Sistema de componentes para Acidos Biliares

Sistema de componentes para Acidos Biliares

Diagnostics Division
13 Mountain View Avenue
Orangeburg, NY 10962
http://www.diagnostics.com
Sistema de componentes para
Acidos Biliares Conjugados
Catalog No.: 06B-242918 (100 Tubes)
RIA HOT LINE U.S. ONLY: 1-800-431-1237
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2
SISTEMA DE COMPONENTES PARA
ACIDOS BILIARES CONJUGADOS
Para la determinación cuantitativa de Acidos Biliares Conjugados en suero o plasma.
Resumen y explicación de la prueba
Los ácidos biliares son esteroides C24 derivados del colesterol. Los ácidos cólico y
quenodeoxicólico son los dos ácidos biliares fundamentales en el hombre. En la bilis,
son conjugados con los aminoácidos, glicina y taurina, formando los cuatro ácidos
biliares conjugados que son medibles con este ensayo: ácido glicocólico, ácido
taurocólico, glicoquenodeoxicólico y ácido tauroquenodeoxicólico.
Los ácidos biliares fundamentales son degradados en el intestino formando los ácidos
biliares secundarios, los ácidos deoxicólico y litocólico y los productos de oxidación.
Las sales de los ácidos biliares conjugados son potentes detergentes que colaboran en
la absorción de los lípidos en el intestino. Los ácidos biliares conjugados son casi
entera-mente absorbidos por el intestino y retornados al hígado y la vesícula biliar por
la circulación enterohepática.
Se conoce desde hace muchos años que la concentración de los ácidos biliares séricos
estan elevados en los pacientes con lesión hepática como resultados del fracaso del
hígado enfermo de eliminar eficazmente los ácidos biliares de la sangre portal1. Se ha
comunicado que la concen-tración sérica de los ácidos biliares conjugados se
encuentra elevada en muchas formas de lesión hepática estructural.
Enfermedades del metabolismo hepático que implican aniones orgánicos no parece que
produzcan concentraciones anormales de ácidos biliares2. No aparecerán incrementos
de los ácidos biliares conjugados en suero, ni siquiera en presencia de lesión hepática,
si el paciente sufre mala absorción intestinal como la que se encuentra después de una
reserc-ción ileal o by-pass2,3. Se ha sugerido la posibilidad que el nivel de los ácidos
biliares sea el test único más sensitivo e indicador específico de hepatopatia cuando
otros test químicos o enzimáticos son frecuente-mente normales2,4-9, aplicable para el
seguimiento de la recuperación o predecir recaidas de las patologias como hepatitis y
para monitorizar drogas tóxicas.
Fundamento de la prueba
En el radioinmunoensayo, el anti-cuerpo debe tener igual afinidad por el estándar y por
la sustancia a analizar presente en el suero o plasma del paciente. La fracción sin
marcar compite con sus equivalentes marcados por un número limitado de zonas de
1
unión disponibles en el anticuerpo. Por lo tanto, el nivel de radiactividad ligada es
inversamente proporcional a la concentración de la sustancia a analizar en la muestra
del paciente o en el estándar.
En el procedimiento de ICN Pharmaceuticals en fase sólida, se utilizan tubos
recubiertos de anticuerpos y un trazador [125I] para medir pequeños volúmenes de
ácidos biliares en suero.
Reactivos
Para diagnóstico in vitro
1.
2.
Tubos Recubiertos de Anticuerpos Anti-Acidos Biliares, NE. de Catálogo
06B243011. Contiene 100 tubos de polipropileno recubiertos de anticuerpos
antisuero (conejo). Conservación: Refrigerar de 2-8EC bien cerrados en su
envase. Calentar a temperatura ambiente antes de abrirlos. NO MEZCLAR
TUBOS DE DIFERENTES LOTES EN UN MISMO ENSAYO. Estabilidad: Consultar
la fecha de caducidad del paquete.
Juego de Estándares de Acidos Biliares, NE. de Catálogo 06B262056, contiene
taurocolato sódico en buffer con albúmina de suero humano*, azida sódica** al
0,05% y otros conservantes. Volumen mínimo de 2,0 ml/vial para el estándar
A; 1,5 ml/vial para los estándares B-F. Listo para usar. Conservación: Refrigerar
a 2-8EC. Estabilidad: Consultar la fecha de caducidad en el vial.
Estándar
Nivel de Estándar
Fmole/l
A
B
C
D
E
F
0
0,4
2,0
6,0
15
50
3.
Trazador de Acidos Biliares [125I], NE. de Catálogo 06B229717, contiene
derivado del ácido glicocolico [125I] en buffer con gamma globulina bovina, azida
sódica** al 0.1% conservantes y colorante. Una botella contiene <5FCi (185
kBq) de [125I]; 110 ml/botella. Listo para su uso. Conservación: Refrig-erar a 28EC. Establiidad: Consul-tar la fecha de caducidad en el vial.
*
PRECAUCION: MANIPULAR COMO POSSIBLE TRANSMISOR DE INFECCIONES:
El material original del que se ha obtenido este producto no reaccionaba frente
a HBsAg y era negativo en anticuerpos anti-HIV cuando se analizó con reactivos
2
autorizados. No se conoce ningún método que asegure que los productos
derivados de sangre humana no sean infecciosos. Consultar CDC/NIH, Biosafety
in Microbiological and Biomedical
Laboratories (Publicación HHS NE CDC 84-8395).
**
ADVERTENCIA: Los reactivos contienen azida sódica. La azida sódica puede
reaccionar con el cobre o plomo de las tuberías de desagüe y formar azidas
metálicas altamente explosivas. Al desechar los reactivos, dejar correr gran
cantidad de agua para evitar la formación de dichas azidas. Muy tóxico si se
ingriere. En contato con acidos libera gases muy tóxicos. En caso de contacto
con la piel, lávese inmediatamente con abundante agua.
ADVERTENCIA: CONTIENE MATERIAL RADIACTIVO
Este Kit de ICN Pharmaceuticals de Radioinmunoensayo contiene <5 microcurios (185
kBq) de [125I] por botella de trazador. Este material radiactivo sólo pueden recibirlo,
poseerlo y utilizarlo médicos, veterinarios en la practica de la medicina veterinaria,
laboratorios clínicos u hospitales, y solamente para pruebas clínicas in vitro o de
laboratorio, que no impliquen la administración interna o externa del producto, o de sus
radiaciones, a los seres humanos o animales. Su recepción, adquisición utilización y
transferencia, están sometidas a las normas y regulaciones de la legislación española.
ICN Pharmaceuticals, Inc.
El cumplimiento de las normas básicas para seguridad de las radiaciones asegurara una
protección adecuada. Dichas normas pueden obtenerse de la Junta de Seguridad
Nuclear, Madrid. A continuación recogemos un resumen del mismo:
Ë No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos donde se utilicen materiales radiactivos. Ë No pipetear soluciones radiactivas oralmente. Ë Evitar el contacto directo con
todo material radiactivo, utilizando artículos protectores tales como batas de
laboratorio y guantes desechables. Ë Todo trabajo radiológico se realizará en zonas
especiales, que no sean de paso. Ë Los materiales radiactivos deben ser almacenados
en sus envases originales en una zona especial. Ë Debe llevarse un libro de registro
con la entrada y salida de material radiactivo. Ë El equipo de laboratorio y material de
vidrio, sometido a contaminación debe estar separado de forma que se evite la
contaminación cruzada de diferentes radioisótopos. Ë Cualquier posible contaminación
con material radiactivo se tratará inmediatamente según los métodos establecidos. Ë
El material radiactivo será eliminado de acuerdo con las normas y regulaciones de las
agencias que tengan jurisdicción sobre el laboratorio. Ë Los envases no contaminados
se desecharán junto con el material no radiactivo, después de destruir sus etiquetas.
Equipos y reactivos necesarios pero no suministrados con el kit:
3
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Tubo de Vidrio al vacio o tubo de Vidrio al vacio que contenga EDTA o heparina.
Agua destilada
Gradilla para tubos.
Una pipeta-diluidor automática o pipeta semi-automática con capacidad para 25
Fl y volumen de 1000 Fl.
Baño de agua para 37 ± 1EC.
Aspirador
Jeringa con unión, 2 ml y cabezal de metal.
Contador gamma para medir [125I].
Papel para gráficas adecuado, tal que lineal, semilog o logit-log.
Obtención de muestras
La muestra debe obtenerse en ayunas o dos horas despues de haber comido. Se ha
usado en algunos estudios comidas estándares11. Manejar todas las sangres y sueros
como materials infecciosos.
1.
Preparación de muestra para análisis: Recoger la sangre en un Tubo de Vidrio al
vacio Marca de 5 ml. Si se desea plasma, usar heparina o EDTA. Si lo que se
desea es suero, dejar que la sangre se coagule a temperatura ambiente.
Centrifugar y recoger el suero o plasma.
2.
Conservación: Conservar las muestras antes de su análisis a 2-8EC. Si se espera
que este período supere las 48 horas, las muestras deben congelarse y
descongelarse solo una vez. La repetición de la congelación y descongelación
o una conserva-ción sin congelar larga puede resultar en un suero nublado; que
deterioraria las muestras y podria dar resultados erroneos.
3.
Traslado de las muestras: El suero y plasma, envasados cuidado-samente, deben
enviarse de 2-8EC. Si el tiempo de traslado excede de 48 horas, las muestras
deben enviarse congeladas.
Procedimiento del Ensayo
Los Tubos recubiertos, reactivos y muestras deben llevarse a tempera-tura ambiente
antes de utilizarlos, pero no debe permanecer a esta temperatura más tiempo del
estrictamente necesario, para minimizer su deterioro. Solo usar reactivos que se
encuentren en sets que hagan juego. SE OBTENDRA UN OPTIMO RESULTADO
MEDIANTE LA ESTRICTA ADHERENCIA A ESTE PROTOCOLO. UN PIPETEO
CUIDADOSO ES ESENCIAL.
En el presente protocolo se recomienda, analizar los estándares por duplicado. Las
muestras de los pacientes deben analizarse por duplicado y la preparación de la curva
4
estándar y las determinaciones clínicas deben realizarse simultanea-mente. Los sueros
control deben analizarse a la vez y de forma simultanea a las muestras de los
pacientes.
El análisis utiliza 25 Fl de muestra de paciente sin diluir. Las muestras con valores
>50 Fmol/l deben diluirse y reanalizarse. Si el suero aparece ictérico o si se conoce
que el paciente tiene valores altos de ácidos biliares conjugados, se puede utilizar una
dilución 1:8 o superior.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
*
Numerar 12 tubos recubiertos de anticuerpos antiácidos biliares para la curva
estándar. Comenzando con el 13 numerar 2 tubos recubiertos por cada muestra
clínica.
Añadir 25 Fl de estándares de ácidos biliares y de muestras clínicas como se
indica en el esquema que sigue.
Añadir 1,0 ml solución trazadora de ácidos biliares [125I] a todos los tubos.* No
agitar estos tubos.
Incubar todos los tubos en un baño de agua a 37±1EC durante 60 minutos a
contar a partir del último pipeteo del paso anterior. Introducir toda la gradilla a
un tiempo. No utilizar un horno u otro calentador de aire.
Retirar las gradillas del baño de agua y aspirar o decantar todo el liquido. Lavar
con 1,0 ml de agua destilada y aspirar o decantar otra vez.
Obtener un contaje de fondo del contador. Contar la radiactividad de los tubos
en secuencias de un 0,5 a 2 minutos con un contador gamma. Los tubos 1 y
2 daran las cuentas del nivel del trazador. Las cuentas de estos tubos debe ser
de 7.000-30.000 cpm. El tiempo necesario dependerá de la eficacia del
contador usado. El tiempo requerido para que el nivel del trazador acumule
10.000 cuentas nos indicara el tiempo requerido para todos los análisis con el
contador gamma del usario.
Si se utiliza un dispensador automático de muestras para combinar los pasos 2
y 3, se debe seleccionar una punta de suficiente diámetro de forma que no se
forme excesiva turbulencia o burbujas. Se recominda usar puntas de 1,0 mm
para pipetas Micromedic y de 1,5 mm para Cordia. La puntas pueden tocar el
interior del tubo de ensayo hasta aproximadamente la mitad durante el proceso
de pipeteo.
5
RADIOINMUNOENSAYO EN FASE SOLIDA PARA DETERMINAR
ACIDOS BILIARES CONJUGADOS
Tubo NE
Estándar
(Fl)
Suero
Pacient
(Fl)
25 A
25 B
25 C
25 D
25 E
25 F
-------------
1, 2
3, 4
5, 6
7, 8
9,10
11,12
Muestras
Pacientes
Trazador
Incubar
Lavar
Añadir
1000 Fl
a todos los
tubos. No
agitar.
Incubar
todos los
tubos a 37
± 1EC por
60 minutos
Aspirar o
decantar y
lavar todos
los tubos
25
Contar la radioactividad de todos los tubos.
Cálcular de Resultados
Cálculos Logit-Log
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Determinar las cuentas de fondo del contador gamma.
Restar las cuentas de fondo a todos los tubos para obtener las cuentas
corregidas por minuto (o por un tiempo uniforme). Utilizar solo las cuentas
corregidas para estos cálculos.
Promediar las cuentas de los tubos 1 y 2 para obtener el Promedio del Recuento
del Trazador.
Dividir las cuentas corregidas de cada tubo por el Promedio Recuento de Nivel
de Trazador para obtener el % de Nivel de Trazador en cada tubo. Se debe
obtener un valor separado por cada determinación duplicada.
Puede trazarse una Curva Estándar como sigue: Utilizando un papel logit-log,
comparar los % de Nivel de Trazador vs. Fmol/l de Estándar de Acidos Biliares
conjugados la escala log. La Table 1 muestra unos datos típicos de recuento y
los % de Nivel del Trazador calculados. La curva estándar trazada para esos
datos se muestra en la Figura 1.
La concentración de Acidos Biliares Conjugados en el suero de un paciente se
determina por interpolación en la curva estándar del % de Nivel de Trazador
calculado.
Se puede calcular las muestras clínicas diluidas de la forma siguiente: Fmol/l en
la muestra del paciente diluida (de la curva estándar) x factor de dilución =
Fmol/l de ácidos biliares conjugados sin diluir en el suero de paciente.
6
8.
Ejemplo del cálculo de una muestra de paciente:
Cuentas (encontradas)
Cuentas de fondo
% de nivel del trazador
= 5663
= 288
= 5663 - 288 x 100 = 55,0%
9772
La curva estándar logit-log de % de nivel del trazador (Figura 1) muestra el
55,0% correspondiente a una concentración de 1,9 Fmol/l en la muestra del
paciente.
El promedio de este valor y el de la determinación duplicada se con-sidera como
la concentración de Acidos Biliares Conjugados en Fmol/l.
Limitaciónes del Procedimiento
El sistema de componentes de ICN Pharmaceuticals para la determinación de Acidos
Biliares Conjugados puede ser utilizado para medir la concentración de los ácidos
biliares conjugados fundamentales que se encuentran elevados en la mayoria de las
patologias hepáticas. Los ácidos biliares conjugados secundarios y los no conjugados
tienen un mínimo efecto en los resultados tanto por su relativa baja concentración en
suero como por la baja reacción cruzada con el anticuerpo.
A pesar de la variabilidad de las reacciones cruzadas de los ácidos biliares conjugados
séricos, este sistema ofrece unas correlaciones satisfactorias con el 3"-hidroxidehidrogenasa, ensayo conocido para medir los niveles totales de sales biliares séricas.
Valores Esperados
Los valores séricos de voluntarios sanos (en ayunas) fueron:
N = 162
Media = 2,23 Fmol/l
S.D. = 1,95 Fmol/l
Niveles típicos en suero obtenidos con este sistema para patologia especifica hepática
se muestra en la Figura 2.
El uso de una comida estándar para obtener un suero de 2 horas post-prandial de
ácidos biliares puede ser interesante para estándarizar el método.
7
Los siguientes rangos de valores esperados obtenidos con este método puede servir
de guia:
Normal - Menos de 6 Fmol/l
Anormal - Mayor de 6 Fmol/l
Características específicas de la prueba
Exactitud:
1.
Se realizó una regresión lineal de los resultados obtenidos de 45 muestras
clínicas, comparando este sistema con aquellos obtenidos en un hospital
universitario con el metodo 3"-hidroxidehidrogenasa los resultados fueron los
siguientes:
Coeficiente de correlación
Pendiente
Intercepción-y
2.
= 0,94
= 1,18
= -6,4
La recuperación se hizo añadiendo un volumen de ácido glicocolico y ácido
taurocolico mezclados (3:1) a varios volúmenes de un pool de sueros pobres.
Acidos Biliares
Añadidos
Fmol/l
Acidos Biliares
Encontrados
Fmol/l
% Recuperado
20,9
10,5
5,2
3,8
17,6
9,3
5,2
3,4
84,2
88,6
100
89,5
8
Precisión:
Para determinar la variación intra-ensayo e inter-ensayo se analizaron suéros humanos
y un control comercial con valores normales y altos.
Inter-ensayo
Muestra
NE de
Determinaciones
Media, Fmol/l
S.D.
% CV
1
25
3,2
0,6
18
Intra-ensayo
3
25
13,2
1,9
14
2
19
6,9
1,0
14
1
20
3,8
0,5
12
2
20
6,8
0,7
11
3
20
11,4
0,7
7
Sensibilidad:
La sensibilidad es de 0,2 Fmol/l, determinada como la concentración de ácido
taurocolico a 90% de fijación del trazador.
9
Especificidad:
% de Reacción cruzada
(Peso Base)
Compuesto
1. Acidos Biliares Conjugados
Acido Taurocolico
Acido Glicoclico (en suero)
Acido Taurocenodeoxicolico
Acido Glicocenodeoxicolico
Acido Taurodeoxicolico
Acido Glicolitocolico
Acido Glicodeoxicolico
2. Acidos Biliares No Conjugados
Acido Cenodeoxicolico
Acido Colico
Acido Deoxicolico
Acido Litocolico
Acido Dehidrocolico
3. Esteroides (a 10 veces los valores
fisiolóicas)
Cortisol
Aldosterona
Estriol
Testosterona
4. Varios (a la dosis especificada)
Colesterol (1 mg/ml)
Etanol (1,5 mg/ml)
Digoxina (20 ng/ml)
Espirolactona (20 ng/ml)
Heparina (1 mg/ml)
100.0
85
210
62
4,0
3,3
3,3
8,1
3,1
0,2
0,7
0,03
N.D.*
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
<1
N.D.
N.D.
<1
* No detectable en Bo
10
TABLE 1
Conjugated Bile Acids Radioimmunoassay
Counts per
Minute
Tube No.
Background
Corrected
Counts
A
Average
Counts
B
% of Trace
Standard
Level
Curve
A x 100 Concentrati
on Fmole/L
B
288
---
Trace
1
10050
9762
Level
2
10070
3
9772
---
0
9782
---
0
8025
7737
79.2
0.4
4
8252
7964
81.5
0.4
5
5713
5425
55.5
2.0
6
5936
5648
57.8
2.0
7
3526
3238
33.1
6.0
8
3499
3211
32.8
6.0
9
2133
1845
18.9
15
10
2002
1714
17.5
15
11
1207
919
9.4
50
12
1272
984
10.1
50
Patient Sample
5663
5375
55.0
11
1.9
FIGURE 1
Typical Standard Curve with Logit Log Transformation
FIGURE 2
12
References
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
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13
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