con estadio de diferenciación más avanzado, presentando estas células mayor producción de IFN-γ en respuesta a la activación con anti-CD3 (40.56%±13.7% versus 24%±8.8%,
p=0.015), un menor umbral de activación y un menor contenido en
TRECs.
Conclusiones. La expresión de NKG2D en linfocitos T
CD4+CD28null define una subpoblación de células CD4+ con un alto grado de diferenciación que caracteriza la senescencia del sistema inmunológico.
O-037
ALTERACIÓN DE RECEPTORES ACTIVADORES E INHIBIDORES EN CÉLULAS NK DE ANCIANOS. I.C. Gayoso Cabada, B. Sánchez-Correa, N. Rojas, A. Pera, C. Campos, S. Morgado, J. Casado, R.
Tarazona, R. Solana Lara. Instituto Maimónides de Investigación Biomédica, Córdoba.
Las células NK son una población heterogénea de linfocitos definidas por un fenotipo de membrana CD3–CD56+ que se caracterizan
por su capacidad para lisar gran variedad de tipos celulares transformados o infectados por virus. Las células NK son un componente muy
importante de la respuesta innata, tanto por su función efectora como
por su función reguladora de la iniciación de la respuesta inmune adaptativa. Se sabe que el envejecimiento afecta al número y función de
células NK. Se han definido diferentes cambios en las células NK asociados a la edad como son, el incremento en ancianos del porcentaje
de células NK, el descenso de la respuesta a IL-2 o el descenso en la
producción de citoquinas. Las células NK poseen receptores de membrana encargados de la activación o inhibición de su función citotóxica. La activación de las células NK está determinada por el balance
entre señales inhibidoras y activadoras procedentes de dichos receptores. De esta forma el balance entre señales activadoras e inhibitorias
determina la activación de las células NK.
Nuestro trabajo estudia la expresión de receptores activadores e
inhibidores de la citotoxicidad NK en jóvenes y ancianos y la influencia sobre los cambios en la capacidad funcional de las células NK en
ancianos.
Para la realización de este estudio se tomaron las PBMCs de
donantes voluntarios jóvenes (18-35 años) y ancianos (70-95 años)
sanos. Se identificaron las células NK por citometría de flujo y se analizó la expresión de los receptores NK activadores e inhibidores en
las subpoblaciones de células NK de voluntarios jóvenes y ancianos sanos
Los resultados muestran un descenso en la expresión del receptor NKp30 y del receptor DNAM1 en células NK de ancianos. Tam-
bién encontramos un incremento del receptor KIR2DL1 en células
NK de ancianos. La alteración del patrón de expresión de receptores
activadores e inhibidores podría provocar un descenso en la capacidad citotóxica en células NK de ancianos. Además, el descenso de
la expresión de NKp30 y DNAM1 puede contribuir no solo al descenso en la capacidad citotóxica natural de estas células, sino que,
dado el importante papel de este receptor en la interacción de células NK con células dendríticas, puede influir en las alteraciones en la
iniciación de la respuesta inmune adaptativa observadas en ancianos.
O-038
EFFECTS OF DACLIZUMAB, BASILIXIMAB, THYMOGLOBULIN
AND CAMPATH-1H ON HUMAN NATURAL KILLER CELLS. E.
Sarmiento Marchese1, D. Stauch1, J. Carbone2, K. Kotsch1. 1Institute of
Medical Immunology, Charité Universitätsmedizin Berlin, Germany. 2Gregorio Maranon University Hospital, Madrid.
Introduction. MoAb against the anti-IL2Ralpha-chain (anti-CD25)
have been efficiently implemented in transplantation induction protocols
including the humanized antibody daclizumab (DAC) as well as the
chimeric antibody basiliximab (BAS). Alternatively, rabbit anti-thymocyte
globulin (rATG) or the humanized anti-CD52 MoAb (Campath-1H)
are used.
Aim and methods. As natural killer (NK) cells are functionally
relevant for an effective clearance of opportunistic viral infections
and anti-tumor activity post transplantation, we analyzed the effects
in vitro of these agents at a concentration of 10ug/ml on NK cell
phenotype, viability, cytokine release (IFNγ, TNFα), apoptosis
(FasL) and activation (CD25) by flow cytometry and real-time RTPCR.
Results. Within the first hour of co-incubation with rATG and
Campath-1H, NK cells (CD3–CD56+) revealed a significant mRNA
expression of IFNg (40 fold) and TNFa (30 fold) in contrast to DAC
and BAS. Gene expression data were confirmed by illustrating that
rATG and Campath-1H resulted in an early (1h) and significant
secretion of IFNg (133pg/ml for rATG; 68 pg/ml for Campath-1H)
and TNFα (313 pg/ml for rATG; 223 pg/ml for Campath-1H) detectable
in the supernatant. Whereas induction of TNFa reached the highest
level after 6h (404 and 582 pg/ml, respectively) and declined rapidly,
IFNg secretion was still significantly elevated after 24h (731 and 828
pg/ml). In contrast, DAC and BAS did not induce significant cytokine
release. Both, rATG and Campath-1H induced necrosis (70,7% and
69,5%) and apoptosis (14,6% and 14,2%) compared with DAC and
BAS (<2% respectively). Specially, FcγRIII (CD16) present in
CD56dimCD16+NK, ist targeted with rATG and Campath-1H showing
a complete depletion. FasL (7 fold) and CD25 mRNA expression was
also significantly enhanced. Whereas FasL expression declined rapidly,
CD25-mRNA illustrated constant enhancement after 24 hours
corresponding with the increase of CD3-CD56+CD25+NK cells after
24 hours: from 0,5% in the control to 17% with rATG and 23% with
Campath-1H.
Conclusion. Therapeutic anti-CD25 antibodies do not have
deleterious effects on NK cells whereas rATG and Campath-1H induces
cell apoptosis, necrosis and pro-inflammatory activity of NK cells. The
latter observation needs to be considered for the risk of cytokine release
syndrome after antibody application and for the selection of the optimal
therapeutic strategy in clinical settings.
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Funds. European Molecular Biology Organization (ERA-EDTA),
Spanish National Health Ministry (FIS PI 081430) and the Medical
Immunolgy Institut Charitè, Berlin, Germany.
O-039
INHIBITION OF NKG2D EXPRESSION IN NK CELLS BY CYTOKINES SECRETED IN RESPONSE TO HUMAN CYTOMEGALOVIRUS INFECTION. A. Muntasell1, G. Magri1, D. Pende2, A. Angulo3, M. López-Botet1. 1Universidad Pompeu Fabra, Barcelona. 2Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro. 3Institut d'Investigacions Biomèdiques August
Pi i Sunyer.
The NKG2D receptor activates NK cell cytotoxicity and cytokine
production upon recognition of self-molecules induced by cellular
stress under different conditions such as viral infections. The importance
of NKG2D in the immune response to Human Cytomegalovirus (HCMV)
is supported by the identification of several viral molecules that prevent
the expression of NKG2D ligands by infected cells. In this study we
report that, paradoxically, a significant, selective and transient reduction
of NKG2D expression on NK cells is detected during HCMV infection
of peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Antagonizing type I
IFN, IL-12 and IFNÁ prevented HCMV-induced down-regulation of
surface NKG2D. Moreover, treatment of purified NK cells with recombinant
IFN‚1 and IL-12 mimicked the effect, supporting a direct role of these
cytokines in regulating NKG2D surface expression in NK cells. The
loss of NKG2D expression selectively impaired NK cell cytotoxicity
against cells expressing NKG2D-ligands, but preserved the response
triggered through other activating receptors. These results support that
down-regulation of NKG2D expression on NK cells by cytokines with
a key role in anti-viral immune response may constitute a physiological
mechanism to control NK cell reactivity against normal cells expressing
NKG2D ligands in the context of inflammatory responses to viral
infections.
O-040
ANÁLISIS DE RECEPTORES NK Y FUNCIONALIDAD EN UN
PACIENTE CON LINFOCITOSIS NK DE FENOTIPO CD16+/CD56–.
L. Arriarán, A. Muntasell, M. Sáenz, A. López De Arcuate , M. LópezBotet , P. Echaniz, E. Cuadrado. Laboratorio de Inmunología del Hospital
Donostia.
Caso clínico. Varón de 42 años clínicamente asintomático, sin adenopatías ni visceromegalias con serología POSITIVA para AcHbc, VHC,
VHA, Epstein-Barr, Toxoplasma, Citomegalovirus, Herpes simple y
Varicela Zoster. VIH: NEGATIVO.
El paciente presenta una linfocitosis de 13.000 cel/ul con una
población expandida (67%) de linfocitos NK de fenotipo
CD16+/CD56–/ CD57+/CD2+/CD3–. El análisis de receptores NK
(NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKp30, NKp46, NKp44, ILT2, KIR,
DNAM) en dicha población mostró un marcaje alto y uniforme para
NKG2A, ILT2, KIR y DNAM así como la ausencia o baja expresión de los receptores NCR: NKp30 y NKp46. Las células expandidas presentaban marcadores de activación temprana (CD69), eran
positivas para HLA-DR. La expresión de mediadores de citotoxicidad (perforina y granzima) se comprobó mediante tinción intracitoplásmica. Para analizar la actividad citotóxica de la población NK
expandida se empleó un ensayo de degranulación por citometría
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de flujo (expresión de CD107a). Los PBMC del paciente se incubaron con 50UI/ml de rIL-2 y al día siguiente se cultivaron con diferentes células dianas, no observándose defectos en la función. Tras
el cultivo de las células del paciente con IL-2+ IL – 15 se constató de
la expresión de los receptores NKp30 y NKp46 en las células del
paciente.
Conclusiones. Los estudios realizados indican un origen monoclonal de la expansión de células NK con un fenotipo heterogéneo para
algunos KIRs. La falta de expresión de receptores NCR en la población
expandida, no excluye su actividad citotóxica ya que estas células son
capaces de expresarlas en respuesta a citocinas.
SESIÓN 5: INMUNIDAD E INFECCIÓN
Moderadores: Miguel López Botet (Barcelona)
Maria Montoya (Barcelona)
O-041
LAS CÉLULAS T REGULADORAS BLOQUEAN LA ACTIVIDAD
INMUNOESTIMULADORA DE LA IL-12 Y LA RESPUESTA INMUNE FRENTE A ANTÍGENOS VIRALES EN LA INFECCIÓN CRÓNICA POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS DE LA MARMOTA
(WHV): REVERSIÓN PORINHIBIDORES DE TGF-µ. I. Otano
Andrés1, J.D. Dotor1, A. Benito1, J. Crettaz1, C. Olagüe1, S. Menne2, J.
Prieto1, G. González-Aseguinolaza1. 1Universidad de Navarra, Pamplona. 2Cornell University, , United States.
Introducción. El tratamiento con análogos de nucleósidos/
nucleótidos de la infección crónica por virus de la hepatitis B (VHB)
ha de mantenerse durante largo tiempo ya que estos fármacos son
poco eficaces en la inducción de una respuesta inmune antiviral.
Ello comporta costos elevados y limita la eficacia del tratamiento.
En un estudio reciente hemos comprobado que la expresion intrahepática de IL-12 durante 40 días induce una respuesta inmune antiviral capaz de eliminar la infeccion vírica en marmotas con hepatitis cronica por WHV. Sin embargo, en animales con carga viral igual
o por encima de 1010 pv/ml el tratamiento con IL-12 no logra inducir una inmunidad protectiva. Se hace necesario el desarrollo de
estrategias capaces de vencer la anergia inmune que también está
presente en aquellos pacientes con hepatitis crónica B que presentan una alta carga viral. En este trabajo hemos analizado la actividad de las Treg en el modelo de la hepatitis de la marmota y los
cambios en la función de las Treg tras la administración de un bloqueante de TGF-β.
Metodos. Se cuantificaron mediante citometria de flujo (FACS) las
células Treg de sangre periférica de marmotas crónicamente infectadas con WHV. Las Treg fueron purificadas utilizando bolitas inmunomagnéticas y se estimularon con anticuerpos anti CD3 analizándose
la proliferación celular con CFSE y la produccion de citoquinas mediante PCR cuantitativa. Se evaluó in vitro e in vivo el efecto del TGF-β sobre
la función de Treg utilizando un péptido bloqueante de esta citoquina
(P17).
Resultados. Se observó que las Treg purificadas de sangre periférica de marmota ejercen un potente efecto inhibidor sobre la actividad
de los linfocitos T efectores. El P17 fue capaz de bloquear in vitro esta
actividad inhibidora. Mientras que los linfocitos de sangre periférica
de marmotas con viremias superiores a 1010 vg/ml no responden con
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INMUNOLOGÍA
producción de IFNgamma a la estimulación con IL-12, la administración a estos animales del péptido P17 por vía intraperitoneal restauró la capacidad de los linfocitos T de producir IFNgamma tras adición
de IL-12.
Conclusión. Los animales con infección crónica por hepadnavirus con una viremia mayor de 1010 pv/ml presentan un aumento
de la actividad Treg causante de la inhibición de las respuestas efectoras antivirales. El TGF-β juega un papel relevante en esta anergia
inmunológica. El bloqueo de TGF-β puede contribuir a facilitar la
respuesta al tratamiento inmunomoestimulante de la hepatitis crónica B.
clara entre el porcentaje de células T CD8+ CMV-específicas con
fenotipo “EMRA” y la duración de la viremia de CMV tras el trasplante. Sin embargo, será necesario llevar a cabo estudios prospectivos para establecer la relación de causalidad entre estos dos
hechos.
O-043
DIVERSIDAD DE LOS GENES HLA, KIR Y FCGR Y SU RELACIÓN CON LA VARIABILIDAD CLÍNICA DE LA INFECCIÓN POR
VIRUS HERPES SIMPLEX TIPO 1. M. Moraru, E. Cisneros, N. GómezLozano, R. De Pablo, F. Portero, M. Vaquero, G. Roustán, C. Vilches.
Hospital Universitario Puerta de Hierro, Madrid.
O-042
ASOCIACIÓN DEL PORCENTAJE DE LINFOCITOS T CD8+ CMVESPECÍFICOS CON FENOTIPO “EMRA” CON LA DURACIÓN
DE LA VIREMIA POR CITOMEGALOVIRUS EN TRASPLANTADOS DE ÓRGANO SÓLIDO. S. Cantisán Bohórquez1, J. Torre-Cisneros1, R. Lara Contreras1, I. Gayoso Cabada1, A. Rodríguez-Benot1,
F. Santos Luna1, M. Casal Román1, M. Montejo Baranda3, R. Solana
Lara1. 1Instituto Maimónides para la Investigación Biomédica de Córdoba
(IMIBIC)-Universidad de Córdoba-Hospital Reina Sofía, Córdoba. 2Hospital
de Cruces, Bilbao.
Introducción. Las células T CD8+ effector-memory (EM) (CD45RACCR7–) intervienen durante la infección aguda por citomegalovirus
(CMV), mientras que, una vez resuelta la viremia, un porcentaje de
estas células re-expresan CD45RA, denominándolas como “EMRA”
(CD45RA+CCR7–). Las células “EMRA” han sido descritas recientemente como linfocitos memoria de larga vida, y parecen representar a
las verdaderas células memoria en la infección por CMV.
Objetivo. Estudiar si existe relación entre el porcentaje de células EMRA (CD45RA+CCR7–, CD45RA+CD28– y CD45RA+CD27–) y la
duración de la viremia por CMV.
Material y método. Estudio transversal de 42 pacientes HLAA*02 trasplantados de órgano sólido. Para estudiar los linfocitos
T CD8+ CMV-específicos se extrajo una muestra de sangre periférica de cada paciente, entre 1-3 años tras el trasplante. Los PBMCs se
incubaron con pentámeros CMVpp65 HLA-A*0201(APC) en combinación con anticuerpos monoclonales frente a CD8, CD28, CD27,
CCR7 y CD45RA. Se analizó por citometría de flujo de cuatro colores.
Se utilizó el test de Spearman para determinar la existencia de
correlación y la regresión lineal múltiple para determinar los factores
asociados con el porcentaje de células T EMRA.
Resultados. Se observó correlación estadísticamente significativa entre la duración de la viremia por CMV tras el trasplante y el
porcentaje de células T CD8+ CMV-específicas CD45RA+CD27– (r =
0.609; p = 0.004), CD45RA+CD280– (r = 0.579; p = 0.008) y
CD45RA+CCR7– (r=0.488; p=0.029). En el análisis multivariante, por
cada incremento de 10 días en la duración de la viremia de CMV
los porcentajes de CD45RA+CD27–, CD45RA+CD28– y CD45RA+CCR7incrementaban un 5.58% (p=0.001), 5.35% (p = 0.001) y 4.49% (p =
0.012), respectivamente, cuando se ajustaba por el seroestatus para
CMV, tipo de órgano y edad. Luego, mientras más tiempo está replicando el virus mayor es el porcentaje de linfocitos T CD8+ CMV-específicos con fenotipo “EMRA”.
Conclusiones. Los resultados demuestran que, en nuestros
pacientes trasplantados de órgano sólido, existe una asociación
El virus Herpes simplex tipo 1 (HSV-1) establece infecciones
latentes de por vida que pueden mantenerse asintomáticas o cursar
con reactivaciones ocasionales o recurrentes. Aunque la mayoría de
los individuos adultos han estado expuestos al virus, la clínica de la
infección es altamente variable, lo que apunta hacia un componente genético implicado en esta diversidad de respuesta. Se conocen
varias estrategias desarrolladas por el virus para evadir la respuesta inmunitaria del huésped. Sin embargo, los mecanismos de defensa frente al patógeno no están bien esclarecidos. La gran variabilidad del sistema HLA y de los receptores KIR (killer-cell immunoglobulin-like receptors) y su implicación en la respuesta inmunitaria frente a infecciones virales, así como la capacidad del virus para
subvertir la presentación antigénica, hace que sean buenos candidatos para explicar la diversidad interindividual de la respuesta protectora frente a HSV-1. Las diferencias de afinidad de los receptores
para la fracción cristalizable de las inmunoglobulinas (FcγR), conferidas por polimorfismos en los genes que los codifican, podrían
influir también en la eficacia de la respuesta inmunitaria frente al
virus, y en su capacidad para competir con señuelos virales (glicoproteínas gE y gI).
En este trabajo hemos analizado la contribución de la diversidad
genética del sistema HLA, de los KIR, y de los receptores para la IgG
FcγRIIa (CD32A) y FcγRIIIa (CD16A) a la variabilidad clínica de la infección por HSV-1. Para ello, se ha recogido información clínica de la infección por HSV-1 y muestras de sangre de 301 individuos, en las que
se han determinado los genotipos HLA, KIR, FCGR2A y FCGR3A y la
presencia de anticuerpos tipo IgG frente a HSV.
Hemos observado una desviación coincidente, pero no significativa, con los resultados publicados previamente en una población
italiana, en la que se demostró una asociación negativa con el alelo
B*35. Además, encontramos asociaciones no descritas hasta ahora con
los alelos HLA-B*18 (p=0.003) y HLA-C*15 (p=0.01). No hemos observado ninguna asociación significativa entre la distribución de los genes
KIR y sus ligandos y la clínica de la infección; en particular, la relación
previamente descrita entre la infección sintomática y la presencia de
los genes KIR2DL2 y KIR2DS2 no tiene significación estadística en la
nueva muestra. Por último, nuestros resultados apuntan hacia una relación directa entre la presencia del alelo CD16A de alta afinidad en
homozigosis y la menor frecuencia de sintomatología herpética
(p=0.037).
El elevado número de comparaciones realizado en este estudio
([71 alelos HLA, 16 genes KIR, 4 ligandos, 6 genotipos FCGR] x cuatro
grupos de estratificación clínica) aumenta la probabilidad de encontrar asociaciones significativas espurias. No obstante, nuestros datos
apuntan, en conjunto, hacia una contribución modesta de los polimor-
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fismos relacionados con la inmunidad adaptativa y con la vigilancia
de su sabotaje, a la predisposición genética a sufrir reactivaciones de
la infección por HSV-1.
*Este estudio ha sido financiado con el proyecto BFU2005-04622 (Mº Educación y Ciencia).
O-044
RESPUESTA INMUNITARIA EN PULMÓN DURANTE UNA
INFECCIÓN EXPERIMENTAL MIXTA CON EL VDVB Y HVB-1.1.
M.Á. Risalde Moya, V. Molina Hernández, M. Pedrera Mazarro, P.J. Sánchez Cordón, F. Romero Palomo, J.C. Gómez Villamandos. Universidad
de Córdoba, Córdoba.
El virus de la diarrea vírica bovina (vDVB) se considera el principal factor predisponente para la aparición de infecciones respiratorias secundarias en bovino, desconociéndose con exactitud las estrategias utilizadas por este virus para evadir la respuesta inmune en
pulmón y facilitar la instauración de agentes concomitantes. Así, el
objetivo de este trabajo fue estudiar los cambios cuantitativos y secretores que experimentan las diferentes poblaciones y subpoblaciones de linfocitos en el pulmón de animales coinfectados experimentalmente con el vDVB y el herpesvirus bovino tipo 1.1 (HVB-1.1), con
el fin de determinar el papel de estas células inmunocompetentes en
la patogenia de la enfermedad y el tipo de respuesta inmune establecida (Th1 o Th2).
Para ello, 8 terneros fueron inoculados intranasalmente con la cepa
no citopática 7443 del vDVB y coinfectados a los 12 días post-inoculación (dpi) con la cepa Iowa del HVB-1.1. Los animales fueron sacrificados en grupos de dos a los 2, 4, 7 y 14 dpi del HVB-1.1. Además, 2 animales control se inocularon con medio estéril y fueron sacrificados al
final de la experiencia. Se tomaron muestras de sangre en días previos y posteriores a ambas inoculaciones, analizándose las distintas
poblaciones de linfocitos periféricos (CD4, CD8, δγ y B) por inmunofluorescencia indirecta mediante citometría de flujo. Las muestras de
pulmón fueron procesadas de forma rutinaria para su posterior estudio histopatológico e inmunohistoquímico (CD79, CD3, CD4. CD8,
WC1, INFγ e IL-4).
Los animales inoculados con vDVB mostraron, tras la infección
con HVB-1.1, un descenso en sangre periférica de linfocitos CD4+ y
CD8+ (2 y 4 dpi), así como de los linfocitos γδ+ y B+ que se prolongó durante todo el proceso. Coincidiendo con el mayor declive
de las diferentes poblaciones linfocitarias en sangre, observamos
en pulmón la aparición de un infiltrado mononuclear, constituido
principalmente por linfocitos T y macrófagos. Unido a los cambios
cuantitativos, el estudio de la expresión de mediadores químicos
indicativos de activación de los linfocitos e instauración de la respuesta inmune reveló que, tras la inoculación con HVB-1.1, se produce un incremento en el número de linfocitos reactivos frente a la
IL-4.
Estos resultados sugieren una migración de las células inmunocompetentes sanguíneas al pulmón como respuesta a la infección con
HVB-1.1. Sin embargo, pese a producirse un incremento en el número de estas poblaciones, no se instaura una respuesta celular correcta
(Th1) frente a la coinfección, sino que se mantiene la respuesta Th2 previamente instaurada, lo que impide una respuesta de defensa adecuada frente a agentes secundarios.
*Este trabajo ha sido financiado por la Junta de Andalucía a través del proyecto de Excelencia PO9-AGR-4671.
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VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
O-045
IMPORTANCIA DE LOS DIFERENTES RECEPTORES NK EN EL
DETERIORO DE LA RESPUESTA INMUNE INNATA OBSERVADA EN PACIENTES HIV+ VIRÉMICOS. M. Frias Casas, L. Castro
Orgaz, R. González Fernández, M. Cobo Medina, L. Montes Torres, J.
Peña Martínez. Hospital Universitario Reina Sofia de Córdoba, Córdoba.
Objetivo. Ciertos defectos funcionales de las células NK en la infección por HIV tienen un efecto directo en la expresión anormal tanto en
los receptores inhibidores como en los activadores. Debido a que la
interacción de estos receptores interviene en la función innata del sistema inmune del individuo, el objetivo de este estudio es analizar la
expresión de estas moléculas, como son NKG2A, NKG2C, NKp30,
NKp44, NKp46 y en particular CD85j, con su ligando HLA-G, en individuos HIV+ que poseen un buen control de la viremia a pesar de
habérseles retirado el tratamiento comparándolo a su vez con pacientes avirémicos.
Material y métodos. Para la realización de este estudio se utilizaron PBMCs previamente congeladas de pacientes HIV+ a los que se
les retiró el HAART durante al menos dos años (n=21), PBMCs congeladas de donantes sanos (n=24) y PBMCs congeladas de pacientes HIV+
con HAART (n=22). El análisis de las poblaciones celulares se realizó
mediante citometría de flujo de cuatro colores. El paquete estadístico
usado para el análisis de los datos fue el SPSS (V.17)
Resultados. En el caso de las moléculas CD85j y HLA-G los resultados obtenidos muestran un incremento significativo en todas las subpoblaciones NK conocidas, CD56dim, CD56bright y CD56neg en pacientes a los que se les ha retirado el HAART. En el caso de pacientes sanos
y HIV+ tratados encontramos los niveles de CD85j y HLA-G normales. Este incremento significativo de la molécula CD85j y su ligando
HLA-G está correlacionado positivamente con la carga viral de los
pacientes (P<0,05). Por el contrario respecto a los receptores lectina tipo
C (NKG2A y NKG2C) y receptores de citotoxicidad no encontramos
ningún cambio significativo en su expresión entre pacientes virémicos
y avirémicos.
Conclusión. Estos resultados sugieren que un nivel alto de carga viral HIV induce el aumento de la expresión de receptores inhibidores, en este caso, CD85j así como su ligando HLA-G, mientras que
en los demás grupos este incremento fue restringido como resultado
de una replicación de HIV significativamente menor.
O-046
THE VIRAL PROTEIN A238L INHIBITS CICOOXYGENASE-2 AND
METALLOPROTEINASE-9 EXPRESSION IN HUMAN COLORECTAL CARCINOMA CELLS. E. G. Sánchez1, A. G. Granja2, P. Sabina3,
I. Bañon-Rodríguez4, I. Antón5, M. Fresno1, Y. Revilla1. 1Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa (CBMSO), MADRID. 2Cancer Research UK London, , United Kingdom. 3Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa. 4Centro
Nacional de Biotecnologia (CNB). 5Centro Nacional de Biotecnologia (CNB).
Introduction. Cyclooxygenase-2 (COX-2), an inducible
prostaglandin synthase, is overexpressed in several human cancers
and affects many processes that have implicated in different stages
of carcinogenesis. Multiple lines of evidence indicate that COX-2 is
a “bona fide” pharmacologica target for anti-cancer therapy. Both
tumor formation and growth are reduced in animals that are either
engineered to be COX-2 deficient or treated with selective COX-2
inhibitors. The mechanisms of the pro-tumorogenic activity of COX-
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INMUNOLOGÍA
2 are: production of angiogenic factors, increasing of cells proliferation,
inhibition of inmmune surveillance, prevencion of apoptosis and
increased metastatic potencial. Previously, we have demonstrated
that the viral protein A238L, of African Swine Fever Virus, is able
to inhibit COX-2 expression through the NFAT transactivation
pathway in Jurkat T cells.
Objetives. To study if the viral protein A238L has an antitumor or
antimetastatic function in human colorectal carcinoma cells, Caco-2.
Materials and methods. We generated Caco-2 cells that stably
express the A238L gene by transfection with an expression plasmid.
We analysed COX-2 promoter expression and transcriptional activity
of NFAT, NFkB and the activity of the p300 coactivator by luciferase
assays. COX-2, metalloproteinase-9 (MMP-9) and ICAM-1 mRNA
expression were measured by PCR assays, and MMP-9 secretion and
activity through a gelatin zymografy. Finally, we performed chamber
assays to analyze migration ability of Caco-A238L cells and ELISA
assays to measure prostaglandin E2 levels.
Results and conclusions. The viral protein A238L inhibits COX2 promoter activity, mRNA expression and PGE2 synthesis in Caco-2
cells, and this inhibition is mediated by blocking NFAT, NFkB and p300
transcriptional activity. Moreover, we have observed that the presence
of this viral protein disminished the migration ability of Caco-2 cells
probably due to inhibit the expression and secretion of MMP-9, and
A238L is able to modulate the expression of other molecules involved
in cellular adhesion as ICAM-1.
Taken together, this date indicate that A238L could be a potencial
tool for anti-tumor therapy.
O-047
NKP46 AND DNAM-1 NK CELL RECEPTORS DRIVE THE RESPONSE TO HUMAN CYTOMEGALOVIRUS INFECTED MYELOID
DENDRITIC CELLS OVERCOMING VIRAL IMMUNE EVASION
STRATEGIES. G. Magri1, A. Muntasell1, N. Romo1, A. Sáez-Borderías1,
D. Pende2, A. Angulo3, A. Moretta4, M. López-Botet1. 1Universitat Pompeu Fabra , Barcelona. 2Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro. 3Institut
d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer. 4Università di Genova.
Myeloid dendritic cells play a central role in the biology of human
cytomegalovirus (HCMV) infection as they differentiate from myeloid
progenitors, which constitute a main site for viral latency, and are
themselves susceptible to direct infection. NK cells are involved in
immune defence against HCMV though information on the nature of
NK cell receptors involved is limited. In the present study we analysed
the response of NK cell populations against autologous monocytederived dendritic cells (moDC) infected by the TB40/E HCMV strain,
assessing the antagonistic effect of monoclonal antibodies (mAbs)
specific for different activating NK cell receptors.
Interaction with autologous HCMV-infected moDC, which
down-regulated the expression of HLA class I and II molecules,
specifically activated NK cells, triggering IFNÁ production and
cytotoxicity. NKp46 and DNAM-1-specific mAbs inhibited NK cell
activation in response to HCMV-infected moDC, despite that DNAM
ligands (PVR and Nectin-2) were down-regulated. Differences in
the efficiency of CD94/NKG2A+ and CD94/NKG2C+ NK cell subsets
from HCMV seropositive donors to respond against infected moDC
were noticed.
Our results indicate that NK cells efficiently respond against HCMVinfected immature moDC, overcoming putative viral immune evasion
strategies, and support that the NKp46 and DNAM-1 receptors play a
central role in this process.
SESIÓN 6: INMUNIDAD INNATA E INFLAMACIÓN
Moderadores: J.L. Rodríguez Fernández (Madrid)
Francisco Sánchez Madrid (Madrid)
O-048
PAPEL DE COT/TPL2 EN HIPERNOCICEPCIÓN INFLAMATORIA
INDUCIDA POR TLR. I. Soria Castro, A. Krzyzanowska, M. López
Peláez, M. Fernández, S. Alemany. IIB, Alberto Sols, CSIC, Madrid.
Objetivos
• Determinar el papel de Cot/tpl2 en la inflamación inducida por
zymosan.
• Identificación de los distintos mecanismos empleados por Cot/tpl2
en procesos de inflamación in vivo.
• Estudio del papel de Cot/tpl2 en hipernocicepción asociada a inflamación.
Materiales y Métodos
• Modelos de inflamación in vivo en ratones Cot/tpl2+/+ y Cot/tpl2–/–:
inyección i.p. con zymosan (2 mg/ml , 0,5 ml) e inyección intraplantar i.pl.con zymosan (30 µg/µl).
• Luminiscencia in vivo: actividad MPO en pata y peritoneo, IVIS
LUMINA (Gross et al, 2009).
• Cuantificación de células del peritoneo y marcaje de neutrófilos
(Ly6G+/F4/80–) y macrófagos ( F4/80+/Ly6G+) por citometría de
flujo.
• Medida de citoquinas y quimioquinas por Citometría, por el método de CBA.
• Medida de PGE2 y LTB4 por inmunoensayo encimático, Cayman
Chemical.
• Test de nocicepción: método validado por Cunha (Cunha et al,
2004) con anestesiómetro eléctrico, tras la i.pl. con zymosan y con
LPS.
Resultados. La ausencia de Cot/tpl2 redujo significativamente la
hipernocicepción asociada a inflamación inducida por lipopolisacárido y por zymosan. Los ratones deficientes en Cot/tpl2 mostraron
una reducción del 40% de la actividad MPO in vivo a las 6 horas tras
la inyección intraplantar con zymosan. Consecuentemente, en el modelo de peritonitis inducida con zymosan, los ratones deficientes en
Cot/tpl2 mostraron una reducción de un 30% de la actividad MPO así
como un 25 menos de neutrófilos y un 65% de macrófagos en el lavados peritoneal. La ausencia de Cot/tpl2 también determinó la reducción de los niveles de ciertas citoquinas y quimioquinas detectadas
durante la inflamación con zymosan. Así mismo, mientras que en ensayos in vitro realizados en macrófagos estimulados con zymosan
Cot/tpl2 es necesario para generar TNF-α y PGE2, en modelos in vivo,
los ratones deficientes en Cot/tpl2 tan solo mostraron una pequeña
reducción de los niveles de TNF-α así como una inducción de los niveles de PGE2.
Conclusiones. Nuestros datos muestran como Cot/tpl2 es una
buena diana terapéutica para reducir la inflamación aguda así como
la hipernocicepción asociada a inflamación, debido a su capacidad
para controlar el reclutamiento de células inflamatorias. También
hemos demostrado como el papel de Cot/tpl2 descrito para ensa-
29
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Página 30
yos in vitro no es extrapolable en estudios de animal entero, lo que
debería ser considerado a la hora de desarrollar fármacos contra
Cot/tpl2.
O-049
EFECTO POTENCIADOR DE LA DEFICIENCIA EN APOE SOBRE
EL DESARROLLO DE ARTRITIS EN ROEDORES. J. Postigo1, F.
Genre1, M. Iglesias1, L. Buelta2, M. Fernandez-Rey1, J. Merino1, R. Merino1. 1Universidad de Cantabria, Santander. 2Universidad de Cantabria.
Diversos estudios epidemiológicos han mostrado un incremento
en la frecuencia de arteriosclerosis en los pacientes con artritis reumatoide (AR) que no se explica unicamente en base a factores de riesgo
vascular tradicionales. Todo ello sugiere que mecanismos inmunoinflamatorios implicados en la patogenia de la AR también influyen
en la aceleración de la arterioesclerosis en estos pacientes. Un aspecto que aun no se ha evaluado en este contexto es hasta que punto la
aparición de arteriosclerosis y/o las anomalías metabólicas asociadas,
influyen en el propio desarrollo de AR.
En el presente trabajo se evalua como la deficiencia en ApoE y la
hipercolesterolémia asociada influyen en la inducción y evolución de
la artritis autoinmune experimental (CIA), la cual inducimos inmunizando con colágeno de tipo II bovino (C-II) a ratones B10RIII, deficientes o no en ApoE, lo cual les hace susceptibles al padecimiento
de arteriosclerosis
El seguimiento clínico complementado con técnicas radiológicas
y anatomopatológicas muestra que los ratones B10RIII-ApoE–/– inmunizados con C-II padecen una CIA mucho más severa que los ratones B10RIII control. En correlación con estos hallazgos, mediante QPCR, hemos observado que los ratones B10RIII-ApoE–/– inmunizados con C-II, tienen incrementada la expresión articular de citocinas pro-inflamatorias artritogénicas (TNFα e IL-1β) y las citocinas y
factores de transcripción asociados a la diferenciación de linfocitos T
CD4+ hacia los subtipos Th1 y Th17 (IFNγ, TGFβ, IL-6, IL-21, T-bet
y RORγt), en comparación con los ratones silvestres inmunizados.
Así mismo, en los ratones B10RIII-ApoE–/– se observa un incremento importante de linfocitos Th17 (CD4+ IL-17+) y en menor grado de
Th1 (CD4+ IFNγ+) en los ganglios linfáticos 3 semanas tras la inmunización con C-II en comparación con los ratones silvestres inmunizados.
En conjunto, nuestros resultados demuestran que la deficiencia en
ApoE y/o la hipercolesterolémia asociada a dicha deficiencia, agravan
el curso clínico de la CIA en ratones susceptibles promoviendo respuestas Th1 y Th17.
O-050
LA SOBRE-EXPRESIÓN DE BCL-2 INCREMENTA LA ACTIVIDAD
SUPRESORA DE LOS LINFOCOTOS CD4+CD25+ REGULADORES
POR UN MECANISMO DEPENDIENTE DE TGFB. M. Iglesias1, I.
Santiuste1, L. Buelta1, J. Postigo2, J. Merino2, R. Merino3. 1Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria-CSIC, SANTANDER. 2Universidad de
Cantabria. 3Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria (IBBTEC)CSIC.
Recientemente nuestro grupo ha demostrado la protección contra el desarrollo de patologías autoinmunes en un modelo de ratón
transgénico (Tg) que sobre-expresaba Bcl-2 humano (hBcl-2) en linfo-
30
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citos B y en una subpoblación de linfocitos T. Este efecto protector
estaba mediado por linfocitos T CD4+CD25+ reguladores (Treg) que
se encontraban expandidos en los animales Tg. Con la finalidad de
profundizar en los mecanismos responsables de dicha protección,
hemos estudiado el número y actividad funcional de los linfocitos
Treg así como el desarrollo de artritis autoinmune tras inmunización con colágeno de tipo II bovino (CIA) en ratones (DBA/1x
C57BL/6)F1 Tg para hBcl-2 en linfocitos T (F1-hBcl-2-TgT). A diferencia de lo descrito en los ratones hBcl-2 Tg en linfocitos B y T, el porcentaje de células Tregs en los ratones F1-hBcl-2-TgT es similar al observado en ratones F1 no-Tg controles. Sin embargo, experimentos funcionales in vitro muestran que la sobre-expresión de hBcl-2 en los linfocitos Tregs potencia en más de 10 veces su actividad supresora. De
acuerdo con estos hallazgos, los ratones F1-hBcl-2-TgT no desarrollan
CIA tras inmunización con colágeno de tipo II. En correlación con la
ausencia de CIA, los ratones F1-hBcl-2-TgT expresan niveles normales de las citocinas pro-inflamatorias TNFα IL-1β e IL-6 a nivel articular, cuantificadas por Q-PCR, mientras que la expresión de la citocina anti-inflamatoria TGFβ se encuentra incrementada. La eliminación
in vivo de las células Tregs en los ratones F1-hBcl-2-TgT, mediante un
Ac monoclonal anti-CD25, induce el desarrollo de CIA similar a la
observada en los controles no-Tg que no fueron tratados con este AcM
y promueve un incremento en la expresión articular de TNFα IL-1β e
IL-6, indicando que la ausencia de patología autoinmune en esta línea
de ratones Tg también es dependiente de los linfocitos Tregs. Por último, el tratamiento local con un anticuerpo anti-TGFβ incrementa la
severidad de la artritis en los ratones F1 no-Tg y sobre todo, promueve la aparición de CIA en los ratones F1-hBcl-2-TgT. Estos resultados ponen en evidencia que la sobre-expresión de hBcl-2 en linfocitos
Tregs potencia su actividad supresora y que dicho incremento está
mediado por TGFβ.
O-051
CRITICAL ROLE OF PI3K IN THE UPREGULATION OF KC AND
MIP-2 BY HISPANOLONE DERIVATIVE IN TLR4-ACTIVATED
MACROPHAGES. S. Hortelano1, P.G. Traves2, R. López-Fontal3, G.
Bergazyn3, L. Boscá2, B. Rodríguez4, B. De Las Heras5. 1Unidad de Inflamación y Cáncer, Área de Biología Celular y del Desarrollo, Centro Nacional
de Microbiología, Majadahonda. 2Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (CSIC-UAM), Madrid. 3CNIC. Madrid. 4Instituto de Química Orgánica (CSIC), Madrid. 5Departamento de Farmacología Facultad de Farmacia,
Universidad Complutense, Madrid.
Background. The search for new anti-inflammatory natural products
has enormously increased in last years. We have recently described
that hispanolone derivative 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol (T11)
inhibits LPS-dependent NO release through a mechanism that involves
inhibition of NF-κB activation.
Objective. In this study, we want to extend our results to other
TLR ligands and demonstrated the differential regulation of inflammatory
chemokines in the presence of T11 in mouse peritoneal macrophages.
Material and methods. Mouse peritoneal macrophages were
maintained in culture and activated with pro-inflammatory stimuli in
the absence or presence of T11. Expression of inflammatory cytokines,
mediators and chemokines was determined.
Results. We show that T11 exerts potent inhibitory effects on the
expression of NF-κB responsive genes such as NOS-2 and COX-2 after
stimulation with TLR2, TLR3 and TLR4 ligands. In addition, using
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INMUNOLOGÍA
microarray and quantitative RT-PCR analysis, we observed a clear
inhibition of the expression of proinflammatory cytokines such as IL1α, IL-1‚ and IL-6 and chemokines including CCL2, CCL4, CCL5, CCL7,
CCL12, CCL17, and CXCL10 in T11-treated cells after LPS stimulation.
In contrast, the chemoattractants CXCL1/KC and CXCL2/MIP-2
chemokines were highly upregulated. This synergistic effect was only
observed after LPS stimulation and was dependent on PI3K inhibition
as demonstrated the upregulation of KC and MIP-2 in LPS-stimulated
macrophages after treatment with the specific inhibitor of PI3K LY294002.
Consisting with this, treatment of LPS-stimulated macrophages with
T11 resulted in a decreased activity of PI3K and Akt phosphorylation.
Conclusions. Taken together, these results demonstrate that T11
differentially affects the ability of TLR4 signaling pathway to induce
pro-inflammatory cytokines and describe a novel negative role of PI3K
for the regulation of TLR signaling.
*This work was supported by grants from the FIS PI05.0050, PI08/0070 and the Fundación
Mutua Madrileña to S.H, and by a Santander-Complutense grant to S.H. and B.de las H.
O-052
EFFECTS OF ULTRAVIOLET RADIATION IN DIFFERENT SUBPOPULATIONS OF PERIPHERAL BLOOD MONOCYTES. Z. Moreno Villegas1, D. Diaz Martin1, G. Parada Hermoza1, L. Ortega Moreno1,
H. Barcenilla Rodríguez1, M.Á. Sánchez Luengo1, L. Chara Velarde1, J.
Monserrat Sanz1, A. Prieto Martín1, M. Álvarez De Mon-Soto2. 1Universidad Alcalá de Henares. 2Hospital Universitario Príncipe de Asturias.
Background. Ultraviolet (UV) irradiation has cytotoxic effects
on the skin and the immune system as a consequence of oxidative stress.
Several effects have been described in different immune cellular types.
However, there are no studies about its effects in recently described
monocyte subpopulations.
Objetive. To determine the UV irradiation effects on the different
subsets of peripheral blood monocytes.
Material and methods. Peripheral blood mononuclear cells were
isolated from healthy donors by standard Ficoll-Paque density gradient
centrifugation. Monocytes were irradiated with an UV-emitting lamp
(I=1319W/m2) over different times (7, 14 and 28 minutes). Later, cells
were cultured for 3, 6, 24 and 48 hours and were adquired in a FACSCalibur
flow cytometer using fluorochrome-labeled monoclonal antibodies.
Monocytes were selected in a FSC-SSC dot plot, and defined as CD3
negative and CD14 positive. Monocyte subpopulations were identified
as classic monocytes (CD14+ CD16–), inflammatory monocytes (CD14+high
CD16+) and resident monocytes (CD14+dim CD16+). The absolute number
of viable (7-AAD-) monocytes were calculated using microbeads as an
internal reference.
Results. We observed that in both CD16+ monocyte subsets UV
exposure caused a rapid and dramatical decrease in the absolute number
of viable cells. However, the absolute number of viable classic monocytes
(CD14+ CD16–) increased progressively after 7 minutes of UV exposition.
Meanwhile, 14 minutes of irradiation caused at 3 hours a slow increase
of viable cell number, but after 6 h decreased strongly. For all subpopulations
studied, 28 minutes of UV induced a massive cell death. We also observed
a very slight and progressive increase in viable classic monocytes
absolute number from 6 and 24 yours for 28 and 14 minutes of irradiation
respectively.
Conclusion. Classic monocytes are much more resistant to ultraviolet
emissions than inflammatory and residents subsets, which disappear
at 3 hours of cultured.
O-053
SVT003407 Y SVT008294: NUEVOS COMPUESTOS CON ACTIVIDAD DUAL ANTI-PROLIFERATIVA Y ANTI-INFLAMATORIA
COMO POTENCIALES FÁRMACOS ANTIPSORIÁTICOS. S. Marchán, C. Herrero, J. Cabellos, C. Lagunas. Laboratorios Salvat, Esplugues
de Llobregat.
Objetivos. La psoriasis es una enfermedad inflamatoria crónica
de la piel caracterizada por una hiperproliferación y diferenciación
anormal de queratinocitos y un aumento en la producción de citoquinas proinflamatorias. Las terapias actuales abordan ambos aspectos de la patología. El objetivo de este estudio es evaluar el potencial
terapéutico para el tratamiento de la psoriasis de dos agonistas del
receptor PPARγ, SVT003407 y SVT008294.
Materiales y métodos. Actividad PPARγ: la actividad fue determinada por estudios de afinidad con un radioligando competitivo así
como ensayos celulares de transactivación.
Actividad antiproliferativa y citotoxicidad: se determinó mediante métodos colorímetros en las líneas celulares HEKn (queratinocitos
epidérmicos humanos) y HDFa (fibroblastos dérmicos humanos).
Actividad anti-inflamatoria: La inhibición de la producción de citoquinas inflamatorias in vitro se determinó en PBMC humanos estimulados con LPS mediante qRT-PCR. La capacidad anti-inflamatoria in
vivo se determinó en un modelo de inflamación tópico inducido por
TPA en oreja de ratón.
Resultados. Los agonistas del receptor PPARγ SVT003407 y
SVT008294 son dos nuevos compuestos en desarrollo preclínico para
el tratamiento tópico de la psoriasis que muestran una actividad dual
anti-proliferativa y anti-inflamatoria. Ambos productos presentan una
marcada inhibición de la proliferación de queratinocitos sin efectos
citotóxicos asociados. Dado que estos compuestos no muestran actividad anti-proliferativa sobre fibroblastos, su administración tópica no
debería conllevar atrofía dérmica, tal como sucede con otros fármacos.
Por otro lado, en un modelo celular basado en la estimulación de
PBMC’s con LPS, estos productos son capaces de inhibir la producción
de las citoquinas inflamatorias validadas clínicamente para el tratamiento de psoriasis como TNFα, IL-1α, IL-12p40 (subunidad presente en las citoquinas IL-12 e IL-23). Finalmente, estos compuestos son
eficaces en un modelo in vivo de inflamación tópica, siendo la respuesta anti-inflamatoria de éstos superior al estándar terapéutico tazaroteno.
Conclusiones. SVT003407 y SVT008294 presentan un potencial
terapéutico elevado para el tratamiento de la psoriasis dado que actúan en las dos principales causas responsables del desarrollo de la patología: proliferación de queratinocitos y producción de mediadores inflamatorios.
O-054
RIAM (RAP1-INTERACTING ADAPTOR MOLECULE) ES ESENCIAL PARA LA FAGOCITOSIS MEDIADA POR COMPLEMENTO EN CÉLULAS PROMIELOCITICAS. I. Medraño Fernández1, I.M.
Olazabal Olearreaga2, J. Merino Gracia1, F. Sánchez Madrid2, V.A. Boussiotis3, C. Cabañas Gutiérrez4, E.M. Lafuente Duarte1. 1Facultad de Medicina, UCM, Madrid. 2Hospital de La Princesa. 3BIDMC, Harvard, United States. 4CBM-SO, CSIC.
Introducción. Los receptores del complemento CR3 y CR4 (αMβ2
y αxβ2, respectivamente), son miembros de la familia de integrinas β2.
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Estímulos pro-inflamatorios inician cascadas de señalización inside-out
que incrementan la afinidad de estas integrinas, induciendo una activación de la fagocitosis. Algunos componentes de esta vía de señalización inside-out a αMβ2 han sido definidos, como Rap1, cuya activación incrementa la fagocitosis de partículas opsonizadas por complemento, y Talina cuya unión a la región citoplasmática de la integrina
β2 es esencial para la activación de αMβ2. Sin embargo, se desconoce
el mecanismo por el que Rap1 induce la unión de talina a αMβ2. Recientemente hemos identificado a RIAM, un efector de Rap1 que funciona
como una proteína adaptadora interaccionando directamente con Rap1GTP y con Talina. Se ha descrito que la asociación Rap1-RIAM contribuye al reclutamiento de Talina a la subunidad ‚ en otras integrinas.
Objetivos. Estudiar la implicación de RIAM en fagocitosis mediada por complemento y adhesión a través de integrinas β2 (αMβ2 y
αxβ2), en células promielocíticas.
Materiales y métodos. Hemos estudiado las siguientes actividades en la línea HL-60 interferida establemente para RIAM (shRNA) y
diferenciada a neutrófilo con ATRA: 1) Adhesión a Fibrinógeno/iC3b,
soluble y en placa. 2) Fagocitosis mediada por complemento (FACS).
3) Detección de Rap1-GTP (Pull-Down). 4) Reclutamiento de Talina a
la copa fagocítica (confocal).
Resultados. La línea celular promielocitica HL-60 interferida establemente para la expresión de RIAM y diferenciada a neutrófilo muestra un defecto en adhesión a fibrinógeno e iC3b, ligandos de αMβ2 y
αxβ2, y un defecto en fagocitosis mediada por complemento. Este defecto es especifico de CR3 y CR4 ya que no se observa en la fagocitosis
mediada por FcR. La activación de Rap1 mediada por 8-CPT-2MecAMP, un activador de EPAC (GEF específica de Rap1) induce un incremento en fagocitosis que es inhibido por la interferencia de la expresión de RIAM. Además la interferencia de expresión de RIAM resulta en un menor reclutamiento de Talina a la copa fagocítica, lo que produciría un defecto en la activación de las integrinas αMβ2 y αxβ2.
Conclusión. Nuestros datos sugieren que RIAM funciona como
el nexo de unión entre la forma activa de Rap1 y el reclutamiento de
Talina a la región citoplasmática de la subunidad beta de las integrinas αMβ2 y/o αxβ2. RIAM, por tanto actuaría como el efector de Rap1
que regula la activación de las receptores fagocíticos del complemento CR3 y CR4.
O-055
LOS LIGANDOS DE RECEPTORES TOLL-LIKE REGULAN EL
PATRÓN MIGRATORIO DE LOS LEUCOCITOS EN SANGRE
PERIFÉRICA. J.C. Nieto Sáchica, E. Cantó, M.A. Ortiz, C. Zamora, S.
Vidal. Institut De Recerca Hospital De Santa Creu I Sant Pau, Barcelona.
Los leucocitos juegan un papel central en la regulación de la respuesta inmune, conocer las vías que regulan la migración y la dinámica del tránsito celular, nos permitirán entender la progresión del proceso inflamatorio.
Nosotros hemos investigado como ligandos de TLR2 (Pam3CSK4,
FSL-1), TLR4 (LPS) o algunos mediadores inflamatorios (IFN-γ, IL-10,
TNF-α) producidos tras el estímulo con ligandos de TLRs pueden regular la expresión de los receptores de quimiocinas (CCR2, CCR4, CCR5,
CCR6, CXCR3) en las diferentes poblaciones leucocitarias.
Resultados. Primero por citometría de flujo se analizó la expresión de los receptores de quimiocinas en monocitos, linfocitos y neutrofilos en sangre total. Los monocitos expresaban CCR2, CCR4, CCR5,
mientras que los linfocitos expresaban CXCR3, CCR6 y CCR4. Tras esti-
32
VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
mular cultivos de sangre total con ligandos de TLR2 y TLR4 durante
20 horas observamos que disminuía la expresión de CCR2, aumentaba la expresión de CCR4, CCR5, CXCR3 en monocitos y aumentaba la
expresión de CXCR3 en linfocitos. Los principales mediadores inflamatorios detectados en estos cultivos fueron IL-10, IL-6, TNFα. En conscuencia determinamos la influencia de estos mediadores inflamatorios
sobre la expresión de los receptores de quimiocinas. Al estimular sangre total con IL-10 y TNF-α disminuía la expresión de CCR2 y aumentaba la expresión del CCR4 y el CXCR3 en monocitos. Para validar el
efecto de la IL-10, bloqueamos con anti IL-10 neutralizante los cultivos
de sangre total estimulada con el ligando de TLR4.
Conclusión. El reconocimiento de patógenos por las diferentes
poblaciones leucocitarias en especial por los monocitos, altera su repertorio de receptores quimiocinas, lo que condicionaría su tránsito a través de los tejidos.
O-056
LA ACTIVACION CONSTITUTIVA DE NOTCH1 DESEQUILIBRA
EL BALANCE PROLIFERACIÓN/DIFERENCIACION EN LAS
CELULAS HEMATOPOIETICAS EN EL EMBRIÓN DE RATÓN
POSTGASTRULACIÓN. I. Cortegano, L. Luna, P. Melgar, M. Alia, B.
Palacios, N. Serrano, A. Sánchez-Archidona, B. De Andrés, J. De La Pompa , M. Marcos, M. Gaspar. Centro Nacional de Microbiología, Instituto de
Salud Carlos III, Madrid.
Objetivo. Estudiar el efecto de la activación constituida de Notch1
a lo largo del desarrollo embrionario en el embrión postgastrulación
de ratón.
Material y Métodos. Modelo murino Cre-lox en el cual la región
intrcitoplásmica del receptor Notch1 (N1ICD) se encuentra constitutivamente activa y es expresada en todas las células que en algún momento del desarrollo son Tie-2+, además esta construcción está unida a la
proteína fluorescente GFP para la identificación de las células mutantes. Se ha realizado la caracterizacion fenotípica de las poblaciones a
día 9 de gestación en saco vitelino mediante citometría de flujo multiparamétrica. Se han aislado las poblaciones GFP+ para estudiar su
potencial hematopoiético (ensayos de methocult), su expresión génica (PCR a tiempor real).
Resultados. Nuestros resultados muestran que, al igual que ocurre en el caso de la delección de Notch1, su hiperactivación de células Tie2+ da lugar a la desaparación de los islotes sanguíneos de la aorta-dorsal y al bloqueo de la hematopoyesis definitiva en los embriones de día 9.5 de gestación. El potencial hematopoiético de los progenitores aislados de los ratones transgénicos se reduce en 10-20 veces
en comparación con el ratón control. Los estadios inmaduros e intermedios en el proceso de diferenciación eritroide y mieloide en los ratones mutantes se ven incrementados y presentan mayor capacidad de
proliferación; sin embargo, tanto el proceso de hemoglobinización como
la diferenciación a estadíos más maduros de estos linajes están bloqueados. El análisis de la expresión génica de muestras purificadas por
citometría de flujo de las poblaciones progenitoras GFP+ muestra un
aumento en la expresión tanto de los ligandos de Notch como de sus
dianas directas (Dll4, Jagged 1 y 2, Hes1 y HRT2), así como de los genes
implicados en la vía no canónica de Wnt (Dkk1 y Wnt5a). En cuanto
al análisis de los genes esenciales para la hematopoiesis, la hiperactivación de Notch1 en estos estadios celulares reduce en gran medida
la expresión de SCL, Fli1 y GATA2 y no altera la expresión de LMO2
y LDB1. El análisis de los genes de ciclo celular muesta alteraciones en
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INMUNOLOGÍA
la expresión de ciclinas importantes en la regulación de este proceso
como la ciclina E1 y la ciclina B2.
Conclusión. La hiperactivación de Notch1 en células embrionarias Tie2+ produce un bloqueo en la diferenciación final hematopoiética mieloeritroide con acúmulo de precursores intermedios de los linajes eritroide y mieloide.
SESIÓN 7: CÉLULAS DENTRÍTICAS
Moderadores: Alberto Varas (Madrid)
David Sancho (Madrid)
O-057
LANGERHANS CELLS CONTROL ANTIGEN-SPECIFIC SKIN
INFLAMMATION. M. Gomez De Agüero Tamargo1, M. Vocanson1, A.
Kissenpfenning2, B. Malissen2, K. Dominique1, B. Dubois1. 1INSERM U
851, Lyon, France. 2Centre d'Immunologie Inserm-CNRS de MarseilleLuminy, France.
We previously reported that induction of CD8+ cytotoxic T cell
responses by skin immunization does not involve skin resident Langerhans
cells (LC) (Kissenpfennig et al. Immunity 2005) and requires recruitment
of inflammatory DC from blood (Le Borgne et al. Immunity 2006). In
particular, we showed using Langerin-DTR transgenic mice that LC
were dispensable for induction of contact hypersensitivity (CHS)
responses to the strong contact sensitizer DNFB. We now show using
the cross-reactive and tolerogenic hapten DNTB, and Langerin-GFP
and -DTR knock-in mice, that LC mediate hapten-specific skin CD8+
T cell tolerance and prevent CHS to this hapten. A single skin painting
with DNTB induces LC activation and emigration to skin draining
lymph nodes (dLN). Skin-derived LC constitute the major DC subset
that is present in dLN as soon as 24 hours after skin DNTB painting
and able to present the tolerogenic hapten to specific CD8+ T cells.
Remarkably, while skin immunization with DNTB is unable to prime
specific CD8+ effector T cells and results in lack of CHS, in vivo ablation
of LC induced by injection of Diphteria toxin into Langerin-DTR mice
allowed for priming of hapten-specific CD8+ CTL, indicating a tolerogenic
role for LC. Alternatively, repeated skin delivery of DNTB results in
the priming of CHS effectors cells and correlates with mobilization of
both LC and non LC Ag-presenting DC into dLN. Thus, LC induce Agspecific tolerance via the skin and this can be overcome by the mobilization
of other subsets of myeloid DC.
O-058
ACTIVATION OF CDCS INDUCES SPECIFIC PDC COOPERATION TO PROMOTE A COORDINATED IMMUNE RESPONSE.
B. Pérez-Cabezas1, P. Bastos-Amador1, M. Naranjo-Gomez1, M. Bofill2,
F. Carmona3, F. Nuñez4, R. Pujol-Borrell1, F.E. Borras1. 1Fundació Ins Inv
Germans Trias i Pujol, Badalona. 2Fundació Irsicaixa. 3Dpto Estadistica UB.
4UCTS, Ins Inv Vall d'Hebron, Barcelona.
Two well-characterized blood dendritic cell populations, conventional
(cDC) and plasmacytoid (pDC) have been described. Both populations
exhibit multiple differences including phenotype, TLR-expression and
cytokine and chemokine secretion. cDCs are highly efficient at exogenous
antigen presentation and they traffic from tissues to local lymph nodes
for antigen presentation via apherent lymphatic vessels. In contrast,
pDCs are less competent in antigen uptake, they are present in the
thymus and secondary lymph nodes and are rarely found in noninflamed tissues and apherent lymphatics. These marked differences
and some evidences reported by our and other laboratories suggest
specialized and may be complementary and coordinated functions
between DC subsets to induce a potent immune response.
AIMS. To verify the coordination between pDC and cDC in the
generation of immune responses, determining the mechanisms of pDCsconditioning by activated cDCs and looking for specific differences
depending on the cDC activation stimulus.
Methods. cDCs and pDCs were sorted from buffy coats obtained
from healthy blood donors. Sorted cDCs were stimulated with LPS
or R848 during 16h. Meanwhile, pDCs from the same donor were CFSElabeled and maintained in IL3. Then, CFSE-pDCs and stimulated-cDCs
were mixed (2:1) and co-cultured for additional 5h. CFSE-pDCs were
sorted again and the RNA was extracted for microarray analyses and
real time-PCR. Functional features of the conditioned-pDC included
phenotype changes, induction of alloproliferation and production of
IFNa.
Results. Phenotypically, activated cDC induced the up-regulation
of several maturation markers in pDCs, including CD25, CD83 and
CD86. Also, conditioning of pDC by activated-cDC promoted the
expression of several genes such as chemokines and proinflammatory
cytokines such as IL6. Qualitatively, the gene expression profile of pDCs
conditioned by LPS-cDCs or by R848-cDCs was very similar and both
were able to induce alloresponses. However, as expected, the higher
number of changes in gene expression was found when pDCs were
conditioned by R848-cDC.
Conclusions. Our results demonstrate that different types of cDC
activating factors promote specialized gene and functional activation
profiles in pDC that may in turn contribute to establish an appropriate
immune-regulatory environment.
Acknowledgments. This work is being supported by a grant from
the ‘‘Fondo de Investigaciones Sanitarias’’ FIS 06/0453 to FEB.
O-059
REDISTRIBUCIONES DE CÉLULAS DENDRÍTICAS Y MONOCITOS EN PACIENTES CON LLC-B ZAP-70+. M.Á. Sánchez Luengo,
G. Parada Hermoza, Z. Moreno Villegas, L. Ortega Moreno, D. Díaz
Martín, H. Barcenilla Rodríguez, A. Prieto Martín, J. Monserrat Sanz,
E. Reyes Martín, M. Álvarez De Mon-Soto. Dpto. Medicina, Unidad I+D
asociada UAH/CSIC/IMMPA, Alcalá de Henares.
Introducción. Las células dendríticas (DCs) son muy importantes en la protección frente a agentes infecciosos y en la defensa antitumoral, alteraciones en estas poblaciones celulares repercuten de manera muy significativa en estas respuestas. Una de las principales causas
de morbilidad y mortalidad en los pacientes con LLC-B son las infecciones producidas por agentes infecciosos.
Objetivos. Estudiar mediante la citometría de flujo las posibles
alteraciones en DCs y monocitos relacionadas con la expresión de ZAP70 en pacientes con LLC-B.
citometría de flujo de 4 colores en 34 pacientes con LLC-B que se categorizaron en ZAP-70+ (n=16) y ZAP-70– (n=18), los resultados se compararon con 18 controles sanos. Para la determinación inmunofenotípica de células dendríticas se utilizo un kit de enumeración de DCs,
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que permite discriminar entre DCs mieloides tipo I, tipo II y DCs plasmacitoides. En el caso de la determinación de monocitos se utilizó marcaje mediante CD14 y CD16 para discernir entre las distintas poblaciones de monocitos, y se evaluó la expresión en las diferentes poblaciones monocitarias de los marcadores de coestimulación CD80 y CD86,
y los marcadores de migración CX3CR1 y CD62L.
Resultados. En los pacientes con LLC-B ZAP-70+ se observó
respecto a los pacientes ZAP-70- y los controles sanos una disminución de las DCs mieloides tipo I (mDC 1) y una disminución de
las DCs plasmacitoides (pDC) contrarestada por un incremento
en las DCs mieloides tipo II (mDC 2). A su vez estos pacientes ZAP70+ presentaron también una importante redistribución de las poblaciones monocitarias con un descenso importante de los monocitos
clásicos CD14+hiCD16–, y de los monocitos CD14+highCD16+high y
CD14+highCD16+low presentando estas últimas poblaciones descensos importantes en la expresión de moléculas implicadas en la migración y coestimulación celular. El descenso observado en estas poblaciones monocitarias se debe al fuerte incremento en los pacientes
con LLC-B ZAP-70+ de los monocitos CD14+lowCD16+high y CD14CD16+high.
Conclusiones. Los pacientes con LLC-B y concretamente los ZAP70+ se caracterizan por presentar una fuerte alteración en el compartimento de DCs y monocitos que podría estar asociado al peor pronóstico de estos pacientes y una mayor susceptibilidad de sufrir infecciones.
O-060
LA VÍA CANÓNICA DE SEÑALIZACIÓN BMP PARTICIPA EN LA
MADURACIÓN DE LAS CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS.
V.G. Martínez, C. Hernández-López, L. Hidalgo, A. Entrena, J. Valencia, A. Zapata, A. Vicente, R. Sacedón, A. Varas. Facultad Medicina, Universidad Complutense, Madrid.
Objetivos. Las Proteínas Morfogenéticas Óseas (BMPs) son factores de crecimiento secretados bien conocidos por sus funciones durante el desarrollo embrionario, aunque cada vez son más las evidencias
que las implican también en procesos de diferenciación y proliferación
celular en tejidos adultos, incluyendo el sistema inmunitario. Parte
esencial de este sistema son las células dendríticas (DCs) por su elevado potencial inmunogénico. En este estudio, se pretende demostrar la
expresión y funcionalidad de la vía de señalización BMP en las células dendríticas humanas.
Material y Métodos. A partir de monocitos de sangre periférica
se obtuvieron células dendríticas inmaduras (iDCs) tras cultivo en AIMV suplementado con IL-4 y GM-CSF. La adición posterior de diferentes estímulos madurativos permitió obtener células dendríticas maduras (mDCs). La expresión y funcionalidad de los componentes de la
vía de señalización BMP se realizó por PCR cuantitativa. Los efectos
de la activación de la vía BMP en la supervivencia de iDCs y mDCs
fueron analizados por citometría de flujo tras cultivo con BMP-4. Asimismo, las iDCs se trataron con BMP-4 para analizar, por citometría
de flujo, ELISA y PCR cuantitativa, los cambios en expresión de marcadores de maduración, niveles de producción de citoquinas, y capacidad aloestimuladora.
Resultados. Tanto iDCs como mDCs expresaban los componentes de la vía de señalización BMP. El incremento en la expresión de
proteínas Id tras la estimulación con BMP-4 demostró que la vía de
señalización era funcional, y el pre-tratamiento con dorsomorfina
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indicó que ocurría mayoritariamente a través de la ruta canónica
de las proteínas Smad. El tratamiento con BMP4 disminuyó la tasa
de apoptosis fundamentalmente en iDCs, mediante un incremento
en la expresión de Bcl-2. La activación de la vía BMP en iDCs condujo a la adquisición paulatina de un fenotipo maduro por aumento en
la expresión de CD40, CD80, CD86, CD83, PD-L1 y PD-L2, acompañado de un incremento en la secreción de determinadas citoquinas y
de la capacidad aloestimuladora. Finalmente, se demostró en iDCs
la inducción mediada por BMP-4 de los factores de transcripción
de la familia Runx, cuyos niveles están incrementados en mDCs vs
iDCs.
Conclusiones. El presente estudio demuestra que la vía canónica
de señalización BMP está implicada en la maduración y supervivencia de las DCs humanas.
O-061
EFECTO IN VITRO DE LA LENALIDOMIDA (REVLIMID®) SOBRE
CÉLULAS HUMANAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENO CD1D
POSITIVAS. J. López Relaño, M. Gómez Del Moral, B. Abós Gracia,
E. Martínez-Naves. Facultad de Medicina Universidad Complutense de
Madrid.
Introducción. La Lenalidomida es un análogo de la Talidomida
con una reconocida función inmunomoduladora y antitumoral. Es usada en el tratamiento de diferentes cánceres hematológicos, síndromes mielodisplásicos y tumores sólidos. Se ha descrito su capacidad
de activar a las células NKT (Natural Killer T cells), un tipo de linfocito T con funciones inmunomoduladoras que reconoce antígenos lipídicos presentados por la molécula CD1d, expresada en células presentadoras de antígeno, principalmente células dendríticas y monocitos.
Objetivos. Estudiar el efecto de la Lenalidomida en el proceso de
diferenciación in vitro de monocitos a células dendríticas inmaduras
(iDCs) y a macrófagos.
Material y métodos. Se generaron iDCs y macrófagos a partir
de monocitos extraídos de Buffy coats de donantes sanos utilizando
GM-CSF e IL-4, en presencia o ausencia de Lenalidomida. Por citometría de flujo se analizó la expresión en superficie de las moléculas de
HLA no clásicas CD1d y CD1a; la molécula de HLA clásica HLA-DR;
y la molécula coestimuladora de la presentación antigénica CD86 durante el proceso de diferenciación de los monocitos a iDCs y macrófagos. Se estudió la expresión génica de las moléculas de CD1d y CD1a
durante el proceso de diferenciación, mediante la valoración de RNA
por la técnica de q-RT-PCR.
Resultados. Las iDCs generadas a partir de monocitos en presencia de Lenalidomida presentaron un aumento de la expresión en
superficie de las moléculas CD86 y HLA-DR, utilizadas como marcadores de maduración, con respecto a las células control. También
se observó un aumento de la expresión en superficie de la molécula
presentadora de antígenos lipídicos CD1d. Existió un aumento del
tránscrito del gen de CD1d observado mediante q-RT-PCR bajo estas
condiciones.
Conclusiones. La Lenalidomida modifica el proceso de diferenciación in vitro de monocitos a macrófagos, generándose iDCs con
una mayor expresión en superficie de las moléculas CD86 y HLADR, lo que sugiere un efecto positivo de la droga sobre la maduración de las DC y su capacidad presentadora. Así mismo, el efecto
de la Lenalidomida sobre el aumento de la expresión, tanto a nivel
de RNA como en superficie, de la molécula CD1d de las DC gene-
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INMUNOLOGÍA
radas a partir de monocitos, afectará a su reconocimiento por células NKT, como ya ha sido descrito en estudios de citotoxicidad anteriores.
O-062
CÉLULAS NKT HUMANAS RESPONDEN A CÉLULAS DENDRÍTICAS TRATADAS CON LÍPIDOS DEL POLEN DE OLIVO (OLEA
EUROPEAE) A TRAVÉS DE CD1D. B. Abós Gracia1, M. Gómez del
Moral1, J. López Relaño1, L. Castro de las Cuevas2, M.T. Villalba Díaz2,
E. Martínez Naves1. 1Facultad de Medicina, Universidad Complutense de
Madrid. 2Facultad de Química, Universidad Complutense de Madrid.
Introducción. CD1d es una molécula de tipo MHC no polimórfica que restringe a células NKT (Natural Killer T). CD1d presenta antígenos de naturaleza lipídica, tanto endógenos como exógenos, a células NKT.
El polen es uno de los principales agentes ambientales que puede
actuar como antígeno estimulando respuestas alérgicas. En este trabajo se muestra como las células NKT pueden responder a células dendríticas tratadas con lípidos del polen de olivo (Olea europeae) a través
de CD1d.
Objetivo. Estudiar si las células dendríticas (DCs) son capaces de
presentar antígenos lipídicos procedentes del polen de olivo a las células NKT.
Material y métodos. DCs inmaduras fueron generadas in vitro a
partir de monocitos de sangre periférica de donantes sanos mediante
su cultivo con GM-CSF e IL-4. iDCs se trataron durante 48 h con lípidos totales del polen de olivo, con la fracción polar (fosfolípidos –PLs–)
y la fracción apolar (triglicéridos –TGs–), separadas por cromatografía en capa fina (TLC). Las células NKT se expandieron a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), por cultivo con IL2 y α-Galactosilceramida. Se analizó la expresión en iDCs de las moléculas CD1a, CD1d, CD86 y HLA-DR, por citometría de flujo. Los niveles de ARNm de CD1D, CD1A, CD1B y CD1C fueron cuantificados
por PCR cuantitativa. Por último, se analizaron la producción de IL4 e IFN-γ (ELISA) y la citotoxicidad (detección con Lactato Deshidrogenasa –LDH–) de NKTs frente a iDCs tratadas con lípidos.
Resultados. Las iDCs tratadas con lípidos de polen de olivo incrementaron la expresión de CD1d y de CD86 respecto a las células control. El aumento de CD1d fue aún mayor con la fracción de fosfolípidos. La expresión de CD1a y HLA-DR no varió significativamente entre
las células tratadas con lípidos totales y las células sin tratar. Tampoco hubo variación con la fracción fosfolipídica y de triglicéridos. A nivel
transcripcional, la expresión génica de CD1D en iDCs tratadas con lípidos totales de polen fue mayor respecto a las células control. Por el
contrario, los niveles de tránscritos de CD1A, CD1B y CD1C disminuyeron. Las células NKT lisaron de forma eficiente las iDCs tratadas con
lípidos totales de polen, pero no las iDCs tratadas con PLs y TGs. En
cuanto a la producción de IFN-γ e IL-4 por las NKTs, se detectó un
aumento de ambas citoquinas en las iDCs tratadas con lípidos totales.
Conclusiones. Las iDCs tratadas con extractos lipídicos del polen
de olivo aumentaron la expresión de CD1d, siendo este aumento mayor
al tratar con la fracción de PLs. Esto apunta a los lípidos polares como
responsables de dicho aumento. Por otro lado, las NKTs fueron capaces de responder frente a los lípidos del polen, lisando las iDCs tratadas y produciendo además IFN-γ e IL-4.Todos estos datos sugieren que
las células NKT pueden jugar un papel importante en la respuesta
inmune frente a alergenos como el polen de olivo.
O-063
DIVERSIDAD FUNCIONAL DE LOS LIGANDOS DE NOTCH EN
LA GENERACION DE LOS DISTINTOS SUBTIPOS DE CELULAS
DENDRITICAS EN EL TIMO HUMANO. E. Martín Gayo1, M.J. García Leon1, B. De Andrés2, M.L. Gaspar2, M.L. Toribio García1. 1Centro
de Biología Molecular "Severo Ochoa", Madrid. 2Centro Nacional de Microbiología. Instituto de salud Carlos III, Madrid.
Previos estudios han identificado dos subtipos de células dendríticas (DCs) en el timo humano, plasmacitoides (pDCs) y convencionales (cDCs), cuya relación ontogénica sigue en debate. Nuestros trabajos previos indicaron que las cDCs derivan de los progenitores multipotenciales (MHPs) que colonizan el timo humano a través de una
ruta alternativa a la ruta linfoide T, que implica la generación de progenitores intermediarios con características mieloides. Estos progenitores han perdido el potencial pro-T (progenitores no-T) y mantienen
potencial NK y granulo-monocítico, pero su capacidad de generar
pDCs se desconoce. La generación de progenitores no-T se inhibe por
la señalización a través de receptores Notch, en favor de la generación
pro-T. Sin embargo, se desconoce el impacto de Notch en los progenitores no-T una vez generados, así como la función de Notch en la
generación de los subtipos de células intratímicas no-T a partir de ellos.
Con el fin de analizar estas cuestiones, hemos derivado sistemas experimentales de diferenciación in vitro de MHPs intratímicos humanos
CD34+ sobre células estromales de médula ósea (OP9) que carecen de
ligandos de Notch o expresan selectivamente el ligando Delta-like 1
(DLL1) o Jagged-1 (JAG1). Además, hemos realizado estudios de genómica comparativa por macroarrays para definir las relaciones ontogénicas de diferentes linajes intratímicos T y no-T. Nuestros resultados
indican que, en ausencia de ligandos de Notch, los MHPs se diferencian in vitro en progenitores no-T CD5loCD123+ que expresan genes
asociados con el linaje DC y con la vía de Notch y son capaces de generar células NK, cDCs y pDCs. Por el contrario, la señalización mediada por DLL1 inhibe la generación de progenitores no-T, aunque JAG1
la permite, y ambos ligandos promueven la supervivencia y expansión
de los progenitores CD5loCD123+ una vez generados. Finalmente, DLL1
y JAG1 regulan diferencialmente la generación de células NK, cDC y
pDC a partir de estos progenitores. En conclusión, nuestros datos
demuestran una función estadio-específica de los diferentes ligandos
de Notch y sugieren que su expresión diferencial en el timo humano
podría regular de forma nicho-específica la generación de diferentes
tipos de DCs y células NK a partir de un progenitor intratímico común.
O-064
CALICIVIRUS-LIKE PARTICLES MODULATE PORCINE DENDRITIC CELLS IN VITRO. E. Crisci1, C. Lorena1, L. Fraile1, T. Mussá1, J. Domínguez2, I. Mena3, J. Bárcena3, M. Montoya1. 1Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, Campus de la Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, Barcelona. 2 Dpto Biotecnología Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), Madrid.
3Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA), Madrid.
Objective. We have analyzed the immunogenic potential of viruslike particles (VLPs) from rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV)
in porcine bone marrow-derived dendritic cells (poBMDCs), as we
have previously described in mice(1).
Materials and Methods. VLPs from the capsid protein of RHDV
were generated and constructions correctly assembled into RHDV-
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VLPs. PoBMDCs were generated as previously described(2). Briefly,
poBMDC were generated by cultivating porcine bone marrow cells for
8 days in RPMI-1640 supplemented with 100 ng/ml recombinant porcine
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rpGM-CSF, R&D).
PoBMDCs were incubated with RHDV-VLPs at two different concentrations
(50 and 10 µg/ml) or stimulated with TLR-4 ligand (LPS, 10 µg/ml,
SIGMA) as positive control.
PoBMDCs in our assays were CD172a+ SLAI+, SLAII+, CD80/86+,
CD11R3+, CD16low, CD163low, CD1low, CD11R1– and CD4– . At four time
points (4, 8, 16, 24 hours) poBMDC phenotype and production of
cytokines (IFN-α, TNF-α, IL-18, IL6) were analysed.
Results. RHDV-VLPs-stimulated poBMDCs presented activated
phenotype compared with untreated cells. SLAII, SLAI, CD80/86
were up-regulated in a dose dependent manner after 24 hours as
compared with untreated cells. Moreover, RHDV-VLPs activated
poBMDCs for TNF-α, IFN-α, IL-18 and IL-6 secretion in a dose
dependent manner.
PoBMDCs were high responders to LPS and RHDV-VLPs compared
to unstimulated cell by cytokine secretion. Sequential kinetics were
induced whereby IFN-α peaked at 8 hours, IL-18 and TNF-α at 16
hours, and IL-6 production progressively increased after 4 hours up to
24 hours.
Conclusions. Our data showed that the RHDV-VLPs modulate
the poBMDCs response in vitro supporting their immunogenic potential
for new vaccine development against animal viral infections.
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by titration of infected cells-supernatants in Madin-Darby canine kidney
cells (MDCK) and by RT-qPCR of infected cells at 4, 8, 16, 24h and
48h pi.
Results. Porcine BMDC revealed a defined vacuolar aspect with
several dendritic processes in the cells by TEM. Control poBMDC in
our assays were CD172a +, SLAI +, SLAII +,CD1 low, CD4 –, CD11R1 –,
CD11R3low, CD14low, CD16low, CD40–, CD80/86+ and CD163low. Stimulation
with TLR agonists induced up-regulation of SLAI, SLAII and CD80/86
and different kinetic profile in secreted cytokines, being high responders
to Poly-IC and moderate responders to LPS. Infected-poBMDC presented
different phenotype by means of SLAI, SLAII and CD80/86 up-regulation.
Different cytokine kinetic profile of IFN-α, TNF-α, IL-18 and IL-12 were
observed depending on the virus used. No viral progeny was detected
in the supernatant of infected-DC. Ultrastructural changes were also
detected in influenza infected-DC at TEM.
Conclusions. The different responses observed in TLR-stimulated
or influenza infected poBMDC pave the way for understanding the
relation between those virus and porcine DC for triggering immune
response in swine, a crucial host in this viral infection.
O-066
EXOSOME CAPTURE AND PRESENTATION BY HUMAN PLASMACYTOID DENDRITIC CELLS. P. Bastos-Amador, B. Pérez-Cabezas, M. Naranjo-Gómez, R. Pujol-Borrell, F.E. Borràs Serres. Instituto de Investigación Germans Trias i Pujol , Badalona.
References
1. Crisci E. et al., Virology (2009).
2. Kekarainen T. et al., Vet Immunol Immunopathol (2008).
O-065
INFECTION BY SWINE, AVIAN AND THE PANDEMIC HUMAN
INFLUENZA A 2009 VIRUS DIFFERENTIALLY UP-REGULATE
SURFACE MARKERS AND CYTOKINE SECRETION ON PORCINE DENDRITIC CELLS IN VITRO. T. Mussá1, M. Pujol1, C. Rodríguez-Cariño1, L. Córdoba1, E. Crisci1, N. Busquets1, J. Maldonado2, J.
Dominguez3, L. Fraile1, M. Montoya1. 1Centro de Recerca en Sanidad Animal, Bellaterra. 2Laboratórios HIPRA. 3Departamento de Biotecnología, INIA
Introduction and objective. Dendritic cells (DC) link innate and
adaptive immune system, expressing specialized pattern-recognition
receptors which recognise particular pathogen-associated molecular
patterns. Furthermore, there is growing evidence that the so-called
“early” cytokines play an important role in influenza virus infection.
Our main goal was to characterize the interaction of porcine bone
marrow derived dendritic cells (poBMDC) with swine, avian and human
influenza virus in vitro.
Material and methods. Porcine BMDC were generated and DC
morphology and virus infection evaluated by transmission electron
microscopy (TEM). poBMDC were stimulated with TLR agonists (PolyIC, LPS, R837 or CpG or infected with 104 TCID50/f the following viruses
A/Swine/Spain/80598-LP1/2007(H3N2), pandemic A/Catalonia/63/
2009(H1N1),high pathogenic A/Ckicken/Italy/13474/99(H7N1) and
low pathogenic A/Anas plathyrhynchos/Spain/1877/2009(H7N2).
TLR agnonists-stimulated cells were analysed by flow cytometry at
24h whereas infected-DC phenotype was analysed at 16 and 24 hours.
IFN-α, TNF-α, IL-12 and IL-18 secretion were analysed by ELISA at
4, 8, 16 and 24 hours post infection (pi). Virus replication was evaluated
36
Introduction. Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) constitute a
minor population of blood cells whose best-known function is the
secretion of IFN-I in response to viral infections. It has been broadly
shown that pDCs are also capable of antigen presentation. Yet, the
ability of these cells to capture and present exogenous antigens has not
been addressed. Several authors have demonstrated that pDCs may
capture soluble proteins or antigens bound to antibodies. Recently,
their ability to phagocytose and present antigens entrapped into
microparticles has been reported. Since exosomes were described as
vesicles bearing functional MHC-peptide complexes the interest in the
study of their function has increased enormously. These particles (50100nm) have an endocytic origin, are secreted by several cell types and
might function as a mechanism to spread alloantigens between dendritic
cells.
Aim. To evaluate exosome capture by human plasmacytoid dendritic
cells.
Methods. Peripheral dendritic cells were isolated from blood of
healthy donors by sorting. Fluorescent exosomes were purified from
supernatants of Jurkat T cell line labeled with the lipophilic probe
Vybrant Dio. Capture of exosomes were performed at 37ºC or 4ºC as
control. The uptake was analyzed by flow cytometry and confocal
microscopy. After 24 hours of capture, pDCs were incubated with
autologous T cells (ratio 1:20) to measure exo-induced proliferation
using CFSE loss as a marker.
Results. pDCs capture exosomes in a temperature dependent
manner, although not as efficiently as their counterparts conventional
dendritic cells. In some samples exosome capture by pDCs may reached
nearly 70% at 24h but it was never as efficient as obtained for cDCs
which could be nearly 90% positive for Vybrant Dio-labeled exosomes
at shorter time points (12h). Exosome uptake doesn’t induce nor prevent
pDCs maturation induced by specific stimuli. Finally, pDCs are able
to present alloantigens derived from exosomes.
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INMUNOLOGÍA
Conclusions. Recent data pointed out pDCs as a critical cell type
in tolerance induction in transplantation and autoimmunity. Capture
of exosomes by pDCs may represent a way of alloantigen presentation
for tolerance induction or graft rejection. The mechanism of interaction
between pDCs and exosomes and their consequences need further
studies.
SESIÓN 8: INMUNOGENÉTICA
Moderadores: M. Dolores de Juan (San Sebastián)
Manuel Muro (Murcia)
O-067
ARTRITIS REUMATOIDE: PREDICCIÓN DEL RIESGO PRODUCIDO POR LA COMBINACIÓN DE FACTORES AMBIENTALES
Y GENÉTICOS. J. Varade López1, L. Rodríguez1, M. Fuentes Ferrer1,
A. Balsa2, S. Cano3, D. Pascual-Salcedo2, B. Fernandez-Gutierrez3, E.
Gomez de la Concha3. 1Hospital Clinico San Carlos, Mostoles. 2Hospital
Universitario La Paz, Madrid. 3Hospital Clinico San Carlos, Madrid
Introducción. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune de etiología compleja con múltiples factores, tanto ambientales como genéticos, implicados en su desarrollo. El locus HLA-DRB1
es el principal contribuyente a su desarrollo. Otras regiones involucradas en la susceptibilidad a AR son PTPN22, STAT4, TRAF1/C5 o
OLIG3/TNFAIP3. Dado que los polimorfismos de riesgo asociados a
AR solamente incrementan moderadamente la predisposición la combinación de estos factores junto con otros factores ambientales podría
ayudar a anticipar el diagnóstico de esta enfermedad.
En este trabajo analizamos el riesgo de desarrollar la enfermedad combinando la información de múltiples variantes genéticas y
ambientales asociadas a la AR.
Material y métodos. Para ello analizamos 737 pacientes de AR y
489 individuos sanos como controles. El genotipado de polimorfismos
de un solo nucleótido (SNPs) localizados en los loci PTPN22 (rs2476601),
STAT4 (rs7574865), 6q23 (rs6920220 y rs10499194 y TRAF1/C5 (rs3791847)
se realizó mediante sondas TaqMan. La caracterización de los alelos
HLA-DRB1 se realizó por tecnología Luminex. La presencia de anticuerpos frente a péptidos citrulinados (anti-CCP) fue analizada por
ELISA. La información sobre el hábito tabáquico se obtuvo mediante
encuesta. Las OR fueron calculadas mediante regresión ordinal con el
número de alelos de riesgo como variable independiente para analizar el desarrollo de la enfermedad. El análisis de tendencias se realizó
mediante el test de x2.
Resultados. Los individuos portadores de varios factores de susceptibilidad presentar un riesgo incrementado a padecer AR respecto al observado para cada marcador de forma independiente (p=2.8x109; OR: 3.69 vs. 2.56-1.42 respectivamente), siendo este efecto más pronunciado en los individuos que presentan anticuerpos anti-CCP
(p=1.08x10-7, OR= 4.58). O más acentuado incluso en los individuos
que son o han sido fumadores (p=0.0004, OR=6.28), observándose en
este último caso un efecto similar al encontrado al estratificar la cohorte simultáneamente por presencia de anticuerpos anti-CCP y el hábito tabáquico (p=0.0005; OR=6.38).
Conclusiones. Nuestros datos sugieren que el tabaco actúa principalmente mediante la inducción de la generación de epítopos citrulinados.
O-068
ASOCIACIÓN DEL GENOTIPO IL-10/TNFA EN PACIENTES DE
ARTRITIS REUMATOIDE CON LA RESPUESTA CLÍNICA A CORTICOIDES, NIVELES DE CITOCINAS Y CÉLULAS TREG. B. de
Paz Cazón1, M. Alperi López2, F.J. Ballina García2, C. Prado Cueto1,
C. Gutiérrez Martín2, A. Suárez Díaz1. 1Universidad de Oviedo, Oviedo.
2Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo.
Objetivos. Analizar la posible influencia de los genotipos funcionales de IL-10 y TNFα en la respuesta clínica al tratamiento en pacientes de artritis reumatoide (AR) así como su efecto sobre los niveles
de citocinas y células Treg.
Métodos. Se determinaron los polimorfismos genéticos presentes
en el promotor de IL-10 (-1082G/A) y TNFα (-308G/A) mediante amplificación e hibridación con sondas aleloespecíficas. Los niveles séricos
de citocinas se cuantificaron mediante ELISA, el porcentaje de células
CD4+CD25high por citofluorimetría y la expresión de Foxp3 mediante
RT-PCR a tiempo real. La respuesta clínica tras 6 meses de tratamiento (n= 125) se determinó mediante el cambio en la actividad de la enfermedad (ΔDAS28) y el porcentaje de respuesta al tratamiento (ACR).
Resultados. Mediante análisis de regresión lineal se encontró que
el genotipo alto productor de IL-10 se asocia con una mayor respuesta al tratamiento, específicamente a la terapia con prednisona (p=0,0003).
El estudio del efecto combinado de los polimorfismos de ambas citocinas indicó una asociación del genotipo alto IL-10/bajo TNFα con la
buena respuesta a este tratamiento (p=0,001). Por otra parte, la cuantificación de citocinas séricas mostró niveles incrementados de TNFα,
IL-6 e IL-18 en pacientes (n=196) comparados con controles, encontrándose una disminución de TGFβ e IL-10. Sin embargo, en los pacientes analizados al diagnóstico (n=32) sólo se encontraron diferencias
significativas en los niveles de IL-6 y TGFβ. No se encontraron diferencias en los niveles de IL-17, el porcentaje de células CD4+CD25high
y la expresión de Foxp3. El tratamiento recibido por los pacientes no
mostró efectos significativos sobre los niveles de citocinas o de células
Treg. Sin embargo, los pacientes tratados con prednisona portadores
del genotipo buen respondedor a corticoides presentaron niveles más
elevados de TGFβ, FoxP3 y células Treg que los pacientes con otros
genotipos, mientras que los niveles relativos de TNFα e IL-17 eran
menores.
Conclusión. Los pacientes de AR con el genotipo alto productor
de IL-10/bajo de TNFα presentan una mejor respuesta al tratamiento con prednisona, que puede ser debida, al menos en parte, a un incremento en los niveles de Foxp3 y células Treg junto con una reducción
de mediadores inflamatorios.
O-069
PATRÓN DE EXPRESIÓN DE MICRORNAS EN CÉLULAS CD4
DE PACIENTES CON LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO. J.M.
Lucena, A.M. Escalera Cardenas, C. Abad Molina, A. Nuñez Roldan,
J.R. García Lozano, M.F. Gonzalez Escribano. Hospital Universitario
Virgen Del Rocio, Sevilla.
Objetivo. Determinar el patrón de expresión de microRNA en
células T CD4+ de sangre periférica en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES).
Material y Métodos. Se incluyeron muestras de 7 pacientes con
LES: 4 asintomáticos y 3 en fase activa y 3 controles sanos. Las células T CD4+ se aislaron a partir de sangre periférica mediante micropar-
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tículas magnéticas conjugadas con anti-CD4. El RNA se obtuvo con el
miRNeasy Mini Kit separándolo en dos fracciones: una que contiene
el RNAm y otra con los RNA de menos de 200 nucleótidos que incluye los microRNA. El cDNA se sintetizó con sistema Multiplex RT y el
análisis de expresión se realizó mediante Real-Time PCR con las tarjetas microfluídicas TaqMan® Low Density Array A Human MicroRNA
Panel v2.0 que incluyen 378 microRNA. El análisis estadístico se realizó con el programa StatMainer. Como controles internos se utilizaron RNU48, RNU44 y U6.
Resultados. El microRNA U6 tuvo que ser descartado como control interno porque se obtuvieron diferencias significativas en cuanto
a su nivel de expresión entre el grupo de pacientes y controles. Los
microRNA, miR-224, miR-143, miR-376c y miR-485-3p se encontraron
sobreexpresados en pacientes con LES respecto a controles sanos. El
microRNA, miR-576-5p, por el contrario, presentaba una expresión
más baja en pacientes con LES que en controles sanos.
Conclusiones. Las células T CD4+ de sangre periférica de pacientes con LES presentan un patrón de expresión de microRNA distinto
al de población sana.
O-070
ASOCIACIÓN DEL GEN TNF∞ CON LA SÍNTESIS INTRATECAL
DE IGM EN PACIENTES DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE. M. L. Cavanillas1, J.C. Álvarez-Cermeño2, M. Bartolomé1, M. Espiño2, R. Arroyo1,
E. Urcelay1, L.M. Villar2. 1Hospital Clínico San Carlos, Madrid. 2Hospital
Ramón y Cajal.
Introducción. La heterogeneidad entre los pacientes de esclerosis
múltiple (EM) en el curso de la enfermedad y en la respuesta a fármacos, podría reflejar distintos mecanismos patogénicos derivados de
una heterogeneidad genética. Esta diversidad también se evidencia al
estudiar las bandas oligoclonales IgM. La síntesis intratecal de IgM se
produce en un 40% de los pacientes de EM que presentan brotes y está
relacionada con un curso más agresivo.
El factor de necrosis tumoral α (TNFα) es una citoquina secretada
por macrófagos activados presente en lesiones crónicas y agudas de
EM. Existe síntesis intratecal de TNFα en pacientes con EM, y el nivel
de esta citoquina en LCR podría correlacionar con la progresión de la
enfermedad, pues su secreción aumenta durante los brotes.
Estudios en distintas poblaciones caucásicas asociaron polimorfismos del promotor del gen TNFα, localizado en el complejo HLA,
con la susceptibilidad a EM independientemente del HLA-DRB1*1501.
Objetivo. Analizar si la síntesis intratecal de anticuerpos IgM oligoclonales pudiera asociarse con polimorfismos del gen TNFα.
Material y métodos. El estudio se realizó en 44 pacientes de EM
con bandas oligoclonales IgM restringidas en LCR (M+), en 100 pacientes sin dichos anticuerpos (M-) y en 600 controles. Se procedió al genotipado de 4 polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) del promotor
del gen TNFα, utilizando tecnología Taqman y se analizaron también
dos microsatélites. El genotipado de las muestras de EM fue ciego para
el estatus IgM de los pacientes. El análisis estadístico se realizó con el
test Chi-cuadrado (Epi Info v. 6.02). Las frecuencias haplotípicas fueron estimadas con el algoritmo de expectación-maximización (Haploview 6.0).
Resultados. Los SNPs TNF-238 y TNF-376 mostraron diferencias
significativas en sus frecuencias alélicas entre los dos grupos de EM
(29M+ y 59M–) en una primera población y la replicación en una población independiente obtuvo resultados concordantes. El análisis global
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evidenció diferencias fuertemente significativas al comparar las frecuencias alélicas entre los grupos M+ y M– (TNF-238: 19% vs. 4%; p=
0.0003 y TNF-376: 17% vs. 2%; p=0.0002). Las frecuencias de los alelos
minoritarios de TNF-376 y TNF-238 se asociaron con una OR de 3.97
(p=9.6x10-6) y de 2.54 (p=0.0034), al comparar el grupo M+ con el grupo de controles. El análisis haplotípico con los dos microsatélites no
aportó información adicional.
Conclusión. La frecuencia del alelo TNF-376A aumenta casi 4 veces
en el grupo de pacientes de EM con síntesis intratecal de IgM.
O-071
ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS FUNCIONALES DEL GEN LILRA3 (ILT6) POR SECUENCIACIÓN DIRECTA. D. Ordóñez Del Valle,
C. Vilches Ruiz. Hospital Universitario Puerta de Hierro, Madrid.
En el Leukocyte Receptor Complex (LRC, 19q13.4) se encuentran
varias familias génicas de receptores del Sistema Inmunológico (LILR,
LAIR y KIR) que activan o inhiben a diferentes subpoblaciones leucocitarias linfoides y mieloides, y que reconocen principalmente moléculas HLA de clase I. El gen A3 de la familia LILR (denominado previamente ILT6, LIR-4, CD85e o HM43) presenta en el 23,3% de los españoles una deleción de 6’7 kb que afecta prácticamente a toda su región
codificante. Esta deleción se asocia de manera significativa a un mayor
riesgo de padecer ciertas enfermedades autoinmunes, como la Esclerosis Múltiple (EM) o el Síndrome de Sjögren. Nosotros hemos demostrado que el riesgo de padecer EM se ve potenciado (Odds Ratio = 9,2;
95% CI = 4.08 - 20.75; p-valor < 10-6) por la presencia conjunta de la
deleción de LILRA3 y del alelo HLA-DRB1*1501.
Por otra parte, en la población japonesa son frecuentes las inserciones y los cambios de base que alteran el marco de lectura de LILRA3. Estas alteraciones tienen un significado biológico idéntico a la
presencia de la deleción porque inactivan funcionalmente a LILRA3.
Además, en la población caucasoide británica se han descrito varios
polimorfismos en la secuencia codificante de LILRA3 que inducen cambios de aminoácido.
La identificación de todas estas variaciones requiere un análisis
preciso del gen completo, tanto de sus regiones codificantes, como
de las no codificantes. En este trabajo presentaremos un método de
obtención y análisis de la secuencia genómica de LILRA3 mediante una
PCR de larga distancia que cubre toda su porción codificante (4,95 Kb),
así como un resumen de los resultados obtenidos hasta el momento.
*Este trabajo ha sido financiado por un proyecto de investigación de la Fundación LAIR
O-072
VARIACIONES GENÉTICAS EN IL28B E INFECCIÓN DEL VIRUS
DE LA HEPATITIS POR DIFERENTES GENOTIPOS VIRALES. C.
Abad Molina, M.A. Montes Cano, J.R. García Lozano, M. Romero
Gomez, N. Barroso, J. Aguilar Reina, A. Nuñez Roldan, M.F. Gonzalez Escribano. Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla.
Introducción. Factores genéticos del hospedador pueden modificar el curso de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC). Recientemente, se ha asociado el locus IL28B con la respuesta al tratamiento en personas infectadas con el VHC.
Objetivo. Investigar la relación del locus IL28B con la infección
por VHC.
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INMUNOLOGÍA
Material y Métodos. Se incluyeron un total de 731 individuos: 284
con infección persistente (210 infectados por genotipo viral 1 y 66 por
genotipo viral no-1), 69 individuos aclaradores espontáneos y 378 no
infectados como grupo control. Los datos de respuesta al tratamiento
se conocían en 219 pacientes, 113 de ellos tenían una respuesta sostenida al tratamiento y 106 no la presentaban. El genotipado se realizó
usando sondas Taqman. La comparación de la distribución de frecuencias genotípicas y alélicas se realizó mediante x2.
Resultados. El genotipo CC se encontró aumentado en: a) Pacientes infectados por genotipo viral no-1 (66.7% frente a 39.1% en pacientes infectados por el genotipo viral 1, p = 8.5 x 10-5, OR = 0.32, 95%CI
0.17-0.60); b) Pacientes que presentan aclaramiento viral espontáneo
(72.5% frente a 45.6% de los individuos que presentan infección persistente, p = 6.2 x 10-5, OR = 0.32, 95%CI 0.18-0.57); y por último, c)
Pacientes con respuesta sostenida al tratamiento (60.2% frente a 32.1%
encontrado en pacientes que no tienen una respuesta sostenida al
tratamiento, p = 3.2 x 10-5, OR = 0.31, 95%CI 0.17-0.56)
Conclusión. Nuestros resultados sugieren una preferencia del genotipo viral por infectar a determinadas variantes de IL28B, así como asociación de este locus a la respuesta natural y mediada por tratamiento.
O-073
ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS EN EL GEN IRF5 EN SUBGRUPOS DE PACIENTES CON ESCLEROSIS MÚLTIPLE. M.D.C. Cénit
Laguna1, K. Vandenbroeck2, I. Alloza2, A. Antigüedad3, D. Otaegui4,
J. Olascoaga4, M. García Barcina3, V. De Las Heras1, R. Alvarez-Lafuente1, M. Fernández-Arquero1. 1Hospital Clínico San Carlos, Madrid. 2Neurogenomiks, Universidad del País Vasco. 3Hospital de Basurto. 4Inst. Investigación Sanitaria Biodonostia.
Objetivos. La Esclerosis Múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crónica desmielinizante que afecta al sistema nervioso central.
Aparece en individuos genéticamente predispuestos tras la exposición
a ciertos factores ambientales. Solamente se conoce el 50% de la carga genética responsable de dicha enfermedad. Esto pudiera ser debido, entre otras causas, a la existencia de genes que afecten solamente
a un subgrupo de pacientes o a genes cuyo efecto se vea modificado
por la interacción con otros genes o con el ambiente. El gen IRF5 ha
sido asociado a varias enfermedades de carácter autoinmune. Un reciente estudio mostró asociación de polimorfismos en IRF5 con la susceptibilidad a padecer EM.
Evaluamos la asociación de polimorfismos en IRF5 con la susceptibilidad a EM y analizamos su posible asociación con el subgrupo
de pacientes de EM con replicación activa de Herpes Virus 6 (HHV6A) y con el grado de respuesta a interferón-β.
Materiales y métodos. Genotipamos los SNPs rs4728142 y
rs3807306 en 1496 pacientes de EM y 1506 controles mediante tecnología TaqMan. Los pacientes tratados con interferón-β fueron clasificados como respondedores y no respondedores a dicha terapia atendiendo a criterios clínicos. Mediante PCR cuantitativa a tiempo real se
determinó la presencia del HHV-6A en suero. Se comparan las frecuencias génicas mediante el test x2.
Resultados. El análisis combinado de nuestros datos con los del
estudio previo publicado muestra la asociación de los polimorfismos
rs4728142 y rs3807306 con la susceptibilidad a padecer EM (ORMantelHaenszel=1,14 (p≤ 0,002)).
Observamos que la frecuencia del alelo rs3807306T está significativamente incrementada en el subgrupo de pacientes con replicación
activa del HHV-6A con respecto al subgrupo de pacientes que no presentan replicación (p=0,05) y con respecto a controles (p=0,016, OR
(95% CI)= 1,61 (1,07- 2,43)).
Además, la frecuencia del alelo rs3807306T parece incrementada
en el subgrupo de pacientes respondedores a interferón-β con respecto a los pacientes no respondedores (p=0,09) y con respecto a controles (p=0,15, OR (95% CI)= 1,24 (0,91- 1,68)).
Conclusiones. El efecto descrito en EM del gen IRF5 parece deberse principalmente al subgrupo de pacientes que presentan replicación
del HHV6-A. El gen IRF5 pudiera tener cierto papel en el grado de respuesta a interferón-β.
O-074
ANÁLISIS DEL REPERTORIO DE PÉPTIDOS ASOCIADOS A
HLA-DR EN BAZO HUMANO. J.A. Collado Miguens, I. Álvarez
Pérez, L. Muixí Ponsà, M. Carrascal Pérez, D. Jaraquemada. Universidad Autónoma de Barcelona, Bellaterra.
Introducción. El bazo es el principal órgano linfoide secundario
donde se desarrolla la respuesta inmune adaptativa frente a antígenos procedentes del torrente sanguíneo. Para ello es necesaria la intervención de los linfocitos T CD4+, que responden a complejos formados por las moléculas de MHC de clase II propio con péptidos
antigénicos procedentes de patógenos o proteínas propias alteradas.
En condiciones no patológicas, las células presentadoras muestran
péptidos propios a los linfocitos T. El conjunto de estos péptidos es
representativo de los proteomas celulares presentes en el bazo, así
como del material extracelular captado por las APCs. Aunque hay
una gran base de datos sobre los péptidos asociados a moléculas de
HLA en células linfoblastoides, sólo recientemente se ha empezado
a abordar el análisis sistemático de los repertorios peptídicos asociados a moléculas de HLA procedentes de tejido humano, aunque aún
no hay estudios sobre qué péptidos se presentan en bazo en ausencia de infección.
Objetivo. Estudio del repertorio de péptidos asociados a HLA de
clase II, presentados en condiciones fisiológicas, en el bazo humano
Material y métodos. Se partió de muestras de tejido congeladas
(N=3) que se sometieron individualmente a un proceso de homogenización mecánica y se lisaron en presencia de un detergente no iónico
(NP-40) para la solubilización de los complejos péptido-MHC. Se hizo
una inmunopurificación del lisado con un anticuerpo anti-HLA-DR
(B8.11.2), acoplado a sefarosa. Se eluyeron los complejos pMHC en condiciones ácidas, desnaturalizando todo el complejo. Los péptidos asociados al HLA-DR se purificaron mediante ultrafiltración utilizando
centricones con un tamaño de corte de 10kDa. Los péptidos purificados se desalaron y se fraccionaron por SCX-HPLC. Las diferentes fracciones peptídicas se analizaron por espectrometría de masas en un LTQ
acoplado “on line” a una RP-HPLC para una mejor resolución de los
espectros de secuenciación.
Resultados. Se han secuenciado 1678 péptidos correspondientes
a 646 proteínas, algunas comunes entre las diferentes muestras. Los
datos han permitido el estudio de la procedencia de las proteínas
parentales, la distribución de tamaño y la importancia de la ruta de
presentación de los péptidos asociados a HLA-DR en condiciones
fisiológicas. Los repertorios fisiológicos de péptidos de clase II provenientes de bazo humano se han comparado con sistemas no fisiológicos como son las líneas celulares linfoblastoides. Los datos muestran un gran solapamiento de los repertorios de cada alelo estudia-
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do, con una diferencia notable: un porcentaje considerable de péptidos del bazo (entre el 34 y el 56%) proceden del espacio extracelular, de proteínas parentales tanto solubles como componentes del citoesqueleto.
Conclusiones. Se presenta el mayor análisis del repertorio peptídico asociado a HLA-DR en un tejido linfoide secundario. A pesar de
ser muestras heterozigotas, la asignación a alelo de los péptidos ha
sido posible. Los péptidos provienen principalmente de proteínas expresadas en células B y de suero y mayoritariamente degradadas en la vía
endocítica. La característica principal de estos repertorios en comparación de los datos estándar utilizados hasta ahora para definirlos, es
la presencia de péptidos de origen extracelular.
O-075
IMPLICACIÓN DE LA MOLÉCULA PDCD1 EN LA RESPUESTA
AL TRATAMIENTO DE LA INFECCIÓN CRÓNICA POR EL VIRUS
DE LA HEPATITIS C. J.R. Vidal Castiñeira, A. López Vázquez, R. Diaz
Peña, R. Pérez, C. López Larrea. Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo.
Objetivos. PDCD-1 (programmed cell death-1) es una molécula
reguladora inhibidora de linfocitos T. Varios estudios han descrito una
asociación de diversos polimorfismos del gen PDCD-1 con una serie
de enfermedades autoinmunes, como el lupus eritematoso sistémico
o la artritis reumatoide, así como en infección por CMV en trasplantados renales. El presente trabajo tiene como objetivo analizar la posible
implicación de los polimorfismos de PDCD-1 y sus haplotipos, con
la respuesta al tratamiento de la infección crónica por el virus de la
Hepatitis C (HCV).
Material y métodos. Se incluyeron en este estudio 274 pacientes
con infección por HCV. Estos pacientes fueron monitorizados durante el tratamiento combinado (Peg-IFN-Alpha y rivabirina) y durante
el periodo post-tratamiento. Al final de este periodo se clasificaron en
no respondedores (NR) y en respondedores (R) en función de la presencia de RNA-HCV en suero. Se analizaron los polimorfismos PD-1.3
G/A, PD-1.5 C/T y PD-1.9 T/C mediante PCR-RFLP. La expresión de
PD-1 en CD4+ y CD8+ se determinó mediante citometría de flujo en 32
pacientes. Las frecuencias haplotípicas se determinaron mediante el
programa PLINK.
Resultados. 121 pacientes se clasificaron como NR y 153 pacientes alcanzaron una respuesta sostenida. Encontramos una distribución
de PD-1.3 diferente en los 2 grupos. PD-1.3 A estaba aumentado en
pacientes respondedores mientras que PD-1.3 G estaba aumentado en
pacientes NR (p=0.008, OR= 2.97, 95% CI=1.28-7.07). No se encontró
ninguna asociación adicional con la respuesta al tratamiento viral. Se
observó además que el haplotipo CGC (wild-type) se encontraba más
aumentado en pacientes NR frente a pacientes que respondían adecuadamente al tratamiento (p<0.05, OR= 1.73, 95% CI=1.04-2.88). Finalmente observamos que los pacientes con el polimorfismo PD-1.3 A presentaban una menor expresión PD-1 en CD8+ en comparación con el
wild-type.
Conclusiones. Con este estudio identificamos un nuevo factor
genético asociado a la respuesta al tratamiento viral de la infección
por HCV. La presencia del polimorfismo PD-1.3 A, asociado a una
menor expresión de PD-1, parece condicionar una mejor respuesta
al tratamiento de la infección por HCV, probablemente a causa de
una menor inhibición de la respuesta mediada por linfocitos CD4+
y CD8+.
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VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
O-076
CONTRIBUCIÓN DE MARCADORES SNPS A LA SUSCEPTIBILIDAD A ESPONDILITIS ANQUILOSANTE EN LA REGIÓN CROMOSÓMICA 19Q13. R. Díaz Peña1, A.M. Aransay Bañares2, J. Bruges Armas3, C. López Larrea1. 1Unidad de Histocompatibilidad y Trasplante, Servicio de Inmunología, Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo, Asturias. 2Unidad de Genómica Funcional, CIC bioGUNE, Parque Tecnológico de Bizkaia, Derio, Bizkaia. 3Servicio Especializado de Epidemiología
y Biología Molecular, Hospital de Santo Espírito de Angra do Heroísmo, Angra
do Heroísmo, Azores, Portugal
Objetivos. Este estudio fue diseñado con el objetivo de llevar a
cabo un genotipado de alta densidad mediante marcadores SNP en
población HLA-B27 positiva dentro de la región cromosómica 19q13
y observar su asociación con EA. También se analizaron otros genes
candidatos, como IL23R, ERAP1, IL17A, IL10RA, IL17RA, TNFRSF11B,
TNFSF11, TNFRSF11A, NOD2, CYP2D6, y otras regiones cromosómicas en las que se localizan genes de interés, como el cromosoma 5q (IL3,
CSF2, IL4, IL5 y IL13), el cromosoma 21q (IL10RB, IFAR2, IFNAR1 y
IFNGR2) y el cromosoma 2 (genes de familia IL1).
Material y métodos. Se analizaron 249 pacientes EA y 302 controles sanos, HLA-B27 positivos. Se diseñó un panel a la carta que contenía 1536 tag SNPs entre los genes y regiones candidatas seleccionadas,
basándose en las frecuencias alélicas europeas descritas por el proyecto HapMap. El genotipado de alta densidad se llevó a cabo utilizando
la tecnología Golden-Gate (Illumina-Inc.’s). Todos los individuos fueron tipados para HLA-B.
Resultados. Dos SNPs (rs8111398 y rs1055234) en dos genes diferentes (LAIR2 y CNOT3) revelaron asociaciones significativas con EA
(P<10-3). Análisis de haplotipos también revelaron implicación de regiones en EA: Región comprendida entre los genes CDC42EP5 y LAIR2
(~15.5 kb; P<0.0005); y entre CNOT3 y TMC4 (~6.7 kb; P<0.001). Además, definiendo bloques haplotípicos, 2 bloques de 2 y 3 SNPs localizados entre los genes CDC42EP5 y LAIR2 mostraron asociacion con
EA (P=9.0x10-4 y P = 0.001, respectivamente).
Conclusiones. El trabajo permitió encontrar regiones localizadas
dentro del cromosoma 19q asociadas a EA. Estas regiones se localizan
próximas a genes candidatos en la susceptibilidad a EA, concretamente LAIR2 y CNOT3. En el estudio se hipotetiza con el papel que LAIR2
podría tener en el incremento de la susceptibilidad a EA, ya que es
capaz de unir péptidos de colágeno, pudiendo actuar de mediador
proinflamatorio.
O-077
IDENTIFICACIÓN DE LIGANDOS DE HLA-DR DERIVADOS DE
LA SEMENOGELINA-1 EN TIMO HUMANO. I. Álvarez1, R. Colobrán2, J. Collado1, F. Canals3, B. Kyewski4, R. Pujol-Borrell2, D. Jaraquemada1. 1Unitat dÍmmunologia. Institut de Biotecnologia i Biomedicina.,
Bellaterra. 2Institut dÍnvestigació en Ciències de la Salut Germans, Trias i
Pujol. 3Institut dÓncologia. Hospital Vall d´Hebron. 4German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany.
Objetivos. El timo es el órgano linfoide donde maduran los linfocitos T y se genera el repertorio inmunocompetente. Para que los linfocitos T no reconozcan tejidos propios en periferia, los timocitos sufren
procesos exhaustivos de selección en el timo, donde los TCRs interaccionan con complejos de MHC-péptidos propios. Para generar tolerancia, los péptidos deberían representar todos los potenciales ligan-
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INMUNOLOGÍA
dos de los linfocitos T en periferia, incluyendo aquellos derivados de
antígenos específicos de tejido (TRAs). La expresión de algunos TRAs
se regula por el Autoimmune Regulator (AIRE). En este trabajo nos
hemos propuesto describir el repertorio peptídico asociado a HLA-DR
en timo humano y comprobar la existencia de péptidos asociados a
HLA-DR provenientes de TRAs.
Material y métodos. Se utilizaron muestras de timos procedentes
de cirugía cardíaca pediátrica. El tejido se homogeneizó y los péptidos
asociados a las moléculas de HLA-DR se purificaron mediante cromatografía de inmunoafinidad y ultrafiltración. Para la identificación
de los péptidos asociados a HLA-DR, las muestras peptídicas se analizaron por espectrometría de masas de trampa iónica. Se realizaron
experimentos de PCR cuantitativa (qPCR) para estudiar la transcripción de autoantígenos en diferentes muestras.
Resultados. Se identificaron 131 ligandos naturales de HLA-DR
de timo humano. La mayoría de péptidos provenían de proteínas de
membrana o extracelulares. Se identificaron dos péptidos (que forman
un nested set) procedentes de la semenogelina 1 (codificado por el gen
SEMG1), una proteína abundante en el semen y potencial TRA. Mediante qPCR se confirmó que la semenogelina-1 es un TRA dependiente de
AIRE. Se confirmó la transcripción de la SEMG1 en timo al mismo nivel
que otros TRAs. La expresión de SEMG1 estaba restringida a una población de células epiteliales tímicas medulares (mTECs) con niveles altos
de MHC de clase II.
Conclusión. Mediante el uso de espectrometría de masas y qPCR
hemos identificado un ligando natural de HLA-DR procedente de la
semenogelina-1 en timo humano. La semenogelina-1 es un TRA con
expresión tímica similar a otros autoantígenos. La expresión de SEMG1
es dependiente de AIRE. La población celular que expresa SEMG1 es
una población de mTECs de alta expresión de MHC de clase II.
SESIÓN 9: INMUNODEFICIENCIAS I
Moderadores: Manel Juan (Barcelona)
Margarita López Trascasa (Madrid)
O-078
NUEVAS MUTACIONES EN EL GEN TNFRSF6 EN PACIENTES
ESPAÑOLES CON SINDROME LINFOPROLIFERATIVO AUTOINMUNE. L. Martínez-Martínez1, C. González-Santesteban1, M.V. Rubiales1, M. Pradas1, M.Á. Martínez-Carretero1, Y. Barrios2, P. Soler3, I.
Badell1, O. de la Calle-Martín1. 1Hospital Sant Pau- UAB, Barcelona. 2Hospital Universitario de Canarias. 3Hospital de la Vall d'Hebrón, Barcelona.
Objetivos. El Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune (ALPS) es
una alteración genética que afecta a la apoptosis. El ALPS se caracteriza por la aparición durante la infancia de linfoadenopatías, hepatoesplenomegalia, citopenias autoinmunes y aumento (>1,5%) de linfocitos T doble negativos (DNT: CD3+/TCRalfa-beta+/CD4-/CD8-) en
sangre periférica. La mayoría de los casos (>65%), conocidos como
ALPS tipo Ia, están causados por mutaciones herterozigotas dominantes en la línea germinal en el gen TNFRSF6, que codifica la proteína
CD95 (Fas).
Material y Métodos. El estudio incluyó a 32 pacientes procedentes de diferentes hospitales españoles que cumplían criterios clínicos
(linfoadenopatía, esplenomegalia y/o citopenias) y de laboratorio
(hipergammaglobulinemia y elevadas células T DN) de ALPS. Se ana-
lizó el gen TNFRSF6 en todos los pacientes. En casos seleccionados en
los que no se hallaron mutaciones en dicho gen, se analizaron TNFSF6
(Fas ligando) y CASP-10 (caspasa-10).
Resultados. 26 de los pacientes (86%) eran heterocigotos para una
mutación única en el gen TNFRSF6 (ALPS Ia). Se describieron 7 alteraciones diferentes que afectaban a los exones 2, 8 y 9. Cuatro de estas
mutaciones no habían sido previamente descritas (E20X, Y216fsX13,
IVS8+3A->G y L226P). Estas mutaciones incluían inserciones, defectos
de splicing, mutaciones missense y nonsense. Los otros 6 pacientes no
tenían mutaciones ni en TNFRSF6, TNFSF6 ni CASP-10, por lo que fueron clasificados como ALPS tipo III. Los pacientes ALPS Ia tenían niveles séricos muy elevados de IL-10 e IgE comparado con los controles
y familiares portadores de la misma alteración. Estos marcadores se
encontraron elevados en los pacientes ALPS III pero de una forma no
tan remarcable, a excepción de un caso. Este último caso es una niña
con una clínica muy severa de ALPS con niveles muy elevados de IL10, IgG, IgA e IgE. En esta paciente se descartaron mutaciones en
TNFRSF6, TNFSF6, CASP-8, CASP-10, N-Ras y FADD.
Conclusiones. La combinación de elevados linfocitos T DN
(>1,5%) con niveles séricos incrementados de IL-10 e IgE está fuertemente asociado a mutaciones en Fas. Esto permite la orientación de los
pacientes con signos clínicos de ALPS a una evaluación más directa
hacia la secuenciación del gen TNFRSF6 y otros genes relacionados
con la apoptosis. En estos pacientes se han descrito 4 nuevas mutaciones en TNFRSF6 (E20X, Y216fsX13, IVS8+3A->G y L226P), así como
2 familias con numerosos miembros afectos.
O-079
DIVERSIDAD CLÍNICA EN UNA FAMILIA CONSANGUÍNEA
CON MUTACIONES EN EL GEN RAG-1. L. Martínez-Martínez1, C.
González-Santesteban1, M.V. Rubiales1, M. Pradas1, I. Badell1, P. Soler2,
O. de la Calle-Martín1. 1Hospital Sant Pau- UAB, Barcelona. 2Hospital de
la Vall d'Hebrón, Barcelona.
Objetivos. Las mutaciones en los genes RAG causan Inmunodeficiencia Severa Combinada (SCID), Síndrome de Omenn (OS) o un
fenotipo intermedio denominado Omenn-like. Además de la mutación
existen otros factores que determinan el fenotipo final. Presentamos
3 casos de una misma familia con presentación clínica y evolución muy
diferentes.
Material y métodos. El caso clínico 1 es un varón caucásico nacido en el año 2005, que a partir del segundo mes de vida sufre múltiples cuadros infecciosos (pielonefritis, muguet oral, enteritis) acompañados de eritrodermia exfoliativa. Es trasplantado a los 8 meses de
vida de un hermano no HLA idéntico (9/10). La evolución del TMO
fue excelente, sin embargo, a los 21 meses post-TPH se detecta un súbito empeoramiento con resultado fatal. El caso 2 es un varón prematuro, hermano del caso 1, nacido en 2009, que desde el nacimiento sufre
eritrodermia exfoliativa generalizada con todo tipo de complicaciones
sistémicas que le llevan al exitus en el segundo mes de vida. El caso 3
es una niña prematura, prima hermana de los dos casos anteriores,
nacida en 2010 y también con eritrodermia generalizada. Se trata de
una familia consanguínea con antecedentes previos de fallecimientos
en la infancia.
Ante la sospecha diagnóstica de SCID/OS, se realizan estudios de
poblaciones linfocitarias por citometría de flujo, ensayos de linfoproliferación y determinación de niveles de inmunoglobulinas. Así mismo, se secuencian los genes RAG-1 y RAG-2.
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Resultados. El caso 1 presentaba linfopenia con ausencia de linfocitos B e inversión del cociente CD4/CD8. Los linfocitos T eran propios y expresaban CD45RO en superficie, pero los ensayos de linfoproliferación demostraron que eran anérgicos. Tras el TPH, las poblaciones se normalizaron, incluyendo los linfocitos B. Sin embargo, el
infiltrado masivo acompañado de sepsis coincide con una nueva ausencia de linfocitos B y aumento de IgE. El caso 2 presentaba linfocitosis,
sin inversión del cociente CD4/CD8 pero también con ausencia de linfocitos B. Los linfocitos T eran de memoria con marcadores de activación (HLA-DR), de lo que se deduce una expansión en periferia. El
caso 3 presentaba linfopenia, con ausencia de linfocitos B y sin inversión del cociente CD4/CD8. Sus linfocitos T también eran CD45RO+.
Los niveles de IgG, IgA, IgM e IgE eran indetectables en los casos 1 y
2; por el contrario, en el caso 3, a pesar de la ausencia del resto de
isotipos, los niveles de IgE eran muy elevados (364 UI/mL), lo que
también ocurrió en el caso 1 tras la recidiva post-TPH de su enfermedad (313 UI/mL).
El análisis de los genes RAG mostró una deleción en homocigosis
en el gen RAG-1 de todos ellos: c.631delT (mutación previamente descrita). Los padres eran portadores de la misma.
Conclusiones. Los 3 pacientes tenían la mutación c.631delT, sin
embargo, el caso 1 debutó con un SCID aunque tras el TPH rebrotó
como un OS; el caso 2 presentó un síndrome mixto SCID/OS, mientras que el caso 3 tiene una presentación típica de Omenn.
O-080
30 ANOS DE EXPERIENCIA EN EL HOSPITAL DOCE DE OCTUBRE EN EL SEGUIMIENTO DE LA ENFERMEDAD GRANULOMATOSA CRÓNICA (CGD). V. Pérez-Aradas, E. Mancebo, S. LermoRojo, P. Talayero, J. Ruíz-Contreras, L.I. González-Granado, P. Rojo,
D. Blázquez, M.J. Torres Collado, L.M. Allende. Hospital Doce de Octubre, Valdemoro.
Objetivos. El presente estudio describe las características clínicas
y epidemiológicas, las infecciones detectadas, y los principales microorganismos que infectan al grupo de pacientes con CGD en estudio
(1980-2010).
Materiales y métodos. En este trabajo se incluyen 14 pacientes
con CGD procedentes de la Unidad de Inmunodeficiencias en un periodo de 30 años. Los pacientes con sospecha clínica de CGD se les realizó estudio inmunológico: NBT, bioluminiscencia o citometría de flujo utilizando el ensayo oxidativo DHR y se confirmó mediante estudio genético.
Resultados. Un total de 14 casos fueron diagnosticados de CGD,
provenientes de 10 familias distintas; de los cuales el 86% mostró una
herencia ligada al X y el resto herencia autonómica recesiva. La edad
de inicio de síntomas estuvo comprendida entre los 4 y 144 meses, con
una media de 34 meses. La edad media del diagnóstico fue de 11,5 años
(6 m– 17a). Los procesos infecciosos más frecuentes fueron: la neumonía (15,4%), la adenitis cervical (12,5%), fiebre de origen desconocido
(10,2%), osteomielitis (8,8%) abscesos (8,1%), entre otros. De estos, se
aisló organismo causal en el 28,6% de los casos. Los principales gérmenes aislados fueron: Staphylococcus aureus y Salmonella sp (23%cada uno),
Serratia marcescens, Streptococcus, Nocardia y Aspergillus fumigatus (5,8%
cada uno), entre otros. Se objetivó la presencia de granulomas en un
5,1% de los casos, siendo ésta la principal complicación no infecciosa.
Conclusiones. La clínica de la CGD es heterogénea, sin embargo,
es la neumonía su forma de presentación más frecuente. El tiempo trans-
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VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
currido desde el inicio de los síntomas hasta el diagnóstico genético
es prolongado, por tanto, consideramos de gran importancia el conocimiento de esta patología por parte de los equipos clínicos, para que
ante la sospecha de una probable CGD se pueda actuar de forma inmediata con los procedimientos diagnósticos y terapéuticos pertinentes.
O-081
DOS NUEVAS MUTACIONES EN ATM EN UN CASO DE ATAXIATELANGIECTASIA. R. López Blanco1, M.J. Bernal1, M.T. Martínez
de Saavedra1, M. Ley1, A. Brusco2, C. Rodríguez1, F. Mora1. 1H.U. Puerta del Mar, Cádiz. 2Universidad de Turín, Italy
Un niño de 3 años y 6 meses fue remitido a consulta de Inmunología con sospecha de Ataxia-telangiectasia para valoración de función
inmune y estudio genético. Presentaba ataxia de la marcha y alteraciones oculomotoras, leves telangiectasas oculares y niveles de alfafetoproteína elevados. Presentó infecciones respiratorias de repetición y
un episodio de neumonía, con buena respuesta al tratamiento antibiótico. Había completado el calendario vacunal para la edad, incluyendo triple vírica, sin reacciones adversas. El estudio de inmunidad mostró las siguientes alteraciones: deficiencia de IgG2 e IgG3 y niveles elevados de IgM. La producción de Ac frente a polisacáridos y VHB fue
adecuada, pero no produjo niveles protectores de Ac frente a sarampión, rubeola ni parotiditis. El fenotipo linfocitario mostró elevación
de células NK, de linfocitos T de memoria y de linfocitos T gammadelta. La respuesta proliferativa in vitro a mitógenos fue normal.
La secuenciación del mensajero el gen ATM mostró una deleción
de dos pares de bases (c.8873_8874delTT) en heterocigosis. Esta mutación no está descrita en la literatura. A nivel de la proteína la mutación
daría lugar a un codón de STOP en el primer triplete después de la
deleción (p.F2958X) como resultado se produciría un proteína truncada que carece de los 99 aminoácidos del extremo carboxilo terminal.
Con una probabilidad muy alta se trata de una mutación patogénica
dada la importancia del cambio estructural que ocurriría en la proteína, el cual afecta al domino catalítico de la misma.
Mediante MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) se
consiguió detectar la segunda mutación: una gran deleción que afecta a varios exones del gen ATM. Esta deleción se consiguió caracterizar a nivel de ARN mensajero y de ADN genómico. La deleción se produce entre el exon 34 y el intrón 38: (c.5129_5762+1116del9264). En
cDNA se detecta un tránscrito que carece de los exones 34 a 38. La pérdida de estos exones da lugar a un frameshift (p.Glu1669AspfsX16).
La proteína que produciría este transcrito carecería de los 1388 aminoácidos finales. Aunque esta deleción no está descrita, sin duda se trata de una mutación patogénica dadas las importantes consecuencias
deducidas para la proteína.
O-082
CARACTERIZACIÓN INMUNOLÓGICA Y MOLECULAR DE LA
PRIMERA FORMA AUTOSÓMICA RECESIVA DE SÍNDROME
HIPER IGE (DOCK8) EN ESPAÑA. S. Lermo-Rojo, E. Mancebo, P.
Talayero, V. Pérez-Aradas, J. Ruíz-Contreras, L.I. González-Granado,
M. Menchén, M.J. Díaz-Madroñero, S. Sanromán, L.M. Allende. Hospital 12 de Octubre, Madrid.
Objetivos. Diagnóstico genético de un paciente con sospecha clínica de síndrome Hiper IgE (HIES).
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INMUNOLOGÍA
Paciente y métodos. Paciente varón de 17 años de edad, nacido
de progenitores no consanguíneos, madre fallecida de un linfoma. El
paciente sufre candidiasis mucocutánea desde el primer año de vida,
alergia al huevo, asma e infecciones respiratorias recurrentes. Ha desarrollado enfermedad pulmonar crónica de patrón obstructivo y bronquiectasias en ambos pulmones. Infecciónes cutáneas por Molluscum
contagiosum. Pápulas en la cara compatibles con epidermodisplasia
verruciforme y numerosas verrugas planas. En el examen inmunológico se aprecian cadenas kappa en sangre y orina, compatibles con una
gammapatía monoclonal de significado incierto, eosinofilia con niveles elevados de IgE y respuesta linfoproliferativa normal. Se realiza
estudio genético de la forma autosómica dominante (STAT3) y de la
recesiva más frecuente (DOCK8).
Resultados. El paciente no presenta alteraciones en el gen STAT3,
mientras que en DOCK8 se detecta una deleción del exón 16 a nivel de
mRNA, debido a una mutación puntual en DNAg en heterocigosis en
posición +5 del intrón 16 (GTAAG por GTAAA). Esta mutación cambia la pauta de lectura, provocando la aparición de un codón stop prematuro. Se observan tanto en el paciente como en su padre, dos SNPs
en homocigosis en la región inicial del gen (exones 2 y 3), lo que sugiere una gran deleción en heterocigosis en esa zona. Los resultados del
análisis de dosis génica apoyan esta sospecha.
Conclusiones. Nuestros resultados documentan el primer caso
descrito en España de HIES autosómico recesivo por mutaciones en
DOCK8. Los defectos de este gen han de considerarse en pacientes con
HIES de clínica típica de la forma recesiva: infecciones cutáneas virales, carcinoma o epidermodisplasia de células escamosas, infecciones
pulmonares sin pneumatoceles y ausencia de alteraciones extrainmunológicas a excepción de afección del sistema nervioso central. El diagnóstico genético, aunque laborioso es necesario para confirmar el diagnóstico clínico y proporcionar consejo genético.
anticuerpos anti-Factor H se analizaron mediante técnicas de ELISA.
Además, se ha realizado un análisis cualitativo de Factor I circulante
mediante Western Blot.
La actividad hemolítica del complemento (CH-50) y la presencia
del anticuerpo C3 NeF se realizaron mediante ensayos hemolíticos.
Se ha abordado el estudio molecular en los cuatro pacientes
mediante técnicas de PCR y secuenciación.
Resultados. Los cuatro pacientes presentaban un perfil compatible con activación de la vía Alternativa del Complemento (bajos niveles de C3, Factor B, Factor H) y ausencia de Factor I.
El estudio molecular está permitiendo identificar las mutaciones
responsables del defecto en cada uno de los cuatro pacientes.
Uno de los pacientes es homocigoto para una mutación ya caracterizada. Dos pacientes son heterocigotos compuestos para 2 mutaciones nuevas y 2 descritas. En el último paciente, aún en estudio, hemos
caracterizado una mutación, ya descrita, en heterocigosis.
Conclusiones. La deficiencia completa del Factor I, regulador del
Sistema del Complemento, se presenta con una clínica y un perfil de
Complemento característico. La clínica se caracteriza por la presencia de diversas infecciones de repetición y en algunas ocasiones por
procesos autoinmunes.
Ante la presencia de un perfil de consumo de Complemento prolongado en el tiempo, deberían incluirse en el estudio de los pacientes
el estudio de factores que regulan la vía Alternativa como son: el Factor H, el C3NeF, la Properdina y el Factor I.
La deficiencia de factor I, es un defecto genético que posiblemente esté subestimado como ocurre en otras inmunodeficiencias primarias, aunque actualmente los análisis de este regulador se realizan en
el despistaje bioquímico-genético por la implicación de mutaciones en
heterocigosis con el Síndrome Hemolítico Urémico atípico (aHUS).
O-084
O-083
CUATRO NUEVAS FAMILIAS ESPAÑOLAS CON DEFICIENCIA
COMPLETA DE FACTOR I . M. Alba Domínguez1, M.J. Melero2, J.I.
González-Granado3, J.A. Trujillo4, P. Soler5, S. Garrido1, A. López-Lera1,
P. Nozal1, M. López-Trascasa1. 1Hospital Universitario La Paz, Madrid.
2Hospital Infanta Cristina, Badajoz. 3Hospital Doce de Octubre, Madrid. 4Hospital San Pedro de Alcántara, Cáceres. 5Hospital Vall de Hebrón, Barcelona.
Objetivos. El Factor I (FI) es una serín proteasa circulante que
actúa como regulador esencial de la cascada del Complemento. Rompe e inactiva a C3b y C4b (constituyentes de la C3 y C5 convertasas).
La proteína humana es un heterodímero compuesto por una cadena pesada (H) no catalítica de 50KDa, unida mediante dos puentes
disulfuro a una cadena ligera (H) catalítica de 38KDa.
La deficiencia de FI, un defecto de herencia autosómica recesiva,
ocasiona un consumo incontrolado de C3 (elemento central de las tres
vías de activación del Complemento), así como de FB y FH. Esto impide tener un mecanismo eficaz de defensa mediado por dicho sistema
perteneciente a la Inmunidad Innata.
Hemos caracterizado bioquímica y genéticamente cuatro familias
que presentaban un perfil clínico sugerente de esta inmunodeficiencia
primaria asociada a bajos niveles de C3.
Material y Métodos. Se obtienen muestras de suero y ADN de 4
pacientes y sus familiares directos.
Los niveles de inmunoglobulinas, C3 y C4 se midieron mediante
nefelometría. Los niveles de factor I, factor H así como la presencia de
HIPOGAMMAGLOBULINEMIA SECUNDARIA A RITUXIMAB
EN PACIENTES CON LNH DE CÉLULA B: IMPORTANCIA CLÍNICA, VALORACIÓN Y VALIDEZ DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO EN LA VALORACIÓN DE POLIMORFISMOS DE FC–RIII. P.
Carrasco, J. Iglesias, N. Matamoros. Hospital Son Dureta, Palma de
Mallorca, Llucmajor.
Objetivos. La evidencia científica ha revelado en los últimos años
una serie de casos clínicos de pacientes con LNH tratados con Rituximab (RTX) que después de la suspensión (mayor a 9 meses) del tratamiento, continúan con una severa depleción de célula B e hipogammaglobulinemia. La importancia de las variantes alélicas en algunos FcγRs,
en particular en el receptor de baja afinidad FcγRIIIa (CD16), es cada
vez mayor para valorar la eficacia en la terapia con anticuerpos monoclonales. El polimorfismo G559T del gen FCGR3A (CD16A) resulta en
dos alotipos del FCγRIIIa; con valina o fenilalanina en la posición 158.
Este polimorfismo, modula la unión a IgG1 y el mecanismo de citoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA). Nuestro objetivo es
realizar una evaluación de estos pacientes, determinando la importancia clínica de la hipogammaglobulinemia y estudiar si la presencia
del polimorfismo en el FCγRIIIa es relevante en el contexto de la depleción crónica de célula B presente en estos pacientes. Por otra parte pretendemos determinar la validez y utilidad clínica de la citometría de
flujo (CF) como técnica de screening para valorar dicho polimorfismo.
Material y métodos. Para la estandarización de la técnica de valoración de los polimorfismos de FCγRIIIa mediante CF se estudiaron 40
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controles sanos. Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales:
CD16-FITC (MEM154; Santa Cruz Biotechnology) que requiere la presencia de valina en la posición aminoacídica 158, CD16-FITC (3G8; Santa Cruz Biotechnology) que presenta igual reactividad para la valina o
fenilalanina en la posición 158, Goat anti mouse-FITC (Dako), CD56-PE
(BD) y CD3-ECD (BC). Se analizó la expresión de MEM-154 y 3G8 en
células NK y granulocitos. También se estudiaron 4 pacientes con LNH
de célula B que presentaban hipogammaglobulinemia tras 9 meses de
suspensión del tratamiento con RTX. Se evaluaron los niveles de inmunoglobulinas circulantes, población linfocitaria B, historia clínica de infecciones y necesidad de terapia sustitutiva con gammaglobulina (GGIV).
Resultados. Todos los pacientes presentaron niveles de IgG<500
mg/dl, disminución severa de isotipos IgA e IgM, disminución de subclases de IgG, persistencia de depleción linfocitaria de célula B (<3%)
y presencia de infecciones de repetición (respiratorias, digestivas y urinarias principalmente). Al cabo de 6 meses de seguimiento, todos
comenzaron terapia sustitutiva con GGIV. Los resultados preliminares de la valoración de la CF como técnica de screening para el estudio de los polimorfismos, muestran que no es capaz de discriminar
entre los diferentes polimorfismos (F/F, F/V, V/V), si bien estos resultados deben ser comprobados por biología molecular.
Conclusiones. Los pacientes estudiados con hipogammaglobulinemia secundaria presentaban una importante clínica de infecciones
y confirman que esta nueva inmunodeficiencia requiere de un estudio
previo exhaustivo, seguimiento y probablemente terapia sustitutiva
con GGIV. Por otra parte la persistencia de la depleción linfocitaria de
célula B, incluso después de 2 años en algunos pacientes, reafirma
las diferencias individuales en respuesta al tratamiento con RTX, lo
que nos sugiere en relación al polimorfismo de FcγRIIIa la necesidad
de su estudio. Los hallazgos de las alteraciones moleculares en estos
pacientes, clínicos y analíticos, superponibles a los pacientes con Inmunodeficiencia Variable Común (IVC), pueden ser útiles para conocer
la etiopatogenia de las alteraciones en el stop madurativo de la población B que se ha descrito en estos pacientes.
O-085
PAPEL DE LA MUTACIÓN A91V EN LINFOHISTIOCITOSIS
HEMOFAGOCÍTICA FAMILIAR TIPO 2: PREVALENCIA EN
POBLACIÓN MARROQUÍ Y ESPAÑOLA. N. Lanio1, V. Daza1, N.
Martínez-Pomar1, N. Romo2, A. Ferreira3, M.C. García3, J.A. Salinas1,
G. Fontán3, M. López-Botet2, N. Matamoros1. 1Hospital Universitario
Son Dureta, Palma de Mallorca. 2Universitat Pompeu Fabra, Barcelona. 3Hospital La Paz, Madrid.
Introducción. Mutaciones en el gen de la Perforina-1 (PRF1) se asocian a Linfohistiocitosis Hemofagocítica Familiar tipo 2 (FHL2), síndrome raro de herencia autosómica recesiva, caracterizado por proliferación de histiocitos con marcada actividad hemofagocítica. La sustitución
aminoacídica A91V (c.272C>T) ha sido descrita como un polimorfismo neutral en base a su alta frecuencia en algunas poblaciones. Sin embargo, la evidencia clínica y ensayos funcionales posteriores, han demostrado que podría tratarse de una mutación que afecta tanto el nivel de
expresión de la proteína, como su capacidad citolítica, especialmente en
individuos heterocigotos compuestos que portan otra mutación en PRF1.
Objetivos. Establecer la prevalencia de dicha mutación en población sana marroquí y española. Esclarecer el posible papel patogénico
de la mutación A91V en individuos heterocigotos con familiares afectos de FHL2.
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Paciente y métodos. Estudio molecular del gen PRF1 por secuenciación directa de ADN en 145 controles (100 españoles-45 marroquíes).
Análisis por citometría de flujo de la expresión de perforina en células NK y ensayo de citotoxicidad contra la línea celular K562, de mujer
clínicamente sana de origen marroquí (A91V/G149S), madre de niño
afecto (G149S/G149S).
Resultados. El análisis molecular del gen PRF1 en los controles
revela que la frecuencia de la mutación A91V es similar a la descrita
en series anteriores para raza caucásica y superior en poblaciones endogámicas. Los ensayos funcionales realizados para el caso descrito
(A91V/G149S), demuestran afectación, tanto en la expresión de perforina como en la capacidad citotóxica de las NKs. Sin embargo, al
preincubar las células con IL-2 se restaura parcialmente la función citotóxica, sin observarse este efecto en el paciente homocigoto
(G149S/G149S).
Conclusiones. Los resultados descritos demuestran que la mutación A91V en individuos heterocigotos compuestos podría causar deficiente función citotóxica y convertir a los portadores en candidatos a
sufrir un cuadro clínico más suave y/o de aparición tardía. Por tanto, recomendamos un seguimiento clínico preventivo, especialmente
si se detecta otra mutación en PRF1, UNC13D o STX11. La alta frecuencia observada de la mutación A91V en la población control, aconseja
ampliar el estudio molecular a los familiares de pacientes con FHL2,
valorando siempre su presencia.
O-086
LOS LINFOCITOS B DE PACIENTES CON INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMÚN PRODUCEN NIVELES REDUCIDOS DE
INMUNOGLOBULINAS EN RESPUESTA A LIGANDOS DE TLR9
(CPG-ODN) O ANTI-CD40 + IL-21. A. Clemente Ximenis, J. Pons De
Ves, N. Matamoros Flori, J. Iglesias Alzueta, C. Martínez García, J.M.
Ferrer Balaguer. Instituto Universitario de Investigación en Ciencias de la
Salud (IUNICS), Hospital Universitario Son Dureta, Palma de Mallorca.
La Inmunodeficiencia Variable Común (IVC) es un defecto humoral caracterizado por hipogammaglobulinemia, pobre respuesta a vacunación y mayor susceptibilidad a padecer infecciones recurrentes causadas por bacterias capsuladas. Algunas mutaciones genéticas y/o
polimorfismos descritos apuntan a defectos intrínsecos del linfocito B
y de la colaboración T/B durante la respuesta inmunitaria. Sin embargo se desconoce la causa subyacente a la inmunodeficiencia en la mayoría de pacientes.
Objetivos. Estudiar la diferenciación y producción de inmunoglobulinas de los linfocitos B de pacientes con IVC y controles sanos
en respuesta a la estimulación con ligandos bacterianos específicos de
TLR9 (CpG-ODN) o simulando la colaboración con el linfocito T
mediante anti-CD40 combinado con IL-21. Evaluar la contribución de
la señalización a través del BCR.
Material y métodos. Los linfocitos B de 16 pacientes y 17 controles sanos se purificaron mediante selección negativa a partir de
muestras de sangre periférica. Posteriormente, se cultivaron (1x105
células/pocillo) durante 11 días en presencia de CpG-ODN (0,6 μg/ml)
o anti-CD40 (1 μg/ml) + IL-21 (100 ng/ml) en combinación o no con
anti-IgM (5 μg/ml).
El nivel de expresión de CD38 en membrana, como marcador de
diferenciación, se determinó por citometría de flujo. La producción de
IgG, IgA e IgM se cuantificó mediante CBA FlexSet en los sobrenadantes de cultivo.
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INMUNOLOGÍA
Resultados. El grado de diferenciación alcanzado (expresión de
CD38) fue inferior en los linfocitos B de los pacientes sólo al estimular
con anti-CD40+IL21+anti-IgM.
La secreción de IgG e IgA fue inferior en linfocitos B de pacientes independientemente del estímulo utilizado.
La producción de IgM fue también inferior en IVC tras estimulación con CpG-ODN, pero comparable a los controles en respuesta a
anti-CD40+IL-21.
La adición de anti-IgM a los cultivos no aumentó la secreción de
inmunoglobulinas en los controles ni la restauró en los pacientes.
Conclusiones. Los linfocitos B de pacientes con IVC no se diferencian óptimamente ni en respuesta a ligandos de TLR9 (CpG-ODN)
ni a las moléculas mediadoras de la interacción T/B estudiadas (antiCD40+IL-21). Ello sugiere un amplio defecto en las vías de señalización responsables de la diferenciación del linfocito B a célula productora de anticuerpos.
O-087
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS EN EL ESTUDIO DE INMUNODEFICIENCIAS ASOCIADAS CON DEFECTOS DE REPARACIÓN
DE DNA. M.J. Recio Hoyas1, E. Martínez Busto1, L. Woodbine2, E.
Riballo2, J.R. Regueiro1, P. Jeggo2. 1Facultad de Medicina. Universidad
Complutense, Madrid. 2Genome Damage and Stability Centre. Sussex University, United Kingdom.
Las inmunodeficiencias asociadas con defectos de reparación de
DNA, constituyen un grupo de desórdenes caracterizados por linfopenia T y/o B, radiosensibilidad clínica y, en algunos casos, aparición
de determinados tipos de tumores. Los genes responsables de estas
patologías codifican para una serie de proteínas implicadas en las vías
de reparación de DNA, entre las que se encuentran Artemis, Ligasa IV
y Cernnunos (XLF).
En este trabajo se describen los estudios de reparación realizados en dos pacientes con clínica de inmunodeficiencia y radiosensibilidad clínica.
Casos clínicos. Paciente 1. Numerosos episodios de infecciones
por bacterias y hongos en piel y mucosas, linfopenia T severa y niveles disminuidos de inmunoglobulinas. Fallece a los 3 meses de edad.
Paciente 2. Varón de 4 meses de edad que presenta clínica SCID,
expansión T oligoclonal y varios rasgos dismórficos, entre los que destaca la presencia de microcefalia.
Los análisis de reparación, en ambos pacientes, se llevaron a cabo
en fibroblastos irradiados (γ-IR) obtenidos a partir de biopsia de piel.
Los estudios de supervivencia celular mostraron una disminución del
número de colonias respecto a individuos control, lo que nos indica
que las células de estos pacientes son radiosensibles. Por otro lado, los
estudios de inmunofluorescencia (anticuerpos α-γH2AX y α-CENPf) realizados para monitorizar la cinética de reparación de roturas de
DNA de doble cadena en las distintas fases del ciclo celular mostraron
defectos en fase G2. Los resultados en fase G1 fueron similares a los
obtenidos en individuos control.
Los resultados obtenidos apuntan a un posible defecto en algunas de
las proteínas reparadoras de daño en el DNA. Los estudios de secuenciación realizados en el paciente 2 han descartado Ligasa IV y Cernunnos
como genes responsables de la patología. Por el contrario, el Western-blot
de Artemis realizado en el paciente 1, revela una banda de menor tamaño que podría corresponder a una proteína truncada. Actualmente estamos realizando el estudio molecular para confirmar este resultado.
Conclusión. Estas técnicas sirven para diagnosticar con rapidez
posibles inmunodeficiencias asociadas con defectos de reparación de
DNA y para profundizar en el papel de las proteínas reparadoras en
el desarrollo de tumores. Es importante recordar que se necesitan fibroblastos, bien de biopsia o bien de raspados bucales.
SESIÓN 10: INMUNOTERAPIA
Moderadores: Luis AlvarezVallina (Madrid)
Francisco Lozano (Barcelona)
O-088
T CELL ALLOREACTIVITY IS ENHANCED BY CTLA-4 BLOCKADE WITH TREMELIMUMAB ONLY WHEN CD4+ CD25+ REGULATORY T LYMPHOCYTES ARE DEPLETED IN VITRO AND IN
VIVO. C. Alfaro Alegria1, N. Suarez2, J. Dubrot1, A. Palazon1, S. Hervas-Stubbs1, I. Martínez-Forero1, S. Martin-Algarra2, B. Sangro2, F.
Lecanda1, J.L. Pérez-Gracia2, I. Melero1. 1CIMA, Pamplona. 2CUN.
Anti-CTLA-4 monoclonal antibodies that block the interaction of
CTLA-4 with CD80 and CD86 such as tremelimumab and ipilimumab
are currently being tested in the clinic for cancer treatment exploiting
their properties to de-repress tumor-specific cellular immunity. Addition
of the fully human anti-CTLA-4 (tremelimumab) to cultures of human
T cells with allogenic dendritic cells did not increase proliferation.
Magnetic bead-mediated elimination of CD4+ CD25+ Treg cells before
setting up those alloreactive cultures also largely failed to increase
primary proliferation. In contrast, pre-depletion of CD4+ CD25+ Treg
and culture in the presence of tremelimumab synergistically resulted
in increased proliferation and DC:T cell aggregation. These effects were
much more prominent in CD4 than in CD8 T cells. The synergy mechanism
can be traced to enhanced CTLA-4 expression in effector cells as a result
of Treg elimination, thereby offering more targets to the blocking antibody.
Human T cells and allogenic DC were coinjected in the peritoneum
of Rag2–/– IL-2Rγ–/– mice. In these conditions, tremelimumab injected
intravenously did not significatively enhance alloreactive proliferation
unless Treg cells had been pre-depleted. Synergistic effects e in vivo
were again largely restricted to the CD4 T cell compartment. Similar
results were observed with PBL and allogenic DC obtained from patients
suffering from advanced solid malignancies. These experiments indicate
that tremelimumab therapy may benefit from previous or concomitant
Treg depletion.
O-089
IMMUNOTHERAPEUTIC AGONIST ANTI-CD137 MAB ACT ON
TUMOR ENDOTHELIAL CELLS TO ENHANCE ADHESION
MOLECULES AND RECRUITMENT OF ACTIVATED T
LYMPHOCYTES. A. Palazón García1, J. Dubrot Armendariz1, A. Rouzaut Subirá1, S. Hervás-Stubbs1, I. Martínez-Forero1, A. Morales-Kastresana1, A. Teijeira1, A. Martínez2, M. Jure-Kunkel3, I. Melero1. 1CIMA,
Pamplona. 2CIBIR. 3Bristol Myers-Squibb Pharmaceutical Research Institute.
Agonist anti-CD137 mAb are being used for the treatment of
cancer in mice and in clinical trials based on their co-stimulatory
effects on primed T cells and perhaps on other cells of the immune
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system. We provide evidence both at the protein and the mRNA
level, indicating that CD137 is selectively expressed on the surface
of tumor endothelial cells. Interestingly CD137 is up-regulated on
mouse endothelial cell lines under conditions of hypoxia. Treatment
with anti-CD137 mAb in Rag–/– mice does not result in any measurable
anti-angiogenic effects. By contrast, CD137-mediated in vivo stimulation
of tumor endothelial cells with monoclonal antibodies increases the
surface expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1 and
E-selectin. As a result, CD137–/– activated T lymphocytes entered
more avidly into tumor tissue when adoptively transferred to mice
that are being treated with agonist anti-CD137 mAb. The enhanced
entrance of activated T lymphocytes into the malignancy can be
neutralized with anti-ICAM-1 and anti-VCAM-1 blocking antibodies.
Accordingly, stimulation of CD137 does not only enhance T cell
activation but also augments their traffic into the malignant tissue
through direct actions on the blood vessels that irrigate the tumor,
thereby providing an additional mechanism of action for the
immunotherapeutic effects.
O-090
TREATMENT WITH ANTI-CD137 MABS CAUSES INTENSE
ACCUMULATIONS OF LIVER T CELLS WITHOUT SELECTIVE
ANTITUMOR IMMUNOTHERAPEUTIC EFFECTS IN THIS
ORGAN. J. Dubrot1, F. Milheiro1, C. Alfaro1, A. Palazón1, I. MartínezForero1, A. Morales-Kastresana1, M.C. Ochoa1, S. Hervás-Stubbs1,
M. Jure-Kunkel2, L. Chen3, I. Melero1. 1CIMA, Pamplona. 2Bristol MyersSquibb Pharmaceutical Research Institute, United States. 3Sidney Kimmel
Cancer Center. Johns Hopkins Medical School, United States.
Background/Aims. Cancer therapy with agonist anti-CD137
mAbs has been shown to induce immune-mediated tumor rejections
in mice and equivalent agents of this kind are currently being tested
in cancer patients. Previous reports indicated that CD137 stimulation
induces polyclonal infiltrates of T lymphocytes in the liver. This
study characterizes the liver infiltrates, the target-dependency of the
phenomena and addresses the question of whether tumors nested
in the liver are a more favourable target for CD137-based
immunotherapy.
Methods. Liver infiltrates were studied with conventional histology
and multiple colour flow cytometry of total liver leukocytes. CD137–/–
mice, mice with a single rearrangement of the TCR (OT-1 mice) and
Rag–/– mice were used to clarify molecular requirements. Mice implanted
with MC38 colon carcinomas either subcutaneously or inside the liver
were used for comparative studies under treatment with agonist antiCD137 mAbs.
Results. CD137 treatment caused mononuclear inflammation in
portal spaces of the liver, which gave rise to moderate increases in
transaminases without signs of cholestasis. Marked increases in the
numbers of CD8+ T cells were observed, including CD8+ T lymphocytes
co-expressing CD11c. Infiltrates were absent in CD137–/– mice and
mitigated in mice harbouring a single transgenic TCR on their CD8 T
cells. Despite of the tumor-independent accumulation of T cells in
the liver, immunotherapeutic effects were not more prominent against
tumors located in this organ
Conclusions. Target-dependent effects of CD137 stimulation lead
to liver infiltration with T cells, but lymphocyte enrichment in this
organ does not privilege this site for immunotherapeutic effects against
transplanted tumors.
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O-091
CUANTIFICACION DE ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL POR
CITOMETRIA DE FLUJO CON ALTA SENSIBILIDAD. E. Domingo, C. Moreno, A. Sánchez-Ibarrola, C. Panizo, J.A. Páramo, J. Merino. Clínica Universidad de Navarra, Pamplona.
La citometría de flujo es la técnica de elección para la cuantificación rutinaria de enfermedad mínima residual (EMR) en pacientes con
neoplasias hematológicas. Sin embargo, su sensibilidad es 10-4, un logaritmo por debajo de las técnicas moleculares. En el presente trabajo nos
planteamos el objetivo de desarrollar un protocolo de citometría de
flujo que permita alcanzar una sensibilidad similar al PCR cuantitativo y que pueda aplicarse de forma rutinaria en el laboratorio diagnóstico.
Material y Métodos. Se utilizaron 16 muestras EMR+ (Mieloma
Múltiple y LLC-B) con una infiltración en torno a 0.01%. La cuantificación del grado de infiltración se llevó a cabo por procedimiento estándar en un citómetro FACSCanto (Becton-Dickinson) con técnica de 6
colores (se calculó la media de 5 procedimientos independientes de
marcaje y análisis). Estas muestras se diluyeron 10 veces con leucocitos normales con el fin de obtener una infiltración en torno a 10-5. El
análisis de EMR en las muestras diluidas se llevó a cabo por medio de
la adquisición de 6 millones de leucocitos, que se marcaron y adquirieron en tubos independientes, a razón de 2 millones por tubo.
Resultados. En primer lugar se comprobó que la adquisición de
6 millones de leucocitos en tubos independientes es realizable (estabilidad de la fluorescencia inter-tubo) y aplicable al análisis diario de un
laboratorio diagnóstico (se exploró la posibilidad de acortar el tiempo
por medio del aumento en la tasa de adquisición sin que se afecten los
resultados). El procedimiento se validó comparando la cuantificación de EMR por citometría de flujo y PCR cuantitativo en diluciones
sucesivas de una muestra de Leucemia Linfoblástica Aguda BII Phi+
(10-3 a 10-5).
Con este protocolo se cuantificó EMR en muestras de Mieloma
Múltiple y LLC-B con una infiltración en torno a 10-5, obteniéndose en
todos los casos una medición exacta y precisa. La especificidad de la
técnica se confirmó por medio del análisis de 10 millones de leucocitos normales, tanto de médula ósea como de sangre periférica (n =
6).
Conclusión. La adquisición de 6 millones de leucocitos es realizable con un citómetro digital de forma rutinaria, permitiendo alcanzar una sensibilidad de 10-5 en análisis de EMR, manteniéndose la exactitud, precisión y especificidad de la técnica.
O-092
TERAPIA GÉNICA DE PACIENTES CON HIPER-IGM LIGADA
AL CROMOSOMA X (XHIM1) MEDIANTE EL USO DE VECTORES LENTIVIRALES REGULADOS. S. Torres Rusillo, Z. Romero
García, M. Cobo , P. Muñoz, J.D. Unciti Broceta, A.K. Vega Bogado, F.
Martín, I.J. Molina. Universidad De Granada / CIBM, Armilla.
Objetivos. El Síndrome de hiper IgM ligado al cromosoma X (XHIGM1) es una inmunodeficiencia primaria causada por mutaciones
en el gen que codifica para la proteína CD40L, presente en linfocitos T
CD4+. Recientes estudios en animales revelan que corregir el defecto
en progenitores hematopoyéticos puede llevar consigo el desarrollo
de un severo síndrome linfoproliferativo, probablemente a consecuencia de la expresión no regulada del vector terapeútico. Así, nuestro
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INMUNOLOGÍA
objetivo será transducir de forma eficiente linfocitos T primarios de
pacientes XHIM1 con un vector lentiviral terapeútico inducible y tejido-específico, en el que la expresión del transgén CD40L se encuentre
dirigida por el propio promotor de éste.
Material y métodos. Se construyó el vector lentiviral pCD40LCD40L, con el promotor específico de CD40L y el gen terapéutico. Las
células diana fueron linfocitos T de pacientes XHIM1. Tras la transducción, los linfocitos fueron aloestimulados, para obtener la población
CD4+. La detección de la proteína CD40L se realizó por citometría de
flujo.
Resultados. Los linfocitos T de pacientes XHIM1 transducidos por
el vector lentiviral pCD40L-CD40L, expresan CD40L sólo tras aloestimulación y estimulación con PMA+Ionomicina. Esta situación refleja la capacidad del vector de expresar la proteína CD40L sólo en condiciones de activación.
Conclusión. El vector lentiviral pCD40L-CD40L es capaz de
aumentar, de forma específica y regulada, la expresión en superficie
de CD40L en linfocitos T de pacientes XHIM1.
O-093
ESTUDIO DE LA BIOCOMPATIBILIDAD Y TOXICIDAD DE
NANOPARTÍCULAS INORGÁNICAS EN LÍNEAS CELULARES
HUMANAS. B. Díaz Freitas1, T. Lozano1, M. Peleteiro1, I. Pastoriza
Santos2, M. Arruebo3, R. Ibarra3, L. Liz Marzan4, A. Gonzalez Fernandez1. 1Universidad de Vigo. Laboratorio de Inmunologia, Vigo. 2Universidad
de Vigo. 3Instituto de Nanociencia de Aragón (INA), Zaragoza. 4Universidad
de Vigo.
Introducción. Los recientes avances en el campo de la Nanotecnología
han permitido desarrollar nuevos nanomateriales y herramientas con gran potencial e impacto socio-económico, principalmente en el campo biomédico donde
estos materiales pueden permitir mejorar las técnicas de diagnóstico y la terapia
de muchas enfermedades, especialmente en la detección y en el tratamiento del
cáncer. Los nanomateriales ofrecen oportunidades únicas en el diseño de nuevos
instrumentos clínicos y en la mejora de los ya existentes, pero sobre todo, las nanopartículas (NPs) se han propuesto como transportadores de fármacos, en el
desarrollo de biosensores y de vacunas, en la destrucción de células tumorales
mediante hipertermia y como agentes de contraste debido a su gran versatilidad
en composición, tamaño y funcionalidad.
Objetivo. El uso de NPs en aplicaciones biomédicas puede ofrecer
claros beneficios, pero antes de su uso in vivo es importante tener en
cuenta su potencial toxicidad y si son capaces de inducir una respuesta inmunológica. Las NPs pueden inducir agregación, inflamación, toxicidad, fagocitosis, alergia, etc. por lo que es necesario poner a punto técnicas que permitan evaluar estas cuestiones antes de su aplicación.
Métodos. Se han estudiado a través de diferentes técnicas la toxicidad y la biocompatibilidad (MTT, LDH, QSSC, Azul Tripán, fagocitosis, activación del complemento, producción de ROS, modelación de
marcadores de membrana, etc.) de NPs inorgánicas de diferente composición y tamaño en varios tipos celulares humanos.
Resultados. Muchas de las NPs analizadas se agregan en condiciones fisiológicas, además, se ha encontrado que la toxicidad es dependiente de la dosis y existe variabilidad entre diferentes tipos celulares,
la técnica empleada y el lote de NPs estudiado. Por otro lado, algunas
NPs interfieren con las técnicas utilizadas.
Conclusiones. Se han puesto a punto diferentes técnicas que permiten analizar la toxicidad y la respuesta inmunológica dependiendo
de las características y propiedades de cada tipo de NP. Nuestros resul-
tados muestran que debido a variabilidad encontrada según el tipo
celular analizado y las características de las NPs es necesario utilizar
diferentes técnicas y líneas celulares para estudiar la toxicidad y biocompatibilidad de los nanomateriales.
O-094
EL “TARGETING” EX VIVO A CÉLULAS DENDRÍTICAS DE UN
ADENOVIRUS QUE EXPRESA EL ANTÍGENO NS3 DEL VHC
AUMENTA SU MADURACIÓN Y LA INDUCCIÓN DE RESPUESTAS ANTIVIRALES IN VITRO E IN VIVO. I. Echeverria Beistegui1,
A. Pereboev2, L. Silva1, A. Zabaleta1, J.I. Riezu-Boj1, F. Borrás-Cuesta1, J.J. Lasarte1, J.I. Esteban1, J. Prieto1, P. Sarobe1. 1CIMA Universidad
de Navarra, Pamplona. 2University of Alabama at Birmingham, United States.
Objetivos. La eliminación del virus de la hepatitis C (VHC) está
asociada a la inducción de potentes respuestas celulares mediadas por
linfocitos T. Para activar a los linfocitos T es necesaria la correcta presentación del antígeno por las células dendríticas (CD) maduras. El
objetivo de este trabajo ha sido desarrollar una estrategia que sea capaz
de aumentar las funciones de las CD, con el fin de mejorar su inmunogenicidad.
Metodología. Se han utilizado moléculas adaptadoras que contienen el receptor coxsackie-adenovirus unido al CD40L murino o
humano (CFm40L o CFh40L) para transducir ex vivo CD con un adenovirus recombinante que codifica la proteína NS3 del VHC (AdNS3).
Se analizó la transducción, maduración e inmunogenicidad de las CD
in vitro e in vivo.
Resultados. CFm40L potenció la maduración de las CD de ratón,
la producción de IL-12, y aumentó la expresión de moléculas coestimuladoras 4-1BBL, OX40L y CD70. La transducción de las CD con
AdNS3 y CFm40L aumentó la presentación del antigeno NS3 in vitro,
resultando en una mayor activación de linfocitos T productores de IFNγ. Además, la inmunización de ratones con estas CD activó potentes
respuestas CD4 y CD8 frente al antígeno NS3. Del mismo modo,
CFh40L aumentó la transducción y maduración de las CD humanas
derivadas de monocitos. La comparación de las CD transducidas con
AdNS3 y CFh40L de pacientes con hepatitis crónica C o donantes sanos
mostraron niveles similares de maduración. Por último, en pacientes
con hepatitis crónica C, estas CD indujeron respuestas específicas frente a NS3, a diferencia de las CD transducidas únicamente con AdNS3.
Conclusión. Los resultados muestran que esta molécula adaptadora aumenta la eficacia de las CD transducidas con AdNS3, sugiriendo que esta estrategia podría aplicarse como vacuna terapéutica frente al VHC.
O-095
EFICACIA DEL RITUXIMAB EN EL TRATAMIENTO DEL PÉNFIGO FOLIÁCEO: ESTUDIO DE UNA PACIENTE. E. Zumaquero1,
S. Arias-Santiago2, S. García-Rodríguez1, A. García-Pérez1, P. Navarro1, M.A. Fernández-Pugnaire2, M. Zubiaur1, J. Sancho1. 1Instituto de
Parasitología y Biomedicina "López-Neyra", CSIC, Armilla (Granada), Armilla. 2Hospital Clínico Universitario San Cecilio, Granada.
Una mujer de 65 años ingresa en el Servicio de Dermatología por
cuadro de lesiones ampollosas y costrosas de dos meses de evolución
siendo diagnosticada de pénfigo foliáceo. La necesidad de dosis eleva-
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das de corticoides para controlar el cuadro determinan un síndrome de
Cushing yatrógeno por lo que se decidió iniciar tratamiento con Rituximab, a dosis de 375 mg/m2 una vez a la semana durante 4 semanas.
Objetivo del estudio. Hacer un seguimiento de los parámetros
inmunológicos y clínicos de la paciente antes y después del tratamiento con Rituximab.
Materiales y Métodos. Previo al tratamiento y después de cada infusión de Rituximab se procede a la extracción de sangre de la paciente y
de un control sano obteniéndose plasma y células mononucleares
(PBMCs). Usando un sistema multiparamétrico (BioPlex) se han cuantificado simultáneamente los niveles de 10 citoquinas en el plasma de la
paciente. El análisis de marcadores de superficie se lleva a cabo mediante citometría de flujo. Tras estimulación de los PBMCs con una mezcla
de los superantígenos SEE y SEB se estudia la formación de conjugados
y expresión de marcadores de activación por citometría de flujo, la formación de sinapsis inmunológicas maduras mediante microscopía confocal y la secreción de citoquinas en los sobrenadantes por BioPlex.
Resultados. Tras el tratamiento con Rituximab se observa: Depleción total de linfocitos B CD19+ desde la primera infusión, con descenso de los niveles de IgA sérica y mantenimiento de la IgG. Disminución de los niveles de IL-6 en plasma al inicio del tratamiento e incremento en fases posteriores. Aparición de una subpoblación de linfocitos T muy positiva para CD38. Fuerte disminución en la formación de
la sinapsis inmunológica, menor expresión de CD69 en respuesta a
superantígenos y menor producción de citoquinas. Sin embargo, la
mejora clínica no se hace evidente hasta trascurridos tres meses, no
apareciendo nuevas lesiones a lo largo de los dos años de seguimiento. La reconstitución parcial de linfocitos B CD19+CD20+ solo se observa a partir de 21 meses de tratamiento.
Discusión y Conclusiones. La disminución de la producción de
citoquinas y la menor capacidad de activación de los linfocitos T in
vitro parecen estar directamente relacionados con la ausencia de linfocitos B CD19+ en sangre periférica y la menor capacidad de presentación antigénica derivada de ello. Desde el punto de vista clínico, el
tratamiento con Rituximab permitió la reducción de dosis de corticoides y azatioprina, que producían importantes efectos adversos, con
desaparición de la mayoría de las lesiones a partir de los tres meses de
iniciarse el tratamiento. Rituximab se presenta como un tratamiento
de segunda línea para aquellos casos de pénfigo foliáceo rebeldes al
tratamiento convencional o para disminuir los efectos secundarios clásicos de los corticoides o inmunosupresores.
O-096
ESTUDIO DEL HLA SOLUBLE COMO MARCADOR DE RESPUESTA AL TRATAMIENTO INMUNOMODULADOR EN LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE. S. Mirete Bachiller1, R. Álvarez Lafuente2, L. Costa Frossard1, M. García Montojo2, N. Marín Crespo1, M.I. Domínguez
Mozo2, M. Espiño Martínez1, J.C. Álvarez Cermeño1, L.M. Villar Guimerans1. 1Hospital Ramón y Cajal, Madrid. 2Hospital Clinico San Carlos, Madrid.
Objetivo. Los antígenos de Clase I solubles (sHLA) ejercen un
papel inmunomodulador, induciendo la apoptosis de los linfocitos T
antivados. Los niveles séricos de estas moléculas aumentan en los
pacientes de esclerosis múltiple (EM) tratados con interferon beta
(IFNB). En este trabajo estudiamos si los niveles séricos de estas moléculas también aumentan durante el tratamiento con Acetato de Glatiramero y Natalizumab, otros fármacos que se utilizan actualmente
en la EM También comparamos la cinética del aumento de sHLA en
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las distintas presentaciones de IFNB y relacionamos los niveles de estas
moléculas con la respuesta clínica al tratamiento.
Materiales y Métodos. Se siguió durante 1 año a 65 pacientes con
EM que iniciaron diferentes tratamientos (14 Rebif, 11 Betaferon, 20
Avonex, 14 Copaxone, 6 Tysabri). Se monitorizó la aparición de brotes
o el aumento de discapacidad durante este tiempo.
La detección de sHLA en suero se realizó a través de un ELISA
puesto a punto en nuestro laboratorio. Se midió al inicio del tratamiento y a un mes, tres, seis y 12 meses. Además, se ensayó la presencia de
anticuerpos neutralizantes anti IFNB en todos los pacientes, a fin de
descartar que los resultados del estudio estuviesen afectados por la
aparición de dichos anticuerpos.
El análisis estadístico se realizo mediante Tests de Anova y U-Mann
Whitney
Resultados. Los niveles de sHLA no aumentan durante el tratamiento con Acetato de Glatiramero o Natalizumab. En cuanto al IFNB,
la cinética de aumento fue similar y más temprana en los pacientes tratados con IFNB a dosis más altas (Rebif y Betaferón). El aumento se aprecia al mes de tratamiento, alcanza el máximo a los tres meses y se mantiene constante a partir de entonces. La cinética de aumento de sHLA
para de pacientes tratados con IFNB a dosis más bajas (Avonex) fue más
tardía, alcanzando valores similares a los de Rebif y Betaferón a los 6
meses de tratamiento. Los porcentajes de aumento fueron similares en
los pacientes con una respuesta clínica completa y en aquellos que experimentaron brotes o aumento de discapacidad durante el tratamiento,
pero los valores basales fueron más bajos en estos últimos (0=.01).
Conclusiones. Pacientes tratados con interferón a altas dosis presentan un aumento temprano en las concentraciones de sHLA. La concentración de sHLA soluble de pacientes tratados con Avonex también
experimenta un aumento, que se iguala a partir de los 6 meses con los
de Rebif y Betaferon. Los niveles basales de sHLA fueron más elevados en pacientes con respuesta clínica completa. Esto podría indicar
una relación entre los niveles de estas moléculas y la respuesta a IFNB
en la EM. Sin embargo, no se observaron aumentos de sHLA en relación a los tratamientos con Acetato de Glatiramero o Natalizumab Esto
demuestra que esta molécula no se relaciona con el mecanismos de
acción de estos dos fármacos.
O-097
¿QUÉ INFLUENCIA TIENE LA EXPRESIÓN DE ZAP-70 EN LA
CAPACIDAD MIGRATORIA DE LAS CÉLULAS DE LEUCEMIA
LINFÁTICA CRÓNICA? M. Alfonso Pérez1, A.E. Beltrán1, S. Guasch
Vidal1, C. Cuesta Mateos1, J.M. Zapata2, C. Muñoz Calleja1. 1Hospital
Universitario de La Princesa, Madrid. 2Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”, CSIC/UAM.
Introducción y objetivo. La tirosina kinasa ZAP-70 (“70 Kd zeta associated protein”), en condiciones fisiológicas, se expresa en linfocitos T,
donde tiene un papel esencial en la transducción de señales tras la activación del receptor de células T. También se ha demostrado su expresión
ectópica en células tumorales de varios síndromes linfoproliferativos de
células B, entre ellos, la leucemia linfática crónica (LLC). En esta enfermedad, la positividad para ZAP-70 se considera un factor de mal pronóstico, si bien su papel patogenético no está bien caracterizado.
El receptor de quimioquinas CCR7 y sus ligandos, las quimioquinas homeostáticas CCL19 y CCL21, median el “homing” linfocitario
hacia órganos linfoides secundarios (OLS) y parecen responsables de
la localización de las células tumorales de LLC en OLS, considerados
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INMUNOLOGÍA
nichos de supervivencia para dichas células. En este sentido, se ha
sugerido que el peor pronóstico de los pacientes ZAP-70+ podría estar
en relación con una mayor capacidad migratoria de sus células tumorales en respuesta a los ligandos de CCR7 presentes en los OLS.
Objetivo. Estudiar cómo afecta la expresión de ZAP-70 a: 1) la
intensidad de expresión de CCR7 y su endocitosis tras la activación;
2) a los procesos de migración y adhesión celular en presencia de los
ligandos de CCR7.
Materiales y métodos. Se obtuvieron muestras de sangre periférica de pacientes que cumplían los criterios morfológicos e inmunofenotípicos de LLC, tras la firma de consentimiento informado según
requisitos de la declaración de Helsinki. La expresión de CCR7, ZAP70 y VLA-4 se analizó mediante citometría de flujo en las células B
CD19+. La expresión de ZAP-70 se cuantificó en forma de índice (MIF
linfocitos B/MIF linfocitos T), estableciéndose un punto de corte a partir del análisis de muestras de donantes sanos. Con células mononucleares aisladas mediante centrifugación en gradiente de densidad,
realizamos ensayos de migración en Transwell, de endocitosis de CCR7
y adhesión a fibronectina en presencia de CCL19 y CCL21.
Resultados
CCR7
n MFI
ZAP
-70 +
ZAP
-70 -
n
Migración (%)
Basal CCL19 CCL21
n
Adhesión (%)
Basal CCL19 CCL21
Endocitosis (%)
n CCL19 CCL21
11 182.7 ±
107.6
10
3.3 ± 51.4 ± 45.3 ±
5.0
61.5
52.7
4
40.3 ± 41.9 ±
42.4
52.6
36.7 ±
53.8
4 51.1 ± 37.9 ±
18.0
14.9
15 294.4 ±
186.5
11
1.6 ± 27.6 ± 39.1 ±
1.4
22.0
25.0
3
7.9 ±
6.8
4.6 ±
4.4
7 46.6 ± 25.3 ±
13.7
15.2
7.2 ±
8.5
Conclusiones. La expresión de CCR7 en células de LLC es ligeramente inferior en pacientes ZAP-70+ aunque los resultados no alcanzan significación estadística (p=0,089) A pesar de esta pequeña diferencia, ni la migración ni la adhesión a fibronectina en presencia de
CCL19 ó CCL21, son diferentes entre células de LLC ZAP-70+ y ZAP70-. Sin embargo, de forma interesante, la migración y la adhesión en
ausencia de estímulo tienden a ser mayores en células ZAP-70+, si bien
somos conscientes de la necesidad de aumentar el número de muestras. Por su parte, la endocitosis de CCR7 en presencia de sus ligandos
ocurre con igual intensidad en células de LLC ZAP-70+ que ZAP-70–.
Es por tanto posible que la capacidad invasiva “constitutiva” en
términos de migración y adhesión de las células de LLC ZAP-70+ sea
mayor que la de las ZAP-70-, diferencia que desaparecería ante un estímulo quimiotáctico.
SESIÓN 11: INMUNODEFICIENCIAS II
Moderadores: Nuria Matamoros (Palma de Mallorca)
Jose Ramón Regueiro (Madrid)
Materiales y métodos. Presentamos a una mujer que a los 57 años
se le diagnostica de IDVC; actualmente se encuentra en tratamiento
con inmunoglobulina intravenosa (IGIV). Al diagnostico presentaba
bronquiectasias e infecciones de repetición de vías respiratorias altas
con 1 episodio de neumonía extra-hospitalaria y artralgias, sin otra sintomatología típica de la IDVC. Las radiografías de tórax realizadas no
mostraron alteraciones patológicas, siendo consideradas normales, realizándose un TAC en el que se describe la presencia de bronquiectasias sin adenopatías ni otras alteraciones significativas.
Al año del diagnóstico la paciente acude al servicio de urgencias
por disfagia alta para sólidos de una semana de evolución acompañada de afonía intermitente y sensación de cuerpo extraño. No presenta síndrome constitucional asociado. Siendo valorada por otorrinolaringología, se constata la existencia de una adenopatía de 1 cm, blanda, no adherida y no dolorosa, que comprime estructuras anatómicas.
Se realiza una PAAF con diagnóstico de linfadenitis reactiva, sin presencia de células malignas en ganglio ni en sangre periférica. En aproximadamente 2 años, aparecen múltiples adenopatías látero-cervicales, submandibulares, mediastínicas, retroperitoneales y pélvicas, hepato-esplenomegalia, afectación difusa y generalizada del parénquima
pulmonar con múltiples imágenes nodulares. En ninguno de los estudios anatomopatológicos ni inmunológicos se ha observado malignidad siendo diagnosticados como granulomas no caseificantes.
Durante este tiempo debuta con trombopenia (168.000-140.000/μl)
de posible origen autoinmune, sin anemia ni otras citopenias.
Actualmente presenta un importante deterioro clínico general con
una gran disminución de su capacidad pulmonar y aparición de diarreas intermitentes sin aparente causa infecciosa, que no presentaba al
momento del diagnostico; el empeoramiento clínico está claramente
relacionado con el aumento del tamaño y numero de sus granulomas.
Resultados. En la IDVC está indicada la realización del estudio
de las sub-poblaciones linfocitarias, especialmente los linfocitos B (LB)
en estadios madurativos. Al diagnóstico, en la paciente se observó una
disminución de los LB de memoria (CD19+CD27+), inversión del
cociente CD4/CD8 y aumento de los linfocitos T activados; sin realizarse otros estudios de fenotipo. Posteriormente, a raíz de la clínica
que desarrolló la paciente, el estudio inmunofenotípico fue ampliado
acorde con lo descrito actualmente para las formas severas de la IDVC
granulomatosa (clasificación EUROclass).
Conclusión. Las alteraciones encontradas, sobre todo fenotipicas,
se correlacionan con la forma severa de la IDVC granulomatosa. Actualmente no se contempla dentro del protocolo de estudio la realización
de fenotipos especiales para detectar estas formas, ya que tampoco
se sabe si las alteraciones fenotípicas descritas actualmente se producen desde el comienzo de la enfermedad o aparecen evolutivamente.
Sin embargo, una vez establecida la forma granulomatosa, el deterioro es rápido y no se observa regresión de a pesar de las terapias actualmente aplicadas (corticoides, anti-TNF).
O-098
O-099
FORMA GRANULOMATOSA DE LA INMUNODEFICIENCIA
VARIABLE COMUN, A PROPOSITO DE UN CASO. I. Hidalgo Izaguirre, A. De Andres Martin, J.L. Castañer Alabau, G. Silva Carreras, E. Roldan Santiago. Hospital Ramon y Cajal, Madrid.
DEFICIENCIA DE ADA EN PACIENTE CON LINFOPENIA SEVERA Y NEUMONITIS INTERSTICIAL BILATERAL POR VIRUS DE
LA GRIPE H1N1. P. Talayero, E. Mancebo, S. Lermo-Rojo, V. Pérez-Aradas, L.I. González-Granado, J. Ruiz-Contreras, M. Menchén, M.J. DíazMadroñero, M.J. Castro, L.M. Allende. Hospital 12 de Octubre, Madrid.
Objetivos.Plantear la necesidad de consensuar protocolos de fenotipaje y manejo clínico de una de las formas más graves e incapacitantes de la IDVC.
Objetivo. Diagnóstico genético de lactante de 6 meses de edad remitido por sospecha clínica de Inmunodeficiencia Combinada Severa.
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Paciente y métodos. Varón de 6 meses de edad con neumonitis
intersticial bilateral por virus de la gripe A H1N1, gastroenteritis aguda por rotavirus y malnutrición grave. Se realizó estudio inmunológico de poblaciones linfocitarias e inmunoglobulinas y estudio genético
de secuenciación de las regiones codificantes de los genes RAG1, RAG2
y ADA.
Resultados. El estudio inmunológico reveló una linfopenia severa (100 células/µL) con fenotipo T- B- NK+ e hipogammaglobulinemia
(IgG 270 mg/dL, IgA <40 mg/dL, IgM <25 mg/dL). Ante la gravedad
del cuadro clínico e inmunológico presentado, se le realizó trasplante
de médula ósea de donante no emparentado con buen prendimiento.
Los resultados del estudio genético (que se obtuvieron tras la realización del trasplante) no revelaron ningún cambio respecto a la secuencia consenso en los genes RAG1 y RAG2, sin embargo se evidenciaron
dos cambios en heterocigosis (Leu107Pro; 1050-1054delGAAGA) en el
gen ADA. Dichos cambios ya estaban descritos como causantes de
SCID, y su presencia en heterocigosis fue confirmada en los progenitores.
Conclusiones. La deficiencia de ADA supone el 15% de las SCID
y el 30% de las SCID de herencia autosómica recesiva, siendo por tanto una de las etiologías genéticas más frecuentes. Este hecho hace que,
ante un cuadro clínico de patología pulmonar infecciosa severa o recurrente acompañado de la presentación de linfopenia muy severa, se
dirija el estudio genético hacia el gen ADA.
O-100
DEFECTOS EN LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL TCR EN HETEROCIGOTOS PARA MUTACIONES EN CD3GAMMA O DELTA.
M. Muñoz-Ruiz, V. Pérez-Flores, L.M. Allende, H. Takada, W.W. Schamel, S.S. Kiliç, O. Sanal, C.M. Roifman, E. Fernández-Malavé , J.R.
Regueiro. Universidad Complutense de Madrid/Facultad de Medicina,
Madrid.
Introducción. Los portadores de mutaciones graves en CD3G (γ+/–)
o CD3D (δ+/–) son sanos, pero muestran una pequeña reducción en el
número total de linfocitos αβ y γδ en sangre periférica. Tratamos, en
este contexto, de averiguar si presentan otros defectos en linfocitos T
y extender el trabajo a ratón.
Métodos. Citometría de flujo comparativa, biotinilación y ensayos funcionales.
Resultados. Un análisis detallado de la expresión en superficie del
TCR/CD3 usando un amplio rango de anticuerpos CD3-específicos
muestra una reducción consistente de su unión en heterocigotos (6090% de los controles). Esta reducción es estable in vitro en células T γ+/–
transformadas (40-60% de los controles). La biotinilación en superficie y el marcaje intracelular confirman estas observaciones, sugiriendo
que hay menos proteína CD3 en linfocitos humanos γ+/– y δ+/–. Las células T primarias de ratones γ+/–, δ+/– y ε+/– también muestran una unión
reducida de anticuerpos anti-CD3 (40-50% de los controles). De hecho,
algunos anticuerpos anti-CD3 (17A2, 7D6) no pueden distinguir entre
γ+/– y γ–/– en células Tαβ de ratón. La disminución en la expresión del
TCR en humanos y ratones correlaciona con defectos en parámetros
funcionales tardíos (proliferación inducida por anti-CD3, pero no por
IL-2 o PMA+ionomicina), mientras que los eventos tempranos de activación se encuentran disminuidos en humanos (inducción de CD69 en
γ+/–) y normales en ratones (inducción de CD69 en γ+/–, δ+/– o ε+/– ).
Conclusiones. Los heterocigotos portadores de mutaciones
en CD3G, CD3D y CD3E muestran un deterioro parcial pero con-
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sistente de la expresión y función del TCR/CD3. Estos resultados
podrían ser de valor diagnóstico (detección de portadores de mutaciones en CD3), pero también pueden dar información de la función específica de cada cadena si se objetivan defectos específicos
de cadena.
O-101
ESTUDIO POBLACIONAL DE LA DISTRIBUCIÓN DE LA MUTACIÓN E52DEL EN MYD88. L. Carretero-Iglesia1, M. Pascal1, O. Fernández1, D. Comas2, M. López-Nevot3, R. De Pablo4, O. Vall5, J.I. Aróstegui1, J. Yagüe1, A. Más6, M. Juan Otero1. 1Hospital Clinic i Provincial de
Barcelona, Barcelona. 2CEXS-UPF-PRBB, Spain. 3Hospital Universitario
Virgen de las Nieves, Universidad de Granada, Granada. 4Hospital Puerta de
Hierro, Madrid. 5Hospital del Mar, Barcelona. 6Australia, India, Francia.
La deficiencia de MyD88 es una Inmunodeficiencia primaria del
sistema inmune innato definida a través de 9 pacientes homozigotos
para mutaciones que bloquean la función de la molécula señalizadora de la vía TIR (Receptores TLR e IL1). Característicamente estos
pacientes presentan sensibilidad a Pneumococo, Staphylococcus aureus
y algunos gram negativos, desarrollando cuadros infecciosos habitualmente con poca inflamación e incluso sin fiebre. Además hacia los 910 años parece que desaparece esta sensibilidad y los individuos no
muestran mayor número de infecciones de lo habitual. De las 5 familias de la descripción inicial (von Bernuth H et al, Science 2008, 321:691)
3 de ellas acumulaban 6 individuos con la mutación 160del3, designada como E52del, todas ellas familias de la etnia gitana.
Objetivos. Definir el grado de penetración de la mutación E52del
en nuestra población especialmente en DNAs de población gitana sana,
y en otras poblaciones relacionadas.
Material y Métodos. Muestras de DNA genómico: 400 gitanos
españoles de diversos orígenes geográficos (Barcelona, Madrid y Granada), 100 gitanos de Bulgaria, 300 donantes no-gitanos españoles
sanos, 200 individuos de muestras de la India (estado de Gujarat). El
cribaje de la mutación se hace con Qiaxcel System (Qiagen) o con HRM
(High Resolution Melting) por PCR en tiempo real y se recomprueba
los casos de mutación por secuenciación convencional.
Resultados. En los resultados preliminares de 200 individuos de
etnia gitana, 9 de ellos eran heterozigotos para E52del (frecuencia alélica = 1,63 %), mientras que ninguno de los 200 no gitanos ni de los 100
hindúes estudiados mostraron la mutación.
Conclusiones. La inesperadamente alta prevalencia de esta mutación observada en estos estudios preliminares en la etnia gitana, tiene
una relevancia especial dada la alta consanguinidad observada en este
grupo. Los resultados obtenidos nos impulsan a ampliar el análisis a
una población mayor y a considerar que la posibilidad de detectar descendientes afectos es mayor de lo esperado.
O-102
EL GEN MSH5 NO ES UN FACTOR ETIOLÓGICO EN LA DEFICIENCIA SELECTIVA DE IGA PERO DEFINE AL SUBGRUPO DE
SUSCEPTIBILIDAD DE HLA-DRB1*0102. N. Del Pozo Rodríguez1,
L.M. Medrano1, A. Ferreira2, M.C. García Rodríguez1, C. Núñez1. 1Hospital Clínico San Carlos, Madrid. 2Hospital La Paz, Madrid.
Introducción. La etiología de la deficiencia selectiva de IgA
(DIgA) está influenciada por variantes genéticas en la región cromo-
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INMUNOLOGÍA
sómica 6p21, donde se localiza el HLA, aunque la susceptibilidad
observada no ha sido adscrita a ningún gen o genes específicos. Basándose en aspectos funcionales y estudios de asociación previos, se
ha propuesto un posible papel etiológico del gen MSH5, ubicado
en esa misma región cromosómica. Sin embargo, el extenso desequilibrio de ligamiento en la región HLA obliga a realizar análisis adicionales.
Nuestro objetivo ha sido evaluar el papel de ciertos SNPs del gen
MSH5 en DIgA, considerando su desequilibrio de ligamiento con
otros marcadores HLA clásicamente asociados (DRB1*0102 y B*08DR*03).
Material y Métodos. Realizamos un estudio con 146 tríos compuestos por individuos con DIgA y ambos progenitores, todos ellos de
origen caucásico. Todas las muestras fueron genotipadas mediante sondas TaqMan para 2 SNPs del gen MSH5: rs28381349 (L85F), en el exón
3; y rs3131378, en el intrón 12. El genotipado de otros marcadores HLA
se llevó a cabo mediante PCR-SSOP (Polymerase Chain Reaction – Sequence Specific Oligonucleotide Probe) o mediante ensayos TaqMan para SNPs
altamente correlacionados. El alelo minoritario de cada uno de los SNPs
de MSH5 estudiados se encuentra en un haplotipo de susceptibilidad HLA a DIgA (85F en HLA-DRB1*0102 y rs3131378_C en B*08DR*03), por ello los datos familiares se usaron para establecer los haplotipos incluyendo dichos marcadores, lo que permitió realizar análisis
estratificados.
Resultados. Los análisis TDT mostraron resultados significativos al considerar los polimorfismos estudiados en el MSH5. Sin
embargo, los análisis estratificados considerando otros alelos del
HLA excluyen un posible papel etiológico del gen MSH5. No obstante, el alelo minoritario del polimorfismo L85F define al subgrupo portador de susceptibilidad dentro de los portadores del
haplotipo DRB1*0102.
Conclusiones. El gen MSH5 no parece tener un papel etiológico
en DIgA, como previamente se había postulado. Sin embargo, el alelo
85F (rs28381349_T) permite definir, junto con DRB1*0102, un haplotipo de susceptibilidad a esta enfermedad. El factor causal dentro de ese
haplotipo ha de encontrarse en el extremo telomérico de HLA de clase II ó en HLA de clase I ó III, puesto que marcadores centroméricos
en HLA II presentan la misma composición alélica en todos los haplotipos que presentan DRB1*0102.
O-103
EFECTOS INMUNOLÓGICOS SECUNDARIOS AL ESTRÉS PSICOLÓGICO PRODUCIDO POR EL DIAGNÓSTICO DE CÁNCER
DE MAMA. A. Corell1, P. Mora2, N. López-Fernández1, M. Nocito2,
L. Barrero2, R. Reinoso3, M.E. Mateo1, M. Martino3. 1Universidad De
Valladolid, Valladolid. 2Hospital Clínico Universitario de Valladolid, Valladolid. 3IOBA-Universidad de Valladolid.
Objetivos. Determinar las alteraciones inmunológicas secundarias al estrés psicológico asociado al diagnóstico de cáncer de
mama en mujeres españolas y evaluar su evolución al año del diagnóstico.
Material y métodos. 80 mujeres diagnosticadas de cáncer de
mama participaron en este estudio prospectivo. El nivel de estrés psicológico y la ansiedad atribuible al diagnóstico del cáncer fueron evaluados mediante tests psicológicos (STAI). Para la evaluación del sistema inmune se analizaron diferentes parámetros inmunológicos: 1)
inmunoglobulinas séricas y factores de complemento; 2) subpobla-
ciones linfocitarias, viabilidad y etapa apoptótica, capacidad fagocítica y explosión oxidativa de monocitos y granulocitos; 3) función
celular adaptativa, medida como la producción de ATP de los linfocitos CD4 tras la estimulación con PHA. Todos estos parámetros fueron analizados en el momento de la intervención quirúrgica (extirpación del tumor) y un año después de la operación, tras haber concluido todos los tratamientos quimioterápicos y/o radioterápicos
post-quirúrgicos.
Resultados. La respuesta funcional de las células CD4 aumentó
significativamente al año de la intervención. El índice de producción
de ATP (estimuladas/basal) en el momento de la intervención fue de
5.3 mientras en la segunda visita (tras cirugía y tratamiento) dicho
índice de ATP ascendió a 11.9, siendo esta diferencia estadísticamente significativa. En cuanto a la inmunidad innata, tanto la capacidad
fagocítica como la respuesta oxidativa de los monocitos fueron significativamente superiores al año de haber sido tratadas respecto al
momento de la cirugía. Hubo correlaciones significativas entre el
nivel de estrés y/o ansiedad y los parámetros inmunológicos estudiados.
Conclusiones. El estrés psicológico asociado al cáncer de mama
provoca alteraciones inmunológicas disminuyendo la respuesta celular innata y adaptativa. Estas alteraciones son dependientes del grado
de estrés y ansiedad. Una vez que el estrés cesa y se ha “superado”
la enfermedad, se produce una recuperación de la capacidad fagocítica y de la respuesta oxidativa de los monocitos, así como una clara
mejoría de la respuesta funcional de los linfocitos T CD4.
O-104
HIPERZINCEMIA: SÍNDROME AUTOINFLAMATORIO CRÓNICO E INFECCIÓN RECURRENTE. I. Sologuren Marrero1, I. Barrios
Del Pino2, E. Herrera Ramos1, R. López Almaraz2, E. Santiago Quintana1, Y. Florido Ortega1, N. Gonzálrz Quevedo1, E. Colino Gil3, O.
De La Calle4, J.I. Aróstegui Gorospe5, C. Rodríguez Gallego5. 1Hospital Universitario de Gran Canaria "Dr" Negrín, Las Palmas De Gran Canaria. 2Hospital Universitario De Canarias, Santa Cruz De Tenerife. 3Hospital Universitario Insular Materno Infantil, Las Palmas De Gran Canaria. 4Hospital Sant Pau, Barcelona. 5Hospital Clínic De Barcelona, Barcelona.
Introducción. Las inmunodeficiencias primarias (IDP) son un
grupo heterogéneo de enfermedades. Los pacientes presentan generalmente infecciones recurrentes, aunque los síndromes autoinflamatorios se caracterizan por episodios no provocados de inflamación. Entre estos últimos cabe destacar las inflamasomopatías (alteraciones en la activación de IL-1β, Fiebre Mediterránea Familiar
–FMF-, Síndrome hiper IgD –HIDS-, criopirinopatías –FCAS, MWS,
NOMID/CINCA-) y los defectos del TNF-receptor (TRAPS), que
presentan episodios de inflamación estériles, crónicos o generalmente periódicos.
Paciente. Varón con infecciones recurrentes por Gram negativos
desde los 17 días de edad: abscesos perianales y de glúteo, absceso
hepático por E. coli y sepsis nosocomial por P. aeruginosa. El paciente
presentaba frecuentemente neutropenia, anemia y trombocitopenias
graves. Retraso estaturo-ponderal.
Resultados. En cultivos de sangre total no activados se observaron valores muy altos de citocinas inflamatorias, que no respondían
a la estimulación con lipopolisacáridos. Se confirmó un síndrome de
inflamación crónico: PCR 75-206 mg/L; VSG 72-164 mm/hora; ferri-
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tina 941-4652 mg/dL; fibrinógeno 713 mg/dL y fiebre persistente, incluso en ausencia de infección. Se descartaron IDP clásicas, los síndromes
autoinflamatorios asociados a inflamasoma, TRAPS y otros síndromes
autoinflamatorios.
La presentación clínica sugirió síndrome de hiperzincemia e hipercalprotectinemia, una enfermedad muy rara (7 casos descritos), que se
cree debida a una alteración de la producción de calprotectina
(S100A8/A9). Se confirmaron valores extremadamente altos de Zn y
S100A8/A9. Al compararlo con pacientes con HIDS, FMF, CINCA/
NOMID, o TRAPs, el niño presentaba valores hasta 1000 veces más
elevados de S100A8/A9 y de S100A12 (dos alarminas del citoplasma
del neutrófilo con potente actividad proinflamatoria), niveles similares de IL-6 y elastasa de neutrófilos e inferiores de IL-8. El paciente fue
tratado con ciclosporina A (CsA) y seguido durante dos años. Se aprecia una remisión de los síntomas de la enfermedad (fiebre, PCR, hemoglobina, clínica), que correlaciona perfectamente con la bajada de niveles de IL-6, pero no se aprecia efecto en otros mediadores proinflamatorios (S100A8/A9, S100A12, TNF-α, IL-1B, IL-8) o con niveles de
Zn.
Conclusiones. El déficit de hiperzincemia causa una IDP con
aumento de susceptibilidad a infección y síndrome autoinflamatorio
persistente, no periódico. Responde a tratamiento con CsA, con un
efecto clínico que correlaciona con bajada de niveles de IL-6 sérica. No
se conoce la etiología. Nuestros datos indican que no es debido a desregulación de S100A8/A9.
O-105
LINFOPENIA CD4+ IDIOPÁTICA Y NIVELES DE EXPRESIÓN
CD95/FAS: CORRELACIÓN CON SUSCEPTIBILIDAD A LA APOPTOSIS. F. Silva Carreras , I. Hidalgo Izaguirre, R. Alenda Asensi, E.
Roldan Santiago, J.L. Castañer Alabau, A. Andrés Martín. Hospital
Ramon y Cajal, Madrid.
Objetivos. Caracterizar la linfopenia CD4+ idiopática como una
entidad asociada a la sobreexpresión de CD95/Fas mediante análisis
por citometría de flujo.
Material y Métodos. Dos pacientes varones de 48 y 65 años
en los que se observó una progresiva inversión del cociente
CD4/CD8 con serología negativa para VIH, virus linfotrópicos T y
ausencia de otras inmunodeficiencias primarias. Caso 1: asintomático desde el inicio remitido por linfopenia importante (346/μL)
observado en un hemograma. Caso 2: asintomático y remitido por
inversión de cociente CD4/CD8 (0,6 y valor absoluto de linfocitos
T CD4+ 282/μL), hallazgo durante seguimiento por una adenopatía en la que el estudio citológico por PAAF fue compatible con proceso reactivo.
Se estudió el porcentaje y el nivel de expresión del antígeno CD95
en los linfocitos CD4+ de ambos pacientes y de controles sanos, así
como la inducción in vitro de apoptosis con el anticuerpo anti-CD95
(clon CH11), determinada como células Anexina + en cultivos de 24
horas.
Resultados. El porcentaje de células positivas para el antígeno
CD95 en la población T CD4+ en controles sanos fue muy variable, por
lo que no fue un buen parámetro diferenciador con respecto a los enfermos. Por el contrario, se detectó una población con intensidad media
de fluorescencia (IMF) para CD95-PE ≥ 300 (unidades arbitrarias),
población no presente en sanos. Tal IMF correlacionó con la apoptosis
in vitro, tanto espontánea como inducida con el clon CH11 (apoptosis
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espontánea: 48% en enfermos, 8% en sanos; apoptosis inducida: 64%
en enfermos, 15% en sanos).
Conclusiones. El nivel de expresión de CD95 es un excelente indicador de la linfopenia CD4 idiopática que, además, indica un “switch”
del antígeno desde su forma inactiva hasta su forma activa.
O-106
INMUNODEFICIENCIA TAB-GD+B+NK+ DE COMIENZO TARDÍO CAUSADA POR UNA MUTACIÓN DE SPLICING EN EL GEN
CD3D. C. Chean Pacheco1, J. Navarro Capistegui1, D. Gurbindo Gutierrez1, I. Gordillo Gutierrez1, P. Pérez Breña2, M.C. García Rodríguez3,
P. Aparicio Rubio3, M.J. Recio4, J.R. Regueiro4, J. Gil Herrera1. 1Hospital General Universitario Gregorio, Madrid. 2Centro Nacional de Microbiologia, Madrid. 3Hospital Universiario La Paz, Madrid. 4Universidad Complutense ee Madrid.
Introducción. Todos los pacientes descritos con defectos en CD3‰
presentan inmunodeficiencia combinada severa (IDCS) en el primer
semestre de vida y ausencia completa de linfocitos T incluyendo ambos
linajes α/β y γ/δ.
Objetivo. Estudiar las características diferenciales de un caso de
IDCS causada por una mutación de splicing en el gen CD3D.
Paciente y Métodos. Varón diagnosticado de IDCS a los 14
meses, con retraso ponderoestatural, dermatitis atópica, muguet,
neumonía, crisis epileptiformes, diarrea por Cryptosporidium y colangitis esclerosante. Sometido a trasplante de progenitores hematopoyéticos (TPH, alogénico de donante familiar haploidéntico) a los
22 meses; el día +10 post-TPH presentó recuperación leucocitaria,
y +12 un 100% de células del donante en sangre periférica (XX, por
FISH con sonda CrX/Y). Utilizamos citometría de flujo (BD Bioscience), incorporación de H3Thy, nefelometría, ELISA y hemaglutinación.
Resultados. Al ingreso, los linfocitos totales eran normales (3300
células/μL) con linfopenia T (14%, 532 células/μL) a expensas de células TCR αβ+ (CD4+ y CD8+, fenotipo de memoria y repertorio Vβ limitado), y un número normal de células TCRγδ+; ambas coexpresaban
CD25 y eran de origen antólogo. El tamaño del timo era normal pero
las células T CD4+CD45RA+CD31+ permanecieron muy bajas hasta el
TPH. A pesar de la expresión reducida de CD3, TCRαβ y TCRγδ, encontramos respuestas linfoproliferativas T in vitro. Los linfocitos NK (29%,
1102 células/μL) y B (54%, 2054 células/μL) eran normales, así como
la IgG, IgA e IgM séricas.
Sin embargo, no se indujeron respuestas específicas tras inmunización (toxoide tetánico, virus Influenza y VHB). La hiperIgE
(2141-4525 KU/L) e hipereosinofilia (800 – 5200/μL) se mantuvieron durante toda la evolución pre-trasplante. 9 meses post-TPH, los
linfocitos CD3+ (3496/μL) se han normalizado, revertido la relación
entre TCRα/β (36%) γ/δ (1%), aumentado la cifra de
CD4+CD45RA+CD31+, y descendido la IgE sérica a 235 KU/L. La
sintomatología digestiva ha mejorado, y desaparecido la presencia
de Cryptosporidium en heces.
Conclusión. Se trata del primer caso de inmunodeficiencia
selectiva de células T α/β (Tα/β–γδ+B+NK+), y se asocia con un
repertorio limitado de células T funcionales, comienzo tardío de
las manifestaciones clínicas y rasgos Ommen-like. La reversión
de las alteraciones inmunológicas y mejoría clínica del paciente
tras el TPH apoyan la patogenicidad de esta nueva mutación en el
gen CD3D.
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INMUNOLOGÍA
SESIÓN 12: INMUNOLOGÍA TUMORAL
Moderadores: Ignacio Melero (Pamplona)
Angel M. García Lora (Granada)
O-107
REGRESIÓN DE METÁSTASIS TRAS INMUNOTERAPIA: IMPLICACIÓN DE GENES EFECTORES DE LA RESPUESTA INMUNITARIA Y LA PRESENTACIÓN ANTIGÉNICA. R. Carretero1, E.
Wang2, A.I. Rodríguez1, A. Engle1, M.L. Ascierto1, F. Camacho3, F.M.
Marincola2, F. Garrido1, T. Cabrera4. 1Hospital Universitario Virgen de las
Nieves, Granada. 2National Institutes of Health. 3Hospital Universitario Virgen del Rocio, Sevilla. 4Universidad de Granada, Granada.
Objetivos. Los tratamientos contra el cáncer basados en la activación
de la respuesta inmunitaria no están demostrando los resultados esperados. Solo un bajo porcentaje de pacientes muestran una completa regresión tumoral, mientras que otro gran porcentaje no muestra una respuesta a la terapia, existiendo un grupo de respuesta mixta (regresoras y progresoras). El objetivo de este estudio es el análisis del patrón de expresión
genómica de las diferentes lesiones de un paciente con respuesta mixta.
Material y metodos. Tras tratamiento inmunoterápico con células tumorales antólogas más BCG, se obtuvieron 5 metástasis, 3 progresoras y 2 regresoras. El patrón de expresión génica analizado mediante microchips de expresión génica (30000 genes). Mediante el programa IPA se estudiaron las interacciones entre los genes diferencialmente expresados y las rutas metabólicas afectadas. Los resultados se confirmaron mediante marcaje con anticuerpos monoclonales.
Resultados. Se detectaron diferencias significativas en 424 genes
(p<0,05) entre metástasis regresoras y progresoras. 131 de los genes sobreexpresados en metástasis regresoras están implicados directamente en
la respuesta inmunitaria, incluyendo HLA clase I y II, genes activados
por interferón (ISGs)como IRF1 y STAT 1 y moléculas efectoras (IEFs)
como granzima B CD16, TCR… Las rutas metabólicas activadas durante la regresion son la presentación antigénica y el rechazo inmunitario.
Las tinciones inmunohistoquímicas mostraron que existe un patrón de
infiltración diferente entre los 2 grupos de metástasis, y que las metástasis progresoras no tienen expresión de HLA B y C
Discusión. Los análisis demostraron claramente que las metástasis en regresión tienen mucho más activadas las vías del rechazo inmunitario (ISGs e IEFs). Por lo tanto se demuestra que la inmunoterapia
es capaz de activar la eliminación de alguna metástasis, pero otras pueden evitarla y progresar. Los datos muestran que las moléculas HLA
juegan un papel fundamental en el reconocimiento y eliminación tumoral. Si la inmunoterapia no puede recuperar la presentación de antígenos tumorales a los linfocitos, se impide que el sistema inmunitario
pueda reconocerlo y activar la respuesta de rechazo frente al tumor.
O-108
NIVELES SÉRICOS DE INTERLEUCINA 6 EN PACIENTES SOMETIDOS A COLONOSCOPIA DIAGNÓSTICA POR SOSPECHA DE
CÁNCER COLORRECTAL. A. Fernández Suárez, M.A. Marín Moreno, J.L. Domínguez Jiménez, J.M. Aguilar Benítez, J.J. Puente Gutiérrez, D. Fatela Cantillo, M.J. De La Torre Calzada, O. Elorza Maza,
J.M. Díaz Iglesias. Hospital Alto Guadalquivir, Andújar.
Introducción. La interleucina-6 (IL-6) es una citocina pleiotrópica perteneciente a la familia de las hematopoyetinas. Está implicada
en la activación de los hepatocitos para provocar la síntesis de proteínas de fase aguda La producción de IL-6 se induce rápidamente en
las reacciones inflamatorias que acompañan la muerte cerebral, lesiones, traumas, estrés, infecciones y diversas neoplasias.
Objetivos. Determinar los niveles séricos de la IL-6 en pacientes
con sospecha de cáncer colorrectal (CCR) sometidos a colonoscopia
diagnóstica, para evaluar su utilidad como marcador en esta patología. Como objetivo secundario se intentará averiguar si existe alguna
relación entre la concentración de IL-6 y las principales variables pronósticas (anatomía patológica).
Material y Métodos. Los pacientes incluidos procedían de tres
hospitales de la provincia de Jaén adscritos a la Empresa Pública Hospital Alto Guadalquivir. Todos los pacientes presentaban sospecha clínica de CCR, siendo remitidos por Aparato Digestivo a la Unidad de
Endoscopias para realizar una colonoscopia diagnóstica. Se recogieron muestras de suero consecutivamente entre abril de 2008 y julio de
2009. Todos los análisis fueron realizados antes del procedimiento de
colonoscopia. Se tuvieron en cuenta los ritmos circadianos de la IL-6,
realizando todas extracciones de suero a la misma hora de la mañana
(10:30 horas). Los niveles séricos de IL-6 (pg/mL) se analizaron mediante un inmunoensayo "ECLIA" de electroquimioluminiscencia concebido para ser utilizado en los analizadores cobas e601 del Modular cobas®
6000 (Roche Diagnostics). Los niveles séricos de IL-6 no seguían una
distribución normal. Los datos se analizaron mediante el programa
SPSS, versión 11.0.
Resultados. Se recogieron muestras de suero a 170 pacientes [edad
media 61.5 años (20-93), 54.1% mujeres]. La colonoscopia seguida de
la anatomía patológica confirmó el diagnóstico de CCR en 30 pacientes. El resto de diagnósticos encontrados fueron: 36 pacientes presentaron pólipos (20 hiperplásicos y 16 adenomas, siendo 11 de ellos adenomas avanzados), 59 enfermedades digestivas benignas, 5 neoplasias
no CCR, 4 otras patologías no tumorales ni digestivas (cólico nefrítico, EPOC, síndrome de Sjögren, pólipos endometriales), y en 36 pacientes no se evidenció ninguna patología relevante. La mediana (percentil 25 – percentil 75) de la concentración sérica de IL-6 para el grupo con CCR fue 5.68 pg/mL (3.77-10.17), para el grupo de pólipos 3.09
pg/mL (2.00-6.16), para el grupo con enfermedades digestivas benignas 2.48 pg/mL (1.58-6.05), para otros cáncer no CCR 8.55 pg/mL (1.6311.73) y para los pacientes sin evidencia de enfermedad 2.77 pg/mL
(1.66-3.96). De acuerdo a la clasificación TNM, los niveles de IL-6 para
T1, T2, T3 y T4 fueron 1,75 pg/mL (1.50-2.00), 4.72 pg/mL (2.93-8.55),
5.54 pg/mL (4.00-9.40) y 30.03 pg/mL (20.10-51.65) respectivamente.
Sólo se encontraron diferencias significativas para T4 (p=0.021). Se
encontraron valores muy elevados para N3 y M1. Los niveles de IL-6
sólo correlacionaron con las variables tamaño tumoral (cm) y tumor
primario (Rho de Spearman 0.433, p=0.027 y 0.435, p=0.021 respectivamente). La IL-6 no mostró ninguna variación en su concentración
dentro del grupo de pólipos (tamaño, morfología o número de pólipos, tipo de adenoma, presencia de adenoma avanzado). El área bajo
la curva ROC (95% CI) para la IL-6 fue de 0.691 (0.587–0.795). Un punto de corte de 6.7 pg/mL de IL-6 mostraba una sensibilidad del 43.3%
con una especificidad del 80.7% para la detección del CCR.
Conclusiones. La rentabilidad diagnóstica de la IL-6 para la detección del CCR es limitada, mostrando una sensibilidad similar a la del
antígeno carcinoembrionario (CEA). Por otra parte, su especificidad
es moderada, y no está restringida a este tipo de tumor, comportándose como una proteína de fase aguda. Su correlación con las variables
tamaño tumoral y tumor primario (T) podría indicar una potencial
aplicación como marcador pronóstico.
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O-109
DESCUBRIMIENTO DE BIOMARCADORES ÚTILES EN EL DIAGNÓSTICO PRECOZ EN CÁNCER COLO-RECTAL MEDIANTE LA
DETECCIÓN DE AUTO-ANTÍGENOS. M. Fuentes García1, M. González González1, J.M. Sayagües1, R. Bartolome Casado1, J. Labaer2, J.
García1, A. Orfao1. 1Universidad de Salamanca-CSIC, Salamanca. 2Center for Personalized Medicine, Tempe, United States.
Los biomarcadores, particularmente aquellos con un alto valor predictivo, tienen un elevado potencial en Oncología, incluyendo la monitorización de la terapia o indicando progresión y/o detección precoz.
Para descubrimiento de biomarcadores se ha empleado el propio sistema inmune del individuo, el cual produce respuestas humorales frente a proteínas antigénicas tumorales provenientes de alteraciones en
niveles de expresión, mutación, degradación y/o localización. La presencia de anticuerpos frente proteínas tumorales antigénicas puede realizarse incluso antes de la aparición del cáncer. El reciente desarrollo de
arrays de proteínas ofrece una herramienta ideal para el cribado selectivo de miles de proteínas frente a los sueros de los pacientes.
Objetivos. Detectar auto-anticuerpos frente a proteínas tumorales antigénicas de pacientes de cáncer colo-rectal en diferentes estadios
sin presentar metástasis y su posterior validación.
Metodología. Mediante un novedoso sistema de arrays de proteínas, denominado NAPPA (Nucleic Acids Programmable Protein Arrays)
(Science 2004, 305:86-90, Nature Methods 2008, 5:535-8) se realizará
el screening de 25 sueros de pacientes con Cancer-Colorectal y 25 pacientes pre-y post- tratamiento neoadyuvante frente a más de 2000 proteínas humanas tumorales antigénicas.
Resultados y Conclusión. Se han detectado anticuerpos frente a
proteínas tumorales como por ejemplo entre otras: K-RAS, p53,
CXCL1,SPARC, gastrin,… Estos resultados se han validado mediante
iFISH (Fluorescence in situ hybridization) y SNPs arrays mostrando alteraciones genéticas en aquellas células tumorales diferentes en aquellos
pacientes con respuesta favorable en el tratamiento neoadyuvante.
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en los pacientes con respecto al porcentaje de dichas células encontrado
en las muestras de sangre de los individuos control (3,3±2,5% vs 0,4±0,5%;
p=0,014). Las diferencias son casi significativas cuando se consideran las
muestras de sangre de los pacientes (3,3±2,5% vs 0,8±1%; p=0,052). También hay diferencias significativas en la proporción de células CD4+FOXP3+
(CD25–), que se ve aumentada en el tejido tumoral con respecto a la encontrada en sangre tanto de pacientes (3,2±2,1% vs 0,6±0,7%; p=0,03) como
de individuos control (3,2±2,1% vs 0,14±0,1%; p=0,014).
Además, hemos encontrado células CD8+ LAP+ en el tejido tumoral de pacientes, significativamente incrementadas con respecto a lo
encontrado en la sangre de individuos control (2,6±1,8% vs 0,4±0,6%;
p=0,034). Sin embargo, no hay diferencias significativas en la población CD4+ LAP+. Si consideramos el parámetro LAP+ (independientemente del fenotipo CD4+ o CD8+) se alcanza una significación marginal (p=0,05) cuando comparamos tejido tumoral y sangre de controles. Creemos que es la primera vez que se describe este hallazgo en
humanos. Estudios previos habían descrito la presencia de células CD8+
LAP+ en un modelo animal de EAE con un papel supresor. En conjunto, nuestros datos sugieren un incremento de la expresión de LAP en
pacientes respecto a sanos, independientemente del origen (sangre o
tejido) o el tipo (CD4 o CD8) de la población celular analizada.
Finalmente, no se han encontrado datos relevantes con relación
a la población de células Th17.
Conclusiones. Estos resultados sugieren que los mecanismos inmunológicos de inmunosupresión (Treg) están más presentes en el ambiente tumoral que mecanismos de proinflamación (Th17) y que, dentro de
la función reguladora/inmunosupresora, no sólo las células del linaje CD4, ampliamente estudiadas, tienen un papel, sino también las
células CD8.
*Este trabajo ha sido financiado por el Fondo de Investigación Sanitaria (FIS) (PS09/02096).
Ana Aguinaga Barrilero es beneficiaria de una beca predoctoral concedida por la Universidad Complutense de Madrid (UCM).
O-111
O-110
INFILTRACIÓN DE CÉLULAS T REGULADORAS (CD4+ FOXP3+) Y CD8+
LAP+ Y AUSENCIA DE CÉLULAS TH17 EN PIEZAS TUMORALES DE
PACIENTES CON ADENOCARCINOMAGÁSTRICO.A. Aguinaga Barrilero1, A. Gutiérrez Calvo2, J.M. Martín Villa1. 1Facultad de Medicina, UCM, Madrid.
2Hospital Universitario Príncipe de Asturias.
Objetivo. Se han realizado diversos estudios sobre la posible
influencia de las células T reguladoras de las células Th17 en la proliferación de los tumores. Nuestro objetivo es valorar simultáneamente
la presencia de ambas poblaciones en pacientes con adenocarcinoma
gástrico.
Material y métodos. Se han obtenido muestras de tejido tumoral
y de sangre de 4 pacientes, 2 muestras de sangre adicionales de pacientes y 5 muestras de sangre de individuos control. Se han valorado por
citometría de flujo marcadores de superficie y citoquinas específicas
de las distintas poblaciones T (CD3, CD4, CD8, CD25, FOXP3, IL-17,
IL-4, IFNγ). Como citoquina asociada a las células T reguladoras se ha
analizado en este estudio el TGF‚ a través de la expresión de LAP
(latency associated peptide), que forma el complejo inactivo latente
TGF‚ y se detecta en la superficie celular.
Resultados. Los resultados obtenidos revelan un aumento significativo de células T reguladoras (CD4+CD25+FOXP3+) infiltrantes del tumor
54
LA DEFECTUOSA EXPRESIÓN DE LA CADENA CD3ZETA EN
LINFOCITOS T DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON
ADENOCARCINOMA GÁSTRICO NO SE DEBE A CAMBIOS EN
LA SECUENCIA DEL CDNA NI A BAJOS NIVELES DEL CORRESPONDIENTE ARNM. A. Aguinaga Barrilero1, M. Pérez Blas1, A. Gutiérrez Calvo2, N. Rodríguez Pérez1, A. Blázquez2, I. Lasa2, J. Martín2, J.M.
Martín Villa1. 1Facultad de Medicina, UCM, Madrid. 2Hospital Universitario Príncipe de Asturias.
Objetivo. Estudiar la expresión de la cadena CD3ζ en linfocitos T
de sangre periférica en un grupo de pacientes con adenocarcinoma
gástrico.
Material y métodos. Se obtuvieron muestras de sangre mediante venopunción de 34 pacientes con adenocarcinoma gástrico y 19 individuos sanos control y se aislaron linfocitos T de sangre periférica. Además, se obtuvo ARNm mediante extracción con Trizol y se retrotranscribió a cDNA. La determinación de los marcadores celulares (CD3ζ,
CD3ε y CD45), se realizó mediante citometría de flujo. Se realizó secuenciación del cDNA obtenido y se midieron los niveles de ARNm mediante PCR cuantitativa.
Resultados. Se observó una expresión disminuida de la cadena
CD3ζ en linfocitos T de pacientes, tanto en porcentaje de células que
expresan esta cadena (91±8% vs 93±9%, p=0.04) como en valor de fluorescencia media (Mean Fluorescence Intensity, MFI; 405±516 vs 729±479,
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INMUNOLOGÍA
p=0.057). De una manera concordante, otras cadena pertenecientes al
complejo TCR-CD3, (tal como CD3ε) mostraron también una menor
expresión (68±15% vs 77±6%, p=0.03; MFI 265±64 vs 334±74, p=0.002),
mientras que otras moléculas fuera de este complejo (CD45) no mostraron diferencias. Estudios adicionales de secuenciación del cDNA de
CD3ζ y medición de niveles del correspondiente ARNm, no revelaron
diferencias entre los pacientes y los individuos control.
Conclusiones. Se confirma una baja expresión de la cadena CD3ζ
en linfocitos T de sangre periférica en pacientes con adenocarcinoma
gástrico. El hecho de no encontrar diferencias en el cDNA ni en los
niveles de ARNm apunta a que el defecto responsable de esta baja
expresión parece estar localizado a nivel post transcripcional.
*Este trabajo ha sido financiado por el Fondo de Investigación Sanitaria (FIS) (PI050572).
Ana Aguinaga Barrilero y Noelia Rodríguez Pérez son beneficiarias de una beca predoctoral concedida por la Universidad Complutense de Madrid (UCM).
O-112
INDUCCIÓN DE APOPTOSIS EN CÉLULAS T LEUCÉMICAS POR
LOS INHIBIDORES DE METILACIÓN DE ADN ZEBULARINE Y
DECITABINE. M.J. Ruiz Magaña, J.C. Morales Camino, M.A. Saldivia, M.D.C. Ruiz Ruiz. Universidad de Granada/Cibm, Armilla.
Objetivos. Las alteraciones epigenéticas juegan un papel fundamental en el desarrollo y progresión de tumores. Una de las principales modificaciones epigenéticas en humanos es la metilación del
ADN, alteración que suele provocar el silenciamiento de genes supresores de tumores. Existen compuestos farmacológicos que inducen la
hipometilación del ADN y pueden revertir estas mutaciones siendo de
gran interés en la terapia antitumoral. El objetivo de este trabajo ha
sido conocer el efecto de los agentes desmetilantes decitabine y zebularine en células T leucémicas y en linfocitos T normales y su capacidad para inducir apoptosis en dichas células.
Material y métodos. Como células T leucémicas se usaron las líneas celulares Jurkat, CEM-6 y MOLT-4. Los linfocitos T normales se aislaron por selección negativa a partir de muestras de sangre de donantes voluntarios sanos; se activaron con fitohemaglutinina y anti-CD28
durante 20 horas y se mantuvieron 5 días en medio suplementado con
IL-2. La determinación de células apoptóticas se realizó mediante
tinción con ioduro de propidio y análisis citofluorimétrico. La expresión de proteínas se analizó mediante Western Blot. La producción de
especies reactivas de oxígeno, la caída de potencial de membrana mitocondrial y la activación de la proteína pro-apoptótica Bak se ensayaron mediante citometría de flujo. El daño al ADN se determinó mediante ensayo cometa.
Resultados. Decitabine y zebularine inducen apoptosis dependiente de caspasas y de la activación de la ruta intrínseca o mitocondrial en líneas celulares T leucémicas, pero no en células T normales,
en reposo o activadas. Además, estos agentes desmetilantes inducen
daño al ADN y regulan la expresión de proteínas relacionadas con la
inducción de apoptosis (como Apaf-1, Bax o c-IAP2). Las cinéticas de
inducción de apoptosis, de inducción de daño al ADN y de regulación
de proteínas sugieren que el mecanismo de acción antitumoral de estos
agentes podría ser en cierto modo independiente de su actividad como
inhibidores de la metilación del ADN.
Conclusiones. Los agentes desmetilantes decitabine y zebularine
pueden ser una estrategia terapéutica interesante en el tratamiento de
leucemias de células T dados sus múltiples efectos y su acción selectiva sobre células leucémicas.
O-113
REGULACIÓN DE LA ACCIÓN CITOTÓXICA DE LINFOCITOS
T ACTIVADOS POR INHIBIDORES DE HISTONA DEACETILASAS. C. Ruiz-Ruiz, C. Gómez-Jiménez, M.J. Ruiz-Magaña, M.A. Saldivia. Universidad de Granada, Armilla
Objetivos. Los inhibidores de histona deacetilasas (HDACi) regulan la expresión de proteínas relacionadas con apoptosis, como ligandos y receptores de muerte, en células tumorales, induciendo así apoptosis en dichas células y modulando su sensibilidad a otras drogas terapéuticas. Nosotros hemos estudiado la posible capacidad de los HDACi para regular la expresión de ligandos de muerte en células con capacidad citotóxica y de esta manera potenciar la acción de las mismas
sobre células tumorales.
Material y métodos. Se obtuvieron PBMCs de donantes voluntarios sanos por centrifugación en gradiente Ficoll-Histopaque y se descartaron los monocitos tras adhesión al frasco de cultivo. Las células T
se aislaron por selección negativa mediante separación magnética y su
activación se llevó a cabo por incubación durante 20 horas en presencia
de fitohemoaglutinina-M y anti-CD28. Las células T activadas se utilizaron tras 5 días de cultivo en medio suplementado con IL-2. Como
modelos de células tumorales se usaron células HeLa, SKBr3 y MCF-7
y como células normales células dediduales estromales. Los HDACi utilizados fueron vorinostat, MS-275, ácido valproico y butirato sódico. La
determinación de células apoptóticas se realizó mediante citometría
de flujo tras tinción del ADN con ioduro de propidio. El análisis de expresión de proteínas de membrana se llevó a cabo mediante citometría de
flujo y la expresión de ARNm se determinó mediante PCR a tiempo real.
Resultados. El cocultivo de células tumorales con células T activadas en presencia de los mencionados HDACi, potencia la acción citotóxica de dichas células T. Este efecto no se observa cuando se utilizan
células T en reposo y ocurre específicamente sobre células tumorales.
Analizamos la capacidad de dichos inhibidores para regular la expresión de ligandos de muerte en células T activadas encontrando que no
hay cambios en la expresión de TRAIL, aunque sí se incrementa la
expresión de CD95L. Además las células tumorales, tras el tratamiento con los HDACi, son más sensibles a la apoptosis mediada por CD95L
y otros ligandos de muerte.
Conclusiones. Los inhibidores de HDAC pueden regular la acción
citotóxica de células T activadas sobre células tumorales ejerciendo un
doble efecto: aumentando la sensibilidad de las células tumorales e
incrementando la capacidad citotóxica de los linfocitos T.
O-114
GENERACIÓN DE ANTICUERPOS MULTIVALENTES PARA EL
DIAGNÓSTICO DE TUMORES SÓLIDOS IN VIVO. Á. Cuesta Martínez1, D. Sánchez-Martín1, L. Sanz1, M. Compte1, L. Kremer2, F.J. Blanco3, L. Álvarez-Vallina1. 1Hospital Universitario Puerta de Hierro, Majadahonda. 2Centro Nacional de Biotecnología, Consejo Superior de Investigaciones Científicas. 3CIC bioGUNE, Parque Tecnológico de Bizkaia.
Objetivos. A partir del desarrollo de la tecnología del hibridoma
para la generación de anticuerpos monoclonales y junto con el desarrollo de las técnicas de ingeniería genética, se han generado una gran
variedad de anticuerpos recombinantes (AcR) con capacidad para localizar depósitos tumorales in vivo.
En este trabajo estudiamos las propiedades estructurales y funcionales in vitro e in vivo de un nuevo armazón proteico de origen euca-
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riótico capaz de generar AcR trivalentes, denominado Trimerbody, formado por un anticuerpo monocadena (scFv) unido al dominio NC1,
responsable de la trimerización del colágeno XVIII.
Material y métodos. Se realizaron estudios estructurales para la
determinación de su naturaleza multimérica y estudios funcionales de
ELISA frente al antígeno específico del scFv. Para determinar la ganancia en afinidad funcional (avidez) del Trimerbody frente al scFv monomérico, se realizaron estudios de Resonancia del Plasmón de Superficie (SPR). La localización de depósitos tumorales in vivo se realizaron mediante la conjugación del los anticuerpos con un fluorocromo
de emisión cercana al infrarrojo
Resultados. Los estudios estructurales (centrifugación analítica y
cromatografía de afinidad) demuestran que el Trimerbody se presenta en solución como una estructura trimérica perfecta, con un peso
molecular de 110 kDa.
Los estudios funcionales demuestran que el nuevo formato Trimerbody presenta mayor capacidad de unión que el formato monomérico, indicando que el armazón NC1 no altera la capacidad de unión
del scFv a su antígeno. Los datos obtenidos mediante SRP demuestran
que el Trimerbody aumenta las constantes de unión respecto del scFv,
con una mejora en 100 veces la afinidad funcional por su antígeno.
Los ensayos de localización de depósitos tumorales in vivo demuestran que el Trimerbody presenta mejores características para la localización de tumores sólidos, con mayor intensidad de señal y mayor tiempo de retención, que el mismo anticuerpo en formato monomérico.
Conclusiones. Estos datos indican que el armazón NC1 para la
trimerización de scFvs mejora las propiedades funcionales in vitro, así
como sus propiedades farmacocinéticas para la localización tumoral
in vivo. Estos datos abren nuevas alternativas para la mejora y el desarrollo de procedimientos diagnósticos no invasivos del cáncer humano.
VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
y CCL21, implicadas en migración y supervivencia celular de las células de LLC, en busca de nuevas aplicaciones en el campo de la oncohematología.
Material y métodos. Se realizaron estudios de quimiotaxis y de
apoptosis en presencia de fasudil y de los ligandos de CCR7, las quimioquinas CCL19 y CCL21. La activación de la GTPasa RhoA se estudió mediante ensayos de pull-down y el papel de la inhibición del fasudil sobre los sustratos de Rho mediante ensayos de inmunoblot.
Resultados. La actividad quimiotáctica inducida por los ligandos
de CCR7, CCL19 y CCL21, en células de LLC se redujo significativamente en presencia de fasudil. Para descartar que la inhibición de la
migración fuera debida a un efecto tóxico se realizaron experimentos
de viabilidad celular en presencia de fasudil a 24, 48 y 96 horas que
demostraron que la viabilidad de las células tratadas con fasudil es
equiparable a la de las células sin tratar. Con el fin de confirmar que la
inhibición de la migración tiene lugar a través del bloqueo de la vía
Rho/ROCK/MLC se realizaron ensayos de inmunoblot en los que se
constató que fasudil inhibe la fosforilación de MLC inducida por CCL19
o CCL21.
Conclusión. Estos resultados sugieren que los inhibidores de la
vía RhoA/ROCK/MLC pueden tener una aplicación terapéutica en la
LLC-B ya que bloquearíamos la entrada de las células de LLC en los
nichos de supervivencia que constituyen los OLS, haciéndolas más
sensibles a la terapia de elección empleada en cada caso. Pretendemos
explorar esta posibilidad en ensayos preclínicos en un modelo murino de la enfermedad utilizando fasudil como agente único o en combinación con agentes terapéuticos de primera elección como fludarabina, ciclofosfamida o rituximab.
SESIÓN 13: INMUNIDAD Y TRASPLANTE
O-115
LA QUINASA ROCK: ¿UNA NUEVA DIANA TERAPÉUTICA EN
EL TRATAMIENTO DE LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA?
C. Cuesta Mateos, M. Alfonso Pérez, S. Guasch, A. Beltran Nuñez, J.M.
Zapata, C. Muñoz Calleja. Hospital Universitario de la Princesa, Madrid.
Introducción. La Leucemia Linfática Crónica de células B (LLCB) es una neoplasia incurable a fecha de hoy, caracterizada por una
infiltración diseminada de células tumorales en médula ósea y órganos linfoides secundarios (OLS). Estos OLS proporcionan microambientes de supervivencia para las células de LLC que pueden así escapar a las terapias citotóxicas contribuyendo a la progresión de la enfermedad.
En este sentido, el receptor de quimioquinas CCR7 y sus ligandos,
las quimioquinas homeostaticas CCL19 y CCL21, parecen jugar un
papel esencial en la entrada de las células de LLC en los OLS. Previamente, nuestro grupo ya demostró que células de LLC de pacientes
con linfadenopatía clínica migraban más eficientemente a los ligandos
de CCR7 y que una de las vías principales implicadas en esta migración es la vía de la pequeña GTPasa RhoA.
Fasudil es un inhibidor químico de ROCK, la molécula efectora de
RhoA, que actualmente se utiliza para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y para mejorar la capacidad cognitiva de las víctimas de infarto o en pacientes con Alzheimer.
Objetivo. Investigar el papel del fasudil en las vías de señalización dependientes de CCR7 tras activación con sus ligandos CCL19
56
Moderadores: : Jose Luis Vicario (Madrid)
Eduard Palou (Barcelona)
O-116
VALOR PRONÓSTICO DE LA DETERMINACION DE IL-10 Y
ANTICUERPOS ANTI-HLA SOLUBLE TRAS RECHAZO EN TRASPLANTE DE CORAZON. B. Manzanares Martin, R. Gonzalez Fernandez, J.M. Arizon Del Prado, M. Frias Casas, A. López Granados, J.
Peña Martínez. Hospital Reina Sofia, Cordoba.
La IL-10 se postula que pueda jugar un importante papel en la tolerancia de los órganos trasplantados debido a su acción inmunosupresora y antiinflamatoria. También la determinación de Acs anti-HLA
soluble resulta de interés en el diagnóstico del rechazo.
Objetivos. Establecer si los niveles de IL-10 y de anticuerpos antiHLA soluble tienen valor pronóstico en la evolución tras rechazo del
trasplante de corazón y su importancia para predecir el riesgo posterior de padecer infecciones y rechazo.
Material y métodos. Se analizaron 25 pacientes trasplantados
de corazón en nuestro hospital. Se recogieron muestras pretrasplante
y postrasplante (días 1, 3, 5, 7, 15, 30 y posteriormente un control al
mes hasta el año). Durante un cuadro infeccioso o de rechazo se realizaron determinaciones cada 2 días. Para la determinación en suero
de IL-10 se utilizó la técnica Quantikine de R&D Systems. También
se determinaron Ac anti-HLA soluble (técnica Pra-stat de Sangstat). El
diagnóstico y grado de rechazo se hizo por criterios clínicos y anato-
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INMUNOLOGÍA
mopatológicos según protocolos de seguimiento vigentes en este hospital. Los cuadros infecciosos fueron diagnosticados según los criterios establecidos en cada caso.
Resultados. La elevación de las cifras de IL-10 en el período posterior al episodio de rechazo se relaciona con una buena evolución del
trasplante mientras que la falta de elevación de los valores de IL-10 o
la disminución de ellos después del rechazo parece estar relacionado
con una mala evolución del trasplante. La disminución de las cifras de
acs anti-HLA soluble después del rechazo se relaciona con pronóstico favorable y buena evolución del rechazo. La falta de disminución o
la elevación de las cifras de Anticuerpo anti-HLA soluble (PRA) después del rechazo se van a relacionar con mal pronóstico y mala evolución del trasplante,
Conclusión. Estos resultados podrían aconsejar la monitorización
de los enfermos trasplantados de forma rutinaria con estas determinaciones.
O-117
ESTUDIO DE ANTICUERPOS ANTI-HLA POR TECNOLOGÍA
LUMINEX EN LA PREDICCIÓN DEL RECHAZO AGUDO EN
PACIENTES DE TRASPLANTE RENAL. J.L. Santiago, M.Á. Figueredo, A. Rodríguez De La Peña, A. Sánchez-Fructuoso, I. Pérez-Flores,
A. Barrientos. Hospital Clínico San Carlos, Madrid.
El trasplante renal sigue siendo a día de hoy la mejor terapia en
pacientes con insuficiencia renal terminal para mejorar tanto su supervivencia como su calidad de vida. Aunque el rechazo agudo del injerto ha disminuido considerablemente en los últimos años, debido fundamentalmente a la mejora de los tratamientos inmunosupresores, la
realidad es que su impacto en la supervivencia del injerto a largo plazo ha sido menos eficaz de lo esperado. Es de sobra conocido que los
anticuerpos donante específicos (ADEs) son un factor importante tanto en la aparición de episodios de rechazo como en la supervivencia
del riñón. Sin embargo, el papel de los anticuerpos anti-HLA presentes en los pacientes antes del trasplante sigue siendo controvertido.
El propósito del estudio fue analizar si los pacientes con ADEs presentes en su suero antes del trasplante tenían peor pronóstico que los
pacientes con anticuerpos anti-HLA pre-trasplante pero que no eran
donante específicos. Los que presentaron algún episodio de rechazo
fueron biopsiados y todos los pacientes híper-inmunizados (HI) fueron sometidos al mismo protocolo de inducción: Timoglobulina, Tacrolimus, Micofenolato y esteroides.
Se analizó el suero del día del trasplante de 23 pacientes HI mediante el estudio Single Antigen por Luminex. Encontramos ADEs preformados en 13 pacientes que presentaron una mayor incidencia de rechazo
humoral (OR=6.4; p=0.057) y celular (OR=14.4; p=0.02) que los pacientes con anticuerpos anti-HLA no donantes específicos. Además, la
supervivencia del injerto a 2 años fue significativamente inferior en
este mismo grupo (60% vs 100; p=0.01), de hecho los 5 pacientes que
fueron trasplantectomizados presentaban ADEs pre-trasplante. El valor
predictivo de estos anticuerpos fue casi del 100% en los pacientes con
ADEs positivos pre-trasplante que habían perdido el injerto anterior
en el primer año post-trasplante.
En conclusión, los anticuerpos anti HLA específicos frente al donante presentes en el suero del receptor antes del trasplante se asocian con
un mayor riesgo de rechazo agudo y una supervivencia del injerto
menor y se deben evitar en pacientes con perdida temprana del injerto en trasplante previos.
O-118
ALTA PREVALENCIA DE ANTICUERPOS ANTI-HLA-DQ EN EL
TRASPLANTE RENAL, EN PACIENTES CON GLOMERULOPATIA DEL TRASPLANTE. A. López Vázquez, J.M. Baltar, R. Alonso
Arias, B. Suárez Álvarez, P. Menéndez, C. Díaz Corte, E. Gómez Huertas, F. Ortega Suárez, C. López Larrea. Hospital Universitario Central de
Asturias, Oviedo.
Introducción. La Glomerulopatía del trasplante (GT) es una patología caracterizada por el depósito de C4d en capilares peritubulares
y la multilaminación de la membrana basal glomerular con imágenes en doble contorno. Se encuadra en el rechazo crónico activo mediado por Ac de la clasificación de Banff-07. Se ha descrito la alta prevalencia de anticuerpos anti HLA de clase II en pacientes con esta patología.
Objetivos. Analizar la prevalencia y especificidad de los Ac antiHLA en la GT.
Métodos. Estudio retrospectivo con 11 trasplantes renales diagnosticados de GT. Se realizó la determinación de la presencia de anticuerpos anti HLA mediante los kits One-Lambda Labscreen Single
Antigen de clase I y II.
Resultados. Solamente 3 pacientes presentaban Anticuerpos antiHLA de clase I, que ya habían sido detectados pretrasplante y en ningún caso resultaron ser específicos de donante. La totalidad de los
pacientes estudiados presentaban Ac anti-HLA de clase II, 8/11 frente a HLA-DQ solamente (73%), 1/11 frente a HLA-DR y DQ (9%), 1/11
frente a HLA-DR y DP (9%) y 1/11 frente a HLA-DP (9%). En ninguno de los casos estudiados se detectaron Ac anti HLA de clase II pretrasplante. Dada la elevada prevalencia de Ac anti HLA-DQ, se evaluó mediante inmunohistoquímica y utilizando un anticuerpo monoclonal específico de esta molécula, su expresión en biopsias renales,
encontrando un patrón de tinción similar a los depósitos de C4d que
aparecen en el rechazo humoral, mayoritariamente en el endotelio
de capilares peritubulares. En 9 de las 11 biopsias estudiadas se detectaron además depósitos de complemento,
Conclusiones. La elevada prevalencia de Ac anti-HLA-DQ así
como la expresión de esta molécula en biopsias de pacientes con
GT sugieren que HLA-DQ juega un papel predominante en el desarrollo de dicha patología. La determinación y el seguimiento postrasplante de estos anticuerpos puede ser una herramienta muy útil
en la detección precoz de la GT lo cual podría permitir el tratamiento de esta patología previo al establecimiento de un daño irreversible del injerto.
O-119
LABSCREEN SINGLE ANTIGEN CORRELACIONA MEJOR CON
EL CROSSMATCH POR CITOMETRÍA DE FLUJO QUE LABSCREEN MIX. L. Burgos Rodríguez, C. Moreno Parado, E. Domingo Rodríguez, J. Merino Roncal, A. Sánchez Ibarrola. Clinica Universidad De
Navarra, Pamplona.
La producción de anticuerpos frente a antígenos HLA se considera un claro factor de mal pronóstico para la supervivencia del órgano trasplantado. Sin embargo bajos niveles de anticuerpos anti HLA
pueden no ser perjudiciales, sino incluso beneficiosos para el pronóstico del injerto. La mayor sensibilidad de las técnicas de fase sólida
(Luminex) para la detección de anticuerpos anti HLA obliga a correlacionar estos datos con los obtenidos mediante otras técnicas de
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menor sensibilidad. En general los datos disponibles en la bibliografía son datos reales de series de trasplantados que correlacionan el
crossmatch con datos previos de Luminex. Estas correlaciones han
defraudado las expectativas debido presumiblemente a las características técnicas del ensayo y a la variabilidad de los anticuerpos que
se detectan.
Material y Métodos. En el presente estudio hemos analizado la
reactividad de 37 sueros de pacientes con anticuerpos anti HLA mediante las técnicas de Luminex, citometría de flujo y microlinfocitotoxicidad. Para la citometría de flujo (n=71 crossmatches) hemos enfrentado los sueros a 16 células tipadas para HLA de clase I, de tal forma que
cada uno de los sueros presentan reactividad frente a un único antígeno de los expresados en los linfocitos tipados. Finalmente hemos comparado los resultados obtenidos de la citometría de flujo con los de fase
sólida tanto en sistemas que detectan mezclas antigénicas (LABScreen Mix, One Lambda) como antígenos únicos (LABScreen Single Antigen, One Lambda).
Resultados. Se comprueba una correlación estadísticamente significativa (r=0,83) entre los valores de Luminex antígeno único y
los movimientos de canal en la citometría de flujo. Hemos realizado un cálculo matemático para la definición del punto de corte de la
fase sólida (MFI= 6883). Como cabría esperar, el LABScreen Single
Antigen correlaciona mejor con la citometría de flujo que el LABScreen Mix (r=0,49).
Conclusiones. En este estudio hemos definido la intensidad media
de fluorescencia con significado clínico relevante en la tecnología Luminex, mediante correlación con los datos de citometría de flujo y citotoxicidad.
O-120
VALORACIÓN DEL ESTADO INMUNOLÓGICO DE PACIENTES
TRASPLANTADOS HEPÁTICOS INFECTADOS CON VHC. J.M.
Lucena, L. Barrera, C. Bernal Pulido, M.Á. Gómez Bravo, A. Núñez
Roldán, M.F. González Escribano. Hospital Universitario Virgen Del
Rocio, Sevilla.
Objetivo. Valorar el estado inmune de pacientes trasplantados de
hígado con infección por virus de hepatitis C (VHC) tanto antes del
trasplante como durante el primer año post-trasplante mediante la
monitorización de la activación de células T CD4+.
Material y métodos. Se incluyeron 13 pacientes infectados con
VHC y trasplantados de hígado. El nivel de activación de células T
CD4+ se monitorizó en función de la concentración de ATP (Immuknow®, Cylex). En cada paciente se realizaron 5 determinaciones: una
antes del trasplante y las demás a los 15, 30, 90 y 180 días post-trasplante. Para establecer los niveles de concentración de ATP en células CD4+ en individuos sanos se utilizaron muestras de sujetos sin patología hematológica ni hepática. En cada muestra, además de la cantidad total de ATP en sangre, se determinó la concentración de células
CD4+ mediante citometría de flujo y la concentración de ATP/célula
CD4+. El análisis estadísitico se realizó mediante el test no paramétrico Mann-Whitney U.
Resultados. En las muetras pre-trasplante, los pacientes infectados VHC presentan una cantidad total de ATP inferior a los controles
sanos (133.3 ng/ml vs. 375.1 ng/ml, p<0.0001). Sin embargo, no se
encontraron diferencias significativas con respecto a la concentración
de ATP/célula CD4+ entre pacientes y controles sanos (0.33 pg/cel vs
0.42 pg/cel, p=0.271). A lo largo de estudio post-trasplante, se obser-
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VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
vó un incremento de la cantidad de ATP/célula CD4+ en los primeros 30 días (p<0.0001) y una disminución posterior hasta alcanzar los
niveles previos del trasplante a los 180 días (p=0.16).
Conclusiones. La determinación de la concentración de ATP/célula CD4+ es más útil para comparar el nivel de activación de las células
CD4. Durante el primer mes post-trasplante las células T CD4+ presentan un nivel de activación mayor como consecuencia de la reacción
frente al órgano trasplantado. Pasado este tiempo el nivel de activación vuelve a los niveles previos al trasplante.
O-121
CARACTERIZACION DE SUBPOBLACIONES FUNCIONALES T
Y B EN TRASPLANTE CARDIACO: ASOCIACION CON RECHAZO CELULAR. J. Carbone Campoverde, A. Gallego López, N. Lanio
Amador, J. Navarro Caspistegui, N. Del Pozo Rodríguez, J. Fernandez
Yañez, E. Fernandez-Cruz, E. Sarmiento Marchese. Hospital Gregorio
Marañon, Madrid.
Introducción. Se desconoce el rol exacto de distintas subpoblaciones funcionales linfocitarias en la patogenesis del rechazo definido clásicamente como celular tras el trasplante cardiaco. El rechazo celular
se caracteriza por un infiltrado inflamatorio que incluye predominantemente linfocitos.
Objetivo. En este estudio evaluamos prospectivamente la dinámica de distintas poblaciones funcionales de linfocitos T y B en sangre
periférica de 46 receptores adultos de trasplante cardiaco y su asociación con el desarrollo de rechazo celular.
Métodos. Inducción: 2-dosis de Daclizumab, 1 mg/kg IV (día 0 y
14); mantenimiento: tacrolimus o ciclosporina, micofenolato mofetil y
prednisona. Estudios inmunológicos: Determinaciones seriadas de linfocitos B naïve y memoria; linfocitos T naïve, memoria, activados, reguladores y efectores CD4+ y CD8+. Estudio realizado mediante citometría de flujo en sangre total. Subpoblaciones linfocitarias expresadas
como porcentaje del total de linfocitos CD19+, CD4+ o CD8+. Tiempos
de estudio: Pre-trasplante, 7 días, 1 mes, 3 meses, 6 meses y un año
post-trasplante. Los episodios de rechazo celular se definieron según
criterios de la ISHLT incluyendo sólo grados 2R o superiores. El diagnóstico de rechazo celular se hizo a través de biopsia endomiocárdica realizada por protocolo o cuando aconteció clínica sugestiva. Los
rechazos fueron tratados con bolos IV de metilprednisolona (250-500
mg/d) por 3 días, o prednisona 100 mg PO por 3 días consecutivos
seguidos de reducción de la dosis.
Resultados. Los pacientes que tuvieron rechazo celular moderado o severo (n=9) en comparación con aquellos que tuvieron función
estable del injerto mostraron a día 7 porcentajes más bajos de linfocitos B naive (CD19+CD27–IgM+IgD+, p=0.04), de células reguladoras
CD4+ (CD4/CD127lowFoxP3+, p=0.081) y más altos de células CD8+ de
memoria efectoras (CD8+CD45RA–CCR7–, p=0.037). A los 3 y 6 meses,
los porcentajes de linfocitos B naïve fueron más bajos en los pacientes con rechazo (p=0.06 and p=0.019, respectivamente), mientras que
el porcentaje de linfocitos B de memoria con cambio de isotipo
(CD19+CD27+IgM–IgD–) fueron más altos (p=0.022 y p=0.064, respectivamente).
Conclusión. Los datos sugieren que niveles más altos de linfocitos B de memoria podrían estar implicados en la patogenia del rechazo celular. El rol potencial de las alteraciones de los distintos compartimentos de linfocitos B como biomarcadores de rechazo queda por
definir.
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VIGILANCIA DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS ANTI-HAEMOPHILUS INFLUENZAE EN PACIENTES CON TRASPLANTE CARDIACO E INFECCIONES. N. Del Pozo Rodríguez, E. Sarmiento, J.
Navarro, J. Rodríguez-Molina, P. Muñoz, J. Fernández-Yañez, J. Palomo, E. Fernández-Cruz, J. Carbone. Hospital General Universitario Gregorio Marañón, Madrid.
SIMULTANEOUS IMMUNE MONITORING OF SPECIFIC ANTICYTOMEGALOVIRUS HUMORAL AND CELLULAR RESPONSES IN HEART TRANSPLANT PATIENTS. E. Sarmiento Marchese1,
N. Lanio Amador1, J. Carbone Campoverde1, A. Gallego López1, J. Navarro Caspistegui1, J. Fernandez-Yañez1, R. Alonso1, P. Muñoz1, F. Kern2.
1Gregorio Marañon University Hospital, Madrid. 2Brighton and Sussex Medical School, Sussex, UK, United Kingdom.
Introducción. Se ha descrito que la hipogammaglobulinemia IgG
puede ser un parámetro útil para identificar pacientes de trasplante
cardiaco (TC) en riesgo de infecciones después del TC. La medición de
anticuerpos específicos anti-polisacárido capsular Haemophilus influenzae tipo B (IgG anti-Hib) puede ser útil en la evaluación del estatus de
la inmunidad humoral en pacientes con inmunodeficiencias. La vacuna anti-Haemophilus influenzae no se encuentra en el calendario vacunal previo al trasplante.
Objetivo. Evaluación de anticuerpos específicos IgG anti-Hib en
una cohorte de pacientes TC con o sin complicaciones infecciosas bacterianas.
Materiales y Métodos. Realizamos estudio prospectivo en 70 pacientes con TC 2003-2009 (edad media=53,34 años, rango:22-69); Hombres=48
(68,6%), Mujeres=22 (31,4%). Se realizó la medición en suero de niveles de anticuerpos específicos IgG anti-Hib, mediante ELISA (Binding
Site®): pre-trasplante (basal), 7 y 30d post-TC. Todas las muestras pre y
post-trasplante fueron estudiadas al mismo tiempo.Terapia de inducción utilizada: Metilprednisolona y anticuerpos monoclonales anti-CD25.
Terapia inmunosupresora de mantenimiento: Tacrolimus/Ciclosporina, Micofenolato mofetil y Prednisona. Se utilizó profilaxis universal con
ganciclovir. Episodio Clínico: infección bacteriana que requirió terapia
intravenosa durante el primer año de seguimiento post-TC.
Resultados. 21 pacientes TC (30%) tuvieron infecciones bacterianas. Microorganismos aislados: Acinetobacter baumanii, Corynebacterium
spp, Enterobacter aerogenes, Enterococo spp, Escherichia coli, Haemophilus
influenzae B, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphilococcus aureus, Staphilococcus epidermidis, Sternotrophomonas malthophilia, Streptococo viridians. En los pacientes TC observamos
una disminución significativa de IgG anti-Hib tanto a día 7 (0,765mg/L)
como a 30 días (0,655mg/L) post-TC respecto al basal (1,05mg/L), rango=0,11-9mg/L; p=0,008 y p<0,001 respectivamente, IC: 95%. Observamos en pacientes infectados una tendencia a disminución de IgG
anti-Hib al mes (1,10±1,28mg/L) vs basales (2,00±2,56mg/L) p=0,055;
IC:95%. Se observó una tendencia a menor concentración IgG anti-Hib
7 días post-TC en pacientes infectados vs no infectados (1,21±1,99 vs
2,01±2,47mg/L). Los niveles IgG anti-Hib basales y 30d post-trasplante eran similares en infectados y no infectados. Se ha sugerido que niveles anti-Hib >1mg/L son protectores a largo plazo.
Conclusiones. La vigilancia de IgG específica anti-Hib, en el seguimiento del trasplante cardiaco, tiene el potencial de identificar a aquellos receptores en alto riesgo de desarrollar infecciones bacterianas.
Background. CMV reactivation is frequent and not harmless after
heart transplantation (HT). Kern and Sarmiento have previously observed
that assessment of specific humoral and cellular responses could identify
patients at risk of CMV disease(1, 2).
Objective. To prospectively define combined quantitative thresholds
of protective humoral and cellular CMV-specific responses after HT
that discriminate patients at risk of CMV reactivation.
Patients. 38 CMV-seropositive adult HT patients receiving prophylactic
IV ganciclovir (5 mg/kg bid during 14 days). Induction: daclizumab
(day 0 and 14). Maintenance: tacrolimus or cyclosporine, mofetil
mycophenolate and prednisone. Nine patients (24%) presented CMV
reactivation, three of whom developed CMV disease.
Methods. Proportions of interferon-gamma producing peripheral
blood CD4 and CD8 T-lymphocytes after ex vivo activation with CMVIE-1 and pp65 peptide pools and serum titers of anti-CMV IgG were
measured by flow-cytometry and ELISA, respectively. Pre-HT and 30d
samples were collected. CMV antigenemia was detected by IF and
confirmed by PCR during six months follow up.
Results. Pre-HT: CMV-IgG titer was higher in patients without
antigenemia (24375 vs 9009, p=0.009). This difference remained at 30d
(18162 vs 5682, p=0.002). Pre and 30d median values of CD8 responses
were not statically different between the two groups but intra-patient
analysis of IE1 responses showed that frequencies diminished more
markedly over time in patients who developed CMV reactivation.
Optimum Cut-off values after ROC analysis were 15500 titer for CMVIgG and 0.41% for IE1-CD8/IFNγ+ frequencies at 30d post-HT. To
calculate the positive and the negative predictive value (PPV and NPV),
cases presenting both results below the cut-off were defined as “positive”
and the rest as “negative”. Cross-table analysis and the Wilson method
provided PPV of 47% and NPV of 100% a sensitivity of 100% and
specificity of 64% with and accuracy of 73% (95%CI). There were not
significant differences among distinct clinical variables. Post-HT bacterial
infections were more prevalent in patients who developed CMV
reactivation.
Conclusion. The combined analysis of quantitative humoral
and cellular responses could be a valuable monitoring tool for the
design of prolongued prophylaxis strategies in selected patients.
References
1. JEM 2005,201(7):1031-36.
2. Int Immunopharmacol 2009,9(6):649-52.
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Pósters
Inmunología
Vol. 29 / Supl. 1/ Junio 2010: 60-122
SESIÓN 1: AUTOINMUNIDAD
Moderadores: Carmen Gelpi (Barcelona)
Ricardo Pujol-Borrel (Barcelona)
P-001
ESCLEROSIS SISTÉMICA Y ANTICUERPOS ANTI-RNA POLIMERASA III. V. Pérez Aradas, B. Joven, E. Pérez Aradas, M. Talise
Astier, S. Lermo, M. Sevilla Sánchez, Y. Paredes, D. Valero Hervas, J.
Alfaro, A. Serrano, P. Carreira. Hospital Doce de Octubre, Valdemoro
La Esclerosis sistémica (ES) es una enfermedad reumática autoinmune muy heterogénea caracterizada por daño microvascular y fibrosis de la piel y otros órganos. Estos pacientes presentan anticuerpos
antinucleares como son los anticuerpos anticentrómero (ACA) y antitopoisomerasa (Scl-70) (ATA) que se encuentran relacionados con distintas manifestaciones clínicas de la enfermedad. Sin embargo, estos
dos son positivos en aproximadamente el 50% de los pacientes con
esclerosis sistémica. Existen otros anticuerpos con características distintas cuyas principales dianas son las RNA polimerasas I, II y III
(ARA) y que son los que se relacionan con mayor frecuencia con la
enfermedad. Los pacientes con positividad para anticuerpos RNA
polimerasa III no presentan ninguno de los demás anticuerpos que
suelen encontrarse en pacientes con ES, como los ACA, ATA y antiPM/Scl. Por tanto estos pacientes forman un grupo serológico separado. La prevalencia de este anticuerpo puede variar desde un 5% al
25%. Se ha demostrado que estos pacientes tienen un mayor riesgo
de sufrir la forma cutánea difusa de la esclerodermia y una elevada
probabilidad de desarrollar afectación cutánea mayor y nefropatía
hipertensiva.
Objetivos. 1) Analizar la incidencia de anticuerpos anti RNA Polimerasa 3 (pol3) en pacientes con esclerosis sistémica (ES), y 2) Comparar las características clínicas del grupo de pacientes Pol3 (+) con los
grupos de pacientes anti-toposiomerasa I (aScl70) (+) y anticentrómero (ACA) (+).
Pacientes y métodos. Pacientes con ES vistos en la consulta de
reumatología entre enero y mayo de 2009, cuyas características habían sido incluidas previamente en una base de datos con información demográfica y clínica recogida prospectivamente. Se analizó
el suero para la presencia de anticuerpos Pol-3, mediante ELISA.
Las características clínicas de los pacientes Pol-3 (+) se compararon
con las de otros dos grupos de pacientes: uno con aScl70 (+) y otro
con ACA (+). Se utilizó Odds ratio con IC del 95% para medir la
fuerza de asociación entre las variables cualitativas, y prueba t para
muestras independientes para analizar las diferencias entre variables cuantitativas.
Resultados. De los 73 pacientes con ES analizados, 16% eran positivos para Pol3 y negativos para ACA y aScl70. Cinco tenían enfermedad difusa, 3 afectación muscular, 3 fibrosis pulmonar y 1 crisis renal,
pero ninguno tenía hipertensión pulmonar (HP). Comparando el 16%
60
Pol3 (+) con el grupo de 65 pacientes con ES y aScl70 (+), los pacientes
Pol3 (+) tenían una incidencia menor de fibrosis pulmonar (OR=0,02;
95%CI 0,05-0,85; p=0,04); y con el grupo de 98 pacientes ACA (+), los
pacientes Pol3 (+) eran más jóvenes al inicio de la enfermedad (33 vs
48 años, p=0,02), y presentaban más enfermedad difusa (OR=4,6; 95%CI
1,2-16,8; p=0,03), más áreas avasculares en la capilaroscopia (OR=6,5;
95%CI 1,6-26,8; p=0,01), más contracturas en flexión (OR=7,0; 95%CI
1,2-41,7; p=0,05) y mayor afectación muscular (OR=6,9; 95%CI 1,4-34,7;
p=0,03).
Conclusiones. Los anticuerpos anti-RNA polimerasa 3 aparecen
en el 16% de nuestra población de pacientes con una edad menor al
inicio de la enfermedad, afectación cutánea difusa, mayor afectación
muscular y menor frecuencia de fibrosis pulmonar.
P-002
EXPRESIÓN DE FOXP3 Y OTROS MARCADORES DE CÉLULAS
REGULADORAS EN PACIENTES DE LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO. C. Prado Cueto1, J. Gómez Arbesú2, B. De Paz Cazón1, J.
Rodríguez Carrio1, P. López Suárez1, C. Gutiérrez Martín2, A. Suárez
Díaz1. 1Universidad de Oviedo, Oviedo.2Hospital Universitario Central de
Asturias.
Objetivos. El análisis de las células Treg Foxp3+ en el LES ha mostrado resultados contradictorios, habiéndose descrito recientemente
una elevada expresión de este marcador en linfocitos CD25-. Por ello
nos propusimos cuantificar la expresión de marcadores de células Treg
en linfocitos CD4+ de pacientes de LES en función de su expresión de
CD25.
Pacientes y métodos. Mediante citometría de flujo se analizó la
expresión de CD4, CD25, Foxp3, CD127, CD45RO, CCR4 y CCR6 así
como los niveles séricos de IFNα, RANTES y MIP1α en 19 controles y
69 pacientes de LES, de los que se registraron parámetros clínicos e
inmunológicos, actividad (SLEDAI) y tratamiento recibido durante los
últimos tres meses.
Resultados. El porcentaje de células FoxP3+ y Foxp3+CD127-/low
aparece significativamente elevado en pacientes comparado con controles (p<0,001 y p<0,007, respectivamente). Este incremento no se debe
a las células Treg clásicas, ya que la frecuencia de células CD25highFoxp3+ y CD25highCD127-/low es similar en ambos grupos, mientras que la población CD25highCCR4+CCR6+ desciende (p<0,041). El
alto porcentaje de células Foxp3+ en pacientes se debe a la elevada
expresión de este marcador en linfocitos CD25- (p<0,0005) y CD25low
(p<0,0004), observándose también una mayor proporción de células
CD25lowCD127-/low (p<0,008), de acuerdo con su estado de activación celular. Además, se encontró una correlación negativa entre los
porcentajes de CD25-Foxp3+ y CD4+ (r=-0.404, p<0,00009), población
que disminuye en pacientes de LES durante el transcurso de la enfermedad, siendo significativo un año después del diagnóstico (p<0,004).
De hecho, clasificando a los pacientes en función de este parámetro,
sólo aquéllos con una evolución mayor de 1 año presentan un porcen-
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taje elevado de células Foxp3+ (p<0,0003) y CD127-/low (p<0,002) en
la supoblación CD25-, mientras que en los pacientes de diagnóstico
reciente los porcentajes son similares a los controles. No se observó
correlación con SLEDAI, título de anti-dsDNA o niveles séricos de
IFNα, RANTES o MIP1α.
Conclusiones. Los linfocitos CD4+CD25-Foxp3+ están aumentados en el LES, fundamentalmente en pacientes con una duración de la
enfermedad mayor de 1 año. Este incremento podría deberse en parte a la apoptosis o muerte selectiva de células activadas Foxp3- en
pacientes con un proceso inflamatorio crónico.
P-003
EVALUACIÓN DEL VALOR DIAGNÓSTICO DE LAS BIOPSIAS
DE BULBO DUODENAL EN NIÑOS CON ENFERMEDAD CELÍACA. A. Andrés Martín, N. Marín Crespo, S. Mirete Bachiller, C.
Camarero Salces, G. Roy Ariño. Hospital Ramón Y Cajal De Madrid,
Madrid.
Objetivos. Comparar la distribución de las distintas sub-poblaciones de linfocitos intra-epiteliales (LIEs) en bulbo duodenal frente
a duodeno distal, con el fin de poder ser utilizado en el diagnóstico de
la enteropatía celíaca.
Material y métodos. Se han analizado por citometría de flujo (CTM)
81 biopsias procedentes de pacientes celíacos (C), 33 de no celíacos
(NC) y 9 de celíacos en tratamiento (DSG), obtenidas de duodeno distal y bulbo, comparando las 3 sub-poblaciones que se utilizan en el
diagnóstico rutinario en nuestro Servicio: CD45+, CD3+TCRγδ+,
CD103+CD3- (NK intestinales). Todos los resultados se confirman con
los datos histológicos y serológicos.
Resultados. En la tabla 1 se muestran los porcentajes (media ± ES)
de las diferentes sub-poblaciones analizadas comparando los datos
obtenidos en duodeno (D) frente a bulbo (B), sin que se observen diferencias estadísticamente significativas.
Tabla 1.
D
CD45+
CD3+ TCRÁ‰+
i-NK
Celíacos
B
19,9 ± 0,7
29,9 ± 1,4
1,5 ± 0,2
18,7 ± 0,7
30,7 ± 1,6
1,4 ± 0,2
D
No celíacos
B
8,9 ± 0,7
6,7 ± 1,1
31,8 ± 3,0
7,8 ± 0,9
5,8 ± 0,8
26,2 ± 2,7
DSG
D
B
11,7 ± 1,7
29,0 ± 4,8
7,0 ± 1,3
9,3 ± 1,4
29,9 ± 4,7
5,6 ± 1,5
En el bulbo se reproducen las diferencias estadísticamente significativas (P<0,001) que se observan en la distribución de las sub-poblaciones del duodeno entre los diferentes grupos diagnósticos (Fig. 1).
Conclusiones. Confirmamos una buena técnica diagnóstica para
la enfermedad celíaca basada en las alteraciones inmunológicas de la
enfermedad, que no es parcheada y se mantiene constante a lo largo
del duodeno, pudiendo también utilizarse en los casos de diagnóstico
dudoso (dato que se presentará en la sesión).
P-004
CARACTERIZACIÓN DE PACIENTES CON ANTICUERPOS
ANTI PÉPTIDOS CITRULINADOS. E. Ruiz Ortiz De Arrizabaleta1, D. Grados2, A. Marín1, I. Salvador1, A. Teniente Serra1, A. Briega1, S. Holgado2, M. Martínez-Morillo2, X. Tena2, R. Pujol-Borrell1,
E. Martínez-Cáceres1. 1LIRAD-BST-HUGTIP, Badalona. 2REUMATOLOGÍA-HUGTIP.
Introducción. La determinación de Ac anti-péptidos citrulinados tiene valor diagnóstico y pronóstico en la artritis reumatoide (AR),
con una sensibilidad similar a la del factor reumatoide y una mayor
especificidad. A pesar de eso, se ha descrito su presencia en otras enfermedades y en personas sanas.
Objetivo. Describir las características clínicas de una cohorte de
pacientes con Ac anti-péptidos citrulinados positivos.
Pacientes y métodos. Estudio retrospectivo realizado en el HUGTiP (población de referencia: 700.000 habitantes) durante el periodo 2007- Febrero 2010. Se revisaron las historias clínicas de los
pacientes con valores de Ac anti-péptidos citrulinados (anti-vimentina citrulinada mutada) ≥20 U/ml excluyendo aquellos casos sin
información clínica. Técnica utilizada: ELISA Anti-VMC (Orgentec).
Resultados. Se realizaron 1.310 determinaciones, de las cuales 449
fueron positivas (34,3%). Se analizaron 335 pacientes (109 hombres
(32,5%) y 226 mujeres (67,5%)).
En 240 casos (71,6%) los pacientes presentaron una enfermedad
reumática asociada. El 67,9% de los pacientes con AR presentaron
valores >100 U/ml; eran especialmente elevados en las formas seropositivas y erosivas. En los casos de conectivopatías y vasculitis los
valores encontrados fueron entre 20 y 50 U/ml. Siendo >50 U/ml
solo en 7 pacientes: 3 LES, 3 Sínd. Sjögren (SS) y 1 poliarteritis nodosa (PAN). La distribución en enfermedad de Still, reumatismo palindrómico y AR del anciano fue similar para todos los valores. El 73%
de artritis no filiadas presentaron valores entre 20-50 U/ml. En el grupo miscelánea (artritis psoriásica, artritis por microcristales, polimialgia reumática, sarcoidosis, artritis asociada a enfermedad inflamatoria intestinal y artritis postinfecciosa) el 71,4% presentó valores <50
U/ml. Tan solo superó el valor de 100 U/ml 1 caso de polimialgia
reumática, 1 caso de condrocalcinosis y 1 paciente con neoplasia de
pulmón.
Noventa y cinco casos (28,4%) no presentaron enfermedad reumática asociada. 16 pacientes (17%) presentaron valores >50 U/ml (3
fumadores). En 6 casos los valores fueron >100: 2 casos de nefropatía hipertensiva, 2 de pneumopatía (hipertensión pulmonar y fibrosis pulmonar idiopática), 1 de anemia hemolítica autoimune y 1 caso
de drepanocitosis.
Conclusiones. A pesar que los Ac anti-péptidos citrulinados son
muy específicos de AR, se han descrito en otras enfermedades reumáticas. Valores >50 U/ml tienen un valor predictivo positivo (VPP) del
66% (76% si >100 U/ml) para el diagnóstico de AR, mientras que si
consideramos como positivo un valor >20 U/ml, el VPP baja hasta el
39,1%. Por ello, en pacientes sin patología articular, valores entre 20-
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50 U/ml deben considerarse negativos y esta determinación ha de ser
valorada sólo en el contexto de una enfermedad reumática.
P-005
ALTERACIONES DE LAS SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS
EN PACIENTES CON ESCLEROSIS MÚLTIPLE. L. García Ortiz1,
O.M. Garibay Vargas1, G. García Castillo1, M.E. Vargas Camaño1,
M.D.C. Chima Galán1, J.C. Pérez Razo1, J. Gutiérrez Salinas1, J.J.M.
Zaragoza Saavedra2. 1Centro Medico Nacional 20 De Noviembre ISSSTE, Ciudad De México, Mexico. 2Instituto Nacional De Cancerologia,
Mexico.
Objetivo. Identificar si existe diferencia en la cuenta de subpoblaciones linfocitarias (CD3, CD4, CD8) y en el cociente CD4/CD8 entre
pacientes con esclerosis múltiple y controles sanos.
Introducción. La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad neurológica que con frecuencia causa invalidez, se caracteriza por una respuesta inflamatoria en la sustancia blanca, en donde las células T activadas entran al SNC y desencadenan una respuesta autoinmune. La
liberación de citocinas por los linfocitos CD4+ cerca de las vainas de
mielina puede mediar el daño directo y aumentar el ataque citolítico
de los macrófagos y otras células inflamatorias. La cronicidad de la
enfermedad puede inducir a las células CD8+ a inhibir la producción
de IgG por medio de las células B y la disminución de las células CD4+
parece correlacionarse con supresión funcional. Al inicio de las recaídas los linfocitos CD8 están disminuidos en sangre periférica, secundariamente la relación CD4/CD8 esta aumentada. Aún no se sabe si
esta alteración es resultado de la enfermedad o si se trata de una inmunodeficiencia que predispone a este padecimiento. No existen estudios
donde se evalúen alteraciones en las subpoblaciones de linfocitos en
pacientes con EM.
Material y métodos. Se realizó una investigación de casos y controles, de tipo observacional, transversal, prospectiva, comparativa y
abierta, en donde se estudiaron 38 pacientes con esclerosis múltiple
diagnosticados de acuerdo a los criterios de McDonald1 de 18 a 65 años
de edad, atendidos por los servicios de Neurología e Inmunología del
Centro Médico Nacional “20 de Noviembre” – ISSSTE. El grupo control estuvo constituido por 38 personas sanas, pareadas por sexo y sin
antecedentes de enfermedades autoinmunes ni neurológicas, que acudieron al Banco de Sangre del mismo Centro Médico. Se tomaron muestras sanguíneas, previo consentimiento informado, de cada uno de los
participantes para la determinación de CD3, CD4 y CD8 por citometría de flujo. Se realizó un análisis exploratorio de las medidas de tendencia central de cada variable, y para determinar diferencias estadísticamente significativas entre los grupos su utilizó la prueba de T de
Student.
Resultados. Las medias de las determinaciones de CD3, CD4, CD8
y del cociente CD4/CD8 en los pacientes con EM fueron las siguientes: 1109, 732, 383 y 2.45; mientras que en los controles se encontró:
1592, 953, 614 y 1.78, respectivamente. Los valores de t (3.52, 2.45, 3.92
y 2.21, gl= 75, α= 0.05) mostraron diferencias estadísticamente significativas para CD3, CD8 y el cociente CD4/CD8 (P<0,05).
Conclusiones, CD3 en los pacientes con EM los muestra portadores de linfocitopenia T. Los linfocitos CD8 también se encontraron disminuidos, lo cual condiciona un aumento en la relación CD4/CD8,
como se ha reportado en este y otros trabajos. Queda por demostrar si
esta disminución está asociada a una respuesta a infección viral crónica o es constitucional en estos enfermos.
62
VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
P-006
ESTUDIO DE ANTICUERPOS ANTIHIPOFISARIOS (AAH) EN
PACIENTES CON TRAUMATISMO CRANEOENCEFÁLICO (TCE).
B. Dávila De Las Fuentes, A. Madrazo Atutxa, I.M. Martínez Morán,
F. Murillo Cabezas, A. Leal Cerro, M.A. Montes Cano, A. Núñez Roldán. HHUU Virgen Del Rocío, Dos Hermanas, Sevilla.
Introducción. El hipopituitarismo es una complicación frecuente
del TCE. Los posibles mecanismos que subyacen tanto en la recuperación como en el agravamiento de la función de la glándula pituitaria
no están claros. La dinámica de cambios observados en la función de
la hipófisis sugiere que el TCE podría disparar mecanismos de autoinmunidad responsables de esta alteración.
Objetivo. Investigar la prevalencia de AAH en pacientes con TCE.
Métodos. Se han estudiado 31 pacientes con TCE (26 varones/5
mujeres), con una edad media de 32,40 ± 9,71 años y con una GCS ≤ 8,
seguidos durante un año tras el TCE. Ninguno tenía antecedentes de
patología autoinmune ni alteración hipofisaria. Se realizó un estudio
de AAH durante la fase aguda, a los 6 y 12 meses del seguimiento
mediante técnica de inmunofluorescencia indirecta, utilizando como
sustrato secciones de lóbulo hipofisario anterior de primate (Euroimmun, Lubeck, Germany) e IgG preabsorbida con tejido de mono con
el fin de minimizar el ruido de fondo.
Resultados. El 51,6% (16/31) presentaron un déficit aislado de hormona del crecimiento (GH). El resto no presentó déficit hormonal alguno. La presencia de AAH se detectó en 7 (22,6%). En 1 caso se detectó
AAH a los 6 meses y en otro a los 12 meses, teniendo ambos un déficit aislado de GH. En los 5 casos restantes la presencia de AAH se detectó en la fase aguda. En 2 de ellos los AAH persistieron durante el seguimiento y no presentaron alteración hormonal. En los tres restantes,
se negativizaron los anticuerpos, presentando solo uno de ellos déficit de GH.
Conclusión. Hemos encontrado una prevalencia elevada de AAH
en los pacientes de nuestra población (TCE). Sin embargo, la presencia de alteraciones hipofisarias no parece estar relacionada con la existencia de AAH.
P-007
ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE DOS ENZIMOINMUNOENSAYOS E INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA EL ANÁLISIS DE ANTICUERPOS ANTINUCLEARES. M.J. Martínez Becerra, C. Serrano Del Castillo, P. Tramón Gutierrez, M.J. Rodríguez Iglesias, P. Palomino Díaz. Fundación Jiménez Díaz-Capio, Madrid.
Objetivos. El objetivo de nuestro estudio es comparar los resultados obtenidos al estudiar los anticuerpos antinucleares (ANA) por dos
enzimoinmunoensayos (ELISA) diferentes con los observados por
inmunofluorescencia indirecta (IFI) así como con los datos de las historias clínicas para evaluar su sensibilidad y especificidad.
Material y métodos. El estudio consiste en una evaluación prospectiva de un total de 144 sueros procedentes de diferentes servicios
clínicos recopilados entre Noviembre 2009-Abril 2010.
Cada suero se analizó por dos técnicas de ELISA diferentes: ELiA
ANA CTD Screen - Phadia® Diagnostics, Uppsala, Sweden- y el kit de
QUANTA Lite® ANA -INOVA Diagnostics®, San Diego, CA-. Simultáneamente analizamos estos sueros por IFI (utilizando portas con dos
tipos de sustrato diferentes: líneas celulares hep2 y cortes de triple tejido de rata -estómago, riñón e hígado-, ambos de INOVA®).
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Las especificidades antigénicas correspondientes a los patrones
observados en la IFI se confirmaron en cada caso mediante Inmunoblot (BlueDot. D-tek®) y ELiA® IgG InmunoCap (Phadia® Diagnostics).
Resultados. Los datos de sensibilidad y especificidad que se obtuvieron al comparar ELiA ANA CTD Screen frente a IFI fueron 76% y
80% (VPP 0,71, VPN 0,84), mientras que con QUANTA Lite® ANA fueron 96% y 58% respectivamente (VPP 0,60, VPN 0,96).
Cuando comparamos los datos clínicos con los resultados obtenidos por ELiA ANA CTD Screen se observa una sensibilidad del 82% y
una especificidad del 89%, con un VPP de 0,85 y un VPN de 0,86; los
datos de sensibilidad y especificidad obtenidos con QUANTA Lite®
ANA fueron 94% y 62% (VPP 0.66, VPN 0.92), mientras que por IFI
fueron 75% y 88% respectivamente (VPP 0.84, VPN 0.81)
Conclusiones. Los resultados obtenidos reflejan que ELIA ANA
CTD Screen presenta unos datos de especificidad similares a los obtenidos por IFI, considerado actualmente el método gold-standard para
el cribado de ANA; sin embargo, QUANTA Lite® muestra una mayor
sensibilidad y una menor especificidad; esto nos hace plantearnos cual
es el balance sensibilidad-especificidad deseado en un método preliminar de cribado de ANA. La incorporación de extractos de células
hep2 podría explicar la mayor sensibilidad de QUANTA Lite® ANA.
P-008
VALOR DIAGNÓSTICO DE LOS ANTICUERPOS ANTI PÉPTIDO
DE GLIADINA DEAMINADA. M. Alba Domínguez, E. MartínezOjinaga Nadal, J. Sarria Oses, B. San José, R. Álvarez Doforno. Hospital Universitario La Paz, Madrid.
Antecedentes. La enfermedad celíaca (EC) es una enteropatía inmune causada por una sensibilidad al gluten en individuos genéticamente susceptibles, que afecta al 1% de la población.
Los métodos de diagnostico serológico constituyen una herramienta no invasiva de cribado de individuos de riesgo y población general.
El conocimiento de la eficacia diagnostica de los marcadores serológicos en el diagnostico de la EC varia de forma considerable de unos
estudios a otros debido a múltiples factores, como son la selección de
pacientes, diferencias poblacionales y variabilidad metodologica. La
disponibilidad de nuevos kits comerciales para determinar anticuerpos contra péptido específico de la gliadina, ha creado expectativas
para mejorar la detección serologica de la EC.
Objetivos. Estudiamos la validez diagnóstica de los marcadores
serologicos utilizados en la rutina diaria para despistaje de EC y de los
nuevos Anticuerpos anti péptido de Gliadina Deaminada isotipo IgG
(GDG) e IgA (GDA).
Pacientes y Métodos. Se estudiaron 156 pacientes con un diagnostico especifico, 41 celiacos sin gluten, 44 celiacos con gluten y 71 no
celiacos. En la muestra total hay 131 pacientes en edad pediátrica (74
son ≤ de 3 años) y 25 pacientes adultos (≥16 años).
Se realizó la detección de Ac anti endomisio (EM) mediante Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) utilizando portas de esófago de mono
(IMMCO).
Se determinaron los niveles de anticuerpos anti Transglutaminasa (anti TG), anti gliadina (AG) y anti péptido de gliadina deaminada (anti GD) de isotipo IgA e IGG mediante EliA en InmunoCAP 250
(Phadia), punto de corte sugerido por la casa comercial ≥10 UI/mL.
Los resultados se analizaron empleando el programa estadístico
SPSS. La validez diagnostica de los ensayos fue calculada por análisis
de la curva ROC (Receiver operating characteristic).
PÓSTERS
Resultados. Del análisis estadístico concluimos que para nuestra
muestra, los marcadores que ofrecen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos estudiados son los Ac anti endomisio, Ac
anti TGA, Ac anti TGG y Ac anti GDG.
La especificidad y sensibilidad de los Ac anti EM fue del 97,2 y
95,5% respectivamente. El mejor punto de corte para los Ac anti TGA
es de 15 UI/mL obteniéndose una sensibilidad y especificidad del 88,6%
y 90,1% respectivamente.
Con respecto a los Ac anti TGG, para el punto de corte sugerido
por la casa comercial 10UI/mL, obtenemos un 54.5% y un 100% de sensibilidad y especificidad, no siendo mejorado al cambiar dicho punto.
Para el marcador de los Ac anti GDG se ha obtenido un 93,2% de
sensibilidad y una especificidad del 91,5%, ajustando el punto de corte a 7UI/mL.
Se analizaron los marcadores en los pacientes menores ó iguales a
3 años y se encontró una especificidad y sensibilidad para los Ac anti
TGA del 96% y 94% y para los Ac anti GDG del 96% y 91,6% respectivamente.
Conclusiones. En función de los resultados obtenidos en este estudio se aconseja realizar el despistaje inicial de enfermedad celiaca con
la prueba Ac anti TGA estableciendo el punto de corte para esa técnica de 15 UI/mL. En niños ≤ 3 años deberá ir acompañada de la determinación de Ac anti GDG aconsejándose un punto de corte de 7UI/mL.
Los Ac anti endomisio se utilizarían como técnica de apoyo en los
casos dudosos.
P-009
METHOTREXATE EFFECT IN DISTRIBUTION AND APOPTOSIS
OF LYMPHOCYTE POPULATIONS IN PATIENTS WITH RECENTONSET RHEUMATOID ARTHRITIS. G. Parada Hermoza1, D. Díaz
Martín1, L. Chara Velarde1, J. Chevarria Montesinos1, A. Sánchez Atrio2,
Z. Moreno Villegas1, L. Ortega Moreno1, J. Monserrat Sanz1, A. Prieto
Martín1, M. Álvarez De Mon-Soto2. 1Universidad de Alcalá de Henares,
Alcalá de Henares. 2Hospital Universitario Príncipe de Asturias.
Purpose. To determine the effect and response to treatment with
methotrexate on the distribution and susceptibility to apoptosis of
different peripheral blood lymphocyte subsets of patients with recentonset rheumatoid arthritis (RA).
Methods. We obtained peripheral blood samples of 21 patients
diagnosed with recent-onset RA, before treatment and after 3 and 6
months of methotrexate treatment. We calculated the DAS-28 score
to determine response to treatment and classifying patients into two
groups:Satisfactory response (SRP) (n=15) (DAS28<3,2) and unsatisfactory
response (URP) (n=6) (DAS28≥3,2). Peripheral blood mononuclear cells
were isolated and characterized using monoclonal antibodies and
annexin-V by flow cytometry. The susceptibility to spontaneous and
Phytohemaglutinina induces apoptosis was determined after 24
hour culture.
Results. We observed a significant increase in the percentage of
activated helper T cells (CD3+CD4+ CD25+) in patients compared to
controls, initially and during treatment. We also observed significant
decrease of NK-cells in URP respect to SRP and controls, except at 6
months of treatment. In the course of treatment we observed a lower
percentage of apoptotic T lymphocytes (CD3+) in URP and apoptotic
activated helper T cells (CD3+CD4+CD25+) in both groups compared
to controls. We also observed a decrease in the percentage of apoptotic
NK- cells in SRP. At 24 hours of cultures, there was an increased
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PÓSTERS
percentage of apoptotic cytotoxic T lymphocytes (CD3+CD8+CD28-)
in URP with respect to SRP and controls, as well as a decrease in the
percentage of apoptotic B lymphocytes compared to controls during
treatment.
In Phytohemaglutinina induced apoptosis, during treatment we
observed a significant decrease in the percentage of apoptotic cytotoxic
T lymphocytes (CD3+CD8+) of patients with respect to controls. We
also found an increase in the percentage of apoptotic B lymphocytes
in PRS compared with controls.
Conclusions. Patients with recent-onset RA, showed alterations
in the distribution and apoptosis of lymphocytes characterized by
increased percentage of activated helper T cells and reduction of the
percentage of apoptotic NK-cells. Methotrexate alters the distribution
and apoptosis, increasing the percentage of activated helper T cells,
apoptotic NK-cells and apoptotic CD3+CD8+CD28- cells while decreasing
the percentage of T lymphocytes (CD3+) and B apoptotic in PRI but
not in PRS.
VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
Grupo 2: De los 79 sueros negativos para ATGA y AGA, todos fueron negativos para GliaPep-A y sólo 5 fueron positivos para GliaPepG. Uno de ellos presentó un titulo alto de GliaPep-G y fue posteriormente diagnosticado como celíaco con deficiencia de IgA. Los otros 4
pacientes presentaban títulos bajos de GliaPep-G (<20 UI/ml) y correspondieron a pacientes pediátricos en estudio de EC pendientes de diagnóstico.
Conclusiones.
• PDG no pueden sustituir a ATGA en el diagnóstico de enfermedad celíaca, debido a su menor sensibilidad y especificidad.
• PDG pueden ser útiles por su alto valor predictivo negativo. PDGIgG muestran una alta especificidad comparados con AGA, evitando la biopsia intestinal innecesaria de pacientes afectados por
otros desordenes gastrointestinales.
• PDG-IgG son útiles para detección de pacientes celíacos con deficiencia selectiva de IgA. Usados en combinación con ATGA pueden evitar la cuantificación sérica de IgA en todos los sueros.
• PDG pueden ser utilizados en el diagnóstico precoz de enfermedad celiaca en niños con ATGA y AGA negativos.
P-010
UTILIDAD DE LOS ANTICUERPOS ANTI-PÉPTIDOS DEAMINADOS DE GLIADINA COMO PARÁMETRO ADICIONAL PARA
EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDAD CELÍACA EN EL LABORATORIO CLÍNICO. P. Carrasco1, J.M. Ferrer1, S. Gordillo2, R. Ferrer1,
N. Matamoros1, E. Bravi3. 1Hospital Son Dureta, Llucmajor. 2Inverness
Medical Ibérica3 Eurospital, Trieste.
Objetivo. La sensibilidad y especificidad de los anticuerpos antitransglutaminasa (ATGA) para la detección de enfermedad celíaca se
aproxima al 100%. Los anticuerpos anti-gliadina (AGA) tienen un valor
limitado debido a su baja sensibilidad y especificidad. Recientemente
se han desarrollado nuevos kits para la identificación de anticuerpos
específicos contra péptidos deaminados de gliadina (PDG) para proporcionar una herramienta sensible y específica.
Nuestro objetivo fue evaluar la sensibilidad, especificidad y rendimiento de PDG en comparación a ATGA y AGA, actualmente utilizados en nuestro laboratorio.
Materiales y métodos. 216 muestras enviadas a nuestro laboratorio para estudio serológico de EC: Grupo 1: 137 muestras seleccionadas por ser positivas para ATGA y/o AGA. Estas incluyeron 67 celiacos, 6 pacientes celíacos con deficiencia selectiva de IgA, 4 celíacos
en dieta sin gluten y 60 pacientes no celíacos. Grupo 2: 79 muestras
seleccionadas por ser negativas para ATGA y AGA.
La detección serológica de ATGA y AGA se realizó mediante kits
Elisa de Eurospital (Eu-tTG-IgA, Eu-tTG-IgG y α-gliatest IgA) y la
detección de PDG IgA e IgG se realizó mediante Gliapep-A y GliaPepG, respectivamente. Los anticuerpos anti-endomisio IgA (EMA) fueron detectados mediante inmunofluorescencia indirecta sobre portas
de esófago de mono (IMMCO).
Resultados. Grupo 1: En los 67 pacientes con EC, Eu-tTG-IgA fue
positiva en 99% de los casos, EMA en 89% y AGA en 73%. La positividad de GliaPep-A fue de 79% y para GliaPep-G de un 86% mientras
su uso combinado obtuvo un positividad en 89% mostrando un mejor
rendimiento que AGA.
Los pacientes con deficiencia de IgA fueron correctamente identificados por Eu-tTG-IgG y GliaPep-G.
De los 60 no celiacos, sólo 8 fueron positivos para Eu-tTG-IgA, 9
para GliaPep-G y 24 para GliaPep-A. 59 de 60 pacientes no celiacos
fueron positivos para AGA.
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P-011
UTILIDAD DEL RECUENTO E INMUNOFENOTIPAJE DE LINFOCITOS INTRAEPITELIALES EN LA MUCOSA INTESTINAL EN
EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDAD CELIACA. J. Melero Ruiz,
M. García Cerrada, M.L. Vargas Pérez, J.J. Fernández De Mera, M.I.
Muñoz Sanjuan, E. Doblaré Castellano, C. Gonzalez Roiz. Hospital
Infanta Cristina, Badajoz.
Introducción. El recuento elevado de los linfocitos intraepiteliales (LIE) totales es un hallazgo histológico clave en la Enfermedad
Celiaca (EC). Los rangos de normalidad varían dependiendo de la técnica empleada.
Objetivo. Determinar el rango normal de los LIE y su lifograma
(LIE-TCRγδ y LIE-NK-Like) por citometría de flujo y establecer su rentabilidad diagnóstica en EC (población infantil y adulta).
Material y métodos. Se obtuvo biopsia duodenal y suero de 246
niños y 461 adultos con sospecha de EC. El diagnóstico histológico se
basó en criterios histológicos clásicos (Marsh I o mayor) y/o serología
positiva para EC (221 niños y 98 adultos con EC activa). El grupo control se constituye por individuos con biopsia Marsh 0 y serología celiaca negativa (25 niños y 363 adultos). Se realizó contaje de los LIE por
citometría de flujo(y la proporciCD3+) (se expresan la media±DS). Se
comparan los grupos con el test U de Mann-Whitney.
Resultados. Comparados con la población control, los niños con
EC activa muestran aumento de la población de LIE (24,25±10,06 frente a 8,48±4,12), aumento de la proporción de TCRγδ (29,26±13,18 frente a 11,48±6,78); y disminución de LIE-NK-Like (4,74±9,25 frente a
30,49±20,50). Al analizar el linfograma intraepitelial en la población
adulta los resultados son: LIE (22,69±10,43 frente a 9,69±5,5), LIE-TCRγδ
(26,85±13,02 frente a 8,45±7,86) y LIE-NK-like (2,08±2,62 frente a
19,67±14,86). Se eligieron los puntos de corte de mayor rentabilidad
clínica según las curvas ROC. En la población infantil se establecieron
como puntos de corte: %LIE >14,2% (ABC 0,946; 95% IC 0,916-0,976);
%TCRγδ>16,5% (ABC 0,898; 95% IC 0,852-0,945); y de %NKLike<10,1%(ABC 0,944; 95% IC 0,915-0,973). En la población adulta:
%LIE > 14,2% ( ABC 0,887; 95% IC 0,848-0,927); %TCRγδ>16,1% (ABC
0,903; 95% IC 0,872-0,934) y %Nk-Like < 4,4% (ABC 0.960; 95% IC 0,9420,977).
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Conclusiones. La alteración del linfograma, fuera de los rangos
establecidos de los 3 parámetros analizados, muestra una especificidad del 100% para el diagnóstico de EC Activa en el niño y en el adulto. El inmunofenotipaje de los LIE es una técnica muy útil en el diagnóstico de la EC que complementa el estudio anatomopatológico clásico aumentando su especificidad.
P-012
DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL ENTRE PANCREATITIS AUTOINMUNE Y CÁNCER DE PANCREAS: UTILIDAD DE LOS ANTICUERPOS ANTI-ANHIDRASA CARBÓNICA II Y ANTI-ALFA 2
AMILASA. M. Sánchez Castañón, G. De Las Heras, C. Gomez, M.
López Hoyos. Hospital Universitario Marques De Valdecilla, Santander.
Se ha descrito la presencia de diversos autoanticuerpos (autoAcs)
en el suero de pacientes con pancreatitis autoinmune (PAI), aunque su
empleo como marcadores diagnóstico y el perfil de autoAcs a emplear es materia de debate. Los más frecuentemente asociados son los Ac
anti-anhidrasa carbónica II (AC-II) y, más recientemente, los anti-alfa
2 amilasa (AMY). En este trabajo hemos analizado la utilidad de distintas combinacions de autoAcs junto con los niveles séricos de IgG4
para el diagnóstico de PAI. Estudiamos 106 pacientes con sospecha clínica de PAI y 94 como control de enfermedad que fueron vistos en
nuestras consultas entre Junio de 2003 y Octubre de 2009. Los Acs antiAC-II y anti-AMY se midieron mediante ELISA casero, mientras que
los niveles de IgG4 se cuantificaron mediante nefelometría. Los resultados mostraron una sensibilidad igual para ambos autoAcs (83%) pero
la especificida fue mayor para los Ac anti-AMY (88%) que para los antiAC-II (76%). La presencia de niveles elevados de IgG4 fue el marcador
más específico (95%) pero con la sensibilidad más baja (58%). La combinación de niveles elevados de IgG4 y Ac anti-AMY o la combinación
de IgG4 elevada junto con Acs anti-AC-II y –AMY tuvo la mayor especificidad (99%) y VPP (86%), pero con la sensibilidad más baja (50%).
Cuando se combinó sólo la presencia de ambos autoAcs, la sensibilidad fue la más alta (75%) con un VPN elevado (98%). Sin embargo,
la especificidad y VPP fue de 93% y 47%, respectivamente. Fue muy
importante la ausencia total de Acs anti-AMY en los pacientes con cáncer de páncreas. En resumen, la combinación de la presencia de Acs
anti-AC-II y –AMY con niveles elevados séricos de IgG4 es de gran utilidad en el diagnóstico diferencial entre PAI y cáncer de páncreas. Financiación.- FIS, IFIMAV.
P-013
DESPISTAJE DE ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ASOCIADOS
A CONECTIVOPATÍAS MEDIANTE ELISA. ESTUDIO EN PARALELO FRENTE A INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA. J.A.
García Trujillo, S. Romero Chala, C. Cámara Hijón, L. Fernández Pereira. Hospital San Pedro de Alcántara, Cáceres.
Introducción. El estudio de anticuerpos antinucleares (ANA) se
ha convertido en una determinación rutinaria de laboratorio y su solicitud ha crecido exponencialmente en los últimos años. Su interpretación requiere considerable experiencia, y existen numerosas discrepancias interlaboratorios. Aunque su sensibilidad es buena para las enfermedades del tejido conectivo, su especificidad es baja, pudiendo aparecer en numerosas enfermedades autoinmunes, infecciones, tumores
e incluso en personas sanas. Se han hecho muchos esfuerzos en des-
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arrollar un sistema no subjetivo y automatizado que pueda distinguir
entre ANAs específicos de enfermedades del tejido conectivo y no específicos.
Objetivos. En este estudio hemos evaluado y comparado los ANAs
realizados por Inmunofluorescencia indirecta y un nuevo ELISA automatizado desarrollado para detectar anticuerpos asociados a enfermedades del tejido conectivo (Elia CTD Screen, Phadia).
Métodos. 213 sueros enviados consecutivamente al laboratorio
para descartar ANAs fueron analizados en paralelo mediante Inmunofluorescencia indirecta y Elia CTD screen (UNICAP 250). Los casos
positivos fueron confirmados por Inmunoblot (IB) de ENAs, dsDNA
por ELISA y por Crithidia luciliae.
Resultados.
• 144 sueros fueron negativos por ambas técnicas.
• 20 sueros fueron positivos por ambas técnicas. 18 de ellos fueron
también positivos por inmunoblot o EIA-DNAds. Los 12 pacientes que tenían una enfermedad del tejido conectivo estuvieron
en este grupo (SLE, Sjögren, esclerodermia y EMTC). 2 de estos 20
que habían dado un resultado positivo débil fueron negativos por
IB y EIA DNAds (tenían una gastritis atrófica y una poliartralgia).
• 8 sueros fueron Elia-CTD screen positivos pero ANA-IFI negativos, uno de ellos tenía un Ro52 y VHC, 1 RNP y conectivopatía
indiferenciada, 3 fueron EIA-DNAds positivos pero no tenían una
enfermedad específica. En 3 no pudimos detectar ningún antígeno por IB.
• 41 sueros fueron ANA-IFI positivos pero CTD negativos. Ninguno de ellos tenía una enfermedad del tejido conectivo.
Conclusiones. Elia CTD screen tuvo una sensibilidad comparable
a ANA-IFI y una especificidad superior (94,3% vs 78.8%). Creemos que
podría ser una buena técnica de cribado, al menos en pacientes de Atención Primaria, donde el número de pacientes ANA negativos llega en
nuestra experiencia al 80% de los casos.
Tabla 1.
ANA-IFI
Pos
Neg
ANA-CTD
Pos
Neg
20
41
8
144
28
61
153
186
213
P-014
RELACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ANTI-NUCLEOSOMA CON
LA ACTIVIDAD DEL LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO. L.
Mozo Avellaned, J. Gómez Arbesú, J.L. Martín Alonso, A. Menéndez
González, C. Gutiérrez Martín. Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo.
Objetivos. Análisis de la eficacia de los Ac anti-nucleosoma (NC),
cuantificados mediante dos ELISA con distinta composición antigénica, en la evaluación de la actividad y la nefropatía en el lupus eritematoso sistémico (LES). Los NC han sido propuestos como el principal
antígeno en la patofisiología del LES y, además, existe una amplia evidencia sobre la asociación de los Ac anti-nucleosoma (anti-Nc) con el
daño orgánico. A pesar de ello, existen datos contradictorios sobre la
eficacia de la determinación de estos autoAc en el diagnóstico y seguimiento del LES. Debido a la complejidad del antígeno, se ha sugerido que la composición antigénica utilizada en el método de evaluación puede ser una de las causas de estas diferencias observadas.
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Material y métodos. Un ELISA utiliza mononucleosomas intactos
humanos mientras que el otro utiliza NC altamente purificados. El
estudio incluyó 106 pacientes de LES que cumplen los criterios del
ACR. La actividad de la enfermedad se evaluó en 49 pacientes mediante un SLEDAI modificado en el que se excluyó la puntuación correspondiente a los Ac anti-dsDNA. En 28 pacientes, se confirmó la nefritis lúpica mediante biopsia.
Resultados. El SLEDAI se correlacionaba significativamente con
los niveles de Ac anti-NC obtenidos con el ELISA con NC intactos como
antígeno (0,387, p<0,01, test Spearman) pero no con ELISA que emplea
NC purificados. No se encontró asociación entre nefritis y la presencia de Ac anti-NC por ninguno de los dos métodos aunque los niveles
de significación eran claramente mayores en el caso del ELISA con NC
purificados. Finalmente, los niveles de Ac anti-dsDNA se correlacionaban mejor con el SLEDAI y nefritis que los de los anti-NC.
Conclusiones. La correlación entre los niveles de Ac anti-NC y
la actividad del LES está influenciada por la composición antigénica,
siendo mayor cuando se utilizan NC intactos. La pérdida de proteínas
antigénicamente importantes durante el proceso de purificación puede ser una de las causas.
P-015
ALTA EFICACIA DIAGNOSTICA DE LOS ANTICUERPOS ANTIPEPTIDOS DEAMIDADOS DE GLIADINA DE ISOTIPO IGG
PARA EL DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD CELIACA EN
NIÑOS. L. Mozo Avellaned, J. Gómez Arbesú, E. Escanlar Monteserín, C. Bousoño García, C. Gutiérrez Martín. Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo.
Objetivo. Evaluar la eficacia diagnóstica para la enfermedad celíaca (EC) de dos tests anti-péptidos deamidados de gliadina (dGp) IgA
e IgG (Phadia, Freiburg, Alemania) en comparación con la de los antigliadina nativa IgA (anti-Glia).
Material y métodos. Se analizaron los sueros al diagnóstico de 100
pacientes con EC (37 niños ≤5 años y 63 >5 años), positivos para Ac
anti-transglutaminasa IgA y biopsia duodenal Marsh I-IV. El grupo
control consistió en 100 individuos (32 ≤5 años y 68 > 5 años) con biopsia negativa, otras enfermedades autoinmunes o alergia a alimentos.
La determinación de Ac anti-dGP IgG también fue evaluada en 6 pacientes celíacos con déficit de IgA.
Resultados. Los tres Ac analizados mostraban potencias diagnósticas (AUC) elevadas y similares. La más alta se obtuvo con anti-dGp
IgG (99,5%) y la más baja con anti-Glia IgA (97,8%). Los Ac anti-dGp
de ambos isotipos presentaron una sensibilidad y VPN similares y
superiores a los obtenidos con los Ac anti-Glia IgA. Respecto a la especificidad y al VPP, los Ac anti-dGp IgG mostraron los valores más elevados. En los niños ≤5 años, los Ac anti-dGp IgG presentaron los valores más altos para todos los parámetros, llegando al 100% en todos
ellos. En el grupo >5 años, los Ac anti-dGp IgG e IgA mostraron una
eficacia diagnóstica diferente a la observada en el grupo de niños ≤5
años. Así, los Ac anti-dGpIgA eran superiores a los IgG respecto a sensibilidad, VPP y VPN mientras que los Ac anti-dGp mostraron la máxima especificidad. Finalmente, los 6 pacientes celíacos con déficit de
IgA presentaban Ac anti-dGp IgG mientras que los anti-Glia IgG únicamente eran detectados en 5 pacientes.
Conclusiones. La eficacia diagnóstica para la EC de los Ac antidGp IgA e IgG depende de la edad del grupo estudiado. Así, los antidGp IgG muestran la mayor eficacia en niños para todos los paráme-
66
VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
tros estudiados mientras que, en adultos, sólo son superiores a los de
isotipo IgA respecto a la especificidad. Además, la incorporación de la
determinación de Ac anti-dGP IgG en la rutina facilitaría el diagnóstico en pacientes con déficit de IgA.
P-016
NIÑO DE 5 MESES CON ALTOS NIVELES CIRCULANTES DE
ANTICUERPOS ANTI-µ2 GLICOPROTEÍNA Y PÚRPURA TROMBOCITOPÉNICA IDIOPÁTICA. J.A. García Trujillo, S. Romero Chala, L. Fernández Pereira, C. Cámara Hijón. Hospital San Pedro de Alcántara, Cáceres.
Objetivos. Dilucidar el papel patogénico que juegan los anticuerpos anti-β2 glicoproteína (‚2GPI) en un niño de cinco meses con trombocitopenia como único criterio diagnóstico de síndrome antifosfolípido.
Material y métodos. Se determinaron anticuerpos anticardiolipina (aCL IgG e IgM) y anti β2GPI por ELISA (Elia, Phadia, Sweden) a
diferentes momentos.
Resultados. La trombocitopenia se resolvió con corticoides y una
infusión de gammaglobulina IV, no repitiéndose más episodios. En
cambio, los altos niveles de β2GPI se mantuvieron elevados hasta los
2 años de edad.
Tabla 1.
Edad
Plaquetas (*109/L) β2 GPI IgG
(UI/mL)
aCL IgG e IgM
β2 GPI IgM
Anticoagulante
lúpico
5 meses
6 meses
10 meses
14 meses
19 meses
29 meses
4
480
329
445
515
291
Negativos
Negativos
Negativos
Negativos
Negativos
Negativos
No determ.
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
139,4
142
140
177
58
22
Conclusiones. Si bien se ha descrito la presencia ocasional de anticuerpos anti β2GPI en niños sanos, siempre ha sido a títulos bajos. Sin
embargo, en este caso además de presentarse a título elevado, coinciden en el tiempo con la aparición de la trombocitopenia y del anticoagulante lúpico. Todo esto parece indicar que realmente están jugando un papel patogénico en este paciente, siendo el caso más joven descrito hasta el momento.
P-017
AUTOANTICUERPOS EN PACIENTES POST TRASPLANTE
HEPÁTICO PEDIÁTRICO. M. Alba Domínguez, R. Álvarez Doforno, P. Jara, L. Álvarez. Hospital Universitario La Paz, Madrid.
Antecedentes. El trasplante hepático es el tratamiento más efectivo para la enfermedad hepatobiliar en estadio final que presenta síntomas intratables. Los autoanticuerpos son detectados frecuentemente en receptores de un trasplante hepático y su aparición es un fenómeno relativamente frecuente. La presencia de estos autoanticuerpos,
de los que se desconoce el significado, puede estar relacionada con una
disfunción o daño hepático ya sea por una situación de rechazo del
injerto, recurrencia de la patología de base o el desarrollo de una enfermedad autoinmune de Novo.
Objetivo. El objetivo de este estudio es 1) Conocer la prevalencia
de los anticuerpos no órgano-específicos en un grupo de pacientes
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INMUNOLOGÍA
pediátricos trasplantados de hígado y seguidos en el laboratorio. 2)
Detección de autoanticuerpos raros e inusuales en triple tejido y HEp2. 3) Identificación de los antígenos reconocidos por los autoanticuerpos.
Materiales y métodos. En este estudio se han incluido 96 pacientes pediátricos trasplantados de hígado y con un tiempo postrasplante igual o mayor de 12 meses. Se detectaron Autoanticuerpos no órgano-específicos: anticuerpos antinucleares (ANA), anti músculo liso
(AML), antimitocondriales (AMA) y antimicrosomales de hígado y
riñón (LKM), anti citosol hepático tipo 1 (LC1) por inmunofluorescencia indirecta (IFI) sobre portas de triple tejido de rata y células HEp-2
humanas (Euroimmun) considerándose positivo los títulos > 1/80.
Para la identificación de los antígenos se empleó un Inmunoblot (IMB)
sobre extracto de hígado humano donante y un dot-blot perfil hepático de proteínas purificadas ó recombinantes (Liver dot De-TEC).
Resultados. 1) De los 96 pacientes se detectaron 14 ANA positivos
(14,6%), 2 con patrón homogéneo, 9 con patrón moteado y 3 con patrón
nucleolar, todos a titulo medio-bajo excepto un caso que presentó títulos elevados. En tres pacientes se detectaron AML (3,1%) todos a títulos elevados. Un paciente con AMA (1%) a título elevado. Un paciente con Ac anti LKM (1%) a título elevado. Un paciente con LC1 (1%).
2) Dentro de los patrones inusuales específicos de hígado, se encuentra la tinción de canalículos biliares y sinusoides hepáticos. Sobre células HEp-2 destaca la presencia de un patrón citoplásmico granular y
citoesqueleto. 3) Los antígenos identificados reconocidos por los autoanticuerpos en HEp-2 fueron midbody, NuMa y fibrilarina. Los AML
reconocieron F-actina. Los AMA reconocieron la deshidrogenasa de
cetoácidos de cadena ramificada. La especificidad del Ac anti LKM fue
el citocromo P450-IID6. Los Ac anti citosol hepático reconocieron a la
proteína formiminotransferasa ciclodeaminasa (LC1). La identificación
del antígeno reconocido por los Ac anti canalículos biliares fue la proteína BSEP que se expresa exclusivamente en hígado.
Conclusión. En nuestra serie aparecen con poca frecuencia autoanticuerpos no órgano-específicos a título elevado después del trasplante hepático pediátrico.
De los autoanticuerpos raros e inusuales específicos del tejido hepático, hemos identificado el antígeno de la mayoría de los anticuerpos
anti canalículos biliares como la proteína BESEP.
Es importante, en el seguimiento de los pacientes post-trasplante
hepático, la detección de anticuerpos, la determinación de su especificidad antigénica y el estudio de la relación de los parámetros clínicos con los resultados del laboratorio.
P-018
ANÁLISIS DE LAS ALTERACIONES EN LA EXPRESIÓN DE CITOQUINAS Y DE FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN EN PACIENTES
CON LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO. S. García-Rodríguez1,
E. Zumaquero-Martínez1, E.J. Pavón-Castillero1, P. Navarro-Cuesta1,
S. Arias-Santiago2, J.L. Callejas-Rubio3, N. Ortego-Centeno3, J. Sancho-López1, M. Zubiaur-Marcos1. 1Instituto Parasitologia y Biomedicina,
López-Neyra,CSIC, ARMILLA. 2Servicio de Dermatología. Hospital Clínico
Universitario San Cecilio, Granada. 3Unidad de Enfermedades Autoinmunes
Sistémicas, Hospital Clínico San Cecilio, Granada.
Objetivo. En la patogénesis del Lupus Eritematoso Sistémico (LES)
están implicados factores genéticos y ambientales que tienen como
consecuencia alteraciones en la regulación del sistema inmune. Se han
evaluado las alteraciones en los niveles plasmáticos y de expresión de
PÓSTERS
un panel de citoquinas (pro-inflamatorias y anti-inflamatorias), así
como de los factores de transcripción que determinan la selección de
linaje de células T en células mononucleares de sangre periférica
(PBMCs) de pacientes con LES respecto a controles sanos.
Material y métodos. Se determinó la concentración plasmática de
10 citoquinas: IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 (p70), IL-13,
IFN-gamma y TNF-alfa en 56 pacientes con LES (SLEDAI 0-20) y 49
controles sanos mediante Bio-Plex precision pro assay (Bio-rad). En un
subgrupo de 13 pacientes (SLEDAI 0-4) y 5 controles sanos se analizó en PBMCs la expresión génica relativa a controles sanos, mediante PCR cuantitativa a tiempo real de IL-1 beta, IL-2, IL-5, IL-6, IL-10,
IL-12 (p70), IFN-gamma y TNF-alfa y de los factores de transcripción:
T-bet (Th1), GATA3 (Th2), Foxp3 (Treg) y ROR-gamma-t (Th17); así
como la expresión de los genes que codifican para las proteínas cinasas implicadas en señalización y supervivencia celular: MAPK1 y AKT1.
Resultados. Los pacientes con LES presentaron niveles plasmáticos significativamente elevados de las 10 citoquinas testadas. IL-6, IL2, IL-5, IL-10, e IL-13 eran las que mostraban un mayor incremento en
relación a los controles sanos. En el subgrupo de 13 pacientes esta
aumentada la expresión génica respecto a los controles sanos de IL-2,
IL-6, IL-10, IL-12 e IFN-gamma estos aumentos son paralelos a sus
niveles plasmáticos.
Se observó que la ratio T-bet (Th1)/GATA3 (Th2) esta aumentada en
todos los pacientes de LES analizados con respecto a controles sanos, no
se observó correlación con el SLEDAI. Se observa una correlación entre
los niveles de expresión de T-bet con ROR-gamma-t (Th17) (Spearman
r=0.8956, p< 0,0001); así como entre la expresión de IL-6 y ROR-gammat (r=0.6264, p<0,0220). 3) 7 de los 13 pacientes de LES que presentan
aumentos en la expresión de T-bet, presentan igualmente aumentos en
la expresión de Foxp3 (Treg), ROR-gamma-t(Th17), MAPK1 y AKT1.
Conclusiones. Los pacientes con LES presentan niveles plasmáticos aumentados de citoquinas proinflamatorias (IL-6), Th0 (IL-2) y Th2
(IL-5, IL-10 e IL-13), confirmándose dicha desregulación a nivel de
expresión de los genes que codifican para algunas de estas citoquinas.
Esta situación proinflamatoria se confirma con el aumento del balance T-bet (Th1)/GATA3 (Th2) y de la expresión ROR-gamma-t (Th17).
P-019
ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS
EN EL SUERO DE RATONES C57BL/6 SILVESTRES RESPECTO A
RATONES C57BL/6 DEFICIENTES PARA CD38 EN UN MODELO
DE ARTRITIS REUMATOIDE. A. Rosal-Vela1, J. Postigo2, S. GarcíaRodríguez1, E. Zumaquero1, M.V. Longobardo1, A. Lario1, P. Navarro1, R. Merino3, J. Merino2, M. Zubiaur1, J. Sancho1. 1Instituto de Parasitología y Biomedicina "López-Neyra", CSIC, Armilla, Spain. 2Facultad de
Medicina, Universidad de Cantabria, Santander. 3Instituto de Biomedicina y
Biotecnología de Cantanbria, CSIC.
El suero es una herramienta de diagnóstico muy válida y fuente
de información acerca del estado fisiológico del individuo. El estudio de la expresión diferencial de proteínas séricas puede ser útil en la
búsqueda de biomarcadores específicos de enfermedad. La técnica de
Proteominer® permite reducir el rango dinámico del proteoma sérico
disminuyendo la concentración de las proteínas mayoritarias y aumentando la de las menos abundantes, consiguiéndose una mayor diversidad de especies proteicas.
Objetivo. Análisis proteómico del suero mediante expresión diferencial 2-D-DIGE para el diagnóstico molecular de la artritis por inmu-
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PÓSTERS
nización con colágeno de tipo II, modelo animal de artritis reumatoide, empleando ratones silvestres (wt) y ratones deficientes en CD38
(CD38ko). Los ratones CD38ko presentan diversas deficiencias en la
respuesta inmunológica antígeno-específica, de ahí su interés en estudio de la artritis reumatoide como patología autoinmune.
Materiales y métodos. Utilización del kit Proteominer Protein
Enrichment (BioRad) de pequeña capacidad con el suero de los ratones wt o CD38ko afectados por la enfermedad; precipitación de la muestra mediante 2-D Cleanup Kit (BioRad) y resuspensión en buffer compatible con marcaje DIGE. El diseño experimental de DIGE comprende el marcaje alternativo de las muestras wt y CD38ko con el Cy3 y
Cy5; un pool de todas las muestras se marca con Cy2 como estándar
interno. Se mantuvo la proporción de 50Ìg proteína/400pmol CyDye
recomendada. Sistema Protein IEF Cell (BioRad) para la 1ª dimensión
y sistema Criterion (BioRad) para la 2ª. La digitalización de los geles
se realizó mediante Typhoon Imager 9400 (GE Healhcare) y el análisis
de las imágenes mediante el software DeCyder 6.0 (GE Healhcare).
Identificación de proteínas por espectrometría de masas (MS-MALDITOF). Validación por Western-blot.
Resultados. Tras el análisis de los geles 2-D, se detectaron aproximadamente unas 300 manchas proteicas presentando 30 de ellas diferencias de expresión notables entre wt y CD38ko. De estas últimas, el
30% presentan una variación en la expresión ≤ -1,5 veces y el 70% de
≥1,5 veces.
Conclusiones. La utilización del Proteominer® en combinación
con el análisis diferencial de proteínas (sistema DIGE), la identificación de las proteínas por MS-MALDI-TOF y la posterior validación por
técnicas alternativas nos ha permitido detectar proteínas relativamente poco abundantes cuya expresión varía significativamente en ratones deficientes en CD38 respecto a ratones silvestres en el contexto de
la artritis reumatoide experimental. Estudios posteriores irán dirigidos hacia tejidos linfoides como ganglios o bazo.
P-020
EL DESCENSO DE LA SUBPOBLACIÓN DE LINFOCITOS B
CD27IGMIGD EN PACIENTES CON LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO SE ASOCIA A LA PRODUCCIÓN DE AUTO-ANTICUERPOS. B. Rodríguez-Bayona1, A. Ramos-Amaya1, J.J. Pérez Venegas2,
C. Rodríguez1, J.A. Brieva1. 1Hospital Universitario Puerta del Mar, Cádiz.
2Hospital de Jerez, Cádiz.
Objetivos. El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad autoinmune caracterizada por la hiperreactividad de las células B
y la producción de gran variedad de auto-anticuerpos (Ac). Estudios
previos realizados en nuestro laboratorio han puesto de manifiesto,
entre otras alteraciones, una reducción significativa de la subpoblación
de linfocitos B CD27IgM IgD en la sangre de pacientes con LES, alteración que es más acusada en pacientes en fase de actividad clínica,
pero que incluso se observa en la mayoría de los pacientes en fase de
remisión clínica. El objetivo del presente estudio consistió en valorar
la relación existente entre las alteraciones en la distribución de las subpoblaciones B circulantes observadas y el estado de autoinmunidad
sistémica, reflejado por la presencia de auto-Ac séricos.
Materiales y métodos. El estudio de subpoblaciones B se realizó
en un grupo de 69 pacientes con LES reclutados consecutivamente y
en 31 controles sanos. El marcaje combinado con CD19, CD27 e IgD
por citometría de flujo permite diferenciar 5 subpoblaciones linfoides B: linfocitos B naïve (CD19+CD27-IgD+), linfocitos B CD27 IgM
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VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
IgD (CD19+CD27+IgD+), de memoria switched (SW) (CD19+CD27+
IgD-), de memoria doble-negativa (DN) (CD19+CD27-IgD-) y células
plasmáticas (CP) (CD19+CD27++IgD-). En pacientes con LES se determinó la presencia de ANA, Ac anti-ENA y anti-ADNdc.
Resultados. En el grupo de pacientes con LES se observó un
aumento de las subpoblaciones de linfocitos B de memoria DN y
de CP, y una disminución de la subpoblación B CD27 IgM IgD. Además, la disminución de la subpoblación CD27IgMIgD estaba en relación con la detección de elevados niveles de auto-Ac séricos (ANA,
anti-DNAdc y anti-ENA) mientras que el aumento de CP y de linfocitos B de memoria DN se asociaba exclusivamente a la presencia
de Ac anti-ADNdc.
Conclusiones. El grado de disminución de la subpoblación de linfocitos B CD27 IgM IgD está ligado a un estado general de autoinmunidad, asociándose a la producción de gran variedad de auto-Ac,
mientras que el aumento de CP y de linfocitos de memoria DN se relaciona específicamente con la producción de Ac anti-ADNdc. Estos
hallazgos sugieren un posible papel de los linfocitos B CD27 IgM IgD
en la patogénesis del LES.
P-021
SV.¿UN NUEVO ANTIGENO TUMORAL IMPLICADO EN UN
SINDROME PARANEOPLASICO? M.T. Ciudad García, M. Agustí,
M.V. Rubiales, C. Gelpí. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Unidad
docente Universidad Autónoma de Barcelona, Córdoba.
Muchas enfermedades paraneoplásicas del sistema nervioso central son inmunomediadas. La presencia de autoanticuerpos antineuronales en suero y líquido cefalorraquídeo de estos pacientes es la
principal evidencia que lo confirma. Estos anticuerpos reaccionan
con proteínas neuronales que a su vez están expresadas en las células del tumor. Por tanto, su caracterización es la base para un test
rápido, útil y diagnóstico, de forma que se pueda asociar una sintomatología a un tipo de neoplasia que aún no se haya conseguido
detectar físicamente.
El objetivo de este trabajo es el estudio de una nueva especificidad
de anticuerpo antineuronal presente en el suero de una paciente con
síndrome paraneoplásico asociado a carcinoma de ovario.
Material y métodos. En el análisis de anticuerpos antineuronales empleamos test comerciales con proteínas recombinantes; inmunofluorescencia indirecta sobre cortes de tejidos y sobre células en cultivo; inmunoblot con extractos de cerebro y cerebelo de rata fetal, de carcinoma de ovario y de cerebro humano.
Resultados. Mediante inmunofluorescencia indirecta estos anticuerpos reconocen un antígeno nuclear en cortes de cerebro y cerebelo de cobaya, en cerebro humano y en las líneas de carcinoma de
ovario humano, UV-20 y UVH1. No reconocen otras líneas celulares
de carcinoma de pulmón, laringe y cérvix. Tampoco se detecta fluorescencia en tejidos de hígado, riñón, estomago y timo de rata y riñón
humano, ni en neutrófilos humanos de sangre periférica. Mediante
inmunoblotting el suero de esta paciente reconoce dos proteínas de
aproximadamente 90 y 45 kDa de peso molecular tanto en extractos
de cerebro y cerebelo de rata fetal como en extractos de las líneas de
carcinoma de ovario mencionadas. No muestra reactividad con extractos de otras líneas celulares.
Conclusiones. Presentamos una nueva especificidad de anticuerpos antineuronales asociados a un síndrome paraneoplásico, que puede ser útil en la investigación y diagnóstico de estas enfermedades.
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INMUNOLOGÍA
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Asimismo serán una herramienta útil para el estudio del antígeno asociado al tumor. Estudios de reactividad cruzada de estos anticuerpos
nos permitirán demostrar su especificidad para antígenos del sistema
nervioso central y carcinoma de ovario.
Finalmente demostramos la utilidad de las técnicas descritas para
el estudio de posibles nuevos anticuerpos ligados a tumor y síndrome
neurológico.
P-022
VALOR DIAGNÓSTICO DEL INMUNOFENOTIPO DE LIES PARA
EL ESTUDIO DE ENFERMEDAD CELÍACA EN POBLACIONES
PEDIÁTRICA Y ADULTA. M. Sáenz Cuesta, L. Arriarán, P. Etxaniz, A. Prada, M.D. De Juan, E. Cuadrado, A. Muñagorri, A. Gómez, I.
Urreta, J. Eizaguirre. Hospital Donostia, Donostia-San Sebastián.
Introducción. Para el diagnóstico de Enfermedad Celíaca (EC)
se utilizan diferentes pruebas: anatomía patológica (AP) de biopsia
intestinal según grados de Marsh; anticuerpos anti tTG IgA; genotipo
de HLA-DQ e inmunofenotipo de LIEs. En los algoritmos actuales
no está considerado este último. La documentación sobre su poder
diagnóstico es limitada.
Objetivo. Evaluar cuál es el aporte del inmunofenotipo de LIEs
en el diagnóstico de EC en dos poblaciones estudiadas.
Material y método. Población pediátrica: 146 niños: 103 con diagnóstico de EC; 43 descartada EC.
Población adulta: 203 pacientes: 37 con diagnóstico de EC; 118 descartada EC; 48 sin diagnóstico definitivo.
La AP de biopsias se estableció según grados de Marsh; los anticuerpos anti tTG IgA se midieron con ELISA; el estudio de inmunofenotipo de LIEs se realizó mediante citometría de flujo y el análisis de
HLA-DQ con técnica de PCR-SSP-DNA.
El estudio estadístico fue confeccionado con “systat package”.
Resultados
Tabla 1.
Variable
Adultos
LIEs
AP
Ac anti tTG
LIEs + AP
LIEs + tTG
Niños
LIEs
AP
Ac anti tTG
LIEs + AP
LIEs + tTG
Punto de corte
TCRγδ>10 y 103ζ3{<5
12
TCRγδ>10 y 103ζ3{<5
12
S (IC 95%)
E (IC 95%)
75,7 (59,9-86,6)
60,0 (46,6-74,4)
64,9 (48,8-78,2)
45,7 (30.5-61,8)
54,1 (38,4-69,0)
92,4 (86,1-95,9)
96,4 (91,2-98,6)
96,4 (91,2-98,6)
100 (96,8-100)
99,2 (95,4-99,9)
82,5 (74,1-88,7)
76,8 (67,5-84,0)
93,1 (86,4-96,6)
66,0 (56,3-74,5)
80,2 (71,4-86,8)
100 (91,6-100)
95,2 (84,2-98,7)
97,6 (87,7-99,6)
100 (91,8-100)
100 (91,8-100)
El valor predictivo negativo de la prueba HLA-DQ2/8 en EC es
de 93,3% (IC de 70.2-98.8) para adultos y de 77% (IC de 49,7-91,8) en
niños.
Conclusiones
• En adultos el inmunofenotipo de LIEs incrementa la Especificidad
en un 7,6% al sumarse a la AP y en un 6,8% junto a tTG.
• En niños el estudio de LIEs presenta mayor Sensibilidad que los
resultados de AP.
• Las diferencias de Sensibilidad y Especificidad para una misma
prueba entre las dos poblaciones puede deberse al diferente criterio clínico utilizado en el diagnóstico.
• Consideramos al estudio de LIEs como prueba adyuvante en la
confirmación de EC.
P-023
DEFICIENTE ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS T DE SANGRE
PERIFÉRICA DE PACIENTES CON PÉNFIGO EN RESPUESTA A
LA ESTIMULACIÓN CON SUPERANTÍGENOS. E. Zumaquero1, S.
Arias-Santiago2, S. García-Rodríguez1, A. García-Pérez1, P. Navarro1,
M.A. Fernández-Pugnaire2, M. Zubiaur1, J. Sancho1. 1Instituto de Parasitología y Biomedicina "López-Neyra", CSIC, Armilla (Granada), Armilla, Spain. 2Hospital Clínico Universitario San Cecilio, Granada.
El pénfigo es una enfermedad autoinmune grave considerada rara
por su baja frecuencia. Se caracteriza por la formación de autoanticuerpos (antidesmogleína 1 y 3) que destruyen los puentes de unión intercelulares de la piel y mucosas favoreciendo las formación de ampollas
intraepidérmicas.
Objetivo del estudio. Hacer un estudio de los parámetros inmunológicos de un conjunto de 8 pacientes diagnosticados de pénfigo.
Materiales y métodos. Se procede a la extracción de sangre de los
pacientes y controles sanos obteniéndose plasma y células mononucleares (PBMCs). Usando un sistema multiparamétrico (BioPlex) se
han cuantificado simultáneamente los niveles de 10 citoquinas en el
plasma de los pacientes y controles sanos. El análisis de marcadores
de superficie se lleva a cabo mediante citometría de flujo. Tras estimulación de los PBMCs con una mezcla de los superantígenos SEE y SEB
se estudia la formación de sinapsis inmunológica mediante microscopía confocal, la formación de conjugados y la expresión de marcadores por citometría de flujo, la secreción de citoquinas por BioPlex.
Resultados. Se observa: Niveles de citoquinas similares en plasma de pacientes y de controles, a excepción de un paciente con mala
respuesta al tratamiento con final de exitus que presentaba niveles elevados de IL-6. Incremento de una subpoblación de células B con fuerte expresión de CD38, probablemente células plasmáticas responsables de la producción de anticuerpos. Menor porcentaje de la subpoblación CD56bright en células NK con propiedades inmunorreguladoras. Aparición de una población de granulocitos de baja densidad
en PBMCs. Disminución en la formación de conjugados T:B, menor
incremento en la expresión de CD38 en células T y menor producción de citoquinas en respuesta a superantígenos.
Discusión y conclusiones. La deficiente activación de los linfocitos T de pacientes con pénfigo inducida por superantígenos, que se
constata por una deficiente formación de conjugados linfocito T:linfocito B y/o una disminución en la formación de sinapsis inmunológicas maduras, podría estar relacionada con una menor capacidad de
presentación antigénica por parte de los linfocitos B de sangre periférica de estos pacientes. Para demostrarlo definitivamente sería necesario realizar experimentos con péptidos específicos para desmogleina 1 o 3.
P-024
ESTUDIO COMPARATIVO DE GLIADINA Y GLIADINA DEAMIDADA EN PACIENTES CON ENFERMEDAD CELIACA. S. Toro
Llamas. Hh.Uu. Virgen Del Rocio, Estepa.
Introducción. La enfermedad celíaca (EC) es una patología autoinmune que se manifiesta tras la ingesta de gluten en individuos genéticamente predispuestos. Se caracteriza por inflamación del intestino
delgado, atrofia vellositaria, malabsorción y otras complicaciones derivadas. El diagnóstico definitivo se basa en la biopsia duodeno-yeyunal, aunque actualmente disponemos de marcadores serológicos que
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apoyan su diagnóstico. Entre ellos, los anticuerpos frente a Gliadina
(AGA), Transglutaminasa (tTG) y Endomisio (EMA) que presentan
altos valores de sensibilidad y especificidad. Recientemente se ha incorporado una variante deamidada de la gliadina.
Objetivo. Comparar si la determinación de anticuerpos frente a
Gliadina vs Gliadina deamidada mejora la sensibilidad y especificidad en pacientes diagnosticados de EC.
Pacientes y métodos. Se incluyeron un total de 42 sujetos con sospecha de EC, de los cuales tras la biopsia se confirmó el diagnóstico en
37 pacientes, de los cuales 32 eran pediátricos (un caso diagnosticado
con déficit selectivo de IgA) y 5 adultos. La determinación de anticuerpos se llevó a cabo mediante la técnica ELISA usando UNICAP- 250
de Phadia.
Resultados. Al comparar los resultados de ambos parámetros en
el grupo completo observamos que el 36.1% (13/36) fueron positivos
para gliadina y el mismo porcentaje se obtuvo para la gliadina deamidada 36,1% (13/36). Cuando seleccionamos los pacientes con EC y anticuerpos frente a tTG positivos los resultados fueron de un 27.8 % (10/36)
y de un 47,2% (17/36) para la gliadina y gliadina deamidada respectivamente. Cuando estudiamos el grupo pediatrico, observamos que los
sujetos afectados por EC y positivos para tTG y gliadina fue de 22,6%
(7/31) frente al 42% (13/31) de los pacientes de EC positivos para tTG
y gliadina deamidada.
Conclusión. Nuestros resultados sugieren que la tTG junto a la
gliadina deamidada proporcionan mayor especificidad y sensibilidad
en el estudio serológico de la EC que la tTG y Gliadina.
P-025
DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS ASOCIADOS A NEUROPATÍAS PARANEOPLÁSICAS. R. Alenda Asensi, J.M. Vazquez Miralles, F.G. Silva Carreras, Á. Carrasco Sayalero. Hospital Universitario
Ramón Y Cajal, Madrid.
Objetivo. Destacar la importancia de los anticuerpos onconeuronales, en la búsqueda de una neoplasia, presentes en un paciente con
síndrome neurológico: síndrome paraneoplásico (PNS).
Material y métodos. Varón de 81 años, procedente del servicio de
Neurología de nuestro Hospital con diagnóstico de “Leve Polineuropatía Sensitiva Mixta en MMII”, para el cual nos pidieron estudio de
anticuerpos onconeuronales en muestra de suero.
Realizamos el estudio de estos anticuerpos por dos técnicas, deben
de dar positivas ambas para informar la presencia de anticuerpos:
• Inmuno-fluorescencia indirecta (IFI) con anticuerpos de la clase
IgG (Euroimmun) con diluciones en suero a 1/10 y 1/100.
• Inmuno-Blot (Enzimo-inmunoensayo) (Euroimmun)
Resultados. En el estudio por IFI se observó un patrón compatible con anticuerpo anti-Hu.
En el estudio por inmuno-blot se observó una banda clara a la altura del antígeno Hu.
Con el informe por el Servicio de Neurología de: “polineuropatía mixta sensitiva” y la detección de los anticuerpos anti-Hu se realizaron estudios complementarios que dieron con el hallazgo en el estudio por TAC de un aumento en la masa parahiliar izquierda de 4’5 cm,
la cual se confirmó por biopsia como carcinoma epidermoide con zonas
basaliodes.
Conclusión. Los anticuerpos anti-Hu son de gran utilidad durante el estudio de un síndrome neurológico para orientar al clínico hacia
la búsqueda de una posible neoplasia.
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VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
SESIÓN 2: CÉLULAS B Y ALERGIA
Moderadores: Jose Antonio Brieva Romero (Cádiz)
Julia Sequí Navarro (Madrid)
P-026
CLINICAL SIGNIFICANCE OF CROSS-REACTIVITY BETWEEN TOBACCO AND LATEX. A. San Miguel, F.J. Martin Gil, A.
Armentia Medina, B. Bartolome. Hospital Universiatario Rio Hortega, Valladolid.
Background. Recently, allergen cross-reactivity was observed
between tobacco and other species of Solanaceae family (tomato, potato,
aubergine and egg plant). We have recently studied IgE response to
tobacco in asthmatic patients sensitised to Lolium perenne (rye grass
pollen) and have found that 30 % of tobacco responsive patients had
also latex sensitisation.
Objective. The aim of our study was to investigate the possibility
of cross-reactivity among tobacco and latex in asthmatic patients with
IgE response to latex.
Methods. We performed a study on tobacco and latex exposure in
15 patients suffered from asthma and latex sensitisation that were
randomly chosen from our data base of sensitive-latex patients. All
these patients were tested in order to try to identify tobacco and latex
as possible allergens that might cause clinical specific response (pricktests, specific IgE to tobacco, latex and related allergens, bronchial
challenge (BC), patch tests with tobacco, latex and nicotine, rubbing
tests) and immunological response: immunoblotting, immunoblottinginhibition and EAST-inhibition.
Results. Positive prick and BC with specific IgE > 0,35 kU/L to
tobacco was demonstrated in 11 asthmatics that were also sensitised
to rye grass. Tobacco IgE level was related with sensitisation to latex
(p<0.002), but not with other vegetables that belong to the Solanaceae
family. EAST-inhibition and immunoblotting-inhibition showed the
existence of cross-reactivity between tobacco and latex.
Conclusions. There exists cross-reactivity between latex and tobacco
allergens. Smoking patients with IgE response to tobacco may be a risk
population for latex sensitisation.
P-027
ALERGIA ALIMENTARIA A SEMILLAS Y SINDROME ANTIFOSFOLIPIDICO (SAP). A. San Miguel Hernandez1, A. Armentia
Medina 1, M.A. Mazon Ramos 1, F. Pineda 2, J. Crespo 1, J. García
Frade1, B. Martin Armentia1, M. Herrrero1. 1Hospital Universitario
Rio Hortega. Valladolid, Valladolid, Spain. 2Laboratorios Diater.
Madrid.
Es conocido que las reacciones alérgicas severas por alimentos
involucran los sistemas gastrointestinal, cutáneo, ocular, respiratorio y cardiovascular.
Las reacciones anafilácticas a alimentos casi siempre se producen de un modo inmediato al estímulo y pueden ser diagnosticadas por pruebas cutáneas, determinaciones de IgE específica y provocación oral si es necesario, pero las complicaciones clínicas de
este síndrome están aún por establecer.
Hemos detectadocasos de anafilaxia alimentaria seguidos de
trombosis severa en menos de tres meses. En todos los casos, la ana-
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INMUNOLOGÍA
filaxia fue producida por ingestión de alérgenos vegetales (semillas
y frutas).
Material y métodos. Se han seleccionado aleatoriamente 52 pacientes afectados por anafilaxia producida por semillas o frutos. También
se han seleccionado aleatoriamente 30 pacientes, que presentan criterios de SAP, procedentes del Servicio de Medicina Interna y de la base
de datos del Servicio de Hematología. Todos los pacientes han sido
estudiados en la misma forma: una detallada historia clínica de alergia, pruebas cutaneas con una completa batería de 36 alergenos, incluyendo “Prick” con el alergeno vegetal sospechoso, IgE específica medida por el método CAP y provocación bronquial en caso de asma. Los
estudios controlados a doble ciego con placebo de provocación oral se
han realizado sólo en caso necesario. Se han incluido 10 controles no
atópicos a los que se les ha realizado las mismas pruebas. El consentimiento informado fue obtenido en todos los pacientes.
Los sueros utilizados en este estudio han sido los de 52 pacientes
con anafilaxia, 30 pacientes que sufrían de SAP, un grupo de 10 pacientes no alérgicos y 4 controles con SAP y lupus eritematoso sistémico
(LES) con trombosis. Ninguno de los pacientes control registraron síntomas de alergia.
La sensibilización a las semillas o frutos fue considerada como la
presencia de: a) una o más pruebas cutáneas positivas. b) un test CAPFEIA Phadia positivo > 0,35 UI/ml o c) una provocación específica
positiva. Todos los pacientes fueron informados de los objetivos del
estudio y ensayos del estudio a fin de tratar de identificar la sensibilización a un alergeno vegetal como factor de riesgo de SAP.
También se ha llevado a cabo la medición de anticuerpos anticardiolipina IgG e IgE específica para los alimentos vegetales mediante ELISA y CAP-FEIA (Phadia), respectivamente. Además, hemos realizado estudios de inhibición de inmunotransferencia para los alergenos vegetales sospechosos, utilizando la avellana como alergeno
común.
Resultados. Entre los pacientes afectados de anafilaxia, 15 (28,84%)
presentaron niveles positivos (moderados y ligeramente altos) de anticuerpos anticardiolipina y síntomas secundarios. De estos pacientes,
11 tuvieron trombosis: 2 de ellos presentaron trombosis de ambas venas;
4 de una vena iliaca, 1 de ambas venas iliacas y cava inferior; 1 diarrea
con sangrado y daño abdominal; y 3 pérdida fetal.
Entre los pacientes diagnosticados previamente como SAP, algunos presentaron hipersensibilidad a semillas y a frutas, ambas confirmadas por el estudio alergológico anteriormente descrito.
Los sueros de los pacientes mostraron unión IgE a varias proteínas incluidas en las fracciones hidro e liposoluble (contenidas en la
fracción oleosa de las lipoproteínas de membrana) de las oleosinas (de
PM entre 16.7 y 14.7 KDa).
De los 9 pacientes con Prick negativo, 4 mostraron IgE positiva y
respuesta a las fracciones liposolubles de la avellana. Todos los pacientes eran jóvenes (20 ± 6 años) y mujeres.
Las lipoproteínas de membrana (contenidas en la fracción oleosa)
podrían aparecer como un grupo de proteínas con capacidad de sensibilización, no demostrada hasta la fecha.
Conclusiones. En resumen, a pesar de la fuerte asociación entre
anticuerpos anticardiolipina y trombosis, el papel patogénico de la
trombosis en el desarrollo de la misma permanece por elucidar. Sin
embargo, hemos descrito un nuevo mecanismo que involucra la hipersensibilidad a alérgenos lipoproteínicos. El conocimiento de estos
nuevos enfoques patogénicos podría identificar nuevas dianas terapeúticas y, por consiguiente, mejorar la monitorización de estos
pacientes.
PÓSTERS
P-028
TLR4-INDEPENDENT UPREGULATION OF ACTIVATION MARKERS IN MOUSE B LYMPHOCYTES INFECTED BY HRSV. D.
López, M.Á. Rico, S. Infantes, M. Ramos, A. Trento, C. Jonhstone, J.A.
Melero, M. Del Val. Centro Nacional de Microbiología. Instituto de Salud
Carlos III, Majadahonda.
Human respiratory syncytial virus (HRSV) is the most common
cause of severe respiratory infections in infants and young children,
often leading to hospitalization. In addition, HRSV poses a serious
health risk in immunocompromised individuals and the elderly. It has
been reported that this virus can infect mouse antigen-presenting cells,
including B lymphocytes. In these B cells, HRSV infection upregulates
the expression of activation markers, including MHC class II and CD86,
but not MHC class I molecules. Here, we report that HRSV infection
of spleen B lymphocytes downregulated TLR4. Either blocking with
anti-TLR4 antibody or genetic deletion, but not functional deficiency
of TLR4, moderately reduced the infectivity of HRSV in B lymphocytes.
HRSV-infected B lymphocytes with deleted TLR4 upregulated MHC
class II and CD86 molecules to the same levels as TLR4+ wild type B
cells. Since the activation of monocytes and macrophages by HRSV
was previously reported to depend on TLR4, the current study indicates
that these cells and B lymphocytes respond to HRSV infection with
different activation pathways.
P-029
ALTERACIONES EN EL COMPARTIMENTO DE CÉLULAS B EN
PACIENTES CON LLC-B ASOCIADAS A LA EXPRESIÓN DE ZAP70. M.Á. Sánchez Luengo1, Z. Moreno Villegas1, G. Parada Hermoza1,
L. Ortega Moreno1, D. Díaz Martín1, H. Barcenilla Rodríguez1, J. Moserrat Sanz1, A. Prieto Martín1, E. Reyes Martín1, M. Álvarez De MonsSoto2. 1Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares. 2Hospital Universitario Príncipe de Asturias.
Introducción. Las células B de los pacientes con LLC-B son muy
similares morfológicamente a las células B maduras de de individuos
sanos a excepción de los casos de LLC-B atípica o mixta. Sin embargo presentan características fenotípicas propias que sirven para su diagnóstico algunas de estas características fenotípicas pueden relacionarse con el estado pronóstico, supervivencia y/o posible respuesta a tratamiento.
Objetivos. Estudiar el fenotipo de células B en pacientes con LLCB según el factor pronóstico ZAP-70.
citometría de flujo de 4 colores, para lo cual se obtuvieron PBMCs de
sangre periférica de 34 pacientes con LLC-B que se categorizaron en
ZAP-70+ (n=16) y ZAP-70– (n=18), y de 18 controles sanos. Para el estudio de las distribución y activación de las células B se utilizaron anticuerpos frente a los antígenos de superficie CD3, CD5, CD19, CD21,
CD23, CD38, CD40, CD80, CD86, HLA-DR.
Resultados. Se observó un fuerte incremento significativo en el
número absoluto de células B en los pacientes con LLC-B ZAP-70+ respecto a los pacientes ZAP-70– y los controles sanos (18.261,61 vs
11.613,38 y 163,20 respectivamente) así como de su porcentaje (83,11
vs 69,39 y 9,79). El estudio de la expresión de los diferentes marcadores de células B reflejó notables diferencias entre los dos grupos de
pacientes con LLC-B según la expresión de ZAP-70 mostrando los
pacientes ZAP-70+ un incremento significativo respecto a los pacien-
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PÓSTERS
tes ZAP-70– tanto del número absoluto como del porcentaje de células B CD38+, CD5+ y CD40+, y porcentajes más bajos de células B
CD21+. Por otra parte los pacientes ZAP-70+ presentaron un descenso significativo del porcentaje de células B que expresan las moléculas
de coestimulación CD80+ y CD86+.
Conclusiones. La expresión de ZAP-70 se asocia con una linfocitosis de células B CD5+, CD38+ y CD40+ y una disminución del
porcentaje de células B que expresan CD80+ y CD86+. Lo cual puede estar relacionado con la mayor agresividad del tumor en estos
pacientes y su peor respuesta a tratamientos y por tanto a su peor
pronóstico.
P-030
PAPEL DE LAS DISTINTAS SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS B EN LA SÍNTESIS INTRATECAL DE INMUNOGLOBULINAS EN LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE. M. Espiño Martínez, J.C.
Álvarez Cermeño, M.C. Sádaba Argaiz, N. Marín Crespo, E. Roldán
Santiago, P. González Porqué, L.M. Villar Guimerans. Hospital Ramón
y Cajal, Madrid.
Objetivo. Estudio de las subpoblaciones de linfocitos B CD5- y
CD5+ en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de los pacientes con esclerosis múltiple remitente-recidivante (EM-RR) y su relación con la síntesis intratecal de IgM e IgG.
Materiales y métodos. Pacientes: se estudiaron 51 pacientes
con EM-RR que presentaban bandas oligoclonales de IgM frente a
los lípidos de la mielina (ML+), 141 pacientes con EM-RR que no
presentaban dichas bandas (ML-), 26 pacientes con otras enfermedades neurológicas inflamatorias del SNC (OENI) y 43 pacientes
con otras enfermedades neurológicas no inflamatorias del SNC
(OENN).
Métodos. La detección de bandas oligoclonales de IgM se realizó mediante isoelectroenfoque e inmunoblotting. La cuantificación de
la IgG, IgM y albúmina se llevó a cabo mediante nefelometría. La existencia de síntesis intratecal de IgG e IgM se determinó a través de los
índices de IgG e IgM. Los valores del índice de IgG mayores de 0,77
indican síntesis intratecal de IgG. Los valores del índice de IgM por
encima de 0,1 indican síntesis intratecal de IgM. Las células de sangre
periférica y LCR se marcaron con los anticuerpos monoclonales: anti
CD19-FITC, anti CD5-PE y anti CD45-PercP. El análisis de las poblaciones celulares se realizó en un citómetro de flujo FACSCanto (Becton Dickinson). Los resultados se analizaron con el test de Mann-Whitney y el test exacto de Fisher.
Resultados. El porcentaje de linfocitos CD5+ está claramente
aumentado en los pacientes con síntesis intratecal de IgM (1,44±0,22%
vs 0,82±0,11, p<0,0001). Además, los valores del índice de IgM se correlacionan estrechamente con los porcentajes de las células B CD5+ en
LCR (p<0,0001). Esto demuestra que esta subpoblación está implicada en la síntesis intratecal de IgM en la EM. Sin embargo, no hay diferencias en esta subpoblación entre los pacientes con y sin síntesis intratecal de IgG (0,94±0,14% y 0,91±0,11%, NS). Los valores del índice de
IgG se correlacionan con los porcentajes de la población de linfocitos
B CD5- en el LCR. Esta población parece ser responsable de la síntesis
intratecal de IgG.
Conclusiones. La subpoblación de linfocitos B CD5+ es la principal responsable de la síntesis intratecal de IgM en los pacientes ML+
mientras que la subpoblación B CD5- esta implicada en la síntesis intratecal de IgG en la EM.
72
VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
P-031
EXPRESIÓN DE LA CADENA ALFA DE LA IL15 Y SU RELACIÓN
CON MARCADORES GENÉTICOS DE LA ENFERMEDAD CELIACA. V. Benito Zamorano1, J.A. Garrote Adrados2, B. Martínez Abad1,
S. Vallejo Diez1, E. Montalvillo Álvarez1, J.M. Marugán De Miguelsanz2, L. Fernández Salazar2, E. Arranz Sanz1. 1Facultad De MedicinaI.B.G.M. Universidad De Valladolid, Valladolid. 2Hospital Clínico Universitario De Valladolid.
Estudios previos de nuestro laboratorio indican que los pacientes
con enfermedad celiaca (EC) tienen una mayor expresión de IL15Rα
en muestras de biopsia duodenal.
Objetivo. Caracterizar la expresión de IL-15Rα en células mononucleares de sangre periférica (CMSP), tanto de individuos con genética positiva de enfermedad celiaca (HLA-DQ2+) como individuos
sanos control. A su vez, dentro de cada grupo se diferencian población
adulta e infantil. Identificar las sub-poblaciones celulares que lo expresan y cuantificar si existen diferencias cuantitativas en su expresión.
Material y métodos. Se utilizaron muestras de sangre periférica
de individuos control sanos sin alteraciones relacionadas con la enfermedad celiaca (14 adultos, edad media 50 años, rango 20-73; 23 niños,
edad media 6,2 años, rango 2-14) y de pacientes con sospecha clínica
de enfermedad celiaca y genética positiva para HLA-DQ2 (4 adultos,
edad media 41 años; 13 niños, edad media 4,2 años, rango 1-12 años).
Las células fueron extraídas de las muestras de sangre por gradiente de densidad. Se identificaron mediante anticuerpos monoclonales
diferentes sub-poblaciones celulares (linfocitos T CD4+, linfocitos T
CD8+, Linfocitos B, células NKs, iNKTs) y se detectaron por citometría
de flujo los niveles de expresión de IL15Rα en dichas poblaciones.
Resultados. En los adultos, se observa una disminución estadísticamente significativa en la población de linfocitos T CD4 + (p= 0,01)
y en la expresión de IL-15Rα en linfocitos T CD8+ (p=0,03).
En la población infantil se observan diferencias estadísticamente
significativas en las poblaciones de linfocitos T CD8+ (p=0,01); linfocitos iNKT (p=0,03) y en linfocitos B (p= 0,04); sin embargo, no se observan cambios estadísticamente significativos en la expresión de IL-15Rα
entre las diferentes poblaciones.
Conclusión. Se estudian por separado población infantil y población adulta, ya que previamente se ha observado que los niveles de
expresión de las diferentes células y moléculas difieren.
El aumento de la expresión de IL15Rα no se refleja en los linfocitos de la sangre periférica, al contrario que en biopsias intestinales.
Esto podría indicar que el aumento observado en biopsias intestinales
en pacientes con enfermedad celiaca no es constitutivo, sino inducido
en la mucosa intestinal.
P-032
PAPEL DE N-RAS EN LA DIFERENCIACIÓN FUNCIONAL DE
LINFOCITOS T CD8+ MADUROS EFECTORES Y DE MEMORIA.
S. Iborra1, M. Ramos1, S. Lázaro1, F. Aguilar1, E. Santos2, D. López1, E.
Fernández-Malavé3, M. Del Val4. 1Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid. 2Centro de Investigación
del Cáncer, IBMCC, CSIC-USAL, Universidad de Salamanca. 3Universidad
Complutense de Madrid. 4Centro Nacional de Microbiología, Instituto de
Salud Carlos III y Universidad Complutense de Madrid.
Objetivos. Determinar la relevancia individual de la isoforma Nras en la función de linfocitos T CD8+ maduros.
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Material y métodos. a) Estudio de la activación de linfocitos T
CD8+ normales y deficientes en N-ras in vitro e in vivo. b) Caracterización de la respuesta de memoria de linfocitos T CD8+ tras inmunización con células dendríticas y péptido, así como tras infección con
el virus vaccinia. c) Estudio de la expresión de factores de transcripción y vías de señalización implicados en la diferenciación funcional
de linfocitos T CD8+ de memoria o efectores.
Resultados y conclusiones. N-ras no es necesario para la activación de un linfocito T CD8+, ni para la adquisición de un fenotipo efector durante una respuesta primaria. Por el contrario, la señalización a
través de N-ras es esencial para la supervivencia de linfocitos T CD8+
durante la fase de contracción de la respuesta así como para la diferenciación funcional a memoria. Este fenotipo en linfocitos T CD8+ deficientes en N-ras correlaciona con la expresión defectiva del factor de
transcripción eomesodermina, característico de células de memoria.
SESIÓN 3: CÉLULAS NK
Moderadores: Raquel Tarazona (Cáceres)
Rafael Solana (Córdoba)
P-033
NORMAL 0 21 MICROSOFTINTERNETEXPLORER4. J.G. Casado1,
E. Delgado2, M.C. Guarnizo2, R.G. Roncero1, S. Morgado1, B. SánchezCorrea1, J.J. Gordillo1, J. De Julián2, R. Tarazona1. 1Universidad de Extremadura/Facultad de Veterinaria, Cáceres. 2Norba, Ginecología y Reproducción S.L., Cáceres.
Introducción. Los prostasomas son pequeñas vesículas secretadas
por la glándula prostática que se fusionan al espermatozoide transfierendo iones, lípidos y proteínas de superficie que mejoran su movilidad, licuefacción y capacitación. En el tracto genital femenino, el descenso de pH incrementa la fusión de prostasomas con espermatozoides permitiendo así la adquisición de nuevas proteínas que protegen
al espermatozoide de las defensas inmunitarias. Por otro lado, el aparato reproductor femenino se considera un ambiente potencialmente
hostil para los espermatozoides con diferentes subpoblaciones de células NK en el tracto genital superior e inferior.
Objetivos. Puesto que se ha sugerido que las células NK representan un importante componente de la repuesta inmune innata en el tracto reproductor, en este trabajo se ha analizado el papel de los prostasomas en la regulación de la actividad NK.
Material y métodos. Los prostasomas en pacientes normozoospérmicos (definidos según los criterios de la OMS) se aislaron por ultracentrigugación y cromatografía y se analizaron fenotípicamente por
citometría de flujo después de su acoplamiento con microsferas de carboxilato. El fenotipo y la funcionalidad de las células NK se determinó mediante citometría de flujo (expresión de CD244, IFN-gamma
intracelular y CD107a/b en membrana) tras el cocultivo de células NK
con diferentes concentraciones de prostasomas.
Resultados. El análisis por citometría demostró que los prostasomas expresan altos niveles de CD48 y ausencia de ligandos para
receptores activadores NKG2D y DNAM-1. La interacción de células
NK con prostasomas provocó un descenso de la expresión de CD244
así como un descenso de la actividad NK en términos de producción
de IFN-gamma y capacidad de desgranulación.
Conclusiones. Los resultados obtenidos in vitro demuestran el papel
de los prostasomas en la inmunomodulación de la actividad NK. El descenso de la actividad NK observado en células NK cocultivadas en presencia de prostasomas sugiere que estas vesículas podrían inmunomodular el microambiente del tracto genital femenino. La interacción NK-prostasomas podría ser considerado un nuevo mecanismo para prolongar la
supervivencia del espermatozoide e incrementar el éxito reproductivo.
P-034
ALTERACIONES EN LA EXPRESIÓN DE DNAM-1 EN LAS CÉLULAS NK DE PACIENTES DE LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA. B.
Sánchez Correa1, I. Gayoso2, J. Bergua3, J. García Casado1, S. Morgado1, R. Solana2, R. Tarazona1. 1Facultad De Veterinaria, Caceres. 2ImibicUniversidad De Cordoba-Hospital Reina Sofia, Cordoba, 3Hospital San Pedro
De Alcantara, Caceres.
Objetivos. Estudios realizados en pacientes diagnosticados de
Leucemia Mieloide Aguda (LMA) sugieren que las células NK juegan
un papel esencial en la defensa del organismo frente a neoplasias de
origen hematológico. Sin embargo, la rápida progresión de la enfermedad y la elevada incidencia de recaídas tras el tratamiento sugiere
que los blastos de leucemia escapan del reconocimiento por las células del sistema inmune. Se han descrito anormalidades en la expresión
de algunos receptores activadores de la citotoxicidad y/o de sus ligandos en el momento del diagnóstico que podrían estar relacionadas con
esta respuesta deficiente de las células NK y por tanto con la resistencia de las células leucémicas a la lisis. En el presente trabajo procedemos a analizar en profundidad las alteraciones en la expresión del
receptor activador DNAM-1 en las células NK de pacientes de LMA,
así como el mecanismo implicado en dicho fenómeno.
Material y métodos. Las muestras analizadas se obtuvieron de sangre periférica de 40 pacientes diagnosticados de LMA en el Hospital San
Pedro de Alcántara y de 47 individuos control. El estudio se realizó de
acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité
Ético de la UEX y del Hospital. Una vez aisladas, las células de sangre
periférica fueron analizadas por citometría de flujo empleando para ello
los anticuerpos de interés. En los ensayos en los que se realizaron cocultivos se emplearon PBMCs de individuos control y células leucémicas
(ratio 1:5). Tras 48 horas de incubación se analizó la expresión en superficie del receptor DNAM-1 en las células NK. El análisis estadístico de
los resultados se realizó empleando el programa SPSS15.
Resultados.
• Los pacientes de LMA menores de 65 años presentan un descenso significativo en la expresión de DNAM-1 en la superficie de las
células NK al compararlos con los individuos control del mismo
rango de edad.
• El análisis de los ligandos de DNAM-1 en la superficie de los blastos leucémicos muestra que la mayoría de los pacientes de LMA
expresan al menos un ligando para dicho receptor activador. Dicha
expresión no presenta correlación con la edad ni con el subtipo
FAB.
• Existe una correlación inversa entre la expresión de DNAM-1 y su
ligando CD112 en las células NK de los pacientes de leucemia
menores de 65 años.
• Los resultados obtenidos tras realizar los cocultivos entre PBMCs
de individuos sanos y células leucémicas con diferentes fenotipos
sugieren que el descenso en la expresión de DNAM-1 observado
en las células NK de los pacientes de LMA es consecuencia del con-
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tacto directo entre DNAM-1 y los ligandos de dicho receptor expresados en la superficie de los blastos leucémicos
Conclusiones. Las células leucémicas son capaces alterar la expresión en superficie del receptor activador DNAM-1. Esta alteración
podría considerarse un mecanismo de escape tumoral, que podría
emplearse como nuevo marcador pronóstico de la supervivencia en
pacientes con LMA.
P-035
INCREMENTO DE CÉLULAS INKT V∞24+ EN EL EPITELIO DUODENAL DE PACIENTES CELIACOS. POSIBLE PAPEL EN LA PATOGENIA DE LA ENFERMEDAD CELIACA. E. Montalvillo Álvarez1,
J.A. Garrote Adrados2, B. Martínez Abad1, S. Vallejo Diez1, V. Benito
Zamorano1, C. Calvo Romero2, L. Fernández Salazar2, E. Arranz Sanz1.
1Facultad De Medicina/IBGM, Universidad De Valladolid, Laguna De Duero. 2Hospital Clínico Universitario de Valladolid.
Objetivo. Establecer las diferencias en la población intraepitelial
de células iNKT en el duodeno de pacientes celiacos en actividad con
respecto a los pacientes no celiacos, tanto con afectación de la mucosa
duodenal por otras patologías como con duodeno no afectado.
Pacientes y método. Se utilizaron explantes de duodeno obtenidos por técnica endoscópica. 8 pacientes celiacos en actividad no tratados (aEC; serología y genética positivas, atrofia vellositaria y alteraciones en el linfograma propias de Enfermedad Celiaca, EC), 6 pacientes no celiacos sin afectación duodenal (CsNo-EC; serología y genética negativas, sin alteraciones histológicas ni de linfograma) y 7 pacientes con algún tipo de patología diferente a EC en la mucosa duodenal (CpNo-EC; serología y genética negativas, sin atrofia vellositaria
y con alteraciones en el linfograma diferentes a las de EC).
Los explantes se procesaron para la extracción de los Linfocitos
Intraepiteliales (LIEs). Las células iNKT fueron identificadas mediante anticuerpos específicos para la cadena Vα24 del TCR, detectados
por citometría de flujo. Los datos se analizaron estadísticamente
mediante el test ANOVA (significación estadística p<0,05).
Resultados. Se observa un aumento estadísticamente significativo
de la población de células iNKT en los celiacos en actividad (aEC mean=
7,46% del total de LIEs) comparado con el resto de los grupos (CsNoEC mean= 1,81% del total de LIEs, CpNo-EC mean= 2,90% del total de
LIEs). Además, en los celiacos en actividad predomina claramente el
fenotipo de célula iNKT Vα24+CD4+CD8- sobre el resto (aEC mean=
84,39% del total de iNKTs), mientras que en los CsNo-EC y CpNo-EC
el porcentaje de iNKTs con fenotipo Vα24+CD4+CD8- es mucho menor
(mean= 47,20% y 51,14% del total de iNKTs respectivamente).
Conclusión. Los pacientes celiacos presentan un mayor porcentaje
de células iNKT en el compartimento intraepitelial del duodeno, las cuales desarrollan principalmente un fenotipo Vα24+CD4+CD8-. De acuerdo a estudios moleculares previos de nuestro grupo, los celiacos en actividad expresan un aumento de Vα24 (representativo de las iNKTs) y de
IFNγ comparado con el resto de grupos, lo que refuerza los datos presentados aquí. Teniendo en cuenta que las células iNKT Vα24+CD4+CD8- se
han descrito como células duales que tras su estimulación son capaces de
producir de forma rápida grandes cantidades de citoquinas tanto de tipo
Th1 (IFNγ) como Th2 (IL4) (La Cava, A. et al. 2006), nuestros resultados
sugieren que esta población intraepitelial de iNKTs podría estar implicada en la inmunopatogénesis de la EC y, posiblemente, contribuyen de
forma importante a la secreción de IFNγ (sin mediación de IL12), principal citoquina implicada en la lesión tisular propia de esta enfermedad.
74
VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
P-036
PAPEL DE NCR EN LA INTERACCIÓN ENTRE CÉLULAS NK Y
CÉLULAS DENDRÍTICAS EN ANCIANOS. N. Rojas-Colonelli1, I.
Gayoso1, B. Sánchez-Correa2, M.D.C. Campos1, A. Pera1, R. Tarazona2,
R. Solana1. 1Hospital Universitario Reina Sofía, Córdoba. 2Universidad de
Extremadura.
Las células dendríticas (DC) y las células asesinas naturales (NK)
interaccionan por contacto celular, resultando una activación bi-direccional de ambas. Las células NK activan sus funciones citotóxicas y se
favorece la maduración de las DC. Asimismo tras esta interacción se
eliminan las DC inmaduras. En estas interacciones intervienen los
receptores NKp30 y DNAM1. Estudios en nuestro laboratorio indican
que existe un descenso significativo en la expresión de estos receptores en células NK de ancianos. En este trabajo analizamos la interacción entre células NK y células dendríticas y los receptores implicados
en la misma en jóvenes y ancianos.
Las DC se generaron in vitro a partir de PBMCs de donantes sanos.
Por cultivo durante 6 días, en presencia de IL-4 y GM-CSF. Se estudió la expresión de CD11c como marcador de células dendríticas. Las
células NK fueron enriquecidas mediante inmunoseparación magnética (>80% son CD3negCD56+). Ambos tipos celulares fueron co-cultivados a razón de 5:1 DC:NK durante 48 horas. Como control de la
activación las DCs se estimularon con LPS (DC maduras) o se dejaron
sin tratar (DC inmaduras). Las células fueron evaluadas fenotípicamente por medio de citometría de flujo.
Las DC de jóvenes maduradas con LPS mostraron un aumento en
la expresión en superficie de los marcadores de activación CD86 y
CD83, al compararlas con las DC sin estimular. La interacción DC-NK
indujo la activación y maduración de las DCs, observándose un aumento en superficie tanto de CD86 como CD83, similares a los encontrados en las DC estimuladas con LPS. En ancianos la expresión de estos
marcadores en células dendríticas resultó descendida al compararlo
con jóvenes, lo que indica una alteración en la interacción DC-NK.
La interacción de las NK con las DC induce la maduración de éstas
últimas, lo que posiblemente esté implicado en la respuesta inmune
innata de ambos tipos celulares. Nuestros resultados previos que muestran un descenso en la expresión de los receptores NKp30 y DNAM1
en ancianos, ambos implicados en la interacción NK:DC, sugieren que
este descenso puede participar en la alteración en la interacción DCNK y contribuir al deterioro de la respuesta inmune adaptativa en personas de avanzada edad.
P-037
ESTUDIO DE EXPANSIÓN DE POBLACIONES LGL EN PACIENTES CON LINFOCITOSIS PERIFÉRICA. L. Arriarán Aronés, M.
Sáenz Cuesta, M.D.C. Montes Fernandez, P. Echaniz Aizpuru, M.D. De
Juan Echavarri, A. Prada Iñurrategui, E. Cuadrado Del Barrio. Hospital Donostia, San Sebastián.
Introducción. Los linfocitos granulares grandes (LGL) son células efectoras de la respuesta inmune que intervienen tanto en la inmunidad innata (NK CD3-) como en la respuesta adaptativa (NK CD3+),
su expansión es muy frecuente en la clínica, pudiendo presentarse desde una forma indolente hasta proliferaciones agresivas sobre todo asociadas a las células NK.
Diseño. Estudio retrospectivo de estas expansiones y su asociación a determinados procesos clínicos.
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INMUNOLOGÍA
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Material y métodos. Estudio retrospectivo de 1.431 linfocitosis recibidas en nuestro laboratorio durante el periodo 2008-2009, de los cuales 179
fueron expansiones NK (12,5%). Sólo en 92 se pudo completar el estudio.
La metodología del estudio incluyó inmunofenotipo linfoide LGL
y realización de reordenamiento de TCR por biología molecular.
Resultados. Fenotipo NK según patologías
Tabla 1. Fenotipo NK según patologías
Patologías
Procesos endocrinos
Proceso reumatológicos
Procesos infecciosos
Procesos neoplásicos
TPH
Procesos hematológicos:
Otras causas
n = 92
Fenotipo
NK %
11
1
12
9
8
16
35
27
1
25
55
12
25
37
Fenotipo CD3+
TCR + TCR 54
42
33
87
44
43
18
1
33
11
31
20
Linfocitosis
media absoluta
LGL
Nro casos
LGL>400
1734
789
2527
2389
2365
911
1344
9/11
1/1
12/12
4/9
8/8
9/11
29/35
Discusión- conclusiones. 1) Se observa una linfocitosis LGL absoluta (>400cel/ul) en todos los grupos estudiados, siendo más significativa en el grupo de los procesos infecciosos y en el grupo de post
TPH. 2) La expansión más frecuente es la NK/CD3+ (70%) lo que nos
lleva a continuar el estudio de reordenamiento de TCR por Biología
molecular. 3) En todos los pacientes post TPH la expansión es de células NK+/CD3+ de carácter monoclonal. Se recomienda realizar seguimiento de estos pacientes hasta la reconstitución del repertorio de células T y estudiar la influencia del quimerismo en el desarrollo de este
repertorio. 4) En los procesos neoplásicos se observa un mayor porcentaje de células con fenotipo NK+/CD3-.
SESIÓN 4: CÉLULAS T
Moderadores: Ana Clara Carrera (Madrid)
Enrique Aguado (Murcia)
P-038
LAS PROTEÍNAS MORFOGENÉTICAS ÓSEAS MODULAN LA
PROLIFERACIÓN DE LOS LINFOCITOS T CD4+ PERIFÉRICOS.
A. Varas, V.G. Martínez, C. Hernández-López, L. Hidalgo, A. Entrena,
J. Valencia, M.N. Vázquez, A. Zapata, R. Sacedón, A. Vicente. Facultad
Medicina, Universidad Complutense, Madrid.
Objetivos. Las Proteínas Morfogenéticas Óseas (BMPs) desempeñan un papel crucial durante la embriogénesis y organogénesis de vertebrados, y también se ha descrito que llevan a cabo diversas funciones en tejidos adultos con capacidad auto-renovadora. Varios autores han demostrado que distintas BMPs están implicadas en el control
de la proliferación de células precursoras hematopoyéticas y también de linfocitos B. En el timo, se ha descrito previamente que las
BMPs regulan la proliferación, supervivencia y diferenciación de los
timocitos. Asimismo, se ha demostrado la expresión de receptores para
BMPs en líneas celulares linfoblastoides así como en la línea Jurkat
TAg. En este estudio, se pretende estudiar la expresión y posible función de las BMPs en los linfocitos T CD4+ periféricos.
Material y métodos. Linfocitos T CD4+ naive fueron aislados
mediante selección negativa inmunomagnética a partir de ganglios linfoides de ratones BALB/c mantenidos en condiciones SPF. Las células
T se cultivaron en medio libre de suero y se estimularon con anticuer-
pos anti-CD3 con o sin anticuerpos anti-CD28. En algunos cultivos
se añadieron diferentes dosis de rhBMP2 o rhBMP4. La expresión y
funcionalidad de la vía de señalización BMP se estudió por citometría
de flujo, y la influencia de las BMPs en la tasa proliferativa de los linfocitos T se analizó tras incorporación de BrdU y detección por ELISA.
Resultados. En este estudio nosotros evidenciamos que las células
T CD4+ periféricas expresan los tres tipos de receptores tipo I de BMP
(BMPRIA, BMPRIB, ActRIA), y que la proporción de células T que expresan los receptores para BMPs incrementa notablemente tras estimulación con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD3 más anti-CD28. La vía de señalización BMP es funcional en estas células T CD4+ periféricas puesto que
al cultivarlas en presencia de BMP4 se incrementan los niveles de Smad1
fosforilada. Además, nuestros resultados demuestran que la adición de
BMP2 y BMP4 durante la estimulación con anti-CD3/CD28 modula de
manera diferencial la proliferación de las células T CD4+.
Conclusiones. En conjunto, los resultados indican que la vía de
señalización BMP juega un papel en las respuestas de células T.
P-039
MULTIPLE, NON-CONSERVED, INTERNAL VIRAL LIGANDS
NATURALLY PRESENTED BY HLA-B27 IN HUMAN RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS-INFECTED CELLS. D. López1, S. Infantes1, E. Lorente1, E. Barnea2, I. Beer2, J.J. Cargnolini3, R. García1, F. Lasala1, M. Jiménez1, A. Admon2. 1Centro Nacional de Microbiología, Instituto
de Salud Carlos III,, Majadahonda. 2Department of Biology, Technion-Israel
Institute of Technology. 3Centro de Biología Molecular Severo Ochoa,
CSIC/Universidad Autónoma de Madrid, Madrid.
Cytotoxic T lymphocyte (CTL)-mediated death of virus-infected
cells requires prior recognition of short viral peptide antigens that
are presented by HLA class I molecules on the surface of infected cells.
The CTL response is critical for the clearance of human respiratory
syncytial virus (HRSV) infection. Using mass spectrometry analysis of
complex HLA-bound peptide pools isolated from large amounts of
HRSV-infected cells, we identified nine naturally processed HLAB27 ligands. The isolated peptides derive from six internal, not envelope,
proteins of the infective virus. The sequences of most of these ligands
are not conserved between different HRSV strains, suggesting a
mechanism to explain recurrent infection with virus of different HRSV
antigenic subgroups. In addition, these nine ligands represent a significant
fraction of the proteome of this virus, which is monitored by the
same HLA class I allele. These data have implications for vaccine
development as well as for analysis of the CTL response.
P-040
UNUSUAL VIRAL LIGAND WITH ALTERNATIVE INTERACTIONS IS PRESENTED BY HLA-CW4 IN HUMAN RESPIRATORY
SYNCYTIAL VIRUS-INFECTED CELLS. D. López1, S. Infantes1, E.
Lorente1, J.J. Cargnolini2, M. Ramos1, R. García1, M. Jiménez1, S. Iborra1, M. Del Val1. 1Centro Nacional de Microbiología. Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda. 2Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, CSIC/Universidad Autónoma de Madrid, Madrid.
Short viral antigens bound to human major histocompatibility
complex (HLA) class I molecules are presented on infected cells. Vaccine
development frequently relies on synthetic peptides to identify optimal
HLA class I ligands. However, when natural peptides are analyzed,
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PÓSTERS
more complex mixtures are found. By immunoproteomics analysis, we
identify here a physiologically processed HLA ligand derived from
human respiratory syncytial virus matrix protein that is very different
from what was expected from studies with synthetic peptides. This
natural HLA-Cw4 class I ligand uses alternative interactions to the
anchor motifs previously described for its presenting HLA-Cw4 class
I molecule. Finally, this octameric peptide shares its C-terminal core
with the H-2Db nonamer ligand previously identified in the mouse
model. These data have implications for the identification of antiviral
CTL responses and for vaccine development.
P-041
CASPASES IN VIRUS-INFECTED CELLS CONTRIBUTE TO
RECOGNITION BY CD8+ T LYMPHOCYTES. D. López1, M. García-Calvo2, G. Smith3, M. Del Val1. 1Centro Nacional de Microbiología,
Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda. 2Department of Metabolic Disorders & Diabetes, Merck Research Laboratories. 3Department of Virology,
Faculty of Medicine, Imperial College London.
CD8+ cytotoxic T lymphocytes recognize infected cells in which
MHC class I molecules present pathogen-derived peptides that have
been processed mainly by proteasomes. Many infections induce a set
of proteases, the caspases involved in apoptosis or inflammation. Here
we report that processing and presentation of a short vaccinia virusencoded antigen can take place also by a non-proteasomal pathway,
which was blocked in infected cells with chemical inhibitors of caspases.
By cleaving at non-canonical sites, at least two caspases generated
antigenic peptides recognised by T lymphocytes. The sites and the
peptidic products were partially overlapping but different to those
used and produced by proteasomes in vitro. Antigenic natural peptides
produced in infected cells by either pathway were quantitatively and
qualitatively similar. Finally, co-expression of the natural vaccinia virus
protein B13, which is an inhibitor of caspases and apoptosis, impaired
antigen presentation by the caspase pathway in infected cells. These
data support the hypothesis that the numerous cellular proteolytic
systems, including those induced during infection, such as caspases
involved in apoptosis or in inflammation, contribute to the repertoire
of presented peptides, thereby facilitating immunosurveillance.
P-042
DISTRIBUCIÓN DIFERENCIAL DE CÉLULAS INKT Y NTREGS
EN EL TEJIDO DIANA DE LA RESPUESTA AUTOINMUNE. L. Usero Redrejo1, E. Codina1, M. Boshuizen1, C. Xufré1, R. Planas2, M. VivesPi2, D. Jaraquemada1, M. Martí1, C. Roura-Mir1. 1Institut de Biotecnologia i Biomedicina, Bellaterra. 2Fundació Institut d’Investigació en Ciències
de la Salut Germans Trias i Pujol, Badalona.
En enfermedades autoinmunes humanas se ha descrito una frecuencia y función reducida de células inmunoreguladoras, T Natural
Killer invariantes (iNKT) y células T reguladoras (nTregs), ambas importantes en el control de la autoreactividad. Estas células además de regular otros tipos celulares se regulan mutuamente. Partiendo de la hipótesis que estas dos poblaciones de células cooperan en el control del
proceso autoinmune, nos propusimos analizar su coexistencia en muestras de tejido humano con autoinmunidad.
Se analizaron muestras de páncreas total (TD), islotes purificados
(ILL) y bazo (B) de un paciente diabético en el debut de la enfermedad así
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como muestras de tiroides de pacientes con Graves-Basedow (GB) y Tiroiditis de Hashimoto (HT) y muestras control. El análisis se realizó por qPCR,
amplificando la cadena Vα24-Jα18 del TCR o Foxp3 para cuantificar células iNKT y nTregs respectivamente. Asimismo, se analizó la presencia
de ambos tipos celulares in situ por inmunofluorescencia en tejido pancreático de ratón NOD en diferentes fases de la patogénesis de T1D.
El análisis no detectó la expresión del TCR Vα24Jα18 en el páncreas
control pero si en las muestras de T1D donde, además, la expresión fue
superior en TD que en ILL. Contrariamente, la expresión de Foxp3 fue
más elevada en ILL que en TD del páncreas diabético. Así, las células iNKT
se concentraban preferentemente fuera de los islotes pancreáticos, mientras que las células nTregs eran reclutadas preferentemente en su interior.
Sólo se pudo confirmar esta distribución diferencial por inmunofluorescencia en el páncreas de ratones NOD diabéticos (20 semanas), pero no
en ratones prediabéticos (9 semanas) o en el debut de la enfermedad (14
semanas) donde no existía un patrón de distribución evidente.
En las muestras de tiroides autoinmune la expresión del TCR
Vα24/Jα18 fue más alta que en los controles, detectando una importante variabilidad en muestras de GB. Contrariamente, la expresión de
Foxp3 fue más elevada en las muestras control que en los tiroides
autoinmunes. El análisis de los resultados mostró una correlación inversa entre la frecuencia de células T Foxp3+ y células Vα24/Jα18+ en los
tiroides con autoinmunidad.
Estos resultados indicarían que las células nTreg e iNKT migran
secuencialmente al tejido diana de la respuesta autoinmune donde las
células nTregs regularían inicialmente la insulitis con la colaboración
de las células iNKTs en etapas posteriores.
P-044
APOPTOSIS ALTERATION OF NAIVE/EFFECTOR/MEMORY T
CELL SUBSETS IN PATIENTS WITH RHEUMATOID ARTHRITIS.
D. Díaz Martín1, L. Chara Velarde1, J. Chevarria Montesinos1, A. Sánchez Atrio2, G. Parada Hermoza1, Z. Moreno Villegas1, L. Ortega Moreno1, J. Monserrat Sanz1, A. Prieto Martín1, M. Álvarez De Mon-Soto2.
1Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares. 2Hospital Universitario Príncipe de Asturias.
Background. Dysregulation of T lymphocyte apoptosis has been
involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA).
Purpose. To investigate the spontaneous and induced apoptosis
in specifically defined naïve/effector/memory subsets in circulating
T lymphocytes from untreated and methotrexate (MTX) or anti-TNFα
antibodies treated RA patients.
Methods. Peripheral blood mononuclear cells from untreated
(20 patients) or treated with MTX (27 patients) or anti-TNFα antibodies
(16 patients) RA patients and 14 healthy controls were purified and
characterized using monoclonal antibodies and annexin V by eight
color flow cytometry in a FACSAria sorter. The percentage of apoptotic
lymphocytes was determined after 24 hour culture.
Results. A statistically significant decrease (p<0.05) in spontaneous
ex vivo apoptosis was found in naïve CD3+CD4+ cells (CD45RA+CD27+)
from RA patients with respect to healthy controls. In CD3+CD8+ T
lymphocytes, we found a significant increase in spontaneous apoptosis
in untreated patients that normalized after treatment in terminated and
non terminated effector subsets (CD45RA+/-CD27-). In mitogen-induced
apoptosis, we found a significant decrease of apoptosis from RA patients
with respect to healthy controls in CD4+ T cell subsets but no in CD8+ T
cell subsets. Conclusions: Patients with RAshow alterations in spontaneous
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INMUNOLOGÍA
and mitogen-induced apoptosis within circulating naïve/effector/memory
CD4+ and CD8+ T-cell subsets. MTX or anti-TNFα treatment normalizes
the apoptosis misbalance in several T cell subsets.
P-045
N-RAS ES UN REGULADOR NEGATIVO DE LA EXPRESIÓN DE
IL-17 EN LINFOCITOS. T. E. Fernández-Malavé1, L. Stark Aroeira2,
S. Iborra2. 1Inmunología, Fac. Medicina, UCM, Madrid. 2Unidad de Investigación, Hosp. la paz, Madrid.
La citocina IL-17(A) identifica al linaje funcional Th17 y contribuye de forma esencial a la actividad fisiopatológica de estas células.
La expresión de IL-17 es inducida en linfocitos T por señales iniciadas
por el receptor de antígeno (TCR), pero la naturaleza de estas señales
no ha sido establecida claramente. Las proteínas de la familia Ras (H, K- y N-ras) son activadas rápidamente a través del TCR y actúan como
interruptores moleculares que controlan respuestas celulares a distintos estímulos externos.
El presente estudio tuvo por objetivo la caracterización del papel
de N-ras en la regulación de la expresión de IL-17 en linfocitos T, a través del uso de ratones deficientes de N-ras (N-ras-/-).
Los linfocitos T de los ratones N-ras-/- mostraron una producción aumentada de IL-17 en respuesta a la estimulación vía TCR in
vitro con anticuerpo anti-CD3 ó concanavalina A, en comparación con
los animales N-ras+/+ y H-ras-/-. Esta sobreproducción de IL-17 por las
células T N-ras-/- activadas fue observada también en respuesta a antígeno en un modelo TCR transgénico, y en animales infectados con el
parásito L. major. Sorprendentemente, a pesar de esta respuesta de IL17 exacerbada, los ratones N-ras-/- fueron menos susceptibles a la inducción de EAE, un modelo de neuroinflamación mediada de forma crítica por las células Th17.
En conclusión, nuestros resultados identifican a N-ras como un regulador negativo de la expresión de IL-17 en linfocitos T activados, y sugieren que otros factores, adicionalmente a la respuesta Th17, juegan un
papel importante en el desarrollo de inflamación autoinmunitaria.
P-046
PAPEL DE LOS DOMINIOS DE CD3GAMMA EN LA EXPRESION
Y FUNCION DEL TCR/CD3. B. Garcillán1, A.C. Guardo1, V. Pérez-Flores1, J.M. Martín-Fernández1, B. Nielsen2, C. Geisler2, O. Sanal3, L. Allende4, J.R. Regueiro1. 1Universidad Complutense, madrid. 2Universty of Copenhagen. 3Hacettepe University Children´s Hospital. 4Hospital 12 de Octubre.
La ausencia de CD3γ (γ–) se asocia a una linfopenia leve, con linfocitos T maduros cuyo TCR se expresa y señaliza mal y no se internaliza por ésteres de forbol (PMA). Estos defectos se normalizan al reexpresar la cadena CD3γ, pero no está claro en qué dominios reside esa
capacidad en estas células.
Objetivos. Definir el papel de los distintos dominios de CD3γ en
comparación con los de CD3δ en la expresión y función del TCRαβ
humano deficiente de CD3γ.
Material y métodos. Se analizó la expresión y función del TCR/CD3
tras introducir vectores retrovirales bicistrónicos que portaban las cadenas completas (dominios EC, TM e IC) CD3γ (γγγ) y CD3δ (δδδ) y construcciones quiméricas con diferentes dominios de ambas cadenas δγγ,
γγδ, γδδ y γγ- (CD3γ sin dominio intracitoplásmico) en la línea celular JGN
(Jurkat Gamma Negative) y en linfocitos T de individuos γ–.
PÓSTERS
Resultados. El dominio extracelular de CD3γ, pero no el de CD3δ,
es necesario y suficiente para la reexpresión del TCR/CD3 en JGN. En
contraste, para la normalización de la expresión del TCR/CD3 en los
linfocitos T de individuos γ- no basta con CD3γ EC, si no que se requiere una cadena completa con al menos un dominio EC o IC de CD3γ. Ciertas funciones (modulación por PMA) requieren el dominio IC de CD3γ,
otras (inducción de citocinas) requieren un dominio IC de CD3γ o CD3δ,
otras (inducción de CD69, reclutamiento de Nck y monovalencia) son
más débiles en quimeras con CD3δ IC y otras (fosforilación de CD3Â
y flujo de calcio) son independientes del dominio IC de la quimera.
Conclusiones. La cadena CD3γ tiene funciones no redundantes con
CD3δ necesarias para la modulación del TCR/CD3 por PMA (en su
dominio IC) y para su expresión normal en membrana (en sus dominios
EC e IC), pero no para la inducción de diversas funciones analizadas
P-047
PAPEL DIFERENCIAL DE LAS CADENAS CD3° Y CD3D EN LA
EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL COMPLEJO TCR/CD3 EN CÉLULAS T MADURAS. J. Reiné Gutiérrez, E. Martínez Busto, B. Garcillán, E. Fernández-Malavé, M.J. Recio Hoyas, J.R. Regueiro. Facultad
de Medicina Universidad Complutense, Madrid.
Introducción. El receptor del linfocito T es un complejo multimérico integrado por diferentes cadenas, en las cuales las cadenas variables TCR (TCRα y TCRβ) son las encargadas del reconocimiento antigénico, mientras que las cadenas invariantes CD3 (CD3ε, CD3γ, CD3δ
y CD3ζ) son responsables del ensamblaje y expresión del complejo
TCR/CD3, así como de las señalización intracelular. El papel específico de cada una de las cadenas CD3 dentro del complejo TCR, sigue
siendo materia de discusión.
Objetivos. a) Determinar el papel de la cadena CD3γ en la señalización del TCR en células deficientes de CD3γ transformadas con Herpesvirus saimiri b) Silenciamiento de las cadenas CD3γ y CD3δ en la
expresión y función de linfocitos T maduros.
Material y métodos. En los estudios de señalización monitorizamos: a) La fosforilación de las determinadas proteínas (ERK, JNK y
p38) de la ruta de las MAPK quinasas en respuesta a anticuerpos antiCD3 b) La expansión de iNKT (Vα24+Vβ11+) en respuesta a α-GalCer
(α-Galactosil-ceramida). En los estudios de silenciamiento los linfocitos T Jurkat fueron electroporados con un pool de oligos siRNA específicos. La expresión del complejo TCR/CD3 se monitorizó por citometría de flujo (SK7; BMA031) al cabo de 24 horas post-tratamiento.
Para evaluar el grado de interferencia de las proteínas CD3γ y CD3δ
se realizaron tinciones intracelulares con el antisuero α-CD3γ (TG5) y
western-blot con el anticuerpo α-CD3δ (APA1/2), respectivamente.
Resultados y conclusiones. Nuestros resultados indican que la
ausencia de CD3γ no afecta a la fosforilación de ERK y p38 tras la estimulación (JNK no es informativo debido a su elevada actividad basal).
Por otra parte, la expansión de las células iNKT en células deficientes de CD3γ fue similar a la observada en células control. Por lo tanto, podemos concluir que en los linfocitos T maduros, la cadena CD3γ
no participa a través de las rutas analizadas. Los resultados de silenciamiento mostraron un papel diferencial de las cadenas CD3γ y CD3δ
en la topología final del complejo TCR/CD3. Sin embargo, no se observaron diferencias funcionales, salvo la modulación mediada por PMA,
selectivamente afectada en las células silenciadas con CD3γ. Estos resultados sugieren la existencia de funciones redundantes y específicas
para ambas cadenas.
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P-048
IMPLICACIONES FUNCIONALES DE LA ROTURA PROTEOLÍTICA DEL ADAPTADOR LAT. A. García-Blesa1, M. Martínez-Florensa2, C. López-Osuna3, A. Alonso4, F. García-Cózar1, E. Aguado4.
1Universidad de Cádiz, Puerto Real. 2Hosp. Clinic, Barcelona. 3Hosp. Universitario de Puerto Real. 4Hospital Carlos Haya-Universidad de Málaga.
El reconocimiento de antígenos por parte de los linfocitos T es uno
de los requisitos esenciales para una adecuada respuesta inmune a determinadas infecciones. Tras este reconocimiento a través del TCR, se desencadenan en las células T una serie de señales intracelulares en las que el
adaptador de membrana LAT (“Linker for the Activation of T cells”) tiene un papel central como plataforma sobre la que se unen y activan otras
proteínas que intervienen en la cascada de señalización intracelular.
La correcta transducción de esas señales intracelulares puede conducir a la activación y proliferación de las células T, aunque en determinadas condiciones pueden provocar su entrada en apoptosis. La apoptosis es por tanto un fenómeno de enorme relevancia no sólo en el desarrollo y la homeostasis de organismos multicelulares, sino también para
el correcto desarrollo de las respuestas inmunes. Cuando las células T
entran en el proceso de muerte celular, se produce la activación de una
serie de proteasas llamadas caspasas que, entre otras, tienen como dianas a varias moléculas implicadas en la transducción de señales de células T. En este trabajo, nuestro grupo demuestra que el adaptador de membrana LAT sufre una rotura proteolítica tras la inducción de apoptosis de
células T. Además, hemos demostrado que LAT se rompe por al menos
dos sitios y hemos encontrado cuáles son esos sitios. Por último, se han
analizado las implicaciones funcionales de la rotura proteolítica de LAT
para su función de transmisión de señales de activación de células T.
P-049
FUNCIONALIDAD DE LINFOCITOS T CD8 E INMUNOSENESCENCIA: RELACIÓN CON LA INFECCIÓN POR CMV. A. Pera, I. Gayoso,
M.D.C. Campos, N. Rojas, S. Cantisan, B. Sánchez, S. Morgado, J. Casado, R. Tarazona, R. Solana. Hospital Reina Sofia de Cordoba, Cordoba.
Los linfocitos T pueden producir múltiples citoquinas en cada
momento, definiéndose un perfil de linfocitos principalmente monofuncionales o polifuncionales. A este respecto, se ha demostrado que existe una correlación entre la multifuncionalidad y una adecuada respuesta inmunitaria. Las células T CD8 multifuncionales se encuentran presentes en individuos con infecciones víricas bien controladas de virus
como el Epstein-Barr, CMV, Influenza y VIH en no progresores. Los lifocitos T CD4 multifuncionales se correlacionan con protección frente a
Leishmania en un modelo murino. En estos modelos la multifuncionalidad predice la progresión. Por tanto, la “calidad” de los linfocitos T
que responden (entendida como la capacidad de una determinada célula de desarrollar múltiples funciones) es más importante que la “cantidad” de linfocitos T específicos. El objetivo de este trabajo se ha centrado en el estudio de la multifuncionalidad de linfocitos T CD8 de individuos jóvenes y ancianos sanos, y su posible relación con la infección
por CMV. Para ello se ha estudiado el efecto de la edad sobre la capacidad multifuncional de las células T CD8 mediante la detección por citometría de flujo de CD107/INFγ/TNF, en individuos sanos en respuesta
al péptido de CMV pp65 y a SEB (superantígeno). Los resultados indican que existen distintas poblaciones de linfocitos T CD8 con una, dos
o tres de las funciones estudiadas tanto en individuos jóvenes como en
individuos ancianos. Se encontraron diferencias en la respuesta frente a
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pp65 o a SEB, observándose que la edad tiene un efecto sobre la capacidad multifuncional de las células estudiadas, en respuesta a CMV.
P-050
EL DOMINIO IG DE CD3D ES NECESARIO PARA EL DESARROLLO DE LOS LINFOCITOS TAB, PERO NO GD EN HUMANOS.
E. Martínez Busto1, J. Reiné1, Á. Mencía2, J. Couso1, D. Gurbindo3, J.
Gil3, M.Á. Moreno-Pelayo2, M.J. Recio1, J.R. Regueiro1. 1Facultad de
Medicina. UCM, Madrid. 2Unidad de Genética Molecular. Hospital Ramón
y Cajal. 3Hospital General Universitario Gregorio Marañón.
La ausencia completa de CD3δ en humanos se asocia a SCID temprana (5 meses) y con inmunofenotipo Tα‚- Tγδ-B+NK+. Estamos analizando un paciente con SCID tardía (14 meses) e inmunofenotipo TαβTγδ+B+NK+. El análisis molecular realizado en el paciente, muestra una
nueva mutación localizada en el intrón 2 (IVS2+5G>A) del gen CD3D.
La mutación afecta a una posición conservada del sitio donador para el
procesamiento del RNA mensajero y causa la pérdida del exón 2. Este
cambio se encuentra en homocigosis en el paciente y en heterocigosis
en los padres. Ninguno de los 70 controles sanos analizados, utilizando
el análisis de restricción con la enzima BsaI, presenta el cambio descrito, lo que lo excluye como un posible polimorfismo.
La proteína CD3δ resultante pierde el dominio Ig, pero conserva
el motivo CXXCXEXXX, que linda con la región transmembranal y
es necesario para el correcto ensamblaje del complejo TCR/CD3. Los
estudios de transfección realizados en células 293T muestran que esta
proteína CD3δ sin exón 2, pero no sin exón 3, es estable in vitro. Este
resultado explicaría la expresión, aunque disminuida, del complejo
TCR/CD3 en los linfocitos T del paciente y la tinción normal con el
anticuerpo APA1/2 específico de CD3δ intracelular. El hecho de que
exista una linfopenia Tα‚ selectiva refleja el papel diferencial del dominio Ig de CD3δ en la selección tímica de linfocitos T αβ vs γδ. Los escasos linfocitos Tα‚ del paciente son oligoclonales y se asocian a inmunopatología Th2 (hiperIgE, eosinofilia). Se especula sobre el posible
papel protector de los linfocitos Tγδ en el paciente.
Conclusiones. Esta es la primera inmunodeficiencia de CD3δ descrita asociada con una linfopenia Tα‚ selectiva (Tαβ-Tγδ+B+NK+) y
ayuda a establecer en el papel del dominio Ig de CD3δ en el desarrollo de los linfocitos Tαβ, pero no en γδ en humanos.
P-051
RELEVANCIA DE LAS INTERACCIONES LIGANDO/RECEPTOR
MEDIADAS POR CD5 EN LA HOMEOSTASIS DE POBLACIONES
LINFOCITARIAS CON POSIBLE FUNCIÓN REGULADORA. R.
Fenutria1, V. Gil2, J. Sintes3, J. Merino4, C. Raman5, R. Merino6, P. Engel7,
M. Ramos-Casals2, G. Soldevilla8, F. Lozano9. 1Fundació Clínic per a la
Recerca Biomèdica, Institut d'Investigacions Biomédiques August Pi i Sunyer, Barcelona. 2Hosp. Clínico de Barcelona. 3Dpto. de Biología Celular, Inmunología y Neurociencias, Univ. de Barcelona. 4Dpto. de Biología Molecular,
Univ. de Cantabria, Santander. 5Dpt. of Medicine, University of Alabama.
6Dpto. de Biología Molecular, Univ. de Cantabria, Santander. 7Dpto. de Biología Celular, Inmunología y Neurociencias, Univ. de Barcelona. 8Instituto
de Investigaciones Biomédicas, Univ. Nacional Autónoma de México. 9Dpto.
de Biología Celular, Inmunología y Neurociencias, Univ. de Barcelona.
CD5 es una glicoproteína tipo I linfocitaria perteneciente a la Superfamilia de Receptores Scavenger Ricos en Cisteina (SRCR), que inclu-
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INMUNOLOGÍA
ye tanto proteínas de membrana (e.g. CD6) como secretadas (e.g. Spα),
que están implicadas en el desarrollo del Sistema Inmune y en la regulación de sus respuestas. CD5 está constitutivamente expresado en
timocitos, en todos los linfocitos T maduros y en la subpoblación B1a
de células B. Del estudio de modelos knock-out se ha demostrado que
CD5 tiene un papel modulador negativo de las señales liberadas por
el receptor de antígeno de las células T y células B.
En el presente estudio se describen datos fenotípicos obtenidos de
un modelo transgénico murino generado en nuestro laboratorio que
expresa una forma recombinante soluble del receptor CD5 humano
(rshCD5tg) bajo el control del enhancer de las cadenas pesadas µ (Eµ).
Dichos animales presentan niveles séricos elevados de dichas formas
solubles circulantes, susceptibles de unirse al/los ligando/s todavía
desconocido/s de CD5 y de bloquear las señales intracelulares mediadas por este receptor. De acuerdo con esta hipótesis el análisis citofluorimétrico de distintas poblaciones linfocitarias, demostró una disminución significativa de células T reguladoras (CD4+CD25+FoxP3+) a
nivel de timo y ganglios linfáticos, así como de células B1a (CD5+)
en peritoneo y de Natural Killer (NK1.1+) en bazo. Estos datos sugieren que las interacciones moleculares mediadas por CD5 son relevantes para la homeostasis de determinadas poblaciones linfocitarias con
funciones reguladoras.
Consecuentemente, los animales rshCD5tg presentaron formas
más severas de modelos experimentales murinos de enfermedad autoinmune (Encefalitis Autoinmune Experimental y Artritis inducida por
Colágeno II).
SESIÓN 5: INMUNIDAD E INFECCIÓN
Moderadores: Miguel López Botet (Barcelona)
Maria Montoya (Barcelona)
P-052
ACTIVIDAD BACTERICIDA DEL SUERO HUMANO FRENTE A
RHODOCOCCUS EQUI. PAPEL DEL COMPLEMENTO. S. Remuzgo Martínez1, L. Pilares Ortega2, I. Beares Gómez2, D. Padilla Castillo3, J. Navas Méndez4, J. Ramos Vivas1. 1Hospital Santa Cruz de Liencres, Instituto de Formación e Investigación Marqués de Valdecilla IFIMAV,
Liencres. 2Hospital Santa Cruz de Liencres, Santander. 3Instituto Universitario de Sanidad Animal (IUSA), Arucas. 4Universidad de Cantabria, Santander.
Objetivos. El objetivo del presente trabajo es evaluar la actividad
bactericida del suero humano frente a distintas cepas del patógeno
oportunista humano Rhodococcus equi.
Material y métodos. Bacterias: 10 aislados clínicos de R. equi procedentes de pacientes con neumonía. Las cepas han sido clasificadas
por métodos genotípicos y fenotípicos para determinar sus características de virulencia. Suero: Hemos obtenido sangre a partir de pacientes sanos y posteriormente hemos conseguido un pool de suero con el
que hemos realizado ensayos de cinéticas de resistencia a la actividad
antibacteriana del complemento.
Resultados y conclusiones. R. equi es un patógeno oportunista en
personas inmunodeprimidas del que se tiene poca información respecto a la biología de su infección. En el presente trabajo hemos demostrado que la capacidad bactericida del suero humano depende del feno-
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tipo de R. equi, evidenciando la presencia de cepas resistentes a dicha
actividad bactericida. Hemos demostrado además, que entre los fenotipos y genotipos de esta especie, hay cepas que presentan una alta
resistencia al suero humano y a las proteínas del complemento, la primera línea de defensa contra microorganismos patógenos.
P-053
CEPAS SUPER-INVASIVAS DE RHODOCOCCUS EQUI INDUCEN
LA PRODUCCIÓN DE CITOQUINAS PRO-INFLAMATORIAS EN
CÉLULAS PULMONARES HUMANAS. J. Ramos Vivas1, S. Remuzgo Martínez1, L. Álvarez Rodríguez2, L. Pilares Ortega3, C. Santa Cruz
Llata2, I. Beares Gómez2, F. Acosta Arbelo4, M. López Hoyos5, J. Navas
Méndez3. 1Hospital Santa Cruz de Liencres, Instituto de Formación e Investigación Marqués de Valdecilla, Liencres. 2Hospital Santa Cruz de Liencres,
Liencres. 3Universidad de Cantabria. 4Instituto Universitario de Sanidad Animal (IUSA), Arucas. 5Hospital Santa Cruz de Liencres, Liencres.
Objetivos. Examinar la inducción de citoquinas proinflamatorias
por cepas de Rhodococcus equi aisladas de humanos, en células pulmonares.
Material y métodos. Hemos testado una batería de cepas de R.
equi para determinar en qué medida esta especie es capaz de invadir
células epiteliales humanas e inducir una respuesta pro-inflamatoria.
Hemos producido un anticuerpo contra esta especie, para realizar estudios de inmunofluorescencia y ensayos de tinción diferencial. También
hemos aplicado ensayos de protección con antibióticos para estudiar
el tráfico intracelular de R. equi en células pulmonares A-549. Posteriormente, hemos utilizado citometría de flujo para determinar la producción de citoquinas mediante ensayos CBA.
Resultados y conclusiones. Hemos demostrado por primera vez
que el patógeno oportunista R. equi es capaz de invadir células pulmonares humanas, lo que puede ser importante para establecer un estado de portador, y resistir al sistema inmunológico innato. Hemos
demostrado también que en esta especie, el plásmido al que se atribuye su virulencia no es necesario para la invasión, y que las cepas superinvasivas sobreviven en el interior celular y son capaces de inducir IL6 e IL-8 en células pulmonares humanas.
P-054
INTERACCIÓN DEL PATÓGENO HUMANO OPORTUNISTA
HAFNIA ALVEI CON LA LÍNEA CELULAR FAGOCÍTICA J774.
S. Remuzgo Martínez1, I. Beares Gómez2, L. Pilares Ortega3, D. Padilla Castillo4, F. Acosta Arbelo4, J. Ramos Vivas1. 1Hospital Santa Cruz
de Liencres, Instituto de Formación e Investigación Marqués de Valdecilla,
Liencres2. Hospital Santa Cruz de Liencres3. Universidad de Cantabria4. Instituto Universitario de Sanidad Animal (IUSA),
Objetivos. Evaluar la capacidad de adherencia del patógeno oportunista Hafnia alvei sobre la línea celular de macrófagos J774.
Material y métodos. Hemos caracterizado una colección de aislados clínicos de la especie Hafnia alvei mediante PCR, para identificar
factores de virulencia implicados en la adherencia de esta especie a células fagocíticas. Hemos desarrollado anticuerpos contra diferentes cepas
de H. alvei para estudiar mediante inmunofluorescencia las interacciones de este patógeno con células del sistema inmunitario. Mediante
cinéticas de adherencia e internalización hemos estudiado el comportamiento de esta enterobacteria en contacto con macrófagos J774.
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Resultados y conclusiones. Hemos comprobado como la diversidad fenotípica de H. alvei puede ser determinante para el control de
la infección por parte de células del sistema inmunitario innato. Hemos
evidenciado por primera vez que esta especie muestra “variación de
fase” en presencia de células fagocíticas, ya que una misma cepa puede presentar células en fase ON (fenotipo rugoso, expresando fimbrias)
o en fase OFF (fenotipo liso, sin producción de fimbrias). Esta variación de fase podría ser determinante en la evasión o en la adherencia
a células del sistema inmunitario. Mediante microscopía electrónica
de transmisión y microscopía láser confocal hemos estudiado en detalle tanto la superficie de las diferentes cepas, como su interacción con
las células fagocíticas.
P-055
LA INTENSIDAD DE LA RESPUESTA A CMV CONDICIONA EL
ESTADO FUNCIONAL E INMUNOLÓGICO EN LOS INDIVIDUOS DE EDAD AVANZADA. M.A. Moro García1, R. Alonso Arias1,
I. Cuevas Pérez1, F.M. Suárez García2, J.J. Solano Jaurrieta3, C. López
Larrea1. 1Hospital Central de Asturias, Oviedo. 2Consejería de Salud Y
Servicios Sanitarios Del Principado de Asturias. 3Hospital Monte Naranco,
Oviedo.
Objetivos. El deterioro del sistema inmune se asocia con una menor
supervivencia en ancianos, habiéndose definido incluso un perfil de
riesgo inmunológico que incluye la inversión del cociente CD4/CD8
y la seropositividad a CMV. La capacidad funcional también se relaciona con su longevidad y existen determinados índices, como el de
Barthel (IB), que permiten su clasificación. El objetivo de este trabajo
fue estudiar si existe asociación entre el deterioro funcional e inmunológico en individuos de edad avanzada.
Material y métodos. Se estudiaron 100 ancianos procedentes de
la residencia Santa Teresa de Oviedo, que fueron divididos en cuatro
grupos, homogéneos en edad, según su IB. De mayor a menor capacidad funcional: grupo 0 (n=25), grupo 1 (n=25), grupo 2 (n=27) y grupo 3 (n=23). Se realizó caracterización de las subpoblaciones celulares
por citometría de flujo, cuantificación de TRECs mediante "real timePCR" y respuesta proliferativa y de activación (CD69, IFN-γ por ELISPOT) de células T frente a anti-CD3 y CMV. También se realizó cuantificación por ELISA del título de anticuerpos específicos frente al virus
de la gripe y CMV.
Resultados. Los individuos con peor estado funcional presentaron niveles significativamente aumentados de células NK y disminuidos de linfocitos B, no encontrándose diferencias en otras poblaciones
leucocitarias como polimorfonucleares, monocitos y linfocitos T. Presentaban también una proporción significativamente menor de células CD4+ y mayor de CD8+, con un cociente CD4/CD8 disminuido.
Los niveles de TRECs en linfocitos T CD4+ fueron significativamente
menores en los individuos de los grupos 2/3, correlacionándose con
una menor frecuencia de las subpoblaciones de células naïve
(CD45RA+CCR7+) y mayor de células efectoras (CD45RA-CCR7-). La
respuesta celular frente a anti-CD3 disminuyó gradualmente a medida que empeoraba el estado funcional y aumentaba la respuesta de
células específicas a CMV y el título de anticuerpos frente al virus.
Inversamente, la respuesta funcional in vivo, valorada por el título de
anticuerpos generados tras la vacunación frente al virus de la gripe fue
mayor en los individuos con mejor estado funcional.
Conclusiones. Existe una clara asociación entre el deterioro funcional de los individuos de edad avanzada y el envejecimiento de su
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sistema inmune, estando ambos parámetros directamente relacionados con la intensidad de la respuesta a CMV.
P-056
UTILIDAD DE UN TEST IN VITRO DE PRODUCCIÓN DE INTERFERÓN-G EN RESPUESTA A M. TUBERCULOSIS EN PACIENTES
CON UVEITIS CRÓNICA POSTERIOR. S. Calleja Antolín, M. Cordero Coma, H.E. Torres Rivas, C. Cuellas, N. Aller, O. Del Árbol, A.I.
De Castro, M.I. Sánchez Salazar, J.M. García Ruiz De Morales. Hospital de León, León.
Objetivos. Evaluar la utilidad de los nuevos test in vitro de producción de interferón-g en respuesta específica a antígenos de M tuberculosis en una población seleccionada de pacientes inmunosuprimidos con uveítis posterior crónica idiopática.
Material y métodos
Diseño. Estudio prospectivo, intervencional; Estudio caso-control.
Método. Se investigó a 31 pacientes con uveítis crónica idiopática,
o panuveítis para una respuesta inmune frente a tuberculosis. Se consideró una posible uveítis tuberculosa cuando los hallazgos oftalmológicos eran compatibles y se confirmaba una respuesta inmune específica frente a M tuberculosis, con la realización in vitro de un ensayo
de producción de interferón-g en respuesta a antígenos específicos
(Quantiferon-TB GOLD, Cellestis). Se registro la respuesta a tratamiento antituberculostático.
Resultados. En 8 de 52 controles (15,38%) y en 10 de los 31 pacientes con uveítis (32,25%), el test del quantiferón-TB resultó positivo (OR:
2,69, IC: 0,90-7,59, p= 0,07). En 2 pacientes el resultado de la prueba
fue indeterminado. Ocho pacientes positivos y uno negativo para Quantiferon, fueron inicialmente tratados para uveítis tuberculosa. Sólo uno
de ellos tenía evidencia de afectación sistémica, ninguno había sido
diagnosticado previamente de tuberculosis, habiendo recibido medicación inmunosupresora sistémica diversa, sin resultados óptimos
sobre su patología inflamatoria ocular. Tras nueve meses de tratamiento antituberculostático, siete de los pacientes previamente Quantiferon positivo y uno de los quantiferon negativo mostraron un descenso de la inflamación ocular, con mejoría de su agudeza visual. No se
observaron recaídas.
Conclusiones. El test de Quantiferón fue de utilidad en la toma
de decisiones terapeúticas en pacientes inmunosuprimidos con uveitis crónica posterior en un área geográfica de prevalencia intermedia-alta de tuberculosis
P-057
PRESENCIA DE CÉLULAS NKT HUMANAS Y EXPRESIÓN DE
CD1D EN LA INFECCIÓN CUTÁNEA POR LEISHMANIA INFANTUM. Y. Campos-Martín1, P. Algara1, Y. Ruano1, J.A. Arribas1, D. García Almagro1, E. Martínez-Naves2, M. Mollejo1. 1Hospital Virgen de la
Salud, Toledo. 2Universidad Complutense, Madrid.
Introducción. La respuesta inmue frente a Leishmania infantum
ha sido estudiada principalmente en animales de experimetación. Las
Leishmanias poseen una enorme capacidad de resistencia a ambientes hidrolíticos debido a una densa superficie de glicolípidos que poseen en su cubierta, siendo CD1d el principal candidato para presentarlos. CD1d presenta antígenos a células T conocidas como NKTs. En
humanos, ha sido estudiada la infección de células dendríticas in vitro
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por L. infantum y se ha observado un aumento de expresión de CD1d
tras la infección en la superficie celular. En estudios funcionales, células NKT autólogas responde a ese aumento de expresión, con una actividad citolítica frente a las células infectadas y con una producción
INF-gamma, de gran importancia para el comienzo de una respuesta
inmune efectiva.
Objetivo. Estudiar la presencia de células CD1d+ y NKT en muestras cutáneas humanas diagnosticadas de Leishmaniasis.
Metodología. Se han incluido las siguientes muestras: 15 biopsias
cutáneas con leishmaniasis con amplificación por PCR de secuencias
repetidas de Leishmania infantum; 15 biopsias cutáneas con procesos inflamatorios sin L infantum (PCR negativas) y 8 biopsias cutáneas con psoriasis utilizadas como control. Los estudios de expresión
de CD1d y NKT se han realizado con técnicas inmunohistoquímicas
(CD1d) y de inmunofluorescencia (Valpha24). El estudio de reordenamiento del TCR semi-invariante (Valpha24JalphaQ/Vbeta11) en células NKT se ha realizado por PCR.
Resultados. En todas las biopsias cutáneas estudiadas con L. infantum la dermis muestra un denso infiltrado inflamatorio con un alto
porcentaje de células que expresan CD1d, mientras que en las biopsias
cutáneas inflamatorias sin L infantum incluidas en el estudio, la expresión de CD1d es observada en menor número de células. La presencia
de células NKT se observa en el 100% de las infecciones cutáneas L.
infantum positivas, no observándose en los otros procesos inflamatorios sin leishmanias. En los casos incluidos de psoriasis, la expresión
de CD1d es principalmente en la epidermis y en todos los casos se ha
demostrado la presencia de células NKT por PCR, como ha sido descrito.
Conclusiones. Los resultados obtenidos en este trabajo apoyan los
ya obtenidos in vitro y confirman la alta expresión de CD1d y la importancia que juegan las células NKT en el comienzo de la respuesta inmune frente a la infección cutánea por L. infantum.
P-058
DESCENSO DEL NUMERO ABSOLUTO DE LINFOCITOS CD4+
ASOCIADO A NEUMONÍA POR PNEUMOCISTIS JIROVECII EN
EL TRANSCURSO DE UNA INFECCION POR VIRUS INFLUENZA H1N1. P. Jiménez Gámiz, J.M. Gonzalez De Vega, M. Bernal, F.
Valero, E.M. García Huertas, F. Garrido Torres-Puchol, F. Ruiz-Cabello Osuna. Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada.
Una paciente de 49 años ingresó en Octubre de 2009 en el Servicio
de Respiratorio de nuestro hospital presentando un cuadro de fiebre,
disnea, tos e infiltrados bibasales en la radiografía de torax. El cuadro clínico se atribuyó a una infección por virus influenza H1N1 que
fue confirmada mediante el análisis molecular de una muestra de un
frotis faríngeo. La paciente mejoró clínicamente tras la instauración del
tratamiento específico del proceso, pero una semana más tarde sufre
un empeoramiento originado por una sobreinfección por Pneumicistis
jirovecii, detectado en el lavado broncoalveolar. Durante la evolución
del proceso las cifras de linfocitos totales experimentaron un descenso progresivo: desde 969 c/µL en el momento del ingreso hasta 562
c/µL cuando acontece la sobreinfección por Pneumicistis jirovecii. El
análisis de las subpoblaciones linfocitarias mediante citometría de flujo reveló que la linfopenia era generalizada, afectando a las cifras de
linfocitos T CD4+ (212 c/µL), linfocitos T CD8+ (153 c/µL) y de linfocitos B (38 c/µL). No se detectaron defectos funcionales en los linfocitos T CD4+ en un ensayo in vitro de activación linfocitaria tras la esti-
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mulación con mitógenos. La linfopenia fue transitoria y las cifras de
linfocitos recuperaron los niveles normales al resolverse el cuadro clínico.
La respuesta inmune del huésped se ve afectada en el curso de
múltiples infecciones virales. La mayoría de las infecciones causadas
por el virus H1N1 tienen un curso leve, sin embargo un pequeño número de pacientes presentan complicaciones respiratorias. Es posible que
en estos casos el efecto del virus H1N1 sobre la respuesta inmune del
paciente esté implicado. Sin embargo, debido a su reciente aparición,
la inmunopatogénesis de la infección por el virus influenza H1N1 es
poco conocida. El Pneumicistis jirovecii es un patógeno que causa neumonías en los pacientes inmunodeprimidos. El riesgo de neumonía
por Pneumicistis jirovecii está asociado al descenso del número absoluto de los linfocitos T CD4+, incrementándose cuando este desciende
por debajo de 200 c/µL. En el caso que presentamos el descenso transitorio y progresivo de las cifras de linfocitos T CD4 se asocia a una
sobreinfección por Pneumicistis jirovecii. Otros autores han detectado
descenso en las cifras de linfocitos T CD4+ y de linfocitos B en pacientes infectados por el virus influenza H1N1. Sin embargo, serán necesarios más estudios para establecer la asociación entre la linfopenia
CD4 y la neumonía por Pneumicistis jirovecii en los pacientes infectados por el virus influenza H1N1. En este sentido, la determinación del
número absoluto de linfocitos T CD4+ puede constituir un marcador
muy útil para monitorizar el riesgo de desarrollar infecciones oportunistas e implantar la profilaxis específica.
P-060
PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE RICINA EN MATRICES
COMPLEJAS UTILIZANDO ANTICUERPOS ESPECÍFICOS. M.D.V.
Jiménez Pérez, B. Fernández Frutos, I. Peraile Muñoz, J.C. Cabria Ramos.
Instituto Tecnológico La Marañosa, San Martín de la Vega.
La toxina ricina, presente en las semillas de la planta “Ricinus
comunnis” (Castor beans) pertenece a una familia de proteínas conocidas como inactivantes de los ribosomas (ribosome-inactivating proteins, RIPs), y es prototipo de toxinas de estructura A-B. La cadena B
es una lectina que se une a una galactosa de la superficie celular, facilitando la entrada de la subunidad A al interior del citosol. La cadena
A inhibe la síntesis de proteínas mediante la inactivación de los ribosomas de las células eucariotas conduciendo a la muerte celular.
Debido a su alta letalidad (LD50 de 2g/Kg), su elevada estabilidad
así como su facilidad de obtención está considerada como un arma biológica potencial.
Por todo ello es necesaria su identificación por métodos rápidos y
específicos a partir de matrices de diferente complejidad.
Objetivos. Los objetivos de este trabajo y, por tanto, de la Unidad
de Defensa Biológica del Instituto Tecnológico la Marañosa:
• Detección de ricina mediante la técnica inmunoenzimática ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
• Utilización de anticuerpos para la purificación de la Ricina de
muestras complejas.
Material y métodos
• ELISA sandwich para detectar las subunidades A y B de la Ricina:
la ricina al ser una molécula de elevado peso molecular (65 kDa)
permite la obtención de anticuerpos monoclonales frente a diferentes regiones de la molécula. En concreto, para este trabajo se
han utilizado anticuerpos monoclonales frente a la cadena A y frente a la cadena B respectivamente. Se han desarrollado métodos de
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amplificación de la señal marcando con biotina el Anticuerpo
monoclonal frente a la cadena B.
• Para la purificación de la Ricina de matrices complejas se utilizó
una separación inmunomagnética. La aplicación de un campo magnético permite separar la ricina, previamente unida a las bolas
magnéticas mediante un anticuerpo, del resto de la matriz.
Resultados. Los resultados obtenidos han sido la puesta a punto
de una tecnología eficaz para la identificación de ricina, basada en una
separación inmunomagnética previa a una cuantificación mediante
ELISA tipo sandwich. Los resultados se expresan extrapolando los mismos en una curva patrón donde se representa la media de los resultados de absorbancia frente a diferentes concentraciones de ricina.
La curva obtenida se ajusta a una ecuación logística de cuatro parámetros según la siguiente ecuación:
D0 = A +
1+
(
B–A
concentración
EC50
)
-C
donde A es la absorbancia mínima, B es la absorbancia máxima y C es
la concentración que produce un 50% de absorbancia máxima (EC50)
de la curva sigmoidal. El intervalo de confianza de la curva se basa en
el cálculo de la t de Student.
Conclusiones. Este inmunoensayo, mediante la utilización de anticuerpos monoclonales específicos, ha demostrado ser una técnica versátil, robusta y simple en su realización, que permite la purificación e
identificación de ricina en matrices complejas.
P-061
IDENTIFICACIÓN DE ESPORAS DE BACILLUS ANTHRACIS
MEDIANTE LA CITOMETRÍA DE FLUJO COMO TÉCNICA
INMUNOLÓGICA. I. Peraile Muñoz, M.D.V. Jiménez Pérez, B. Fernández Frutos, J.C. Cabria Ramos. Instituto Tecnológico La Marañosa,
San Martín de la Vega.
Bacillus anthracis (B. anthracis) es el agente etiológico del ántrax,
enfermedad que presenta asociada una alta tasa de mortalidad. Las
esporas de B. anthracis se diseminan fácilmente, se encuentran de forma natural en el suelo de muchas regiones y son altamente resistentes
frente a condiciones medioambientales extremas. Todo esto explica por
qué las esporas de B. anthracis han sido históricamente utilizadas como
armas biológicas. Por lo tanto la puesta a punto de técnicas capaces de
detectar la presencia de esporas de B. anthracis con rapidez y precisión
es un objetivo prioritario en la Unidad de Defensa Biológica del Instituto Tecnológico La Marañosa.
Objetivo. El objetivo de este trabajo es la utilización de la citometría de flujo como técnica inmunológica para la determinación de esporas de B. anthracis en diversas matrices.
Material y métodos. B. anthracis presenta gran similitud genética con muchas especies del género Bacillus, con las que, además, comparte hábitat, lo que dificulta su determinación específica e inequívoca en matrices ambientales. La detección precisa de esporas de B. anthracis mediante ensayos tradicionales que requieren la germinación
de la espora y el crecimiento de células vegetativas tienen el inconveniente de ser lentos; otras técnicas, como las de Biología Molecular, son
rápidas, no requiren la germinación de la espora, pero llevan asociados complicados protocolos para el tratamiento de la muestra. Las técnicas inmunológicas surgen como una poderosa alternativa en la detección de agentes susceptibles de ser utilizados como armas de guerra
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biológica, dada la gran especificidad y rapidez de las reacciones antígeno - anticuerpo. Entre las técnicas inmunológicas destaca la citometría de flujo, que permite determinar simultáneamente diversos epítopos característicos de la espora de B. anthracis, en su mayoría presentes en el exosporium, mediante su unión específica a anticuerpos y/o
péptidos marcados con distintos fluorocromos. Esta técnica, además
de ser rápida y específica, no exige un laborioso procesamiento de la
muestra, con lo que se minimizan los riesgos asociados a su manipulación.
Resultados. La detección específica de esporas de B. anthracis por
citometría de flujo es posible mediante la utilización de marcadores
específicos de su exosporium, como lo es el péptido ATYPLPIRGGGC
(Williams y col., 2003) o determinados anticuerpos (Kuehn y col., 2009),
diferenciándolas así de manera fiable y rápida de otras esporas del
mismo género como B. cereus o B. thuringiensis. Además, también es
posible determinar la posible virulencia de la cepa mediante el uso de
un anticuerpo específico contra el antígeno protector PA (Schumacher
y col., 2008).
Conclusiones. La citometría de flujo mediante la utilización conjunta de marcadores específicos, permite detectar específicamente y al
instante esporas de B. anthracis, y determinar su posible virulencia, no
exigiendo la muestra prácticamente ningún procesamiento.
P-062
ESTUDIO DE LA SUBPOBLACIÓN NK CD56- CD16+ DE PACIENTES HIV+ EN DIVERSAS SITUACIONES CLÍNICO-TERAPÉUTICAS. L. Castro Orgaz, M. Frias Casas, R. González Fernández, B. Manzanares Martín, M. Cobo Medina, L. Montes Torres, J. Peña Martínez.
Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba, Córdoba.
Objetivos. Un importante componente de la inmunidad innata
son las células Natural Killer. De estas células se han descrito tres subpoblaciones: CD56dim (función citotóxica), CD56bright (función inmunorreguladora) y una tercera población menos estudiada CD56-CD16+
(baja citotoxicidad). Ciertos cambios en esta última población fueron
inicialmente descritos en pacientes HIV+. Una de las características de
esta población es su baja capacidad citotóxica, basado en esto el objetivo de este estudio es analizar la población CD56-CD16+ en pacientes HIV+ en diversas situaciones clínico-terapéuticas entre los que se
encuentran aquellos pacientes a los que se les ha retirado el tratamiento.
Material y métodos. Para la realización de este estudio se utilizaron PBMCs previamente congeladas de pacientes HIV+ sin HAART
durante al menos dos años (n=22), PBMCs congeladas de donantes
sanos (n=21) y PBMCs congeladas de pacientes HIV+ con HAART
(n=24). El análisis de las poblaciones celulares se realizó mediante citometría de flujo de cuatro colores (FACScalibur. Becton Dickinson. San
Diego, California). El paquete estadístico usado para el análisis de
los datos fue el SPSS (V.17. SPSS Inc., Chicago).
Resultados. Los resultados obtenidos muestran un incremento significativo de la subpoblación CD56-CD16+ en pacientes HIV+ sin
HAART respecto a aquellos pacientes HIV+ con HAART y a los donantes sanos (p<0,05). Este incremento sería en detrimento del resto de
subpoblaciones CD56+ (dim y bright) que tienen tendencia a disminuir.
Conclusión. El análisis fenotípico de las células NK en pacientes
HIV+ sin HAART ha mostrado que hay una pérdida selectiva de la
población citolítica CD56+CD16+ y una expansión en la subpoblación
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CD56-CD16+. En estos pacientes sin HAART dicha subpoblación expresa unos elevados niveles de iNKRs, principalmente el receptor inhibidor CD85j ó ILT2 y bajos niveles de NCRs, en comparación con la población CD56+.
P-063
CÉLULAS T CD4+ REGULADORAS EN NEONATOS DE MUY
BAJO PESO Y RIESGO DE SEPSIS. M. Cianchetta Sívori, M. Sánchez-Luna, E. Zamora, E. Maderuelo, S. Villar, B. Alonso, B. Padilla,
S. Sánchez-Ramón. Hospital General Universitario Gregorio Marañon,
Madrid.
La sepsis neonatal es una complicación grave en neonatos de muy
bajo peso (MBP) y causa importante de secuelas graves y mortalidad
en esta población. Por tanto, es necesario identificar marcadores predictivos tempranos de sepsis neonatal. Las células T reguladoras (Treg)
son una subpoblación especializada de células T de origen tímico que
participan en la tolerancia inmunológica y en la supresión de las respuestas efectoras.
Objetivo. Determinar los marcadores clínicos e inmunológicos
capaces de predecir el riesgo de sepsis neonatal. Materiales y Métodos: Se incluyeron de forma consecutiva 37 neonatos de MBP (<1.500g).
Se evaluaron parámetros clínicos y se realizó un estudio inmunofenotípico en sangre periférica mediante citometría de flujo de 4 colores
(sangre del cordón umbilical (CU), 7 días y 1 mes de vida). Resultados:
De los 37 neonatos de MBP incluidos en el estudio, 25 (67%) desarrollaron sepsis nosocomial a los 9,9 ± 3,4 días de vida, y 3 de los 25 (12%)
niños que desarrollaron sepsis fallecieron. El único marcador clínico
predictivo de sepsis fue la edad gestacional (EG), que fue significativamente menor en los neonatos de MBP que desarrollaron sepsis nosocomial (p=0,005). No se observaron diferencias en las células T CD4+
naïve, memoria, pre-efectoras y/o efectoras entre los neonatos de MBP
que desarrollaron sepsis nosocomial y los que no desarrollaron sepsis.
Por el contrario, los neonatos MBP que desarrollaron sepsis presentaban porcentajes de células Treg (CD4+CD25+hi y CD4+CD25+
FoxP3+) aumentados (UCB p<0,02 y p=0,29, respectivamente). Observamos además una expresión significativamente mayor de perforina
en las Treg en los neonatos MBP que desarrollaron sepsis (p= 0,05). Las
células Treg se presentaban una correlación inversa con la EG (r=-0,46;
p=0,005).
Conclusiones. La expansión de células Treg en neonatos de MBP
puede estar reflejando el desarrollo fisiológico del sistema inmunológico en el neonato durante el período de aprendizaje de tolerancia tímica. Los neonatos de MBP se enfrentan a los patógenos y otras amenazas durante una fase temprana del aprendizaje del timo, lo que puede
interferir con las respuestas inmunológicas efectoras frente a patógenos, generando una respuesta tolerogénica, lo que conlleva un mayor
riesgo de sepsis.
P-064
ESTUDIO DE PEPSINA EN LAVADO BRONCOALVEOLAR PARA
DETECTAR REFLUJO GASTROESOFÁGICO EN PACIENTES
ASMÁTICOS GRAVES. I. Toboso De Lamo, A. Pacheco, L.M. Villar,
P. González. Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid.
Objetivos. El asma y otras patologías neumológicas crónicas suponen un grave problema sociosanitario en España. Estudios recientes
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sugieren una asociación entre las formas graves de estas patologías y
el reflujo esofagogástrico (REG), debido a que el epitelio laríngeo es
mucho más sensible a los daños por la pepsina en medio ácido que el
esofágico.
Este estudio pretende poner a punto un método sensible y poco
invasivo de detección y cuantificación de pepsina por ELISA, en lavados broncoalveolares (LBA) de pacientes asmáticos de difícil manejo.
Material y métodos. Muestras biológicas: Como control positivo
se utilizó jugo gástrico de pacientes sometidos a gastroscopias con fines
diagnósticos. Las muestras de LBA se obtuvieron por aspiración bronqueoalveolar, se centrifugaron a 2500 rpm, se alicuotaron y se almacenaron a -80ºC hasta su utilización.
Pacientes: Se estudiaron 30 muestras de 15 pacientes con asma grave.
Reactivos del ELISA. Placas Greiner bio-one, anticuerpo monoclonal de ratón frente a Pepsina A humana (Santa Cruz Biotechnology),
anticuerpo IgG antipepsina porcina conjugado con biotina (Rockland)
y Estreptavidina-peroxidasa (Jackson Inmunoresearch).
Condiciones finales del ensayo:
• Se tapiza la placa de ELISA con anticuerpo antipepsina A humana, durante toda la noche a 4ºC.
• Se bloquea 1 hora con PBS BSA 1% a temperatura ambiente.
• Se incuban las muestras en el mismo tampón durante 45 minutos a temperatura ambiente.
• Se incuba con el anticuerpo conjugado con biotina 45 minutos y
se revela la placa con OPD y H2O2.
Resultados. El límite de detección del ELISA fue de 0,1 ng/mL de
pepsina. El coeficiente de variación inter e intraensayo fue inferior al
10%.
Comparamos los resultados de las muestras de LBA con una recta patrón de jugo gástrico. Consideramos positivas, aquellas muestras
de LBA cuya concentración de pepsina fue al menos el doble que la
concentración media de pepsina en suero (49,8-86,6 µg/ml), para descartar posibles contaminaciones hemáticas. Cuatro de las 30 muestras
de BAL estudiadas, resultaron ser positivas.
Discusión. Este ELISA, constituye un método sencillo, reproducible y eficaz, para la detección y cuantificación de pepsina en LBA.
Futuros estudios, demostrarán la importancia del reflujo en las complicaciones de los pacientes con patologías neumológicas y demostrarán si la cuantificación de pepsina en LBA puede ser de utilizada como
marcador clínico en dichos pacientes.
P-065
IMPORTANCIA EN EL DIAGNÓSTICO DE LA TUBERCULOSIS
PULMONAR LATENTE DE LA PRODUCCIÓN ANTÍGENO-ESPECÍFICA DE CXCL9, CXCL10 Y OTRAS CITOCINAS Y SU CORRELACIÓN CON LA PRODUCCIÓN DE INTERFERON-GAMMA Y
LA REACCIÓN DE MANTOUX. N. Villegas1, J.L. Arroyo2, A. Ferrero1, F. Ausín1, P. Sánchez-Velasco1, F. Leyva-Cobián1, J.G. Ocejo-Vinyals1. 1Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, Liencres. 2Banco de
Sangre y Tejidos de Cantabria.
Objetivos. El objetivo de nuestro estudio ha sido: (i) evaluar si la
cuantificación de CXCL9 y CXCL10 y otras citocinas (CCL5, IL-10, IL12p40 e IL-12p70) producidas por células de sangre circulante tras estimulación con antígenos de Mycobacterium tuberculosis (MTB) (ESAT6, CFP10 y TB7.7), podría ser de utilidad en el diagnóstico de la infección pulmonar latente causada por MTB en una población de bajo ries-
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go para la infección, y (ii) evaluar la correlación entre la producción de
estas citocinas con la producción antígeno-especifica de IFNγ y con
la prueba de Mantoux.
Material y métodos. Participaron en el estudio 303 donantes sanos
procedentes del Banco de Sangre y Tejidos de Cantabria. Todos los
donantes participantes en el estudio fueron evaluados clínica y epidemiológicamente y los datos registrados. En las muestras de sangre circulante se determinó la producción basal y tras estimulación con tres
antígenos de MTB (ESAT-6, CFP10 y TB7.7) de las siguientes citocinas:
IFN-γ, CXCL9, CXCL10, CCL5, IL-10, IL-12p40 e IL-12p70. Las concentraciones de IFN-Á se determinaron mediante ELISA y las de las otras
citocinas mediante luminometría con un panel preformado comercialmente de las citocinas mencionadas.
Resultados. En 46 individuos (15,18%) la concentración de IFN-γ
específico para MTB estaba elevada significativamente. Se descartó en
ellos la presencia de una tuberculosis pulmonar activa. Se realizó la
prueba de Mantoux en 29, resultando positiva en 27 de ellos. La producción de CXCL9 y CXCL10 se correlacionó con la producción de
IFN-γ. Sin embargo, la producción de CXCL9 y CXCL10 estaba significativamente elevada en algunos donantes con producción normal de
IFN-γ. En estos, la prueba de Mantoux fue positiva. Todos estos individuos habían sido vacunados con BCG.
Conclusiones. Estos resultados, indicarían que junto con la determinación de IFN-γ, la determinación de CXCL9 y de CXCL10 podría
ser un complemento útil en el diagnóstico de la infección por MTB. Sin
embargo, su especificidad es menor que la proporcionada por la determinación de IFN-γ, puesto que en aquellos individuos vacunados con
BCG se obtienen resultados falsamente positivos.
flujo e inmunohistoquímica utilizando anticuerpos monoclonales frente a linfocitos T (CD3), linfocitos T cooperadores (CD4), linfocitos T
citotóxicos/supresores (CD8), linfocitos Tγ/δ y linfocitos B. El estudio
de los mediadores químicos (INF-γ e IL-4) se llevó a cabo por inmunohistoquímica.
Los resultados obtenidos muestran un descenso significativo en
el número de linfocitos CD4+ y CD8+ circulantes al principio de la
experiencia. Coincidiendo con el descenso de ambas subpoblaciones, existe una activación intensa de las estructuras linfoides en
los órganos estudiados, que origina una recuperación de estas poblaciones a nivel sistémico. Los linfocitos Tγ/δ, asociados a la protección de mucosas, presentan el mismo comportamiento de las poblaciones anteriores. A diferencia de éstas, los linfocitos B no muestran
cambios significativos durante la experiencia. Unido a los cambios
cuantitativos descritos, se observa una activación linfocitaria caracterizada por la expresión de INF-γ, indicativa de la instauración de
una respuesta inmunitaria tipo I. Así, una adecuada respuesta inmune celular en la puerta de entrada del HVB-1.1 lograría detener su
diseminación.
P-066
La diarrea vírica bovina (DVB) y la rinotraqueitis infecciosa bovina (IBR) son enfermedades del ganado bovino ampliamente distribuidas a nivel mundial, asociadas a importantes pérdidas económicas, que producen graves patologías gastrointestinales y respiratorias, respectivamente. El estudio de la mucosa nasal y tonsila, como
órgano de entrada y replicación vírica primaria, es crucial para profundizar en la patogénesis de dichos procesos víricos. Los macrófagos, importantes elementos del sistema inmune, gracias a su capacidad fagocítica, función de presentación de antígenos y producción
de citoquinas, son las principales células blanco de ambos virus. Por
ello, el objetivo de este trabajo fue el estudio de los macrófagos en
tonsila faríngea y mucosa nasal, tanto a nivel cuantitativo como de
activación secretora, en terneros coinfectados experimentalmente con
el virus de la diarrea vírica bovina (vDVB) y el herpesvirus bovino
tipo 1.1 (HVB-1.1).
Con este fin, 8 terneros, inoculados vía intranasal con la cepa no
citopática 7443 del vDVB, se coinfectaron 12 días después intranasalmente con la cepa Iowa del HVB-1.1. Tras el sacrificio de los animales,
se tomaron muestras de tonsila faríngea y mucosa nasal. El estudio de
los cambios cuantitativos en la población de macrófagos se realizó
mediante inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo monoclonal
MCA387. La activación secretora de los macrófagos se corfirmó también mediante técnicas inmunohistoquímicas para la detección de distintos mediadores químicos (TNF-α e IL-1α) sintetizados y liberados
por estas células.
La presencia de macrófagos inmunomarcados fue considerablemente superior en las áreas interfoliculares que en el interior de las
estructuras linfoides de la tonsila a lo largo de la experiencia. Sin
embargo, los macrófagos intraepiteliales no mostraron cambios, mien-
PAPEL INMUNOMODULADOR DE LA TONSILA FARÍNGEA Y
MUCOSA NASAL EN LA PATOGENESIS DEL HERPESVIRUS
BOVINO-1. V. Molina Hernández, M.Á. Risalde Moya, M. Pedrera
Mazarro, P.J. Sánchez Cordón, G. García Jurado, J.C. Gómez Villamandos. Universidad de Córdoba, Córdoba.
El herpesvirus bovino tipo 1.1 (HVB-1.1), agente causal de la rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR), es un alphaherpesvirus considerado el agente etiológico más importante del cuadro de enfermedades respiratorias bovinas, responsable de elevadas pérdidas económicas en la industria ganadera mundial. El virus penetra en el animal por vía aerógena, y replica en la mucosa de tonsilas y tracto respiratorio superior. Las tonsilas son estructuras linfoepiteliales consideradas de gran importancia en la inmunidad mucosa local. Trabajos previos sugieren que están implicadas en la patogénesis del herpesvirus bovino-1, hecho que, unido a su localización estratégica, las
hace de especial interés para su estudio. Con el fin de profundizar en
el estudio del papel inmunomodulador de las tonsilas en la patogénesis de dicho agente, hemos trabajado sobre la caracterización inmunofenotípica y cuantificación de las subpoblaciones de células efectoras del sistema inmune, así como su actividad biosintética, en la
tonsila faríngea y mucosa nasal de terneros infectados experimentalmente con HVB-1.1.
Para ello, se inocularon 8 terneros intranasalmente con la cepa Iowa
del HVB-1.1 y se tomaron muestras de sangre en días previos y posteriores a la inoculación. Tras el sacrificio secuencial de los animales, se
cogieron muestras de tonsila faríngea y mucosa nasal. La caracterización inmunofenotípica se realizó mediante técnicas de citometría de
84
P-067
RESPUESTA PROINFLAMATORIA DE LOS MACRÓFAGOS EN
INFECCIONES VÍRICAS CONCOMITANTES DEL TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR. V. Molina Hernández, M.Á. Risalde Moya,
M. Pedrera Mazarro, P.J. Sánchez Cordón, F. Romero Palomo, J.C.
Gómez Villamandos. Universidad de Córdoba, Córdoba.
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INMUNOLOGÍA
tras que en la lámina propia, se observa un incremento tanto a nivel
de tonsila como de mucosa nasal. A su vez, se observó un incremento significativo de células, principalmente macrófagos, reactivas frente TNFα en las áreas interfoliculares de la tonsila. Sin embargo ni
en folículos y en el resto de las estructuras tonsilares estudiadas se
observaron cambios significativos en la expresión de los mediadores
estudiados en las muestras empleadas. Se demuestra que los macrófagos no sólo no experimentan una activación proinflamatoria cuando están inoculados con DVB, sino que estos animales al coinfectarse con HVB-1.1 están incapacitados para experimentar una activación proinflamatoria.
P-068
DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN MEDIANTE RT-PCR EN TIEMPO REAL DEL VIRUS DE LA DIARREA VÍRICA BOVINA EN SANGRE Y TEJIDOS DE TERNEROS INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE. V. Molina Hernández1, P.J. Sánchez Cordón1, M.Á. Risalde
Moya1, J.C. Gómez Villamandos1, B. Rodríguez Sánchez2, M. Pedrera
Mazarro1. 1Universidad de Córdoba, Córdoba. 2Universidad Complutense
de Madrid.
Objetivos. Hasta la fecha, son escasos los estudios que hayan evaluado los cambios que se producen en los niveles del virus de la Diarrea Vírica Bovina (vDVB) en el transcurso de una infección mediante el empleo de técnicas de PCR cuantitativas. Con la finalidad de relacionar la presencia y evolución del virus, tanto en sangre como en los
principales órganos linfoides, con el estado de inmunosupresión que
caracteriza la infección, el principal objetivo de este estudio fue determinar y monitorizar, de manera secuencial, la concentración de genoma vírico tanto en sangre como en tejidos durante el curso de una infección aguda experimental.
Materiales y métodos. 8 terneros sin encalostrar fueron inoculados por vía intranasal una cepa no citopática de genotipo 1 del vDVB.
2 animales permanecieron como controles sin inocular, siendo sacrificados al final del experimento. Se tomaron muestras de sangre entera a los 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 12, 13 y 14 días post-inoculación (dpi), las cuales fueron congeladas a -80ºC. Los animales fueron sacrificados en grupos de dos a los 3, 6, 9 y 14 dpi, siendo sometidos a una necropsia rutinaria en la que se tomaron y congelaron muestras de distintos tejidos.
Tras la extracción del RNA, se llevó a cabo una RT-PCR en tiempo real
empleando sondas TaqMan. Con el fin de normalizar diferencias entre
las distintas muestras se empleó el gen de referencia GAPDH como
control endógeno.
Resultados y conclusiones. Esta técnica demostró ser un método
con una alta sensibilidad y especificidad para la detección y cuantificación del vDVB tanto en muestras de sangre como en tejidos, mostrándose como una herramienta de gran utilidad para el estudio de los
mecanismos de diseminación y acantonamiento del virus. Desde el
comienzo del experimento se pudieron detectar elevados niveles de
genoma vírico en las tonsilas, lo que confirmó a este órgano como uno
de los primeros lugares de replicación del virus. Además, se confirmó
el especial tropismo del vDVB por órganos y tejidos linfoides secundarios con predominio de linfocitos B, así como el papel secundario
del pulmón y del hígado en la replicación del virus.
PÓSTERS
P-069
EL DNA DE VIH-1 ASOCIADO A CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA (VIH-1 DNA-PBMC) COMO
MARCADOR PRONÓSTICO DE EVOLUCIÓN VIROLÓGICA
EN LA INFECCIÓN CRÓNICA POR EL VIH-1. C. Rodríguez-Sáinz,
R. Ramos, L. Valor, D.C. Hernández, J. Modrego, D. Alecsandru, E.
Fernández-Cruz. Hospital General Universitario Gregorio Marañón,
Madrid.
Objetivos. Recientemente en la infección aguda por el VIH-1 se
ha analizado la carga viral de VIH-1 DNA-PBMC como un marcador
predictivo en la progresión de la enfermedad alternativo a los marcadores surrogados estándar, VIH-1 RNA y células T CD4+. El objetivo
del estudio es analizar en la infección crónica asintomática por el VIH1 el valor pronóstico del VIH-1 DNA-PBMC para predecir la progresión virológica de la infección VIH-1.
Material y Métodos. En 115 individuos que han participado previamente en el ensayo clínico STIR-2102, analizamos de forma retrospectiva la carga DNA VIH-1 asociada a PBMC mediante PCR cuantitativa a tiempo real. Pacientes naïve para la terapia antirretroviral fueron evaluados en el momento basal (basal pre-ART) y tras recibir seis
semanas de ART previo a la aleatorización (basal post-ART). Se analizó mediante análisis de Kaplan–Meier y de Regresión de Riegos Proporcionales de Cox el valor pronóstico de las variables VIH-1 DNAPBMC, VIH-1 RNA plasmática y linfocitos T CD4+ en las basales preART, post-ART y al final del estudio (mes 36).
Resultados. Tras el tratamiento (basal post-ART) los pacientes
redujeron significativamente los niveles de VIH-1 RNA (siendo el 82%
indetectable), manteniendo los valores de PBMC DNA VIH-1 elevados (media geométrica: 690 copias/106 PBMC). Las curvas de supervivencia Kaplan-Meier mostraron que los niveles de DNA-PBMC preART y post-ART tienen poder predictivo (Log-Rank test: p < 0,001 y p
< 0,001, respectivamente). Los niveles pre-ART de RNA VIH-1 mostraron un Log-Rank test: p= 0,003. Analizadas las variables en un modelo multivariante se observó que el nivel de DNA-PBMC post-ART tiene el valor predictivo más fuerte (HR ajustado, 2.51 [95% IC, 1,33-4,73,
p = 0,004]) y es independiente del VIH-1 RNA (HR 1,74 [95% IC,
1,16–2,60, p = 0,007]).
Conclusiones. El VIH-1 DNA asociado a PBMC es un marcador
con valor clínico para predecir la evolución virológica de individuos
con infección crónica asintomática por el VIH-1. Este método de PCR
permite cuantificar las formas lábiles de DNA asociadas a la replicación viral, que desaparecen tras ART, y las formas intracelulares permanentes, integradas y no integradas de DNA de mayor valor pronóstico.
P-070
ASOCIACIÓN DEL ALELO KIR3DS1 CON LA PÉRDIDA DE
CORRELACIÓN ENTRE LA VIREMIA PLASMÁTICA RNA VIH1 Y LA ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS T CD8+ EN INFECCIÓN CRÓNICA ASINTOMÁTICA. D. Hernández Flórez, L. Valor,
J. Modrego Ruiz, J. Navarro, E. Fernández-Cruz, C. Rodríguez-Sáinz.
Hospital General Universitario Gregorio Marañon, Madrid.
Objetivos. Las formas activadoras e inhibidoras de los receptores
KIR que expresan las células NK y los linfocitos T CD8+ participan en
los mecanismos de defensa frente a la infección VIH-1. En la infección
VIH-1 existe una correlación positiva entre la viremia plasmática VIH-
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1 RNA y el % de linfocitos T CD8+ CD38+ activados. En individuos
naïve para la terapia antirretroviral (ART) con infección reciente se ha
asociado la presencia del receptor activador KIR3DS1 con la ausencia
de correlación positiva entre los linfocitos T CD8+ CD38+ y los niveles de VIH-1 RNA en plasma. Hemos analizado la prevalencia del alelo KIR3DS1 en una cohorte de pacientes con infección VIH-1 crónica
asintomática y su asociación con los linfocitos T CD8+ CD38+ y la viremia plasmática.
Materiales y métodos: Analizamos retrospectivamente el genotipo KIR3DS1/KIR3DL1 mediante PCR-SSP en la cohorte de 185
individuos incluida en el ensayo clínico STIR-2102. En 37 pacientes de la cohorte se cuantificó el VIH-1 RNA pre-ART, las subpoblaciones T CD4+ y T CD8+ y la expresión del marcador de activación
CD38. En las comparaciones de grupos se utilizó el test no paramétrico de Mann-Whitney y para el análisis de correlación el coeficiente de Spearman.
Resultados. En los 185 individuos genotipados 82 fueron positivos para KIR3DS1 (44,3%). En el subgrupo de 37 pacientes, 19
fueron positivos para KIR3DS1 y 18 negativos para KIR3DS1. En
los individuos portadores del alelo KIR3DS1 no se observó correlación entre la viremia VIH-1 RNA y el % de linfocitos T CD8 +
CD38+ (Coeficiente de Correlación de Spearman r= 0,284; p = 0,254).
Sin embargo, en los pacientes que carecían del alelo KIR3DS1 se
observó una correlación positiva entre la viremia plasmática VIH1 RNA y el % de células T CD8+ CD38+ activadas (r= 0,503; p =
0,028).
Conclusión. En pacientes naïve con infección VIH-1 crónica asintomática la presencia del receptor activador KIR3DS1 se asoció a la
ausencia de correlación entre el % de linfocitos T CD8+ CD38+ activados y los niveles de la viremia plasmática VIH-1 RNA. Estos datos confirman el potencial papel del receptor activador KIR3DS1 en los mecanismos inmunológicos frente al VIH-1.
P-071
ESTUDIO DEL POLIMORFISMO TER99GLN DEL GEN QUE
CODIFICA LA QUIMIOCINA CXCL10 EN UNA COHORTE DE 135
PACIENTES ASINTOMÁTICOS CON INFECCIÓN POR EL VIH1. C. Rodríguez-Sáinz, I. Martínez, J. Modrego, D.C. Hernández, D.
Alecsandru, R. Ramos, E. Fernández-Cruz. Hospital General Universitario Gregorio Marañón, Madrid.
Objetivo. En la infección por el VIH-1 se ha descrito que la quimiocina CXCL10 puede favorecer la propagación del virus debido a que estimula la migración de los linfocitos T activados y monocitos hacia los órganos linfoides secundarios y a su capacidad de
activar in vitro la replicación viral. No se han descrito variantes polimórficas del gen CXCL10 implicadas en la infección VIH-1. El objetivo de este estudio es determinar la prevalencia del polimorfismo CXCL10 Ter99Gln (rs11 26858) y su asociación con el VIH-1 DNA
intracelular en PBMC (VIH-1 DNA-PBMC).y la carga viral RNA
VIH-1 plasmática (RNA VIH-1) en una cohorte de 135 individuos
asintomáticos, naïve para la terapia antirretroviral (ART) con infección crónica por el VIH-1 que han participado en el ensayo clínico
STIR-2102.
Material y métodos. El polimorfismo rs11 26858 se determinó
retrospectivamente en 135 pacientes mediante discriminación alélica
con PCR a tiempo real y sondas Taqman. Se analizaron también el VIH1 DNA-PBMC y la RNA VIH-1 plasmática. Estos pacientes naïve para
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VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
la terapia antirretroviral fueron evaluados en el momento basal (basal
pre-ART) y tras recibir seis semanas de ART.
Resultados. El genotipado mostró 134 individuos homocigotos
para el alelo wild-type y un sólo individuo heterocigoto para el polimorfismo Ter99Gln. La prevalencia de la heterocigosis en la cohorte
del estudio es 0,7% y la prevalencia del alelo 99Gln es 0,4%. Esta prevalencia es similar a la descrita para la población sana (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi? rs=1126858). El paciente portador
de la heterocigosis presentó la carga de DNA-PBMC mas elevada
(32.560 copias/106 PBMC) en relación con la del resto de individuos
VIH-1+ de la cohorte (mediana= 655 copias/106 PBMC). Después de
seis semanas de ART los niveles de DNA VIH-1 del paciente heterocigoto se mantuvieron más elevados (10.645 copias/106 ) en relación con
la respuesta al tratamiento del resto de individuos de la cohorte (mediana= 560 copias/106 ).
Conclusiones. La prevalencia de la heterocigosis para el polimorfismo rs1126858 en una cohorte de 135 individuos asintomáticos con
infección crónica VIH-1 es del 0,7%. En nuestro caso el polimorfismo
Ter99Gln se asoció a unos niveles intracelulares elevados de VIH-1
DNA y a una pobre respuesta al tratamiento antiretroviral.
P-072
REGULACIÓN DE LA MAQUINARIA TRADUCCIONAL CELULAR POR EL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA. A. Quintas1, A. Castelló2, E. García-Sánchez1, P. Sabina1, M. Nogal1, L. Carrasco1, Y. Revilla1. 1Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBMSO),
Madrid. 2European Molecular Biology Laboratory (EMBL).
Introducción. El Virus de la Peste Porcina Africana (VPPA) es un
virus DNA con un genoma complejo capaz de infectar distintas especies de cerdo, causando una enfermedad aguda, altamente infecciosa
y en la mayoría de los casos, letal. La infección por VPPA se caracteriza por la ausencia de una respuesta inmune capaz de neutralizar la
infección, lo que ha impedido el desarrollo de una vacuna convencional. Como parásitos intracelulares, los virus son altamente dependientes de la maquinaria traduccional celular para llevar a cabo la síntesis de sus proteínas. Durante la infección por VPPA se produce una
fuerte inhibición de la síntesis de proteínas celulares, mientras que las
proteínas virales son eficientemente sintetizadas. Poco es lo que se
conoce sobre los mecanismos moleculares a través de los cuales el virus
controla la maquinaria traduccional celular.
Objetivo. Análisis del efecto de la infección de VPPA en el estado
y localización de los componentes de la maquinaria traduccional celular.
Materiales y métodos. Análisis del estado funcional, la integridad
y activación de los factores de iniciación de la traducción mediante
ensayos de unión a proteína A sepharosa y Western Blot. Análisis de
la localización de los mismos y otros orgánulos celulares, así como
de proteínas virales mediante ensayos de microscopia confocal y microscopia electrónica.
Resultados. A pesar de la activación de caspasa-3 producida con
la infección de VPPA, los niveles del factor de iniciación eIF4G permanecen constantes. Además, durante la infección los factores de iniciación eIF4G y eIF4E son fosforilados en los residuos Ser1108 y Ser209,
respectivamente; mientras que el factor de regulación de eIF4E, 4E-BP
es hiperfosforilado a tiempos tempranos de la infección e hipofosforilado a partir de las 18 horas post-infección, lo que provoca un incremento de la asociación de los factores eIF4G y eIF4E para formar el
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complejo eIF4F. La infección no solo promueve la formación de eIF4F,
si no que además provoca la redistribución del mismo a los sitios de
replicación viral, conocidos como factorías virales. La activación de
eIF4F es esencial para infección de VPPA puesto que la depleción de
eIF4G y eIF4E en células COS-7 impide la acumulación de la proteína mayoritaria de la cápsida viral, p72. Otros componentes del complejo de iniciación de la traducción, como eIF2, eIF2a y eIF3b asi como
los ribosomas también se encuentran enriquecidos en la periferia de
las factorías virales. En las células infectadas la red mitocondrial se
encuentra polarizada, colocalizando con los ribosomas, mientras que
a tiempos tardíos de la infección se observa una disminución de los
ARNm polyadenilados del citoplasma y un incremento de los mismos
en las factorias virales, correspondiendo probablemente a los ARNm
virales.
Conclusión. El Virus de la Peste porcina africana activa la maquinaria de traducción celular y la distribuye alrededor de las factorías
virales, junto con otros componentes celulares como los ribosomas y
las mitocondrias, para favorecer la síntesis de sus proteínas. Este reclutamiento de la maquinaria traduccional, junto con la degradación de
los ARNm polyadenilados parecen formar parte del mecanismo por
el cual el virus inhibe la síntesis de proteínas celulares, facilitando la
producción de las partículas virales.
SESIÓN 6: INMUNIDAD INNATA E INFLAMACIÓN
Moderadores: J.L. Rodríguez Fernández (Madrid)
Francisco Sánchez Madrid (Madrid)
P-073
ACTIVACIÓN SELECTIVA DE TOLL-LIKE RECEPTOR 7 (TLR7)
EN PACIENTES CON POLIMIALGIA REUMÁTICA Y ARTERITIS
DE CÉLULAS GIGANTES. L. Alvarez-Rodríguez1, V.M. MartínezTaboada1, C. Mata2, J. Calvo Alen2, J.I. Beares-Gomez1, M.J. Marin1,
A. Fontalba1, J.L. Fernandez-Luna1, M. Aranzamendi1, J. Agüero1, M.
López-Hoyos1. 1Hospital U. Marques de Valdecilla, Santander. 2Hospital
Sierrallana, Torrelavega.
Objetivo. Estudiar la expresión y función de los miembros de la
familia de los Toll-like receptor (TLR) en células mononucleares circulantes (PBMC) de pacientes con arteritis de células gigantes (GCA) y
polimialgia reumática (PMR).
Material y métodos. Analizamos PBMC de 70 PMR, 20 GCA y
24 controles sanos de la misma edad (HC). La expresión de los TLR en
distintas subpoblaciones de PBMCs se determinó por citometría de
flujo. La función de los TLR se estudió estimulando PBMCs con ligandos específicos. Estos estudios también se realizaron en un subgrupo
de pacientes con PMR/GCA en remisión clínica con corticosteroides
(CS).
Resultados. Encontramos un aumento significativo en la expresión de TLR7 en células B, T y monocitos de pacientes con enfermedad activa comparado con los HC. A pesar del aumento en la expresión de TLR7, los monocitos circulantes de pacientes con enfermedad activa mostraron una respuesta in vitro disminuida (producción
de citocinas circulantes pro-inflamatorias) tras estimulación con agonistas específicos de TLR7. Un posible defecto genético fue descartado tras no encontrarse cambios en varios SNPs en el gen promotor
PÓSTERS
de TLR7, y tras demostrar una respuesta normal a los agonistas específicos en pacientes en remisión completa sin tratamiento con CS. La
estimulación de PBMCs de HC con plasma de pacientes con enfermedad active indujo un aumento en la expresión de genes de la respuesta mediada por interferón-INF (IFN-β, IFIT1, IRF7 y USP18) determinada por RT-PCR, sugiriendo que la respuesta disminuida a los agonistas de TLR7 podría ser secundaria a una saturación de los receptores por un ligando natural. Como TLR7 reconoce fundamentalmente virus ssRNA, intentamos identificar la presencia de varios virus respiratorios en el plasma de los pacientes con resultados no concluyentes.
Conclusión. Estos datos sugieren una activación selectiva de TLR7
por un ligando(s) natural(es) en pacientes con PMR y GCA. A pesar
de no poder identificar el posible agente causal en el plasma de los
pacientes, el aumento en la expresión de genes de la respuesta mediada por IFN-tipo I tras estimular con plasma de pacientes sugiere una
posible etiología viral en estos dos síndromes.
*El presente trabajo está financiado por becas de: MSC-Instituto de Salud Carlos III
(PI050475 / PI080098), IFIMAV y la Fundación Mutua Madrileña
P-074
LA EDAD Y LOS NIVELES DISMINUIDOS DE VITAMINA D SE
ASOCIAN CON ALTERACIONES EN LA RESPUESTA INMUNE
INNATA Y EN LOS NIVELES DE CITOCINAS CIRCULANTES. L.
Alvarez-Rodríguez, V.M. Martínez-Taboada, J. Beares-Gomez, M.J.
Marin, M. García-Unzueta, J.A. Amado, M. Gonzalez-Paz, C. Santa
Cruz Llata, M. López-Hoyos. Hospital U. Marques de Valdecilla, Santander.
Objetivo. Estudiar in vivo la influencia de la edad y los niveles de
vitamina D en la función de la inmunidad innata y la producción de
citocinas circulantes en individuos sanos.
Material y métodos. Los niveles séricos de 25-hidroxi-vitamina D
(25-(OH)-D) se midieron en 71 individuos sanos. Las citocinas circulantes se determinaron por CBA. Las citocinas intracelulares se determinaron en células CD3+ y CD14+ por citometría de flujo. La expresión de los TLR en diferentes subpoblaciones de PBMCs y su función
tras estimulación con ligandos específicos se determinaron también
por citometría de flujo.
Resultados. Los niveles de 25-(OH)-D disminuían con la edad (r=0,399; p=0,001). La expresión de TLR7 en células B (r=-0,39; p=0,02), T
(r=-0,35; p=0,05) y monocitos (r=-0,43; p=0,01) se correlaciono negativamente con los niveles de 25-(OH)-D. La respuesta in vitro de TLR7
a agonistas específicos se correlacionó de forma significativa con los
niveles séricos de 25-(OH)-D, especialmente en individuos controles
mayores de 60 años. La expresión de TLR5 en células T (r=-0,34; p=0,04)
y TLR8 en monocitos (r=-0,37; p=0,04) también se correlaciono de forma negativa con la 25-(OH)-D. La expresión de TLR1 en células T
(r=0,32; p=0,04) y monocitos (r=0,40; p=0,01) se correlaciono con la
edad. La función de TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 y 8 se correlacionó negativamente con la edad. Los niveles de 25-(OH)-D se correlacionaron
negativamente con las citocinas pro-inflamatorias (TNF-α e IL-6) y la
citocina anti-inflamatoria IL-10. La edad se correlacionó positivamente con los niveles de citocinas pro-inflamatorias (TNF-α, IL-1β e IL6), IL-10 y la citocina Th1, IL-12.
Conclusión. Los niveles séricos de 25-(OH)-D disminuyen con
la edad y se acompañan de cambios en la expresión y función de determinados TLRs, especialmente los envueltos en respuesta viral. La edad
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y los niveles de vitamina D tienen un claro impacto en la producción
de citocinas circulantes.
*El presente trabajo está financiado por becas de: MSC-Instituto de Salud Carlos III
(PI050475 / PI080098) e IFIMAV.
VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
P-076
ANALISIS DE SNPS DEL CLUSTER DE INTERLEUCINA-1 Y
ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL. R. López-Hernandez, D. Lucas, G. Salgado, J.A. Campillo, P. Martínez-García, H. Salama, F. Boix, M. Miras, M.R. Alvarez-López, F. Carballo, M. Muro. Hospital Virgen de la Arrixaca, Murcia.
P-075
ANGIOEDEMA HEREDITARIO POR DEFICIENCIA HOMOCIGOTA DE C1-INHIBIDOR. ESTUDIOS FUNCIONALES EN UN
PACIENTE CON LA MUTACIÓN R378C REVELAN UN RESIDUO
IMPORTANTE PARA LA REGULACIÓN DE LA VÍA DE LAS CININAS. A. López Lera1, B. Favier2, C. Drouet3, M. López Trascasa1. 1Hospital Universitario La Paz. CIBERER, Madrid. 2Université J. Fourier. 3Unité d’Exploration de l’Angioedème, CHU Grenoble, Francia.
Objetivos. El angioedema hereditario por deficiencia de C1-inhibidor (HAE, OMIM#106100) es una enfermedad rara con un patrón
de herencia autosómico dominante en la que se han descrito más de
200 mutaciones heterocigotas distintas. Los únicos pacientes con deficiencia en homocigosis estudiados hasta la fecha, dos hermanos de origen consanguíneo con la mutación c.1576T>G (I440S), se caracterizaban por desarrollar un fenotipo de enfermedad inusual, con un patrón
de consumo de complemento, ausencia de C1q circulante y variabilidad clínica (Blanch et al, JACI, 2006). En el presente trabajo, describimos un paciente de HAE con la mutación c.1198C>T (R378C) en homocigosis y profundizamos en el estudio funcional y conformacional de
la proteína mutante. Así mismo, analizamos los mecanismos causantes del perfil de consumo de complemento que caracteriza a estos
pacientes homocigotos y su evolución bioquímica y clínica durante 28
meses de tratamiento con andrógenos atenuados (Stanozolol).
Métodos. El perfil de complemento se caracterizó por nefelometría, ensayos hemolíticos especíicos e inmunodifusión radial. Las alteraciones conformacionales del mutante R378C y su capacidad funcional de unión a dos de sus proteasas diana (C1s y Kalikreína), se estudiaron mediante ELISA y western blot en muestras de plasma fresco
y sobrenadantes de células Cos-7 transfectadas de forma estable. Los
niveles de expresión del gen de C1-inhibidor se analizaron por RTqPCR y la activación del sistema ubiquitina-proteasoma se cuantificó
mediante ensayos de fluorescencia con el sustrato marcado LLVY-AMC
en lisados de monocitos del paciente.
Resultados. La proteína R378C circula en plasma en una conformación parcialmente latente. El C1-inhibidor R378C tiene una capacidad normal de unión a C1s, pero muy disminuida frente a Kalikreína,
tanto en plasma como en sobrenadantes de células Cos-7. Los niveles
de mRNA del paciente están marcadamente disminuidos en PBMCs.
Los ensayos de fluorescencia demuestran una activación significativa
del sistema ubiquitina-proteasoma, lo que sugiere, junto con los datos
de expresión en células Cos-7, que existe un plegamiento anómalo y
retención intracelular de esta proteína durante su procesamiento. Además, tanto los niveles y función de C1-inhibidor, como el perfil de consumo de complemento, se recuperaron por completo tras 28 meses de
tratamiento con Stanozolol.
Conclusión. La mutación R378C en homocigosis causa un perfil
de consumo de complemento similar al descrito en otros pacientes con
mutaciones homocigotas. Esta sustitución induce una conformación
parcialmente latente que reduce de forma específica la capacidad de
unión a Kalikreína, lo que sugiere que la Arginina en posición 378 juega un papel central en la regulación de la vía de las cininas por C1inhibidor.
88
The interleukin-1 (IL-1) system epitomises the highly regulated
mechanism required for this to be achieved. Several related gene products interact with each other to adjust the response according to
cellular requirements. IL-1 signalling via the IL-1 receptor type I (IL1RI) is an important pathway in the inflammatory process, innate
immunity and the immune response. IL-1 is a potent proinflammatory cytokine involved in the pathophysiology of several inflammatory and autoimmune diseases, is important for the synthesis of
acute phase proteins, and it is a pyrogen cytokine. These physiological effects are mediated at the molecular level by the activation of
JNK and p38 MAP kinases, and consequent up-regulation of genes
via the transcription factors NF-kB, AP-1 and C/EBPb. However, the
relationship of these gene cluster polymorphisms with the immune
response in inflammatory bowel disease (IBD) patients has not been
explored. Thus, the aim of this study was to determine the relationship between IL-1 gene cluster polymorphism and the differential IBD
pathologies in a Spanish population. In this case–control study, we
evaluated 84 patients with IBD and 154 healthy subjects. The following polymorphisms were determined by luminex assay by PCRSSOP technique: IL-1alpha (-889C/T), IL-1beta (-511C/T and
+3962C/T) (rs1143634 and rs1143633), IL-1R (Pst-1 1970C/T) and IL1RA (Mspa-1 11100C/T). Furthermore, the genotypes were correlated with IBD, Crohn disease and Ulcerative Colitis pathologies. When
investigating each polymorphism separately and in conjunction, no
statistical differences in the IL-1 gene cluster genotype and allele distributions between the diagnosis groups and controls were found. In
conclusion, IL-1 gene cluster polymorphisms do not seem to be associated with IBD pathologies.
P-077
PAPEL DE LOS FACTORES DEPENDIENTES DEL HUÉSPED
(GENES HLA Y KIR) EN LA EVOLUCIÓN DE LA ENFERMEDAD
POR CMV EN PACIENTES TRASPLANTADOS DE ÓRGANO
SÓLIDO. D.M. Valero Hervas, M. Castillo Rama, R. San Juan Garrido, F. López Medrano, J.C. Meneu, J. Delgado, J.M. Morales, P. Morales Pérez, M.J. Castro Panete, J.M. Aguado, E. Paz Artal. Hospital Universitario 12 De Octubre, Madrid.
Objetivos. La infección por Citomegalovirus (CMV) es una de las
principales complicaciones tras el trasplante de órgano sólido (TOS)
incrementando la morbilidad y mortalidad y favoreciendo mayores
pérdidas de injerto. Dado que la inmunosupresión actual está dirigida a eliminar las células T efectoras la principal línea de defensa queda limitada a las células Natural Killer (NK) a través de sus receptores de superficie. Los principales receptores implicados son los Killerlike Immunooglobulin Receptors (KIR) que a través de la interacción
con sus ligandos innatos, las moléculas HLA (C, B y A), mediarán la
citolisis de las células infectadas.
El objetivo de éste trabajo ha sido establecer la influencia de los
factores genéticos dependientes del huésped, HLA y KIR, en la predisposición al desarrollo de infección o enfermedad por CMV, así como
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INMUNOLOGÍA
buscar posibles relaciones entre éstos factores y el desarrollo de complicaciones post- trasplante.
Materiales y métodos. Se incluyeron 138 receptores de órgano sólido (79 renales, 42 hepáticos y 17 cardiacos) trasplantados en nuestro
centro entre Marzo 2003 y Diciembre 2004. Se cuantificó la antigenemia CMV mediante PCR a tiempo real (Light Cycler). El perfil genético para HLA-C se obtuvo por Dot Blot Reverso (Innogenetics), mientras que el tipaje de HLA –A y –B se determinó mediante placas comerciales con anticuerpos anti-HLA monoclonales (One Lambda). Finalmente, los haplotipos KIR se determinaron mediante técnicas de PCRSSP (Invitrogen). Los resultados fueron analizados por el software
informático SPSS v.12.
Resultados. No se observaron diferencias en el desarrollo de enfermedad e infección por CMV cuando se compararon los haplotipos KIR,
aunque se observó mayor tendencia de enfermedad en aquellos con
Bx frente a los que presentaron AA. Tampoco se observaron diferencias en la comparación por número de receptores KIR totales, activadores e inhibidores.
Los diferentes perfiles genéticos no ejercieron ningún efecto en
la infección por CMV, sin embargo en el caso de enfermedad los pacientes con homocigosis para C1 presentaban mayor tendencia a presentarla con respecto a los homocigotos para C2. Se observo una relación estadísticamente significativa entre la presencia de alelos serológicos Bw4 y el desarrollo de enfermedad por CMV (OR=7.98; p= 0.05).
El análisis en función del número de interacciones de cada paciente entre su dotación de receptores KIR y de sus ligandos HLA-A, -B y
–C no reveló ninguna asociación significativa en el desarrollo de infección o enfermedad.
Por último, en trasplante hepático se observó en el límite de la significación estadística, que un mayor número de receptores KIR totales
(p=0,052) y receptores KIR activadores (p=0,054) ejercían una función protectora frente al desarrollo de enfermedad frente a CMV.
Conclusiones. La influencia en TOS de los sistemas HLA y KIR
está por determinar. Aunque no parecen ejercer de forma global un
papel protector, en el caso del trasplante hepático los resultados del
estudio indican que si podría proteger frente a la enfermedad. Además el alelo Bw4 podría considerarse como factor de predisposición a
enfermedad por CMV en éste tipo de pacientes.
P-078
IDENTIFICACION DE UN ANTICUERPO MONOCLONAL CON
ACTIVIDAD ANTI FACTOR H EN UNA PACIENTE CON ENFERMEDAD POR DEPOSITOS DENSOS. P. Nozal Aranda1, S. Aguerrevere2, M. Jozsi3, P. Sánchez-Corral1, M. Ibernon4, M. López-Trascasa1. 1Hospital
Universitario La Paz, Madrid. 2Hospital Germans Trias i Pujol. Badalona. 3Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology. Hans Knöll
Institute, Jena, Germany. 4Hospital Germans Trias i Pujol., Badalona.
Objetivos. En la enfermedad por depósitos densos (EDD) se ha
descrito una incapacidad para controlar la vía alternativa del complemento en el plasma, que puede ser debida a la presencia de autoanticuerpos frente a la convertasa de C3 (C3Nef), a la ausencia o falta de
función del Factor H (FH), o a la inactivación de este regulador del sistema del complemento por anticuerpos. Esta última causa sólo ha sido
descrita una vez en un paciente con glomerulonefritis membranoproliferativa tipo II. Aquí describimos la presencia de un autoanticuerpo
anti-FH en una paciente diagnosticada de EDD con una gammapatía
monoclonal.
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Material y métodos. En el suero de la paciente se analizaron los
niveles de inmunoglobulinas, factores del complemento (C3, C4, FH,
FI) y la presencia de anticuerpos frente a ellos mediante nefelometría
y técnicas de ELISA. Posteriormente se purificó su IgG mediante cromatografía de afinidad en columnas de Proteína G- Sepharosa. Por último se determinó la especificidad del anticuerpo y se caracterizó mediante técnicas de ELISA y Western Blot.
Resultados. La paciente presentaba un perfil de complemento
compatible con una activación de la vía alternativa, presentando al inicio cifras bajas de C3 (54 mg/dl) y normales de C4, con C3Nef negativo. Entre los hallazgos serológicos destacaban un FH muy bajo (2.7
mg/dl) y la presencia de una paraproteína monoclonal IgG-lambda.
Mediante ELISA se detectó la presencia de anticuerpos anti-FH, que
resultaron estar mediados por la fracción IgG-lambda y que parecen
reconocer la región N-terminal de la molécula (SCRs 1-7). Se detectó
también que esta IgG además tiene actividad antiplasminógeno.
Conclusiones. En esta paciente, la incapacidad para controlar la
activación del complemento se ve favorecida por la existencia de anticuerpos anti-FH, que parecen reconocer la región con actividad reguladora de esta molécula, impidiendo su función, lo que acaba provocando la aparición de la glomerulopatía de la EDD.
Los anticuerpos anti-FH han sido descritos en otras patologías,
como en el Síndrome Hemolítico Urémico atípico, en cuyo caso están
dirigidos contra el extremo C-terminal de la proteína lo que podría justificar la asociación de este anticuerpo a la EDD en esta paciente.
Existe además una actividad antiplasminógeno en la fracción IgG
de la paciente, cuya aparición podría estar relacionada con los anti-FH,
ya que numerosos patógenos poseen en su superficie proteínas que
unen ambas moléculas para evadir su eliminación por el sistema del
complemento en la respuesta inmune innata.
P-079
ANALYSIS OF LONG PENTRAXIN 3 AS A BIOMARKER IN PIGS.
E. Crisci1, L. Fraile1, S. Valentino2, M. Simon-Grifé1, G.E. Martín-Valls1,
T. Mussá1, B. Bottazzi2, A. Mantovani2, M. Montoya1. 1Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, Campus de la Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona. 2Istituto Clinico Humanitas, Rozzano, Italy.
Objective. The aim of our study was to investigate the possible
role of PTX3 as a biomarker in vivo and in vitro in pigs.
Materials and methods. For in vitro study, porcine bone marrowderived DC (poBMDC) were generated and infected with a H3N2 swine
influenza virus (A/Swine/Spain/80598-LP1/2007).
For in vivo study, sixteen conventional pig farms with history of
pleuritis lesions and cranio-ventral lung consolidation were used. Blood
from 20 randomly selected pigs from each farm was collected and
selected acute phase proteins were determined in serum. Haptoglobin
(Hp) was quantified by a spectrophotometric method (haemoglobin
binding assay) (Tridelta Development Limited, Ireland). Pig-MAP levels
were assessed with an ELISA kit (PigCHAMP ProEuropa, Spain) and
CRP was determined using a commercial immunoturbidimetric method
(Olympus System Reagent, OSR 6147). Moreover, sera from 48 conventional
sows from parity one to eight showing high swine influenza virus (SIV)
antibody titres were also used. PTX3 concentration in sera and culture
supernatant was determinate by sandwich ELISA against murine PTX3
with the following cross-reactive antibodies: 2C3 and 6B11 (Salio et al.,
2008. Circulation 117 : 1055-1064). All the statistical analysis ware
performed using SPSS 15.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
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PÓSTERS
Results. The in vitro study showed that porcine myeloid bone
marrow-derived DC produced PTX3 after infection with porcine
influenza virus H3N2.
The in vivo results have shown that PTX3 serum levels did not
correlate neither with Hp, CRP or Pig-MAP nor with lung lesions score
in conventional swine farms. PTX3 concentration in SIV antibody
positive sera of studied sows increased with the parity number showing
statistical tendency between the youngest and the oldest sows (p=0.07).
Moreover, there was no statistical correlation between SIV antibody
titres and PTX3 amount in serum.
Conclusions. The present study has shown PTX3 in vitro production
in porcine myeloid DC after SIV infection.
In vivo results have shown that PTX3 is not a good biomarker for
chronic lung lesion status in swine farms when compared with Hp and
Pig-MAP. However, PTX3 concentration in SIV antibody positive sera
correlated with a greater exposure to infections, indicating that PTX3
might be used as a biomarker under certain conditions.
*This is the first analysis of PTX3 role in pigs but future studies will further characterize
its possible implication in pathogenesis.
P-080
INFLUENCIA DE LA VARIABLIDAD GENÉTICA DE LAS PROTEINAS SURFACTANTES A1, A2 Y D EN LA SUSCEPTIBILIDAD
Y GRAVEDAD DE LA NEUMONÍA EN ADULTOS. E. Herrera
Ramos1, M.I. García Laorden1, F. Rodríguez De Castro1, J. Solé Violán1, O. Rajas Naranjo2, N. González Quevedo1, Y. Florido Ortega1,
I. Sologuren Marrero1, A.R. Domínguez Acosta1, J.A. Marcos Y Ramos3,
J.C. Rodríguez Gallego1. 1Hospital Universitario de Gran Canaria Doctor, Las Palmas de Gran Canaria. 2Hospital Universitario de la Princesa,
Madrid. 3Hospital Doctor Jose Molina Orosa, Lanzarote
La neumonía es la primera causa de mortalidad por enfermedad
infecciosa en países desarrollados. Además de las inmunodeficiencias
primarias, variantes genéticas en otros genes con menor penetrancia
pueden variar la susceptibilidad y gravedad de la enfermedad con
herencia compleja. En pulmón sano, la inmunidad innata es debida
principalmente a los macrófagos alveolares y a las proteínas surfactantes, (SP) A1, A2 y D, que actúan como opsoninas y son antiinflamatorias en ausencia de infección. Los genes de estas colectinas (SFTPA1,
SFTPA2 y SFTPD) están organizados en un cluster en 10q21-24. Los
ratones deficientes en SP-A y SP-D son muy susceptibles a la infección
respiratoria.
Objetivos. Evaluar la asociación de SNPs no sinónimos y los haplotipos SFTPA1 (6An), SFTPA2 (1An) y SFTPD con la susceptibilidad y
gravedad de la neumonía adquirida en la comunidad (NAC). Evaluar
el desequilibrio de ligamiento (LD). Evaluar el efecto de las variantes
en niveles de SP-A y SP-D.
Materiales y métodos. Se analizaron SNPs no sinónimos de
SFTPA1, SFTPA2 y SFTPD (por SSP-PCR y RFLP) en 682 pacientes adultos con NAC y en 789 controles. Se infirieron haplotipos y se calculó
el LD. Se estudió el efecto de la variabilidad genética en los niveles
séricos de SP-A y SP-D.
Resultados. El alelo SFTPD aa11-C se asoció con niveles séricos
más bajos de SP-D. No se observó asociación del genotipo con los niveles totales de SP-A. Tras correción de Bonferroni, los haplotipos SFTPA1
6A2 (OR=0,78; p=0,0009), SFTPA2 1A0 (OR=0,79; p=0,0017), SFTPA1SFTPA2 6A2-1A0 (OR=0,77; p=0,0005) y SFTPD- aa11-C-(6A2-1A0)
(OR=0,65; P=0,00001) se asociaron a un efecto protector frente a NAC,
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VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
mientras que SFTPA2 1A10 (OR=6,58; p=0,00007) y SFTPA1-SFTPA2
6A3-1A (OR=3,92; p=0,00065) predisponen a NAC.
Los haplotipos 1A10 y 6A-1A se asociaron con mayor mortalidad
(a los 28 y 90 días), y con fracaso multiorgánico (FMO) y síndrome
de distrés respiratorio agudo (SDRA) respectivamente. SFTPD aa11-C
se asoció con el desarrollo de FMO y SDRA.
Conclusión. Este es el primer estudio de variabilidad de SP-A1,
A2 y D en neumonía. Algunas variantes genéticas de SFTPA1, SFTPA2
y SFTPD se asocian significativamente con la susceptibilidad y la gravedad de la NAC.
P-081
UNA DIETA MUY BAJA EN CALORÍAS ANTES DE LA CIRUGÍA
BARIÁTRICA PUEDE MEJORAR LOS PARÁMETROS INFLAMATORIOS Y LA RESISTENCIA A INSULINA UNA DIETA MUY
BAJA EN CALORÍAS ANTES DE LA CIRUGÍA BARIÁTRICA PUEDE MEJORAR LOS PARÁMETROS INFLAMATORIOS Y LA
RESISTENCIA A INSULINA. S. Calleja Antolín, R. Díez Rodríguez,
M. Ballesteros Pomar, A. Calleja Fernández, N. Aller, M. Sánchez Salazar, O. Del Árbol Del Árbol, C. Cuellas, J.L. Olcoz Goñi, A.I. De Castro Rodríguez, J.M. García Ruiz. Hospital de León, León.
Objetivos. Evaluar la influencia de una dieta muy baja en calorías en pacientes obesos que van ser sometidos a cirugía bariátrica, sobre
diversos parámetros inflamatorios que han sido involucrados en el
desarrollo del síndrome metabólico de resistencia a insulina.
Material y métodos. Se incluyó prospectivamente a 45 pacientes
en espera de cirugía bariátrica. Todos fueron sometridos a una dieta
muy baja en calorías durante seis semanas antes de la cirugía. Se estudiaron antes y después de la dieta los siguientes parámetros: peso,
HOMA, circunferencia en la cintura, CRP, IL1b, IL6, IL8, IL10, IL12,
TNF-α, MCP 1, IP10, Resistina y Leptina (CBA Becton Dickinson, ELISA R&D).
Las variables cuantitativas fueron comparadas por el test de T-Student para muestras pareadas.
Resultados. La media de eda fue de 44 años (des viación estándar:
10,3), el 78% de los sujetos fueron mujeres.
La tabla 1 muestra los cambios estadísticamente significativos tras
la dieta muy baja en calorías (VLCD). No se encontró significación
en los valores de IL1b, IL6, IL8, IL10, IL12, TNF-α, y resistina.
Tabla 1. (p<0,05)
Peso (kg)
BMI (kg/m2)
P. cintura (cm)
HOMA
MCP 1 (pg/ml)
IP10 (pg/ml)
Leptina (pg/ml)
CRP
Antes VLCD
Después VLCD
121,8 (16,8)
46 (5)
130, 3 (13)
6,1 (3,9)
437,4 (411)
1324,2 (824,6)
79453,6 (48509,8)
10,4 (9,1)
113 (16,6)
42,6(4,58)
123,7 (11,9)
3,9 (4,2)
1172 (966,53)
356,7 (259,4)
50796,1 (37506,2)
7,9 (6,6)
Conclusión. Una dieta muy baja en calorías antes de la cirugía
bariátrica puede ser útil para modificar algunos parámetros inflamatorios, pudiendo mejorar la Resistencia a la insulina. Los efectos a largo plazo de la dieta muy baja en calorías, sumada a la cirugía bariátrica deben ser evaluados en posteriores estudios.
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INMUNOLOGÍA
P-082
ANÁLISIS DE CÉLULAS EPITELIALES Y LINFOCITOS INTRAEPITELIALES EN PACIENTES CON SÍNDROME DE OJO SECO. R.
Reinoso1, M. Calonge1, E. Castellanos1, M. Martino1, I. Fernández1, A.
Corell2. 1IOBA-Universidad de Valladolid, Valladolid. 2Universidad de Valladolid, Valladolid.
Objetivo. Caracterizar fenotípica y funcionalmente células epiteliales conjuntivales y linfocitos intraepiteliales obtenidos mediante
técnicas mínimamente invasivas en pacientes con síndrome de ojo seco.
Material y métodos. Las células conjuntivales fueron obtenidas
mediante citología por cepillado en 23 pacientes diagnosticados de ojo
seco de tipo evaporativo. La recolección de las células de la superficie ocular fue realizada antes y después de que los pacientes fueran
sometidos durante dos meses a un tratamiento anti-inflamatorio tópico. Además, se analizaron 17 individuos sanos para realizar el análisis comparativo con la población enferma. Se realizaron diferentes ensayos mediante citometría de flujo para determinar el fenotipo de las
células epiteliales y los subtipos de linfocitos intraepiteliales (IELs) presentes, la viabilidad y/o etapa apoptótica y el ciclo celular de las muestras obtenidas.
Resultados. La viabilidad celular del epitelio conjuntival fue notablemente inferior en los pacientes de ojo seco que en los individuos
sanos. Además, se observó un descenso significativo de IELs CD4+ y
de la proporción CD4/CD8 en los pacientes de ojo seco después del
tratamiento anti-inflamatorio. La capacidad proliferativa del epitelio
conjuntival fue significativamente menor en los pacientes de ojo seco
que en los sujetos sanos.
Conclusiones. Las células epiteliales conjuntivales obtenidas
mediante citología por cepillado de pacientes de ojo seco de tipo evaporativo presentan diferente viabilidad, apoptosis y capacidad proliferativa que las obtenidas de sujetos sanos. Después de 2 meses de tratamiento, las células CD8+ incrementaron mientras que las células
CD4+ y la proporción CD4/CD8 disminuyeron, demostrando la naturaleza inflamatoria de esta patología ocular.
P-083
ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE SLAMF8 EN MACRÓFAGOS
HUMANOS Y DE RATÓN. L. Calvache, D. Rojas, M. Alemán, F. Abadía-Molina, A.C. Abadía-Molina. Universidad de Granada, Armilla.
Objetivo. Las moléculas de la familia de SLAM (signaling
lymphocyte activation molecule, SLAM) consiste en nueve miembros,
SLAMf1-9, que se vienen describiendo como moléculas de adhesión
con un papel fundamental en la modulación de la respuesta inmunitaria específica e innata. SLAMf8 es uno de los miembros de la familia descrito más recientemente y que se expresa principalmente en leucocitos humanos. Previamente, se ha observado que la expresión de
SlAMf8 aumenta en células mononucleares humanas CD14+ con INFγ
y disminuye tras ser estimuladas con LPS. Nosotros hemos querido
analizar la expresión de SLAMf8, en células humanas y macrófagos de
ratón con distintos estímulos, con objeto de determinar si se repite en
este patrón.
Métodos. Distintas líneas celulares humanas y de ratón han sido
estimuladas con bacteria, LPS y PMA. La Expresión de BLAME ha sido
analizada mediante RT-PCR y mediante anticuerpos monoclonales.
También analizamos la expresión de SLAMf8 en distintos tejidos de
ratón mediante RT-PCR.
PÓSTERS
Resultados. De acuerdo con lo descrito previamente por Kingsbury et al, (2001) hemos observado que SLAMf8 se expresa en monocitos y macrófagos humanos cuando estos son estimulados con INFγ,
aunque al contrario que éstos vemos que la expresión de SLAMf8
también aumenta una vez son estimulados con LPS o PMA. De acuerdo con lo observado en humanos, en líneas monocíticas de ratón y
macrófagos derivados de peritoneo la expresión también aumenta
cuando son estimulados, tanto con bacteria como en presencia de LPS
o PMA.
Conclusión. Estos resultados indican que la expresión de SLAMf8
varía en función del estado de activación o reposo del macrófago, y
sugiere por tanto que este receptor tiene una función relevante en las
funciones inmunitarias de los macrófagos, tanto en células humanas
como de ratón.
P-084
MOUSE S5D-SRCRB, A NEW MULTIFUNCTIONAL RECEPTOR
INTERACTING WITH MICROBIAL AND ENDOGENOUS STURCTURES. C. Miró Julià1, S. Roselló2, D.F. Rosenbek Finkfink3, C. Escoda Ferran1, C. Vázquez-Echeverría4, C. Pujades4, A. García-Pardo5,
C. Serra-Pagès2, U. Holmskov3, J. Yélamos6, F. Lozano2. 1Fundació Clínic per a la Recerca Biomèdica, cardedeu. 2Hospital clínic de Barcelona,, Spain.
3Institute of Molecular Medicine, Denmark. 4Departament de Ciències Experimentals i de la Salut. 5Centro de Investigaciones Biológicas (CIB-CSIC).
6Hospital del Mar, Barcelona.
The members of the Scavenger Receptor Cysteine-Rich Superfamily
(SRCR-SF) are transmembrane and/or secreted proteins exhibiting one
or several repeats of a well-defined and conserved cysteine-rich protein
module of ~100-110 aa, named SRCR. Two types of SRCR domains
(A or B) have been reported, which exhibit similar core structure but
differ in the number of exons coding for each domain and the number
of intradomain cysteines. Although no unifying function has been
reported for the SRCR-SF members, recognition of pathogen-associated
molecular patterns has been recently shown for some of them. A new
member of the group B of SRCR-SF, mouse S5D-SRCRB (soluble 5
domains of SRCR type B), has been structural and functional characterized.
The gene encodes a mature protein with a predicted Mr of 144.6 kDa,
and encompassing 5 group B SRCR domains (interspersed by Pro-SerThr-rich sequences) and 1 Syndecan-like C-terminal region. Using an
episomal mammalian expression system (pCEPPu/HEK293-EBNA),
a N- and O-glycosylated soluble recombinant form of >200 kDa, was
obtained and used as immunogen for the generation of specific rat
mAbs. Subsequent immunohistochemical and real-time RT-PCR analyses
showed significant S5D-SRCRB expression in genitourinary and digestive
tract. Interestingly, s5d-srcrb mRNA was detected in placodes (a
thickening structure in the embryonic epithelial layer where some
organs or structure later develops) at 9 dpc (days post coitum). Additionally,
S5D-SRCRB was found to bind to some extracellular matrix components
(Fibronectin, Laminin) and Galectin-1, a lectin-type sugar-binding
protein. On the other hand, S5D-SRCRB was also shown to bind to
structural components on the surface of several fungi (β-glucans), and
Gram-negative (LPS) and Gram-positive bacteria (peptidoglycan), and
to induce fungal and bacterial aggregation as well. The binding abilities
together with a restricted tissue expression pattern in adults and embryos
suggest S5D-SRCRB might subserve different functions related to innate
defence and homeostasis of epithelial surfaces, as well as differentiation
and developmental processes.
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P-085
ESTUDIO SECUENCIAL DE LOS MACRÓFAGOS PULMONARES
EN LA IBR Y SU IMPLICACIÓN EN LA PATOGENIA DE LA
ENFERMEDAD. M.Á. Risalde Moya1, V. Molina Hernández1, M. Pedrera Mazarro1, P.J. Sánchez Cordón1, A. Moreno Parra2, J.C. Gómez Villamandos2. 1Universidad de Córdoba, Córdoba. 2Laboratorios HIPRA.
El herpesvirus bovino tipo-1.1 (HVB-1.1) es el agente causal de
la rinotraqueitis infecciosa bovina (IBR), una de las enfermedades víricas de mayor incidencia a nivel mundial en el ganado bovino, ocasionando elevados costes de producción en esta especie. La infección
con este virus afecta sobre todo al tracto respiratorio superior, siendo
la implicación directa del HVB-1.1 en las lesiones pulmonares objeto
de discrepancia. Así, el objetivo de este trabajo fue determinar los cambios cuantitativos y biosintéticos que se producen en los macrófagos
pulmonares de animales inoculados experimentalmente con HVB-1.1.
Para ello, 8 terneros fueron inoculados intranasalmente con la cepa
Iowa del HVB-1.1 y sacrificados en grupos de dos a los 2, 4, 7 y 14 días
post-inoculación (dpi). Asimismo, 2 animales control se inocularon con
medio estéril y se sacrificaron al final del experimento. Las muestras
de pulmón fueron procesadas de forma rutinaria para su estudio histopatológico e inmunohistoquímico (MAC387, TNFα e IL-1α).
Las lesiones histopatológicas observadas en el pulmón de los animales inoculados con HVB-1.1, se caracterizaron por la presencia de
intensos cambios vasculares como congestión, edema o hemorragias,
así como por el engrosamiento de los septos interalveolares y la aparición de un infiltrado de tipo mixto desde el inicio de la experiencia.
El estudio inmunohistoquímico reveló un incremento en el número de macrófagos pulmonares alveolares desde el inicio del proceso,
población que actúa como primera línea de defensa frente a patógenos
aerógenos. Este incremento se vio acompañado de una mayor expresión
de IL-1α por parte de las distintas poblaciones de macrófagos pulmonares, que podría tener un efecto sinérgico con la expresión de TNFα.
Así, los cambios inflamatorios observados en este órgano ocurrirían como resultado de la expresión de citoquinas proinflamtorias por
los macrófagos pulmonares, dando lugar a un incremento de la permeabilidad vascular y adhesión de las células inflamatorias que migran
por quimiotaxis al pulmón. Este hecho podría ser importante para la
rápida instauración de una protección local en estadios tempranos
de la infección, previniendo así la colonización de este órgano por el
virus. Además, el papel que los niveles de citoquinas proinflamatorias
expresadas localmente pueden jugar en la respuesta de fase aguda sistémica debe ser estudiado en trabajos posteriores.
P-086
EVALUATION OF ANTINUCLEAR RO/SS-A AND LA/SS-B ANTIBODIES BY MULTIPLEX TECHNOLOGY AT THE UNIVERSITY
HOSPITAL "12 DE OCTUBRE" (MADRID-SPAIN). M. Talise Astier,
V. Pérez Aradas, S. Lermo, M. Sevilla, E. Pérez Aradas, L. Borque, A.
Serrano. Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid.
Introduction. Autoantibodies to Ro/SS-A and La/SS-B
ribonucleoproteins are found in autoimmune diseases such as primary
Sjögren´s syndrome, systemic lupus erythematousus and rheumatoid
arthritis1. Two types of anti-Ro/SSA antibodies have been described,
anti-SSA-52 kDa and anti-SSA-60kDa, historically, these autoantibodies
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VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
were considered as a uniform autoantibody-system. However, recent
studies provided evidence that Ro60 and Ro52 are not part of a stable
macromolecular complex and that anti-Ro52 and anti-Ro60 (SS-A)
antibodies have different clinical associations and each specific to
different antigens2, for this reason it is necessary to be able to individually
identify these antibodies in the laboratory of autoimmunity and the
automated system Bioplex TM 2200 offers this advantage; we compare
this technique with the immunofluorescence (IIF) and AtheNA Multilyte® ANA test system a multiplex fluorescent microsphere immunoassay
for the semi-quantitative of Ig G class antibody to 9 separate analytes
(DNA, SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Centromere B, and Histone).
Methodology. We studied sera from 600 patients randomly admitted
to the autoimmunity section during May and June 2009. Antinuclear
antibodies (ANA´s ) were determined by immunofluorescence (IIF) on
HEp-2 cell, Athena-Luminex, a multiplex technique that detects 9
different antibodies simultaneously and BioPlex™2200 (by Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA) a fully automated Luminex-based system
developed for analysis of 13 antibodies including anti-SSA-52 kDa and
anti-SSA-60 kDa in a primary tube and SS-B, Sm, Sm/RNP, RNPA,
RNP-68, Scl70, Centromere-B, dsDNA, chromatin, Jo1, ribosomal P.
Results. 33 sera were positive to anti-SSA-52; 42 anti-SSA-60,
and 17 anti-La/SS-B by Bioplex 2200; 37 sera were positive to anti SSA and 11 anti-La/SS-B by Athena-Luminex, with a global concordance
of 96.5% and 98.33% respectively; by IIF we obtained 48 positive
sera, 25 (52.08%) with coarse and fine speckled pattern, 18 (37.50%)
homogeneous, 2 (4.20%) Centromere-B, 2 (4,20%) Nuclear dots. Finally,
80.70% of the patients had at least one diagnosis of autoimmune disease.
Conclusions. We conclude that BioPlex2200 offers a good percentage
of concordance with other methods, and can be a good solution as a
multiplex approach to diagnose autoimmune diseases like Sjögren´s
syndrome, systemic lupus erythematousus and rheumatoid arthritis
because the separation of Ro / SSA 52 and 60 antigens conferred
increased sensitivity.
SESIÓN 7: CÉLULAS DENTRÍTICAS
Moderadores: Alberto Varas (Madrid)
David Sancho (Madrid)
P-087
EFECTO DE WNT5A SOBRE LA DIFERENCIACIÓN DE LAS
CÉLULAS DENDRÍTICAS CONVENCIONALES DERIVADAS DE
PROGENITORES CD34+ DE SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL.
J. Valencia Mahón1, V. García Martínez1, L. Hidalgo Lumbreras1, A.
Entrena Martínez1, A. González Zapata2, C. Henández López1, A. Vicente López1, A. Varas Fajardo1, R. Sacedón Ayuso1. 1Facultad de Medicina, UCM, Madrid. 2Facultad de Biología, UCM.
Objetivos. La familia de proteínas de secreción Wnt ha sido implicada en diversos fenómenos biológicos relacionados con el desarrollo y la diferenciación, tales como la determinación de los diferentes
destinos celulares, la proliferación de células progenitoras, el establecimiento del eje dorsal y el control de la división celular asimétrica.
Diferentes trabajos muestran como los ligandos Wnt participan en el
mantenimiento de los precursores hematopoyéticos humanos regulando su diferenciación, expansión y supervivencia. En el presente estu-
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dio analizamos el efecto de Wnt5a, ligando Wnt no-canónico, sobre la
diferenciación de las células dendríticas convencionales (cDC) humanas producidas a partir de progenitores CD34+ procedentes de sangre
de cordón umbilical (CBCD34+).
Material y métodos. Los progenitores CBCD34+ fueron obtenidos
mediante selección positiva por separación inmunomagnética y utilizados para el establecimiento de cultivos en suspensión dirigidos a la
producción de cDC (8 días en presencia de SCF, FLT3L y GMCSF seguidos de un periodo de 4 días en presencia de GM-CSF e IL-4), a los que
se adicionó o no la proteína Wnt5a. Los intermedios de diferenciación
CD34-CD1a- CD14- y CD14+ CD1a- fueron aislados a partir de estos
cultivos mediante sorting. El fenotipo y supervivencia de las células
recuperadas fueron analizados por citometría de flujo.
Resultados y conclusiones. La adición de Wnt5a a los cultivos de
progenitores CBCD34+ reduce significativamente el número de cDCs
(CD14-CD1a+HLA-DR+CD11c+) recuperadas produciéndose, por el
contrario, un número mayor de células CD14+CD1a- que, tras la adición de IL-4, no diferencian a células CD14-CD1a+. Es más, las cDCs
recuperadas a partir de los cultivos tratados con Wnt5a muestran importantes cambios en los niveles de expresión de moléculas coestimuladoras, esenciales para la función de las cDCs. Estos resultados sugieren que Wnt5a ejerce un efecto negativo sobre la diferenciación de
los progenitores CBCD34+ hacia cDCs.
Se observa un aumento de la producción de interleucina 10 en las DCs
tratadas con 1,25(OH)2-D3 y 9cRA con respecto a las células control.
Conclusiones. Los resultados obtenidos en este trabajo muestran
cómo el 9cRA potencia el efecto tolerogénico de 1,25(OH)2-D3 en las DCs
derivadas de monocitos. Por lo tanto, el uso de estos fármacos inmunosupresores podrían modular la actividad de las DCs en el tratamiento de
enfermedades autoinmunes y mejorar el rechazo en los trasplantes.
P-088
Objetivos. La transmisión madre-hijo durante el embarazo es un
modelo único para el estudio de correlación entre el fenotipo HLA y
la susceptibilidad a la infección por VIH. Se ha estudiado dicha relación en un grupo de parejas madre/hijo en la población española.
Material y métodos. Se han determinado las frecuencias de alelos
HLA de clase I y clase II de 120 niños nacidos de madres infectadas
por el VIH, y de 67 madres infectadas por métodos standard. Aunque
se han encontrado diferencias en la frecuencia de HLA-B35 entre madres
transmisoras y no transmisoras, el alelo fue también significativamente
más frecuente en niños infectados que en no infectados. HLA-B35 ha
sido considerado como un factor de riesgo para la progresión del SIDA
en nacidos de madres VIH positivas. Además, se ha propuesto que si un
determinado alelo puede conferir susceptibilidad hacia, o protección
contra dicha progresión depende del patrón de herencia materna frente a la paterna, ya que el niño hereda un virus que refleja la historia de
los encuentros de células T citotóxicas de la madre.
Resultados y conclusiones. Nuestros resultados en la transmisión vertical del HIV combinan por vez primera las teorías de “la desventaja HLA-B35” y “patrón de herencia” y además sitúan el factor de
susceptibilidad HLA en el haplotipo B35-CW4-DR4 mas cerca del locus
HLA-DRB1 que del locus HLA-C.
EFECTO DE LA COMBINACIÓN DE ÁCIDO RETINOICO Y VITAMINA D3 EN LA FUNCIÓN DE CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE MONOCITOS. I. Luque Llarena1, R. Atencia Arruti1, N.
Maruri Machado1, Á. Prada Iñurrategi2, A. Arrieta Gutiérrez1, M. Riñón
Martínez-Gallo1, S. Larrucea Bilbao1. 1Hospital de Cruces, Barakaldo, Bilbao. 2Hospital Donostia, San Sebastian.
Objetivos. Obtener células dendríticas (DCs) inmaduras tolerogénicas a partir de monocitos de sangre periférica para aplicarlas al
tratamiento de enfermedades autoinmunes y al rechazo de los trasplantes. Una las estrategias para promover la tolerogenicidad de las
células es el uso de fármacos que suprimen la maduración de las DCs.
Hemos valorado el efecto potenciador del ácido 9-cis retinoico (9cRA),
uno de los metabolitos activos de la vitamina A, cuando se combina
con 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2-D3), el metabolito activo de
la vitamina D3.
Metodología. Obtención de DCs: las células mononucleares de
sangre periférica se obtuvieron mediante centrifugación en gradiente
de Ficoll. Posteriormente se aislaron los monocitos mediante selección
negativa y se derivaron a DCs en cultivo con interleucina 4 y factor
estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos durante 7 días
en presencia o ausencia de las hormonas analizadas. Finalmente se
indujo la maduración de las DCs con factor de necrosis tumoral, interleucina 1 beta, interleucina 6 y prostaglandina E2 durante 48 h.
Fagocitosis. Las DCs se incubaron con dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína y se analizaron por citometría de flujo.
Adhesión. las células adheridas a placa se fotografiaron mediante un microscopio óptico invertido.
Cuantificación de IL-10. se realizó en los sobrenadantes de los cultivos de las células mediante ELISA.
Resultados. La capacidad fagocítica de las DCs tratadas con 1,25(OH)2D3 se potencia por la adición de 9cRA. La combinación de ambas hormonas aumenta sinérgicamente la extensión y adhesión a placa de las DCs.
SESIÓN 8: INMUNODEFICIENCIAS I
Moderadores: Manel Juan (Barcelona)
Margarita López Trascasa (Madrid)
P-089
HLA-B35-CW4 AUMENTA TANTO LA TRANSMISIÓN VERTICAL
DEL VIH COMO SU PROGRESIÓN. A. Arnaiz-Villlena1, J. Martínez-Laso2, J.M. Martin-Villa2, D. Rey1, P. Gomez-Prieto1, C. PargaLozano1, N. Martínez-Quiles1. 1Departamento de Inmunología, Facultad
de Medicina, Universidad Complutense. Centro de Transfusiones de la CAM,
Madrid. 2Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad
Complutense, Madrid.
P-090
ESTUDIO GENÉTICO DE UNA FAMILIA CON AGAMMAGLOBULINEMIA LIGADA AL CROMOSOMA X Y EXPRESIÓN POSITIVA DE BTK. APLICACIÓN AL DIAGNÓSTICO PRENATAL. C.
Abad Molina1, A.J. Álvarez Márquez1, G. Pérez Pérez2, M. Navarro2,
C. Guzmán Espinosa1, J.M. Lara Ruiz1, C. Morales Galán1, A. Núñez
Roldán1, B. Sánchez Sánchez1. 1HHUU Virgen del Rocío, Sevilla. 2HU Virgen Macarena, Sevilla.
Introducción. La ausencia de expresión de btk suele ser la principal causa fenotípica de la agammaglobulinemia ligada al cromoso-
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ma X, aunque en un número minoritario de casos encontramos expresión de btk no funcional. Es importante profundizar en el estudio de
los pacientes con déficit de anticuerpos, ya que existe una base genética conocida para la enfermedad y se halla ligada al cromosoma X. En
este sentido, se pueden identificar posibles portadoras, nuevos casos
en las fases iniciales así como poder ofrecer un consejo genético.
Objetivo. Establecer las bases genéticas en un paciente con expresión positiva de btk, ausencia de células B y agammaglobulinemia, y
estudiar a su familia.
Material y Métodos. Caso índice (P1): Se estudió a un varón de
23 años con cuadro clínico sugerente de enfermedad de Bruton desde que tenía un año de edad, que presentaba infecciones de repetición y niveles muy reducidos de inmunoglobulinas. Por citometría
de flujo se estudiaron las subpoblaciones de linfocitos y la expresión
de btk, detectándose ausencia de linfocitos B y expresión positiva de
btk. Se comenzó a secuenciar el gen btk. Posteriormente, un sobrino del caso índice (P2) de 2 años presentaba infecciones respiratorias
de vías altas y bajas desde los primeros meses de vida. En su estudio
presentó un fenotipo idéntico al del caso índice. Secuenciamos los 19
exones del gen btk, comenzando por aquellos con mutaciones descritas en la bibliografía que conllevan a la expresión de una btk no
funcional.
Resultados. Encontramos en P1 y P2 una mutación descrita: R520Q
en el exón 15 del gen btk, y establecimos el estatus de portadoras en la
familia. Mediante el análisis por secuenciación de la mutación R520Q
en el ADN extraído de las vellosidades coriónicas, encontramos dicha
mutación en el feto varón de la madre de P2.
Conclusión. La identificación del caso genético subyacente en el
síndrome de Bruton permite la confirmación diagnóstica en pacientes
sin antecedentes familiares para dicha inmunodeficiencia, permite la
detección del estado de portadora y descartar a las no portadoras, dato
indispensable para realizar un consejo genético adecuado, y posibilita la realización de diagnostico prenatal.
P-091
USO DOMICILIARIO DE GAMMAGLOBULINA INTRAVENOSA EN PACIENTES CON DEFICIENCIA DE ANTICUERPOS. J.
Carbone Campoverde, N. Del Pozo Rodríguez, C. Chean Pacheco, J.
Rodríguez Molina, J. Navarro Caspistegui, C. Esteban, E. Sarmiento
Marchese. Hospital Gregorio Marañon, Madrid.
El uso domiciliario de gammaglobulina intravenosa (GGIV) para
la terapia sustitutiva de pacientes con deficiencias de anticuerpos es
práctica habitual en distintos países europeos como Suecia e Inglaterra. En España no hay experiencia previa con la administración a
domicilio de GGIV. Describimos datos inmunológicos y la prevalencia de reacciones adversas en una serie corta de pacientes con deficiencia de anticuerpos que reciben terapia con GGIV en el domicilio.
Pacientes y Métodos. 3 pacientes (2 con hipogammaglobulinemia IgG secundaria a LLC y neumonía recurrente y 1 con inmunodeficiencia variable común) pasaron de recibir la GGIV en el hospital a
su administración en el domicilio a petición propia. La media de IgG
en el momento del diagnóstico de deficiencia de anticuerpos fue de
161 (rango 35-300) mg/dl. El tiempo medio de administración de GGIV
previa en el hospital fue de 62 (rango 3-180) meses. Ninguno de los
pacientes había tenido reacciones adversas moderadas o graves previas. Preparado de GGIV: Concentración al 5%, líquida, pasteurizada,
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no precisa mantener cadena de frío y puede almacenarse a temperatura ambiente. Velocidad de infusión: 0,01-0,04 ml/kg/min. Las infusiones fueron realizadas por personal de enfermería. No se utilizaron
bombas de infusión. La prescripción y dispensación del hemoderivado así como los controles clínicos periódicos de los pacientes se hicieron en el hospital.
Resultados. El tiempo de seguimiento durante la administración domiciliaria de GGIV ha sido de 26 (rango 7-61) meses. Durante
el seguimiento ninguno de los pacientes experimentó reacciones adversas moderadas o graves. La media de concentración de IgG durante la
fase domiciliaria de tratamiento fue de 716 mg/dl. De un total de 126
infusiones realizadas, la prevalencia de reacción adversa fue de 1,59%:
febrícula post-infusión (n=2). La periodicidad de las infusiones (cada
2-3 semanas) pudo ajustarse mejor que en el hospital al no depender
de la disponibilidad de plazas en los hospitales de día. Los pacientes
continúan recibiendo sus infusiones de GGIV en el domicilio. Se ha
estimado un ahorro para el SNS de 12000 euros derivado de la no utilización del hospital de día para la administración de GGIV en estos
pacientes.
Conclusión. La administración de GGIV en el domicilio fue una
práctica segura en una serie corta de pacientes con deficiencia de anticuerpos.
SESIÓN 9: INMUNODEFICIENCIAS II
Moderadores: Nuria Matamoros (Palma de Mallorca)
Jose Ramón Regueiro (Madrid)
P-092
EL POLIMORFISMO C.657C>T EN EL EXÓN 3 DEL GEN CIAS1
NO SE ENCUENTRA ASOCIADO A NOMID (NEONATAL-ONSET
MULTISYSTEM INFLAMMATORY DISEASE). J. Reiné Gutiérrez1, A.
Torrelo2, J.C. López-Robledillo2, E. Martínez Busto1, M. Muñoz-Ruíz1,
B. Garcillán1, J.R. Regueiro1, D. Gurbindo2, M.J. Recio Hoyas2. 1Facultad de Medicina Universidad Complutense, Madrid. 2Hospital Universitario
Gregorio Marañón, Madrid.
Introducción. La enfermedad neonatal multisistémica inflamatoria (NOMID) se caracteriza fundamentalmente por exantemas cutáneos e inflamación articular que se manifiestan en la mayoría de los casos
durante los primeros meses de vida. La mayor parte de las mutaciones identificadas se encuentran en el exón 3 del gen CIAS1, que codifica para el dominio central de la criopirina, implicado en la regulación de las vías proinflamatorias, caspasa-1/IL-1b y NK-κβ. La desregulación de estas vías da lugar al desorden inflamatorio sistémico
que presentan la mayoría de los pacientes diagnosticados.
Caso clínico. Presentamos un caso clínico de un paciente con 14
años de edad diagnosticado de un posible NOMID, con una historia clínica de lesiones lesiones máculo-papulosas y eritematosas, signos inflamatorios en articulaciones interfalángicas y numerosos episodios de poliartritis de grandes articulaciones (rodillas, manos y
pies) en los primeros meses de vida. Analíticamente desde el comienzo del cuadro clínico ha presentado anemia hemolítica hipocrómica, leucocitosis y trombocitosis con reactantes de fase aguda elevados. El tratamiento con AINES y corticoides no ha dado buenos resultados.
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INMUNOLOGÍA
Resultados. El análisis molecular realizado en el paciente, utilizando oligonucleótidos específicos del exón 3 del gen CIAS1, revela
un cambio en heterocigosis de C>T en la posición 657 (c.657C>T), que
no da lugar a cambio de aminoácido, éste no se encuentra presente en
la madre ni el resto de controles estudiados. Por otro lado, el análisis
de las subpoblaciones linfocitarias en el paciente, utilizando anticuerpos monoclonales específicos, muestra una leve linfopenia TCD8+.
Conclusiones. Los resultados obtenidos sugieren que aunque el
polimorfismo c.657C>T encontrado en el exón 3 del gen CIAS1 no es
responsable de esta patología, no se puede descartar que existan mutaciones en el resto de exones no estudiados.
P-093
SÍNDROME DE GOOD: CASO CLÍNICO DE UN PACIENTE CON
TIMOMA Y AUSENCIA DE LINFOCITOS B.N. Olivares Beobide1,
N. Maruri Machado1, M. Riñón Martínez-Gallo1, A. Pacho De Lucas1,
C. Martínez Bilbao2, C. Esteban González2, M.D. De Juan Echavarri3, A. Arrieta Gutiérrez1. 1Hospital de Cruces, Bilbao. 2Hospital de Galdácano, Galdácano. 3Hospital Donostia, San Sebastián.
Objetivos. Presentar el caso de un paciente con hipogammaglobulinemia, pancitopenia y antecedentes de timoma intervenido, en el
que se sospecha un síndrome linfoproliferativo y se diagnostica una
inmunodeficiencia.
Caso clínico. Varón de 63 años, con antecedentes mórbidos de
sinupatía crónica y bronquiectasias. Intervenido de timoma en enero
de 2009. Controlado por neumólogo por reagudizaciones infecciosas
que requieren ingreso hospitalario, el último por empiema con derrame pleural. Microbiología de líquido pleural y hemocultivos positivos
para Morganella Morganii. La analítica objetivó anemia y leucopenia.
El proteinograma mostró hipoalbuminemia e hipogammaglobulinemia. Serología para VHB, VHC y VIH negativa. Tras resolución del
cuadro agudo se realizó estudio inmunológico para descartar un síndrome linfoproliferativo.
Material y métodos. Se ha realizado el inmunofenotipo de sangre periférica (SP) y médula ósea (MO) al diagnóstico, y SP tras tratamiento sustitutivo con gammaglobulina, caracterizando las subpoblaciones linfocitarias, incluída la exclusión de cadena ligera de los linfocitos B. Otros estudios inmunológicos: reordenamientos JH y TCR por
PCR-SSP para estudio de clonalidad B y T; recuento absoluto de leucocitos y linfocitos; cuantificación de inmunoglobulinas y subclases;
valoración de autoanticuerpos; pruebas funcionales: test de transformación linfoblástica y cuantificación de anticuerpos frente a haemophilus, neumococo y tétanos.
Resultados. Al diagnóstico, en la muestra de SP se constató una
leucopenia y una ausencia de linfocitos B, así como una relación
CD4/CD8 invertida en linfocitos T. En muestra de MO el porcentaje
de linfocitos B CD19+ fue un 0,05% respecto al total de linfocitos (18%),
con cadena ligera de superficie de carácter policlonal.
Conclusiones. El inmunofenotipo por CF es útil para la detección
y monitorización de la inmunodeficiencia y el posible desarrollo de un
linfoma no Hodgkin en pacientes con timoma.
Los parámetros prácticos para el diagnóstico y manejo de las inmunodeficiencias primarias de 2005 definen el síndrome de Good como
un subtipo de inmunodeficiencia variable común.
El bajo porcentaje de linfocitos B e incluso su ausencia en pacientes adultos con antecedentes de timoma sugieren el diagnóstico de síndrome de Good.
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P-094
NUEVA MUTACIÓN COMPLEJA DEL GEN WAS EN PACIENTE
CON SINDROME DE WISKOTT-ALDRICH. V. Daza Cajigal1, N.
Martínez-Pomar1, S. Torres2, K. Vega2, A. Iglesias1, M.R. Juliá1, J.A.
Salinas1, I. Molina1, D. Heine-Suñer1, J. Rosell1, N. Matamoros1. 1Hospital Universitario Son Dureta, Palma De Mallorca. 2Universidad De Granada, Granada.
El síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) es un trastorno recesivo
ligado al cromosoma X, que se caracteriza por la presencia de trombocitopenia, eccema y diferentes grados de inmunodeficiencia. Se origina por mutaciones en el gen WAS, ubicado en la región Xp11.22-23,
que codifica la proteina WASp implicada en los procesos de formación
y reorganización del citoesqueleto de las células hematopoyéticas. Existe una correlación genotipo-fenotipo que relaciona la severidad de las
manifestaciones clínicas con la ausencia de expresión de la proteína
WASp.
Materiales y métodos. Extracción de ADN genómico de sangre
periférica y análisis mutacional de los exones del gen WAS con primers
específicos por secuenciación directa del DNA. Estudios de expresión
de RNA mediante RT-PCR. Estudio de expresión proteica de WASp
mediante técnica de Western blot.
Resultados. Se presenta el primer caso de un paciente afecto de
Síndrome de Wiskott-Aldrich debido a una mutación compleja de novo,
con probable traslocación de un segmento de 5.121 pb del gen WAS
que origina la pérdida de los exones 2-11. Se realiza estudio de secuenciación con primers flanqueantes para los diferentes exones, con imposibilidad de amplificar el exón 11 y amplificación normal del resto de
exones. Mediante secuenciación del gen se localiza a nivel genómico
el punto de corte con pérdida de los exones 2-11. Los estudios de expresión mediante RT-PCR no detectaron el transcrito correspondiente,
posiblemente debido a la inestabilidad del fragmento. Así mismo,
los estudios proteicos revelaron ausencia de expresión de WASp, que
se correlaciona con el fenotipo severo del paciente.
Conclusión. En vista de los hallazgos encontrados, evidenciando
que la presencia de una traslocación puede posibilitar la secuenciación
independientemente de exones, consideramos de gran importancia la
realización del análisis de expresión proteica como complemento del
estudio molecular. Estudios futuros mediante Primer in Situ DNA Synthesis (PRINS) Technique podrán confirmar y localizar la ubicación de
dicha traslocación.
P-095
SÍNDROME DE GOOD: EVALUACIÓN INMUNOLÓGICA. M.G.
Salgado-Cecilia1, R. López-Hernández1, M. Gil Ortega2, A. Bernal
Ramos1, M.V. Martínez-Sánchez1, E. Santos Medina3, P. De La Morena Barrios2, J. Torres Lanzas1, J.A. Campillo Marquina1, M.R. Alvarez-López1, A.M. García-Alonso1. 1Hospital Universitario Virgen de la
Arrixaca, Murcia. 2Hospital Universitario J. M. Morales Meseguer, Murcia.
3Residencia San Basilio. Rey Dº Pedro, Murcia.
Las inmunodeficiencias primarias más frecuentes son las humorales cuyo defecto predominante es el déficit de anticuerpos, entre ellas,
el Síndrome de Good, que es una hipogammaglobulinemia asociada
a timoma, es una entidad poco frecuente, de etiología desconocida y
que normalmente se presenta en la cuarta o quinta década de vida. Los
tumores tímicos son normalmente benignos pero alrededor de un 611% de pacientes con timoma desarrollan una inmunodeficiencia.
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Se presenta el caso de una mujer de 73 años que en 2003 padeció
una infección pulmonar de evolución tórpida, en cuya radiografía se
apreciaba la presencia de una masa mediastínica anterior de 9 cm de
diámetro, ligeramente heterogénea. Cinco años antes la paciente había
sufrido astenia, pérdida de peso, tos con mucosidad y expectoración
abundante. Fue timectomizada en el 2004 y varios meses después
ingresó con un shock séptico secundario a un cuadro de mediastinitis purulenta y dehiscencia de sutura esternal donde se coleccionó
400 c.c. de pus denso. La paciente no mejoraba su estado clínico y
continuó padeciendo infecciones respiratorias. Tras el diagnóstico de
un déficit de anticuerpos en sangre periférica fue remitida a nuestro Hospotal para una evaluación inmunológica por sospecha de Síndrome de Good.
Los resultados de laboratorio mostraban una hipogammaglobulinemia severa: IgG <7,67 mg/dL, IgA 2,09 mg/dL e IgM < 0,88 mg/dL.
El recuento de leucocitos de sangre periférica era de 11.000 céls/µl y
el numero de linfocitos de 3.900 céls/µl con sólo 1,7% de céls B mayoritariamente CD19+5+, NK (137 céls/µl) y una inversión del cociente
CD4+/CD8+ (0,24) por incremento del número de céls T
CD3+CD8+CD57+CD11b-TCRalfa.beta+ (1775 cels/µl) y bajo numero
de células T naive. No se encontraron otras alteraciones inmunológicas.
Tras la instauración de un tratamiento con inmunoglobulinas intravenosas mensual la paciente mejoró significativamente y actualmente sigue asintomática. Dado el porcentaje de pacientes con timoma que
pueden desarrollar inmunodeficiencia, sería recomendable someter
a estos pacientes a seguimiento con objeto de detectar tempranamente las alteraciones inmunológicas y poder iniciar el tratamiento adecuado para mejorar su calidad de vida y evitar posibles complicaciones que puedan poner en riesgo su vida.
SESIÓN 10: INMUNOGENÉTICA
Moderadores: M. Dolores de Juan (San Sebastián)
Manuel Muro (Murcia)
P-096
IDENTIFICACIÓN DE UN NUEVO ALELO HLA-A*80 (A*8002)
CON TRES SUSTITUCIONES AMINOACÍDICAS RELEVANTES
EN EL DOMINIO ALFA-1. A. Teniente, P. Caro, J. Gil, E. Campos, S.
Mantecón, C. Ambrós, L. Mongay, R. Pujol-Borrell, M.J. Herrero, E.
Palou. LIRAD-BST, Mataró.
Introducción. Hasta el momento sólo ha sido descrito un alelo en
el grupo HLA-A*80, el A*8001. Este alelo se encuentra predominantemente en las poblaciones africanas, pero también se observa, con una
frecuencia mucho menor en los individuos españoles.
Objetivos. Caracterizar un nuevo alelo HLA-A*80 a partir de una
unidad de sangre de cordón umbilical de origen caucásico del Banco
de Sangre de Cordón Umbilical de Cataluña.
Material y métodos: Al llevar a cabo la tipificación de HLA
mediante PCR-SSO se detectó un patrón anómalo, lo que llevó a su
clonación y secuenciación de nucleótidos, de los exones 2, 3 y 4 .
Resultados. El nuevo alelo se diferencia de A*8001 por tres cambios de nucleótidos en las posiciones 292 (A ->G), 299 (C -> T) y 301 (A
-> G), dando lugar a tres cambios de aminoácido en el codón 74 (AAC
96
-> GAC) de asparagina en ácido aspártico, en el codón 76 (GCG ->
GTG) de alanina por valina, y en el codón 77 (AAC -> GAC) de asparagina en ácido aspártico, respectivamente.
El nuevo alelo fue designado oficialmente como HLA-A*8002 por
el Comité de Nomenclatura de la OMS en Enero de 2010.
Las tres posiciones con cambios de aminoácidos (74, 76 y 77) se
encuentran en una de las alfa-hélices que forman las paredes del surco peptídico, formando parte de algunos de los bolsillos del sitio de
unión del péptido.
Los tres cambios de nucleótidos se encuentran en la mayoría de
los alelos HLA-A*03 y HLA-A*11, pero no en los alelos HLA-A*01, que
constituyen en conjunto la familia HLA-A1/3/11/80.
Conclusiones. Caracterización de un nuevo alelo HLA-A*80
(A*8002) cuyos cambios de nucleótidos podrían indicar que ha surgido de una conversión génica interalélica entre un alelo A*03/11 y el
A*8001.
P-097
EVALUACION DEL TIPAJE HLA CLASE II ALTA RESOLUCION
MEDIANTE PCR SSO LUMINEX®. EXPERIENCIA EN EL BANCO
DE CORDÓN UMBILICAL DE MALAGA. F.D.P. Sánchez Gordo, J.
Jaen García, A.M. Carrasco Hidalgo, E. Christensen Pedersen, I. Prat
Arrojo. Centro de Transfusión de Málaga y Banco de Cordón de Andalucía,
Málaga.
Introducción. Los requerimientos del tipaje HLA en sangre de cordón para transplante son de compatibilidad en baja resolución para
HLA-A y –B y alta para DRB1. Dado el número de muestras y el volumen de éstas, el tipaje HLA por técnicas de biología molecular requiere la utilización de un método rápido, económicamente asequible, y
de resultados fiables. Una vez validado en nuestro laboratorio, en este
trabajo estudiamos el tipaje HLA clase II por PCR SSO Luminex® de
alta resolución.
Material y métodos. Analizamos los tipajes realizados en 1000
muestras de sangre de cordón umbilical tipadas entre el 17 de Noviembre de 2009 y el 24 de Febrero de 2010 mediante el kit RSSOH2B1 lote
05 ( One Lambda, PCR SSO Luminex®). Las muestras de DNA se extrajeron mediante sistema automático Magtration® MagaZorb® Kit , y se
evaluó el rendimiento mediante espectofotometría (Eppendorf).
Resultados. Se alcanzó un nivel de resolución de 4 dígitos en el
76% de las muestras. (240 muestras no alcanzan los cuatro dígitos, de
ellas 172 por imposibilidad de discriminación del método, y 168 por
sondas complejas de alelos raros con reacciones peri-cutoff). Se muestras las frecuencias encontradas de los diferentes alelos y el nivel de
discriminación. Limitaciones encontradas, fueron la no discriminación
entre DRB1*1401/54; *1201/06/10/17;(en ambos casos la secuencia
del exón 2 es idéntica) *0403/52; *0404/23;*0405/08; ambigüedad *0102
*1104 vs *0120 *1106; siendo la principal limitación a la alta resolución
la dificultad de establecer el adecuado cutoff en beds que diferencian
*0301/16/18/28 (especialmente en muestra 0301 homozigotas) y el
*0701/16.
Conclusiones. Empleado como técnica inicial única, se alcanza el
nivel de resolución de cuatro dígitos en el 76% de las muestras, si tenemos en cuenta las exigencias de la EFI (exón 2), el porcentaje se eleva
al 86%. Y alcanzaría el 91% en caso de normalización en los “beds”
complejos (múltiples sondas) que diferencian 0301 de 0316 y 0701 de
0716 en muestras homozigotas. Como conclusión se trata de una técnica fiable y con adecuada relación calidad/precio.
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INMUNOLOGÍA
P-098
DIFERENCIAS GENÉTICAS DE HLA ENTRE AMERINDIOS, NADENE, ESKIMO Y ALEUTIANOS AMERICANOS. A. Arnaiz-Villena, P. Gomez-Prieto, C. Parga-Lozano, C. Areces, D. Rey, P. Peñaranda, L. Barbolla. Departamento de Inmunologia, Facultad de medicina, Universidad Complutense de Madrid. Centro de transfusiones de la
CAM, Madrid.
Objetivos. Se hipotetiza que los Amerindios fueron los primeros
habitantes de Norte y Sudamérica. Se ha postulado que alcanzaron
el continente americano entre hace 30.000 y 12.000 años. Sin embargo,
han sido encontrados asentamientos humanos más antiguos en el sur
de Sudamérica. Actualmente, muchas de sus lenguas parecen no estar
relacionadas y algunos autores dudan de que hayan surgido de un único grupo poblacional. Se cree que los hablantes de lenguas Na Dene
(Atabascos de Canadá, Navajo, Apache) alcanzaron América hace unos
8.000 años antes del presente, y que los Eskimo-Aleutianos lo hicieron
hace unos 6.000 años antes del presente. Este modelo de poblamiento de América basado en la antropología física y la lingüística es demasiado general y deja sin explicar algunos puntos clave.
En este trabajo, nuestro objetivo ha sido estudiar tanto la genealogía como la comparación de distancias de frecuencia alélicas de HLA
entre estos tres grupos pioneros con el fin de contrastar la robustez de
este modelo de poblamiento de América y establecer las relaciones
genéticas de estos grupos.
Material y métodos. Se han utilizado los haplotipos HLA extendidos para trazar genealogías entre poblaciones y las matrices de distancias genéticas DA de las frecuencias alélicas de HLA para construir
los dendogramas. También ha sido calculada la variación de frecuencias alélicas de HLA mediante análisis de correspondencia. Se han
empleado los programas Arlequin, GNKdist y Vista, una vez obtenidas las frecuencias alélicas de HLA por metodología estandarizada.
Resultados y conclusiones. 1) los Aleutianos parecen tener una
mayor relación con el grupo de Siberianos y Saami (Lapones, Escandinavia); parecen no estar tan relacionados con Esquimales, siendo
menos claro el momento de su llegada al continente americano; 2) Atabascos y Esquimales parecen tener una mayor relación con Siberianos
y otros orientales y, 3) los Amerindios parecen estar alejados de sus
vecinos y del resto de poblaciones mundiales al usar únicamente comparación de frecuencias. Sin embargo, la existencia de un alelo HLA
totalmente específico de Amerindios no se ha encontrado. De todos
modos, se han hallado haplotipos que son específicos de poblaciones
amerindias aisladas. El aspecto más específico de haplotipos HLA en
comparación con los alelos se discutido. Se exponen las causas del particular perfil HLA de Amerindios.
P-099
LA VARIABILIDAD DE LOS INTRONES DEL COMPLEJO MAYOR
DE HISTOCOMPATIBILIDAD EN AVES CANTORAS SALVAJES
(PASSERINES) SUGIEREN QUE EL ALELISMO ES GENERADO
POR CONVERSIÓN GÉNICA. A. Arnaiz-Villena1, D. Rey1, P. GomezPrieto1, S. Abd El Fatah Khalil2, P. Peñaranda2, C. Areces1, C. PargaLozano1. 1Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid. Centro de transfusiones de la CAM, Madrid.
2Centro de transfusiones de la CAM, Madrid.
Objetivos. Estudiar el mecanismo de generación de alelos MHC
en un modelo de aves silvestres.
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Material y métodos. Se han obtenido muestras de DNA de aves
de canto salvajes de todo el mundo.Se ha extraído DNA y determinado sus genes de histocompatibilidad por métodos Standard automáticos de extracción y secuenciación.
Resultados y conclusiones. Se supone que los intrones no siguen
un “reloj molecular” de cambio de bases del ADN. Esto hace que no
sean de utilidad para establecer filogenias. Sin embargo, el estudio de
cambios intrónicos en grupos de modelos ya definidos filogenéticamente por genes que si siguen un “reloj molecular” como ciertas aves
de canto de los géneros: Carduelis, Serinus, y la tribu Carduelini, pueden darnos respuestas a preguntas evolutivas específicas. En este artículo, se ha analizado el intrón 2 del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I con el fin de estudiar la evolución de
los genes MHC de estas aves de canto salvajes. Se han analizado indels,
distancias genéticas, y el promedio de variabilidad (variabilidad media).
No se ha encontrado en estas aves de canto salvajes la conservación
esperada del intrón 2, al contrario se ha registrado una amplia variabilidad. A pesar de que hay una tendencia de los grupos de aves cantoras filogenéticamente definidos a preservar un intrón 2 similar, se ha
observado una gran variabilidad. Esto concuerda que la mayoría de la
variabilidad alélicas de MHC se ha efectuado por conversión génica
(por participación de intrones) y no por mutaciones puntuales.
P-100
EVOLUCIÓN DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD –C, -G Y DE RECEPTORES “NATURAL KILLER” EN PRIMATES. A. Arnaiz-Villena1, D. Rey1, P. Gomez-Prieto1, S. Abd El Fatah Khalil2, P. Peñaranda2, C. Areces1, C. Parga-Lozano1. 1Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid. Centro de
Transfusiones de la CAM., Madrid. 2Centro de Transfusiones de la CAM, Madrid.
Objetivos. Estudiar la evolución en primates de MHC-G y –C.
Material y métodos. Se obtuvieron líneas celulares de los primates a estudiar. Se extrajo ADN y se tipificaron los alelos MHC métodos estándar de secuenciación automática.
Resultados y conclusiones. Las moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC) –C, y –G son ligandos de receptores de inmunoglobulinas de las células NK (KIR). La evolución de MHC-G en primates presenta importantes anomalías: 1) en simios del Nuevo Mundo, las
moléculas MHC-G muestran un elevado polimorfismo y lo más probable
es que sean presentadores de antígenos clásicos, también se agrupan como
si fuesen moléculas MHC-E en dendograma de emparentamiento molecular. Además, sus genes carecen de la deleción del intrón 2, la cual es típica de otros primates en lo que respecta a MHC-G; 2) los primates Euroasíaticos-Africanos de mediano tamaño, muestran un codon stop (de terminación) en el exón 3: únicamente son posibles las isoformas de MHCG sin exón 3; 3) los grandes primates, orangután, gorila, y chimpancé, así
como el hombre, muestran un limitado polimorfismo de MHC-G. Por otra
parte no se han encontrado genes MHC-C en simios Euroasiáticos-Africanos de mediano tamaño, sin embargo nosotros encontramos secuencias
de ADN de MHC-C en los simios del Nuevo Mundo, que son más antiguas en la escala evolutiva. Teniendo en cuenta que en el hombre las moléculas MHC-C (HLA) dominan la señal de los receptores inhibidores KIR,
nuestros hallazgos sugieren que tanto las moléculas MHC-C y sus ligandos en los linfocitos “natural killer” KIR también existen en los primates
más antiguos: los simios del Nuevo Mundo estaban presentes en la Tierra antes de hace 40 millones de años. Asimismo esto concuerda con que
los receptores KIR se han encontrado en promates del Nuevo Mundo.
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PÓSTERS
P-101
LOS PRIMEROS HABITANTES DE AMÉRICA (AMERINDIOS)
TIENEN GENES HLA COMUNES CON ABORIGENES AUSTRALIANOS, POBLACIONES DE LAS ISLAS DEL PACÍFICO Y CON
OTRAS POBLACIONES ASIÁTICAS. A. Arnaiz-Villena1, P. GomezPrieto1, D. Rey1, C. Areces1, L. Barbolla2, P. Peñaranda3, C. Parga-Lozano4. 1Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad
Complutense de Madrid. Centro de transfusiones de la CAM., Madrid. 2Centro de transfusiones de la CAM. 3Centro de transfusiones de la CAM. 4Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense
de Madrid. Centro de transfusiones de la CAM, Madrid.
Objetivos. Estudiar el origen de los Amerindios mediante genes HLA.
Material y métodos. Se han utilizado los haplotipos HLA extendidos para trazar genealogías entre poblaciones y las matrices de distancias genéticas DA de las frecuencias alélicas de HLA para construir
los dendogramas. También ha sido calculada la variación de frecuencias alélicas de HLA mediante análisis de correspondencia. Se han
empleado los programas Arlequin, GNKdist y Vista, una vez obtenidas las frecuencias alélicas de HLA por metodología estandarizada.
Resultados y conclusiones. El problema del origen de los Amerindios no ha sito todavía resuelto. Mientras que el ADN mitocondrial,
el cromosoma Y, HLA y otros marcadores muestran que los primeros
habitantes americanos na-dene y esquimales tienen muchas características genéticas comunes con orientales, en particular con siberianos, los
Amerindios más antiguos muestran un perfil HLA completamente diferente a orientales y siberianos, y presentan alelos HLA “propios” que
no han sido detectados en otras poblaciones del mundo. En este trabajo, no se ha comparado solamente las frecuencias de alelos HLA de la
población amerindia con las frecuencias de alelos de otras poblaciones,
sino que también se ha llevado a cabo una comparación genealógica de
los alelos HLA amerindios relevantes, entre las poblaciones. Las relaciones genéticas HLA de Amerindios han sido comparadas con los otros
primeros habitantes de America (na-dene y esquimales), asiáticos, australianos, poblaciones de las islas del Pacífico y otras poblaciones del
mundo a través de los programas Arlequin, GNKdist y Vista. Nuestros
resultados muestran que algunos alelos raros amerindios también se
encuentran en poblaciones del este de Australia, de las islas del Pacífico, en siberianos y otras poblaciones de Asia. En particular, los resultados en Atabascos NaDene (que viven en el norte de Canadá, próximos a Beringia) muestran que: 1) el paso a través de Beringia no ha sido
la única vía de entrada para el poblamiento de América, 2) no se puede descartar una migración inversa (de America hacia Asia) en diferentes épocas, 3) nuestros resultados no concuerdan con el modelo clásico
de “tres oleadas” para el poblamiento de las Américas a través de Beringia. En resumen, son posibles otros modelos en el que la entrada fuera también a través de la costa pacífica de América del norte y del sur.
P-102
DIMORFISMO MOLECULAR MICA-129 VAL/MET (DÉBIL/FUERTE LIGADOR DEL RECEPTOR NKG2D) Y SUSCEPTIBILIDAD A
ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL. R. López-Hernández, D. Lucas, J.A. Campillo, G. Salgado, F. Boix, A. Bosch, A. Minguela, M. Miras, R. Alvarez, F. Carballo, M. Muro. Hospital Virgen de la
Arrixaca, Murcia.
Este trabajo fue subvencionado por el proyecto 05748/PI/07 de la
Fundación Séneca de la Región de Murcia y CIBERehd (FIS). Ciberehd
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es subvencionado por el Instituto de Salud Carlos III. Ministerio de
Sanidad y Consumo.
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) son desórdenes crónicos multifactoriales que comprenden principalmente a Enfermedad
de Crohn (EC) y Colitis Ulcerosa (CU). Estudios genómicos han mostrado una consistente evidencia de ligamiento a IBD3 (6p21.1-23), un
área que comprende el complejo HLA. En este sentido, MICA esta localizado a 46 kb centromérico al locus HLA-B, es altamente polimórfico e interacciona con NKG2D, su receptor en la superficie de los linfocitos NK, Tγδ y T CD8. Una variación en la posición aminoacídica
129 del dominio α2 de la cadena pesada parece categorizar a los alelos MICA en fuertes o débiles ligadores del receptor NKG2D y, por tanto, influye en las funciones de las células efectoras.
Objetivos. El propósito de este trabajo fue estudiar el polimorfismo alélico del gen MICA y el dimorfismo funcionalmente relevante
(129 val/met) del gen MICA en pacientes EII en nuestra población.
Materiales y métodos. El DNA fué obtenido de pacientes EII y
controles sanos no relacionados (CG) y utilizados para el genotipaje
de MICA por PCR-SSOP por tecnología luminex mediante amplificación y detección del polimorfismo de exones 2, 3 y 4 (OL, CA).
Resultados. En el grupo CG, MICA*008 fue el alelo más frecuente, seguido por MICA*002, MICA*004, MICA*001, MICA*009 y
MICA*016, similarmente a otras poblaciones Caucasoides. No encontramos diferencias estadísticas en la distribución de alelos MICA entre
los grupos EII y CG. Sin embargo, encontramos mas alta frecuencia del
genotipo MICA-129met/met y más baja frecuencia de MICA-129
val/met en EII (principalmente en CU) que en CG (Pc= 0,02).
Puede ser hipotetizado que la presencia de MICA-129 met/met
y MICA-129 val/met puede modificar la activación de células NK, Tγδ
y T CD8 y permitir una exacerbada respuesta inmune en el microambiente intestinal con un fuerte componente inflamatorio. Podemos también especular que la producción de sMICA podría estar relacionada
a MICA-129, con los genotipos MICA-129 met/met y MICA-129
val/met ejerciendo posiblemente su efecto en susceptibilidad a través
de la disminución regulada de la expresión de sMICA.
Conclusión. Estos datos preliminares podrían sugerir un papel
relevante del SNP MICA-129-val/met (débil/fuerte ligador del receptor NKG2D) en la patogénesis de la EII.
P-103
ALELOS DQB1*, HLA CLASE II, EN LA POBLACION DE CASTILLA Y LEON. V. Leon Moya1, A. Leon Arroyo2, J.L. Cacho Gutierrez1.
1Hospital Universitario de Salamanca, Galindo y Perahuy. 2Internacional Institute of Infection and Immunity. Division of Immunology. Shantou University. Guangdong. R P China.
Los estudios de alelos HLA en poblaciones localizadas tienen un
gran interés a fin de disponer de datos basales de poblaciones concretas, aplicable a una gran diversidad de estudios , desde los simplemente poblacionales a servir de base comparativa en los estudios de ciertas enfermedades, sobre todo las que presentan un componente autoinmune.
Material y Métodos. Hemos estudiado la distribución de polimorfismos del gen DPQB1* en nuestra población (n= 128) de Castilla
y León.
Muestras de sangre de 50 a 200 mcl, fueron depositadas en un papel
Whatman 3MM secadas a almacenadas a temperatura ambiente hasta su utilización. El ADN fue extraído con el kit DNA Direct II de Dynal,
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obteniendo de 1- 4 mcg de ADN. El locus DQB1* fué estudiado con
el kit Dynal SSP allset DQB1*. Hemos cambiado las condiciones generales de la PCR a fin de adaptarla a nuestras cantidades de ADN, 2-4
ng y 0,1 U de Taq Polymerasa, por tubo (en vez de 100 ng de ADN y
0,4 U de Taq del protocolo original).
Las condiciones de la PCR fueron: 1) 94ºC, 2 min., 1 ciclo. 2) 94ºC
10 sec., 65ºC 60 sec. 10 ciclos. 3) 94ºC 10 sec., 61ºC 50 sec., 72ºC 30 sec.
30 ciclos. 4) 72ºC 3 min. Los productos PCR fueron visualizados por
electroforesis en agarosa al 2%.
Resultados. Las frecuencias de los alelos DQB1* halladas fueron: HLA DQB1*02, 29,7%; DQB1*03, 27,3; DQB1*04, 1,5; DQB1*05,
19,4; y DQB1*06 , 21,8.
No se hallaron diferencias significativas con otros estudios efectuados en poblaciones españolas y portuguesas.
P-104
POSIBLE ASOCIACION ENTRE EL GEN CYP46 Y LA ENFERMEDAD DE ESCLEROSIS MULTIPLE. V. Leon Moya, J. Arcaya, D.
Cembrero Fuciños, A. Hernández Villalon. Hospital Universitario de
Salamanca.
La Enfermedad de Esclerosis Múltiple, EM, es un desorden complejo con multitud de factores genéticos implicados en su desarrollo y
patología clínica. Cada vez existen más evidencias que implican al
transporte transmembrana celular del colesterol en con la EM. El gen
CYP 46 codifica la enzima 24 colesterol hydrolasa juega un papel importante en la salida al exterior celular del colesterol citoplasmático.
Recientemente se ha comenzado a asociar un polimorfismo del
Intron 2 del gen CYP 46 corre el riesgo de adquirir la EM. En el presente estudio, examinamos la posible asociación del polimorfismo del gen
CYP 46 EM .
Material y Métodos. El presente estudio se efectuó en 38 pacientes de EM, de acuerdo con los criterios de POSER, y 48 sujetos control.
El gen CYP 46 fue estudiado mediante una PCR empleando los
primers For 5'-TGA AAA CGA GTT TCC CGT CC-3' y Rev 5'-GTG
TGA CCA GGT AAC AGT CA-3', las condiciones de la PCR fueron:
95 durante 5 min, 1 ciclo; 95º 30 s, 53º 30 s, 72º 30s 34 ciclos, y finalmente 72º 10 min. El amplicon de 285 bp fué digerido con la enzima de restricción MspI, el alelo CYP C presenta dos fragmentos de
209 y 76 bp.
Resultados. La distribución del polimorfismo en EM es: 47,7% TT,
48,3% TC,4,0 % CC, en el grupo control: 42,8 TT, 46,9 TC 10,2 CC Existen diferencia significativa ente el grupo control y los grupos de enfermos (Chi-cuadrado test P< 0,001).
P-105
ESTUDIO DEL POLIMORFISMO SER326CYS DEL GEN HOGG1
EN ENFERMOS DE ALZHEIMER. V. Leon Moya1, M.D. Sevillano1,
E. Polo-Hernández2. 1Hospital Universitario de Salamanca. 2Instituto Neurociencias Castilla y Leon Universidad de Salamanca.
La acumulación de daños en el ADN de las celulas cerebrales a
lo largo del tiempo, parece jugar un importante papel en la patogenesis del de Enfermedad de Alzheimer, EA. El tipo de daño al ADN
que más influye en la degeneración neuronal es el daño oxidativo, estas
alteraciones se van acumulando con el tiempo en el ADN neuronal
siendo reparado mediante la escinsion de bases oxidadas. Se ha suge-
PÓSTERS
rido que el cerebro en EA el incremento de bases oxidadas puede deberse a un doble mecanismo, bien al incremento del stress oxidativo ó a
deficiencias en la reparación de los mecanismos responsables de la eliminación de las bases oxidadas. Hay evidencias que apuntan a que
el polimorfismo Ser326Cys del gen de la 8 oxoguanina DNA glicolidasa 1 , h OGG1, esta asociado con la reparación del ADN reducido, en
el presente estudio pretendemos ver la posible asociación de este polimorfismo con la EA.
Material y métodos. 36 pacientes diagnosticados de Probable EA
según criterios NINCDS-ADRDA y 66 controles fueron el objeto de
nuestro estudio. El ADN fue extraído mediante el kit DNA direct II
(Dynal) fundamentado en una resina con núcleo metálico que permite separar el complejo ADN-resina mediante un imán. El gen hOGG1
fue estudiado mediante PCR utilizando los primers: For 5´- CCC AAC
CCC AgT ggA TTC TCA TTG C -3’ y Reverse 5’-TTg gAA CCC TTT
CTg CgC TT-3’. Las condiciones de la PCR fueron: 95º durante 5 min,
1 ciclo; 95º 30 s, 53º 30 s, 72º 30s 34 ciclos, y finalmente 72º 10 min. El
amplicon de 234 bp fué digerido con el enzima de restricción Fnu4HI,
el alelo salvaje Ser326 presenta dos fragmentos de 213 y 21 bp, y el alelo mutante Cys326 tres fragmentos 164, 49 y 21 bp. Los fragmentos son
puestos de manifiesto mediante electroforesis en gel de agarosa al
2% conteniendo bromuro de etidio.
Resultados. La distribución del polimorfismo en EA es: 62,3% SS,
33% SC 4,7 % CC, en el grupo control: 66,4 SS, 30,4 SC 3,2 CC . No Existen diferencias significativas entre el grupo control y los grupo EA (Chicuadrado test P< 0,05).
P-106
ESTUDIO DEL POLIMORFISMO DEL PRION P M129V EN
PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE. V. Leon Moya, S.
Gomez-Castro, M.L. Rivera Reigada, J. Barón Sánchez. Hospital Universitario de Salamanca.
La Artritis Reumatoide, AR, es un desorden inmuno degenerativo que ha sido asociado con la presencia de depósitos de proteínas
anormales, en los cuales pueden influir de la Proteína PrPC (PrionC)
en sus formas insolubles PrPSC. Los Priones están localizados en la
membrana citoplasmática. Presentan radicales a los que se ligan moléculas de Cobre, y juegan un papel esencial en el transporte transmembrana del cobre y en el mecanismo antioxidante celular. los heterocigotos del PrNP al polimorfismo Met 129 Val presentan un efecto protector ó al menos un mayor periodo de incubación de ciertas enfermedades con componente autoinmune. El propósito del presente
estudio es relacionar la presencia de este polimorfismo en enfermos
de AR.
Material y Métodos. Nuestro estudio se efectuó sobre 56 pacientes de AR, de y 86 sujetos control. Un fragmento de 775 bp del gen
PrNP fué amplificado empleando los primers (for: 5'-GTG GCC ACA
TGG AGT GAC CTG GGC CTC -3'; rev: 5'-GTG AAA CAG GAA GAC
C -3'). La PCR fue efectuada utilizando 10 ng de ADN genómico en 20
mcl de mezcla de reacción. Las condiciones de la PCR fueron: 95º durante 5 min, 1 ciclo; 95º 30 seg, 30º 30 seg, 72º 60 seg 34 ciclos, y 72º 10 min.
El producto de la PCR fué digerido con el enzima de restricción NspI
y revelado en geles de agarosa al 2%.
Resultados. La distribución alélicas en el grupo control fue: 42%
M/M, 45% M/V, 13% V/V. En pacientes de AR : 44% M/M, 44% M/V,
12% V/V. No hemos encontrado diferencias entre el grupo control y
enfermos de EM (El test Chi-cuadrado, p< 0,05).
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P-107
ESTUDIO DE POLIMORFISMOS EN EL GEN CD24 Y SU ASOCIACIÓN CON LA DISFUNCIÓN NEUROLÓGICA EN PACIENTES
CON ESCLEROSIS MÚLTIPLE. M.D.C. Chima Galán1, C.S. Rodríguez Mandujano1, J.J.M. Zaragoza Saavedra2, L. García Ortiz1, J.C.
Pérez Razo1, J. Gutiérrez Salinas1, V. Dircio Delgado1, N. Plascencia
Alvárez1, L. Núñez Orozco1, D. Soto Candia1, M.E. Vargas Camaño1.
1Centro Médico Nacional 20 de Noviembre - ISSSTE, Ciudad de México,
México. 2Instituto Nacional de Cancerología, México.
Objetivos. Determinar si los polimorfismos CD24v y P1527del
se asocian con la presencia de esclerosis múltiple en un grupo de pacientes mexicanos, en comparación con población sana.Evaluar si los polimorfismos del gen CD24 se encuentran relacionados con el grado de
disfunción neurológica en el grupo de pacientes.
Introducción. La esclerosis múltiple (EM) es un padecimiento desmielinizante del sistema nervioso central (SNC), de etiología multifactorial. Es
la segunda causa de discapacidad en adultos jóvenes, en México tiene una
prevalencia de 13 por 100,000 habitantes y es más frecuente en mujeres con
una relación 2:11. La EM resulta de una respuesta autoinmune a antígenos
propios, donde las células T específicas de la mielina son activadas y migran
al SNC, los mediadores inmunes inician una respuesta inflamatoria que
destruye la mielina causando degeneración axonal2. Se ha demostrado la
asociación de genes que participan en la respuesta inmune, con la presencia de EM. La proteína de superficie CD24 promueve la activación y
migración de las células T al SNC3. En población estadounidense, española e iraní, el polimorfismo CD24v se ha asociado con una progresión más
rápida4,5,6. Mientras que P1527del se ha considerado como un marcador de
protección para el desarrollo de enfermedades autoinmunes como la EM7.
Material y métodos. Se llevó a cabo un estudio de casos y controles,
de tipo observacional, transversal, prospectivo, comparativo y abierto. Se
estudiaron 102 pacientes atendidos en la Clínica de esclerosis múltiple del
Centro Médico Nacional “20 de Noviembre” – ISSSTE, de 18 a 65 años de
edad, diagnosticados con EM de acuerdo a los criterios de McDonald8,
variedad remitente-recurrente; en quienes se determinó el grado de disfunción neurológica, de acuerdo con los parámetros de Expanded Disability Status Scale (EDSS)9. El grupo control estuvo constituido por 259 personas sanas, pareadas por sexo y sin antecedentes de enfermedades autoinmunes ni neurológicas. Previo consentimiento informado se tomó una
muestra de sangre periférica a cada uno de los participantes para extraer
DNA, por medio de un método de precipitación salina diferencial10. Para
identificar los polimorfismos CD24v (T226C, de la región codificante del
exón 2) y P1527del (1527delTG, en la región no traducida 3’ del gen) se realizó la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), análisis de fragmentos
de restricción de longitud polimórfica (RFLP´s) y secuenciación confirmatoria. Se utilizó la prueba de ji cuadrada y Odds Ratio para identificar diferencias estadísticamente significativas de las frecuencias alélicas y genotípicas de los polimorfismos entre los grupos de estudio, una ANOVA y la
prueba de diferencia mínima significativa (DMS), para determinar la correlación de los alelos y genotipos con la disfunción neurológica.
Resultados. Existe diferencia estadísticamente significativa de la distribución del polimorfismo CD24v entre casos y controles (X2= 13,33,
gl= 2, α= 0,5, P= 0,01). No así en la distribución alélica ni genotípica de
P1527del entre los grupos estudiados (X2= 0,16, gl= 2, α= 0,05 y X2= 0,14,
gl=1, α= 0,05). Con respecto a la relación de los polimorfismos de CD24
con la disfunción neurológica (EDSS>6) se obtuvo DMS= 8,28 (p= 0,058).
Conclusión. Se demostró asociación de los polimorfismos CD24v y
P1527del con la disfunción neurológica de los pacientes con esclerosis múltiple estudiados. Así como, una asociación de los genotipos y alelos de CD24v
100
VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
con la EM, tal como se ha reportado en otras poblaciones estudiadas, lo que
apoya que este polimorfismo participa en la susceptibilidad a EM.
Bibliografía
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14ª. ed. 2002. Cap. 12.
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international panel on the diagnosis on multiple sclerosis. Ann Neurol 2001;50:121-7.
9. Kurtzke JF, Rating neurological impairment in multiple sclerosis: an expanded disability status scale (EDSS). Neurology 1983;33:1444-1452.
10. Sambrook J, et al. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 1989.
P-108
DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN NUEVO ALELO
HLA-B, B*07:77. D. Planelles1, A. Balas2, G.F. Sanz3, P. Solves1, F. García-Sánchez2, N. Puig1, R.J. Roig1, J.L. Vicario2. 1Centro de Transfusión
de la Comunidad Valenciana, Valencia. 2Centro de Transfusión de Madrid ,
Madrid. 3Hospital Universitario La Fe, Valencia.
En este estudio se describe cómo una combinación de técnicas
moleculares llevaron a la identificación de un nuevo alelo HLA-B*07
durante el genotipaje de rutina para trasplante de progenitores hematopoyéticos (TPH). El nuevo alelo identificado se compara con otros
relacionados de secuencia conocida.
El estudio HLA de un paciente rumano con indicación de búsqueda de donante para TPH se realizó inicialmente por resolución
intermedia mediante PCR-rSSO (LABType® SSO-Luminex®) dando
como resultado HLA-A*01:DEKY, 26:EBHE; B*07:07, 44:AXJM;
C*04:DGVY, 07:DGVZ. El subtipaje alélico posterior mediante PCRSSP (Olerup SSP) fue A*01:01, 26:01; B*07:07, 44:03; y C*04:01, pero la
definición del grupo C*07 mostró resultados inconcluyentes caracterizados por la presencia de amplificaciones extra (C*07:02+B*40:60;
C*07:38+B*40:60; C*07:15+B*40:60). El tipaje por PCR-rSSO con reactivos LifeMatch® resultó B*07:ZYC, 44:ARJA; C*04:CZAB, 07:CZAC.
Para determinar de forma exacta el tipaje HLA-B y -C, se realizó
secuenciación por amplificación genómica completa y secuenciación
subsiguiente de los exones 2, 3 y 4 con oligonucleótidos de intrón.
El tipaje HLA-C y -B por secuenciación dio como resultado
C*04:01:01:01, 07:02:01:03; B*44:03:01 y un nuevo subtipo HLA-B*07,
oficialmente reconocido como B*07:77, que presentaba una sustitución
99Y>99S respecto a su alelo más próximo B*07:07. El análisis de segregación familiar definió el haplotipo que lo incluye como A*01:01, B*07:77,
C*07:02:01, DRB1*15:01:01, DQB1*06:02:01. B*07:07 muestra también
asociación haplotípica con A*01 y C*07. La alineación del dominio α-2
HLA-B denota la presencia de un residuo 99S en unas pocas moléculas
HLA-B, principalmente en alelos B*37 y otros muy poco frecuentes como
B*40:60, B*53:07, B*39:09 y B*18:18. El aminoácido en posición 99 está
localizado en la cadena β S1, contribuyendo a sus propiedades de unión,
especificidad de la molécula HLA y probablemente de relevancia en el
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INMUNOLOGÍA
TPH. La presencia del residuo 99S en el alelo B*40:60 podría explicar
las reacciones extra de amplificación específicas de B*40:60 observadas
en el subtipaje HLA-C*07 mediante Olerup-SSP.
En conclusión, aunque la técnica PCR-SSP sugirió la presencia
de un nuevo alelo HLA de clase I, el hecho de que ni ésta ni la PCRrSSO lo detectaran confirma que el tipaje basado en la secuenciación
es el más resolutivo para el estudio de histocompatibilidad en TPH.
P-109
POLIMORFISMO EN LA 3’UTR -1188 A/C DEL GEN DE LA INTERLEUKINA-12P40 (IL-12B) SE ASOCIA CON COLITIS ULCEROSA Y ENFERMEDAD DE CROHN. F. Boix Giner, R. López-Hernández, H. Salama, G. Salgado, J.A. Campillo, D. Lucas, A. Minguela,
M. Miras, M.R. Álvarez-López, F. Carballo, M. Muro. Hospital Virgen
de la Arrixaca, Murcia.
Interleukin (IL)-12p40, a subunit of IL-12p70 and IL-23, has previously
been shown to inhibit IL-12p70 activity and IFN-gamma production.
IL-12p40 is induced in excess over the other subunits of IL-12 and IL23 and can exist in a monomeric or homodimeric form. Its most widely
appreciated function is to provide a negative feedback loop by competitively
binding to the IL-12 receptor. However, IL-12p40 acts as a chemoattractant
for macrophages and promotes the migration of bacterially stimulated
dendritic cells. IL-12 plays a key role in promoting Th1 responses
and is associated with several pathogenic inflammatory responses.
Several SNPs have been identified in the IL-12 gene such as 3’UTR 1188
A/C polymorphism (rs3212227), which is associated with different
diseases. The variant C allele of the 1188A/C polymorphism has
been associated with enhanced IL-12 production. However, the relationship
of this polymorphism with the immune response in inflammatory
bowel disease (IBD) patients has not been explored. In this case–control
study, we evaluated patients with IBD and healthy subjects. We aimed
to determine the relationship between 3’UTR -1188 A/C polymorphism
of IL-12 p40 and the differential IBD pathologies, Crohn´s disease (CD)
and ulcerative colitis (UC). Genotype frequencies were 50,9% A/A,
43,8% A/C, and 5,2% C/C in CD patients, and 81,5% A/A, 14,8% A/C,
and 3,7% C/C in UC (p= 0,017; OR= 4,49). Allele frequencies were
72,8% -1188A and 27,2% -1188C in CD patients, and 88,9% A and 11,1%
C in UC (p= 0,03. OR= 4,62).Thus, the -1188A allele was increased in
UC patients and the -1188C allele (high IL-12p40 production) was
increased in CD patients. These data are in concordance with the fact
of that CD has been shown to be associated with a Th1 T-cell mediated
inflammation and high IL-12/IFN-gamma production at histologically
affected sites. These data suggest that the IL-12 p40 3’UTR -1188 A/C
polymorphism seems to be associated with a differential IBD development.
PÓSTERS
tringidos por las moléculas MHCI (residuo P1 del sitio de corte). Existen
dos tipos distintos de proteasomas, la forma constitutiva, expresada en la
mayoría de los tipos celulares, y el inmunoproteasoma, que se expresa
de manera constitutiva en las células dendríticas. Los epítopos de células
T CD8 protectivos son aquellos generados tanto por el inmunoproteasoma como por el proteasoma constitutivo, y por ello, aquí hemos modelado y analizado la actividad catalítica de estas dos proteasas. Además, hemos
combinado las predicciones de unión de péptidos a moléculas MHCI y las
de corte por el proteasoma y/o inmmunoproteasoma intentando mejorar los resultados de predicción de epítopos de células T CD8.
Material y métodos. La actividad proteolítica del inmunoproteasoma y del proteasoma se modelaron a partir de dos conjuntos de datos
distintos no solapantes, uno formado por 553 epítopos de células T
CD8 –procesados naturalmente y restringidos por moléculas MHCI
humanas–, y otro compuesto por 382 péptidos eluidos de moléculas
MHCI humanas, respectivamente, usando N-grams. Los modelos de
corte se generaron considerando fragmentos de los epítopos y de los
péptidos eluídos de moléculas MHCI de distinto tamaño con el mismo número de residuos a cada lado del C-terminal, y se evaluaron
usando una validación cruzada de orden 5.
Resultados. A juzgar por el índice de correlación de Matthews
(MCC), los modelos óptimos para el proteasoma (MCC = 0,43 ± 0,07)
y el inmunoproteasoma (MCC = 0,36 ± 0,06) se obtienen a partir de
fragmentos de 12 residuos. Cuando estos modelos se evalúan usando un test independiente los modelos de corte del inmunoproteasoma
y del proteasoma alcanzan valores de 0,30 y 0,18, respectivamente, que
son comparativamente mejores que los valores alcanzados por otros
métodos relacionados. Mediante un análisis ROC, hemos demostrado
que la combinación de las predicciones de unión de péptidos a moléculas MHCI junto con las predicciones de corte por el inmunoproteasoma y/o el proteasoma incrementan de manera significativa la tasa
de descubrimiento de epítopos de células T CD8 restringidos por distintas moléculas MHCI, como A*0201, A*0301, A*2403, B*0702, B*2705.
Conclusiones. Hemos desarrollado dos modelos diferentes para
predecir los sitios de corte por el proteasoma y el inmunoproteasoma,
que sin duda serán instrumentales para identificar epítopos de células T CD8 protectivos. La predicción de sitios de corte por el inmunoproteasoma y el proteasoma usando nuestros modelos está disponible para uso público en http://imed.med.ucm.es/Tools/PCPS/.
P-111
IDENTIFICACIÓN DE HAPLOTIPOS DEL GEN HAVCR1 ASOCIADOS CON LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE ARNM Y SUSCEPTIBILIDAD A ENFERMEDADES AUTOINMUNES. A.M. Escalera Cardenas, J.R. García Lozano, C. Abad Molina, B. Torres, O. Fernández, A. García, J. Sánchez, A. Nuñez Roldan, J. Martin, M.F. González Escribano. Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla.
P-110
ANÁLISIS Y MODELADO DE LA ACTIVIDAD CATALÍTICA DEL
INMUNOPROTEASOMA Y DEL PROTEASOMA CONSTITUTIVO. C.M. Diez Rivero, E.M. Lafuente, P.A. Reche. Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid, Madrid.
Objetivos. El proteasoma tiene un papel fundamental en el procesamiento de antígenos presentados por moléculas del complejo principal de
histocompatibilidad de clase I (MHCI). Es el responsable de la degradación proteolítica de las proteínas citoplasmáticas, generando el extremo Cterminal de los epítopos de células T CD8 y en general de los péptidos res-
Introducción. El gen HAVCR1 se encuentra localizado en 5q33.2,
una región asociada a alergia y enfermedades autoinmunes.
Objetivos. 1) Definir haplotipos en el gen HAVCR1 teniendo en cuenta tanto los haplotipos de SNPs disponibles en el Proyecto HapMap como
las variantes estructurales descritas en el exón 4. 2) Investigar la posible
relación entre estos haplotipos y los niveles de expresión de ARNm. 3)
Valorar la posible asociación entre el gen HAVCR1 y la susceptibilidad a
artritis reumatoide (AR) y lupus eritematoso sistémico (LES).
Material y métodos. Las 3 variantes ins/del del exón 4 del gen
HAVCR1 fueron genotipadas mediante análisis de longitud de frag-
101
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PÓSTERS
mentos. Los genotipos de 5 “tagSNPs” en este locus y los niveles de
ARNm fueron determinados usando ensayos TaqMan. Las variables
cualitativas se compararon mediante ¯2 y las cuantitativas mediante
Kruskal-Wallis seguida del test de Dunn para comparaciones múltiples.
Resultados. Definimos 4 haplotipos mayoritarios en nuestra población, los dos más frecuentes (haplotipos A y B) llevan las mismas variantes estructurales en el exón 4 y cada uno de ellos presenta una de las
dos combinaciones de tagSNPs más comunes en población CEU. El
análisis de cuantificación reveló que el genotipo B/B presentaba la
mayor mediana de nivel de expresión de ARNm (1.870, 0,430-6.110,
vs. BX+XX p< 0,0001). Además, la frecuencia del genotipo BB fue significativamente más alta en pacientes con AR que en controles (12,3%
vs. 5,9% en controles, p= 0,046, pc= 0,014, OR=2,23 95% CI 1,23-4,10).
Conclusiones. Nuestros resultados sostienen una relación entre
los haplotipos de HAVCR1 y los niveles de expresión de ARNm y sugieren asociación de este gen con enfermedades autoinmunes.
P-112
MARCADORES DE RIESGO PARA ENFERMEDADES AUTOINMUNES EN LA RUTA CD40/NF-KB Y NIVELES DE EXPRESIÓN DE
ARNM DE TNFAIP3, TRAF1, C5 Y CD40. A.M. Escalera Cardenas, J.R.
García Lozano, C. Abad Molina, J.M. Lucena, A. Nuñez Roldan, M.F.
González Escribano. Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla.
Introducción. La ruta de señalización CD40/NF-κB ha sido involucrada en la patogénesis de enfermedades autoinmunes. Entre los loci
relevantes de esta ruta se encuentran: TNFAIP3, TRAF1-C5 y CD40.
Objetivos. Valorar el posible efecto regulador de 4 alelos de susceptibilidad para artritis reumatoide (RA) y/o lupus eritematoso sistémico (LES) sobre los niveles de expresión de ARNm de genes implicados en la ruta de señalización de CD40/NF-κB.
Material y métodos. Para este estudio de expresión, se seleccionaron 120 de un total de 384 muestras de donantes de sangre genotipadas para 4 SNPs confirmados como de riesgo para AR y/o LES. Estos
SNPs marcan las regiones donde se encuentran: TNFAIP3 (rs6920220
y rs5029939), TRAF1 y C5 (rs3761847) y CD40 (rs4810485). El genotipado se realizó utilizando sondas TaqMan. Las 120 muestras se seleccionaron de manera que los genotipos de los 4 SNPs estuvieran homogénea y suficientemente representados. Para el estudio de expresión
la cuantificación relativa de ARNm se realizó con ensayos TaqMan
diseñados específicamente para los transcritos de TNFAIP3, TRAF1C5 y CD40. Se compararon los niveles de expresión de cada transcrito para los diferentes genotipos de los SNPs descritos como de riesgo
en cada región utilizando el test de Kruskal-Wallis.
Resultados. No se observaron diferencias estadísticamente significativas para los diferentes SNPs de riesgo en la expresión de los diferentes transcritos estudiados.
Conclusiones. Los alelos de susceptibilidad estudiados no afectan a la expresión de los genes TNFAIP3, TRAF1, C5 y CD40.
P-113
DETECCION Y CARACTERIZACION DE DOCE NUEVOS ALELOS HLA. A. Balas Pérez, F. García Sánchez, J.L. Vicario Moreno. Centro de Transfusión de Madrid, Madrid.
Doce nuevos alelos HLA fueron detectados y posteriormente caracterizados mediante secuenciación: A*32:19N, B*39:50, B*49:07, Cw*02:23,
102
VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
Cw*04:42, Cw*05:25, Cw*07:04:03, Cw*07:57, Cw*08:25, Cw*17:05,
DRB1*16:15 y DQA1*05:10.
La detección de nuevas variantes alélicas se realizó en el tipaje de
intermedia resolución mediante PCR-SSO y tecnología Luminex, debido a patrones anómalos de hibridación así como en el tipaje mediante secuenciación de los exones 2/3/4 para genes de clase I y exones
2/3 para clase II. La detección del alelo A*32:19N fue motivada por
discrepancias entre el tipaje serológico y molecular.
Todos los nuevos alelos HLA de clase I presentaron cambios en los
exones 2 o 3, produciendo cambios aminoacídicos con la excepción de
Cw*07:04:03. La secuenciación completa, exon 1 a exon 8, no supuso
cambios adicionales. En la tabla se detallan los cambios encontrados
respecto al alelo más homologo en cada caso, así como los haplotipos
deducidos que incluyen a cada una de las nuevas variantes HLA.
Nuevo Alelo
A. homólogo
Codon/S.nucleot./S. Amino
Haplotipo
A*31:19N
B*39:50
B*49:07
Cw*02:23
A*32:01:01
B*39:06:02
B*49:01:01
Cw*02:02:02
A*32:19N-B*14:01-Cw*08:02
B*39:50-Cw*07:02:01:01
A*23-B*49:07-Cw*07:01
B*27:05:02-Cw*02:23
Cw*04:42
Cw*04:16
Cw*05:25
Cw*07:04:03
Cw*07:57
Cw*08:25
Cw*17:05
DRB1*16:15
DQA1*05:10
DQB1*03
Cw*05:01
Cw*07:04:01
Cw*07:01:05
Cw*08:05
Cw*17:01
DRB1*16:01:01
DQA1*05:05
167 TGG>TGA W>Stop
163 ACG>GAG T>E
163 CTG>GAG L>E
113 TAT>CAT Y>H
116 TCC>TAC S>Y
177 GAG>GAC E>D
178 ACG>AAG T>K
180 CAG>GAG Q>E
9 TAC>GAC Y>D
11 GCT>GCC
21 CAC>CGC H>R
90 GCC>GAC A>D
99 TAT>TAC Y>Y
182 GCG>ACG A>T
35 CAG>CGG Q>R
35 CGG>CAG R>Q
86 GGT>TGG G>V
76 ATT>GTT I>V
A*24:02-Cw*04:42-B*35:02
B*18:01:01-Cw*05:25
A*68:01:02-Cw*07:04:03-B*15:18
B*41:01-Cw*07:57
B*35:03:01-Cw*08:25
B*41-Cw*17:05
DRB1*16:15-DQB1*05:02:01
DRB1*11-DQA1*05:10-
P-114
ESTUDIO DEL HLA Y LA INSULINA, GENES CLÁSICOS DE SUSCEPTIBILIDAD A DIABETES TIPO 1, EN UNA POBLACIÓN CON
DEBUT PEDIÁTRICO Y ADULTO DE LA ENFERMEDAD. L. Espino Paisán1, M.Á. Figueredo1, H. De La Calle2, J.L. Santiago1. 1Hospital
Clínico San Carlos, Madrid. 2Hospital General Universitario Ramón y Cajal,
Madrid.
Objetivos. La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad autoinmune caracterizada por la destrucción de las células beta del páncreas.
Los dos primeros factores genéticos asociados a la enfermedad fueron
el HLA de clase II y un VNTR cercano al gen de la insulina que influye en los niveles de expresión del gen.
La edad de debut de la DT1 tiene una distribución bimodal,
con un pico alrededor de los 10-12 años y otro pico en la treintena,
pero tradicionalmente se ha puesto poco énfasis en las posibles
diferencias genéticas entre el debut temprano y tardío de la enfermedad.
El objetivo de este estudio es comprobar si existen diferencias en
la susceptibilidad a DT1 conferida por dos loci clásicos, el HLA y la
insulina, en función de la edad de debut.
Métodos. Se han estudiado 417 enfermos de DT1 del área de
Madrid, diagnosticados según los criterios de la American Diabetes
Association (ADA) y 737 controles sanos provenientes de donantes de
sangre (edad 18-60 años). Se dispone de la edad de debut para 410
pacientes de DT1 (1 a 65 años, media=18,43 ± 11,04, mediana=16 años).
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INMUNOLOGÍA
El tipaje de HLA se realizó mediante inmunoblot y tecnología
Luminex. El SNP rs689, en desequilibrio de ligamiento con el VNTR
originalmente descrito en el gen de la insulina, se genotipó mediante
tecnología TaqMan. El análisis estadístico se realizó mediante el test
de Chi-cuadrado y test de Mann-Whitney para el análisis de la edad
como variable continua.
Resultados. En el estudio del HLA, la presencia de DR3 y/o DR4,
DR3 homocigoto, DR4 homocigoto, DQ8 o el haplotipo de protección DR2 no mostraron diferencias significativas en función de la edad
de debut.
Replicamos el efecto protector del alelo minoritario del polimorfismo rs689 de la insulina (OR= 0,54 [0,43-0,67]; p= 8,3 x 10-9). El análisis por edad no muestra diferencias significativas (p= 0,43).
Conclusiones. Los alelos de susceptibilidad y protección presentes en el HLA y en la insulina están asociados a la DT1 en la población estudiada independientemente de la edad de debut.
P-115
EL FENOTIPO HLA INFLUYE EN EL RIESGO Y PRESENTACION
DE DAÑO HEPATICO INDUCIDO POR AMOXICILLIN-CLAVULAMICO. F. Ruiz-Cabello Osuna1, C. Stephens2, M. Crespo3, A. Moreno1, R. Andrade4, E. Ulzurrun2, M. Romero-Gomez2, Y. Borraz2, M. Lucena5, M. López-Nevot1. 1Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada. 2Hospital Universitario Virgen De La Victoria. 3Universidad de Granada. 4Centro de Investigación Biomedica en Red: Ciberehd. 5Facultad de
Medicina, Universidad De Málaga; CIBERehd.
La mayoría de las reacciones adversas hepáticas atribuibles a
medicamentos son hepatitis de naturaleza idiosincrásica. Aunque el
mecanismo patogénico de esta forma de reacción adversa es escasamente comprendido. El daño hepático (DILI) por Amoxicillin-clavulanate (AC-DILI) tiene principalmente una manifestación colestasico/mixta (Chol/Mix) en población Norte-Europea. Sin embargo
hasta un 30% de población española presentan daño hepatocelular
(HC). El AC-DILI, puede por tanto tener una base genética.
Objetivos. Investigar la posible asociación entre los alelos HLA y
la susceptibilidad a desarrollar AC-DILI y a su asociación al fenotipo
clínico.
Material y métodos. Se ha realizado genotipado de alta resolución de los locus de HLA clase I (A, B y C) y clase II (DRB1, DQB1)
mediante PCR y SBT en 57 pacientes españoles diagnosticados de ACDILI y 400 controles Caucasianos sanos.
Resultados. El alelo HLA B*1801 fue encontrado significanivamente incrementado en pacientes con DILI y daño de tipo HC (10/17,
59%; P= 0,00005) si se comparan con el grupo control. B*1801 apareció
también en pacientes más jóvenes (55 vs 66 years), que requirieron hopsitalización (76% vs 46%) y en general de peor pronóstico de DILI (1
fallecido, 2 transplantados vs 0). En contraste pacientes portadores de
los alelos HLA de clase II DRB1*1501-DQB1*0602, predominó el daño
Chol/Mix (12/13, 92%; P= 0,009). El alelo HLA-A*0101 y el haplotipo
DRB1*0701-DQB1*0202 pereció estar menos frecuentemente representado en los pacientes con AC-DILI (23,5% vs 7%; P= 0,006 y 30% vs
15%; P= 0,03, respectivamente).
Conclusiones. En conclusión, el alelo HLA B*1801 parece predisponer a AC-DILI de tipo HC con peor pronóstico, mientras que el haplotipo DRB1*1501-DQB1*0602 parece jugar un papel en el daño Chol/Mix.
Diferencias étnicas entre las distintas poblaciones en el alelo B*1801
podría explicar las variaciones del daño hepatocelular en AC-DILI.
PÓSTERS
P116
INTERACCIÓN ENTRE IL23R Y TLR9 EN LA SUSCEPTIBILIDAD
A ENFERMEDAD DE CROHN. L.M. Medrano De Dios, B. Dema
Jiménez, J.L. Mendoza, M.C. Núñez Pardo De Vera. Hospital Clínico San
Carlos, Madrid.
Objetivos. La enfermedad de Crohn es una enfermedad inflamatoria intestinal de etiología desconocida. Se conoce la implicación de
IL23R en la enfermedad, y se ha postulado una interacción entre polimorfismos de este gen y de TLR9. Dado el papel de ambos en el mantenimiento de la homeostasis intestinal, nuestro estudio se centró en
la búsqueda de interacciones entre polimorfismos de ambos genes.
Material y métodos. Se llevó a cabo un estudio caso-control, incluyendo 416 individuos con enfermedad de Crohn y 495 individuos sanos
empleados como control. Todas las muestras correspondían a individuos
blancos de origen español y fueron recogidas en la comunidad de Madrid
(Hospital Clínico San Carlos). Se estudiaron 6 polimorfismos de un único nucleótido (SNPs): rs10004819, rs7517847 y rs11209026, pertenecientes al gen IL23R; y rs352162, rs187084 y rs5743836, pertenecientes al gen
TLR9. El genotipado se llevó a cabo mediante tecnología TaqMan.
La comparación de las frecuencias génicas en el caso-control se
realizó mediante el test chi-cuadrado o test exacto de Fisher. Las interacciones se evaluaron en primer lugar en el grupo de enfermos, mediante tablas estratificadas considerando los distintos polimorfismos estudiados en IL23R respecto a los analizados en TLR9. La detección de
una interacción en este grupo, conllevó su posterior análisis en el grupo de controles y la comparación caso-control.
Resultados. El estudio caso-control para el gen TLR9 no mostró
ningún resultado significativo, aunque la frecuencia del alelo minoritario del polimorfismo rs352164 se encontraba ligeramente aumentada en enfermos (p=0,09).
Al estudiar la interacción génica previamente descrita, se observó
una interacción entre los polimorfismos IL23R_rs10004819 y
TLR9_rs5717847. Sin embargo, el efecto no era similar al publicado. La
interacción estaba presente en el grupo de enfermos (p=0,0098) y no
en los controles (p=0,77), pero el estudio caso-control no llegaba a ser
significativo (p= 0,08; OR= 1,48 I.C. 95%= 0,93-2,36 para la presencia
del alelo TLR9 rs5743836_C en individuos IL23R rs10004819_CC). Adicionalmente, se obtuvo un resultado significativo al analizar los SNPs
IL23R_rs7517847 y TLR9_rs352162, observándose un efecto protector
en individuos portadores del alelo minoritario en este polimorfismo
de IL23R sólo si además presentaban el genotipo CC en TLR9_rs352162
(p=0,0003, OR= 0,43 I.C. 95% = 0,26-0,70).
Conclusiones. El efecto protector del alelo minoritario del polimorfismo IL23R_ rs7517847 parece afectar sólo al subgrupo de pacientes caracterizados por poseer el genotipo CC en TLR9_ rs352162.
P-117
ANÁLISIS DE CARACTERÍSTICAS INMUNOGÉNICAS EN EPÍTOPOS DE LINFOCITOS T. D. De Pereda, C.M. Diez Rivero, P.A. Reche
Gallardo. Facultad de Medicina - Universidad Complutense de Madrid, Madrid.
Objetivos. La respuesta inmune de las células T está mediada por
el reconocimiento a través de su receptor (TCR) de los antígenos presentados por moléculas del complejo principal de histocompatibilidad
de clase I (MHCI). Aquí, hemos estudiado si existen características
intrínsecas en los péptidos inmunogénicos que les hagan más fácilmente reconocibles por el TCR.
103
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PÓSTERS
Material y Métodos. El análisis de los péptidos inmunogénicos se
ha realizado a partir de dos conjuntos distintos no solapantes de péptidos de 9 aminoácidos con alta afinidad de unión a moléculas MHCI obtenidos de las bases de datos EPIMHC, NHCBN y MHCPEP. Uno de los
conjuntos está compuesto por 101 péptidos inmunogénicos (HH), mientras que el otro está formado por 470 péptidos no-inmunogénicos (HN).
Hemos analizado la frecuencia de cada aminoácido en cada posición del péptido para cada conjunto. Para ello, hemos utilizado los 101
péptidos HH y 101 péptidos del conjunto HN –elegidos aleatoriamente–, para analizar la misma cantidad de péptidos de cada conjunto.
También hemos analizado las propiedades físico-químicas de los
aminoácidos que conforman los péptidos de ambos conjuntos. El estudio ha sido realizado con 101 péptidos HH y 101 HN. El análisis se ha
repetido 100 veces utilizando 100 conjuntos de 101 péptidos HN diferentes seleccionados al azar.
Por último, el modelado de la diferencia entre estos dos conjuntos
de péptidos se ha abordado como un problema de clasificación, utilizando algoritmos de inteligencia artificial en el entorno WEKA y empleando diversas codificaciones de secuencias distintas, así como combinación de las mismas: binaria, Blosum, propiedades de secuencia, composición de aminoácidos, composición de dipéptidos y propiedades
globales. Estos análisis se han realizado tanto considerando los 9 residuos del péptido, como únicamente aquellos residuos relevantes por
su interacción con el TCR (P1, P4, P7 y P8). Los resultados de las clasificaciones han sido evaluados en experimentos de validación cruzada determinando la sensitividad (SE), la especificidad (SP), la exactitud (ACC) y el coeficiente de correlación de Matthews (MCC).
Resultados. Hemos obtenido diferencias en las frecuencias de aminoácidos para cada posición de los péptidos de ambos conjuntos. De
igual manera, las propiedades físico-químicas de los aminoácidos de
cada posición difieren entre un conjunto y otro. En ambos casos estas
diferencias denotan cierta tendencia, pero no podemos extraer ninguna norma clara de ellas.
Los modelos óptimos de clasificación se obtienen al utilizar algoritmos SMO (“Sequential Minimal Optimization”) con una codificación basada en las propiedades físico-químicas de los aminoácidos.
Tomando un umbral tal que la sensitividad y la especificidad sean iguales (SE = SP = 0,67), obtenemos un valor de ACC = 0,67 y MCC = 0,24.
Considerando únicamente las posiciones de contacto con el TCR los
resultados obtenidos son significativamente peores.
Conclusiones. El análisis de los péptidos inmunogénicos y noinmunogénicos demuestra que, basándonos en la abundancia de aminoácidos o en sus propiedades físico-químicas, ambos conjuntos no
son claramente distinguibles. Sin embargo, los modelos de clasificación desarrollados sí son capaces de diferenciar entre ambos conjuntos. Si las propiedades inmunogénicas de los péptidos dependieran de
la restricción por una molécula MHC específica, nuestros modelos
de clasificación podrían mejorar si fueran entrenados únicamente con
péptidos restringidos por los mismos alelos MHC.
P-118
ESTUDIO DE EPISTASIS GENÉTICAS EN PACIENTES ESPAÑOLES DE ARTRITIS REUMATOIDE. M.N. Perdigones Borderías1, B.
Fernández-Gutiérrez1, D. Pascual-Salcedo2, M.Á. Figueredo Delgado1.
1Hospital Clínico San Carlos, Madrid. 2Hospital Universitario La Paz, Madrid
Objetivos. A pesar de los grandes avances obtenidos en los últimos
años en el conocimiento de la base genética de la artritis reumatoide (AR),
104
VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
restan por descubrir el 50% de los factores hereditarios asociados a esta
enfermedad. Por ello, tras la era de estudios de barrido genómico completo (GWAS), cada vez más trabajos se centran en el análisis de interacciones genéticas implicadas en la susceptibilidad a esta enfermedad. Distintos estudios han propuesto la existencia de epistasis entre polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) localizados en los genes IL1-SELS,
RTN4-GLIS3, MIF-TRAF1 y MIF-CTLA4, aunque no existen publicaciones que validen su implicación. Nuestro trabajo tiene como objetivo replicar estas interacciones genéticas en pacientes españoles de AR.
Materiales y mñetodos. hemos analizado aproximadamente 900
pacientes de AR diagnosticados según los criterios del ACR (American
College of Rheumatology) procedentes de dos hospitales madrileños (Hospital Clínico San Carlos y Hospital Universitario La Paz). El DNA se
extrajo mediante una técnica estándar a partir de sangre periférica y
el genotipado de los SNPs rs16944 (IL1), rs28665122 (SELS), rs17046477
(RTN4), rs7033413 (GLIS3), rs755622 (MIF), rs3761847 (TRAF1) y
rs3087243 (CTLA4) fue realizado mediante tecnología Taqman. El estudio de interacciones se realizó mediante recuento directo y el análisis
estadístico con el software EpiInfo v.6.02.
Resultados. En nuestro estudio de la interacción IL1-SELS no se
observaron diferencias significativas en la distribución de portadores/no
portadores del alelo A del rs28665122 (SELS) entre individuos homozigotos para el alelo minoritario del rs16944 (IL1) (38 de 123, 30,9%) y
el resto de enfermos de AR (228 de 889, 25,6%; p=0,215; OR=1,30 (0,841,99)), a pesar de que la potencia para detectar ese efecto descrito inicialmente (OR=2,26) era de un 97%. El análisis de la interacción RTN4GLIS3 no detecta variaciones significativas de las frecuencias genotípicas del marcador rs17046477 (RTN4) al ser estratificado por los distintos genotipos del marcador rs7033413 (GLIS3). Tampoco se observaron diferencias estadísticamente significativas de la distribución del
rs755622 (MIF) al ser estratificado por los distintos genotipos de los
SNPs rs3761847 (TRAF1) o rs3087243 (CTLA4) a pesar de que la potencia de nuestros estudios era suficiente.
Conclusiones. Las interacciones genéticas descritas entre SNPs
localizados en los genes IL1-SELS, RTN4-GLIS3, MIF-TRAF1 y MIFCTLA4 no se replican en pacientes españoles de AR.
P-119
UN MÉTODO SIMPLIFICADO PARA EL CRIBADO Y LA IDENTIFICACIÓN EXACTA DEL ALELO ASOCIADO A LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE HLA-DRB1*1501. E. Cisneros, M. Moraru, R. De Pablo,
C. Vilches. Hospital Puerta De Hierro, Majadahonda.
La investigación en esclerosis múltiple requiere con frecuencia la
detección de individuos portadores del alelo HLA-DRB1*15:01. Sin
embargo, la complejidad del sistema HLA hace que esta labor pueda
quedar restringida a laboratorios especializados en Histocompatibilidad. Para superar esta limitación, hemos desarrollado un método que
permite la detección simple, robusta y altamente específica del alelo
DRB1*15:01 a laboratorios no especializados en Histocompatibilidad.
Nuestro método combina, en una sola reacción, las ventajas de dos técnicas de uso generalizado para la tipificación HLA: la simplicidad y la
rapidez de la PCR- SSP y la alta resolución del SBT. Además, el método supera las complejidades técnicas asociadas a cada abordaje por
separado. La realización de una única reacción de amplificación en un
solo tubo permite hacer un cribado de los individuos DR2 positivos
sin necesidad de realizar una tipificación HLA completa. El remanente de la reacción sirve para identificar el alelo DRB1*15:01 mediante
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secuenciación directa con un único cebador; a diferencia del SBT convencional, los ADNs DR2-positivos no necesitan ser reamplificados.
Finalmente, la secuencia de nucleótidos así obtenida se compara “on
line” con las secuencias HLA oficiales depositadas en la base de datos
pública IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/Tools/blast2/nucleotide. html?IMGTHLA). En comparación con otros ensayos clásicos para
la detección de alelos asociados a la esclerosis múltiple (PCR-SSP, PCRSSOP y PCR en tiempo real), donde se requiere un número de cebadores o de sondas muy elevado para obtener una tipificación de alta resolución, nuestro método resulta menos complejo y permite asignar el
alelo DRB1*15:01 sin ninguna ambigüedad.
En conclusión, nuestro abordaje permitiría facilitar y agilizar la
investigación en esclerosis múltiple haciendo accesible la identificación específica del alelo DRB1*15:01 a los laboratorios de investigación
en Neurociencias.
*Este estudio ha sido financiado con el proyecto BFU2005-04622 (Mº Educación y Ciencia).
P-120
OLIGOMORFISMOS DE HLA-E Y VARIANTES EN LOS PÉPTIDOS DE UNIÓN DERIVADOS DE HLA-B EN EL SÍNDROME DE
BEHÇET. A. Clemente Ximenis, A. Cambra Conejero, C. Crespí Bestard, N. Matamoros Florí, M.R. Julià Benique. Hospital Universitari Son
Dureta, Palma de Mallorca.
Objetivos. El único ligando conocido de los receptores
CD94/NKG2A, B o C es el complejo compuesto por la molécula HLAE ligada al péptido que presenta. Dicho complejo colabora en la regulación de la respuesta citotóxica mediada por las células NK y otros linfocitos. HLA-E presenta específicamente péptidos derivados de la secuencia líder de moléculas HLA clásicas y HLA-G. Existen dos oligomorfismos principales de HLA-E y la funcionalidad del complejo HLA-E/péptido depende de cuál de ellos interviene y también de la segunda posición aminoacídica del péptido (P2), que puede ser Met o Thr. HLA-B*51
está fuertemente asociado al Síndrome de Behçet (SB) y la configuración
de su secuencia líder (Thr en P2) apunta a una inhibición ineficiente de
la respuesta citotóxica mediada por HLA-E. El objetivo del presente
trabajo consiste en definir la distribución de oligomorfismos de HLA-E
en pacientes con SB, evaluar su asociación con las variantes de HLA-B
que presentan Thr en P2 y analizar su correlación con la clínica.
Métodos. Tipificación de HLA-E mediante PCR-SSP con cebadores específicos de secuencia, diseñados para discriminar los cambios de nucleótido en los codones 107 y 157. Tipificación de HLA-B
mediante PCR-SSP comercial. Se estudian 44 pacientes diagnosticados
de SB y 100 individuos sanos.
Resultados. Sólo se detectaron 2 alelos en ambos grupos, E*0101
y E*0103, con frecuencias alélicas similares a las descritas en población
caucasoide. No encontramos diferencias estadísticamente significativas en la distribución genotípica de los alelos de HLA-E ni en la presencia de Thr o Met en la P2 de la secuencia líder de HLA-B entre
pacientes y controles.
Conclusiones. Según nuestros resultados, en la predisposición genética a padecer el Síndrome de Behçet no son determinantes los alelos de
HLA-E, contrariamente a otros estudios en los que se asocia un riesgo
reducido a HLA-E*0101. Tampoco se observa asociación entre la distribución de los diferentes péptidos derivados de HLA-B y el riesgo de
padecer la enfermedad. Son necesarios estudios funcionales para comprobar si en la regulación de los linfocitos citotóxicos de estos pacientes
son determinantes las diferencias en los complejos HLA-E/péptido.
PÓSTERS
P-121
ANALISIS DE LOS MARCADORES CELIACOGÉNICOS HLADQA1 Y –DQB1 EN PACIENTES CON ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL. D. Planelles1, M.M. Bosca2, M. Minguez2, M.
Rodríguez-Cebria1, J. Tosca2, E. Alba1, R. Granell1, D. Jarque1, E. Laguarda1, A. Benages2, R. Roig1. 1Centro de Transfusión de La Comunidad Valenciana, Valencia. 2Hospital Clínico Universitario, Valencia.
Se ha sugerido que la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y la
enfermedad celíaca (EC) puedan tener alguna relación debido al hecho
de que ambas son patologías inflamatorias crónicas que comprometen el intestino, desarrollan una respuesta inmune similar relacionada
con un patrón Th1 de citocinas y se consideran enfermedades poligénicas complejas en cuya etiopatogenia interaccionan factores genéticos, inmunológicos y ambientales. Entre los genes de susceptibilidad
al desarrollo de EC se ha identificado el haplotipo HLA-DQA1*05:01DQB1*02:01 como factor de riesgo primario. Sin embargo, los estudios
de asociación de genes candidatos en la EII han resultado inconsistentes y heterogéneos. El objetivo de este estudio ha sido evaluar la prevalencia de los alelos celiacogénicos HLA-DQA1 y -DQB1 en pacientes con EII.
El estudio ha incluido una serie de 332 pacientes con EII en los que
se ha realizado un análisis de frecuencias de los haplotipos marcadores clásicos de celiaquía (HLA-DQA1*05:01-DQB1*02:01 y DQA1*03DQB1*03:02) y no-clásicos (HLA-DQA1*02:01-DQB1*02:02). Los resultados obtenidos han sido comparados frente a un grupo control de 577
individuos sanos y con respecto a una serie de 185 pacientes celíacos,
todos ellos de la misma región geográfica.
En la población de pacientes con EII la frecuencia del haplotipo
HLA-DQA1*05:01-DQB1*02:01 fue estadísticamente similar a la del
grupo control (16,7% vs 20,6%) y significativamente diferente de la del
grupo de pacientes celíacos (71,3%). Tampoco se observó variación significativa cuando se comparó la frecuencia del genotipo heterocigoto
HLA-DQA1*02:01-DQB1*02:02 + DQA1*05:05-DQB1*03:01 entre pacientes con EII y controles (3,3% y 3,4%, respectivamente); por el contrario, sí se observó un incremento significativo de la frecuencia de este
genotipo en los pacientes celíacos (21,6%). La frecuencia del haplotipo
HLA-DQA1*03-DQB1*03:02, similar entre el grupo de pacientes con
EII (12,5%) y la población control (18%), apareció significativamente
disminuida en los pacientes con EC (5,4%).
En conclusión, mientras que en nuestra población el haplotipo
HLA-DQA1*05:01-DQB1*02:01 y el genotipo HLA-DQA1*02:01DQB1*02:02 + DQA1*05:05-DQB1*03:01 se confirman como marcadores de alto riesgo de celiaquía, no parecen ser factores de predisposición para desarrollar EII, por lo que el mecanismo de la potencial asociación entre EII y EC no parece tener base en los genes HLA de clase
II DQA1-DQB1.
P-122
¿EL GENOTIPO -1478 DEL/DEL EN EL GEN SOCS1 PROTEGE
CONTRA EL DESARROLLO DE LA LEISHMANIASIS CUTÁNEA
LOCALIZADA? K. Sánchez, M. Fernández-Mestre. IVIC, Dependencia
Federal, Venezuela.
Objetivo. La Leishmanisis es una enfermedad infecciosa causada por
el parásito protozoario Leishmania. En Venezuela, específicamente en
el Estado Miranda (Municipios Brión y Zamora) existen varias zonas
agrícolas que son endémicas para la forma localizada de la Leishmania-
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sis Cutánea (LCL). Sin embargo, en esas zonas existen individuos que
no llegan a padecer la enfermedad, sugiriendo la existencia de algún factor que confiere protección al desarrollo de LCL. En virtud de ello, nos
planteamos evaluar la distribución del polimorfismo -1478 CA/del en
la región promotora del gen supresor de la señalización de citoquinas 1
(SOCS1) en individuos venezolanos sanos y con LCL, con la finalidad
de determinar posibles asociaciones entre alelos y/o genotipos del gen
evaluado con el desarrollo o expresión clínica de la enfermedad.
Materiales y Métodos. La sangre total fue colectada de 100 individuos con LCL, diagnosticados clínica, inmunológica y parasitológicamente y 71 individuos sanos, procedentes de la misma zona, con
prueba de Montenegro negativa, sin cicatrices sospechosas de leishmaniasis, ni historia clínica de LCL. El polimorfismo -1478 CA/del se
determinó mediante PCR-RFLP. Las frecuencias alélicas y genotípicas
se determinaron por conteo directo, las diferencias entre grupos con
la prueba de Ji-cuadrado y la intensidad de la asociación como OR.
Resultados. Se detectó la presencia de la eliminación en la posición -1478 del gen SOCS1. La distribución genotípica en el grupo de
pacientes fue CA/CA: 0,77; CA/del: 0,22 y del/del: 0,01; y en el grupo control CA/CA 0,78; CA/del: 0,14 y del/del 0,8. Al establecer comparaciones, observamos una frecuencia significativamente disminuida del genotipo recesivo del/del en los pacientes LCL con respecto al
grupo control (p 0,021; OR= 0,13; IC95%=0,01-0,92).
Conclusión. Los resultados indican que el polimorfismo del gen
estudiado puede ser relevante en la infección y desarrollo de la LCL.
Sugiriendo que la presencia del genotipo del/del estaría confiriendo
protección a al desarrollo de la infección por Leishmania.
P-125
FRECUENCIA DEL ALELO HLA-B*57:01 EN LA POBLACIÓN DE
CANTABRIA INFECTADA POR HIV Y SU ASOCIACIÓN CON EL
HAPLOTIPO ANCESTRAL B57.1. M.Á. Hoz, P. Sánchez-Velasco,
M.C. Fariñas, S. Echevarría, D. García-Palomo, M. Gutiérrez-Cuadra,
F. Ausín, F. Leyva-Cobián, J.G. Ocejo-Vinyals. Hospital Universitario
Marqués de Valdecilla, Santander.
Objetivos. Los objetivos de este estudio son: (i) estudiar la prevalencia del alelo HLA-B*57:01 en la población de Cantabria infectada
con el HIV y atendida en la Unidad de Enfermedades Infecciosas de
nuestro centro; (ii) determinar la frecuencia de HLA-A y HLA-Cw y
(iii) estudiar la asociación con el haplotipo ancestral B57.1 (HLA-A*01,
B*57:01, Cw*06, DRB1*07, y DQB1*03:03) en aquellos individuos portadores del B*57:01 y su asociación con polimorfismos de otros genes
muy próximos en el cromosoma 6 (Hsp70-Hom, HCP5, HLA-Cw* en
la región 5’ no traducida)
Material y métodos. Se analizaron 1000 muestras de sangre de individuos caucásicos infectados con HIV. El DNA genómico se extrajo
mediante un método semiautomático. La determinación de HLA-I (A*,
B*, Cw* y HLA-II (DRB1* y DQB1*) se realizó mediante SSO-xMAP en
un Luminex. En las muestras que resultaron ser HLA-B*57 o DQB1*03
se determinaron los alelos mediante PCR-SSP. En el caso del polimorfismo de Hsp70-Hom se empleó la técnica de PCR-ARMS. Para los otros
dos polimorfismos (HCP5 y HLA-Cw*), los genotipos se determinaron
mediante secuenciación utilizando el kit MegaBACE sNuPe.
Resultados. Setenta y cuatro pacientes (7,4%) resultaron fueron
HLA B*57, 67 (90,5%) de los cuales mostraron el alelo B*57:01. Veinticinco de estos 67 individuos con el alelo B*57:01 (37%), no presentaban el haplotipo ancestral DRB1*07, DQB1*03:03.
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Veintiocho pacientes (41,8%) no presentaban el antígeno Cw*06.
Ocho de los pacientes con HIV portando el alelo B*57:01 presentaban
un genotipo Hsp70-Hom CC, siendo 8 TT y el resto CT. La frecuencia
de los dos alelos C y T fue de un 50 % cada uno.
Conclusiones. La presencia del haplotipo ancestral 57,1, y en concreto, del haplotipo parcial DRB1*07, DQB1*03:03 y de Cw*06 en nuestra población fue menor que la descrita en otras poblaciones. Igualmente, las frecuencias de los alelos C y T del gen Hsp70-Hom son muy
distintas a las comunicadas para individuos normales de raza caucásica. Se analizan estos y los resultados obtenidos de los polimorfismos
en HCP5 y HLA Cw*.
Aunque la presencia del alelo B*57:01 junto con el haplotipo
DRB1*07, DQB1*03:03 se ha asociado con un valor predictivo positivo
del 100% y negativo del 97%, respectivamente, de hipersensibilidad
frente al abacavir, la falta de estudios concluyentes hizo que en aquellos individuos que portaban el alelo B*57:01 pero con ausencia del
haplotipo ancestral B57.1 se desanconsejase también el tratamiento con
abacavir.
P-126
EL LOCUS IGH DEL PEZ TELEÓSTEO MEDAKA (ORYZIAS LATIPES). S. Magadán1, C. Sánchez Espinel2, F. Gambón Deza3. 1Instituto
Español de Oceanografía (IEO). Centro Oceanográfico de Vigo. 2Facultad
de Biología, Universidad de Vigo. 3 Hospital Meixoeiro, Complejo Hospitalario Universitario de Vigo (CHUVI).
Introducción. Los peces óseos presentan un sistema inmunológico que ha evolucionado de forma independiente de los animales que
pasaron a tierra desde hace 400 millones de años.
Objetivo. Estudio y análisis del locus IGH del pez teleósteo Oryzias latipes, uno de los peces más estudiados en laboratorio.
Métodos. Para llevar a cabo la búsqueda de los anticuerpos que
pueden producirse buscamos en múltiples librerías EST que se han
hecho de este animal y que están introducidas en el Genbank. Para el
análisis informático se empleó software diverso como NTI-invitrogene Vector program, FGNES y MEGA4 para el estudio filogenético.
Resultados. Hemos encontrado cinco zonas en una región del cromosoma ocho donde existen exones de tipo Cµ y Cδ.
Encontramos tres formas diferentes del anticuerpo de la clase IgM
y no encontramos ninguna secuencia de la clase IgD. Dos de las IgM
encontradas son de membrana. Una de ellas es una IgM transmembrana corta en la que faltan los dominios CH3 y CH4 siendo codificada
por la zona 1 del locus. Las otras dos IgM encontradas son codificadas
en la Zona 4 del locus siendo una transmembrana y la otra secretada.
En la forma transmembrana el splicing con el exón transmembrana se
realizan desde un lugar críptico dentro del exón Cµ3. La IgM secretada está compuesta por los cuatro dominios clásicos de esta inmunoglobulina.
Interpuestos entre las zonas donde se encuentran los genes para
las regiones constantes están las regiones VH. Hemos identificado 26
regiones que conforman cuatro familias.
Conclusiones. La disposición de lo exones, aparentemente desordenada, indica la presencia de recientes procesos de recombinación y
duplicación que han barajado los genes. Esta disposición hace sugestivo de que muchos de ellos no formen parte de anticuerpos reales.
El hecho de que se encuentren interpuestos exones de un anticuerpo
u otro lo asevera. La expansión de las familias VH ha sido reciente y
están relacionadas con las presentes en otros teleósteos.
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INMUNOLOGÍA
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FRECUENCIA DEL POLIMORFISMO FUNCIONAL MMP-9 1562(C>T) EN MUJERES CON PREECLAMPSIA EN LA REGIÓN
DE CANTABRIA. I.C. Vaquero Mejia, J.G. Ocejo-Vinyals , F.J. Llorca
Diaz, J. De Miguel Sesmero, F. Leyva Cobian. Hospital Universitario
Marques de Valdecilla, Santander.
Objetivos. Los mecanismos implicados en el desarrollo de la preeclampsia son desconocidos. Aunque se conocen muchos de sus aspectos, otros permanecen sin ser esclarecidos. Múltiples factores genéticos y ambientales parecen intervenir en la fisiopatología de esta enfermedad. Las metaloproteinasas de la matriz extracelular (MMPs), familia de enzimas que descomponen el colágeno en diferentes partes del
organismo incluida la decidua materna, especialmente la MMP-9, han
sido previamente involucradas en preeclampsia. Se ha descrito un polimorfismo en el gen de la MMP-9, (C-1562T), que afecta la actividad de
la enzima.
Nuestro objetivo ha sido determinar si el genotipo C-1562T MMP9 puede tener alguna relación con un mayor riesgo de preeclampsia
en mujeres embarazadas de la región de Cantabria.
Material y Métodos. Se estudiaron 110 mujeres con antecedente
de preeclampsia diagnosticadas entre el 2004 y 2010 en el hospital universitario Marques de Valdecilla y 221 controles sanos. Se extrajo el
DNA genómico de todas las muestras mediante un procedimiento
semiautomático. Mediante técnica de PCR-RFLP se analizó el polimorfismo de MMP-9.
Se analizaron los diferentes alelos y genotipos y se realizó el estudio estadístico mediante el uso de Chi cuadrado o test exacto de Fisher.
Resultados. La presencia de los alelos C y T entre casos y controles mostró una diferencia estadísticamente significativa (p= 0,001,
OR 2,09). El genotipo homocigoto TT se encontró en un 12,7% de mujeres con preeclampsia y en un 2,7% de los controles (p= 0,0008, OR 5,23).
Discusión. Nuestros datos se correlacionan con resultados obtenidos en la población brasileña y difieren de los reportados en otras
poblaciones. Aunque el alelo T no está presente en un elevado porcentaje de pacientes con preeclampsia versus controles (21,8% vs 11,8%)),
de estos resultados, podría deducirse una asociación del mismo con
desordenes hipertensivos del embarazo. Harían falta más estudios de
este tipo para demostrar su papel en la fisiopatología de la preeclampsia.
P-128
ASOCIACION DEL POLIMORFISMO FUNCIONAL C677T DEL
GEN MTHFR CON PREECLAMPSIA EN LA POBLACION DE
CANTABRIA. I.C. Vaquero Mejia, J. Ocejo-Vinyals , F.J. Llorca Díaz
, J. De Miguel Sesmero, F. Leyva Cobian. Hospital Universitario Marques
de Valdecilla, Santander.
Objetivos. El gen MTHFR localizado en el cromosoma 1(1p36.3)
codifica para una proteína de 77 K Da, la enzima metiltetrahidrofolato reductasa. Esta proteína resulta clave en el metabolismo del folato
y la homocisteína. Se ha descrito una variante polimórfica funcional
C>T en la posición 677 (C677T) del gen, localizada en el exón 4, que
determina la sustitución del aminoácido valina por alanina en su dominio catalítico. Esta sustitución da lugar a una variante termolábil de la
enzima la cual presenta una actividad del 50%. Los individuos que presentan dicha variante en homozigosis, presentan niveles elevados de
PÓSTERS
homocisteína en sangre. El polimorfismo C677T se ha estudiado como
factor de riesgo en mujeres con complicaciones durante el embarazo.
Nuestro objetivo principal es valorar si la hiperhomocisteinemia derivada de este polimorfismo podría ser utilizada como marcador de riesgo para enfermedad vascular placentaria y / o preeclampsia.
Material y Métodos. Se estudiaron 110 mujeres con antecedente
de preeclampsia y 221 controles sanos (mujeres con embarazo normal).
Se extrajo el DNA genómico de todas las muestras mediante un procedimiento semiautomático. Mediante técnica de PCR-RFLP se analizó el polimorfismo de este gen. El estudio estadístico de la distribución de los diferentes genotipos se realizó mediante el test de Chi cuadrado o test exacto de Fisher.
Resultados. La distribución genotípica entre grupos mostró diferencias estadísticamente significativas, encontrando el genotipo homocigoto CC en un 39% de mujeres con preeclampsia vs 73% de los controles (p< 0,00001, OR 0,23). El genotipo homocigoto TT estaba presente en el 16% de los casos vs el 1,35% de los controles (p< 0,00001, OR
14,22); finalmente, el genotipo heterocigoto CT se encontró en un 44%
de casos y en un 25% de los controles (p=0,0006, OR 2,37).
Conclusiones. La hiperhomocisteinemia determinada por la presencia del alelo T en homozigosis podría jugar un papel en la fisiopatología de la preeclampsia. En conclusión, en nuestra población, el
genotipo TT del polimorfismo C677T del gen de la MTHFR parece estar
asociado a una susceptibilidad de desarrollar preeclampsia durante el
embarazo.
P-129
COEXISTENCIA EN UN MISMO PACIENTE DE 3 SINDROMES
LINFOPROLIFERATIVOS. ESTUDIO FENOTIPICO Y DE CLONALIDAD PRE Y POST-TRATAMIENTO. P. Garrido, P. Jiménez, C. Sánchez, F. Valero, P. López, M. Almagro, J.M. De Pablos, P. Navarro, A.
Cabrera, M. Jurado , F. Ruiz-Cabello. Hospital Universitario Virgen de
las Nieves, Granada.
Introducción. Se presenta el caso de un paciente de 63 años en que
se diagnostican de forma simultánea 3 Sindromes Linfoproliferativos:
Tricoleucemia, Linfocitosis B monoclonal con criterios de Leucemia
Linfática Crónica (LLC-B) y Leucemia de Linfocitos Grandes Granulares (LGL). A destacar el predominio en sangre periférica (sp) tanto
por mielograma como por Citometría de Flujo de linfocitos de LLC y
LGL, mientras que en médula ósea (MO) la célula predominante era
el tricoleucocito.
Material y métodos. El análisis por Citometría de Flujo se ha realizado mediante marcaje directo con Ac monoclonales en 3-5 colores
(BD Biosciences) en un Citómetro FACSCanto empleando el FACSDiva software (BD Biosciences) para su análisis. El estudio de clonalidad del receptor del linfocito B (BCR) y T (TCR) se obtuvo a partir de
DNA extraído tanto en sangre periférica como en médula ósea siguiendo el protocolo BIOMED-2 descrito por Van Dongen.
Resultados. En la fase pre-tratamiento destaca el predominio por
inmunofenotipo de sp de un 13% de células con fenotipo de LLC-B y
un 4% de células con fenotipo de tricoleucocitos mientras que en MO
la célula predominante era el tricoleucocito (21%). Tras la instauración
de tratamiento disminuyó de forma considerable la población de tricoleucocitos en M.O. En el estudio de clonalidad basal destacaban 2
expansiones en FR2 en MO a 229 pb correspondiente a los tricoleucocitos y otra de menor intensidad a 264 pb de los linfocitos de LLC y 3
expansiones en FR3 a 106pb, 123 y 126 pb respectivamente. En sangre
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periférica predominaba por el contrario la expansión en FR2 de 264pb
(LLC-B). Tras el tratamiento han desaparecido en MO las expansiones
en FR2 y FR3 y en sangre periférica sólo persiste una pequeña expansión en FR3 a 106pb (LLC-B). La población de LGL ha permanecido
constante en todo momento.
Discusión. Se presenta el caso de un paciente con diagnóstico
simultáneo de 3 Síndromes Linfoproliferativos en el que se ha instaurado tratamiento quimioterápico frente a la clona predominante.
Como aportación de esta comunicación se documentan los estudios
de clonalidad realizados tanto pre como post-tratamiento, mostrándose la evidencia molecular de la efectividad terapeútica.
SESIÓN 11: INMUNOTERAPIA
Moderadores: Luis AlvarezVallina (Madrid)
Francisco Lozano (Barcelona)
P-130
TECNOLOGÍA PUNTA EN LOS PROCESOS Y PLANTAS DE PRODUCCIÓN DE IGG. T. De Agustin De Oro, L. Höfferer, A. Nigsch. CSL
Behring, Esplugues del Llobregat.
CSL Behring ha desarrollado una nueva tecnología punta en los
procesos de producción de inmunoglobulinas, consiguiendo dos productos líquidos, uno al 20% para la administración subcutánea, IgPro20
y otro al 10% para administración intravenosa (IgPro10, Privigen®).
Ambos están formulados con L- Prolina y concentrados para la obtención de una cantidad final de proteína de 200g/l o 100 g/l. Debido a
los puntos en común de los procesos de producción, ambos se fabrican en las mismas plantas de producción. En Berna (Suiza), se construyeron dos plantas con tecnología punta, la M99 y la IgLAB, de acuerdo con los estándares tecnológicos actuales y altamente automatizadas. Todos los procesos y actividad se registran electrónicamente, incluyendo el registro de cada lote. Los procesos de producción se realizan
bajo control medio ambiental (climatización automatizada, ventilación
y sistemas de aire acondicionado). La planta IgLAB tiene una capacidad anual de 3 millones de litros de plasma. El primer paso en los procesos de producción de las IgPro10 / IgPro20 es la precipitación de
la fracción de IgG del plasma para la creación de precipitado NA (fraccionamiento Kistler-Nitschmann) o precipitado II+III (precipitación en
frío de Cohn). El precipitado sobrenadante NA o II+III se somete a fraccionamiento por ácido octanoico, eliminándose las proteínas de alto
peso molecular y los lípidos. Después de una ultra/diafiltración, la
solución se incuba a pH 4 (para la inactivación viral), seguido por una
cromatografía de intercambio aniónico, mediante el cual las impurezas (sobre todo IgA e IgM) se unen a la resina. La solución resultante
conteniendo IgG se somete a filtración DV20 (específica para eliminación viral) y finalmente el filtrado se concentra al 10 o 20%, y se estabiliza con 250mM de L-Prolina. El proceso dura unos 4 días, seguidos por 1 día adicional para el llenado en condiciones estériles. Debido al alto grado de automatización, solo se necesitan 15 personas para
la producción de IgPro10 / IgPro20 en dos turnos diurnos.
Conclusión. El proceso de producción simple pero a la vez sofisticado, así como la tecnología punta y la automatización de las instalaciones, consigue productos con IgG altamente purificados cumpliendo con garantías los requerimientos de calidad.
108
P-131
EFECTOS ANTIINFLAMATORIOS DE LAS INMUNOGLOBULINAS MEDIADOS POR LA INHIBICIÓN DEL COMPLEMENTO:
MECANISMOS DE ACCIÓN CONOCIDOS Y PAPEL DE LOS ISOTIPOS DE INMUNOGLOBULINAS. T. De Agustin De Oro, R. Rieben, K. Matozan, S. Mischer, M. Spycher. CSL Behring, Esplugues del
Llobregat.
Se sabe que el sistema del complemento juega un papel importante en la inflamación y que está involucrado en el daño celular y tisular en muchas enfermedades autoinmunes. La capacidad de inhibición
del complemento que ejercen las inmunoglobulinas intravenosas
(GGIV) se conoce desde hace al menos 20 años, y este mecanismo de
acción antiinflamatorio de las GGIV se considera importante en el tratamiento de patologías como la dermatomiositis, la neuropatía multifocal motora y, potencialmente, en otras patologías autoinmunes. Se
han descrito algunos de los mecanismos por los que las GGIV inhiben
al complemento, incluyendo el “scavenging” del C3 y C4 activados, la
unión competitiva de la molécula de Ig por el C1, el aumento de la
inactivación fisiológica del C3b por factores I y H, y la neutralización
de las anafilotoxinas C3a y C5a mediadas por Fab (Basta M. Mol Imm
Rev 2008; 45:4073-9). Para el scavenging de fragmentos activados del
complemento, se han descrito diferencias en la actividad basadas en
las composiciones de las GGIV en isotipos (mayor actividad de IgM
[Rieben R, et al. Blood 1999; 93:942-51]) y diferencias en los procesos
de producción.
Mientras que la inhibición del complemento por las GGIV es un
efecto antiinflamatorio deseado durante la infusión intravenosa, las
inmunoglobulinas también pueden producir una activación perjudicial del sistema del complemento en el caso de que existan agregados en el preparado. Para poder identificar los lotes de GGIV que contienen agregados activados de Ig, se han realizado estudios in vitro
durante el desarrollo de las inmunoglobulinas con uso intravenoso
(hace al menos medio siglo), en los cuáles se midió el consumo del
complemento inducido por activación. A pesar de ello, estos estudios
no pueden diferenciar la inhibición beneficiosa del complemento de
la perjudicial. Los estudios que incluyen la medición de los marcadores de activación del complemento (C5a y C3a) y los análisis indirectos del complemento-scavenging por GGIV pueden ofrecer un novedoso sistema de análisis para la evaluación de las GGIV in vitro.
P-132
ESCAPE INMUNOLÓGICO DE CÉLULAS CON ALTERACIONES
IRREVERSIBLES EN EL GEN BETA 2-MICROGLOBULINA: ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN HLA DE CLASE I EN LESIONES METASTÁTICAS OBTENIDAS DE UN PACIENTE DE MELANOMA
ANTES Y DESPUES DEL TRATAMIENTO CON DCS TRANSFECTADAS CON MRNA TUMORAL. A.B. Del Campo1, J. Carretero
Coca1, R. Méndez2, I. Maleno2, J. Amund Kyte3, G. Gaudernak3, T. Cabrera1, N. Aptsiauri1, F. Ruiz-Cabello1, F. Garrido1. 1Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Universidad de Granada, Granada. 2Hospital Universitario Virgen de las Nieves. 3The Norwegian Radium Hospital, Oslo, Norway, , Norway.
Las células T citotóxicas (CTLs) juegan un papel central en la eliminación de células infectadas por virus y células tumorales, siendo
necesario para ello la expresión de moléculas HLA de clase I. No obstante, la pérdida total de estas moléculas en la superficie celular es un
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INMUNOLOGÍA
mecanismo frecuente empleado por el tumor para evadir la inmunovigilancia. Se han descrito tres mecanismos principales en células tumorales con pérdida total de clase I: mutaciones en beta-2-microglobulina (b2m), deficiencias en TAP, y baja afinidad en la unión de los elementos reguladores de estos genes.
Se han analizado las alteraciones en las moléculas HLA de clase
I presentes en las muestras de tejido procedente de biopsias conservadas en parafina, así como una línea celular obtenida de un paciente
con melanoma metastásico (Kyte et al, 2006). En el análisis mediante
inmunohistoquímica con anticuerpos anti-cadena pesada HLA-ABC
y anti-beta-2-microglobulina se encuentran biopsias positivas, muestras con áreas débilmente positivas, y muestras con zonas tumorales
negativas para dichas moléculas.
El mRNA aislado de una de las lesiones metastásicas con un patrón
inmunohistoquímica fundamentalmente negativo para beta-2-microglobulina, con una mutación puntual en un alelo del gen b2m, y una
LOH en el cromosoma 15, fue usado para desarrollar una vacuna de
células dendríticas, tras la cual, el paciente desarrolló una nueva lesión
metastásica de la que se estableció una línea celular a partir de una
citología. El análisis por FACS mostró una pérdida total de expresión
en superficie de HLA de clase I, debida a una mutación en b2m, así
como una LOH en los cromosomas 6 y 15.
La expresión normal de HLA de clase I en la línea celular fue recuperada mediante la transfección con el vector adenoviral AdCMVb2m
(del Campo et al, 2009) confirmándose la actividad funcional del complejo HLA de clase I recuperado en superficie.
En este paciente, las células tumorales portan alteraciones en HLA
de clase I (mutación en b2m, LOH en el cromosoma 15) y muestran una
pérdida total de expresión de HLA de clase I tras la inmunoterapia. Esto
sugiere que las variantes generadas HLA negativas son capaces de evadir el sistema inmune proporcionando a las células tumorales el escape al reconocimiento inmune por CTLs, lo que podría explicar la evolución clínica del paciente y el fallo de la inmunoterapia aplicada.
P-133
INMUNOGLOBULINAS INTRAVENOSAS EN ENFERMEDADES
NEUROMUSCULARES AUTOINMUNES: ANALISIS COMPARATIVO DE REGIMEN DE 5 DÍAS VS 2 DÍAS. M. García Ormaechea,
E. Moga Naranjo, E. Martínez, L.A. Querol Gutierrez, C. Juárez Rubio,
I. Illa. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona.
Introducción. Las inmunoglobulinas endovenosas (IVIg) se utilizan como tratamiento inmunomodulador en numerosas enfermedades autoinmunes e inflamatorias. La dosis de 2g/kg se administra entre
1 y 5 días sin que haya evidencia de los beneficios de cada régimen.
Nuestro objetivo es estudiar las posibles diferencias clínicas y biológicas entre las dos pautas de infusión, 5 días vs 2 días.
Métodos. Los pacientes (n=5) recibieron las dos pautas de infusión, 2 y 5 días. Se realizaron estudios en sangre periférica pre- y postinfusión (inmediatamente, a los 10 y 30 días). Se determinó la expresión de los receptores Fcγ (FcγRI, FcγRII and FcγRIII), HLA Clase I (A,
B y C) y HLA Clase II (DR) en monocitos por citometría de flujo, y se
analizaron los niveles de STAT1 y STAT3 fosforilados en monocitos
tras estimulación con IFN-γ e IL-10 respectivamente. Se estudiaron las
escalas clínicas INCAT y QMG antes y a los 10 y 30 días después de la
infusión.
Resultados. No se han observado diferencias entre ambas pautas
de administración en la expresión de los receptores Fcγ, HLA Clase I
PÓSTERS
y II, así como tampoco en la mejoría clínica y efectos adversos. Sin
embargo, en la pauta de 2 días, había un descenso de los niveles de
pSTAT1 (88,67% ± 0,22% vs 73,75% ± 0,75%, antes vs día 10 después
de la infusión, respectivamente; p=0,022) y un aumento en los niveles
de pSTAT3 (35,35 ± 5,3% vs 54,34% ± 4,36%, antes vs día 30 después
de la infusión, respectivamente; p= 0,031), no observada en la pauta
de 5 días.
Conclusión. Estas 2 pautas diferentes de infusión podrían estar
alterando los niveles de activación de pSTAT1 y pSTAT3 sin diferencias en la evolución clínica de los pacientes. Sin embargo, se necesita
un número elevado de pacientes para corroborar estos hallazgos.
P-134
EVALUATING THE ACTIVITY OF QUINTON SOLUTIONS ON
THE IMMUNE SYSTEM. P. Maseres Javaloy, J.E. Martínez López, P.
Martínez Peinado, M. García Irles, J.M. Sempere Ortells. Universidad
de Alicante, Alicante.
Objectives. We have recently described an in vitro modulating
effect of QI (Quinton Isotonic® solution; ultrafiltrated cold processed
seawater) on PBMNc from healthy controls.QI is able to emulate many
of the results observed when using conventional culture media such
as RPMI, in terms of cell-morphology, -viability, -proliferation and aggregation. It also exerts a protective effect on erythrocytes avoiding
spontaneous lysis.
Our aim is to amplify the in vitro study of QI on the immune system
and to evaluate the in vivo effect of QH (Quinton Hypertonic® solution)
after oral administration.
Methods. Isolated PBMNc from ten healthy volunteers were
cultured under the following conditions: RPMI, QI and Saline solution
(SS). Cell-activation was measured by flow cytometry according to the
expression of membrane antigens and production of intracellular
cytokines.
QH was orally administered to 5 healthy controls (2+2+2 ampoules
in six hours) and leukocyte activation measured by flow cytometry
according to the expression of membrane antigens and adhesion
molecules vs. pre-administration values.
Results. QI but not SS increased the percentage of cultured
lymphocytes coexpressing CD25, athough in a lesser extent than RPMI.
Cells cultured with QI vs. SS and RPMI also showed an increased
intracellular expression of TNF-α, IL-2 and INF-γ.
QH was able to increase in vivo the lymphocyte expression of CD25,
CD28 and CD45RO membrane antigens as well as the leukocyte
expression of CD11a and CD11b.
Conclusion. QI seems to activate the immune system both in vitro
and in vivo, by increasing the expression of some activation
markers/adhesion molecules and by stimulating a Th1 cytokine profile.
P-135
ESTABILIDAD DE LA EXPRESIÓN DE CD90 EN HFA-MSCS SOMETIDAS A CULTIVO INDEFINIDO. N. Fernandez Arcas1, J.M. Miranda Sayago1, C. Benito López1, A. Reyes Engel2, J. Carrera Rodríguez1, A.
Alonso Ortiz1. 1HRU Carlos Haya, Malaga. 2Universidad de Malaga.
Las células madre mesenquimales humanas (hMSCs) se han convertido en una de las principales promesas en la medicina regenerativa, debido a su capacidad para diferenciarse hacia diferentes linajes
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VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
de potencial uso en terapias celulares. Las hMSCs pueden ser aisladas
desde diferentes tejidos mediante técnicas más o menos invasivas y
son caracterizadas mediante un criterio mínimo internacional.
Junto a la capacidad de diferenciarse hacia poblaciones de interés,
las MSCs han demostrado tener capacidades inmunomoduladoras. En
la actualida múltiples son las investigaciones que se están realizando
con el fin de esclarecer cuáles son los mecanismos implicados en la
inmunomodulación que ejercen estas células.
La médula ósea es la principal fuente para la obtención de poblaciones mesenquimales (BM-MSC), pero recientemente nuevas fuentes
han surgido como contrapunto a las BM-MSCs. Una de estas nuevas
fuentes es el líquido amniótico. El líquido amniótico es obtenido
mediante técnicas mínimamente invasivas en los procedimientos de
amniocentesis para diagnóstico prenatal y se ha demostrado como una
importante fuente para el aislamiento de hMSCs.
Hoy por hoy se desconoce cuál es el comportamiento que presentan las células madre mesenquimales humanas derivadas del líquido amniótico (hAF-MSCs), y si poseen las mismas capacidades de
inmunomodulación que las hBM-MSCs. Lo que sí está confirmado
es que el líquido amniótico presenta capacidades inmunomoduladoras.
Campioni et al. proponen al marcador CD90, uno de los empleados para la caracterización de las hMSCs, como un indicador de las
capacidades inmunomoduladoras. Observan que una disminución en
los niveles de expresión de CD90 se asocian directamente con una disminución en las capacidades inmunomoduladoras de las hBM-MSCs
conforme el cultivo progresa.
En el presente trabajo, se realiza una caracterización de las AFMSCs en cultivo in vitro indefinido, centrándonos especialmente en las
variaciones en los niveles de expresión de CD90.
SESIÓN 12: INMUNIDAD Y TRASPLANTE
Moderadores: Jose Luis Vicario (Madrid)
Eduard Palou (Barcelona)
P-136
VALOR PRONÓSTICO DE LA DETERMINACION DE IL-10 TRAS
UN RECHAZO EN TRASPLANTE DE HIGADO. B. Manzanares
Martin, R. González Fernández, M. De La Mata García, S. Rufián Peña,
L. Castro Orgaz, J. De La Torre Cisneros, J. Peña Martínez. Hospital
Reina Sofia, Córdoba.
Actualmente sigue resultando de gran interés definir diferentes marcadores que puedan determinarse de forma rutinaria y sirvan de ayuda para establecer una inmunosupresión individualizada en los enfermos trasplantados. En concreto, la IL-10 podría ser un buen candidato
debido a su potente acción inmunosupresora y antiinflamatoria.
Objetivos. Establecer el valor pronóstico de los niveles de IL-10
tras un rechazo en trasplantados de hígado. Determinar el riesgo posterior de infección y rechazo.
Material y métodos. Se analizaron muestras de 25 pacientes trasplantados de hígado en nuestro hospital recogidas en el pretrasplante inmediato y postrasplante (días 1, 3, 5, 7, 15, 30 y posteriormente un
control al mes hasta el año. Este control se intensificó durante los cuadros infecciosos o de rechazo. Para la determinación en suero de IL-10
110
se utilizó la técnica Quantikine de R&D Systems. El diagnóstico y grado de rechazo se hizo por criterios clínicos y anatomopatológicos según
protocolos de seguimiento vigentes en este hospital. Los cuadros infecciosos fueron diagnosticados según los criterios establecidos en cada
caso.
Resultados. La elevación de IL-10 en el periodo inmediato posterior a un rechazo se correlaciona con pronóstico favorable en cuanto
se observa un bajo índice de rechazos e infecciones durante la evolución del paciente. Sin embargo la disminución de IL-10 en este mismo
periodo se correlaciona con pronóstico desfavorable. La etiología de
la infección observada parece no depender de los niveles de IL-10.
En la evolución posterior, bajos valores de IL-10 en suero, o disminución respecto a valores anteriores, se relacionan con rechazo en pacientes trasplantados de hígado y al contrario si los valores de IL-10 están
elevados. Se presentarán también los datos de cada paciente en los
casos que sufrieron rechazo.
En conclusión, estos resultados podrían aconsejar la monitorización de IL-10 de los enfermos trasplantados de Hígado una vez hayan
tenido un episodio de rechazo.
P-137
LA ELECCIÓN DE INMUNOSUPRESOR TIENE UN PAPEL FUNDAMENTAL EN EL DESARROLLO DE HEPATITIS INMUNE DE
NOVO MEDIADA POR ANTICUERPOS ANTI-GLUTATION STRANSFERASA T1. I. Aguilera García1, J.M. Sousa Martín2, J.M.
Praena3, M.A. Gómez Bravo2, L. Barrera Pulido2, A. Núñez Roldán1.
1Instituto de Biomedicina de Sevilla, H. U. Virgen del Rocío, Sevilla. 2H. U.
Virgen del Rocío. 3Fundación Pública Andaluza para la investigación.
Objetivos. Analizar la influencia potencial que un grupo de factores puede tener sobre el proceso denominado hepatitis inmune de
novo, complicación a largo plazo del trasplante hepático. Resultados
experimentales de nuestro grupo demuestran que este proceso es una
forma especial de rechazo debido a la incompatibilidad para el gen de
la Glutation S-transferasa T1 (GSTT1) entre donante (positivo) y receptor (nulo), con presencia de anticuerpos anti-GSTT1 donante-específicos. Sin embargo, no en todos los casos se desencadena la respuesta
inmune.
Materiales y métodos. El estudio incluye 162 pacientes con un
seguimiento medio de 32 meses (17-47). El genotipo GSTT1 se determinó mediante PCR. Los anticuerpos se detectaron por IFI y ELISA.
Las variables estudiadas fueron las siguientes: causa del fallo hepático, edad y sexo de donante y receptor, terapia inmunosupresora, infección por citomegalovirus, episodios de rechazo agudo y crónico, gammapatía monoclonal, picos de IgG y presencia de otros anticuerpos.
Los análisis estadísticos se realizaron mediante el sistema SPSS (¯2, test
exacto de Fisher).
Resultados. 35 de los 162 pacientes (21,6%) conformaban el grupo de receptores GSTT1 nulos con donantes GSTT1 positivos. Con ellos
se continuó el estudio, dado que es el único grupo donde pueden ocurrir los dos acontecimientos de interés: producción de anticuerpos antiGSTT1 y desarrollo de hepatitis inmune de novo. 18 de los 35 (51,4%)
produjeron anticuerpos y 9 de los 35 (25,7%) desarrollaron la enfermedad. La mayoría de las variables analizadas, no parecen tener efecto
sobre los acontecimientos de interés, excepto la terapia inmunosupresora. Cuando comparamos el grupo que tomaba ciclosporina (CsA)
con el grupo que tomaba tacrolimus (Tac)(en ambos casos podía estar
combinado con MMF) vemos que la utilización de Tac tiene una cla-
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INMUNOLOGÍA
ra influencia en que se evite la producción de anticuerpos y en la prevención de la hepatitis inmune de novo. El número de pacientes sin anticuerpos en el grupo de Tac fue significativamente mas alto que en el
de CsA (94,1% vs 5,9%, p= 0,001). Con respecto al desarrollo de la enfermedad se observó un efecto protector del Tac frente a CsA (80,8% vs
19,2%, p= 0,003).
Conclusión. La elección de inhibidor de la calcineurina puede tener consecuencias en cuanto al desarrollo de la hepatitis inmune de novo post-trasplante hepático mediada por anticuerpos antiGSTT1.
PÓSTERS
Conclusion. The PRA concept with respect to humoral rejection
evolution by luminex technology could be apparently obsolete and it
could be more useful the MFI level cuantification.
P-139
LAS CÉLULAS T REGULADORAS (CD25+CD127LOW/- CD4+
FOXP3+) COMO MARCADOR DE ALTERACIONES DE LA GLUCOSA EN EL TRASPLANTE RENAL. A. Marín, B. Bayés, M. Granada, M.C. Pastor, A. Sánchez, R. Lauzurica, R. Romero, R. PujolBorrell, E. Martínez-Cáceres. Hospital Germans Trias i Pujol (LIRADBST), Badalona.
P-138
PLASMAPHERESIS/IVIG/ANTI-CD20 COMBINATION DOES
NOT MODIFY PRA PERCENTAGE BY LUMINEX TECHNOLOGY
BUT DECREASE THE DSA MFI LEVELS IN KIDNEY TRANSPLANT: IS THE PRA CONCEPT OBSOLETE? F. Boix Giner, S. Llorente, G. Salgado, J.M. Alemany, M. López, R. López, M.J. González,
J.A. Campillo, A. Minguela, M.R. Álvarez-López, M. Muro. Hospital
Virgen de la Arrixaca, Murcia.
Anti–donor specific HLA antibodies (DSA) have been recognized
as a major cause of graft loss in the last few years. Particularly, in HLA
class II antibody screening, newer serum screening methods, such as
Luminex technology, have greatly enhanced specificity analysis of antiHLA class II antibodies in sensitized patients. Con el analizador luminex,
la fluorescencia de las microesferas expresada como intensidad media
de fluorescencia (MFI) es directamente proporcional a la cantidad de
anticuerpo unido a las microesferas.
Objetives. This work presents a very interesting clinical case with
desensitization protocol with plasmapheresis/IVIG and anti-CD20 and
as the values of MFI units indicate the successful treatment evolution,
in opposite to PRA data outcome.
Clinical case. A Caucasian 70-year-old-woman was transplanted
in our hospital with a deceased donor (71 years-old). The HLA matching
between donor-recipient was zero (only matched age). Our patient was
not sensitized to HLA antigens, with a PRA level approaching 0% by
luminex and CDC techniques. Before transplantation, cross-matching
(CM) by standard CDC assay was negative.
In the immediate post-transplant (PO) period, the patient had
important instability in renal function. In the post-transplantation
monitoring (15 th PO), we detected anti-HLA class II antibodies
(IgG) by Luminex (LabscreenMix, OneLambda, CA). Anti-HLA class
I and anti-MICA antibodies screening was negative. Secondly, we
detected anti-DRB1*04 and DQB1*0302 (donor´s typing had these
alleles) antibodies with MFI=5673 and PRA=36% (LabscreenPRA,
OL). A week later (22th PO), the patient was more highly positive
reaching MFI=7986 and PRA=34%. With these facts, nephrologists in
our hospital indicated a renal biopsy which was compatible with
humoral rejection, positive for C4d deposition. She was pulsed
with corticosteroids, plasmapheresis and IVIG without functional
improvement. The MFI data one week later was not different to the
previous samples.
Thus, we added anti-CD20 (Rituxan) and the initial clinical response
was highly favorable. Biopsies on 45th PO resulted in suggestive
reversion of the rejection. Analysis of the serum on the 45th PO disclosed
that the MFI of the anti-donor DR4 had fallen to 2.021 (PRA=35%) and
seven days later to 1176 (PRA=34%). However, all samples in this study
showed a similar PRA level of 34-36%.
Estudios en la población general han demostrado el papel de las
células T reguladoras y la inflamación en la aparición de diabetes mellitus (DM).
Objetivo. Determinar la incidencia de alteraciones de la glucosa
(AG) en el post-trasplante renal. Determinar la relación entre las AG y
el fenotipo linfocitario así como con los niveles de citocinas proinflamatorias/inmunomoduladoras.
Metodología. 55 pacientes no diabéticos sometidos a trasplante
renal (TR). 66% hombres. Edad: 48±13 años. Inmunosupresión (IMS):
basiliximab, prednisona, tacrolimus y micofenolato. A los 3 meses postransplante se realizó Test de tolerancia oral a la glucosa (TTOG)(75g
glucosa)para clasificar las AG según criterios de la American Diabetes
Association (ADA). El análisis de subpoblaciones linfocitarias CD3,
CD4, CD8, DP γδ, Treg (CD25+127low/– CD4+Foxp3+), NK (CD16+/56+),
NK CD56high, iNKT, CD19+, LB transicionales (CD19+CD27–
CD24+CD38+) se realizó por citometría de flujo en muestras de sangre fresca preTR, 1m-postTR y 3 m-postTR, junto a la determinación
sérica de PCR, IL6, TNFγ, IL10, RsIL2, TGFβ. También se determinaron los niveles de glucosa, insulina, hemoglobina glicosilada (HbA1c),
triglicéridos y adiponectina.
Resultados. Tras el trasplante se observó un incremento de la
HbA1c y triglicéridos y disminuyeron la adiponectina y los niveles de
citocinas pro-inflamatorias (p< 0,05). El fenotipo linfocitario se vió alterado por el tratamiento IMS en la mayoría de las subpoblaciones analizadas, de forma más acentuada a 1m post-TR. El % de Treg desciende al mes del TR y posteriormente se recupera sin llegar a alcanzar, a
los 3m, las concentraciones basales.
Un 32% de los pacientes presentaron AG, siendo la intolerancia
oral a la glucosa la AG más frecuente. PreTR no se observaron diferencias entre normoglicémicos (NG) y AG en: glicemia, HbA1c, triglicéridos, adiponectina y niveles de citocinas, aunque los pacientes con
AHG presentaron a los 3 m postTR una menor concentración de TGFβ
(p= 0,028). En relación a las subpoblaciones celulares, el análisis estadístico mostró que existe una relación inversa entre Treg y glucemia
(r= -0,271, p= 0,05) e insulina (r= -0,328, p= 0,026). El % de Treg respecto al total de CD4+Foxp3+ era menor en los pacientes que desarrollaron AG (preTR: NG 76 ± 8% vs AG 70 ± 9% p= 0,038 y 3 m postTR: NG
72 ± 8% vs AG 65 ± 10% p= 0,018) no observándose diferencias significativas en las otras subpoblaciones. La regresión logística de alteraciones de la glucosa a los 3 meses posTR frente a la edad, Treg preTR
y adiponectina preTR puso de manifiesto que el porcentaje de Treg
es un factor de riesgo independiente de AG en el postTR (Treg: β=-1,94,
sig= 0,041, Exp β= 0,143).
Conclusiones. Las AG son frecuentes en el postTR. Los marcadores clásicos como las citocinas pro-inflamatorias y la adiponectina no
permiten predecir qué paciente presentará AG. El porcentaje de Treg
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es un predictor de AG, lo que sugiere que en la aparición de AG postTR puede existir un componente inmunitario.
P-140
TRATAMIENTO DE DESENSIBILIZACIÓN CON UN INHIBIDOR
DEL PROTEOSOMA EN UN PACIENTE HIPERINMUNIZADO. M.
Vilches, T. García Álvarez, A. Mazuecos Blanca, A. Nieto. Hospital Puerta del Mar, Cádiz.
Muy recientemente, algunas series de casos han sugerido que el
inhibidor del proteosoma bortezomib tiene efecto directo sobre las células plasmáticas secretoras de anticuerpos en pacientes con rechazo del
injerto. Sin embargo, la capacidad de este agente para desensibilizar
candidatos a trasplante, los cuales no reciben inmunosupresión, es
actualmente desconocida.
En el presente trabajo, un paciente altamente sensibilizado (CDC
PRA= 92%) en lista de espera tras un primer trasplante fue sometido
a tratamiento de desensibilización con inmunoglobulinas iv a altas
dosis (días 0 y 31) y Rituximab (días 7 y 22). Dado que no se observaron variaciones en los niveles de anticuerpos anti-HLA, se ensayó la
administración de bortezomib, 1,3 mg/m2 a días 1, 4, 8 y 11. Se tomaron muestras antes del inicio del tratamiento, y a los 10 y 28 días postratamiento. Se realizó monitorización de anticuerpos anti-HLA mediante microesferas de antígeno único clase I y clase II con suero puro y
dilución 1/100. Asimismo, se procedió a determinación de PRA por
CDC, y se midieron las concentraciones de inmunoglobulinas, de anticuerpos específicos frente a una batería de virus y de poblaciones linfocitarias.
Con los sueros puros se observó una discreta disminución progresiva en la intensidad de fluorescencia de los sueros postratamiento en
todos y cada uno de los antígenos HLA positivos (32 de clase I y 27 de
clase II). Esta disminución fue mucho más evidente en los sueros a dilución 1/100 (disminución media del 15,4% y 39,5% a los 10 y 28 días
postratamiento respectivamente en antígenos de clase I, y del 38,1% y
56,6% en antígenos de clase II). Sin embargo, no se observó disminución en el PRA (93%).
En conclusión, un ciclo aislado de bortezomib puede tener un efecto insuficiente en pacientes con una concentración elevada de anticuerpos anti-HLA.
P-141
EL EMPLEO DE PCR EN TIEMPO REAL PROPORCIONA UN
INCREMENTO EN LA CAPACIDAD DE PREDICCION DE RECAIDAS TUMORALES POST-TRASPLANTE ALOGENICO DE PROGENITORES HEMATOPOYETICOS. A. Balas Pérez, F. García Sánchez, J.L. Vicario Moreno. HICENTRO de Transfusión de Madrid, Madrid.
La recidiva tumoral es una de las causas más frecuentes de mortalidad post-trasplante de progenitores hematopoyéticos en pacientes
con leucemia.
Tras el trasplante de progenitores, es de especial interés determinar
si el nuevo sistema hematopoyético es de origen autólogo, pertenece
al donante o existe una mezcla de ambos. En la actualidad este tipo de
información se obtiene mediante estudios de quimerismo genético, utilizando como metodología básica el estudio de sistemas VNTR (Variable Number of Tamden Repeats) o STR (Short Tamden Repeats). Recientemente se han desarrollado estrategias basadas en el empleo de tec-
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VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
nología de PCR cuantitativa en tiempo real (qrt-PCR), empleando polimorfismos de un único nucleótido (SNP) o de inserción-deleción (indels).
El objetivo del presente trabajo es la comparación de las tecnologías de STR y qrt-PCR en un estudio retrospectivo de pacientes sometidos a trasplante, con el fin de determinar correlación entre ambos sistemas así como su nivel de sensibilidad comparado. Asimismo, se analizó un grupo de pacientes que han sufrido recaída tumoral, con el fin
de determinar cual de las dos metodologías permite una mayor predicción de recaída y en que grado.
El estudio de quimerismo mediante sistemas STR se llevo a cabo utilizando un panel de 10 sistemas genéticos (VWA, F13A1, LPL/LPS, TPOX,
D16S539, D21S11, D22S689, Amelogenina, D7S820, D18S51) analizados
en un secuenciador ABI 3130. Por otro lado, para el análisis mediante qrtPCR se emplearon 34 indels englobados en el AlleleSEQR chimerism assay
(Celera Corporation, Alameda,CA) empleando un equipo ABI 7500.
De la comparación de ambas metodologías se puede concluir que:
1. En el 100% de las parejas receptor/donante analizadas mediante
qrt-PCR se han encontrado al menos un sistema informativo, obteniéndose una media de 4 y 7 sistemas informativos para donantes emparentados y no emparentados respectivamente.
2. La comparación de los resultados obtenidos mediante ambas metodologías sobre muestras control obtenidas por dilución límite
del componente menor, demuestra una sensibilidad del 1% y 0,01%
para PCR-STR y qrt-PCR respectivamente. La correlación entre
ambos métodos se ha estimado en R2=0,988. Asimismo la correlación entre la dilución teórica y la obtenida por qrt-PCR es 0,989
para diluciones del 25% al 0,05%, siendo aún mayor, 0,999, para
las diluciones en el rango 1%-0,05%. Para este rango de dilución,
la correlación con el teórico para STR fue solo del 0,88%.
3. El análisis de recidivas mostró que en 11 de las 15 recaídas analizadas se detecto incremento de quimera mediante qrt-PCR y no
mediante STR, obteniéndose una anticipación media en el diagnóstico de recaída de 75 días.
La metodología de qrt-PCR aplicada al estudio de quimerismo
post-trasplante hematopoyético proporciona una mayor sensibilidad
y aplicabilidad clínica que métodos basados en PCR convencional.
P-142
GSTT1, UNA NUEVA DIANA POTENCIAL PARA LA ENFERMEDAD
INJERTO CONTRA HUÉSPED CON AFECTACIÓN HEPÁTICA TRAS
EL TRASPLANTE ALOGÉNICO DE PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS. M.J. Martínez-Bravo1, I. Tallón2, I. Espigado2, Á. Urbano-Ispizúa2, A. Núñez-Roldán1, I. Aguilera1. 1Hospital Universitario Virgen del RocíoIBIS, Sevilla. 2Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla.
Introducción. La GSTT1 (Glutatión S-Transferasa T1) se ha descrito como sistema menor de histocompatibilidad en trasplante hepático
y renal, debido a la presencia de un 20% de genotipo nulo en la población caucásica. En ambos trasplantes se observó un rechazo mediado
por anticuerpos en pacientes GSTT1 negativos que recibieron un injerto de un donante GSTT1 positivo. El objetivo de este estudio es analizar el papel de los anticuerpos anti-GSTT1 en un paciente sometido
a Trasplante Alogénico de Progenitores Hematopoyéticos (TAPH) afectado por Enfermedad Injerto Contra Huésped (EICH) hepática.
Materiales y métodos. La presencia de anticuerpos se realizó usando técnicas de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) sobre tejido triple
de rata. Se confirmó mediante ELISA, con la GSTT1 recombinante
humana. El genotipo para la GSTT1 se realizó por PCR.
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Resultados. Varón, de 33 años, fue sometido a un TAPH de sangre
periférica de su hermana, HLA idéntica, de 31 años y multípara. El día
+30, el paciente tenía aumentados los niveles de enzimas hepáticas en
sangre periférica (ALT 234 UI/L; AST 129 UI/L, γ-GTP 926 UI/L; ALP
1918 UI/L, Bilirrubina Total (BT) 9,78 mg/dL). Fue diagnosticado de
EICH hepática aguda, sin afectación intestinal ni cutánea, tratándose
con Prednisona (PDN) (1 mg/kg/d) a partir del día +35. La función
hepática se normalizó el día +74, retirándosele la PDN. En el mes +5, el
nivel de enzimas hepáticas volvió a aumentar reintroduciéndose la
PDN. En este momento se sospechó una posible hepatitis autoinmune.
El suero del paciente presentaba anticuerpos anti-nucleares y anti-GSTT1.
Se analizó el ADN y se comprobó que el paciente era heterozigoto para
la GSTT1, mientras que su donante era homozigota nula. La donante
poseía un bajo título de anticuerpos anti-GSTT1 (1:40) en suero resultado de la exposición al antígeno que tuvo lugar durante tres embarazos de embriones GSTT1 positivos. El paciente fue sometido a un segundo TAPH en el mes +11, reactivándose la hepatitis causada por GSTT1
el día +61. Se trató con PDN y mejoró en el día +90. En el mes +8 ingresa con EICH crónica cutánea y hepática (BT 65 mg/ dL) alcanzando
el exitus por encefalopatía hepática un mes después.
Conclusión. Se propone que las células B memoria anti-GSTT1
presentes en el injerto, una vez activadas en el organismo huésped por
las moléculas GSTT1 expresadas en el hígado del paciente, produjeron la síntesis de anticuerpos anti-GSTT1. El antígeno GSTT1 debe ser
considerado una nueva diana para la EICH con afectación hepática.
P-143
CUANTIFICACION DE CADENAS LIBRES LIGERAS (SCLL) SÉRICAS EN TRASPLANTE RENAL. IMPLICACIÓN EN LA MONITORIZACIÓN DE GAMMAPATÍAS MONOCLONALES (GMM) TRAS
TRASPLANTE. M. Sánchez Castañon, M. Gago, G. Fernández-Fresnedo, C. Gomez, J. Ruiz-Criado, M. López-Hoyos, M. Arias. Hospital
Universitario Marques de Valdecilla, Santander.
Introducción. Las GMN son causa de patología renal. Recientemente se han introducido metodologías muy sensibles de cuantificación de sCLL. Se ha descrito variabilidad de estos métodos relacionada con la función renal y no se han estudiado en el trasplante renal.
Hemos analizado la asociación entre los niveles de sCLL policlonales
en trasplantados renales(TR) con diferente función renal.
Material y métodos. Se estudiaron 100 pacientes TR y 53 enfermos renales crónicos estratificados por función renal (K/DOQI). Ningún paciente tenía GMN. Los niveles de sCLL policlonales se cuantificaron mediante nefelometría (The Binding Site).
Resultados. La concentración de sCLL κ y λ aumentó con el estadío K/DOQI tanto en los trasplantados (9 veces superior en estadio
5 para κ y 5 para λ respecto a estadio 1) como en los no trasplantados
(6 veces superior para κ y λ respecto a estadio 1). Dichos niveles se
correlacionaron significativamente (p<0,001) con creatinina sérica (0,532
y 0,513 en trasplantados y 0,783 y 0,849 en no trasplantados), cistatina
sérica (0,648 y 0,614 en trasplantados y 0,800 y 0,837 en no trasplantados) y β2 microglobulina (0,722 y 0,688 en trasplantados y 0,912 y
0,875 en no trasplantados). El ratio κ/λ no varió en ninguno de los dos
grupos de estudio ni mostró correlación la función renal. Estos datos
no se influyeron por la inmunosupresión empleada.
Conclusión. Los niveles séricos de CLL deben interpretarse con
cautela por su clara asociación con la función renal. El trasplante renal
no induce cambios diferentes de los derivados de la función renal.
PÓSTERS
P-144
ANÁLISIS DEL POLIMORFISMO KIR EN TRASPLANTE HEPÁTICO. I. Legaz Pérez1, J.A. Campillo Marquina1, M.D.R. López-Álvarez1, J.M. Bolarín Guillén1, B. Las Heras Ferre1, S. Soriano Díaz1, N.
Gómez-Lozano2, C. Alonso Blanco3, M.D.R. Álvarez-López1, C. Vilches Ruiz2, A. Minguela Puras1. 1Hospital Virgen de la Arrixaca y Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBEREHD). Murcia, Churra. 2Hospital Universitario Puerta Del
Hierro. Madrid. 3Hospital Universitario Juan Canalejo, A Coruña.
El aloinjerto hepático es bien aceptado en ausencia de compatibilidad HLA, sin embargo recientemente se ha sugerido un papel del
locus HLA-C en la evolución del mismo a corto y largo plazo. Previamente se ha propuesto la participación de las células NK en la alorrespuesta contra injertos. Tanto las células NK como los linfocitos T
pueden expresar receptores KIR (del inglés, Killer Inmunoglobulin-like
receptors), los cuales a través de la interacción con sus correspondientes ligandos HLA de clase I son capaces de regular la actividad citotóxica de dichas células. Se sabe que las células NK son importantes en
el trasplante de células madre hematopoyéticas, en el que los receptores KIR pueden ejercer un papel modulador. Sin embargo hay pocos
trabajos referidos al trasplante de órganos sólidos. El interés del presente trabajo fue analizar si los genes KIR ejercen algún papel en trasplante hepático.
Un total de 402 trasplantes hepáticos fueron incluidos en el estudio. Los trasplantes se clasificaron en dos grupos de acuerdo a la presencia o ausencia de episodios de rechazo agudo: RA (n=110) y NRA
(n=292). El DNA genómico se extrajo usando QIAamp DNA Blood
Midi Kit a partir de sangre periférica de pacientes y nódulos linfáticos
o bazo de donantes y el genotipaje KIR de pacientes y donantes se realizó mediante PCR-SSP.
La frecuencia de genes y genotipos KIR observada en nuestro grupo de receptores hepáticos resultó similar a la de la población control,
así como a la frecuencia previamente observada en otras poblaciones
caucasoides, con la excepción del gen KIR2DS5 cuya frecuencia apareció significativamente aumentada en el grupo de pacientes con respecto al de donantes sanos (34% vs 25%; P= 0,016). Por otra parte el
análisis de genes y genotipos KIR en los grupos de pacientes en RA y
NRA tampoco mostraban diferencias significativas.
En conclusión, no se detectó una asociación entre el polimorfismo
KIR y la aceptación o el rechazo agudo temprano de injertos hepáticos, pero consideramos que se requieren futuros estudios para analizar si los receptores KIR en combinación con sus correspondientes ligandos HLA-I pueden estar implicados en el desenlace de estos injertos.
P-145
SEGURIDAD DEL USO DE GAMMAGLOBULINA INTRAVENOSA EN PACIENTES CON HIPOGAMMAGLOBULINEMIA E
INFECCIONES GRAVES POST TRASPLANTE CARDIACO: 14
AÑOS DE EXPERIENCIA. J. Carbone Campoverde, N. Del Pozo
Rodríguez, J. Rodríguez Molina, J. Navarro Caspistegui, J. FernandezYañez, J. Palomo, P. Muñoz, C. Rodríguez, M. Ruiz, E. Sarmiento Marchese. Hospital Gregorio Marañon, Madrid.
Introducción. La hipogammaglobulinemia IgG y la deficiencia de
anticuerpos específicos son factores de riesgo de infección en el trasplante cardiaco. Evaluamos la eficacia inmunológica y la seguridad de
la terapia sustitutiva con gammaglobulina intravenosa (GGIV) en
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pacientes con hipogammaglobulinemia IgG tras el trasplante asociada a infecciones graves.
Métodos. 55 receptores cardiacos tratados con GGIV (Grupo-GGIV)
desde 1996. 55 pacientes trasplantados sin infecciones severas y que
no recibieron GGIV fueron estudiados como controles (Grupo sinGGIV). Definición de hipogammaglobulinemia IgG: IgG < 600 mg/dl
(nefelometría). Definición de infección: toda infección grave que requirió tratamiento IV. Indicación de GGIV (uso compasivo): Terapia de
reposición en trasplante cardiaco con hipogammaglobulinemia secundaria e infección grave. El 85% de las infecciones se produjeron durante los primeros 3 meses. Las infusiones de GGIV se iniciaron tras el
diagnóstico de infección. Protocolo: GGIV al 5% pasteurizada; dosis
de 300-400 mg/kg/mes. Objetivo: alcanzar concentraciones normales
de IgG (>700 mg/dl). Velocidad de infusion: 0,01 a 0,04 ml/kg/min.
Resultados. Distribución de infecciones: Bacterianas, n=19; bacteriana+infección CMV, n=8; bacteriana+fúngica, n=4; bacteriana+clostridium difficile (CD), n=2; infección por CMV tratada con gancyclovir,
n=15; infección CMV+CD, n=2; infección CMV+bacteriana+aspergilosis, n=4; nocardiosis pulmonar, n=1. En el grupo-GGIV se documentó
una menor concentración de IgG sérica antes del trasplante (936 vs 1.235
mg/dl, p= 0,012), a los 7d (577 vs 778, p< 0,001), 1 m (553 vs 684, p=
0,003) y cuando se detectó la infección [475 vs 684, p< 0,001]. Tras el uso
de GGIV, las concentraciones de IgG de los pacientes tratados fueron
similares a las del grupo control sin-GGIV a los 3 m (681 vs 737, p= 0,25)
y 6 m (736 vs 769, p= 0,46), mientras que la concentración de álbumina
fue menor en estos pacientes en ambos puntos. No hubieron pacientes
con hipercatabolismo de IgG. Las infusiones de GGIV fueron bien toleradas. No se observaron reacciones adversas moderadas ni graves. No
hubo complicaciones trombóticas. Las concentraciones post-tratamiento de urea, creatinina, GOT, GPT, GGT, bilirrubina, C3 y C4 al mes, 3 m,
6 m y 12 m post-trasplante fueron similares en ambos grupos.
Conclusión. La terapia con GGIV se asoció con reconstitución de
niveles de IgG y fue bien tolerada en pacientes sometidos a trasplante cardiaco con hipogammaglobulinemia IgG e infecciones graves posttrasplante.
P-146
PRESENCIA DE ANTICUERPOS DONANTE ESPECÍFICOS FRENTE A DIVERSOS SISTEMAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD EN
PACIENTES CON SIGNOS DE RECHAZO HUMORAL. J.L. Caro
Oleas1, A. Álvarez Márquez2, M.J. Acevedo Calado1, G. Bernal1, R. Cabrera1, M.Á. Gentil1, I. Aguilera1, A. Núñez Roldán1. 1Hospital Universitario
Virgen del Rocío, Sevilla. 2Coordinación Autonómica de trasplante.
Como continuación de un trabajo anterior (2009), mostramos 14
nuevos casos de pacientes trasplantados renales con sospecha de rechazo humoral y depósitos de C4d en biopsias. Objetivo: Estudiar la relevancia de ciertos sistemas de histocompatibilidad (GSTT1 y MICA),
así como de los anticuerpos anti-HLA detectados por Luminex, en el
rechazo.
Material y métodos. 14 pacientes trasplantados con una prueba
cruzada por CDC negativa que desarrollan rechazo humoral, puesto
de manifiesto por la detección de C4d en biopsias renales y el deterioro en la función renal. Estudiamos la presencia, en sueros previos y
posteriores al trasplante de, anticuerpos anti-HLA clase I y clase II específicos del donante y de anticuerpos anti-MICA, todos ellos, mediante Luminex (Single Antigen y/ó crossmatch Luminex). Además, estudiamos anticuerpos anti-GSTT1 mediante ELISA.
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Resultados. En el suero pre-trasplante estudiamos retrospectivamente, la presencia de anticuerpos (anti-HLA, anti-MICA y antiGSTT1). Detectamos anticuerpos anti-HLA clase I en 3 pacientes, antiHLA clase II en 1 paciente, anti-HLA clase I+II en 1 paciente y antiHLA clase II+MICA en un caso. En los 8 casos restantes no detectamos
ningún anticuerpo en el suero pre-trasplante. En los sueros post-trasplante coincidentes con la biopsia C4d positiva, detectamos la producción de anticuerpos de novo, no detectados en el suero pre-trasplante en 4 casos. En total, hay un paciente con anti-HLA clase I, 2 con antiHLA clase II, 1 con anti-GSTT1, y 3 con una mezcla de anticuerpos, clase HLA I+II=3 casos, HLA clase II+MICA=2 y HLA clase I+GSTT1=1.
En otros 4 pacientes no detectamos ninguno de éstos anticuerpos. Respecto a la evolución clínica de los pacientes, 2 de ellos fallecieron con
el órgano funcionante (1 sin anticuerpos detectables y el otro con antiHLA clase I+II), 4 pacientes han vuelto a hemodiálisis (1 con HLA clase II+MICA, 1 con HLA clase I+GSTT1, 1 con GSTT1 y 1 con HLA
clase I+II). Y los 8 restantes tienen una buena función renal a pesar
de que en la mitad de ellos detectamos algún anticuerpo (4/8).
Conclusiones. Entre los pacientes con signos de rechazo humoral, encontramos un alto porcentaje que presentan anticuerpos antiHLA donante específicos detectables por Luminex tanto previos como
posteriores al trasplante, así como algunos otros con anticuerpos antiGSTT1 y anti-MICA.
P-147
COMPARACIÓN DE DOS MÉTODOS BASADOS EN LA TECNOLOGÍA LUMINEX PARA EL ESTUDIO DE ANTICUERPOS
DONANTE ESPECÍFICOS. J.L. Caro Oleas, M.F. González Escribano, S. Toro Llamas, M.J. Acevedo Calado, M.J. Martínez Bravo, I. Aguilera García, A. Núñez Roldán. Hospital Universitario Virgen del Rocío/
Servicio de Inmunologia, Sevilla.
Al objeto de conocer si el rechazo de un órgano trasplantado es de
naturaleza humoral, es preciso detectar la presencia de anticuerpos
donante específicos en el suero del receptor (criterios de Banff). Para
ello, se dispone de 2 métodos: 1) Single Antigen (SA), que emplea microesferas recubiertas con antígenos recombinantes y 2) crossmatch Luminex (Xm-DSA) que se realiza a partir de moléculas HLA aisladas de de
los propios donantes.
Objetivo. Comparar la sensibilidad entre ambos ensayos.
Material y métodos. 24 sueros de mujeres embarazadas, que reconocían por CDC distintas especificidades tanto de clase I (14 sueros)
como de clase II (10 sueros). Estos sueros se estudiaron mediante SA
y Xm-DSA netos y diluidos. En el Xm-DSA un mismo suero se enfrentó con diferentes lisados (total lisados: 42 y total Xm-DSA: 61, 42 para
clase I y 19 para clase II). Analizamos diferencias de sensibilidad entre
ambos ensayos evaluando la máxima dilución positiva (MDP). También analizamos la posible influencia de la dosis antigéncia (DA), es
decir, la coincidencia de mas de 1 antígeno HLA reconocido por el suero en lisado o la presencia de homocigosis.
Resultados. En general, la máxima dilución positiva fue mayor
en la técnica del SA (66,7% de los sueros anti HLA-A, 57% de los sueros anti HLA-B y 87% de los sueros anti HLA-DR). En el caso de los
sueros anti-DQ, la técnica Xm-DSA fue incapaz de detectar anticuerpos en 2 de 4 casos. En los otros dos, el SA fue más sensible.
Dosis antigénica: se incluyeron 40 casos (18 con 1 DA y 22 con >1
DA). No observamos incremento en la sensibilidad de la técnica cuando teníamos mas de 1 DA.
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Conclusiones. En general, la sensibilidad del SA es mayor que
la del Xm-DSA, sobre todo para los antígenos DQ, que se captan menos
eficientemente. Las discrepancias entre ambos métodos no son atribuibles a la DA por lo que otros factores deben ser postulados.
P-148
DESARROLLO DE UNA LEUCEMIA AGUDA MONOCÍTICA (M5)
EN UNA PACIENTE 17 AÑOS DESPUES DE UN TMO POR UNA
LEUCEMIA AGUDA PROMIELOCÍTICA (M3). P. Jiménez Gámiz , J.
Palacios , P. Garrido , A. Cabrera , A. Fernández, J.M. De Pablos, F. Garrido, F. Ruiz-Cabello. Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada.
Una mujer de 29 años fue diagnosticada en marzo de 1993 de Leucemia Aguda Promielocítica, M3 de la clasificación FAB. Como tratamiento se realizó un trasplante de médula ósea alogenico de una hermana HLA idéntica. Después de 17 años asintomática, en marzo de
2010 la paciente es ingresada nuevamente en el servicio de hematología y se le diagnostica una Leucemia Aguda Monocítica, M5 de la
clasificación FAB. Puesto que el fenotipo de los blastos, determinado
por citometría de flujo, difería de los detectados en el primer diagnóstico, investigamos el origen de la hematopoyesis mediante análisis de
STRs, confirmándose que el proceso leucémico tenía su origen en las
células del donante.
El desarrollo de un proceso leucémico en las células del donante
es una rara complicación del trasplante de médula ósea que puede aparecer tras un periodo de latencia de 4 a 164 meses. En la patogénesis
de esta complicación se ha implicado a varios factores como la quimioterapia y la radioterapia utilizada en el tratamiento y en el acondicionamiento previo al trasplante, la existencia de una respuesta inmune
deficitaria en el huesped y el estres originado por la respuesta alogenica del donante en el microambiente de la médula ósea del huesped, lo que conduce a la aparición de alteraciones genéticas en las células del huesped. No disponemos de datos sobre estudios genéticos de
la primera leucemia. La segunda leucemia se estudió mediante FISH
no detectándose la t(15;17), sin embargo detectamos una delección
en el cromosoma 11q23. Otros autores han evidenciado anomalías en
el cromosoma 11 (específicamente en 11q23) asociadas a la administración de inhibidores de la topoisomerasa II. Asímismo, las delecciones 5q y 7q se han asociado a los tratamientos con agentes alquilantes.
Creemos que es necesario realizar un estudio exhaustivo de los
procesos leucémicos post-trasplante hematológico mediante la combinación de diversas técnicas (citometría de flujo, FISH y técnicas moleculares). El análisis profundo de estos procesos contribuirá a su correcto diagnóstico y al esclarecimiento de los mecanismos que intervienen
en la génesis de las leucemias.
P-149
SEGUIMIENTO DE UN CASO DE MIELOMA MÚLTIPLE IGE. I.
Toboso De Lamo, P. Herrera, M. Cuevas, R. Alenda, L.M. Villar, P. González. Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid.
Objetivos. El Mieloma Múltiple IgE (MM IgE) está considerado
como una patología de muy baja frecuencia, existen menos de 50 casos
descritos en el mundo. El objetivo de nuestro estudio fue establecer la
mejor herramienta para el seguimiento de este tipo de pacientes y estudiar su evolución. Hemos realizado el seguimiento del primer caso de
Mieloma Múltiple IgE descrito en España, en una mujer de 62 años de
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edad, diagnosticada de MM IgE estadio III-B en Marzo de 2009 en el
hospital de Alcorcón y remitida a nuestro hospital para la realización
de un transplante autólogo de células hematopoyéticas (TMO).
Material y métodos. Se realizaron las siguientes pruebas:
• Estudio clínico del paciente.
• Espectro Electroforético de suero y orina.
• Inmunofijación (IF) y caracterización del pico monoclonal de IgE.
• Cuantificación de IgE en suero mediante InmunoCap.
• Valoración de proteinuria de Bence-Jones por Inmunofijación.
• Valoración de crioglobulinas.
Resultados. La paciente presentaba lesiones osteolíticas, anemia,
hipogammaglobulinemia e hipercalcemia.
En el proteinograma y la IF previos al transplante, se observa la
presencia de un pico monoclonal IgE lambda en suero, que desapareció tras el TMO. También se detectó la presencia de cadenas ligeras
lambda de aspecto monoclonal en orina (Bence-Jones Lambda) que
igualmente se negativizaron tras el TMO.
Los valores de cadenas lambda libres en suero fueron 22,5 mg/L
antes del transplante y 0,05 mg/L 3 meses después del mismo.
La valoración de crioglobulinas resultó negativa.
Se realizaron dos cuantificaciones de IgE previas al transplante:
En la primera se detectaron unos niveles de IgE lambda de 680.000
KU/L (163,2 mg/dl) y en la segunda se detectaron unos niveles de IgE
lambda de 1890000 KU/L (453,6 mg/dl). Destacar que estos valores
son los más altos que se han encontrado en un mieloma múltiple IgE
(Valores normales 0-30 KU/L).
La cuantificación post-transplante fue de 175 KU/L (0,042 mg/dl)
de IgE lambda.
Conclusión. Dada la baja incidencia de estos mielomas, es importante realizar la mejor caracterización posible de la patología y el establecimiento de los procedimientos de laboratorio que nos permitan su
seguimiento. En este caso, concluimos que la cuantificación en suero
de la IgE fue la determinación más sensible. Tras el TMO, el pico monoclonal desapareció de suero y orina en la IF y los valores de cadenas
libres en suero se normalizaron, pero los niveles de IgE eran todavía
superiores a los niveles de referencia. Además se constató que esta
paciente mostraba una respuesta óptima inicial al TMO. Futuros estudios demostraran su evolución a largo plazo.
P-150
COMPLEMENTACIÓN DEL ESTUDIO DE ANTICUERPOS ANTIHLA POR CITOMETRÍA Y EL ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE EPITOPOS EN LA DEFINICIÓN DE LA RESPUESTA HUMORAL ALOGÉNICA. S. Mirete, N. Marín, A. De Andrés, J.L. Castañer. Hospital
Ramon y Cajal, Madrid.
Objetivo. Estudio de la respuesta humoral alogénica en un caso
de rechazo agudo acelerado.
Materiales y Métodos. La reactividad de los sueros pre- (incluida la muestra de la prueba cruzada) y post-trasplante se han estudiado mediante citometría de flujo (LABScan 100™): tanto mediante el
screening para la presencia de anticuerpos anti-HLA-I,-II y MICA
(LSMIX, One Lambda), como para la detección de especificidades de
clase I (LS1SA, One Lambda). El análisis estructural de los epítopos
implicados en dicha respuesta fue realizado con el algoritmo HLAMatchMaker Versión 1.3.
Resultados. Varón de 43 años con IRC secundaria a GMN crónica en
hemodiálisis desde agosto de 2001, tipaje HLA-A3, A24, B45, B53, DR1 sin
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sensibilización alogénica previa. Recibe un primer trasplante renal en enero de 2003 con incompatibilidades HLAA26, B35, B64, DR07,DR14, prueba cruzada negativa y función tardía del injerto. El día 14 postrasplante
se realiza biopsia renal en la que se observan lesiones histopatológicas
atribuibles a rechazo agudo III de la clasificación Banff 97. Vuelta a hemodiálisis en septiembre de 2004 y nefrectomía en 2005. Recibe un segundo
injerto renal en enero de 2010 con incompatibilidades HLA -A23, A29; B27,
B61, DR11, DR13 y prueba cruzada negativa. Injerto no funcionante que
requiere transplantectomía el día 6 postrasplante. En la biopsia se identifica un intenso infiltrado inflamatorio mixto y signos de isquemia.
Tras la nefrectomía del primer injerto se detecta la presencia de
anticuerpos anti-HLA de clase I y II. El análisis de las especificidades
muestra la presencia de anticuerpos dirigidos frente a los antígenos
HLA-A26+25+66+43 (> 1000 MFI) y HLA-A34+B08+B64 (500-1000
MFI), este espectro de especificidades se mantiene a lo largo del tiempo. Tras la pérdida del segundo injerto se detecta un espectro de especificidades más amplio (HLA-A26+29+25+66+43+34, >5000 MFI; antiB64, > 2000 MFI; anti- B27+61, >1000 MFI y anti-B08, >500 MFI) así
como anticuerpos frente a antígenos de los CREG 1C, 5C y 8C (>500
MFI) que se pueden explicar por una reactividad cruzada. La cinética de aparición de estos anticuerpos sugiere una respuesta secundaria. El análisis estructural de la respuesta sugiere la posible implicación de los epítopos a76n, a193Av, a207S, a246S, a253Q, presentes en
A26, y b45Ee, b66qlc, b103VgP, en B64).
Conclusiones. El empleo de técnicas de detección y estudio de las
especificidades anti-HLA de alta sensibilidad junto con el análisis estructural de la respuesta permite la identificación de combinaciones donante-receptor de alto riesgo.
P-151
ESTUDIO DEL POLIMORFISMO GENÉTICO DEL RECEPTOR DE
LA INTERLEUKINA 1 (IL1RN 86-BP DUP) EN UNA COHORTE DE
PACIENTES RECEPTORES DE TRASPLANTE CARDÍACO. D. Hernández Flórez, L. Valor, N. Del Pozo Rodríguez, C. Rodríguez-Sáinz,
R. Teijeiro, E. Sarmiento Marchese, E. Fernández-Cruz , J. Carbone
Campoverde. Hospital General Universitario Gregorio Marañon, Madrid.
Objetivo. El gen IL-1RN codifica el antagonista del Receptor de
la IL-1, que inhibe la unión de las citocinas IL-1alfa e IL-1beta a sus
receptores. Se ha descrito un polimorfismo en el intrón 2 del gen causado por un número variable de repeticiones en tándem (VTNR) de
una secuencia de 86 pares de bases (IL-1RN 86-bp DUP) que puede
influir en los niveles de expresión del la proteína. Los pacientes homocigotos para el alelo 2 de este polimorfismo (IL-1RN*2) muestran una
tendencia a desarrollar respuestas proinflamatorias de mayor duración y severidad en comparación con el resto de pacientes. La presencia de IL-1RN*2 se ha asociado con enfermedades inflamatorias
entre ellas la enfermedad arterial coronaria. Nuestro objetivo es analizar la prevalencia de los genotipos que contienen el alelo IL-1RN*2
en individuos trasplantados cardiacos.
Materiales y Métodos. Se evaluaron prospectivamente 59 pacientes
receptores de trasplante cardiaco y de 208 controles sanos. Se purificó el
DNA genómico a partir de la sangre periférica. Se amplificó mediante PCR
la región polimórfica que contiene el VTNR de 86 pares de bases. De acuerdo al número de repeticiones (rp) del fragmento de 86pb se distinguen 6
alelos del 1 al 6. El alelo 1 (410 pb) tiene 4rp, el alelo 2 (240 pb) 2rp, el
alelo 3 (500 pb) 5rp, el alelo 4 (325 pb) 3rp y el alelo 5 (595 pb) 6rp. Se determinó la frecuencia alélica y genotípica de este polimorfismo.
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VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
Resultados. El genotipo IL-1RN*2/ IL-1RN*2 mostró frecuencias
muy similares en los individuos trasplantados y en los controles sanos
(11,1% vs 11,1%). La frecuencia del genotipo IL-1RN*1/IL-1RN*2 se encontró ligeramente incrementada en los pacientes receptores de trasplante
cardiaco en comparación con el grupo de controles sanos (50,8% vs 43,8%)
sin que las diferencias tuvieran significación estadística (p=0,206).
Conclusión. Los resultados obtenidos no muestran diferencias en
la distribución de los genotipos A2/A2 y A1/A2 comparando receptores cardíacos con controles sanos. Es necesario el aumento del tamaño muestral para determinar si existe relación entre este polimorfismo
con la patología cardiovascular de base pre-trasplante y con comorbilidades y/o complicaciones en la fase post-trasplante.
P-152
ESTUDIO PRELIMINAR DE LA INMUNIDAD INNATA EN
PACIENTES CON TRASPLANTE CARDIACO: LECTINA LIGADORA DE MANOSA (MBL) E INFECCIONES BACTERIANAS. N.
Del Pozo, E. Sarmiento, J. Navarro, J. Rodríguez Molina, P. Muñoz, J.
Palomo, J. Fernández-Yañez, E. Fernández-Cruz, J. Carbone. Hospital
General Universitario Gregorio Marañón, Madrid.
Introducción. La lectina ligadora de manosa (MBL) es una molécula importante del sistema inmune innato, participa en la defensa
contra microorganismos activando la vía del complemento independientemente de anticuerpos. Se ha descrito que la deficiencia de MBL
puede predisponer a infecciones en diversas poblaciones. La medición
de MBL puede ser útil para identificar pacientes en riesgo de infecciones post-operatorias. La deficiencia de MBL se ha visto asociada a infecciones severa en post-trasplante renal.
Objetivo. Evaluación de concentración de MBL en una cohorte de
TC con/sin complicaciones infecciosas bacterianas. Determinación de
prevalencia de deficiencia de MBL en pacientes de TC con y sin infecciones.
Materiales y Métodos. Realizamos estudio descriptivo prospectivo en 36 pacientes con TC entre 2003 y 2009 (edad media= 52,61 años,
rango: 24-69); Hombres= 25 (69,4%), Mujeres= 11 (30,6%). Terapia de
inducción utilizada: Metilprednisolona y anticuerpos monoclonales
anti-CD25. Terapia inmunosupresora de mantenimiento:
Tacrolimus/Ciclosporina, Micofenolato mofetil y Prednisona. Profilaxis universal con ganciclovir. Estudio inmunológico realizado: Medición de concentración sérica de MBL mediante técnica de ELISA: pretrasplante (basal), 7 y 30d post-TC. Las muestras pre/post trasplante
fueron conservadas a -70ºC hasta su estudio y evaluadas al mismo
tiempo. Episodio Clínico: infección bacteriana que requirió terapia
intravenosa durante el 1er año de seguimiento post-TC.
Resultados. En pacientes TC observamos una disminución significativa en niveles séricos de MBL al mes post-TC vs basales (1152 ±
1075 ng/mL vs 1088 ± 996 ng/mL p= 0,032; prueba T-2 colas). Los niveles MBL pre-TC estaban disminuídos en relación a 40 controles sanos
(1152 ± 1075 ng/mL vs. 2184 ± 1355 ng/mL, p<0,01; prueba T-2 colas).
La prevalencia de deficiencia de MBL es variable según el nivel de referencia utilizado, siendo mayor en pacientes TC vs. controles sanos
(MBL < 200 ng/mL: 25% vs 7,5%). No observamos diferencias entre
niveles basales, 7 y 30 días post-TC entre grupos de pacientes con infecciones (n= 8) vs. sin infecciones (n= 28). Los microorganismos aislados
en los pacientes infectados fueron: Acinetobacter baumanii, Enterococcus
faecalis, Legionella, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphilococus aureus, Staphilococus epidermidis.
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Conclusiones. El componente de inmunidad innata, MBL, disminuye en suero en el contexto del seguimiento del trasplante cardiaco.
La prevalencia de deficiencia de MBL en variable según el nivel de referencia utilizado.
SESIÓN 13: INMUNOLOGÍA TUMORAL
Moderadores: Ignacio Melero (Pamplona)
Angel M. García Lora (Granada)
P-153
GAMMAPATIAS MONOCLONALES Y BICLONALES TRABAJO
DE LABORATORIO. V.L. Pérez Mestre, D. Sánchez Costilla, S.M.
Pollio. Fuerza Aerea Laboratorio DIBPFA, Capital Federal, Argentina.
La observación del aumento estadístico del requerimiento de dosaje de inmunoglobulinas G, A y M y de las bandas monoclonales halladas por inmunofijacion nos motivaron a la realización de este trabajo
estadístico realizado durante 30 meses a partir del 01 enero 2001.
La llamada crisis del 2001 produjo en la población que recibe asistencia de nuestra obra social patologías que cada profesional de la salud
observó según su particular lugar de trabajo y especialidad.
En mi caso, bioquímica que trabaja en la División Inmunoserología,
me llamo la atención el aumento de la prescripción médica de Inmunofijación y sus correspondientes dosajes de inmunoglobulinas G, A, M en
sangre y eventualmente en algunos en orina. Esto significó no sólo un
aumento de trabajo técnico-científico sino también un cambio en los presupuestos habituales de consumo y provisión de reactivos.
Fue una ardua y enriquecedora tarea, pues me permitió acercarme a los pacientes y médicos, sortear obstáculos propios de nuestra
especialidad Bioquímica y la respuesta inmunológica de cada paciente para llegar al diagnóstico correcto.
Permitío la comprobación de la existencia de cuadros que se agravaban con el desarrollo de una nueva banda monoclonal adicionada
a la ya existente en los últimos estadíos de la enfermedad, o bien el
incremento desmedido la inmunoglobulina patológica que deterioraba mortalmente al paciente estudiado.
P-154
DIFERENCIAS EN LA EXPRESION DE MARCADORES DE DIFERENCIACION TH1 EN RELACION A LA RESOLUCION O RECIDIVA DE LESIONES ASOCIADAS A LA INFECCION POR VPH.
A. Gonzalez, J. Canton, R. Carretero, P. Saenz-López, P. Jimenez, P.
Jimenez, P. Jimenez, F. Garrido, F. Ruiz-Cabello, L.M. Torres. Hospital
Universitario Virgen de las Nieves, Granada.
Objetivos. Evidencias epidemiológicas y experimentales sostienen que el sistema inmunológico juega un papel relevante sobre el control y progresión de las lesiones inducidas por el virus del papiloma.
De hecho, se observa una alta incidencia de infecciones persistentes de
VPH y de lesiones displásicas en pacientes inmunosuprimidos. También en algunas pacientes en las que no se produce aclaración viral, el
virus ocasiona un estado de inflamación crónica persistente que se asocia a su vez al desarrollo neoplásico. Hemos querido investigar si existen diferencias en la expresión de marcadores asociados a respuestas
TH1/TH2, activación y senescencia en pacientes que desarrollan lesiones inflamatorias SIL y también en pacientes que desarrollan lesiones recurrentes después de un tratamiento escisional (LEEP).
Material y métodos. Para este estudio se han comparado las subpoblaciones linfocitarias entre una cohorte de mujeres con displasia
originada por VPH y en una población libre de enfermedad. Las diferentes poblaciones se estudiaron mediante marcaje con anticuerpos
monoclonales contra marcadores especificos y lectura mediante citometría de flujo.
Resultados. Los análisis muestran cambios significativos en la
proporción de células con expresión de marcadores efector/memoria
CD4/CXCR3/CCR5/CD62 bajo (TH1); Treg (CD4/CD25brillantes) y
de apoptosis (CD4/CD95) que son compatibles con un estado de infección crónica persistente, y de una diferenciación terminal (pérdida
de CD27/CD28). Este fenotipo se asocia a disfunción de la población
efectora CD4 y a una situación próxima a la apoptosis. El incremento
de estas células fue significativo y se observó tanto al comparar el grupo de pacientes /control y sobre todo en pacientes con recidivas después del tratamiento escisional. Interesantemente el incremento en la
proporción de células con expresión de CD95/CD4 se pudo relacionar
con el grado y la evolución de las lesiones (CIN-I-III).
Conclusiones. Nuestros datos revelan que un estímulo crónico
persistente puede favorecer la aparición de alteraciones funcionales
de los linfocitos (senescencia replicativa), peomoviendo una situación
de inmunosupresión que favorece el desarrollo tumoral, tal y como se
ha visto en otros tipos de neoplasias.
P-155
EXPRESIÓN DE CD133, MARCADOR DE CÉLULAS MADRE, EN
TUMORES CEREBRALES. L. Cillero, J. Subiza, H. Zimman. Hospital
Clinico San Carlos, Madrid.
Introducción. Recientes trabajos describen que la presencia de células madre tumorales (CSC) puede ayudar a explicar la heterogeneidad
celular y la resistencia a la terapia, (Reya et al., 2001). La formación de
neurosferas es la característica propia de células madre neurales. El uso
de factores de crecimiento en cultivos in-vitro ha permitido el mantenimiento del estado indiferenciado de estas células además de acelerar su
proliferación. (Reynolds BA and Weiss, S, 1996). El gen CD133 ubicado
en la posición 4p15.32 codifica una glicoproteína cinco-transmembrana
(5-TM), marcador de superficie celular para identificar y aislar células
madre del tumor cerebral (BCSCs), (Beier D, 2007).
Objetivo. Fue evaluar el número de células CD133 positivas en los
tumores estudiados y su relación con la formación de tumoresferas.
Materiales y Métodos. Se realizó cultivo primario de 11 muestras
tumorales de pacientes diagnosticados de glioma de alto grado (OMS
III y IV) en medio DMEM-F12 libre de suero conteniendo factores de
crecimiento tales como: EGF, bFGF y LIF, para la selección de células
madre tumorales y un posterior estudio de la expresión del fenotipo
CD133 con el anticuerpo monoclonal CD133/2 marcado con ficoeritrina (Miltenyi Biotec) por citometría de flujo.
Resultados. En nuestra serie, ocho de los once tumores crecieron in-vitro como agregados celulares a los seis días de cultivo, además de presentar expresión de CD133+ fueron clasificados histológicamente como tumores astrocíticos y oligoastrocitarios. Aunque solamente se detectó un pequeño porcentaje de células altamente positivas para CD133. La ausencia de estos clones celulares se observó en
tres tumores diagnosticados como oligodendrogliales.
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Conclusiones. Se puede especular que hay por lo menos dos tipos
de células madre cancerosas en el tumor cerebral que varían en su
expresión de CD133, se pone de relieve la necesidad de más marcadores de superficie de CSC. Sugerimos que cultivos prolongados en presencia de oxígeno superior a la estimada en el cerebro (1-5%) podría
estar dando lugar a una reducción en la expresión de CD133.
P-156
ERP5 Y GRP78 ESTÁN ASOCIADAS CON LA PRODUCCIÓN DE
MICA SOLUBLE EN LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA. S.
Gonzalez Rodríguez1, A. Gonzalez Rodríguez2, J. Contesti3, A. Fernandez Guizan1, A. Acebes Huerta1, C. López Larrea2, L. Huergo Zapico1.
1IUOPA Universidad de Oviedo, Oviedo. 2Hospital Central de Asturias, Oviedo. 3Hospital de Cabueñes, Oviedo.
El receptor activador NKG2D interacciona con una serie de ligandos inducidos en cáncer. La interacción de NKG2D con sus ligandos
activa a las células NK promoviendo la respuesta inmune contra el
cáncer. Muchos tumores avanzados contrarrestan esta actividad antitumoral mediante el corte proteolítico de MICA y su liberación en forma MICA soluble que inhibe la respuesta inmune citotóxica. Recientemente hemos demostrado que ERp5 y GRP78 interaccionan con MICA
en la superficie de la célula tumoral y desempeñan un papel clave en
la producción de MICA soluble. Aquí demostramos que los pacientes de leucemia linfática crónica (LLC) tienen una elevada resistencia
a la citotoxicidad mediada por NKG2D. Esto se debe a que las células leucémicas no expresan o expresan pequeñas cantidades de los
ligandos de NKG2D, MICA y ULBP1-3. Asociado a la baja expresión
de MICA se observa una producción heterogénea de MICA soluble en
los pacientes (entre 0 a 535,5 pg/ml). El 38% de los pacientes presentan cantidades significativas de MICA soluble. Además mostramos
que ERp5 y GRP78 se expresan en la superficie de las células leucémicas y de los linfocitos B. En las células leucémicas, ERp5 y GRP78 se
colocalizan en la superficie celular con MICA y están asociados funcionalmente con la producción de MICA soluble, lo que convierte a
estas moléculas en interesantes dianas terapéuticas en la LLC. Además
la expresión de ERp5 y GRP78 en la superficie de los linfocitos B sugiere una función desconocida de estas moléculas independiente de la
regulación de la expresión de MICA.
P-157
LA EXPRESIÓN DE MICA ESTÁ REPRIMIDA EN TUMORES EPITELIALES POR LA DESACETILASA DE HISTONAS 3. S. Gonzalez Rodríguez1, A. López Soto1, R. Tejedor Vaquero1, L. Huergo Zapico1, A. Acebes Huerta1, S. Rodríguez Rodero1, C. López Larrea2, A. Fernández Guizán2. 1IUOPA Universidad de Oviedo, Oviedo. 2Hospital Central de Asturias, Oviedo.
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expresión de MICA en tumores epiteliales puede estar mediada por
mecanismos epigenéticos. Nuestros experimentos sugieren que la metilación del ADN no está implicado en la represión de la expresión de
MICA en tumores epiteliales, sin embargo el tratamiento de líneas
tumorales epiteliales con el inhibidor de las desacetilasas de histonas
(HDACs) tricostatina A (TSA) incrementa notablemente la citotoxicidad mediada por NKG2D y este efecto está mediado en parte por la
inducción de la expresión de MICA. Nuestros experimentos indican
que el factor de transcripción NFY desempeña un papel crucial en este
proceso. Además mediante el silenciamiento génico y la sobreexpresión de las HDAC1-3 demostramos que HDAC3 es un represor de la
transcripción de MICA. HDAC3 está sobreexpresado en adenocarcinoma de colon lo que favorece la represión de la expresión de MICA
favoreciendo la evasión tumoral de la respuesta inmune.
P-158
IMPORTANCIA PRONÓSTICA DE LOS LINFOCITOS T CD8 Y
CD4 EN LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA. S. Gonzalez Rodríguez1, J. Contesti1, L. Huergo Zapico1, A. Fernandez Guizan1, A. Acebes Huerta1, A.P. Gonzalez Rodríguez2. 1IUOPA Universidad de Oviedo, Oviedo. 2Hospital Central de Asturias, Oviedo.
El número absoluto de linfocitos es un factor pronóstico independiente para la supervivencia en diversas enfermedades hematológicas, pero todavía no ha sido determinado en la leucemia linfática crónica (LLC). Para analizar el papel pronóstico en la LLC, las células NK
y T fueron cuantificadas en un grupo de 256 pacientes de LLC diagnosticados entre 1997 y 2007. Estos pacientes mostraron un número
elevados de células NK y de linfocitos T CD4 y CD8 respecto a los individuos normales. La relación CD4/CD8 estaba invertida en un 39,7%
de los casos. Además, los pacientes diagnosticados en los estadios tempranos de Rai mostraron un número relativo más alto de CD4 (p= 0,03),
CD8 (p= 0,02) y células NK (p= 0,01). El análisis multivariante Cox
identificó el número relativo de linfocitos T CD8 (radio Hazard =1.464;
p=< 0,006) y linfocitos T CD4 (radio Hazard = 0,091; p=< 0,01) como
marcadores independientes de supervivencia. No se observó correlación significativa entre las células NK y la supervivencia de los pacientes. Adicionalmente, los pacientes con un número relativo de CD8>
0,074 o CD4> 0,1 tenían mayor supervivencia global a los 10 años que
aquellos que presentaban menor número de linfocitos T (p= 0,002). En
particular, pacientes con un número de CD8> 0,074 tenían un tiempo
medio de supervivencia significativamente mayor (149,33 vs. 82,06
meses). En resumen, este estudio muestra que las características cuantitativas del sistema inmune de los pacientes pueden modificar la progresión de la LLC, sugiriendo un papel del sistema inmune en la patogenia de esta enfermedad.
P-159
NKG2D es un receptor activador de las células NK que desempeña un papel clave en la respuesta inmune contra el cáncer. Los ligandos de NKG2D, MICA y las ULBPs, se inducen por el daño genotóxico, favoreciendo la eliminación de la célula tumoral por el sistema
inmune. Los tumores avanzados contrarrestan el efecto antitumoral
de NKG2D reprimiendo la expresión de los ligandos de NKG2D en la
superficie de la célula tumoral. La expresión de MICA se encuentra
reprimida en numerosos tumores epiteliales, en particular en tumores
en estadios avanzados. En este trabajo estudiamos si la represión de la
118
EL FENOTIPO DE INESTABILIDAD DE MICROSATELITES (MSI)
DETERMINA EL PATRON DE INFILTRACION LEUCOCITARIA
EN EL CANCER DE COLON. F. Ruiz-Cabello Osuna, M. Bernal, A.
Concha, T. Cabrera, M.D. Galvez, A.I. Rodríguez, R. López, F. Garrido. Hospital Universitario Virgen De Las Nieves, Granada.
Objetivos. Los carcinomas colorectales (CCRs) con fenotipo MSI
han sido descritos con anterioridad, como tumores muy inmunogénicos que escaparían de la acción del sistema inmunitario a través de la
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INMUNOLOGÍA
pérdida de moléculas de HLA de clase I. Hemos estudiado la infiltración tumoral en tres grupos de CCRs clasificados en función del fenotipo MSI y de la expresión de moléculas HLA clase I.
Material y Métodos. El primer grupo tumoral: tumores MSI con
pérdida total de HLA clase I (MSI+/HLA-) (n=8); segundo grupo: tumores con estabilidad de microsatélites y HLA clase I negativos en superficie (MSI-/HLA-)(n=8); y tercer grupo (Control): tumores sin alteraciones en genes HLA o en el gen β2-m (MSI-/HLA+) (n=8). Las mutaciones en el gen de la β2-m fueron estudiadas por secuenciación . En
el estudio inmunohistiquímico sobre tejidos, se emplearon anticuerpos monoclonales dirigidos frente a CD45, CD3, CD4, CD8, CD56,
CD64, CD163, CD206 y Hemo-Oxigenasa 1.
Resultados. Detectamos cuatro casos MSI+/HLA- con mutaciones que afectaban al gen de la β2-microglobulina, y sólo un tumor MSI/HLA- con alteraciones en dicho gen. Observamos que los tumores
MSI+/HLA- se caracterizaban por una alta infiltración de células CD45+,
con una destacable presencia de linfocitos T CD8+ que aparecían con
localización intra y peri-tumoral. El grupo tumoral MSI-/HLA- tenía
el grado de infiltración linfocitaria menos intenso de los tres grupos
de estudio, con escasa o nula presencia de linfocitos CD8+, que aparecían con localización intersticial o estromal, nunca infiltraban el interior de la glándula tumoral. Los tumores Control MSI-/HLA+ se caracterizaban por tener una intensidad de infiltración intermedia, con baja
cantidad de células CD8+, que aparecían con distribución estromal e
intersticial, y una presencia intratumoral menos intensa que en los
tumores MSI+/HLA-. No se encontraron diferencias en la infiltración
por macrófagos tipo I ( macrófagos clásicos) y tipo II (actividad inmunosupresora) entre los grupos tumorales.
Conclusiones. Los tumores MSI+/HLA- presentan una alta infiltración compatible con mayor inmunogenicidad. El escape a la inmunovigilancia no se explica, en todos los casos, por la inmunoselección
de mutaciones de β2-microglobulina. Los tumores MSI-/HLA- deben
utilizar otros mecanismos que justifiquen el fenotipo HLA-, a parte del
escape a CTLs, dada la menor infiltración linfocitaria, y en particular,
la baja presencia de linfocitos T CD8+.
P-160
CARCINOMAS DE COLON CON INESTABILIDAD GENOMICA
PRESENTAN PERFILES DE EXPRESION GENICA COMPATIBLES
CON TUMORES MAS INMUNOGENICOS. F. Ruiz-Cabello Osuna, M. Bernal, T. Cabrera, A. Concha, A.I. Rodríguez, M.D. Galvez, F.
Garrido. Hospital Universitario Virgen De Las Nieves, Granada.
Objetivos. La Inestabilidad de Microsatélites (MSI) es uno de
los principales mecanismos moleculares implicados en el desarrollo
del cáncer colorectal (CCR). Estos CCRs con fenotipo MSI han sido descritos con anterioridad, como tumores muy inmunogénicos, con una
destacable presencia de CTLs. Hemos estudiado los perfiles de expresión génica de tres grupos de CCRs clasificados en función del fenotipo MSI y de la expresión de moléculas HLA clase I.
Material y Métodos. Primer grupo tumoral: tumores MSI con pérdida total de HLA clase I (MSI+/HLA-) (n=8); segundo grupo: tumores con estabilidad de microsatélites y HLA clase I negativos en superficie (MSI-/HLA-) (n=8); tercer grupo (Control): sin alteraciones en
genes HLA o en el gen β2-m (MSI-/HLA+ )(n=8). El análisis de expresión génica fue realizado mediante la tecnología GeneChip de Affymetrix empleando el array HT_HG-U133_Plus 24, que puede procesar 24 muestras de forma simultánea.
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Resultados. Como resultado inicial, obtuvimos clusters jerárquicos en los que observamos que los tumores MSI+/HLA- tendían a agruparse entre sí y a mostrar un perfil de expresión de secuencias génicas
estadísticamente significativas (p< 0,05) que era muy diferente del
de los otros dos grupos del estudio. Los casos MSI-/HLA- y los del
grupo MSI-/HLA+ (Controles) también mostraban una tendencia a
clusterizar, sin embargo ambos agrupaciones mostraban perfiles de
expresión similares. En la comparación MSI+/HLA- vs MSI-/HLA+,
obtuvimos 635 secuencias génicas significativas (p< 0,05) y cuando se
comparaban los grupos MSI-/HLA- vs MSI-/HLA+, el número de
genes estadísticamente significativos (p< 0,05) fue de 217. Los tumores MSI-/HLA- mostraban una mayor expresión de genes de la vía del
TGF-β. Observamos, también, que los casos MSI+/HLA- expresaban
genes relacionados con la respuesta inflamatoria (genes de quimioquinas (CCL3, CCL18, CXCL13…); genes relacionados con la vía del TLR
(TLR2, TLR8, Ly96, PELI1, TICAM2…); genes marcadores de macrófagos (CD14, CD16, CD32, CD64…)) y con la actividad citotóxica
(TCRalfa, cadena ζ del complejo CD3, perforinas, granulisinas, factores de transcripción implicados en la activación de linfocitos T…).
Conclusiones. Estos resultados son consistentes con los datos obtenidos del estudio inmunohistoquímico de la infiltración leucocitaria
tumoral, donde observamos que los casos MSI+/HLA- presentaban la
mayor intensidad de infiltración por parte linfocitos T CD8+.
P-161
EXPRESIÓN DE ANTÍGENOS HLA DE CLASE I Y II EN LÍNEAS
CELULARES Y TUMORES DE PROSTATA. J. Carretero1, A.B. Del
Campo2, R. Méndez2, S. Zichenko2, S. Ward3, F. Ruiz-Cabello2, T. Cabrera2, N. Apstiauri2, F. Garrido2. 1Universidad de Granada, Granada. 2Hospital Universitario Virgen de las Nieves. 3St George University of London, ,
United Kingdom.
Objetivos. Conocer la frecuencia de alteraciones y mecanismos
moleculares implicados en la expresión anómala de HLA de clase I en
el cáncer de próstata, el segundo más frecuente en hombres y cuya
información sobre estas alteraciones es limitada.
Material y métodos. Hemos analizado la expresión de HLA de
clase I y II en trece líneas celulares humanas inmortalizadas, ocho de
ellas establecidas a partir de tumores primarios y cinco a partir de tejido adyacente normal de próstata. Se han comparado los resultados
con los patrones de expresión de líneas celulares tumorales de próstata no inmortalizadas obtenidas de ATCC: DU145, PC3 y LNCap. Se
estudió la expresión de HLA en 46 muestras criopreservadas de tumores de próstata, de las cuales once se seleccionaron para ser microdisectadas y realizar en ellas un análisis de microsatélites para determinar la presencia de LOH. Para ello se llevaron a cabo diferentes técnicas entre las que se incluye inmunohistoquímica, microdisección
laser, análisis de microsatélites y análisis por Citometría de flujo.
Resultados. La inmunohistoquímica reveló que un 90% de los
tumores poseían algún tipo de alteración de la expresión de HLA de
clase I en membrana. Además, hasta un 50% de los tumores microdisectados presentaban LOH en la región HLA-I. En una línea celular
detectamos una pérdida total de expresión de HLA-I debido a una
LOH y una delección en el gen de la beta-2-microglobulina (b2m). La
infección de estas células con un adenovirus portador del gen silvestre de la b2m humana recuperó la expresión normal de HLA de clase
I. En dos líneas celulares encontramos pérdida de haplotipo y pérdida de locus. En varias líneas celulares observamos baja regulación de
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locus A y B. Ninguna de las líneas celulares expresaba HLA de clase II
en condiciones basales, pero tras el tratamiento con IFN-gamma, nueve de las líneas celulares expresaron HLA-DR, y una expresó HLA-DP.
Conclusiones. Los resultados preliminares indican que las alteraciones (reversibles e irreversibles) de HLA de clase I en cáncer de próstata son comparables a las que encontramos en otros tipos de tumores.
P-162
DIFERENTES TRATAMIENTOS DE INMUNOTERAPIA INHIBEN
METÁTASIS ESPONTANEAS CON ALTERACIONES REVERSIBLES EN LA EXPRESIÓN DE MHC-I EN UN MODELO PRECLÍNICO MURINO. C. Garrido López1, I. Romero García2, I. Linares Dickler2, E. Berruguilla Pérez2, A. Collado Torres2, I. Algarra López De
Diego3, F. Garrido Torres-Puchol4, Á.M. García Lora2. 1Universidad de
Granada, Granada. 2Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada.
3Universidad de Jaén, Jaen. 4Universidad de Granada, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada.
La pérdida de expresión de moléculas MHC-I en células tumorales es un mecanismo de escape de la respuesta inmunológica, frecuente en los procesos de metastatización. En pacientes de melanoma, la
administración de inmunoterapia produjo la regresión de aquellas
metástasis con alteraciones reversibles en la expresión de HLA-I. En
este ensayo analizamos la efectividad de diferentes tratamientos de
inmunoterapia en un modelo preclínico, de fibrosarcoma murino con
metástasis espontáneas que presentan alteraciones reversibles en la
expresión MHC-I.
Se realizó un ensayo de metástasis espontáneas con la línea de
fibrosarcoma GR9-A7 en ratones BALB/c. Estableciendo cinco grupos de 20 ratones, los cuales recibieron sus respectivos tratamientos
durante 6 semanas tras la extirpación del tumor primario: Control,
CpG+A7-100Gy, PKS, Docetaxel y PSK+Docetaxel. 6 ratones de cada
grupo fueron sacrificados a mitad del tratamiento para estudiar la
evolución del proceso metastásico. Los 14 restantes se sacrificaron al
finalizar los tratamientos. Los ratones fueron examinados, extirpando las metástasis encontradas, para adaptarlas a cultivo y analizar
su fenotipo MHC-I. Subpoblaciones linfocitarias fueron analizadas
en bazo y sangre periférica.
La línea GR9-A7 presenta expresión de Kd, Dd y Ld. En el grupo Control metastatizó en 18/20 ratones produciendo 17-58 metástasis pulmonares y 1-3 linfáticas. Al final de los tratamientos
CpG+A7-100Gy, PSK y PSK+Docetaxel curaron las metástasis, mientras Docetaxel sólo redujo el número de metástasis. En los grupos
CpG+A7-100Gy, PSK y Docetaxel se encontraron metástasis en los
ratones sacrificados a mitad del tratamiento, pero en menor medida que en el grupo control. El análisis del fenotipo mostró que un
70% de las metástasis del grupo control tenían alteraciones en la
expresión MHC-I reversibles con IFN-gamma. Un porcentaje similar se encontró en las metástasis del grupo Docetaxel. Los tratamientos de inmunoterapia indujeron una mayor inmunoselección, produciendo una pérdida de la expresión de MHC del 80% CpG+A7100Gy y del 100% PSK. El estudio de las poblaciones linfocitarias
demostró una inducción de la respuesta inmunológica, destacable
por el aumento de linfocitos T CD8+ en CpG+A7-100Gy y de T y NK
en PSK y PSK+Docetaxel.
Los tratamientos de CpG+A7-100Gy, PSK y PSK+Docetaxel produjeron una inducción en la respuesta inmunológica capaz de elimi-
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VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
nar las metástasis con alteraciones reversibles en la expresión de MHCI, producidas por GR9-A7.
P-163
RELACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS EN GENES DE LA RESPUESTA INMUNOLÓGICA INNATA CON EL RIESGO Y PROGRESIÓN DEL CÁNCER VESICAL. M. Guirado, R. Carretero, E. Gills,
P. Saenz-López, F. Garrido, F. Ruiz-Cabello, J.M. Cozar. Hospital Universitario Virgen de las Nieves, GranadaHospital Universitario Virgen de las
Nieves, Granada.
Objetivos. Existen estudios que muestran el papel de la respuesta inmunitaria innata en el control de los procesos tumorales. El objetivo de este estudio es analizar la relación de los polimorfismos en
RIPK2, NOD2, Toll 2 y c13orf31, con el riesgo y las características clínicopatológicas del cáncer de vejiga.
Material y métodos. Se analizaron los polimorfismos (snp) en
NOD2 (rs9302752), RIPK2 (rs42490), c13orf31 (rs3764147) y Toll2
(rs5743708), mediante PCR a tiempo real usando sondas Taqman frente a los distintos alelos. Se estudiaron 303 casos de pacientes con cáncer vesical y 384 casos control. C13orf31 es una proteína sin caracterizar que ha sido asociada a la respuesta innata frente a la lepra.
Resultados. De los estudios realizados se extraen los siguientes
resultados: el polimorfismo c13orf31 se relaciona con el riesgo de sufrir
cáncer. El genotipo cc predispone a padecer la enfermedad (p< 0,001
OR= 4.00 IC= 2,09-7,69). Al estudiar la relación de los polimorfismos
indicados con las características clínicopatológicas de la enfermedad
obtuvimos: C13orf31: su genotipo se relaciona con grado de diferenciación (G) (p< 0,001) y grado de infiltración del tumor (T) (p= 0,013)
y muestra una tendencia con el desarrollo de metástasis (p= 0,092).
Toll2 se relaciona con tamaño tumoral (p= 0,048), recidiva (p= 0,012)
y progresión del tumor (p= 0,048). NOD2 se asocia con metástasis en
ganglios (N) (p= 0,018) y en recidiva tras BCG (p= 0,045). RIPK2 está
implicado en metástasis en ganglios (p= 0,047) y en grado de infiltración (p= 0,021).
Conclusiones. Nuestros análisis revelan que los polimorfismos
estudiados, RIPK2, NOD2, Toll2 y c13orf31, influyen en el riesgo de
padecer cáncer urotelial y en el desarrollo de la enfermedad. Estos
datos apoyan la hipótesis de la influencia del sistema inmunitario innato y la enfermedad con el riesgo y progresión de cáncer vesical.
P-164
EL EXOPOLISACÁRIDO BACTERIANO B100 SULFATADO INDUCE APOPTOSIS POR LA VÍA MITOCONDRIAL EN CÉLULAS T
LEUCÉMICAS. C. Ruiz-Ruiz, D. Carranza, G. Srivastava, I. Llamas,
E. Quesada, I.J. Molina. Universidad de Granada, Armilla.
Objetivos. Los exopolisacáridos bacterianos (EPS) son polímeros heterogéneos formados por diferentes monosacáridos y otros sustituyentes no sacarídicos, como pueden ser grupos sulfatos. Dichos
grupos parecen contribuir a las propiedades biológicas atribuidas a
estos EPS: antivirales, antitumorales e inmunomoduladoras, entres
otras. El objetivo de este trabajo es estudiar la actividad antitumoral del EPS obtenido de bacterias halófilas, B100, en estado nativo y
sulfatado.
Material y métodos. Linfocitos T primarios: Se obtuvieron a partir de muestras de sangre de donantes sanos y de pacientes con leuce-
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INMUNOLOGÍA
mia de células T. Fueron mantenidos en RPMI 1640 completo en un
incubador a 37ºC con 5% de CO2 durante 24 o 48h.
Líneas celulares: Jurkat, HEL, CEM, MOLT-4, HPB-ALL, Raji, DAUDI, NAMALWA, HL-60, K562, U937, SKBr3, EVSA-T y HSV fueron
mantenidas en el mismo medio de cultivo y condiciones que los linfocitos T primarios.
Las células apoptóticas y la caída de potencial de membrana mitocondrial fueron analizadas en un citómetro FACScan tras tinción con
ioduro de propidio (IP) y DiOC6, respectivamente.
La detección de proteínas se realizó mediante inmunoblot.
Resultados. La forma sulfatada del EPS B100 es capaz de inhibir
totalmente el crecimiento de diferentes líneas celulares como Jurkat
y HEL. La forma nativa de B100 y las formas nativa y sulfatada del EPS
N12 (estrechamente relacionado con B100) también lo hacen aunque
con menor eficacia. Sin embargo, solo B100S induce apoptosis de forma dosis-dependiente en las líneas leucémicas T MOLT-4 y Jurkat. Este
efecto proapoptótico se observa de manera restringida en el linaje hematopoyético, dentro del cual existe un gradiente de sensibilidad. Las
líneas leucémicas T son las más sensibles. B100S también induce una
moderada apoptosis en leucemias T primarias pero no en linfocitos T
normales. La apoptosis inducida por B100S va acompañada de una
caída del potencial de membrana mitocondrial y es dependiente de
caspasas, siendo la primera en activarse la caspasa-9. Estos datos indican que dicha inducción de apoptosis tiene lugar a través de la ruta
intrínseca o mitocondrial.
Conclusiones. B100S es el primer exopolisacárido bacteriano descrito capaz de inducir apoptosis de manera potente y selectiva en células T leucémicas, lo que sugiere su uso potencial en el tratamiento de
este tipo de tumores.
P-165
ALTERACIONES SUCESIVAS EN LA EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS HLA-I ORIGINAN INMUNOESCAPE Y CÉLULAS DE MELANOMA DIRECTAMENTE MÁS ONCOGÉNICAS. C. Garrido López1,
E. Berruguilla Pérez2, I. Linares Dickler2, I. Romero García2, A. Collado Torres2, I. Algarra López De Diego3, F. Garrido Torres-Puchol4, Á.M.
García Lora2. 1Universidad de Granada, Granada. 2Hospital Universitario
Virgen de las Nieves, Granada. 3Universidad de Jaén, Jaen. 4Universidad de
Granada, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada.
La línea tumoral Ando-2 procede de una metástasis de un
paciente de melanoma, la cual presenta la pérdida de un haplotipo
HLA. Se estableció una línea transfectada con el alelo A2, AndoTA2. Tras el crecimiento in vivo de Ando-2 en ratones BALB/c-nude
se obtuvo la línea Ando-nude, que perdió completamente la expresión HLA-I. En este estudio analizamos el comportamiento oncogénico de estas tres líneas que presentan diferente expresión de
moléculas HLA-I.
Se analizó la presencia de precursores de CTLs en la sangre del
paciente. El crecimiento local in vivo fue analizado mediante inyección
de diferentes dosis de células en ratones inmunodeficientes. La tasa de
proliferación in vitro se analizó por ensayos con Alamar blue y MTT, y
los resultados se correlacionaron con la expresión de genes del ciclo
celular (RT-PCR). La capacidad metastásica se estudió mediante ensayos in vitro de invasión y migración.
Ando-2, tiene expresión superficial de moléculas HLA-I, con la
pérdida de un haplotipo. Ando-TA2, recupera la expresión superficial
del alelo A2. La línea Ando-nude no expresa moléculas HLA debido a
PÓSTERS
la down-regulación de la APM. En la sangre del paciente fueron encontrados CTLs específicos contra Ando-TA2. En crecimiento in vivo Ando2-nude crece en todas las concentraciones inyectadas, mientras que
Ando-2 sólo crece al inyectar 5,106 de células, y la transfectante no crece a ninguna concentración. Estos resultados se correlacionan con el
mayor rango de proliferación in vitro de Ando-nude, seguida de Ando2 y Ando-TA2. En el estudio de los genes del ciclo celular la transfectante presenta expresión muy alta de ciclinaA1 y Mdm2. Ando-nude
tiene una mayor expresión de Cdk2, Cdc25A y E2F1. Los ensayos de
invasión y de migración, Ando-nude mostró un mayor potencial, seguida por Ando-2 y finalmente por Ando-TA2.
La línea Ando-2 es el resultado de la fase de inmunoselección en
el paciente, en la que se seleccionan aquellas células tumorales con alteraciones en la expresión HLA-I. Una segunda pérdida de HLA-I en
estas células originó células más oncogénicas per se y con mayor capacidad migratoria e invasiva.
P-166
CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LÍNEAS CELULARES DE
MELANOMA: BUSCANDO MARCADORES DE CÉLULAS INICIADORAS Y DE PRONÓSTICO. M. Caballero-Baños, J. Milà, R.
Vilella. Hospital Clínic, Barcelona.
La teoría de las “Cancer Stem Cells” (CSCs) nos propone que toda
la masa tumoral estaría formada a partir de poblaciones minoritarias
con características similares a las “Stem Cells” convencionales; es decir,
en el estadio final de la masa tumoral, podríamos encontrar una gran
proporción de células tumorales diferenciadas, y una pequeña proporción de células con capacidad tumorigénica (CSCs). Una posible explicación de los pobres resultados observados en la terapia del melanoma metastático, sería que los tratamientos empleados atacarían la población diferenciada de la masa tumoral, dejando intacta la población
de “Melanoma Stem Cells”, la cual respondiendo posteriormente a diferentes y desconocidos estímulos microambientales, sería capaz de regenerar la masa tumoral.
Objetivo. Definir algún marcador de superficie que nos permita
identificar a las células iniciadoras de melanoma así como algún marcador o grupo de marcadores que nos permitan definir subtipos de
melanoma de valor pronóstico.
Metodología. Cultivamos líneas de melanoma establecidas in vitro
con dos medios diferentes: DMEM y Knockout-DMEM (específico para
células embrionarias, cultivo teóricamente enriquecido en Cancer Stem
Cells). Realizamos un fenotipado de superficie con 59 monoclonales
que determinan la expresión de 56 moléculas de superficie.
Resultados. Obtenemos el nivel de expresión de 56 moléculas
de superficie en dos condiciones diferentes (medio DMEM y Knockout-DMEM), de 13 líneas de melanoma criopreservadas. A partir de
estos resultados, calculamos la expresión diferencial de los diferentes
marcadores en cada línea en concreto, observando marcadores que
aumentan su expresión en cultivo con medio Knockout-DMEM, así
como otros que disminuyen.
Conclusiones. 6 marcadores de superficie aumentan su expresión cuando las líneas son cultivados en medio específico para células embrionarias (teóricamente, podrían considerarse marcadores de
células iniciadoras de melanoma). Así mismo encontramos 13 marcadores que se expresan de forma heterogénea en ambas condiciones (posibles marcadores de subtipos de melanoma de valor pronóstico).
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PÓSTERS
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Tabla 1. Marcadores que aumentan su exposición en medio Knockout-DMEM
Marcador
Aumento en medio
Knockout DMEM (%)
CD1 (2)
CD11a
CD26
CD31
CD36
CD84
3,92
4,54
6,00
2,92
2,77
2,46
Tabla 2. Marcadores de expresión heterogénea en líneas de malanoma
DMEM
β2-micro
Locus A
DE
CD1
CD4
CD13
CD16
CD26
CD38
CD45
CD45RO
CD46
Knockout DMEM
CD54
CD55
CD57
CD58
CD71
CD146
W6/32
β2-micro
Locus A
DR
CD1
CD13
CD26
CD38
CD45RO
CD46
CD55
CD57
CD58
CD74
CD81
P-167
IDENTIFICACIÓN DE GENES PROANGIOGÉNICOS Y ANTIOXIDATIVOS EN MONOCITOS PRIMARIOS HUMANOS SOMETIDOS A HIPOXIA. I. Guijarro Muñoz, A. Cuesta Martínez, L. Alvarez Vallina, L. Sanz Alcober. Hospital Puerta de Hierro, Madrid.
Objetivos. Los monocitos son reclutados por los tumores y se acumulan en áreas hipóxicas, contribuyendo a la angiogénesis tumoral.
En este trabajo, estudiamos la influencia de un microambiente hipóxico sobre el perfil de expresión génica de monocitos primarios para
122
identificar la modulación selectiva de genes que puedan jugar un papel
en dicho proceso.
Métodos. Para caracterizar cómo los monocitos se adaptan al
microambiente hipóxico, estudiamos el patrón de expresión génica de
monocitos humanos expuestos 24h a 1% O2 con respecto a los cultivados en condiciones de normoxia usando el microarray GeneChip Gene
1.0 ST (Affymetrix). Como control de respuesta a hipoxia, el incremento en la expresión de VEGFA se comprobó en cada experimento. Los
resultados se analizaron usando la base de datos de ontología génica
DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery).
Resultados. De los 28.869 genes analizados en el microarray
(correspondientes a 19.734 transcritos primarios), un total de 379 fueron modulados al menos dos veces con respecto a los controles normóxicos. Además de VEGF, demostramos la sobreexpresión de más
de 50 genes relacionados con angiogénesis (incluyendo FLT-1, ANG
y MMP-19), componentes de la matriz o reguladores de la misma
(como ADAM8, SPP1, TFP1 and TSN1), respuesta inmune (CD16,
CD32, CD300, y COLEC12) y el metabolismo glicolítico y no glicolítico que habían sido previamente identificados como inducibles por
hipoxia.
De especial interés fue la identificación de un cluster de genes
implicados en la unión a metales y a la prevención del daño oxidativo, no descritos previamente. Su asociación con hipoxia no es extraña,
ya que el flujo sanguíneo en los tumores es irregular, causando periodos de hipoxia seguidos de reperfusión. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) producidas durante la reperfusión son causa de estrés oxidativo.
Conclusiones. Estos resultados apoyan el papel protector frente
al estrés oxidativo atribuido a una familia de genes antioxidantes y
sugieren que su expresión puede suponer una ventaja adaptativa de
los monocitos al cambiante entorno tumoral.
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Índice de autores
A
Abad Molina C, 37, 38, 93, 101, 102
Abadía-Molina AC, 91
Abadía-Molina F, 91
Abd El Fatah Khalil S, 97
Abós Gracia B, 34, 35
Acebes Huerta A, 118
Acevedo Calado MJ, 114
Acosta Arbelo F, 79
Acosta YY, 21
Admon A, 18, 75
Aguado E, 20, 78
Aguado JM, 88
Agüero J, 87
Aguerrevere S, 89
Aguerri Moreno M, 11, 15
Aguilar Benítez JM, 53
Aguilar F, 72
Aguilar Reina J, 38
Aguilera García I, 110, 114
Aguilera I, 112, 114
Aguinaga Barrilero A, 54
Agustí M, 68
Alba Domínguez M, 43, 63, 66
Alba E, 105
Alecsandru D, 85, 86
Alemán M, 91, 111
Alemany S, 29
Alenda Asensi R, 52, 70
Alenda R, 115
Alfaro Alegria C, 45
Alfaro C, 46
Alfaro J, 60
Alfaro Sánchez D, 12
Alfonso Pérez M, 48, 56
Algarra López de Diego I, 120I, 121
Alia A, 32
Alia M, 18
Allende L, 77
Allende LM, 42, 49, 50
Aller N, 90
Alloza I, 39
Almagro M, 107
Alonso A, 20, 78
Alonso Arias R, 24, 57
Alonso B, 14, 83
Alonso Blanco C, 113
Alonso E, 59
Alonso Ortiz A, 11, 109
Alperi López M, 37
Álvarez Cermeño JC, 48, 72
Álvarez de Mon-Soto M, 19, 31, 63, 71, 76
Álvarez Doforno R, 63, 66
Álvarez I, 13, 40, 66
Álvarez Lafuente E, 48
Álvarez Márquez AJ, 93, 114
Álvarez Pérez I, 39
Alvarez R, 98
Álvarez Rodríguez L, 79
Alvarez Vallina L, 122
Alvarez-Cermeño JC, 13, 38
Alvarez-Lafuente R, 39
Álvarez-López MDR, 113
Alvarez-López MR, 88, 95 , 101
Alvarez-Rodríguez L, 87
Álvarez-Vallina L, 55, 56
Alvaro-Blanco J, 18
Amado JA, 87
Ambrós C, 96
Amund Kyte J, 108
Andrade R, 103
Andrés Martín A, 52, 61
Angulo A, 26, 29
Antigüedad A, 39
Antón I, 28
Antón LC, 13
Aparicio P, 20
Aparicio Rubio P, 52
Aptsiauri N, 108, 119
Aransay Bañares AM, 40
Aranzamendi M, 87
Arcay J, 99
Areces C, 97 , 98
Arias M, 113
Arias-Santiago S, 47, 67, 69
Arizon del Prado JM, 56
Armentia Medina A, 70
Arnaiz-Villena A, 93, 97, 98
Aróstegui Gorospe JI, 50, 51
Arranz Sanz E, 72, 74
Arriarán L, 26, 69, 74
Arrieta Gutiérrez A, 93, 95
Arroyo JL, 83
Arroyo R, 38
Arruebo M, 47
Ascierto ML, 53
Atencia Arruti R, 93
Ausín F, 83, 106
B
Badell I, 41
Baena E, 18
Balas A, 100, 102, 112
Ballesteros Pomar M, 90
Ballina García FJ, 37
Balsa A, 37
Baltar JM, 57
Bañon-Rodríguez I, 28
Barbolla L, 97, 98
Bárcena J, 35
Barcenilla Rodríguez H, 19, 31, 33, 71
Barnea E, 18, 75
Barón Sánchez J, 99
Barrera L, 58, 110
Barrero L, 51
Barrientos A, 57
Barrio Cano L, 15
Barrios del Pino I, 51
Barrios Y, 41
Barroso N, 38
Bartolome B, 70
Bartolome Casado R, 16, 54
Bartolomé M, 38
Bastos-Amador P, 33, 36
Bayés B, 111
Beares Gómez I, 79, 87
Bech-Serra JJ, 13
Beer I, 18, 75
Beltrán AE, 48
Beltran Nuñez A, 56
Benages A, 105
Benito A, 26
Benito López C, 109
Benito Zamorano V, 72, 74
Bergazyn G, 30
Bergua J, 73
Bernal G, 114
Bernal M, 42, 118, 119
Bernal Pulido C, 58
Bernal Ramos A, 95
Berruguilla Pérez E, 120, 121
Blanco FJ, 55, 56
Blázquez A, 54
Blázquez D, 42
Bofill M, 33
Boix F, 88, 98, 101, 111
Bolarín Guillén JM, 113
Borque L, 92
Borras FE, 33
Borràs Serres FE, 13, 36
Borrás-Cuesta F, 47
Borraz Y, 103
Boscá L, 30
Bosca MM, 105
Bosch A, 98
Boshuizen M, 76
Bottazzi B, 89
Bousoño García C, 66
Boussiotis VA, 31
Bravi E, 64
Briega A, 61
Brieva JA, 17, 68
Broere F, 21
Bruges Armas J, 40
Brusco A, 42
Buelta L, 30
Burgos Rodríguez L, 57
Busquets N, 36
C
Caballero-Baños M, 121
Cabañas Gutiérrez C, 31
Cabellos J, 31
Cabrera A, 107, 115
Cabrera R, 114
Cabrera T, 53, 108, 118, 119
Cabria Ramos JC, 82
Cacho Gutierrez JL, 98
Calleja Antolín S, 90
Calleja Fernández A, 90
Callejas-Rubio JL, 67
Calonge M, 91
Calvache L, 91
Calvo Alen J, 87
Calvo Romero C, 74
Camacho F, 53
Cámara Hijón C, 65, 66
Camarero Salces C, 61
Cambra Conejero A, 105
Campanero MR, 18
Campillo JA, 88, 98, 101, 111
Campillo Marquina JA, 95, 113
Campos C, 25
Campos E, 96
Campos MDC, 22, 74, 78
Canals F, 13, 40
Cano S, 37
Cantisán Bohórquez S, 27
Cantisan S, 78
Cantó E, 32
Canton J, 117
Carballo F, 88, 98, 101
Carbone Campoverde J, 14, 58, 59, 94, 113, 116
Carbone J, 25, 59, 116
Cárdaba Olombrada B, 11, 15
Cargnolini JJ, 75
Carlos L, 15
Carmona F, 33
Caro Oleas JL, 114
Caro P, 96
Carranza D, 120
Carrascal Pérez M, 39
Carrasco Hidalgo AM, 96
Carrasco L, 86
Carrasco P, 43, 64
Carrasco Sayalero Á, 70
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ÍNDICE DE AUTORES
Carrasco YR, 15
Carreira P, 60
Carrera Rodríguez J, 109
Carretero Coca J, 108
Carretero J, 119
Carretero R, 53, 117, 120
Carretero-Iglesia L, 50
Casado J, 25, 78
Casado JG, 23, 73
Casal Román M, 27
Castañer Alabau JL, 49, 52
Castañer JL, 115
Castellanos E, 91
Castelló A, 86
Castillo Rama M, 88
Castrillo A, 14
Castro de las Cuevas L, 35
Castro MJ, 49
Castro Orgaz L, 28, 82, 110
Castro Panete MJ, 88
Cavanillas ML, 38
Cembrero Fuciños D, 99
Cénit Laguna MDC, 39
Cernuda Morollón E, 23
Chara Velarde L, 31, 63, 76
Chean Pacheco C, 14, 52, 94
Chen L, 46
Chevarria Montesinos J, 63, 76
Chima Galán MDC, 62, 100
Christensen Pedersen E, 96
Cianchetta Sívori M, 83
Cillero, 117
Cisneros E, 27, 104
Ciudad García MT, 68
Clemente Ximenis A, 44, 105
Cobo Medina M, 28, 46
Codina E, 76
Colino Gil E, 51
Collado J, 13, 40
Collado Miguens JA, 39
Collado Torres A, 120, 121
Colobrán R, 40
Colomé N, 13
Comas D, 50
Compte M, 55, 56
Concha A, 118, 119
Contesti J, 118
Córdoba L, 36
Corell A, 51, 91
Cortegano I, 18, 32
Costa Frossard L, 48
Couso J, 78
Cozar JM, 120
Crespí Bestard C, 105
Crespo J, 70
Crespo M, 103
Crettaz J, 26
Crisci E, 35, 36, 89
Cuadrado E, 26, 69, 74
Cuellas C, 90
Cuesta Martínez Á, 55, 56, 122
Cuesta Mateos C, 48, 56
Cuevas M, 115
Cuevas Pérez I, 24
D
Dale J, 14
Dávila de las Fuentes B, 62
Daza Cajigal V, 95
Daza V, 44
de Agustin de Oro T, 108
de Andrés A, 115
124
VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
de Andres B, 18, 32, 35
de Andrés C, 14
de Andres Martin A, 49
de Castro Rodríguez AI, 90
de Juan Echavarri MD, 74, 95
de Juan MD, 69
de Julián J, 73
de la Calle H, 102
de la Calle-Martín O, 41, 51
de la Mata García M, 110
de la Morena Barrios P, 95
de la Pompa JL, 20, 32
de la Torre Calzada MJ, 53
de La Torre Cisneros J, 110
de las Heras B, 30
de las Heras G, 65
de las Heras V, 39
de Miguel Sesmero J, 107
de Pablo R, 27, 50, 104
de Pablos JM, 107, 115
de Paz Cazón B, 37, 60
de Pereda D, 103
del Árbol O, 90
del Campo AB, 108, 119
del Monte Nieto G, 20
del Pozo Rodríguez N, 50, 58, 59, 94, 113, 116
del Val M, 71, 72, 75, 76
Delgado E, 73
Delgado J, 15, 88
Dema Jiménez B, 103
Díaz Corte C, 57
Díaz Freitas B, 47
Díaz Iglesias JM, 53
Díaz Martín D, 19, 31, 33, 63, 71, 76
Díaz Peña R, 40
Díaz-Madroñero MJ, 42, 49
Diez Rivero CM, 101, 103
Díez Rodríguez R, 90
Dircio Delgado V, 100
Doblaré E, 64
Domingo E, 46, 57
Domínguez Acosta AR, 90
Dominguez J, 35, 36
Domínguez Jiménez JL, 53
Domínguez Mozo MI, 48
Dominique K, 33
Dotor JD, 26
Drouet C, 88
Dubois B, 33
Dubrot Armendariz J, 45
Dubrot J, 22, 45, 46
Dukovska D, 18
E
Echaniz Aizpuru P, 74
Echaniz P, 26
Echevarría D, 106
Echeverria Beistegui I, 47
Eguiluz C, 21
Eizaguirre J, 69
Elorza Maza O, 53
Engel P, 78
Engle A, 53
Entrena A, 23, 34, 75, 92
Escalera Cardenas AM, 37, 101, 102
Escanlar Monteserín E, 66
Escoda C, 14, 91
Espejo C, 13
Espigado I, 112
Espino Paisán L, 102
Espiño M, 38, 48, 72
Esteban C, 94, 95
Esteban JI, 47
Etxaniz P, 69
F
Fariñas MC, 106
Fatela Cantillo D, 53
Favier B, 88
Fenutria R, 78
Fernández A, 115
Fernández Arcas N, 109
Fernández-Arquero M, 39
Fernández-Cruz E, 14, 58, 59, 85, 86, 116
Fernández D, 18
Fernández de Mera JJ, 64
Fernández-Fresnedo G, 113
Fernández Frutos B, 82
Fernández Guizan A, 118
Fernández-Gutierrez B, 37, 104
Fernández I, 91
Fernández-Luna JL, 87
Fernández M, 29
Fernández-Malavé E, 50, 72, 77
Fernández-Mestre M, 105
Fernández O, 50, 101
Fernández Pereira L, 65, 66
Fernández-Pugnaire MA, 47, 69
Fernandez-Rey M, 30
Fernández Rodríguez ML, 11
Fernández Salazar L, 72, 74
Fernández -Sánchez A, 24
Fernández Suárez A, 53
Fernandez Yañez J, 58, 59, 113, 116
Ferran I, 14
Ferreira A, 44, 50
Ferrer Balaguer JM, 44
Ferrer JM, 64
Ferrer R, 64
Ferrero A, 83
Figueredo MÁ, 57, 102, 104
Florido F, 15
Florido Ortega Y, 51, 90
Fontalba A, 87
Fontán G, 44
Fraile L, 35, 36
Fraile L, 89
Fresno M, 28
Frias Casas M, 28, 56, 82
Fuentes Ferrer M, 37
Fuentes García M, 16, 54
G
Gabari I, 22
Gago M, 113
Gallardo Posada S, 11
Gallardo S, 15
Gallego López A, 14, 58, 59
Galvez MD, 118, 119
Gambón Deza F, 106
García A, 101
García-Alonso AM, 95
García Álvarez T, 112
García Barcina M, 39
García-Blesa A, 20, 78
García-Calvo M, 76
García Casado J, 73
García Castillo G, 62
García-Ceca Hernández J, 12
García Cerrada M, 64
García-Cózar F, 20
García Frade J, 70
García Irles M, 109
García J, 54
Inmunol 29-S1 132p
4/6/10
09:55
Página 125
INMUNOLOGÍA
García Jurado G, 84
García Laorden MI, 90
Garcóa Leon MJ, 20, 35
García Lora ÁM, 120, 121
García Lozano JR, 37, 38, 101, 102
García Martínez V, 92
García MC, 44
García Montojo M, 48
García Olivares E, 12, 16, 17
García Ormaechea M, 109
García Ortega P, 15
García Ortiz L, 62, 100
García-Palomo D, 106
García-Pardo A, 91
García-Pérez A, 47, 69
García R, 18, 75
García Rodríguez MC, 50, 52
García-Rodríguez S, 47, 67, 69
García Ruiz JM, 90
García-Sánchez E, 86
García Sánchez F, 100, 102, 112
García Trujillo JA, 65, 66
García-Unzueta M, 87
Garcillán B, 77, 94
Garibay Vargas OM, 62
Garrido F, 53, 120, 108, 115, 117, 118, 119
Garrido López C, 120, 121
Garrido P, 107, 115
Garrido S, 43
Garrido Torres-Puchol F, 120, 121
Garrote Adrados JA, 72, 74
Gaspar ML, 18, 35
Gaudernak G, 108
Gayoso Cabada IC, 25, 27
Gayoso I, 22, 23, 73, 74, 78
Geisler C, 77
Gelpí C, 68
Genre F, 30
Gentil MA, 114
Gil Herrera J, 52
Gil J, 78, 96
Gil Ortega M, 95
Gil V, 78
Gills E, 120
Gómez A, 69
Gómez Arbesú J, 60, 65, 66
Gómez Bravo MA, 58, 110
Gomez C, 65, 113
Gomez de Agüero Tamargo M, 33
Gomez de la Concha E, 37
Gómez del Moral M, 34, 35
Gómez Huertas E, 57
Gómez Villamandos JC, 28, 84, 85, 92
Gomez-Castro S, 99
Gómez-Jiménez C, 55, 56
Gómez-Lozano N, 27, 113
Gomez-Prieto P, 93, 97, 98
Góngora R, 16
González A, 117
González-Aseguinolaza G, 26
González Escribano MF, 37, 38, 58, 102, 114
González Fernandez A, 47
González Fernández R, 28, 56, 82, 110
González González M, 16, 54
González-Granado JI, 43
González-Granado LI, 42, 49
Gordillo Gutierrez I, 52
González I, 22
González MJ, 111
González P, 83, 115
Gonzalez-Paz M, 87
González Porqué P, 72
ÍNDICE DE AUTORES
González Quevedo N, 51, 90
González Rodríguez A, 118
González Rodríguez AP, 118
González Rodríguez I, 20
González Rodríguez S, 118
González-Santesteban C, 41
González Zapata A, 92
Gordillo JJ, 73
Gordillo S, 64
Grados D, 61
Granada M, 111
Granell R, 105
Granja AG, 28
Grau López L, 13
Guardo AC, 77
Guarnizo MC, 73
Guasch S, 48, 56
Guaza C, 13
Gueimonde Fernández M, 20
Guijarro Muñoz I, 122
Guirado M, 120
Gurbindo D, 78, 94
Gurbindo Gutierrez D, 52
Gutiérrez Calvo A, 54
Gutiérrez-Cuadra M, 106
Gutiérrez Martín C, 37, 60, 65, 66
Gutiérrez Salinas J, 62, 100
Guzmán Espinosa C, 93
H
Heine-Suñer D, 95
Henández López C, 92
Hernández DC, 86
Hernández Flórez D, 85, 116
Hernández Villalon A, 99
Hernández-López C, 23, 34, 75
Herrera P, 115
Herrera Ramos E, 51, 90
Herrero C, 31
Herrero MJ, 96
Herrrero M, 70
Hervás-Stubbs S, 22, 45, 46
Hidalgo Izaguirre I, 49, 52
Hidalgo L, 23, 34, 75
Hidalgo Lumbreras L, 92
Höfferer L, 108
Holgado S, 61
Holmskov U, 91
Hortelano S, 30
Hoz MÁ, 106
Huergo Zapico L, 118
I
Ibarra R, 47
Ibernon M, 89
Iborra S, 72, 75, 77
Iglesias A, 95
Iglesias Alzueta J, 44
Iglesias J, 43
Iglesias M, 30
Illa I, 109
Infantes S, 18, 71, 75
J
Jaen García J, 96
Jara P, 66
Jaraquemada D, 13, 39, 40, 76
Jarque D, 105
Jeggo P, 45
Jiménez Gámiz P, 115
Jiménez M, 18, 75
Jiménez P, 107, 117
Jiménez Pérez MDV, 82
Jonhstone C, 71
Joven B, 60
Jozsi M, 89
Juan Otero M, 50
Juárez Rubio C, 109
Julià Benique MR, 105
Juliá MR, 95
Jurado M, 107
Jure-Kunkel M, 45, 46
K
Kern F, 59
Kiliç SS, 50
Kissenpfenning A, 33
Kotsch J, 25
Kremer L, 55, 56
Krzyzanowska A, 29
Kyewski B, 40
L
Labaer J, 54
Lafuente Duarte EM, 31
Lafuente EM, 101
Laguarda E, 105
Lagunas C, 31
Lahoz Navarro C, 11
Lanio Amador N, 14, 44, 58, 59
Lara Contreras R, 27
Lara Ruiz JM, 93
Lario A, 67
Larrea E, 22
Larrucea Bilbao S, 93
las Heras Ferre B, 113
Lasa I, 54
Lasala F, 18
Lasala F, 75
Lasarte JJ, 47
Lauzurica R, 111
Lázaro S, 72
Leal Cerro A, 62
Lecanda F, 45
Legaz Pérez I, 113
Leno Durán E, 12, 16, 17
Leon Arroyo A, 98
Leon Moya V, 98, 99
Lermo S, 60 , 92
Lermo-Rojo S, 42, 49
Ley M, 42
Leyva Cobian F, 83, 106, 107
Liiv I, 13
Linares Dickler I, 120, 121
Liz Marzan L, 47
Llamas I, 120
Llorca Diaz FJ, 107
Llorente S, 111
Longobardo MV, 67
López Almaraz R, 51
López-Álvarez MDR, 113
López Blanco R, 42
López-Botet M, 26, 29, 44
López Cacho JM, 11, 15
López D, 18, 71, 72, 75, 76
López de Arcuate A, 26
López-Fernández N, 51
López-Fontal R, 30
López Granados A, 56
López-Hernandez R, 88, 95, 98, 101
López Hoyos M, 65, 79, 87, 113
López Larrea C, 23, 24, 40, 57, 118
López Lera A, 43, 88
López M, 111
125
Inmunol 29-S1 132p
4/6/10
09:55
Página 126
ÍNDICE DE AUTORES
López Medrano F, 88
López-Nevot M, 50, 103
López-Osuna C, 78
López P, 107
López Peláez M, 29
López R, 111, 118
López Relaño J, 34, 35
López-Robledillo JC, 94
López Soto A, 118
López Suárez P, 20, 60
López-Trascasa M, 43, 88, 89
López Vázquez A, 40, 57
Lorena C, 35
Lorente E, 18, 75
Lozano F, 14, 78, 91
Lozano T, 47
Lucas D, 88, 98, 101
Lucena JM, 37, 58, 102
Lucena M, 103
Luna L, 32
Lund-Johansen F, 16
Luque Llarena I, 93
M
Maderuelo E, 83
Madrazo Atutxa A, 62
Magadán S, 106
Magri G, 26, 29
Maldonado J, 36
Maleno I, 108
Malissen B, 33
Mancebo E, 42, 49
Mancheño U, 22
Mansilla MJ, 13
Mantecón S, 96
Mantovani A, 89
Manzanares Martin B, 56, 82, 110
Marchán S, 31
Marcos JA, 90
Marcos M, 32
Marcos MAR, 18
Margolles Barros A, 20
Marín A, 61, 111
Marín Crespo N, 48, 61, 72
Marin MJ, 87
Marín Moreno MA, 53
Marin N, 13, 115
Marin Sánchez A, 15
Marincola FM, 53
Martí M, 76
Martín Alonso JL, 65
Martin Armentia B, 70
Martín F, 46
Martín Gayo E, 35
Martin Gil FJ, 70
Martín J, 54
Martín Villa JM, 54
Martin-Algarra S, 45
Martín-Fernández JM, 77
Martín-Valls GE, 89
Martin-Villa JM, 93
Martínez A, 45
Martínez Abad B, 72 74
Martínez Becerra MJ, 62
Martínez Bilbao C, 95
Martínez Bravo MJ, 114
Martínez Busto E, 45, 77, 78, 94
Martínez Cáceres E, 13
Martínez de Saavedra MT, 42
Martínez E, 109
Martínez F, 18
126
VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
Martínez García C, 44
Martínez I, 86
Martínez López JE, 109
Martínez Morán IM, 62
Martínez Naves E, 35
Martínez Peinado P, 109
Martínez VG, 14, 23, 34
Martínez VG, 75
Martínez-Bravo MJ, 112
Martínez-Cáceres E, 15, 61, 111
Martínez-Carretero MÁ, 41
Martínez-Florensa M, 20, 78
Martínez-Forero I, 22, 45, 46
Martínez-García P, 88
Martínez-Laso J, 93
Martínez-Martínez L, 41
Martínez-Morillo M, 61
Martínez-Naves E, 34
Martínez-Ojinaga Nadal E, 63
Martínez-Pomar N, 44, 95
Martínez-Quiles N, 93
Martínez-Sánchez MV, 95
Martínez-Taboada CM, 87
Martínez-Taboada VM, 87
Martino M, 51, 91
Marugán de Miguelsanz JM, 72
Maruri Machado N, 93, 95
Más A, 50
Maseres Javaloy P, 109
Mata C, 87
Matamoros Flori N, 44, 105
Matamoros N, 43, 44, 64, 95
Mateo ME, 51
Matozan K, 108
Mayayo T, 11
Mazon Ramos MA, 70
Mazuecos Blanca A, 112
Medrano de Dios LM, 103
Medrano LM, 50
Medraño Fernández U, 31
Melero I, 22, 45, 46
Melero JA, 71
Melero MJ, 43
Melero Ruiz J, 64
Melgar P, 32
Mellado M, 15
Mena I, 35
Menchén M, 42, 49
Mencía Á, 78
Méndez R, 108, 119
Mendoza JL, 103
Menéndez González A, 65
Menéndez P, 57
Meneu JC, 88
Menne S, 26
Merino R, 30
Merino Gracia J, 31
Merino J, 30, 46, 67, 78
Merino R, 30, 67, 78
Merino Roncal J, 57
Milà J, 121
Milheiro F, 46
Minguela A, 98, 101, 111
Minguela Puras A, 113
Minguez M, 105
Miranda A, 15
Miranda Sayago JM, 109
Miras M, 88, 98, 101
Mirete Bachiller S, 48, 61
Mirete S, 115
Miró C, 14, 91
Mischer S, 108
Modrego J, 85, 86
Modrego Ruiz J, 85
Moga Naranjo E, 109
Molina Hernández V, 28, 84, 85, 92
Molina I, 95
Molina IJ, 46, 120
Mongay L, 96
Monserrat Sanz J, 19, 31, 33, 63, 76
Montalban X, 13
Montalvillo Álvarez E, 72, 74
Montejo Baranda M, 27
Montes Cano MA, 38, 62
Montes Fernandez MDC, 74
Montes Torres L, 28, 82
Montes-Casado M, 21
Montoya M, 36, 89
Montoya N, 35
Mora F, 42
Mora P, 51
Morales Camino JC, 55, 56
Morales Galán C, 93
Morales JM, 88
Morales Pérez P, 11, 88
Morales-Kastresana A, 45, 46
Moraru M, 27, 104
Moreno A, 103
Moreno C, 46
Moreno de Alborán I, 18
Moreno Parado C, 57
Moreno Parra A, 92
Moreno Villegas Z, 19, 31, 33 63, 71, 76
Moreno-Pelayo MÁ, 78
Moretta A, 29
Morgado S, 23, 25, 73, 78
Moro García MA, 24
Moserrat Sanz J, 71
Mozo Avellaned L, 65, 66
Muixí Ponsà L, 39
Muntasell A, 26, 29
Muñagorri A, 69
Muñoz Calleja C, 48, 56
Muñoz Fernandez R, 12, 16, 17
Muñoz P, 46, 59, 113, 116
Muñoz Sanjuan MI, 64
Muñoz-Ruiz M, 50, 94
Murillo Cabezas F, 62
Muro M, 88, 98, 101, 111
Mussá R, 35
Mussá T, 36, 89
N
Naranjo Gómez M, 13, 33, 36
Navarro Caspistegui J, 14, 52, 58, 59, 94, 113
Navarro J, 59, 85, 116
Navarro M, 93
Navarro P, 47, 67, 69
Navarro, 107
Navas Méndez J, 79
Nielsen B, 77
Nieto A, 112
Nieto Sáchica JC, 32
Nigsch A, 108
Nocito M, 51
Nogal M, 86
Nozal P, 43, 89
Nuñez A, 101
Núñez C, 50
Nuñez F, 33
Núñez Orozco L, 100
Núñez Pardo de Vera, MC, 103
Inmunol 29-S1 132p
4/6/10
09:55
Página 127
INMUNOLOGÍA
Nuñez Roldan A, 37, 38, 58, 62, 93, 102, 110, 112,
114
O
Ocejo-Vinyals J, 107
Ocejo-Vinyals JG, 83, 106, 107
Ochoa MC, 46
Ochoa MDC, 22
Ojeda G, 21
Olagüe C, 26
Olascoaga J, 39
Olazabal Olearreaga IM, 31
Olcoz Goñi JL, 90
Olivares Beobide N, 95
Ordóñez del Valle D, 38
Orfao A, 16, 54
Ortega Moreno L, 19, 31, 33, 63, 71, 76
Ortega Suárez F, 57
Ortego-Centeno N, 67
Ortiz M, 18
Ortiz MA, 32
Otaegui D, 39
Otano Andrés I, 26
P
Pacheco A, 83
Pacho de Lucas A, 95
Padilla B, 83
Padilla Castillo D, 79
Palacios B, 18, 32
Palacios J, 115
Palazón A, 22, 45, 46
Palazón García A, 45
Palomino Díaz P, 62
Palomino P, 15
Palomo J, 113, 116
Palomo P, 59
Palou E, 96
Panizo C, 46
Parada Hermoza G, 19, 31, 33, 63, 71, 76
Páramo JA, 46
Paredes Y, 60
Parga-Lozano C, 93, 97, 98
Pascal M, 50
Pascual-Salcedo D, 37, 104
Pastor MC, 111
Pastoriza Santos I, 47
Pavón-Castillero EJ, 67
Pawelec G, 23
Paz Artal E, 11, 88
Pedrera Mazarro M, 28, 84, 85, 92
Peleteiro M, 47
Pende D, 26 , 29
Peña JL, 11
Peña Martínez J, 28, 56, 82, 110
Peñaranda P, 97, 98
Pera A, 22, 25, 74
Peraile Muñoz I, 82
Peralbo E, 22
Perdigones Borderías MN, 104
Pereboev A, 47
Pérez Aradas E, 60, 92
Pérez Aradas V, 11, 60, 92
Pérez Blas M, 54
Pérez Breña P, 52
Pérez Mestre VL, 117
Pérez Pérez G, 93
Pérez R, 40
Pérez Razo JC, 62, 100
Pérez Venegas JJ, 68
Pérez-Aradas V, 42, 49
Pérez-Cabezas B, 33, 36
ÍNDICE DE AUTORES
Pérez-Flores I, 57
Pérez-Flores V, 50, 77
Pérez-Gracia JL, 45
Peterson P, 13
Pilares Ortega L, 79
Pineda F, 70
Pini E, 21
Planas R, 76
Planelles D, 105, 100
Plascencia Alvárez N, 100
Polli SM , 117
Polo-Hernández E, 99
Pons De Ves J, 44
Portero F, 27
Portolés P, 21
Posada De La Paz M, 11
Postigo J, 30, 67
Prada A, 69
Prada Iñurrategui A, 74, 93
Pradas M, 41
Prado Cueto C, 37, 60
Prados Martin A, 12, 16, 17
Praena JM, 110
Prat Arrojo I, 96
Prieto J, 26, 47
Prieto Martín A, 19, 31, 33, 63, 71, 76
Puente Gutiérrez JJ, 53
Puig N, 100
Pujades C, 91
Pujol Borrell R, 13
Pujol M, 36
Pujol-Borrell R, 15, 33, 36, 40, 61, 96, 111
Q
Querol Gutierrez LA, 109
Quesada E, 120
Quintas A, 86
Quiralte J, 15
R
Rabasco Álvarez AM, 11
Raïch Regué D, 13
Rajas Naranjo O, 90
Raman V, 78
Ramo Tello C, 13
Ramos M, 71, 72, 75, 85
Ramos Vivas J, 79
Ramos Y, 90
Ramos-Amaya A, 17, 68
Ramos-Casals M, 78
Reche Gallardo PA, 103
Reche PA, 101
Recio Hoyas MJ, 45, 77, 94
Recio MJ, 52 , 78
Regueiro JR, 45, 50, 52, 77, 78, 94
Reiné Gutiérrez J, 77, 94
Reiné J, 78
Reinoso R, 51, 91
Remuzgo Martínez S, 79
Revilla Y, 28, 86
Rey D, 93, 97, 98
Reyes Engel A, 109
Reyes Martín E, 19, 33
Reyes Martín E, 71
Riballo E, 45
Rico MÁ, 71
Rieben R, 108
Riezu-Boj JI, 22, 47
Riñón Martínez-Gallo M, 93, 95
Risalde Moya MA, 28, 84, 85, 92
Rivera Reigada ML, 99
Rodríguez AI, 53, 118, 119
Rodríguez B, 30
Rodríguez C, 42, 68, 113
Rodríguez Carrio J, 60
Rodríguez de Castro F, 90
Rodríguez de La Peña , 57
Rodríguez Gallego C, 51, 90
Rodríguez Iglesias MJ, 62
Rodríguez L, 18, 37
Rodríguez Mandujano CS, 100
Rodríguez Molina J, 94, 113, 116
Rodríguez Pérez N, 54
Rodríguez Rodero S, 118
Rodríguez Sánchez B, 85
Rodríguez-Bayona B, 17, 68
Rodríguez-Benot A, 27
Rodríguez-Cariño C, 36
Rodríguez-Cebria M, 105
Rodríguez-Molina J, 59
Rodríguez-Sáinz C, 85, 86, 116
Roifman CM, 50
Roig R, 105
Roig RJ, 100
Rojas A, 18
Rojas D, 91
Rojas N, 25, 78
Rojas-Colonelli N, 22, 74
Rojo JM, 21
Rojo P, 42
Roldan Santiago E, 49, 52
Roldán Santiago E, 72
Romero Chala S, 65, 66
Romero García I, 120I, 121
Romero García Z, 46
Romero Gomez M, 38
Romero Palomo F, 28, 84
Romero R, 111
Romero-Gomez M, 103
Romo N, 29, 44
Roncero RG, 73
Rosal-Vela A, 67
Rosell J, 95
Roselló S, 91
Rosenbek Finkfink DF, 91
Roura-Mir C, 76
Roustán G, 27
Rouzaut Subirá A, 45
Roy Ariño G, 61
Rubiales MC, 41, 68
Rufián Peña S, 110
Ruiz C, 18
Ruiz M, 113
Ruiz Magaña MJ, 55, 56
Ruiz Ortiz de Arrizabaleta E, 61
Ruiz Ruiz MDC, 12, 55, 56
Ruiz-Cabello F, 107, 108, 115, 117, 119, 120
Ruiz-Cabello Osuna F, 103, 118, 119
Ruíz-Contreras J, 42, 49
Ruiz-Criado J, 113
Ruiz-Magaña MJ, 55, 56
Ruiz-Ortiz de Arrizabaleta E, 15
Ruiz-Ruiz C, 55, 56, 120
S
Sabina P, 28, 86
Sacedón Ayuso R, 92
Sacedón E, 23
Sacedón R, 34, 75
Sádaba Argaiz MC, 72
Sáenz Cuesta M, 69, 74
Sáenz M, 26
Saenz-López P, 117, 120
Saez de Guinoa Corral J, 15
127
Inmunol 29-S1 132p
4/6/10
09:55
Página 128
ÍNDICE DE AUTORES
Sáez-Borderías A, 29
Salama H, 88, 101
Saldivia MA, 55, 56
Salgado G, 88, 98,101, 111
Salgado-Cecilia MG, 95
Salinas JA, 44, 95
Salvador Corres I, 15
Salvador I, 61
San José B, 63
San Juan Garrido R, 88
San Miguel A, 70
Sanal O, 50, 77
Sánchez A, 111
Sánchez Atrio A, 63, 76
Sánchez B, 78
Sánchez C, 107
Sánchez Castañón M, 65, 113
Sánchez Cordón PJ, 28, 84, 85, 92
Sánchez Correa B, 73
Sánchez Costilla D, 117
Sánchez EG, 28
Sánchez Espinel C, 106
Sánchez Gordo FDP, 96
Sánchez Ibarrola A, 57
Sánchez J, 101
Sánchez K, 105
Sánchez Luengo MA, 19, 31, 33, 71
Sánchez Madrid F, 31
Sánchez Salazar M, 90
Sánchez Sánchez B, 93
Sánchez-Archidona AR, 18, 32
Sánchez-Corral P, 89
Sánchez-Correa B, 23, 25, 73, 74
Sánchez-Fructuoso A
Sánchez-Ibarrola A, 46
Sánchez-Luna M, 83
Sánchez Luengo MA, 19
Sánchez-Martín D, 55, 56
Sánchez-Ramón S, 14, 83
Sánchez-Velasco, 106, 106
Sánchez-Velasco P, 83
Sancho J, 47, 67, 69
Sancho-López J, 67
Sangro B, 45
Sanromán S, 42
Santa Cruz Llata C, 79, 87
Santiago JL, 57, 102
Santiago Quintana E, 51
Santiuste I, 30
Santos E, 72
Santos Luna F, 27
Santos Medina E, 95
Sanz Alcober L, 122
Sanz GF, 100
Sanz L, 55, 56
Sarmiento E, 59, 116
Sarmiento Marchese E, 14, 25, 58, 59, 94, 113, 116
Sarobe P, 47
Sarria Oses J, 63
Sayagües JM, 16, 54
Schamel WW, 50
Sempere Ortells JM, 109
Serra-Pagès C, 91
Serrano A, 60, 92
Serrano del Castillo C, 62
Serrano Hernandez A, 11
Serrano N, 18, 32
Serrano Pertierra E, 23
Sevilla M, 92
Sevilla Sánchez M, 11, 60
128
VOL. 29 SUPL. 1/ 2010
Sevillano MD, 99
Silva Carreras F, 52
Silva Carreras FG, 70
Silva Carreras G, 49
Silva L, 47
Simon-Grifé M, 89
Sintes J, 78
Smith G, 76
Solana E, 22
Solana Lara R, 25, 27
Solana R, 23, 73, 74, 78
Solano Jaurrieta JJ, 24
Soldevilla G, 78
Solé Violán J, 90
Soler P, 41, 43
Sologuren Marrero I, 51, 90
Solves P, 100
Soria Castro I, 29
Soriano Díaz S, 113
Soto Candia D, 100
Sousa Martín JM, 110
Spycher M, 108
Srivastava G, 120
Stark Aroeira L, 77
Stauch D, 25
Stephens C, 103
Suárez Álvarez B, 57
Suárez Díaz A, 37, 60
Suárez García FM, 24
Suarez N, 45
Suárez-Álvarez B, 24
Subiza J, 117
T
Takada H, 50
Talayero P, 42, 49
Talise Astier M, 11, 60, 92
Tallón I, 112
Tarazona E, 22
Tarazona R, 25, 73, 74, 78
Teijeira A, 45
Teijeiro R, 14, 116
Tejedor Vaquero R, 118
Tejera Alhambra M, 14
Tena X, 61
Teniente Serra A, 15, 61, 96
Toboso de Lamo I, 83, 115
Toribio García ML, 20, 35
Toro Llamas S, 69 , 114
Torre-Cisneros J, 27
Torrelo A, 94
Torres B, 101
Torres Collado MJ, 42
Torres Lanzas J, 95
Torres LM, 117
Torres Rusillo S, 46
Torres S, 95
Tosca J, 105
Tramón Gutierrez P, 62
Traves PG, 30
Trento A, 71
Trujillo JA, 43
U
Ulzurrun E, 103
Unciti Broceta JD, 46
Urbano-Ispizúa Á, 112
Urcelay E, 38
Urreta I, 69
Usero Redrejo L, 76
V
Valencia J, 23, 34, 75
Valencia Mahón J, 92
Valentino S, 89
Valero F, 107
Valero Hervás DM, 11, 60, 88
Vall O, 50
Vallejo Diez S, 72, 74
Vallespinós M, 18
Valor L, 85, 116
Van Eden W, 21
Vandenbroeck K, 39
Vaquero M, 27
Vaquero Mejia IC, 107
Varade López J, 37
Varas A, 23, 34, 75
Varas Fajardo A, 92
Vargas Camaño ME, 62, 100
Vargas Pérez ML, 64
Vazquez Miralles JM, 70
Vázquez MN, 23, 75
Vázquez-Echeverría C, 91
Vega Bogado AK, 46
Vega K, 95
Vicario JL, 100
Vicario Moreno JL, 102, 112
Vicente Á, 23, 34, 75
Vicente López A, 92
Vidal Castiñeira JR, 40
Vidal S, 32
Vilches C, 18, 27, 104
Vilches M, 112
Vilches Ruiz C, 38, 113
Vilella R, 121
Villalba Díaz MT, 35
Villar Guimerans LC, 48
Villar Guimerans LM, 72
Villar L, 13, 115
Villar LM, 38, 83
Villar S, 83
Villegas N, 83
Vives-Pi M, 76
Vocanson M, 33
W
Wang E, 53
Ward S, 119
Woodbine L, 45
X
Xufré C, 76
Y
Yagüe J, 50
Yélamos J, 20, 91
Z
Zabaleta A, 47
Zafra MP, 21
Zamora C, 32
Zamora E, 83
Zapata A, 23, 34, 75
Zapata González A, 12
Zapata JM, 48 56
Zaragoza Saavedra JJM, 62, 100
Zichenko S, 119
Zimman H, 117
Zubiaur M, 47, 67, 69
Zumaquero E, 47, 67, 69

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