Trabajo Práctico Nº - Aula Virtual FCEQyN
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales Ingeniería en Alimentos. Cátedra: Química y Bioquímica de los Alimentos Dr. Ing. Luis A. Brumovsky – Mgter. Bqca. Marta A. Horianski Trabajo Práctico Nº 2 - 2014 1 TRABAJO PRÁCTICO Nº 2 PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS PROTEÍNAS DESNATURALIZACIÓN E HIDRATACIÓN Objetivo ¬ ¬ ¬ Evaluar el efecto desnaturalizante de diferentes agentes sobre una proteína. Evaluar propiedades de hidratación de las proteínas mediante el empleo de diferentes métodos. Extraer proteínas de una fuente alimenticia basándose de las propiedades de solubilización. Introducción DESNATURALIZACIÓN La desnaturalización proteica puede definirse como cualquier modificación de su conformación a nivel de la estructura secundaria, terciara y cuaternaria que no vaya acompañada por la ruptura de los enlaces peptídicos implicados en la estructura primaria, dando lugar a cambios en las propiedades químicas, físicas y biológicas. Durante la desnaturalización las moléculas plegadas y enrolladas de las proteínas, se desdoblan e interaccionan entre sí, con el agua o iones pequeños, dependiendo que tipo de interacción predomine, la proteína se solubilizará o se volverá insoluble, dando lugar a la formación de agregados o geles. Esto puede ocurrir a diferentes velocidades, dependiendo de las características de cada proteína y de los efectos de los agentes desnaturalizantes sobre las mismas. Puede ocurrir por acción del calor, congelación, fuerzas mecánicas, agentes químicos tales como sales, ácidos, bases, metales, solventes orgánicos, etc. · Desnaturalización por calor: La mayoría de las proteínas globulares incrementan su solubilidad al aumentar la temperatura, dentro de un rango de 0 a 40ºC. A temperaturas mayores de 40 a 50ºC, la mayoría de las proteínas son inestables y comienzan a desnaturalizarse. Se produce perdida de solubilidad en la zona de pH neutro, y puede precipitar separándose completamente del líquido donde se encuentra disuelta. La sensibilidad de las proteínas a la desnaturalización térmica, depende de numerosos factores tales como la naturaleza y concentración de la proteína, actividad del agua, pH, fuerza iónica, naturaleza de los iones presentes. · Desnaturalización por salación (salting-out): A concentraciones salinas altas superiores a 1 M la solubilidad de las proteínas decrece debido a que gran parte del agua presente en el medio se fija a los iones salinos, lo que determina la deshidratación de las proteínas y puede haber precipitación. Esto se debe a que las interacciones proteína–proteína resultan más importantes que las interacciones proteína – agua y esto puede conducir a una agregación seguida de precipitación. La acción precipitante de las sales viene dada por la serie de Hofmeister donde los iones de la izquierda tienen mayor efecto precipitante. SO4= < F- < CH3COO- < Cl- < Br- < NO3- < I- < ClO4- < SCNNH4+ < K+ < Na+ < Li+ < Mg++ < Ca++ Las sales más empleadas para producir este efecto son las de sulfato de amonio y sulfato de sodio. · Desnaturalización por solventes orgánicos: La adición de algunos solventes orgánicos, tales como etanol o acetona a una solución acuosa de proteína, rebaja la constante dieléctrica del medio disminuyendo las fuerzas electrostáticas de repulsión existentes entre las moléculas proteicas, favoreciendo la interacción proteína-proteína lo que contribuye a la agregación y precipitación. · Desnaturalización por metales pesados: Las sales de metales pesados precipitan las proteínas porque el ion del metal pesado muy probablemente se combina con la forma aniónica de la proteína. La proteína en el lado alcalino de su punto isoeléctrico existe como ión negativo y así al combinarse con el ión del metal o catión, formará proteínatos tales como proteinato de mercurio, de 1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales Ingeniería en Alimentos. Cátedra: Química y Bioquímica de los Alimentos Dr. Ing. Luis A. Brumovsky – Mgter. Bqca. Marta A. Horianski Trabajo Práctico Nº 2 - 2014 2 plomo, de plata, etc. En cambio los reactivos alcaloidales precipitan las proteínas al combinarse el radical acídico del reactivo alcaloidal con la forma catiónica de la proteína que predomina en él lado ácido del punto isoeléctrico. Se forma entonces precipitados que podríamos llamar por ejemplo tanato de proteína, fosfomolibdato de proteína, etc. · Desnaturalización por solutos orgánicos: Compuestos orgánicos como la urea y las sales de guanidina inducen la desnaturalización de las proteínas, en soluciones concentradas (8 a 6 M) por ruptura de los enlaces hidrógeno. · Desnaturalización isoeléctrica: A valores de pH ↑ ó ↓ a su punto isoeléctrico (pI), las proteínas tienen cargas positivas o negativas. La repulsión y la hidratación de los restos cargados promueven la solubilización de la proteína. A pI debido a ausencia de repulsiones electrostáticas se promueve la agregación y precipitación. En estas condiciones se forma un precipitado que se disuelve tanto del lado alcalino como de acido del pI. La mayor parte de la proteínas de los alimentos son acidas con una solubilidad mínima a pH = 4-5 (pI) y máxima a pH alcalinos. PROPIEDADES DE HIDRATACIÓN Las propiedades de hidratación están vinculadas a la interacción de las proteínas con el agua e influyen en aspectos relacionados a la formulación, procesamiento y almacenamiento de alimentos. Para utilizar los concentrados y aislados secos de proteínas, hay que hidratarlos, por eso es de gran interés práctico estudiar las propiedades de hidratación y rehidratación de las proteínas alimenticias. Figura 1. H2O (Vapor) ADSORCIÓN PROTEÍNA DESHIDRATADA HINCHAMIENTO H2O (Líquida) ABSORCIÓN H2 O SOLUBILIDAD Figura 1. Representación esquemática de las interacciones proteína-agua durante el proceso de hidratación de un polvo proteico. · Capacidad de adsorción de agua: Indica la aptitud de un material a adsorber agua en forma espontánea cuando se lo expone a una atmósfera de humedad relativa constante. En principio es un fenómeno superficial. Si la extensión de la hidratación es muy importante, puede ocurrir absorción en el interior, hinchamiento y eventualmente solubilización. · Capacidad de absorción de agua: Indica la aptitud de un material a embeber agua en su estructura en forma espontánea cuando se lo pone en contacto con el agua a través de una superficie que se la mantiene húmeda o por inmersión. · Solubilidad: La solubilidad de un material proteico describe la capacidad de formar soluciones coloidales. Se define como la porción de nitrógeno que se solubiliza luego de un determinado y específico procedimiento. · Capacidad de retención de agua: Es la cantidad de agua que un material proteico puede retener bajo la acción de una fuerza centrífuga, depende de las condiciones de centrifugación, tiempo de centrifugado y temperatura. Estandarizando la fase de centrifugación es posible reducir los efectos de las condiciones de operación. 2 Trabajo Práctico Nº 2 - 2014 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales Ingeniería en Alimentos. Cátedra: Química y Bioquímica de los Alimentos Dr. Ing. Luis A. Brumovsky – Mgter. Bqca. Marta A. Horianski 3 DESARROLLO PRÁCTICO Nº 2 PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS PROTEÍNAS DESNATURALIZACIÓN E HIDRATACIÓN Consignas - - - Evaluar el efecto desnaturalizante sobre las proteínas de la clara de huevo de los siguientes factores: Calor, soluciones salinas concentradas, solventes orgánicos, solutos orgánicos, metales pesados y ácidos. Evaluar propiedades de hidratación de las proteínas determinando: a) La capacidad de absorción de agua de una muestra proteica en polvo utilizando el aparato de Baumann modificado. b) La capacidad de retención de agua de una muestra proteica en polvo mediante el método propuesto por Piva et al. Extraer las proteínas de la leche fraccionándola en caseínas y proteínas del suero basándose en las propiedades de solubilización en función del pH y temperatura. Desnaturalización Materiales y métodos Muestra: - Clara de huevo Materiales: - Vaso de precipitado de 50 y 400 ml Tubos de ensayos Pipetas Mechero de bunsen y trípode o placa calefactora Gradilla Baño María invertido - Agua destilada Solución de etanol al 96% Solución de nitrato de plata al 5% Solución de cloruro de mercurio al 5% Solución de ácido cítrico al 5% Solución saturada de sulfato de amonio Solución saturada de urea Reactivos: Metodología Desnaturalización por calor 1. Colocar 5 ml de clara de huevo sin diluir en un tubo de ensayo 2. Calentar en baño de agua en ebullición durante 5 minutos. Desnaturalización por soluciones salinas concentradas 1. Colocar 5 ml de clara de huevo sin diluir en un tubo de ensayo 2. Agregar 5 ml de solución saturada de sulfato de amonio. 3. Dejar reposar 20 minutos Desnaturalización por un solvente orgánico 1. Colocar 5 ml de clara de huevo sin diluir en un tubo de ensayo. 2. Transferir el tubo a un baño de hielo. 3. Dejar reposar durante 5 minutos. 4. Adicionar 5 ml de etanol al 96%. 5. Homogeneizar suavemente. 3 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales Ingeniería en Alimentos. Cátedra: Química y Bioquímica de los Alimentos Dr. Ing. Luis A. Brumovsky – Mgter. Bqca. Marta A. Horianski Trabajo Práctico Nº 2 - 2014 4 Desnaturalización por un soluto orgánico 1. Colocar 5 ml de clara de huevo sin diluir en un tubo de ensayo. 2. Agregar 5 ml de solución saturada de urea. 3. Homogeneizar suavemente. Desnaturalización por metales pesados 1. Colocar 1 ml de clara de huevo diluida 1:5 en agua destilada en cada uno de dos tubos de ensayo. 2. Adicionar a uno de ellos 5 gotas de nitrato de plata al 5% y al otro 5 gotas de cloruro de mercurio al 5%. 3. Homogeneizar suavemente. Desnaturalización por ácidos orgánicos fuertes 1. Colocar 1 ml de clara de huevo diluida en un tubo de ensayo. 2. Agregar 15 gotas de solución de ácido cítrico al 5%. 3. Homogeneizar suavemente. Resultados Comparar el aspecto de la clara tratada con el de la clara sin tratar. Reportar las observaciones hechas y los resultados obtenidos. Agentes desnaturalizantes Temperatura Calor Soluciones salinas concentradas Solución saturada de sulfato de amonio Solventes orgánicos Solución de etanol al 96% Solutos orgánicos Solución saturada de urea Aspecto de la muestra Solución de cloruro de mercurio al 5% Metales pesados Solución de nitrato de plata al 5% Ácidos. Solución de ácido cítrico al 5% Propiedades de hidratación 1. Adsorción de agua Mediante las isotermas de sorción o desorción se pueden describir gráficamente la cantidad de agua adsorbida o perdida, de acuerdo a que si el material esta seco o húmedo, en función de la humedad relativa de la atmósfera circundante al material o actividad de agua del material. Las isotermas de sorción se obtienen principalmente a través de dos grupos diferentes de métodos: el método gravimétrico y los basados en la determinación de la aw o presión de vapor de agua. Método gravimétrico: En este método se mide el cambio de peso de la muestra en función de una determinada presión de vapor de agua de la atmósfera circundante y se asume que en el equilibrio el material tiene la misma presión de vapor que la atmósfera circundante. El método gravimétrico estático es el más utilizado y ha sido estandarizado por “European Cooperative Project Cost 90”. Se utiliza un desecador que contiene un soporte perforado sobre el cual se apoyan los pesafiltros o frascos con tapas conteniendo la muestra. En la base del desecador se coloca un recipiente 4 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales Ingeniería en Alimentos. Cátedra: Química y Bioquímica de los Alimentos Dr. Ing. Luis A. Brumovsky – Mgter. Bqca. Marta A. Horianski Trabajo Práctico Nº 2 - 2014 5 conteniendo aproximadamente 150 ml de una solución de humedad relativa conocida constante. El desecador se debe colocar en una cámara de temperatura constante. Materiales y métodos Muestra: - Proteína deshidratada Materiales: - Pesa filtros Reactivos: - Solución de humedad relativa conocida Equipos: - Desecador - Balanza Metodología Se utiliza un desecador para cada humedad relativa. La humedad relativa de la atmósfera dentro de cada desecador se ajusta utilizando soluciones de presión de vapor de agua conocida. Tabla Nº 1. 1. Colocar dentro del desecador un recipiente con la solución de humedad relativa conocida. 2. Tarar cada pesafiltro 3. Colocar una cantidad de muestra (0,5–2 g) de tal forma que la altura no supere los 0,3 cm para evitar largos periodos de equilibrio. 4. Colocar los pesafiltros en el desecador por duplicado, se hace vacío parcial y se almacenan a temperatura constante. 5. Pesar las muestras tapadas a diferentes tiempos y seguir la evolución hasta pesada constante (diferencia entre dos pesadas sucesivas < 0,1 mg). 6. Determinar el contenido de humedad de las muestras, una vez alcanzado el equilibrio. g H2O Contenido de humedad = 100 g masa seca Los tiempos para llegar al equilibrio son por lo general entre 7 y 14 días para aw < 0,65 y hasta de 4–5 semanas para AW > 0,80. Tabla 1: Humedad relativa de soluciones saturadas salinas a diferentes temperaturas. Soluciones salinas Cloruro de litio (a) Cloruro de magnesio (a) Nitrato de magnesio (a) Bromuro de sodio (a) Ioduro de potasio (a) Cloruro de sodio (b) Sulfato de amonio (b) Cloruro de potasio (b) Cloruro de bario (b) Nitrato de potasio (a) Sulfato de potasio (b) 20 11,31 33,07 54,38 59,14 69,90 75,20 81,34 85,05 90,65 94,62 97,59 25 11,30 32,78 52,89 57,57 68,86 75,10 80,99 84,20 90,30 93,58 97,30 Temperatura (ºC) 30 35 40 11,28 11,25 11,21 32,44 32,05 31,60 51,40 49,91 48,42 56,03 54,55 53,17 67,89 66,96 66,09 75,00 74,90 74,68 80,63 80,27 79,91 83,60 82,70 81,80 90,00 89,50 92,31 90,79 89,03 97,00 96,71 96,41 50 11,10 30,54 45,44 50,93 64,49 74,43 79,20 80,20 84,78 95,82 Fuente:(a) Greenspan (1976); (b) Kitic et al. (1986) Métodos para determinar el contenido de humedad - Calentamiento en estufa con vacío (100 ºC) hasta constancia de peso (± 0,1 mg). - Titulación por Kart Fischer. - Secado infrarrojo. 5 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales Ingeniería en Alimentos. Cátedra: Química y Bioquímica de los Alimentos Dr. Ing. Luis A. Brumovsky – Mgter. Bqca. Marta A. Horianski Trabajo Práctico Nº 2 - 2014 6 Aplicaciones - El método gravimétrico es el más utilizado por su sencillez y porque no requiere equipos costosos. - Se puede aplicar a cualquier tipo de producto y rango de humedad relativa. Limitaciones - Largo tiempo necesario para lograr el equilibrio - Puede haber crecimiento de microorganismos a humedades relativas superiores a 65%. Para solucionarlo se puede utilizar UV, acetato fenilmercúrico, fungicidas, timol o sorbato de potasio. Métodos de obtención de la isortermas de sorción basados en la determinación de la presión de vapor de agua y/o aw. El material se humidifica ya sea por el agregado de agua o por exposición a una atmósfera de alta humedad relativa. El contenido de agua se determina mediante algunos de los métodos descriptos anteriormente y se determina la actividad de agua. 2. Capacidad de absorción de agua La determinación de la capacidad de absorción de agua se puede realizar utilizando el - Aparato de Baumann (1966). - Aparato de Baumann modificado (Torgersen y Toledo, 1977). Aparato de Baumann modificado Actualmente las mediciones se llevarán a cabo utilizando el equipo de Baumann modificado. Consiste en un filtro bacteriológico Millipore de 4 cm de diámetro, o un filtro de Buchner en el cual se coloca un papel de filtro (tipo Whatman o similar). El filtro está conectado mediante una manguera flexible a una pipeta graduada de 1 a 2 ml, sostenida en posición horizontal y al mismo nivel que el papel de filtro. Figura 2. El ensayo se debe realizar a temperatura ambiente cuidando que no existan corrientes de aire. Figura 2. Aparato de Baumann modificado Materiales y métodos Muestra: - Proteína deshidratada: Gelatina, aislados proteicos de soja. Materiales: - Papel de filtro - Papel absorbente - Espátula Reactivos: - Agua destilada Equipos: - Balanza - Cronómetro - Aparato de Baumann 6 Trabajo Práctico Nº 2 - 2014 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales Ingeniería en Alimentos. Cátedra: Química y Bioquímica de los Alimentos Dr. Ing. Luis A. Brumovsky – Mgter. Bqca. Marta A. Horianski 7 Metodología 1. Llenar el equipo, toda la tubería y la pipeta, con agua termostatizada a temperatura ambiente evitando la incorporación de burbujas. 2. Colocar el papel de filtro dejando que embeba agua aproximadamente 5 min. Con un papel absorbente se elimina el exceso de agua sobre el papel de filtro hasta lograr enrasar en cero la columna de agua de la pipeta. 3. Dejar 5–10 min para verificar la nivelación del equipo (en este tiempo no debe variar la posición del menisco de agua). 4. Pesar la muestra alrededor de 50–60 mg para cada medida. 5. Colocar el polvo proteico exactamente pesado distribuyéndolo uniformemente sobre el papel de filtro. Si se observa poca uniformidad en el tamaño de partícula, el polvo será previamente tamizado, de modo de asegurar que todas las partículas que se utilicen posean un tamaño menor que el corte del tamiz. 6. Disparar el cronómetro. 7. Registrar el retroceso de la columna de agua en la pipeta (cantidad de agua absorbida) en función del tiempo hasta que esta no varíe más. Registrar el tiempo cada 5 seg. hasta los 30 seg. Luego cada 10 seg. hasta el primer minuto, luego cada 5 minuto hasta los 30 minutos y cada 30 minutos hasta los 90 minutos. Realizar una lectura final a las 2 horas. El tiempo para llegar al valor de equilibrio puede variar entre 5 minutos y 2 horas, dependiendo del tipo de proteína y granulometría de la muestra. Se puede determinar a la vez la velocidad y la extensión de la hidratación. Expresión de los resultados: La cantidad de agua absorbida (q) a cada tiempo se expresa como: ml de agua/g masa seca (MS) y se grafica en función del tiempo en minutos obteniéndose las curvas de absorción de agua (Figura 3). El máximo valor que se obtiene en la curva corresponde al parámetro conocido como capacidad de absorción de agua o WIC (Water Imbibing Capacity). A partir de las curvas de cinética de absorción, y, calculando la pendiente en la porción lineal inicial de la curva se puede obtener la velocidad inicial de absorción de agua. Curva de absorción de agua q= Donde: q = cantidad de agua absorbida en el tiempo t. Q = máxima capacidad de absorción de agua. B = tiempo necesario para absorber la mitad de la cantidad máxima de agua (Q/2). Velocidad de absorción = Donde: Figura 3. Curva de absorción de agua = (Q − q) (Q − q) = cantidad de agua que debe ser (BQ) absorbida para alcanzar el equilibrio. = constante específica de velocidad K. Aplicaciones - Sirve para determinar la absorción espontánea de agua de cualquier material proteico en polvo. - Permite determinar la capacidad de absorción de agua y velocidad de hidratación. Es un parámetro muy importante desde el punto de vista tecnológico, vinculado a la práctica de 7 Trabajo Práctico Nº 2 - 2014 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales Ingeniería en Alimentos. Cátedra: Química y Bioquímica de los Alimentos Dr. Ing. Luis A. Brumovsky – Mgter. Bqca. Marta A. Horianski 8 rehidratación que normalmente se realiza antes de la utilización de cualquier ingrediente proteico. - Permite estudiar el efecto de la temperatura, pH y de la presencia de solutos en el agua de hidratación. - Es importante en productos de bajo contenido de agua y en procesos de secado y almacenamiento. Limitaciones - Cuando las proteínas son muy solubles y dan soluciones de baja viscosidad, se observa de que luego de llegar al máximo en la curva de absorción de agua, esta comienza a decrecer. En estos casos no se puede definir una máxima capacidad de absorción de agua. 3. Solubilidad. - Determinación de la solubilidad. Efecto del tratamiento térmico Preparar dispersiones acuosas de proteínas de suero que contengan 0,5, 1 y 3% de proteínas. Tratar las muestras durante 0, 10, 30 y 60 minutos a 90 °C. Centrifugar a 14000g durante 15 minutos y determinar la solubilidad en cada condición de temperatura como: Solubilidad (%) = Proteína soluble Proteína total Para medir proteína soluble se utilizará el método de Bradford Método de Bradford para la determinación de proteínas. (Rango: 0,1 a 1 mg/ml) Materiales y métodos Muestra: - Proteína deshidratada: Gelatina, aislados proteicos de soja. Materiales: - Micropipetas Probetas de 100 ml Tubos de hemólisis Pipetas Reactivos: - Serva Blue G (Serva, Westbury, NY) o Coomassie Brilliant Blue G-250 - Ácido fosfórico 85% - Agua destilada - NaOH 1M Equipos: - Balanza - Espectrofotómetro Metodología 1. Disolver 100 mg de Serva Blue G (Serva, Westbury, NY) o Coomassie Brilliant Blue G-250 en una mezcla de 100 ml de y 50 ml de etanol 95%. 2. Una vez que el colorante se disolvió completamente, llevar a 1 litro con agua destilada fría. Agregar en una relación de 50 ml por cada ml de reactivo. 3. Prender el espectrofotómetro 15 min. antes de usarlo, para que se estabilice la lámpara. 4. Poner 40 ml de muestra en un tubo de hemólisis. 5. Agregar 2 ml de reactivo de color e incubar 5 min. 6. Medir la absorbancia a 590 nm en cubetas de vidrio o poliestireno. Nota: Alternativamente el NaOH 1M puede agregarse sobre la muestra si no hubiera sido incorporado previamente al reactivo. 8 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales Ingeniería en Alimentos. Cátedra: Química y Bioquímica de los Alimentos Dr. Ing. Luis A. Brumovsky – Mgter. Bqca. Marta A. Horianski Trabajo Práctico Nº 2 - 2014 9 Aplicaciones - Selección de las condiciones optimas de extracción, purificación y separación de fracciones proteicas. - Conocimiento de las aplicaciones potenciales de la proteína. - Optimizar las condiciones de procesamiento. - Indicar el grado de tratamiento térmico por calor. 4. Capacidad de retención de agua Se determinará la capacidad de retención de agua empleando el procedimiento propuesto por Piva et al. (1981) en el cual se tiene en cuenta la fracción de proteína solubilizada durante el procedimiento. Esquema 1. Materiales y métodos Muestra: - Proteína deshidratada: Proteína del suero de la leche, aislados proteicos de soja. Materiales: - Micropipetas o pipetas Pasteur Vaso de precipitado Pipetas de 5 y 10 ml Tubos ependorff de 2 o 1,5 ml Pesafiltros Reactivos: - Agua destilada Equipos: - Balanza - Centrífuga Metodología Se realizará según el esquema 1. 1. Preparar 5 ml de la suspensión de proteína al 20%. Homogeneizar bien. 2. Transferir 2 o 1,5 ml exactamente medidos a dos tubos ependorff. 3. Centrifugar durante 30 minutos a 2000 rpm. 4. Separar el sobrenadante y residuo de cada ependorff y colocarlos en pesafiltros tarados. 5. Pesar cada uno de ellos. Registrar los pesos en la Tabla 2. 6. Llevar los pesafiltros con los sobrenadantes y residuos a estufa a 105 ºC durante 18-24 h hasta peso constante. 7. Pesar y calcular S, R, W 1 y W 2. Determinar WHC, HW y Fracción soluble WHC (retención de agua o Water Holding Capacity) = W 2/R (g H2O/g residuo seco) HW (agua retenida o Held Water) % = [W 2/(W 1+W2)] x 100 (g H2O /H2O inicial) Fracción soluble = [S/R+S)] x 10 Tabla 2. Registro de pesos y cálculos Nº PF PPF PPF+(R+W ) 2 PPF+(S+W ) 1 PPF + R PPF +S Wr W 2 W 1 9 Trabajo Práctico Nº 2 - 2014 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales Ingeniería en Alimentos. Cátedra: Química y Bioquímica de los Alimentos Dr. Ing. Luis A. Brumovsky – Mgter. Bqca. Marta A. Horianski Esquema 1. Método propuesto por Piva et al. (1981) para determinar capacidad de retención de agua Aplicaciones - El cálculo de agua retenida es más recomendable como expresión de la capacidad de retención de agua ya que se independiza de la fracción de proteína solubilizada. - En el caso de no disponer de un liofilizador se puede utilizar secado en estufa (100 ºC hasta peso constante) del residuo (R + W 2) y calcular W 1 como diferencia entre el agua agregada y W 2. Limitaciones - Si la proteína es totalmente soluble no puede utilizarse este método. Extracción las proteínas de la leche, fraccionamiento en caseínas y proteínas del suero y posterior disolución Normalmente la leche de vaca contiene aproximadamente 30-35 g/lt de proteínas. Cerca de 80% de las proteínas de la leche son caseínas las que se encuentran formando grandes complejos esféricos conocidos como “micelas de caseínas”. Otra fracción importante de las proteínas de la leche son las llamadas “proteínas del suero”. Las caseínas de la leche fueron definidas inicialmente como aquellas fosfoproteínas que precipitan de la leche descremada cruda por acidificación a pH 4.6 (pI) a 20 ºC. Se reconocen cuatro familias importantes: caseínas alfa-S1; alfa-S2; beta y kappa. Estas proteínas precipitadas pueden ser redisueltas si se modifica el pH a valores superiores del pI. Las proteínas del suero son las proteínas que permanecen solubles después de la precipitación isoeléctrica de las caseínas. Los principales componentes de esta fracción son beta-lactoglobulina, alfa-lactoalbúmina, albúmina e inmunoglobulinas. Una de las formas de separar o fraccionar las caseínas de las proteínas del suero se basa en la precipitación isoeléctrica de las caseínas a pH 4.6. 10 10 Trabajo Práctico Nº 2 - 2014 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales Ingeniería en Alimentos. Cátedra: Química y Bioquímica de los Alimentos Dr. Ing. Luis A. Brumovsky – Mgter. Bqca. Marta A. Horianski Materiales y métodos Muestra: - Leche descremada de vaca a 20 ºC Materiales: - Vaso de precipitado de 100 ml Probetas de 100 ml Papel filtro Buchner matraz kitasato Pipetas Pesafiltros Espátula Reactivos: - HCl 0.2 M - Agua destilada - NaOH 0.2 Equipos: - Termómetro Medidor de pH Baño termostatizado Balanza Estufa Metodología 1. Colocar 40 ml de leche descremada a 20 ºC en un vaso de precipitado de 100 ml. 2. Agregar 40 ml de agua destilada a 20 ºC. 3. Medir el pH y ajustar a 4.6 con HCl 0.2 M, agitar constantemente. Se puede requerir unos 6 a 7 ml de acido. 4. Continúe mezclando durante 20 minutos. 5. Filtrar la mezcla empleando vacío. 6. a) Transfiera el filtrado (caseínas) y el sobrenadante a pesafiltros tarados. Pesar cada uno de ellos. Llevar los pesafiltros a estufa a 50 ºC durante 18-24 h hasta peso constante. Determinar el peso de las proteínas en cada fracción. b) Transfiera el filtrado (caseínas) en un vaso de precipitado de 100 ml Agregue 40 ml de agua destilada, mezcle y agregue gotas de NaOH 0.2 M hasta que el precipitado se redisuelva. Mida constantemente el pH, no exceda pH 7. Referencias bibliográficas CHEFTEL J. C., CUQ J. L. Y LOIENT D. Proteínas alimentarias. Bioquímica. Propiedades funcionales. Valor nutritivo. Modificaciones químicas. Editorial Acribia. (1989). Zaragoza, España. FENNEMA, O. R., PARKIN, K. L. DAMORAN, S. Fennema química de los alimentos. 3a edición, Editorial CRC Press. Edición en la lengua española editorial Acribia S. A. (2008) España. GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS: Propiedades funcionales. Cátedra de propiedades físicas y químicas de los alimentos ll. Facultad de Ciencias Exactas. UNLP. (2007). PILOSOF A. M. R. Y BARTHOLOMAI G. B. Caracterización funcional y estructural de proteínas. Editorial Eudeba(2000). Bs. As. Argentina. SALFIELD J. R. (1977). 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