DIAGNOSTIC AUTOMATION, INC.

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KIT PARA INMUNOALÁLISIS ENZIMÁTICO DE PROGESTERONA
Catálogo Número: 2077
DIAGNOSTIC AUTOMATION, INC.
23961 Craftsman Road, Suite E/F, Calabasas, CA 91302
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Σ=96 prueba
2°C-8°C
#2077
Enzyme Immunoassay for the
Quantitative Determination of
Progesterone Concentration in Human
Serum or Plasma
SÓLO PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO
Almacene a una temperatura de 2 a 8 °C.
PROPIETARIO Y NOMBRES COMUNES
Inmunoanálisis Enzimático para Progesterona
USO
Para la determinación cuantitativa de la concentración de Progesterona en suero o
plasma humano.
INTRODUCCIÓN
La Progesterona es un esteroide C21 que se sintetiza tanto en los tejidos como en el
colesterol circulante. El colesterol se transforma en pregnenolona, la cual más tarde es
convertida en progesterona por medio de una combinación de deshidrogenasa e isomerasa.
Los principales sitios de producción son las suprarrenales y los ovarios, y la placenta
durante el embarazo. La mayor parte de este esteroide se metaboliza a pregnanediol en el
hígado y se conjuga como un glucorónido antes de ser excretado por los riñones.
La progesterona tiene una gran variedad de efectos sobre los órganos. El rol principal de la
progesterona es mostrado por los órganos digestivos. En los varones, la progesterona es un
intermediario necesario para la producción de corticosteroides y andrógenos. En las
hembras, la progesterona permanece relativamente constante a lo largo de la fase folicular
del ciclo menstrual. Entonces la concentración aumenta rápidamente después de la
ovulación y permanece elevada por un período de 4 a 6 días y disminuye al nivel inicial 24
horas antes del comienzo de la menstruación. Durante el embarazo, la producción de
progesterona placentaria aumenta su nivel sostenidamente de 10 a 20 veces más que los
niveles pico de la fase lútea. En consecuencia, las medidas de progesterona se realizan para
determinar la ovulación así como para caracterizar defectos en la fase lútea. Otros usos del
análisis de progesterona, abarcan la terapia de progesterona y evaluaciones de la etapa
temprana de embarazo.
Los kits de Diagnostic Automation, Inc. Progesterone por EIA han sido diseñados para la
medición de progesterona total en suero o plasma humano.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
El Diagnostic Automation, Inc. progesterone EIA se basa en un principio de unión
competitiva entre la progesterona presente en la muestra de prueba y la progesterona-HRP
presente en el conjugado por una cantidad constante anti-progesterona de conejo. Se
incuban los pozos recubiertos con anticuerpo IgG de cabra anti-conejo con 25 μl de
estándares de progesterona, controles, muestras de pacientes, 100 μl de Reactivo
Conjugado de progesterona marcada con HRP y 50μl de reactivo de conejo antiprogesterona a temperatura ambiente (18-25°C) por 90 minutos. Durante la incubación, una
cantidad fija de progesterona marcada con HRP compite con la progesterona endógena en
el estándar, muestra, o suero control por un número fijo de sitios de unión de anticuerpos
específicos en la progesterona. Por lo tanto, la cantidad de conjugado peroxidasa de
progesterona unido inmunológicamente a los pozos disminuye progresivamente a medida
que la concentración de progesterona en las muestras aumenta.
El conjugado de peroxidasa progesterona no consolidado y se lavan los pozos. Luego, se
añade una solución de Reactivo TMB y se incuba a temperatura ambiente por 20 minutos,
teniendo como resultado un color azul. Se detiene el desarrollo del color agregando 1N
HCl, y se mide la absorbancia espectrofotométricamente a 450 nm. La intensidad del color
resultante es proporcional a la cantidad de enzima presente y está inversamente relacionada
a la cantidad de progesterona no marcada en la muestra. Se obtiene una curva de
calibración trazando la concentración del estándar contra la absorbancia. La concentración
de progesterona en las muestras y controles ejecutados al mismo tiempo con los estándares
se puede calcular de la curva de calibración.
REACTIVOS
Materiales proporcionados con el kit:
• Pozos de microtitulación recubiertos con anticuerpos de Cabra Anti-Conejo IgG, 96
pozos.
• Estándares de Referencia para Progesterona: 0, 0.5, 3.0, 10, 25, y 50 ng/ml. Líquidos,
0.5ml cada uno. Listos para usar.
• Reactivo de Conejo Anti-Progesterona (color rosado), 7 ml.
• Conjugado Concentrado de Progesterona-HRP (x11), 1.3 ml.
• Diluyente de Conjugado de Progesterona-HRP, 13 ml.
• Control de Progesterona 1, Líquido, 0.5 ml. Listo para usar.
• Control de Progesterona 2, Líquido, 0.5 ml. Listo para usar.
• Reactivo TMB (Un Paso), 11 ml.
• Solución Stop (1N HCl), 11 ml.
Materiales requeridos pero no proporcionados:
• Pipetas de precisión: 25 μl, 50 μl, 100 μl, 200 μl, y 1.0 ml.
• Puntas desechables de pipeta.
• Agua destilada o desionizada.
• Mezclador Vortex o equivalente.
• Papel absorbente o toallas de papel.
• Papel milimetrado Lineal-lineal.
• Lector de placa de microtitulación.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES PARA USUARIOS
No se dispone de métodos científicos que puedan asegurar por completo que el virus de la
Hepatitis B, Virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV/HTLV-III/LAV), u otros agentes
infecciosos estén ausentes en los reactivos de este kit. Por lo tanto, todos los productos de
sangre humana, incluyendo muestras de pacientes, deberían ser considerados
potencialmente infecciosos. Su manejo y disposición deben estar de acuerdo con los
procedimientos definidos por una regulación o guía de seguridad de riesgo biológico, en
donde este exista (ej., Manual Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories
1984 de los Centros de control de enfermedades/Institutos Nacionales de salud de los
Estados Unidos de Norteamérica.
RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS
1. Debe utilizarse suero o plasma EDTA.
2. No es necesario un tratamiento previo especial de la muestra.
3. Las muestras de suero o plasma deben almacenarse a una temperatura de 2 a 8°C por
hasta 24 horas, y congelarse a una temperatura de −10°C o menor por períodos más largos.
No utilice muestras considerablemente hemolizadas o lipémicas.
4. Por favor observe: Para el análisis no deben utilizarse muestras que contengan azida de
sodio.
ALMACENAMIENTO DEL KIT DE PRUEBA E INSTRUMENTACIÓN
Los kits de prueba que no han sido abiertos deben almacenarse a 2-8 °C después de
recibirse y la placa de microtitulación debe mantenerse en una bolsa sellada con desecantes
para evitar su exposición al la humedad. Los kits de prueba abiertos permanecerán estables
hasta la fecha de expiración si son almacenados como se indicó previamente. Un lector de
placa de microtitulación con un ancho de banda de 10nm o menor y un rango de densidad
óptica de 0-3 DO, con una longitud de onda de 450nm es aceptable para utilizarse en la
medición de absorbancia.
PREPARACIÓN DEL REACTIVO
1. Todos los reactivos deben llevarse a temperatura ambiente (18-25°C) antes de
utilizarse.
2. Para preparar el Reactivo de trabajo conjugado Progesterona-HRP, agregue 0.1 ml de
Concentrado de Conjugado de Progesterona-HRP (11x) a 1.0 ml de Diluyente de
Conjugado de Progesterona-HRP (dilución 1:10 y mezcle bien9. La cantidad de conjugado
diluido depende del tamaño de su ensayo. Deseche el exceso después de su uso.
3. Las muestras con concentraciones de progesterona sobre los 50 ng/ml deben ser
cuantificadas por dilución con el diluyente del que disponga su proveedor.
PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PARA EL SUERO Y PLASMA
1. Asegure el número deseado de pozos recubiertos en el soporte.
2. Dispense 25 μl de estándares, pruebas y controles a los pozos apropiados.
3. Dispense 100 μl de Reactivo conjugado de trabajo Progesterona-HRP a cada pozo.
4. Dispense 50 μl de reactivo de conejo anti-progesterona a cada pozo. Mezcle bien por 30
segundos. Es muy importante mezclar bien.
5. Incube a temperatura ambiente (18-25°C) por 90 minutos.
6. Enjuague y sacuda los micropozos 5 veces con agua destilada o desionizada. (Por favor,
no use agua del grifo.)
7. Dispense 100 μl de Reactivo TMB en cada pozo. Mezcle suavemente por 5 segundos.
8. Incube a temperatura ambiente (18-25°C) por 20 minutos.
9. Detenga la reacción agregando 100 μl de Solución Stop a cada pozo.
10. Mezcle suavemente por 30 segundos. Es importante asegurarse de que el color azul
cambie completamente a amarillo.
11. Lea la absorbancia a 450 nm con un lector de pozo de microvaloración en un período
de 15 minutos.
CÁLCULO DE RESULTADOS
1. Calcule el valor de la media de absorbancia (A450) para cada set de estándares de
referencia, controles y muestras.
2. Construya una curva de calibración trazando la media de absorbancia obtenida por cada
estándar de referencia contra su concentración en ng/ml en un papel milimetrado lineallineal, con los valores de absorbancia en el eje vertical o Y, y las concentraciones en el eje
horizontal o X.
3. Use los valores de la media de absorbancia de la curva de calibración en cada muestra
para determinar la correspondiente concentración de Progesterona en ng/ml.
4. Cualquier valor obtenido de mezclas diluidas deben ser convertidas posteriormente
aplicando el factor de dilución apropiado en los cálculos.
EJEMPLO DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN
Los resultados de un procedimiento estándar típico con lecturas de densidad óptica a
450nm mostrados en el eje Y contra las concentraciones de Progesterona mostradas en el
eje X. Nota: Esta curva de calibración tiene como único propósito ilustrar y no debería
utilizarse para calcular datos desconocidos. Cada laboratorio debe obtener sus propios datos
y curva de calibración.
Progesterona (ng/ml)
0
0.5
3
10
25
50
Absorbancia (450nm)
Absorbancia (450nm)
3.576
2.730
2.215
1.679
1.148
0.718
Conc. Progesterona ng/ml
VALORES ESPERADOS Y SENSIBILIDAD
Cada laboratorio debería establecer su propio rango normal basado en su población de
pacientes. La prueba de Progesterona EIA fue aplicada en muestras de pacientes de
laboratorio clínico seleccionadas aleatoriamente. Los resultados son como se muestra a
continuación:
Varones:
Hembras:
Embarazo:
Adultos
Pre-pubertos (niños)
Fase Folicular
Fase Lútea
Post Menopáusicas
0.13 − 0.97 ng/ml
0.70 − 0.52 ng/ml
0.15 – 0.70 ng/ml
2.00 – 25.0 ng/ml
0.06 – 1.60 ng/ml
1er trimestre
2do trimestre
3er trimestre
10.3 – 44.0 ng/ml
19.5 – 82.5 ng/ml
65.0 – 229 ng/ml
SENSIBILIDAD
El nivel más bajo detectable de progesterona en esta prueba es de 0.05 ng/ml.
ESPECIFICIDAD
Los siguientes materiales han sido analizados en búsqueda de reactividad cruzada. El
porcentaje indica reactividad cruzada a un 50% de desplazamiento comparado con la
Progesterona.
En la siguiente tabla, se encuentran resumidos datos de la reactividad cruzada de muchos
esteroides endógenos y farmacéuticos:
Reactividad cruzada (%) = Concentración de Progesterona Observada ×
100
Concentración de Esteroides
Esteroide
Progesterona
Androsterona
Corticosterona
Cortisona
Colesterol
Estradiol
Estrona
Estriol
Prednisolona
Testosterona
Reactividad Cruzada
100%
0.086%
0.74%
0.11%
<0.08%
<0.01%
0.08%
<0.024%
0.075%
0.1%
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
1. Se obtendrán resultados reproducibles y confiables si el procedimiento de análisis se
lleva a cabo con una buena comprensión de las instrucciones del inserto del paquete,
combinado con una buena práctica de laboratorio.
2. El procedimiento de lavado es crítico. Un lavado insuficiente tendrá como resultado poca
precisión y lecturas de absorbancia falsamente elevadas.
3. Los resultados obtenidos del uso de este kit sólo deben ser utilizados junto a otros
procedimientos de diagnóstico y la información de la que disponga el médico.
CONTROL DE CALIDAD
Una Buena práctica de laboratorio, requiere que los controles sean ejecutados con una
curva de calibración. Una cantidad de controles estadísticamente significativa debe ser
analizada para establecer el valor de la media y rangos aceptables para asegurar un buen
desempeño. Recomendamos utilizar los inmunoensayos de control de sueros Bio-Rad
Lyphochek como controles. El kit de Progesterona EIA también contiene controles
internos, Niveles 1 y 2.
REFERENCIAS
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and Abnormal Early Pregnancy, Fertility and Sterility, 30, 398-402, (1978.)
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Par. Sci., 65, 783- 800, (1976.)
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and Progesterone in Eliciting the Midcycle Luteinizing Hormone and Follicle-Stimulating
Hormone Surges, Jour. Clin. Endo. And Metab. 49, 507-513, (1979.)
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Textbook of Endocrinology, R.H. Williams ed., pp. 355-407, W.B. Saunders, Phil. (1981.)
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6. Shepard, M.K., and Fainstat, T., Comparison of Serum Progesterone and Endometrial
Biopsy for Confirmation of Ovulation and Evaluation of Luteal Function. Fertility and
Sterility, 28: 541, (1977.)
7. Johansson, E.D., and Johansson, L.E., Progesterone Levels in Amniotic Fluid and
Plasma from Women. I. Levels During Normal Pregnancy. Acta, Obstet. Gynecol. Scand.,
50: 339, (1971.)
8. USA Center for Disease Control/National Institute of Health Manual, “Biosafety in
Microbiological and Biomedical Laboratories"” 1984.
DIAGNOSTIC AUTOMATION, INC.
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Fecha de Revisión: 4-10-06