Nº2/12. Septiembre 2012
Transcripción
Nº2/12. Septiembre 2012
02/2012 IZASALAB izasa.es REVISTA DEL GRUPO INSTRUMENTACIÓN CIENTÍFICA Sistemas de medición de oxígeno OxySense , líder en la fabricación de sistemas de medición de oxígeno invasivos y no invasivos es la solución más atractiva en pruebas de permeabilidad para empaquetadores y fabricantes de todo el mundo Tecnología MSOT para imagen de animales pequeños como ratas y ratones con iTheraMedical Sistema automático de Patch Clamp de Fluxlon IZASALAB 2/2012 Editorial Hace breves fechas, Izasa firmó un acuerdo de distribución para España y Portugal con OxySense, empresa norteamericana ubicada en Dallas, Tejas. Como afirma en su declaración de misión como empresa: OxySense es el proveedor líder en detección de oxígeno de forma no invasiva, espacio en cabeza y en disoluciones; asimismo en sistemas de seguimiento y permeabilidad de oxígeno. Su objetivo es desarrollar soluciones innovadoras para el desafío del análisis de gases al que se enfrentan las industrias de empaquetado y procesamiento. Su compromiso es mejorar continuamente su tecnología, mientras que a la vez amplía la eficacia de la aplicación de sus sistemas y equipos. Nos es grato presentarles esta firma en esta nueva edición de Izasa Lab en su segundo número del 2012. La soluciones que aporta son prácticas y con un presupuesto de inversión acorde a los tiempos que vivimos. Foto Portada Shiny Stars Esperamos que sea para todos de gran beneficio este acuerdo y le deseamos a OxySense suerte y éxito en su presentación en España y Portugal. Toda la gama de productos OxySense puede encontrarla en nuestra página web www.izasa.es. Redacción: Grupo Instrumentación Científica de IZASA Cumpliendo con ASTM F2714-08 Diseño y maquetación: Dpto. Marketing GIC Contenidos Analizador de oxígeno Medida de oxígeno invasivo y no invasivo, con OxySense Atención al Cliente (DAC) Tfno: 902 20 30 80 Fax: 902 20 30 81 [email protected] Centro de Gestión de Avisos (CGA) Tfno: 902 12 04 89 Fax: 934 01 03 30 [email protected] www.izasa.es Espectrometría Caviar y cigarrillos. Análisis FTIR del Alginato en el papel de fumar 6 Absorción atómica con cámara de grafito. 8 Lanzamiento de sistemas UFMS de Shimadzu Cromatografía Análisis de Carbendazima en zumo de naranja UHPLC-MS/MS 10 12 Análisis de metabolitos en orina de rata en modo Scan/MRM con el nuevo Shimadzu GCMS-TQ8030 14 Cromatografía en Capa Fina instrumental 16 Procesos en biocombustibles Desarrollo de procesos en biocombustibles Microscopía Óptica BIOSTATION IMQ IZASALAB 2/2012 4 Control de calidad de productos farmacéuticos orgánicos especiales Caracterización de partículas Determinación de tamaño de partículas nanométricas y potencial Z 2 3 18 20 21 Sistema de imagen confocal Andor Revolution DSD 22 Nuevo microscopio confocal Nikon C2+ 24 Ciencias de la Vida “Oxygen Radical Absorbance Capacity” con el Synergy™HT ORAC Test antioxidante 26 Sistema automático de Patch Clamp de Fluxlon 30 Tecnología MSOT para imagen de animales pequeños 33 ANALIZADOR DE OXÍGENO Analizadores 5250i y 325i para la medida de oxígeno invasivo y no invasivo, de OxySense OxySense , es líder en la fabricación de sistemas de medición de oxígeno invasivos y no invasivos así como la solución más atractiva en pruebas de permeabilidad para empaquetadores y fabricantes de todo el mundo. O xySense 5250i es un instrumento flexible que cuenta con un software de trabajo avanzado y de fácil utilización que permite al usuario realizar cualquier tipo de medida de oxígeno así como su seguimiento tanto en gas y como en líquido. Dispone de un escáner de código de barras SampleTracker que permite de forma rápida y eficaz tomar las lecturas de diferentes zonas y guardarlas para su estudio posterior. El usuario puede analizar e imprimir sus lecturas, así como, realizar todos los estudios típicos de oxígeno incluyendo el análisis en espacio en cabeza, estudios de vida útil, oxígeno disuelto así como estudios de permeación en películas para embalaje y embases. recipiente antes de su llenado y sellado; por medio de ellos, se determina la concentración de oxígeno potenciando las medidas no invasivas. Características. • Medidas tanto en líquidos como en gases. • Puede trabajar como sistema aislado. • Pantalla táctil de trabajo. • Registro automático de datos en tiempo real. • Pantalla que vuelca datos y gráficos. • Software de escaneo de código de barras Sample Tracker para manejo de múltiples muestras y análisis. • Impresora integrada para impresión de informes con capacidad para gráficos y datos. Beneficios. • Se utiliza en medidas tanto invasivas como no invasivas en aceite, agua y aire. • Permite mediciones múltiples a lo largo del tiempo en el mismo paquete. • Sensores de bajo coste desechables o Prestaciones Intervalo de trabajo OxySense 325i es un instrumento flexible que permite al usuario realizar cualquier tipo de medida de oxígeno así como su seguimiento tanto en gas (espacio en cabeza) como en líquido (oxígeno disuelto). Funcionan con sensores llamados OxyDot que se colocan en el paquete / reutilizables que eliminan el riesgo de contaminación de la muestra o fugas. • No hay bombas ni células electroquímicas que mantener ni reemplazar. • No requiere mantenimiento anual ni necesidad de calibración de fábrica. Aplicaciones. • Análisis de permeabilidad en películas, botellas y paquetes. • Análisis Headspace (aire en cabeza). • Análisis de O2 disuelto. • Estudios de validez. • Pruebas de cierre (sellado). • Detección de fugas. GAS LÍQUIDO 0,03 % - 30 % 15 ppb– O2 Saturación Intervalo de temperatura -10 - 70 ºC -10 - 70 ºC Intervalo de humedad 0 – 100 % 0 – 100 % Tiempo de respuesta 1s 1s Exactitud 5 % de la lectura 5 % de la lectura Dimensiones 29,21 x 33,02 x 17,78 cm 29,21 x 33,02 x 17,78 cm Alimentación 100 V - 240 V (50/60 Hz) 100 V - 240 V (50/60 Hz) IZASALAB 2/2012 3 ESPECTROMETRÍA / FTIR CIENCIAS DE LA VIDA Caviar y cigarrillos. Análisis FTIR del Alginato en el papel de fumar de los cigarrillos Según las estimaciones de la Comisión Europea en su orden de normalización M/425, los cigarrillos que por descuido no se apagan causan unos 14.000 incendios al año en la UE con 7.000 muertes, 2.500 lesiones y alrededor de 50 millones de euros en daños materiales. ¿Cómo puede la espectrometría molecular disminuir el número de estos accidentes?. materiales, como muebles o prendas textiles. Los cigarrillos que se apagan solos pueden reducir el número de accidentes en comparación con los cigarrillos normales. Estos cigarrillos se hacen mediante la adición de dos bandas retardantes especiales al papel del cigarrillo durante la fabricación. Espectrofotómetro FTIR modelo IRAffinity-1. L a esferificación es una de las muchas aplicaciones de la espectrometría molecular que combina texturas y sabores poco convencionales. Se trata del proceso de transformación de un fluido líquido en uno perlado. Para producir estas perlas simplemente se añade alginato , sustancia derivada de las algas, en el fluido. Fig. 3 Estructura del alginato. Estas bandas actúan como reductores de velocidad al disminuir el flujo de oxígeno a través del papel que rodea al tabaco ardiente. Frenan la velocidad a la que la que se quema el cigarrillo cuando el extremo encendido la cruza. Son más propensos a auto-extinción. Estos topes están hechos de una capa de alginato en el papel de cigarrillo, el alginato mismo utilizado para el caviar molecular. Una sencilla aplicación del espectrómetro Las gotas del fluido luego se dejan caer en un baño de agua con calcio. El baño de agua con calcio reacciona inmediatamente con el alginato en el fluido para formar una película alrededor de las gotitas. Se crean de este modo esferas con el mismo aspecto que el caviar (Figura 1). Fig. 4 Estructura de la celulosa. ¿Qué relación tiene este falso caviar con los cigarrillos? Los cigarrillos son una fuente de calor y por lo tanto, representan un peligro de incendio. Pueden encender otros 4 IZASALAB 2/2012 Fig. 1 Esferas con aspecto de caviar. 0.25 0.22 0.21 0.20 0.19 0.18 0.17 0.16 0.15 0.14 0.13 0.12 0.11 0.10 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 -0.01 Abs. Abs. CIENCIAS DE LA VIDA 4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 1/cm Cigarette paper, white DuraSampleIIR Fig. 5 Espectro del papel de fumar blanco medido con ATR. 4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 1/cm Cigarette paper, white plus algenate Na DuraSampleIIR Fig. 6 Espectro del papel de fumar con un capa de alginato. 0.23 0.22 0.21 0.20 0.19 0.18 0.17 0.16 0.15 0.14 0.13 0.12 Abs. FTIR en combinación con el accesorio de reflectancia atenuada de un solo rebote (ATR) muestra las diferencias de los materiales. Los espectros del material solo y el de la capa de papel final se muestran paso a paso. Todos los componentes importantes en el papel tales como celulosa, carbonato sódico y alginato tienen amplias señales en el espectro infrarrojo. Todos tienen en común las características de los polisacáridos de estructura de anillo de 6 eslabones en conjunción con los grupos -COC- y -OH unidos. 0.3525 0.3375 0.3225 0.3075 0.2925 0.2775 0.2625 0.2475 0.2325 0.2175 0.2025 0.1875 0.1725 0.1575 0.1425 0.1275 0.1125 0.0975 0.0825 0.0675 0.0525 0.0375 0.0225 0.0075 -0.0075 -0.0225 0.11 0.10 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 El espectro del papel muestra señales significativas del blanqueador del carbonato de sodio. Estos son una señal fuerte a 700 cm-1, a 900 cm-1 y una señal ancha a 1400 cm-1. Esto se basa en la subestructura del grupo carbonato que genera dos enlaces –CO y -C = en una constelación y también en la distribución de electrones sobre este sistema de unión, lo que resulta en la señal ancha a 1400 cm-1. La vibración simétrico Sy(-COO-) se ve a 1440 -1360 cm-1. El espectro de alginato en el papel 0.04 0.03 0.02 0.01 0 -0.01 4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 1/cm Sodium alginate, Sosa DuraSampleIIR Fig. 7 Espectro IR del alginato sódico. muestra una mezcla de alginato y papel siendo posible diferenciar entre ambos espectros. A pesar de que ambos materiales son de base polisacárida, tienen diferencias en su estructura molecular que son visibles en el espectro infrarrojo. La señal en 1600 cm-1 es el-OH de unión en las moléculas grandes. Al comparar la estructura de los polisacáridos la diferente sustitución en los sistemas de anillos genera la señal adicional en comparación con la celulosa. IZASALAB 2/2012 5 ESPECTROMETRÍA / UV Control de calidad de productos farmacéuticos orgánicos especiales. Identificación por Espectrometría UV La Farmacopea Europea marca la pauta para las condiciones de ajuste de los instrumentos proporcionando un entendimiento común de sus prestaciones. Así, para calibrar y validar un instrumento se realizan hasta nueve controles. L a Farmacopea Europea marca la pauta para las condiciones de ajuste de los instrumentos proporcionando un entendimiento común de sus prestaciones. Así, para calibrar y validar un instrumento se realizan hasta nueve controles. El requisito más importante para los espectrofotómetros UV es su resolución que debe ser de 1 nm. Por tanto, según la Farmacopea, un espectrofotómetro como el Shimadzu UV-1800 es una buena solución. Este espectrofotómetro de doble haz está equipado con una rendija de 1 nm. La prueba de ello, es la resolución del espectro de una mezcla preparada a partir de hexano y tolueno. UV 1800 . 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 265 270 nm Figura 1: Espectro del hexano/tolueno con resolución 1nm. 6 IZASALAB 2/2012 275 El UV-1800 es un sistema recomendado por su estabilidad en línea de base y la exactitud en cada punto de información en todo el rango de medición completo y se puede utilizar para el control de calidad simple de sustancias farmacéuticas de acuerdo con los requisitos de EP, USP y la FDA. También son de gran interés otras aplicaciones que necesitan una resolución mayor. En estos casos, se requiere un instrumento de alto rendimiento, en particular, cuando el análisis se lleva a cabo con una resolución de inferior a 1 nm. Un buen ejemplo es la medida de Gadodiamida en rango UV con un espectrofotómetro Shimadzu UV-2600. El análisis. La Gadodiamida (conocida bajo la marca de OMNISCAN) se usa como un medio de contraste en resonancia magnética (RM). Se utiliza como indicador de la parte neurológica en una exploración. Desde el punto de vista químico, esta sustancia es un complejo tipo quelato con una estructura molecular de grupos cargados negativamente que rodean a un ion metálico; en este caso el ión Gd (gadolinio). Para su identificación, se necesita alta resolución por su perfil espectral en la zona en torno a 247,3 nm y 253,1 nm. Las figuras 2 y 2a muestran el espectro de la misma sustancia con 0,2 nm y 0,5 nm 0.593 Abs 0.400 0.200 0.000 -0.028 240.00 Estructura química de la molécula de Gadodiamida. de resolución. La determinación automática de la posición de la banda sólo puede verificar las señales de interés de absorción en la zona de 260 a 240 nm con una gran resolución. La señal a 247 nm desaparece cuando la medida se realiza con resolución de 1 nm. La detección automática es imposible y la manual se hace difícil. Para este ejemplo, se utilizó un espectrofotómetro UV-2600 y los espectros se midieron en absorbancia. Propiedades de la medida. • Intervalo espectral: 240 a 300 nm. • Velocidad de lectura: Muy Lenta. • Intervalo de muestreo: 0,1 nm. • Modo de barrido: Sencillo • Paso óptico: cubeta estándar de cuarzo de 10 mm. • Instrumento: UV-2600 • Modo de medida: Absorbancia. • Anchura de la rendija: 0,2 nm. • Longitud de onda de cambio de la fuente de luz: 360 nm. 260.00 280.00 nm 300.00 0.593 0.400 0.200 0.000 -0.028 240.00 260.00 280.00 300.00 nm Figura 2 y 2a: Espectros de Gadodiamida en la zona UV con detección de banda automática; los espectro se midieron con 0,2 nm y 0,5 nm de resolución. 0.241 Abs 0.220 0.200 Synonyms Omniscan Molecular weight 576.68036 Molecular formula C16H29GdN5O8 Classifications known drug FDA approved drug bioactive Características de la Gadodiamida. 0.180 0.173 245.06 246.00 247.00 nm 248.00 249.00 249.04 Figura 3: Zoom en la región de interés. La línea verde oscura de 0,5 nm y la roja de 0,2 nm que es mucho mayor y afilada. La línea con color verde claro está con una resolución de 1 nm. IZASALAB 2/2012 7 ESPECTROMETRÍA / AA Absorción atómica con cámara de grafito: ¿Qué tubo se debe emplear? Cuando se trabaja en absorción atómica con cámara de grafito, es importante la elección del tubo en función del elemento a analizar y la composición de la muestra. También se emplea cuando se requiere reducir la sensibilidad de la medida de un elemento en caso de muestras en las que esté en alta concentración. Por ejemplo, en el caso de aluminio, hierro y cobre, aunque se pueden analizar a niveles de ppb usando el tubo pirolítico, la sensibilidad se puede reducir en un factor de 100, a un nivel de 100 ppb, empleando el tubo de alta densidad. La figura 3 muestra un ejemplo de curvas de calibración para medida de Cu, empleando tubos de alta densidad y pirolítico. Los puntos de medida corresponden a 20, 40 y 60 ppb para el tubo de alta densidad, y 2, 4 y 6 ppb en el caso del tubo pirolítico. En ambos casos los valores de absorbancia obtenidos son similares. Figura 1. Espectrómetro de Absorción Atómica AA-7000 con cámara de grafito GFA-7000, de Shimadzu . E n atomización electrotérmica se emplean una gran variedad de tubos de grafito. El espectrómetro de absorción atómica AA-7000 de Shimadzu, en combinación con el atomizador por cámara de grafito de alta sensibilidad GFA-7000, puede emplear los siguientes tipos de tubos: tubo de grafito de alta densidad, tubo de grafito pirolítico, tubo de grafito con plataforma y tubo de grafito con plataforma omega®. El tubo de grafito de alta densidad está hecho de grafito ordinario y es muy empleado. Dado que la estructura cristalina hexagonal del grafito es de naturaleza porosa, la muestra inyectada en el tubo permea dentro de la pared del mismo durante el proceso de calentamiento. Sin embargo, el tubo pirolítico posee una superficie metálica brillante, creada a partir de la formación de una capa pirolítica mediante deposición química de vapor. Dado que la densidad de la superficie es mayor que la del tubo de alta densidad, la 8 IZASALAB 2/2012 permeación de la muestra a través de la pared es menor, mejorando la formación de la nube atómica durante la etapa de atomización. El tubo de plataforma consiste en un tubo de grafito en el que va montada una placa sobre la que se deposita la muestra. En el tubo de Shimadzu, la plataforma está hecha de grafito pirolítico 100 %. La figura 2 muestra una comparación de los perfiles de un tubo pirolítico y otro de alta densidad. El tubo de alta densidad es más adecuado para elementos con bajas temperaturas de atomización. El tubo de alta densidad se emplea para la medida de varios elementos, especialmente aquellos que tienen bajas temperaturas de atomización, tales como cadmio (Cd), plomo (Pb), sodio (Na), potasio (K), zinc (Zn) y magnesio (Mg). Figura 2. Comparación de los perfiles de pico generados en un tubo pirolítico (6 ppb) y en un tubo de alta densidad (60 ppb). Figura 3. Comparación de sensibilidad de diferentes tubos de grafito. El tubo pirolítico produce picos bien definidos para elementos que forman carburos. En general, el tubo con recubrimiento pirolítico es la solución más efectiva para elementos que forman carburos fácilmente al reaccionar con el grafito en un tubo de alta densidad sin recubrimiento. Elementos que muestran este comportamiento son típicamente níquel (Ni), calcio (Ca), titanio (Ti), silicio (Si), vanadio (V) y molibdeno (Mo). En el tubo de alta densidad, la muestra permea con facilidad por la pared del tubo, lo que provoca que exista una gran superficie de contacto entre el elemento y el carbón. En el tubo pirolítico sin embargo, al ser menor el área de contacto, se suprime la formación de carburos, obteniéndose una mayor sensibilidad como resultado. Figura 5. Tubo de plataforma Omega®. Cuando se comparan los perfiles de los picos obtenidos durante la atomización, se observa un pico más puntiagudo en el caso del tubo pirolítico, mientras que el tubo de alta densidad produce un pico más ancho. La figura 2 muestra un ejemplo para cobre. La concentración de ácido afecta a la sensibilidad y reproducibilidad. La variación en la concentración de Figura 4. Efecto de la concentración de ácido nítrico sobre la sensibilidad para Pb en diferentes tipos de tubos. (Pb: 5 ppb, inyección 10 µL). ácido tiene un efecto significativo sobre la sensibilidad y la reproducibilidad del resultado analítico. El efecto de la concentración de ácido nítrico en la sensibilidad para plomo se muestra en la figura 4. En el caso del tubo pirolítico, el resultado analítico se ve fácilmente afectado por la concentración de ácido. El tubo de alta densidad es el que menos cambios de sensibilidad presenta al cambiar la concentración de ácido. En el tubo con plataforma (figura 5), la muestra se inyecta en la plataforma y no entra en contacto directo con al pared del tubo. Durante la atomización electrotérmica, el tubo de grafito se calienta desde las paredes. Por lo tanto, en los tubos de alta densidad como en los pirolíticos, la muestra es calentada y atomizada a medida que la pared del tubo se calienta. Por el contrario, en el tubo con plataforma, la muestra se atomiza después de que la temperatura de todo el tubo, no solo la pared, alcance la temperatura de atomización, de forma que la atomización se produce en condiciones óptimas de distribución de temperatura. Cuando se emplea el tubo con plataforma, el pico de atomización producido es más ancho, aunque el material de la plataforma sea pirolítico (figura 6). 200 ºC superior a la empleada en un tubo pirolítico. La diferencia en el proceso de calentamiento de la muestra en el tubo con plataforma respecto al tubo normal, minimiza los efectos de la matriz en muestras complejas, de forma que se separa claramente la señal de fondo de la señal del elemento, especialmente en combinación con modificadores de matriz tales como paladio, iridio, rodio y otros. Por lo tanto, el uso de tubo con plataforma y modificador de matriz es la solución más efectiva para la determinación de elementos en muestras con matrices complejas, tales como muestras biológicas, aguas residuales o agua de mar. El tubo con plataforma es la elección en caso de muestras con matriz compleja. El tubo con plataforma requiere que la temperatura de calcinación y atomización se establezca en un valor entre 100 ºC y Figura 6. Comparación de los perfiles de pico generados en un tubo pirolítico (6 ppb) y en un tubo con plataforma (60 ppb). IZASALAB 2/2012 9 ESPECTROMETRÍA GCMS/MS- LCMS/MS Lanzamiento de sistemas UFMS de Shimadzu Shimadzu vuelve a marcar un nuevo estándar mundial en Espectrometría gracias a las innovaciones tecnológicas desarrolladas que proporcionan excelente calidad de datos y mayor velocidad de análisis. S himadzu, como líder en desarrollo de tecnologías avanzadas, introduce tres nuevos espectrómetros de masas de triple cuadrupolo: LCMS-8040, LCMS-8080 y el GCMS-TQ8030. Los equipos de LCMS-8040 y LCMS-8080 vienen a expandir el número de equipos de LCMS/MS de Shimadzu, mientras que el GCMS-TQ8030 logra un nuevo hito en la progresión en el campo de los GCMS/ MS. Las nuevas tecnologías desarrolladas en ULTRA-FAST en combinación con la alta velocidad propiedad de Shimadzu (UF), proporcionan una serie de equipamiento claramente desmarcados en el campo de ULTRA FAST MASS SPECTROMETRY (UFMS). resultados asombrosos en sensibilidad y cuantificación. Tecnologías para alcanzar alta sensibilidad. • Gas coaxial para la mejora de la ionización • Hot Source Induced Desolvation (HSID) elimina los contaminantes neutros y asegura la entrada eficiente de iones en el espectrómetro de masas. • Tecnología de flujo laminar para hacer converger gran cantidad de iones en el detector, y así mejorar la transmisión de iones a alta velocidad. Excelente Sensibilidad. • El mejor de su clase en sensibilidad gracias al gas coaxial precalentado y al HSID. • Límites de detección en niveles de La serie UFMS de Shimadzu, no solo proporciona resultados con alta sensibilidad sino una calidad de datos excelente, permitiendo un dramático incremento de la eficiencia analítica así como el aumento del rango de aplicaciones. LCMS-8080. 10 IZASALAB 2/2012 pocos femtogramos. • Gran rango dinámico de trabajo. GCMS-TQ8030. Los químicos necesitan medir substancias químicas de forma rápida y precisa, pero las matrices y la preparación de muestras son un problema. Una solución a esos problemas es el nuevo GCMS-TQ8030. El espectrómetro de masas de triple cuadrupolo GCMS-TQ8030 proporciona gran velocidad de análisis, gran precisión y la facilidad de manejo que los científicos necesitan. Alta sensibilidad y selectividad mejorada. • Las fuentes de ionización de alta eficacia de Shimadzu proporcionan una sensibilidad extrema. • Reducción de ruido por neutros gracias al detector bajo patente de Shimadzu. • Gran variedad de modos de medida, proporcionan gran selectividad y flexibilidad de trabajo al científico. Utiliza la misma interface de usuario LabSolutions que en los sistemas de HPLC/UHPLC y GC/GCMS, que proporciona un uso intuitivo y fácil con un procesamiento de datos mejorado y mejorando la productividad del flujo de trabajo analítico. Diseñado para analíticas de alta sensibilidad. El LCMS-8080 permite unos Espectrómetro de masas de triple cuadrupolo GCMS-TQ8030. Espectrómetro de masas de triple cuadrupolo LCMS-8080. Prestaciones de alta velocidad. • La patente de Shimadzu UFsweeper permite realizar 600 MRM por Las nuevas tecnologías desarrolladas en ULTRAFAST en combinación con la alta velocidad propiedad de Shimadzu (UF), proporcionan una serie de equipamiento claramente desmarcados en el campo de ULTRA FAST MASS SPECTROMETRY (UFMS). segundo. • La patente de Shimadzu ASSP permite realizar barridos de masas de 20.000 uma/s. • El modo de trabajo Fast Scan/ MRM simultáneo permite obtener información cualitativa y cuantitativa en el mismo análisis. de aplicaciones. Facilidad de uso. • Función AART, que permite el ajuste automatice de los tiempos de retención y MRM de forma automática. • Easy sTop permite reducir el tiempo en las labores de mantenimiento. • Acceso frontal y sencillo a la fuente de ionización y gran facilidad de cambio de filamentos y cámara de ionización. Ultra Alta Velocidad. • Permite realizar barridos de masas a una velocidad de 15.000 uma/s. Alta sensibilidad. • Mejora de sensibilidad gracias a la mejora de la óptica de iones y celda de colisión. • Mayor sensibilidad en los modos convencionales de scan. • 555 MRM/s, la mayor velocidad alcanzada. • Cambio de polaridad en 15 ms. Gran Robustez. • Robusto, interface de usuario sencillo y compatible con el LCMS-8030. • Los paquetes de analíticas predefinidos eliminan la necesidad de puesta a punto de métodos tediosas. LCMS-8040. El LCMS-8040 incorpora la nueva óptica de iones y celda de colisión que proporciona una mayor sensibilidad en MRM. Estas mejoras también influyen en la mejora de especificaciones en modo scan, ampliando de ese modo el campo Espectrómetro de masas de triple cuadrupolo LCMS-8040. IZASALAB 2/2012 11 CROMATOGRAFÍA / LCMS/MS Análisis de Carbendazima en zumo de naranja mediante UHPLC-MS/MS Se necesita disponer de metódicas muy sensibles para evitar que los productos contaminados entren en la cadena alimentaria. A la hora de poder introducir bienes de consumo a través de la aduanas, es necesario que los métodos sean rápidos y efectivos, con objeto de no retrasar la entrada de productos perecederos. L os sistemas de LCMS/MS ofrecen la sensibilidad y la robustez necesarias, mientras que los sistemas de UHPLC permiten los análisis rápidos. Shimadzu ha desarrollado un método ultra rápido de UHPLC-MS/MS para el análisis de carbendazima en zumo de naranja, usando el veloz y preciso inyector automático NEXERA SIL-30ACMP en tándem con el espectrómetro de masas de última generación LCMS-8040. Carbendazima. Método. Los análisis se realizaron mediante el Shimadzu NEXERA UHPLC con el automuestreador de alta eficacia SIL-30ACMP. Se usó una columna Phenomenex Kinetex XB-C18 de 2.6 µm de tamaño de partícula, 2.1 mmID x 30 mm de longitud a una temperatura de 40 ºC. El gradiente binario consta de una disolución 5 mM de Acetato de amonio y metanol a un flujo de 0.75 mL/ min. La ionización se realiza en modo electrospray para iones positivos en el nuevo espectrómetro de gran velocidad de barrido, alta sensibilidad de triple cuadrupolo de Shimadzu LCMS-8040. Para probar el método se utilizaron varias firmas comerciales de zumo de naranja, se diluyeron 50 veces y se filtraron antes de la inyección. No se requiere ninguna preparación de muestra adicional. Gracias a la gran velocidad de inyección del NEXERA UHPLC y a la rápida adquisición de datos del LCMS-8040, el tiempo de análisis es tan solo de 0.8 minutos (48 segundos). 12 IZASALAB 2/2012 Fungicides help protect oranges (citrus sinensis) from disease, such as black spot mold. Resultados y discusión. La carbendazima se detectó en numerosos zumos comerciales, aunque todos ellos por debajo de la concentración máxima designada por la regulación de la FDA (10 ng/mL), y los valores máximos permitidos por la unión Europea (200 ng/mL) y la US EPA (80 ng/mL). El límite de detección de la carbendazima en zumos de naranja es de aproximadamente de 0,4 ppb y el límite de cuantificación de aproximadamente de 1 ppb. La preparación de muestra únicamente requiere la dilución y filtración, lo cual permite tener unos tiempos de análisis por muestra muy bajos. La curva de calibración va de 1 ppb hasta 750 ppb. La curva es totalmente linear hasta 500 ppb, mientras que por encima de este valor, se observa una ligera saturación que provoca la pérdida ligera de linealidad. El rango de carbendazima Contact surfaces of needle and needle port where carryover is likely to occur Injection rinse cycle options of the SIL-30ACMP Needle port Port section is rinsed by any of the rinse solutions(1 to 3 solutions) Sample loop Needle Rinse ports Discharge to drain port Drain Multi-rinse mechanism can accommodate up to 4 solutions The Nexera UHPLC combined with the increased sensitivity of the LCMS-8040 are perfect for higher throughput, higher sensitivity quantitation Se detectó que el contenido en carbendazima se mantuvo constante, incluso meses después de su fecha de caducidad en condiciones de almacenamiento refrigerado. Esto viene a demostrar la capacidad de la carbendazima para persistir en los alimentos, y subraya la necesidad Chromatogram of orange juice spiked with 1 ppb carbendazim and calibration curve. de realizar analíticas para vigilar la seguridad alimentaria. detectado en las muestras oscila entre 1 ppb y 8,1 ppb, mientras que en las muestras certificadas como orgánicas no se ha encontrado. El sistema NEXERA UHPLC permite la realización de gradientes rápidos con tiempos de análisis por debajo de 1 minuto, mientras que autosampler SIL30ACMP permite ciclos de inyección de tan solo 7 segundos. La óptica de iones mejorada del LCMS-8040 hace posible conseguir mejores límites de detección con preparaciones de muestra muy simples. No solo los análisis son muy rápidos, sino que los tiempos de retención y las áreas de picos son extremadamente reproducibles, con desviaciones estándar del 0.55 % y 2.98 % respectivamente. Se detectó que el contenido en carbendazima se mantuvo constante, incluso meses después de su fecha de caducidad en condiciones de almacenamiento refrigerado. Esto viene a demostrar la capacidad de la carbendazima para persistir en los alimentos, y subraya la necesidad de realizar analíticas para vigilar la seguridad alimentaria. Conclusión. La carbendazima se detectó en 4 firmas comerciales de zumo de naranja en el rango de pocas ppb, inferiores a los límites estrictos marcados por la FDA. Levels of carbendazim measured in dierent orange juice brands and an orange juice. Representative chromatograms of two brands of orange juice. The MM brand contained. The retention times and peak areas were very reproducible even without using. La curva de calibración es lineal hasta 500 ppb, y el método es suficientemente sensible para detectar carbendazima por debajo de los límites legales más restrictivos. No existe efecto memoria en el método y el análisis se realiza en menos de 1 minuto, gracias a la rápida inyección en ciclos de 7 segundos. La preparación de muestra solo requiere dilución y filtrado de la muestra. IZASALAB 2/2012 13 CROMATOGRAFÍA / GCMS Análisis de metabolitos en orina de rata en modo Scan/MRM con el nuevo SHIMADZU GCMS-TQ8030 El nuevo espectrómetro de masas de triple cuadrupolo de Shimadzu GCMS-TQ8030, está equipado con las función Scan/MRM para poder realizar medidas simultaneas de Scan y MRM. La ventaja de poder realizar análisis en Scan/MRM radica en la información adicional proporcionada, ya que permite observar los analitos que coeluyen con el analito diana. S i se dispone de un método en Scan es muy sencillo incorporar las correspondientes transiciones para mejorar los límites de detección del método analítico. De esta manera, los analitos diana se pueden cuantificar perfectamente y los compuestos desconocidos se pueden estudiar comparando sus espectros con las bibliotecas de espectros comerciales o propias. Esta nota de aplicación muestra los resultados de las medidas de metabolitos extraídos de orina de rata, utilizando el modo Scan/MRM con 5 transiciones añadidas al método Scan desde la base de datos de Metabolitos por GCMS. La muestra de orina se trató según descrito por I.Matsumoto (Mass Spectrom. Rev 1996), y posteriormente se procedió a la derivatización con TMS. Condiciones Analíticas. Se utilizó el modo de trabajo Scan/MRM. Las condiciones analíticas se encuentran en la tabla 1. Se añadieron 5 transiciones de la base de datos de Metabolitos por GCMS, para monitorizar los analitos diana. IZASALAB 2/2012 :GCMS -TQ8030 Column :DB-5 (Length 30 m, 0,25 mm I.D., df=1.0 µm {MS} {GC} Injection Temp :280 ºC Interface Temp. :280 ºC Colum Oven Temp :100 ºC (4 min) ►(4 ºC / min) ► 320 ºC (0 min) Ion Source Temp. :200ºC Injection Mode :Splitless Tuning Mode :Standard Sampling Time :1 min Flow Control Mode :Linear velocity (39,0 cm / sec) Acquisition Mode :Scan/MRM Injection Volume :1µl Scan Mass Range :m/z 45 600 Scan Event Time :0.2 sec Scan Speed :3.333 u/sec MRM monitoring m/z Quantitative transition Qualitative transition Compound name RT (min) Precursor >Product CE (V) Precursor >Product Lactic acid-2TMS 7.51 219 > 149 8 219 > 191 CE (V) 5 Glycerol-3TMS 14.711 218 > 159 6 213 > 113 14 Glutaric acid-2TMS 18.827 158 > 116 8 158 > 101 15 Adipic acid-2TMS 22.078 275 > 141 8 275 > 111 10 Suberic acid-2TMS 27.76 303 > 109 12 303 > 191 4 Tabla 1. Condiciones analíticas. Resultados. Los metabolitos en orina de rata se midieron en modo Scan/MRM, y el cromatograma total de iones es el que aparece en la figura 1. En las figuras 2 y 3 se muestran Fig 1. Cromatograma total de iones de metabolitos en orina de rata medidos en modo SCAN/MRM. 14 GC-MS los cromatogramas de los analitos diana en modo Scan y en modo MRM. biblioteca de espectros de los analitos extraídos del modo Scan del método. En las figuras 4 y 5 se muestran también las búsquedas en Cromatograma total de iones de metabolitos en orina de rata Negro: Cromatograma total de iones, Rojo: MRM Transition 158> 116, Verde: MRM Transition 158> 101, Morado: MRM Transition 275> 141, Azul: MRM Transition 275>111. Fig 2. Scan Mass Chromatogram Comparison of Metabolites in Rat Urine. Fig 3. MRM Mass Chromatogram Comparison of Metabolites in Rat Urine. Fig 4. Scan Mass Chromatogram and Mass Spectra for Uracil-2TMS(*1) (Upper: Measurement spectrum. Lower: Library spectrum) Fig 5. Scan Mass Chromatogram and Mass Spectra for Malic Acid-3TMS(*2) (Upper: Measurement spectrum. Lower: Library spectrum) IZASALAB 2/2012 15 CROMATOGRAFÍA / TLC ¿Qué es la Cromatografía en Capa Fina instrumental y qué ventajas tiene? La Cromatografía en Capa Fina instrumental es una técnica moderna de separación que destaca por su gran flexibilidad, capacidad de análisis, sencillez y economía. L a cromatografía plana, o cromatografía en capa fina, al contrario que la cromatografía en columna (GC, HPLC) utiliza una fase estacionaria plana para la separación. Esta fase estacionaria se soporta en una placa de vidrio o en una hoja de aluminio o plástico. La placa TLC constituye un sistema abierto que va pasando por los diferentes pasos individuales del análisis en un modo off-line. La independencia relativa entre aplicación de muestra, desarrollo del cromatograma, detección, etc, en tiempo y localización, hace posible el análisis en paralelo de muchas muestras en la misma placa. La posibilidad de ajustar y combinar numerosos parámetros para optimizar la separación proporcionan una flexibilidad que no es superada por ninguna otra técnica cromatográfica. Cámara de desarrollo automático ADC2 de Camag. se encuentra presente en muchos laboratorios como una herramienta conveniente para separaciones simples y rápidas. Si las expectativas en cuanto a calidad y valor de los análisis son mayores, hay disponibles instrumentos adecuados para cada uno de los pasos necesarios en el proceso. metodología altamente estandarizada, así como el uso de métodos validados Cubetas de desarrollo horizontal para análisis para placas HPTLC. cualitativo y cuantitativo. El uso de instrumentos sofisticados, controlados desde una plataforma integrada de software, asegura la consecución de un alto grado de fiabilidad y reproducibilidad de los datos generados. HPTLC es por lo tanto, el nombre de una técnica que cumple con todos los requisitos de calidad de cualquier laboratorio analítico, incluso de aquellos que trabajan en un entorno totalmente regulado. El coste inicial de un sistema HPTLC, así como su mantenimiento y coste por muestra, son comparativamente bajos. La cromatografía en capa fina instrumental alcanza un alto nivel de rendimiento, manteniendo los parámetros de un método constantes y minimizando los efectos del entorno en el proceso abierto de separación. Aplicador de muestra semi-automático Camag Linomat 5. La cromatografía en capa fina se puede llevar a cabo manualmente, de una forma sencilla y económica. Por este motivo, 16 IZASALAB 2/2012 La forma más avanzada de cromatografía en capa fina se denomina comúnmente cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HPTLC), pero el término no se refiere solo a TLC instrumental empleando placas HPTLC. Se trata de un concepto completo que incluye el uso de Densitómetro TLC Scanner de Camag. Aplicaciones farmacéuticas Plantas medicinales • • • • • • • • Control de Calidad. Test de uniformidad de contenido (CUT). Control de identidad y pureza. Test de estabilidad, etc. Identificación. Test de estabilidad. Detección de adulteraciones. Ensayo de marcadores, etc. Interfaz TLC-MS, permite la extracción de una banda para su análisis en un espectrómetro de masas. La posibilidad de evaluación visual de las muestras separadas en la placa es uno de los aspectos más valiosos de la cromatografía en capa fina. Esto alcanza una dimensión totalmente nueva mediante el uso de técnicas modernas para la generación y evaluación de imágenes digitales. Aplicaciones clínicas Forense • • • • • Detección de documentos falsificados. • Venenos. • Colorantes, etc. Lípidos. Estudios de metabolismo. Screening de medicamentos. Control de dopaje, etc. Chromatogram under white light Cosméticos Alimentos y piensos • Identificación de materias primas. • Conservantes, pigmentos. • Screening de sustancias ilegales, etc. • • • • Medio ambiente Aplicaciones industriales Control de calidad. Aditivos (p. e. Vitaminas). Pesticidas. Test de estabilidad (caducidad), etc. Chromatogram under UV 254 nm Chromatogram under UV 366 nm Diferentes posibilidades para visualización de placas: luz blanca, luz UV 254 nm y luz UV 366 nm. • Aguas. • Suelos. • Análisis de residuos, etc. • Desarrollo y optimización de procesos. • Monitorización de procesos. • Validación de limpieza, etc. IZASALAB 2/2012 17 PROCESOS EN BIOCOMBUSTIBLES La rapidez en el análisis es la clave en el desarrollo de procesos en biocombustibles Las ventajas de la biomasa basadas en tecnologías de etanol se han visto desde hace tiempo como posible alternativa de combustible a partir de existencias hidrocarburos procedentes de alimentos. D e particular interés en el argumento de alimentos frente a combustibles ha sido la utilización de existencias no alimenticias a base de piensos (biomasa) como una fuente alternativa para la producción de combustibles, tales como etanol (butanol) a través del pretratamiento, hidrólisis enzimática y, finalmente, la fermentación de azucares necesarios (glucosa, xilosa) en una gama de combustibles viables. Si bien la atracción de esta tecnología es muy clara, la consecución de los mismos en los procesos económicamente viables es una perspectiva muy diferente que requiere un arduo esfuerzo y años de investigación y desarrollo. Hay variables extensivas involucradas, incluyendo: fuente de materia prima/ disponibilidad (por ejemplo, el rastrojo de maíz, mijo, remolacha azucarera/caña de azúcar, sorgo, yuca y muchos más), el tratamiento previo y los procesos de hidrólisis enzimática y, finalmente, las condiciones de fermentación y el proceso. Todas las variables tienen que ser determinadas, optimizadas y, finalmente, monitorizadas y controladas durante la final de la fermentación de biocombustibles. Por supuesto la clave de esta optimización es la capacidad de analizar con precisión los componentes clave, tales como los azúcares fermentables y el etanol producido. Aunque están disponibles una variedad de técnicas analíticas, el uso de la tecnología de electrodo de enzima inmovilizada ofrece ventajas claras, particularmente con la velocidad inherente de obtención de resultados en menos de un minuto, a la vez que mantenemos la precisión. Facilidad de uso para el operador, formación y el costo favorecen esta tecnología en comparación con otras tecnologías tradicionales, como HPLC. La tecnología del biosensor de YSI, utilizando electrodos de enzima inmovilizada, es la clave para la medición rápida y precisa, indicando: • Resultados específicos para el analito de interés. • Resultados rápidos de 60 segundos, resultados que se pueden utilizar para ajustar el proceso. • Bajos costes operativos, las enzimas se utilizan una y otra vez. Una enzima específica para el sustrato de interés está inmovilizada entre dos capas de membrana, policarbonato y acetato de celulosa. El sustrato se oxida al entrar en la capa de enzima, produciendo peróxido de hidrógeno, que pasa a través de acetato de celulosa a un electrodo de platino, donde se oxida el peróxido de hidrógeno. La corriente resultante es proporcional a la concentración del sustrato. Las membranas YSI contienen tres capas. La primera capa, de policarbonato poroso, limita la difusión del substrato en la segunda capa enzimática, impidiendo la reacción de cada enzima-limitado. La tercera capa, de acetato de celulosa, sólo permite pequeñas moléculas, tales como peróxido de hidrógeno, para alcanzar el electrodo, lo que elimina muchos compuestos electroquímicamente activos que podrían interferir con la medición. Desarrollo del analizador bioquímico YSI 2900. La aplicación de fermentación de rastrojo de maíz es un ejemplo de la amplia zona de aplicación de la tecnología de electrodo enzimático donde, junto con la precisión demostrada (comparables con HPLC), el cambio rápido en los resultados, la necesidad para los operadores menos calificados y la química específica de las enzimas, ofrece la posibilidad de un ahorro importante en el desarrollo de los biocombustibles/proceso de producción. El desarrollo del nuevo analizador bioquímico YSI 2900 ha supuesto la introducción de un instrumento moderno del siglo 21 especialmente aplicable a las mediciones realizadas en la industria de los biocombustibles, ahora y en el futuro. En el 2900 se ha incorporado una larga lista de innovaciones técnicas y beneficios: • Se ha desarrollado para ser resistente al taponamiento, debido al diseño de la cámara única y de corto recorrido, a ancho Analyte Oxygen Hydrogen Platinum Immobilized Cellulose Polycarbonate ¿Cómo se produce el etanol?. 18 IZASALAB 2/2012 Ejemplo de cómo se produce la reacción en YSI. Estudio Xilosa-Glucosa Un ejemplo más específico sería la aplicación de esta tecnología para la medición rápida de xilosa y la monitorización de glucosa en la fermentación del rastrojo de maíz. En este caso, la glucosa y la xilosa se midieron periódicamente, usando un analizador bioquímico YSI 2700, en muestras de fermentación de rastrojo de maíz filtrado en un período de 48 horas durante de producción de bioetanol a escala de laboratorio*. Algunas muestras requieren dilución. Los resultados fueron comparados con HPLC con las mismas muestras (ver resultados más adelante). La ventaja de una simple, rápida y precisa medida de glucosa y xilosa es proporcionar datos cercanos en tiempo real para estos dos parámetros clave. La información relacionada con el progreso de la fermentación del azúcar puede ayudar a los investigadores a mejorar el rendimiento de etanol. Siete muestras fermentadas durante 48 horas de rastrojo de maíz ácido-hidrolizado se recogieron y filtraron. Las muestras se recogieron en 0, 4, 8, 12, 24, 32 y 48 horas para controlar el consumo de glucosa y xilosa (azúcares principales del ácido hidrolizado). Se midieron cada una de las muestras recogidas mediante HPLC configurado para cada perfil de azúcar, y por el YSI 2700 configurado para medida simultanea de xilosa y glucosa. La glucosa se agota el plazo de 10 horas, mientras que el agotamiento de xilosa no se llegó a completar. Las concentraciones de ambos azúcares se mantuvieron relativamente estables en las 24 horas del inicio de la fermentación. Tabla 1 Datos sobre 072707 de NREL Los resultados se muestran en la tabla1. Las muestras T-0 y T-4 se diluyeron diez veces y dos veces, respectivamente, para llevar las señales dentro de los rangos reportables para xilosa. Los resultados de las muestras diluidas se calcularon de nuevo. De los datos de HPLC, las muestras se sabe que contienen varios azúcares que son interferencias potenciales de la membrana piranosa oxidasa. Estos son arabinosa, manosa, galactosa y celobiosa. No se encontró ninguno que tuviera un efecto significativo sobre la lectura xilosa. En la matriz estudiada de rastrojo de maíz, la glucosa y xilosa son con mucho los azúcares dominantes de sacarificación y los valores de YSI obtenidos son muy cercanos a los del HPLC. YSI vs HPLC – Agotamiento sobre 48 horas de aspiración, y para comodidad del operador del 2900 tiene un muestreador automático integrado y la capacidad de tomar de 1 a 96 muestras. de laboratorio. La manipulación de datos mejorada permite varios métodos para comunicar sus resultados en tiempo real y lograr un control más estricto del proceso. • La pantalla táctil de gran tamaño cuenta con 8 idiomas y los videos de formación incluidos ayudarán al nuevo personal de laboratorio. En un laboratorio de fermentación, con alta rotación de personal esto puede ser un problema, por lo que los videos de formación minimizarán este impacto y garantizarán que la técnica de análisis consistente se puede mantener a través de una serie de laboratorios, preservando así la comparabilidad de los datos y reducirá al mínimo la variación El YSI 2900 tiene un diseño modular, lo que permite la expansión futura de la química y características adicionales para ofrecer a los usuarios finales. Las químicas incluyen: glucosa, lactato, glutamina, glutamato, xilosa, etanol, metanol, sacarosa, galactosa, lactosa, colina, el peróxido de hidrógeno, amonio**, potasio** y glicerol**. Hasta dos químicas compatibles en la actualidad se pueden medir simultáneamente, con un máximo de seis que estarán disponibles en breve. Las pruebas de glicerol y la capacidad El YSI 2700 configurado para xilosa y glucosa proporcionan resultados con relativa facilidad de uso, velocidad y precisión en comparación con HPLC. Dado que el YSI también se conoce para tolerar muestras de un amplio rango de pH y muestran poco o ningún efecto a color y turbidez, se proporciona un método complementario excelente a HPLC al supervisar fermentaciones utilizando biomasa lignocelulósica. En conclusión, el biosensor YSI se puede utilizar para controlar la glucosa y xilosa para obtener información valiosa relevante para la eficiencia que maximiza la producción de etanol. La tecnología de YSI permite a los usuarios recopilar más datos durante las periodos críticos para ayudar a comprender mejor las condiciones del proceso, y en algunos casos podría permitir a los usuarios ajustar las condiciones del proceso durante la fermentación. La tecnología es aplicable a usos de escala de banco, a escala piloto y a escala de producción. de monitoreo on-line/control se encuentran actualmente en desarrollo y los investigadores de YSI también están estudiando las estadísticas mejoradas, y un modo de predecir de forma más rápida. Investigadores de YSI, con sede en los EE.UU., se esfuerzan por mejorar continuamente la tecnología utilizada en la producción de biocombustibles, incluyendo el combustible hecho a partir de algas y otros bichos (sujeto a la publicación de otra forma). *YSI agradece la contribución de Nancy Dowe y su equipo en el National Renewable Energy Laboratory, US DOE, Golden, CO. **Disponible en breve (amonio y potasio disponible actualmente en el YSI 7100). IZASALAB 2/2012 19 CARACTERIZACIÓN DE PARTÍCULAS Determinación de tamaño de partículas nanométricas y potencial Z Con más de 30 años de experiencia en instrumentos de dispersión láser, Brookhaven Instruments lanza nuevos equipos compactos para determinación de tamaño de partícula y potencial Z. P roductos tan diversos como cosméticos, pinturas, tintas, fármacos o látex, todos ellos dependen de la dispersión de partículas en una fase líquida. Para producir de forma precisa estas dispersiones coloidales y asegurar que se comportan de acuerdo a la especificación, es necesario controlar el tamaño de partícula durante el proceso de fabricación como parte del control de calidad. El nuevo software Particle Solutions incorpora muchas novedades, como los gráficos en 3D. Una técnica que permite la medida rápida y exacta del tamaño de partícula es la dispersión de luz dinámica (Dinamic Light Scattering—DLS). Brookhaven Instruments Corporation fue una de las primeras compañías que desarrolló instrumentos para la determinación de tamaño empleando esta técnica. En la actualidad, el analizador de tamaño de partícula 90Plus es uno de los más populares. El 90Plus realiza la medida rápida de tamaño de partícula en el rango nanométrico en una amplia variedad de muestras y concentraciones. Es un instrumento ideal para la medida de coloides, látex, micelas, micro emulsiones, proteínas y otras nanopartículas. La mayoría de las medidas se realizan en uno o dos minutos. El 90Plus, a pesar de su sencillez de manejo, proporciona herramientas potentes para extraer la mayor cantidad posible de información de la muestra. El algoritmo de filtro de suciedad, por ejemplo, puede eliminar el efecto de la presencia de contaminación en la muestra, en forma de partículas grandes, que de otra forma pueden arruinar la medida por dispersión de luz dinámica. Entre las características más importantes se puede destacar el potente láser de estado sólido de 35 mW, y la posibilidad de medida a 2 ángulos: medida normal a 90 º y medida con alta sensibilidad a la presencia de pocas partículas de gran tamaño, a 15 º. Interfaz del nuevo software Particle Solutions. Además de tamaño de partícula, el instrumento tiene capacidad de medida de potencial Z, importante parámetro para determinar la estabilidad de suspensiones y emulsiones en función de la carga superficial de las partículas y la composición del medio. La medida puede realizarse en dos modos: medida estándar ELS (Electrophoretic Light Scattering), para muestras acuosas, y medida PALS (Phase Analysis Light Scattering), que presenta una sensibilidad 1000 veces mayor, y permite medir movilidades electroforéticas muy pequeñas, como las que se pueden observar en disolventes orgánicos, en muestras con alta concentración salina, en líquidos de alta viscosidad, o cerca del punto isoeléctrico. La medida de potencial Z se realiza en una cubeta estándar de plástico de 1 cm, muy económica, no siendo necesario el uso de celdas especiales, normalmente de precio muy superior. El manejo es a través del nuevo software Particle Solutions, que integra las medidas de tamaño de partícula por DLS y de potencial Z. Posee una base de datos con potentes herramientas de filtrado y búsqueda, y permite la exportación sencilla y rápida de resultados a hoja de cálculo o pdf. Bancada óptica de tamaño compacto del nuevo 90Plus. 20 IZASALAB 2/2012 El instrumento es configurable para la medida de tamaño de partícula, potencial Z (ELS o PALS), o ambas. MICROSCOPÍA ÓPTICA BIOSTATION IMQ: combinación de microscopio, incubador y cámara digital de alta sensibilidad en un solo sistema La solución perfecta para time-lapse largos, con imágenes de células vivas. La BioStation IM-Q elimina la necesidad de un cuarto oscuro para imágenes en fluorescencia, lo que significa que se puede instalar en cualquier lugar. L a BioStation IM-Q incorpora un microscopio, un incubador y una cámara CCD refrigerada de alta sensibilidad en un diseño compacto. Este conjunto proporciona unas condiciones de estabilidad del medio para trabajar con células vivas y soluciones avanzadas para la adquisición de datos en timelapse largos. Imágenes de fluorescencia de excepcional alta sensibilidad La alta sensibilidad de la cámara CCD incorporada, equivalente a ISO800, reduce el tiempo de exposición, que minimiza el fotoblanqueo y daños a los especímenes, mientras que aumenta el rendimiento de adquisición multipunto. La BioStation IM-Q contiene cuatro sensores para un control preciso de un entorno de 37 ºC. Además mantiene un nivel de humedad de 95 % o más alto y el mezclador de gases de CO2 proporciona un suministro estable en una concentración de 5 %. Garantiza con exactitud las condiciones del experimento. La deriva de enfoque en observaciones de time-lapse de larga duración se ha reducido considerablemente, lo que permite la toma, con seguridad, de imágenes en time-lapse largos, incluso de varios días. La BioStation IM-Q mueve la lente del objetivo en lugar de la platina. por esto elimina la deriva de enfoque causada por la vibración de la placa de cultivo, reduciendo el estrés celular. Manejo fácil y sencilo. La BioStation IM-Q se controla totalmente desde un PC. El usuario sólo tiene que colocar la placa de en su posición y programar la toma de imágenes. Todo, desde el manejo de la célula hasta las imágenes de time-lapse se realiza de forma automática ordenada. IZASALAB 2/2012 21 MICROSCOPÍA ÓPTICA Sistema de imagen confocal Andor Revolution DSD El sistema Andor Revolution DSD (Differential Spinning Disk), un innovador equipo confocal spinning disk basado en iluminación estructurada, consigue un alto grado de seccionado óptico de las muestras mediante la combinación de un diseño óptico novedoso y un método de procesamiento de imágenes de alta velocidad. R evolution DSD ofrece imágenes de alto contraste y bajo ruido de fondo con objetivos desde 10x a 100x, tanto secos como de inmersión en agua o aceite. Ello hace al DSD una alternativa perfecta al microscopio láser confocal para un amplio rango de muestras tanto de tejidos como de células vivas o fijadas. Unidad DSD de Andor. El equipo utiliza una fuente de iluminación de haluro metálico de 200 W de potencia. Al no utilizar un sistema de láseres, el sistema DSD permite la obtención de imágenes confocales con un coste bajo. Es un dispositivo modular que puede acoplarse a cualquier microscopio de investigación ya existente en el laboratorio. De este modo, 22 IZASALAB 2/2012 cualquier laboratorio podrá obtener imágenes confocales de forma rutinaria con bajos costes de mantenimiento. Revolution DSD utiliza un disco “Spinning Disk” de características únicas. Ambas caras del disco poseen un patrón de iluminación estructurada (SIP) con un ratio metal/espacio vacío de 1:1 lo que permite que aproximadamente la mitad de la luz que incide sobre el mismo sea reflejada mientras que la otra mitad sea transmitida. Esto permite separar la luz de emisión (en foco y fuera de foco) de la muestra en dos partes: una imagen de fluorescencia en foco (transmitida T) y una de fluorescencia fuera de foco (reflejada R). La diferenciación de ambas imágenes preprocesadas (T menos R) permite crear la imagen confocal. Este proceso es el que define el nombre del equipo: Differential Spinning Disk. El disco “Spinning Disk” se fabrica con dos patrones de iluminación diferentes, dispuestos de forma radial. El patrón interior posee un periodo de 320 micras mientras el exterior lo posee de 160 micras. El primero de los dos patrones se denomina patrón de alta señal (High Signal SIP) y el segundo patrón de alto seccionamiento (High Sectioning SIP). Estos dos patrones permiten al usuario adaptar el seccionamiento del DSD y el ratio señal/ruido al grosor de la muestra y al objetivo a usar. Andor ha diseñado el Revolution DSD con la mejor cámara interline de su clase, el modelo Clara. Todos los componentes del sistema se encuentran perfectamente integrados para la realización de experimentos 5D y 6D, pudiéndose integrar con cualquier microscopio de investigación de las marcas principales, tanto de tipo directo como invertido. El equipo utiliza una fuente de iluminación de haluro metálico de 200 W de potencia. Al no utilizar un sistema de láseres, el sistema DSD permite la obtención de imágenes confocales con un coste bajo. Características Beneficios para los usuarios del equipo • Control en tiempo real. Permite el intercambio entre los modos de fluorescencia y confocal y entre las diferentes longitudes de onda con un solo clic de ratón. • Excitación en todo el espectro (equipo sin La excitación se realiza mediante una lámpara de haluro metálico de láseres). elevada intensidad (200 W). No necesita láseres. • Excelente confocalidad. El equipo obtiene secciones ópticas limpias, incluso a bajo aumento. • Elevada relación calidad/precio. Diseñado para altos niveles de rendimiento con un muy fácil alineamiento y bajos costes de mantenimiento. • Adaptado a muestras vivas o fijadas. Permite trabajar de 10x a 100x tanto en muestras vivas como fijadas. • Para inmuno y proteínas fluorescentes. La selección de filtros del equipo permite el uso de sondas en el UV, visible e IR cercano. • Integración con cualquier microscopio. El DSD se conecta a una montura C en cualquier microscopio de investigación, directo o invertido. • Cámara Andor Clara. Con el mejor rendimiento, rango dinámico y rango espectral de su clase. • Eliminación activa del fondo. El diseño óptico patentado combina la luz de emisión en foco y la luz de emisión fuera de foco para eliminar el fondo y obtener un elevado contraste. IZASALAB 2/2012 23 MICROSCOPÍA ÓPTICA Nuevo microscopio confocal Nikon C2+: Un equipo esencial para el laboratorio de microscopía El sistema de microscopía confocal Nikon C2+, en sus dos versiones C2+ y C2si+ (este último con capacidad espectral) se configura como un equipo esencial para cualquier laboratorio de microscopía. S u increíble estabilidad junto a su conjunto de tecnologías ópticas, facilidad de uso y alta velocidad de adquisición de hasta 100 fps, convierten al equipo confocal C2+ en la herramienta perfecta para un nuevo microscopio o como el accesorio ideal para un sistema de imagen Nikon. Ultra compacto y ligero, une a su gran calidad de imagen la utilización del software Nikon NIS-Elements. Este software, compartido con el microscopio confocal de alto nivel Nikon A1R+, le proporciona al C2+ una gran flexibilidad permitiéndole la realización de gran cantidad de experimentos (confocal, TIRF, fotoactivación, etc.) así como el procesamiento, análisis y presentación de gran cantidad de datos. Calidad de imagen La utilización en el C2+ de espejos de alta precisión y pinholes circulares, ópticamente ideales para microscopía 24 IZASALAB 2/2012 confocal, junto con la afamada óptica Nikon CFI60, posibilitan la obtención imágenes libres de ruido, con un brillo, contraste y resolución excelentes con las mayores distancias de trabajo. Con el C2+ pueden obtenerse fácilmente imágenes de hasta 2.048 x 2.048 píxeles con una profundidad de color de 12 bits. Adicionalmente, el nuevo sistema de control del escáner y la técnica única de corrección de imagen de Nikon permiten la obtención de una velocidad de escaneo 8 fps a 512 x 512 píxeles y de 100 fps a 512 x 32 píxeles. • Alta definición en imágenes diascópicas DIC. El C2+ permite la obtención simultánea de 3 canales de fluorescencia más un canal de luz diascópica. Las imágenes diascópicas DIC de alta calidad y las de fluorescencia pueden ser sobreimpuestas para la localización de las sondas fluorescentes. Microscopio confocal espectral Nikon C2si+ El sistema confocal espectral C2si+ permite la adquisición simultánea del espectro de fluorescencia de la muestra en un amplio intervalo de longitudes de onda (desde 400 a 750 nm) con diferentes resoluciones espectrales (10 / 5 / 2.5 nm) mediante la utilización de un sistema de detección con 32 canales fotomultiplicadores. Esta flexibilidad permite la separación de diferentes fluorocromos con picos de emisión separados únicamente por unos pocos nanómetros. • Alta velocidad de barrido espectral de un intervalo completo de longitudes de onda. El Nikon C2si+ permite la adquisición del espectro completo de la fluorescencia de cada uno de los fluorocromos existentes en la muestra, en un intervalo de 320 nm, con un único barrido de láser mediante un sistema de detección con 32 canales fotomultiplicadores, todo ello en menos de 2 segundos a una resolución de 512 x 512 píxeles. • Muy alta eficiencia en la detección de la emisión fluorescente de la muestra. La tecnología exclusiva Nikon DEES (Diffraction Efficiency Enhancement System) consigue incrementos en la eficiencia fotónica del microscopio confocal por encima del 40 % con relación a otros sistemas utilizando para ello un prisma de rotación de planos de polarización de la luz de emisión de la muestra. El sistema DEES redunda asimismo en una mejor velocidad de barrido espectral al no ser necesario acumular más fotones en los fotomultiplicadores del equipo. La utilización en el C2+ de espejos de alta precisión y pinholes circulares, ópticamente ideales para microscopía confocal, junto con la afamada óptica Nikon CFI60, posibilitan la obtención imágenes libres de ruido, con un brillo, contraste y resolución excelentes con las mayores distancias de trabajo. Flexibilidad y elevada funcionalidad Macro confocal AZC2+ / AZ-C2si+ La utilización del software NIS-Elements junto al C2+ permite la utilización de un único software para controlar una gran cantidad de dispositivos: cámaras, sistemas TIRF motorizados, módulos de fotoactivación, etc. El sistema confocal macro AZ-C2+ /AZC2si+ (con capacidad espectral) permite el escaneo de especímenes enteros, tales como embriones en un solo barrido. Mediante la combinación de objetivos de alta y baja magnificación y el sistema de zoom del microscopio AZ100, el equipo AZ-C2+ permite la toma de imágenes desde el nivel macro al nivel micro de una muestra. Posibilita adicionalmente la toma de imágenes “profundas” en especímenes in vivo. • Sistema de imagen multimodal TIRF/ Fotoactivación-C2+. Un módulo TIRF láser motorizado y un módulo para fotoactivación pueden ser integrados junto a un C2+ para poder visualizar tanto moléculas únicas con una elevada relación señal/ruido como las características de fluorescencia de las proteínas fluorescentes fotoconvertibles y fotoactivables. • Función Mosaico de imágenes. El software permite la toma de imágenes en modo confocal de gran tamaño y a gran resolución mediante la función “Large Images”. IZASALAB 2/2012 25 CIENCIAS DE DELA LAVIDA VIDA / OXYGEN RADICAL ABSORBANCE CAPACITY Desarrollando el ensayo “Oxygen Radical Absorbance Capacity” con el Synergy™HT. ORAC Test antioxidante Las capacidades antioxidantes de alimentos, cosméticos, suplementos y agentes farmacéuticos han ganado un especial interés en distintas industrias. Esto es resultado de la evidencia de existencia de una relación entre especies reactivas al oxigeno/ nitrógeno (ROS) con el envejecimiento y patogénesis. (1,2). Introducción Los organismos vivos usan un combustible (ATP) o “moneda energética” de cuya producción resultan compuestos tóxicos, y requiere que un balance sea mantenido entre los oxidantes y los antioxidantes. ROS (reactive oxygen species) son generalmente mantenidos bajo control por una combinación de enzimas antioxidantes, proteínas y antioxidantes proporcionados por la dieta. Un problema grave en la capacidad antioxidante de nuestro metabolismo esta asociada con toda una serie de enfermedades crónicas. Posiblemente, la ingestión de alimentos o suplementos que contengan una fuerte actividad antioxidante puede proteger frente a estos cambios en el balance entre oxidantes/antioxidantes organismo. de nuestro Todos los organismos vivos están expuestos a ROS de manera continua. Además de fuentes exógenas, los ROS se forman in vivo, dentro de nuestro organismo, mediante diferentes mecanismos como por ejemplo la interacción de radiaciones ionizantes con moléculas biológicas de nuestro organismo que puede resultar en la formación de radicales libre. ROS son también un producto habitual de la respiración celular. Los electrones pasan a través de la cadena respiratoria frecuentemente escapan como perdidas, y directamente reducen moléculas de oxigeno al anión superoxido. Además, numerosas enzimas en fagotitos (ej: neutrófilos y macrófagos) sintetizan ROS como una parte de su habitual función celular. Las moléculas ROS se clasifican en dos categorías: Moléculas ROS que contienen e l e c t r o n e s impares (Ej: anión Superoxido O2-, Ión hidroxilo OH-, y Figura 1. Ilustración de la determinación de la actividad antioxidante expresada el radical hidroxilo como el área neta bajo la curva (AUC). La AUC para estándares, muestras y blancos es calculada y el valor del blanco substraído. El análisis realizado por el +OH) y reaccionan software Biotek consiste en la substracción a una curva obtenida de la cinética directamente de un pocillo “muestra” y de la de un pocillo “blanco” y ha sido resaltada el AUC con moléculas neta como describe Huang et al. [9]. 26 IZASALAB 2/2012 biológicas. Y la segunda categoría de ROS son moléculas que tienen la capacidad de capturar electrones de otras moléculas (Ej. H2O2 o HOCl) y pueden dañar biomoléculas a través de interacción directa o iniciando una cadena de reacciones donde las especies ROS son transferidas de molécula a molécula. Hay diferentes métodos para medir la capacidad antioxidante total descrita por Wayner et al. [3] fue ampliamente usada el los años 80 y en los 90. Este método fue remplazado por métodos más precisos tales como el ensayo ORAC. El ensayo de la capacidad absorbente de radicales oxigeno remplazo los ensayos con phycoeritrina como substrato fluorescente por la fluoresceína, la cual es mucho mas estable a lo largo del tiempo empleado en el ensayo [7]. Este ensayo ha sido automatizado [8] y a lo largo del tiempo se ha estandarizado como un ensayo en microplacas [9]. El ensayo ORAC del daño realizado por los radicales libres a la sonda fluorescente, (Ej. la fluoresceína), resulta en una caída de la señal de fluorescencia [10]. La deducción por supuesto, es que el descenso en la señal de fluorescencia es indicativo de la cantidad de daño del NOTA APLICATIVA radical. La presencia de antioxidantes resulta en una inhibición del daño del radical libre al compuesto fluorescente. Esta inhibición es observada como una preservación de la señal fluorescente en el tiempo. Las reacciones que tienen antioxidantes o son “blancos” (respecto al antioxidante) son analizadas en paralelo usando cantidades equivalentes de un generador de ROS y de sonda fluorescente (Figura 1.). Como la reacción se continúa hasta su final, se puede cuantificar la protección llevada a cabo por el antioxidante sobre la sonda fluorescente, calculando el área bajo la curva (AUC) de la muestra analizada. Después de substraer el AUC del blanco de la AUC de la muestra, la diferencia resultante sería la protección conferida por el compuesto antioxidante (Figura 2.) . La comparación de resultados con una serie de estándares, permite calcular equivalencias y comparar resultados de diferentes muestras, con distintos antioxidantes en distintos experimentos. Comúnmente el Trolox®, (acido 6-hydroxi-2,5,7,8-tetrametmetilcromo2-carboxilico), es usado como estandar de calibración y los ensayos ORAC son expresados como Trolox® equivalentes. El ensayo ORAC es el más eficaz y versátil, actualmente conocido, para poder calcular el poder antioxidante de un compuesto, pues el ensayo finaliza permitiendo calcular la totalidad de la AUC combinando tanto el tiempo de inhibición como el poder de dicha inhibición en cuanto al porcentaje del daño del radical libre inhibido por el antioxidante, en un único calculo. La estandarización del ensayo ORAC con el uso de un calibrador universal y con la combinación de un ensayo que puede desarrollarse fácilmente con muchos distintos compuestos, Figura 2. Descripción esquemática de un ensayo ORAC. Generadores de especies reactivas con el oxigeno son añadidos a reacciones paralelas, que contienen un blanco de buffer, o muestras de antioxidantes o estándares. La capacidad antioxidante de una muestra es la diferencia neta entre el area bajo la curva (AUC) de la muestra y la AUC del blanco. Figura tomada de Huang et al. [9]. alimento y materiales, ha permitido una sencilla comparación de las capacidades antioxidantes de distintos compuesto y establecer una base de datos[11]. Materiales y Métodos Los distintos reactivos fueron adquiridos en Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo). Na-Fluoresceina, AAPH, Trolox®, Sodium Fluorescein 2,2’-Azobis(2amidinopropane) dihydrochloride (AAPH), 6-hydroxy-2,5,7,8tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox®), acido gálico, EGCG, EGC y dihidrato de quercitina. Se emplearon microplacas de fluorescencia, de color negro y con el fondo transparente para permitir la lectura de fluorescencia por debajo del pocillo. El ensayo ORAC fue desarrollado esencialmente tal como ha sido descrito por Huang et. al [9]. Se pesaron 0.414 g de AAPH, y se disolvieron en 10 mL de 75 mM buffer fosfato (pH 7,4) para llegar a una concentración final de AAPH de 153 mM y esta solución de AAPH es preparada en el día. Del ensayo ORAC. Una solución stock de fluoresceína (4 x 10-3 mM) fue preparada en buffer fosfato 75 mM (pH 7,4) y almacenada en oscuridad a 5 ºC. Inmediatamente antes de ser usada la solución de fluoresceína fue diluida 1:1000 con más buffer fosfato 75mM (pH 7,4). la solución diluida de fluoresceína fue preparada siempre en el día. Se añadió a cada pocillo 150 μl de la solución de fluoresceína diluida. Además a los pocillos “blanco” se añadieron también 25 μl de buffer fosfato 75 mM (ph 7,4), mientras que a los estándares se añadieron 25 μl de una dilución de Trolox® y a los pocillos muestra, se añadieron 25 μl de cada muestra (antioxidante). La microplaca fue incubada durante un mínimo de 3 min en el Synergy HT Lector multimodo de microplacas (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT) a 37 °C. Las reacciones fueron iniciadas con la adición de 25 μl de AAPH empleando IZASALAB 2/2012 27 CIENCIAS DE LA VIDA / OXYGEN RADICAL ABSORBANCE CAPACITY los dispensadores del Synergy HT, para llegar a un volumen final de reacción de 200 μl. La señal de la fluoresceína fue monitorizada cinéticamente con toma de lectura de datos de la señal fluorescente cada minuto. Se empleó el Synergy™ HT con inyectores/dispensadores, como lector multimodo, para la lectura de la señal de fluorescencia, usando como filtro de excitación 485 nm y como filtro de emisión 528 nm. La reacción comienza con la adición de 25 μl de AAPH (153 mM) seguido de agitación a la máxima intensidad durante 10 seg. La fluorescencia de cada pocillo fue entonces medida por el fondo del pocillo cada 60 segundos, y los valores ORAC fueron calculados tal como describe Cao & Prior [12]. La AUC y la AUC neta (resultante de la substracción del blanco) fueron determinadas mediante el software Gen5 mediante su modulo de análisis de datos(BioTek Instruments, Winooski, VT) usando ecuaciones 1 y 2 respectivamente. los valores de las AUC netas de las muestras en la curva estándar del Trolox® . AAPH Kinetics Resultados Los experimentos iniciales examinaron el efecto de la concentración AAPH en las cinéticas de la fluoresceína respecto a la caída de la señal. Se demuestra en la Figura 3. que la presencia de AAPH resulta en una marcada perdida de señal de fluorescencia de la sodio fluoresceína a lo largo del tiempo. Mientras que las muestras que no contenían AAPH (0 mM) son relativamente estables más alla de un periodo de 120 minutos, una completa perdida de la fluorescencia fue observada con concentraciones de AAPH mayores de 28 mM. Cuando la AUC de cada concentración es representada frente a la concentración de AAPH (Figura 4). Se ve que una concentración final de AAPH de 19 mM, como describen prior y sus colegas, fue adecuada para realizar el ensayo ORAC para testar Time (m) Figura 3. AAPH Induce la caída de la fluorescencia. Varias concentraciones de AAPH fueron incubadas con sodio fluoresceína y la fluorescencia fue monitorizada cinéticamente durante 120 minutos. Los datos fueron procesados por el software Biotek Gen5. AAPH Concentration Curve AAPH Conc. (mM) Figura 4.Curva de concentración del AAPH. Varias concentraciones de el generador de ROS . el AAPH, fueron incubadas con cantidades contantes de sodio fluoresceína en solución. El área total bajo la curva (AUC) de cada pocillo y el resultado subsiguiente fuero representados frente a la concentración empleando el software Gen5. de desarrollar el ensayo ORAC y medir la actividad antioxidante de las muestras, de una manera eficiente y automatizada. Las curvas cinéticas de diferentes concentraciones del estándar AUC = 0.5+(R2/R1)+(R3/R1)+(R4/R1)+…….+ 0.5(Rn/R1) (Ecuación 1) Trolox® demuestran Donde R1 es la fluorescencia leída al inicio de la reacción y Rn es la ultima diferentes grados de medida de fluorescencia. protección de la fluoresceína Neta AUC = AUCmuestra – AUCblanco (Ecuación 2) frente a la oxidación, que resulta en perdida de La mayor distintos antioxidantes fluorescencia. La curva estándar fue concentración de Trolox® simultáneamente. Así que obtenida empleando la esta concentración de AAPH testada (100 μM) proporciono AUC neta de diferentes protección total (19 mM) se ha sido empleada una concentraciones de Trolox® en los distintos experimentos. durante aproximadamente contra su concentración. Los 20 minutos, antes que la valores ORAC de las muestras Los datos en la Figura 5. fluorescencia comenzase a son entonces calculados demuestran la capacidad disminuir. automáticamente usando el del lector Synergy™ HT Gen5 software que interpola 28 IZASALAB 2/2012 La AUC neta es calculada de estas curvas cinéticas y representada frente a la concentración de Trolox® y una relación lineal es observada (Figura 6). Estableciéndose una regresión lineal donde el coeficiente de correlación (r2) obtenido es 0.9987, así se demuestra que la determinación de muestras desconocidas empleando Trolox® equivalentes puede ser hecha con confianza. La curva estándar puede entonces ser interpolada para cuantificar muestras desconocidas. Las determinaciones resultantes son expresadas Trolox Kinetics Curves Trolox Calibration Curves Trolox (uM) Minutes Figura 5. Curvas cineticas Trolox. Representación de curvas cinéticas de un ensayo ORAC empleando Trolox® como estándar antioxidante en un rango de concentraciones de 0 a 100 μM .Las reacciones fueron iniciadas con la adición de 25 μl de una solución de AAPH (153 mM) y la fluorescencia fue monitorizada cada minuto empleando el Synergy HT. como Trolox® equivalentes. Numerosos compuestos con capacidad antioxidante conocida, fueron empleados en el ensayo ORAC, tal como se ha descrito anteriormente. Como se describe en la Figura 7, todos estos compuestos muestran un significativa linealidad de su capacidad antioxidante respecto a su concentración. Muestras de zumo de uva también han sido analizadas mediante el ensayo ORAC empleando el Synergy™ HT. La Figura 8 demuestra la significativa actividad antioxidante encontrada en el zumo de uva, donde una muestra diluida 1:1000 exhibía una actividad ORAC equivalente a 40 μM Trolox®. En adición, estos datos demuestran la Figura 8. Repetibilidad de la muestra. Dos muestras de distintos zumos de uva fueron diluidas 1:1000 con buffer fosfato y analizada su capacidad antioxidante usando el ensayo ORAC, realizándose 5 replicados de cada muestra. Figura 6. Típica Curva estándar de antioxidantee. Las AUC neta de diferentes estándares Trolox® son representadas como una función de la concentración. La curva de calibración subsiguiente es entonces usada para interpolar la capacidad antioxidante de muestras desconocidas. Dose Response Curves repetibilidad del Synergy HT. En estos experimentos, 5 diluciones 1:1000 de dos zumos de uva distintos, fueron analizados mediante el ensayo ORAC por triplicado. Conclusión El ensayo ORAC es el método más fiable y versátil para analizar simultáneamente la capacidad antioxidante de numerosos compuestos, de una manera cuantitativa y validada por numerosas publicaciones. El Synergy HT con inyectores es un instrumento ideal para desarrollar el ensayo ORAC. El Synergy HT es un lector de microplacas multimodo, compatible con integraciones en robot o acoplamientos de “stackers”, puede desarrollar medidas de absorbancia (monocromador), medidas de Fluorescencia y de Luminiscencia. El Synergy HT emplea un único diseño de óptica dual. La óptica de fluorescencia es capaz de desarrollar medidas en cualquier formato de microplaca, tanto fluorescencia “Top” como fluorescencia “Bottom”, y Figura 7. Curvas respuesta a la dosis de antioxidante. El ORAC de diferentes compuestos antioxidantes, tales como Tris buffer, fueron medidos como se ha descrito anteriormente y sus AUC netas representadas frente a su concentración cuantificación de la señal mediante PMT. Dispone de un control patentado de la temperatura en 4 zonas por microprocesador, que asegura una estabilidad de la temperatura en todos los pocillos de la placa. Los dos inyectores, permiten la adición de reactivos a la placa cuando esta se encuentra en al cámara de lectura justo antes de iniciar la cinética, lo cual permite una adecuación perfecta de tiempos entre el comienzo de la reacción y el inicio de la toma de medidas, sin perdida de ninguna señal. La bibliografía de este artículo puedes descargártela en la sección publicaciones de nuestra web www.izasa.es IZASALAB 2/2012 29 CIENCIAS DE LA VIDA / PACH CLAMP Sistema automático de Patch Clamp de Fluxlon El sistema IonFlux-16 es un equipo de Patch Clamp automático con la simplicidad de un lector de placas. Diseñado para el estudio de canales de iónicos regulados por voltaje y por ligando, su versatilidad y sencillez permite el análisis masivo de compuestos de manera eficaz y a un precio altamente competitivo. 3 E ste sistema está compuesto por tres partes fundamentales: 1. El lector: Mediante la aplicación de presión sobre los pocillos de las placas, ejecuta los protocolos de dispensación de líquidos y células y registra las corrientes generadas por los canales iónicos. 2. El Software: Permite la programación, la realización y complejo análisis de los experimentos con canales iónicos. Las gráficas y los distintos comandos permiten a los usuarios manejar rápidamente el equipo y mejorar la productividad. 3. Las placas: En el fondo de estas placas hay unos patrones de micro-capilares que permiten la dispensación de las células y la liberación rápida de los diferentes compuestos que hay en los pocillos. El equipo utiliza una interfaz neumática acoplada a los electrodos para ejercer presión sobre los pocillos de las placas y empujar las células y los compuestos hasta las zonas de registro. Este sistema de dispensación de líquidos y Pneumatic Pressure Interface Gasket Fluid reservoir Microfluidic channel 30 IZASALAB 2/2012 1 2 células tiene una serie de ventajas que hacen a este equipo muy fácil de manejar y de mantener: • Perfusión continua de líquido en las zonas de registro. Permite el aclarado rápido de los compuestos. • Flujo laminar constante. Se evitan Electrode turbulencias en las zonas de registro, así como la disminución de la concentración de las sustancias. Permite la aplicación uniforme de los compuestos sobre las células. • Sin necesidad de tener un dispensador de líquidos. Se evitan los pasos de pipeteos para la dispensación de compuestos, lo que disminuye el tiempo experimental. • Disminución de las partes móviles del equipo. Se reducen los gastos en reparaciones y calibraciones. Una de las ventajas principales de este equipo es la gran capacidad que tiene para el análisis masivo de moléculas, pudiendo llegar a testar más de 600 compuestos diferentes y 8000 puntos experimentales al día. Esta capacidad de análisis junto a un precio asequible hace que el coste por punto experimental sea uno de los más bajos del mercado. En la actualidad varias compañías farmacéuticas a nivel mundial han adquirido el sistema IonFlux y han comprobado, tras hacer varios estudios, que la relación calidad y relevancia de los datos frente al coste experimental es mejor que la que tienen los sistemas de Patch Clamp automático tradicionales. Cómo funciona el sistema IonFlux. 1. Las células y los compuestos son añadidos a las placas. Las placas del sistema IonFlux son la parte de productos consumibles del equipo. Hay diferentes diseños de placas que se ajustan a una gran variedad de aplicaciones para canales iónicos. Estas placas tienen tamaños estándar, lo que las hace perfectamente compatibles con cualquier robot o lavador que haya en los laboratorios. Modelo IonFlux-HT IonFlux-16 Formato de placa 384 pocillos 96 pocillos Número de patrones experimentales 32 8 Número de compuestos por patrón 8 8 Número de registros por patrón 2 2 Número de células por registro 20 20 Compuestos testados por placa 256 64 Puntos experimentales por placa 512 128 interna de las células, mientras que otros dos pocillos sirven para la entrada y el desecho de las células. Los 8 pocillos restantes son usados para depositar en ellos los compuestos o las diluciones seriadas que se van a testar. 2. Acoplamiento de las células. Las células depositas en el pocillo de entrada son empujadas por la presión neumática que ejerce la interfaz a través de un canal hasta las dos zonas de acoplamiento. Allí las células son atrapadas por succión y son expuestas a los 8 compuestos que hay en cada patrón experimental. Dado que hay dos zonas de acoplamiento, con este equipo se obtienen los datos de cada compuesto siempre por duplicado. Dependiendo del tipo de placa, hay zonas de acoplamiento para un conjunto de 20 células o zonas de acoplamiento para una única célula. 3. Registro de la corriente en la zona de acoplamiento. Los electrodos del sistema están siempre en contacto con las zonas de acoplamiento y la solución interna de las células. Las corrientes generadas por los canales iónicos se miden en cada amplificador y se digitalizan para verlas en el ordenador. El sistema usa un modo de registro continuo para facilitar la adquisición de los datos provenientes de canales iónicos de rápida actuación. La red de micro-capilares que hay debajo de las placas del sistema IonFlux forman unos patrones experimentales que se repiten. Cada patrón experimental contiene 12 pocillos en los que cada experimento es llevado a cabo. Dentro de cada patrón, dos de los pocillos son usados para depositar la solución IZASALAB 2/2012 31 Aplicaciones Canales Iónicos regulados por ligando: La tecnología de la red de microcapilares empleada por el sistema IonFlux posibilita el uso de una gran cantidad compuestos y distintas concentraciones para el estudio de canales iónicos regulados por ligando. Además, gracias a la perfusión constante se mejora drásticamente el aclarado de los compuestos, lo que permite estudiar canales tan complejos como el receptor NMDA. Canales Iónicos regulados por voltaje: Los canales iónicos regulados por voltaje son los responsables de la forma, la duración y la frecuencia de los potenciales de acción en las células excitables. Dado su importante papel fisiológico, el estudio de su regulación farmacológica es fundamental. Gracias a la tecnología de este sistema se pueden realizar rastreos de compuestos que afectan a estos canales, determinar su IC50, estudiar mutantes, etc. Toxicología en Canales hERG: Debido a la dificultad y al elevado precio de testar los compuestos In vivo, el canal ether-a-gogo realted gene humano sigue siendo un indicador importante del potencial cardiaco y la toxicidad de las moléculas. Gracias a la capacidad del sistema IonFlux de trabajar con compuestos de baja solubildad, de testar muchas compuestos en un día y el bajo precio por punto experimental, este equipo es el más adecuado para la investigación con los canales hERG. Entre las posibles aplicaciones para el estudio de estas proteínas se encuentran las siguientes: Determinación IC50, rastreo de compuestos, estudios de los canales hERG a temperatura fisiológica. Efectos debidos a la temperatura: Gracias al módulo de control de temperatura se pueden realizar varios tipos de experimentos en los que la temperatura afecta a la actividad del canal iónico. Con este módulo se consigue una temperatura estable incluso cuando se aplica un nuevo compuesto. 32 IZASALAB 2/2012 Modulation of the GABA response by the diazepam and two other alloesteric modulators. Diazepam (valium) and other GABA positive allosteric modulators characterized using the IonFlux System. Pharmaceutical companies are developing this target class to improve treatment for move disorders (i.e. anxiety) and chronic pain. Sodium channel blockers like lidocane are being developed across a broad number of indications. Data obtained with the IonFlux System exemplifies the funcional characterization of the local anesthetic lidocane as an effective sodium chanel blocker. Shown here, Nav 1.7 current suppressed by increasing compound concentrations. CIENCIAS DE LA VIDA / MSOT Tecnología MSOT para imagen de animales pequeños como ratas y ratones con iTheraMedical Izasa firmó recientemente la representación exclusiva en España y Portugal de la firma iTheraMedical, empresa dedicada a la fabricación de equipos para imagen de animales pequeños como ratas y ratones mediante la tecnología MSOT (Multispectral Optoacustic Tomography) tomografía multiespectral optoacústica. C on su capacidad única para visualizar y cuantificar con precisión las moléculas en los tejidos, las nanopartículas, biomarcadores y agentes ópticos, en vivo y a tiempo real, a través de varios centímetros de tejido, la tecnología MSOT se sitúa en la vanguardia de la próxima era en imágenes de biomedicina. Combina imágenes de alta resolución con la versatilidad de la especificidad del contraste óptico, dando información sobre los procesos fisiológicos en tejidos, in vivo y a nivel molecular y celular. Técnicas de obtención de imágenes. La obtención de imágenes del interior del cuerpo humano es una potente herramienta de detección de patologías. En la actualidad, la obtención de estas imágenes biomédicas está dominada por las técnicas de rayos X, aunque los ultrasonidos están tomando su protagonismo, sin olvidar las técnicas de resonancia magnética. La técnica más antigua de obtención de imágenes biomédicas es la radiografía. La mayor desventaja de esta técnica es la utilización de radiación ionizante. Las estructuras espaciales dentro del cuerpo son proyectadas a la superficie del detector. Por tanto, las estructuras que están por encima de otras aparecen superpuestas sobre éstas en la imagen. La resonancia magnética está basada en el efecto físico de la resonancia magnética nuclear de los protones de hidrógeno. Esta técnica usa radiación no ionizante, sin embargo, hay un riesgo que emana de los fuertes campos electromagnéticos y de las altas frecuencias empleadas en ellos. Esta modalidad proporciona mejor contraste y resolución en tejidos blandos que las técnicas de rayos X. La técnica de ultrasonidos es un modalidad de obtención de imágenes biomédicas que se aplica en la visión de la morfología de los órganos, en diagnóstico funcional y en terapia. Las ondas ultrasónicas emitidas son reflejadas en las fronteras de las capas internas de los tejidos. Cuanto mayor es la diferencia en la densidad, mayor es la reflexión del sonido. La profundidad de penetración y la resolución dependen directamente de la frecuencia del ultrasonido. Cuanto mayor es la frecuencia, mejor es la resolución, sin embargo, la profundidad de penetración desciende. Técnicas Optoacústicas. Para superar las limitaciones de las técnicas basadas en la absorción de luz aparece la tomografía optoacústica (combinación de luz y ultrasonidos). Esta técnica es una modalidad híbrida no invasiva, alternativa a las técnicas de imágenes ópticas utilizadas en la actualidad, capaz de proporcionar alto contraste en imágenes obtenidas mediante absorción óptica, pero con resolución espacial mucho mejores que las técnicas puramente ópticas debido a la detección de ultrasonidos generados por el efecto optoacústico . El efecto optoacústico es la base física para la tomografía optoacústica y IZASALAB 2/2012 33 CIENCIAS DE LA VIDA / MSOT Nuevamente nos encontramos con un equipo capaz de obtener imágenes, no ya sólo de un alto nivel sino que nos permite observar concentraciones de diferentes moléculas en órganos comprometidos o sanos para su posterior estudio comparativo a la vez que nos proporciona información funcional de otros muchos componentes biológicos dentro del mismo organismo. está referida a la generación de ondas acústicas debido a la absorción de energía electromagnética sin embargo, sólo en la pasada década ha emergido como una prometedora modalidad biomédica para obtención de imágenes del interior del cuerpo humano. La técnica está basada en la irradiación de un volumen con un láser mediante un pulso corto, del orden de nanosegundos, que permite la deposición de energía óptica en las estructuras absorbentes dentro del volumen. Estas estructuras se calientan tan rápidamente, que se produce una expansión térmica que provoca una onda de presión que se propaga hacia la superficie del volumen. Esta onda está en el rango de los ultrasonidos y es detectable por transductores de ultrasonidos de banda ancha colocados en contacto con la superficie del volumen. Basándose en las medidas en el dominio del tiempo obtenidas en la superficie, es posible la reconstrucción de la distribución espacial, tanto 2D como 3D, de las fuentes optoacústicas dentro del volumen. 34 IZASALAB 2/2012 Aplicando el pulso láser sobre un tejido biológico, este absorberá los fotones en puntos donde haya componentes absorbentes, como la hemoglobina. La longitud de onda es elegida de manera que la mayor parte de la energía absorbida es convertida a calor de manera eficiente. El calor provoca una calentamiento local en el tejido acústico absorbente. Esto causa una variación de presión debido al cambio de volumen. La onda de presión se propaga a la superficie de manera relativamente no dispersiva y mediante transductores ultrasónicos se puede detectar y convertir en una señal eléctrica. Así el proceso consiste en que la energía óptica es convertida en térmica por la absorción de fotones, la energía térmica se transforma en energía mecánica por la expansión termoelástica y la energía mecánica se convierte en eléctrica mediante los transductores . Estas señales, cuya amplitud es proporcional a la absorción, son postprocesadas para obtener la reconstrucción, a resolución ultrasónica, de la distribución espacial de energía óptica absorbida, es decir, la creación de una imagen de absorción del tejido biológico La utilización de un pulso corto de luz, más corto que el tiempo de propagación del sonido a través una unidad volumétrica de tejido, conocida como vóxel, generará la máxima presión posible resultante de toda la energía óptica del pulso antes de escapar del vóxel. Bajo esta condición se obtiene la máxima amplitud de presión posible, por unidad de energía óptica absorbida. De esta manera se obtiene la mayor sensibilidad de detección y resolución posible en imágenes optoacústicas. Aplicación de la optoacústica en Medicina. La obtención pura de imágenes por ultrasonidos está basada en la detección de las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos, por tanto, su bajo contraste no es capaz de mostrar información fisiológica de las estructuras. De ahí que la optoacústica combine el alto contraste óptico debido a la absorción de energía electromagnética, con la fina resolución ultrasónica Por tanto, esta técnica supera las limitaciones de las técnicas puramente ópticas y mejora el contraste de las técnicas basadas en ultrasonidos, permitiendo la conjunción de lo mejor de ambas modalidades para proporcionar información funcional, como por ejemplo, concentraciones de moléculas detectadas por absorción óptica, tales como la hemoglobina (HHb) y la oxihemoglobina (HbO2), y anatómica en tejidos blandos Además, estas ondas no ionizantes no suponen riesgo para la salud. El alto contraste ofrecido es debido a la gran diferencia del coeficiente de absorción óptico en los constituyentes de los tejidos, e incluso se puede obtener información espectroscópica de estos componentes midiendo los coeficientes de absorción a diferentes longitudes de onda. En cuanto a la resolución espacial, ésta se degrada de forma significativa con la profundidad, debido al scattering en tejidos blandos. Las imágenes por ultrasonidos pueden proporcionar mejores resoluciones que las imágenes ópticas teniendo la capacidad de obtener imágenes de tejidos heterogéneos con una resolución por debajo de milímetros a profundidades de varios centímetros. Tanto la resolución espacial como la máxima profundidad es escalable con el ancho de banda de la señal de ultrasonidos detectado. La luz difusa del NIR se ha erigido, como se ha comentado anteriormente, en el rango de longitudes de onda óptimas (venta biomédica), dentro de la energía electromagnética, para la obtención de imágenes optoacústicas en biomedicina, debido a su naturaleza no invasiva y contraste. La baja absorción y la alta dispersión, a través de varios centímetros en el tejido, entre 700 y 900 nm, permite a la luz en estas longitudes de onda dispersarse a través del tejido varios centímetros (~5 cm). Los vasos sanguíneos juegan un importante rol en la homeostasis, crecimiento y reparación de tejidos. Su nivel de hemoglobina y su grado de oxigenación producen información crucial en aplicaciones en medicina, desde oncología a hematología. Nuevamente nos encontramos con un equipo capaz de obtener imágenes, no ya sólo de un alto nivel sino que nos permite observar concentraciones de diferentes moléculas en órganos comprometidos o sanos para su posterior estudio comparativo a la vez que nos proporciona información funcional de otros muchos componentes biológicos dentro del mismo organismo. tumoral y distribución de sondas moleculares específicos • Cardio: Imágenes de las arritmias cardiacas, la isquemia, la formación de ateros, y de los marcadores biológicos de vulnerabilidad. • Cerebro: Análisis de glioblastomas, perfusión, derrame cerebral y enfermedades neurodegenerativas • Cinética: En tiempo real de visualización y cuantificación de los cambios temporales y espaciales en la distribución de la sonda para analizar las propiedades farmacocinéticas, la administración de fármacos y la función de órganos Es importante destacar que el campo de aplicación se puede ampliar según el usuario final y adaptarse a las necesidades específicas de éste. Debido a sus características favorables en términos de resolución espacial, profundidad de penetración, funcionamiento en tiempo real, sensibilidad y especificidad, la tecnología de iThereMedical, (MSOT) puede ser utilizada en multitud de aplicaciones. Aplicaciones. • Cáncer: Análisis de la angiogénesis, Sobre la base de su amplia penetración en la investigación académica y una estrecha colaboración con socios académicos y de investigación farmacéutica, iThereMedical se encuentra continuamente explorando nuevas aplicaciones y confía en que su tecnología MSOT se convertirá en el método diagnóstico de imagen de elección en un número significativo de aplicaciones clínicas y preclínicas. hipoxia IZASALAB 2/2012 35 Super Resolución: Microscopía Óptica más allá del límite N-SIM alzanca una resolución lateral dos veces superior a la de los microscopios tradicionales a una velocidad increíblemente rápida: 0.6 segundos / cuadro. Adicionalmente permite la obtención de imágenes en 3D e imágenes en TIRF mediante el nuevo iluminador iluminador TIRF-SIM Antes Después N-STORM, con una resolución lateral de 20 nm. y una resolución axial de 50 nm., permite la obtención de imágenes en dos y tres dimensiones e imágenes multiespectrales Antes IZASA, S.A. Tel.: 902 20 30 80 - Fax :902 20 30 81 - [email protected] - www.izasa.es Después Referencias artículo pg. 26 Desarrollando el ensayo “Oxygen Radical Absorbance Capacity” con el Synergy™HT. ORAC Test antioxidante 1. Halliwell, B., Aruoma, O. (1991) DNA Damage by Oxygen Derived Species. Its Mechanisms and Measurement in Mammalian Systems. FEBS Lett. 281:9-19. 2. Ames, B.N., Shigenaga, M.K., and Hagen, T.M. (1993) Oxidants, Antioxidants and the Degenerative Diseases of Aging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7915-7922. 3. Benzie, IFF, Strain, JJ. (1996) The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of “Antioxidant Power”: The FRAP Assay. Anal. Biochem. 238:70-76. 4. Rice-Evans, C. and Miller, NJ. (1994) Total Antioxidant Status in Plasma and Body Fluids. Methods Enzymol. 234:279-293. 5. Cao, GH., Alessio, HM.and Cutler, RG., (1993) Oxygenradical Absorbance Capacity Assay for Antioxidants. Free Radical Biol. Med. 14:303-311. 6. Cao, G., Verdon, C., Wu, A., Wang, H., and Prior, R. (1995) Automated Assay of Oxygen Radical Absorbance Capacity with the COBRAS FARA II. Clin. Chem. 41:17381744. IZASALAB 2/2012 7. Huang, D., Ou, B., Hampsch-Woodill, M., Flanagan, J., and Prior, R. (2002) High-throughput Assay of Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) Using a Multichannel Liquid Handling System Coupled with a Microplate Fluorescence Reader in 96-Well Format. J. Agric. Food Chem. 50:4437-4444. 8. Ou, B., Hampsch-Woodill, and Prior, R. (2001) Development and Validation of an Improved Oxygen Radical Absorbance Capacity Assay Using Fluorescein as the Fluorescent Probe. J. Agric Food Chem. 49:4619-4626. 9. Wu, X., Gu, L., Holden, J., Haytowitz, D., Gebhardt, S., Beecher, G., and Prior, R. (2004) Development of a Database for Total Antioxidant Capacity in Foods: a Preliminary Study. J. Food Composition and Analysis. 17:407-422. 10. Cao, G., and Prior, R. (1999) Measurement of Oxygen Radical Absorbance Capacity in Biological samples. Oxidants and Antioxidants. Methods Enzymol. 299:50-62. Anexo 1