Identificación y análisis funcional de genes implicados en el

Transcripción

Universidad de León, Facultad de Biología
Departamento de Ecología, Genética y Microbiología
Identificación y análisis funcional de genes implicados en
el catabolismo del ácido glucónico en Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032
Michal Letek Polberg
León, 2002
Agradecimientos
Deseo expresar mi agradecimiento a todas las personas que me han apoyado y ayudado durante
la realización de este trabajo y muy especialmente:
Al Dr. Luis Mariano Mateos, por su dirección, esfuerzo y constante interés.
Al Dr. José Antonio Gil, por su dirección y apoyo.
A mi madre, porque se lo merece.
Y a todos mis compañeros de laboratorio, por estar siempre dispuestos a prestarme su ayuda y
experiencia, en especial a Noelia, Angelina y Juan Pablo.
Memoria presentada por Michal Letek Polberg,
Licenciado en Biología, para optar al
Grado de Licenciado en Biología.
León, 2002
A Patricia.
Indice
1. Introducción
1.1 Características generales de corinebacterias
1.1.1 Características generales del género Corynebacterium
1.2 Genética y biología molecular de las corinebacterias
1.2.1 Vectores de clonación
1
3
6
7
8
1.2.1.1 Plásmidos
8
1.2.1.2 Fagos y sus derivados
9
1.2.1.3 Transposones y elementos de inserción
1.2.2 Métodos de introducción de DNA exógeno en corinebacterias
10
10
1.2.2.1 Transformación de protoplastos
10
1.2.2.2 Electroporación o electrotransformación
10
1.2.2.3 Conjugación
11
1.2.3 Clonación de genes en corinebacterias
11
1.2.4 Expresión de genes en corinebacterias
12
1.2.4.1 Regiones reguladoras: promotores, operadores y terminadores
1.2.5 Mecanismos de regulación de la expresión génica a nivel de
transcripción: inducción y represión catabólica
12
13
1.2.5.1 Sistemas inducibles y de represión catabólica
14
1.3 Metabolismo del ácido glucónico en bacterias
15
1.4 Genes implicados en el metabolismo del glucónico en bacterias
18
1.4.1 Genes gnt en Escherichia coli
18
1.4.2 Genes gnt en Bacillus
21
1.5 Producción y aplicaciones del ácido glucónico y sus derivados
22
1.6 Uso de bases de datos en campos científicos
23
1.6.1 Aplicaciones bioinformáticas de tipo heurístico
1.7 Objetivos del presente trabajo
2. Materiales y Métodos
2.1 Materiales
2.1.1 Reactivos químicos, bioquímicos y enzimas comerciales
2.1.1.1 Ácidos nucleicos
23
27
28
30
30
30
2.1.2 Microorganismos utilizados
30
2.1.3 Plásmidos utilizados
31
2.1.4 Medios usados y condiciones de cultivo
31
2.1.4.1 Medios de cultivo para E. coli
32
2.1.4.2 Medios de cultivo para C. glutamicum
32
2.1.4.3 Antibióticos y otros aditivos
32
2.1.5 Soluciones de uso general
33
2.1.6 Conservación de las cepas bacterianas
33
2.2 Métodos para el análisis de ácidos nucleicos
34
2.2.1 Preparación del DNA
34
2.2.1.1 Aislamiento de DNA total de corinebacterias
34
2.2.1.2 Minipreparación de DNA plasmídico de E. coli
34
2.2.1.3 Preparación de DNA plasmídico de E. coli mediante lisis alcalina
35
2.2.2 Métodos de limpieza y conservación de ácidos nucleicos
2.2.2.1 Fenolización y concentración del DNA
2.2.3 Manipulación del DNA
36
36
37
2.2.3.1 Digestión del DNA con enzimas de restricción
37
2.2.3.2 Desfosforilación de los extremos 5´-fosfato libres del DNA
38
2.2.3.3 Ligación de fragmentos de DNA
38
2.2.3.4 Electroforesis de DNA en geles de agarosa
39
2.2.3.5 Extracción de fragmentos de DNA de geles de agarosa-TAE
40
2.2.4 Técnicas de introducción de DNA en bacterias
2.2.4.1 Transformacion en E. coli
2.2.4.2 Obtención de células de E. coli competentes por el método del cloruro de
rubidio
40
40
40
2.2.4.3 Transformación de células competentes de E. coli
41
2.2.4.4 Selección por color de los transformantes
41
2.2.4.5 Conjugación en corinebacterias
42
2.2.5 Técnicas de hibridación de DNA
42
2.2.5.1 Transferencia de DNA desde un gel de agarosa a un soporte sólido
43
2.2.5.2 Marcaje de DNA con digoxigenina
43
2.2.5.3 Hibridación
44
2.2.5.4 Detección colorimétrica
45
2.2.6 Reacción en cadena de la DNA polimerasa
46
2.2.7 Técnicas de secuenciación de DNA
47
2.2.6.1 Determinación de la secuencia de nucleótidos
47
2.2.6.1 Métodos de análisis informático de secuencias
48
3. Resultados
3.1 Fundamentos del presente trabajo de investigación
3.2 Identificación del gen gntK (gluconato kinasa) en el genoma de
Corynebacterium glutamicum
3.2.1 Amplificación del hipotético gen gntK por Reacción en Cadena
de la Polimerasa (PCR)
49
51
51
53
3.2.2 Subclonación del gen gntK
53
3.2.3 Secuenciación y análisis del gen gntK
54
3.2.4 Interrupción del gen gntK en corinebacterias
56
3.2.5 Conjugación E. coli-corinebacterias y análisis de los
transconjugantes
3.2.6 Comprobación de interrupción del gen gntK por hibridación
Southern
3.2.7 Análisis nutricional de los transconjugantes obtenidos
3.3 Interrupción del gen gntP (gluconato permeasa)
58
58
60
61
3.3.1 Hibridación Southern
62
64
3.4 Mapa físico de Corynebacterium glutamicum
3.5 Análisis de la disposición cromosómica de los genes gnt en C.
glutamicum
3.6 Aplicaciones prácticas del presente trabajo
65
70
72
4. Conclusiones
73
5. Bibliografía
76
Abreviaturas
A adenina
AMPc AMP cíclico
ATCC American Type Culture Collection (colección
americana de cepas tipo)
BCIP 5-bromo,1-cloro,3indolil-fosfato
BrEt bromuro de etidio
CIA cloroformo isoamílico
CRP proteína reguladora del catabolismo
ddNTP cualquiera de los cuatro didesoxinucleótidos
(ddATP, ddCTP, ddGTP y ddTTP)
AMP ácido adenosín-5´-fosfato
Ap ampicilina
ATP adenosina-5´-fosfato
bla gen de resistencia a ampicilina
C citosina
col colaboradores
Da dalton
DMSO dimetilsulfóxido
DNA ácido desoxirribonucleico
DNasa desoxirribonucleasa
dNTP cualquiera de los cuatro desoxinucleótidos
(dATP, dCTP, dGTP y dTTP)
DO densidad óptica
EDTA ácido etileno-diamino tetracético
ER endonucleasa de restricción
G guanina
g gramos
IPTG 1-isopropil-!-D-1-tiogalacto- piranósido
IS elemento de inserción
kan gen de resistencia a kanamicina
Kb kilobases (1000 pb)
Km Kanamicina
KDa kilodaltons
l litro
M molar
mM milimolar
mm milímetros
Mb megabases
mb milibares
MCS mutiple cloning site (sitio de clonación múltiple)
mg miligramos
ml mililitros
MOPS ácido morfolinopropanosulfónico
mRNA RNA mensajero
NBT azul de nitrotetrazolio
ORF open reading frame (marco de lectura abierto)
ori origen de replicación
pb pares de bases
PCR Reacción en Cadena de la DNA Polimerasa
PEG polietilén glicol
pH logaritmo negativo de la concentración de
hidrogeniones
r.p.m. revoluciones por minuto
R
RNA ácido ribonucleico
RNasa ribonucleasa
RNAr RNA ribosomal
SSC tampón de cloruro y citrato de sodio
SDS dodecilsultfato sódico
T timina
TAE tampón tris-acetato
Tn transposón
Tris tris (hidroximetil) aminometano
Tris-HCl hidrocloruro de Tris
U uracilo
UV ultravioleta
V voltios
wt cepa silvestre
X-Gal 5-bromo,4-cloro,3-indolil-!-D-galactopiranósido
µg microgramos
:: indica que la cepa contiene el plásmido señalado
indica resistencia
Aminoácidos
Ala
Alanina
A
Arg
Arginina
R
Asn
Asparragina
N
Asp
Acido Aspártico
D
Cys
Cisteína
C
Gln
Glutamina
Q
Glu
Acido Glutámico
E
Gly
Glicina
G
His
Histidina
H
Ile
Isoleucina
I
Leu
Leucina
L
Lys
Lisina
K
Met
Metionina
M
Phe
Fenilalanina
F
Pro
Prolina
P
Ser
Serina
S
Thr
Treonina
T
Trp
Triptófano
W
Tyr
Tirosina
Y
Val
Valina
V
1
Introducción
1. Introducción
1.1 Características generales de corinebacterias
Las corinebacterias son bacilos Gram-positivos, pleomórficos, no ramificados, no
esporulados, catalasa positivos, oxidasa negativos, cuyo tamaño oscila entre 2-6 µm de
longitud y 0.5 µm de diámetro. En función de los requerimientos de oxígeno, se pueden
dividir en bacterias aerobias o anaerobias facultativas, grupo en el que se incluyen los
géneros Brevibacterium y Corynebacterium respectivamente; y bacterias anaerobias o
aerotolerantes, como es el caso de los géneros Eubacterium y Propionibacterium (Jones
y Collins, 1986). El pleomorfismo en su ciclo de vida se observa en formas bacilares de
longitud diversa y frecuentes engrosamientos en los extremos, estando marcadamente
influido por las condiciones del cultivo (Cure y Keddie, 1973).
Sneath y col. (1986) en la novena edición del manual Bergey, incluyen a las
corinebacterias en la sección 15 que engloba una diversa colección de 22 géneros. La
inclusión de las corinebacterias en esta sección se basó más en criterios prácticos (Jones
y Collins, 1986), que en fuertes relaciones filogenéticas entre las corinebacterias y los
géneros restantes. Basándose en la composición de su pared, las corinebacterias parecen
estar próximas filogenéticamente a Mycobacterium y Nocardia (Barksdale, 1970). A
partir de estudios de RNAr 16S de un gran número de microorganismos, se ha agrupado
a las corinebacterias en la subdivisión de eubacterias Gram-positivas de alto contenido
en G+C, en estrecha relación filogenética con Arthrobacter, Mycobacterium, Nocardia
e incluso Streptomyces (Woese, 1987); Goodfellow (1989) define a su vez el grupo de
actinomicetos nocardiformes el cual contiene los géneros Corynebacterium,
Mycobacterium, Gordonia, Nocardia, Rhodococcus y Tsukanella, y cuya característica
principal es la presencia en la pared celular de ácidos micólicos y sus derivados. En
concordancia con los criterios filogenéticos indicados, en la nueva edición del Manual
Bergey (de próxima aparición y que contiene 30 secciones distribuidas en 5 volúmenes)
las corinebacterias aparecen en el volumen 4, sección XXIII, conjuntamente con el
resto de microorganismos Gram-positivos de elevado contenido en G+C en lo que
constituye
la
clase
Actinobacteria
y
enclavándose
Corynebacterineae (Garrity y col., 2002) (Fig. 1.1.).
dentro
del
suborden
Dominio Bacteria
!
Phylum Actinobacteria phy. nov.
! Clase I. Actinobacteria (Bacterias Gram-positivas de alto contenido en G+C)
! Subclase V. Actinobacteridae
! Orden I. Actinomycetales
! Suborden V. Actinomycineae
! Familia I. Actinomycetaceae
! Género I. Actinomyces
! Género III. Arcanobacterium
! Suborden VI. Micrococcineae
! Familia I. Micrococcaceae
! Género I. Micrococcus
! Género II. Arthrobacter
! Familia V. Brevibacteriaceae
! Género I. Brevibacterium linens
! Familia VI. Cellulomonadaceae
! Género I. Cellulomonas
! Familia XII. Microbacteriaceae
! Género I. Microbacterium
! Género III. Agromyces
! Género IV. Aureobacterium
! Suborden VII. Corynebacterineae
! Familia I. Corynebacteriaceae (Bacterias corineformes)
! Género I. Corynebacterium
! Corynebacterium diphtheriae
! Corynebacterium glutamicum
! Familia IV. Mycobacteriaceae
! Género I. Mycobacterium
! Familia V. Nocardiaceae
! Género I. Nocardia
! Género II. Rhodococcus
! Suborden IX. Propionibacterineae
! Familia I. Propionibacteriaceae
! Género I. Propionibacterium
! Suborden XI. Streptomycineae
! Familia I. Streptomycetaceae
! Género I. Streptomyces
! Suborden XIII. Frankineae
! Familia I. Frankiaceae
! Género I. Frankia
Figura 1.1.- Algunos de los microorganismos más importantes englobados en el orden Actinomycetales
según el “Taxonomic Outline of the Procaryotes, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Second
Edition” (http://www.springer-ny.com/bergeysoutline/main.htm).
Las corinebacterias están ampliamente distribuidas en la naturaleza encontrándose
en el suelo, el agua y también en la mucosa y piel del hombre y animales. Algunas
especies pertenecientes a este grupo son conocidas por sus efectos patógenos en
humanos y otros animales, así como por su patogenicidad en plantas; la especie
patógena de corinebacterias más conocida es Corynebacterium diphtheriae, que
adquiere la capacidad de producir la toxina diftérica cuando es lisogenizada por el fago
! (Costa y col., 1981). Otras especies patógenas del hombre son: Corynebacterium
amicolatum, Corynebacterium striatum, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium
urealyticum y Corynebacterium xerosis (Oteo y col., 2001; Lagrou y col., 1998; Boc y
Martone, 1995; Pitcher y col., 1992; Kono y col., 1983); todas estas especies son
patógenos de especial relevancia en pacientes inmunodeprimidos. Entre las especies
patógenas de otros animales destacan: Corynebacterium bovis, Arcanobacterium
pyogenes, Corynebacterium renale, y Rhodococcus equi (Watts y col., 2001; Fernández
y col., 2001; Hirsbrunner y col., 1996; Vengust y col., 2002).
Carlson y Vidaver (1982) reconocieron la existencia de 14 especies de
corinebacterias fitopatógenas, siendo las más conocidas Corynebacterium fascians,
Corynebacterium flaccumfaciens y Corynebacterium michiganensis como causantes de
graves infecciones en diferentes especies de plantas, generando de esta forma graves
pérdidas en la agricultura. Actualmente todos los géneros de corinebacterias
fitopatógenas del género Corynebacterium han sido reclasificados, pasando a los
géneros Curtobacterium, Rhodococcus y Clavibacter en la mayoría de los casos
(Goodfellow, 1984; Davis y col., 1984). Así pues la nueva clasificación engloba a
Rhodococcus fascians, causante de fasciación e hiperplasias en una extensa variedad de
plantas (Cornelis y col., 2002), Curtobacterium flaccumfaciens,
que provoca
marchitamientos en alubias, remolacha (Tegli y col., 2002) y Clavibacter
michiganensis, causante de marchitamiento y roya en plantas de patata y tomate (Brown
y col., 2002).
Un grupo de corinebacterias no patógenas presenta la capacidad de excretar ácido
glutámico en grandes cantidades, por lo que al grupo se le denominó bacterias del ácido
glutámico e incluyen especies de los géneros Corynebacterium, Brevibacterium, y
Arthrobacter (Abe y col., 1967). Este grupo de bacterias presenta un estrecho rango de
contenido en G+C en el DNA total (53-56 %) y elevada similitud morfofisiológica. Las
especies no patógenas de corinebacterias son utilizadas en procesos industriales de gran
relevancia, como los ya indicados de producción de aminoácidos (Aida y col., 1986;
Yamada y col., 1972), en la producción de nucleótidos y otros factores nutricionales
(Martín, 1989), bioconversión de esteroides (Constantinides, 1980), degradación de
hidrocarburos (Cooper y col., 1979), maduración de quesos (Lee y col., 1985),
producción de enzimas (Khurana y col., 2000) y otros procesos con interés desde el
punto de vista aplicado. Algunas especies son productoras de metabolitos semejantes a
los antibióticos: bacteriocinas del tipo corinecinas-linocinas (Kerry-Williams y Noble,
1984; Suzuki y col., 1972; Valdes-Stauber y Scherer, 1996) ), agentes antitumorales
(Milas y Scott, 1978), etc.
1.1.1 Características generales del género Corynebacterium
El género Corynebacterium fue creado por Lehmann y Neumann (1896) para
clasificar taxonómicamente a los bacilos de la difteria, incluyendo posteriormente otras
especies similares parásitas de animales. El género fue definido en base a características
morfológicas, corynebacteria proviene del griego "#$%&' (corunë): bastón nudoso y,
!(")*$+#& (bacterion): bastoncillo.
El género Corynebacterium es muy diverso y contiene especies importantes desde el
punto de vista médico, así como saprófitos y especies no patógenas utilizadas en
procesos industriales; sus hábitats son muy variados, pudiendo aparecer en heces, suelo,
piel, plantas, etc., y están ampliamente distribuidos en la naturaleza. Las características
más relevantes de este género fueron descritas por Collins y Cummins (1986), y
coinciden con las características generales descritas para corinebacterias: Grampositivas, no esporuladas, que carecen de movilidad, bacilos rectos o ligeramente
curvados, a menudo con la típica forma de V (lo que también se denomina “forma de
letras chinas”), aunque también aparecen formas elipsoidales, son aerobias o anaerobias
facultativas, catalasa positivas, quimioorganotrofos, con un contenido en G+C entre 51–
65%. Presentan ácido mesodiaminopimélico en el tetrapéptido de la mureína y en su
pared están presentes arabino-galactanos y ácidos corinemicólicos (ácidos micólicos de
22 a 36 átomos de carbono) (Fig. 1.2).
Figura 1.2.- Pared celular de Corynebacterium. MP: membrana plasmática; PG: peptidoglucano o
mureína; AG: arabino-galactanos; CC: capa cérea conteniendo ácidos corinemicólicos; P: porina (Puech
y col., 2001).
Con respecto a la especie Corynebacterium glutamicum originalmente se denominó
Micrococcus glutamicus; el término Micrococcus se debe a que en fase tardía del
crecimiento exponencial y en la fase estacionaria, pasan a tener un aspecto de bacilo
corto o incluso cocoide, perdiendo el aspecto bacilar característico de la fase temprana
de crecimiento exponencial. El término glutamicus se debe a su capacidad de producir
ácido glutámico en condiciones aeróbicas (Abe y col., 1967). C. glutamicum es un
bacilo que aparece de forma individual, en parejas, o formando masas irregulares; la
morfología de las colonias cuando crecen sobre agar es de aspecto suave, circular y de
color amarillento, siendo el rango de temperatura óptima de crecimiento entre 25 y
37ºC. Con respecto a los requerimientos nutricionales, todos ellos necesitan biotina para
su crecimiento y algunas cepas requieren además tiamina y ácido p-aminobenzoico
(PABA) (Collins y Cummins, 1986).
1.2 Genética y biología molecular de las corinebacterias
Desde los años 80 las corinebacterias han sido objeto de especial atención en el
campo de la ingeniería genética y la biología molecular y fruto de ello ha sido el
desarrollo de sistemas de clonación molecular que han servido para estudiar en
profundidad aspectos básicos de la biología de este grupo de bacterias. Los estudios
iniciales usando la temperatura de fusión del DNA cromosómico (Tm) de algunos de sus
representantes del grupo permitió estimar el tamaño del cromosoma en unas 3.000 Kb
(Wallace y Morowitz, 1973). Estudios más detallados utilizando técnicas de
electroforesis en campo pulsante determinaron de forma más precisa el tamaño del
genoma de algunas especies pertenecientes a este grupo: 3.082 Kb para
Corynebacterium glutamicum (Bathe y col., 1996), 2.850 Kb para Brevibacterium
ammoniagenes (Bak y col., 1970; Crombach, 1978) y 3.105 Kb para Brevibacterium
linens. Recientemente se ha descrito la secuenciación del genoma completo de
Corynebacterium glutamicum y el tamaño del genoma ha resultado ser de 3.309 Kb
(Nakagawa y col., 2000).
El desarrollo de un sistema de clonación molecular en corinebacterias implicó la
utilización de una serie de herramientas y técnicas de uso común como fueron: A)
búsqueda de vectores endógenos o funcionales en corinebacterias B) desarrollo y
optimización de los procesos de transferencia de material genético a las corinebacterias.
1.2.1 Vectores de clonación
1.2.1.1 Plásmidos
En sus inicios no se conocían vectores capaces de replicar en corinebacterias, por lo
que se hizo necesaria una búsqueda de plásmidos endógenos. Los primeros plásmidos se
aislaron de cepas de corinebacterias procedentes de pacientes y contenían marcadores
de resistencia a antibióticos (Fig. 1.3). Sin embargo, aunque estos plásmidos contienen
marcadores fenotípicos de fácil selección, su manipulación no resultaba útil debido a su
gran tamaño y a su bajo número de copias.
Plásmidos
Cepa de origen
Tamaño (Kb)
Fenotipo de
resistencia
pXZ10145
pNG2
pAG1
pCG4
pTP10
pDG101
Antimonio
C. glutamicum
C. diphteriae
C. melassecola
C. glutamicum ATCC31830
C. xerosis
C. flacumfaciens subsp. oorti
5,3
14,4
20,4
29
45
69
Cm
Em
Tc
Sm, Spc
Tc, Cm, Em, Sm
Arsenito, Arseniato,
Figura 1.3.- Plásmidos de resistencia en Corynebacterium (Deb y Nath, 1999). Cm, cloramfenicol; Sm,
estreptomicina; Em, eritromicina; Spc, espectinomicina; Tc, tetraciclina.
Plásmidos
pCR1
pHM1519
pSR1
pCG100
pCG1
pCL1
pCC1
pBL1
pWS101
pGX1901
pX18
pBL100
pRBL1
Especie
C. renale
C glutamicum ATCC13058
C. lilium
C. callunae NRRLB2244
B. lactofermentum ATCC13869
B. linens CECT75
B. linens RBL
Tamaño (Kb)
1,4
2,7
3
3
3,2
4,1
4,2
4,4
4,4
4,4
4,5
7,5
8
Origen
Animal
Suelo
Suelo
Suelo
Suelo
Suelo
Suelo
Suelo
Suelo
Suelo
Suelo
Suelo
Suelo
Figura 1.4.- Plásmidos crípticos de pequeño tamaño en los géneros Corynebacterium y Brevibacterium
(Deb y Nath, 1999).
La mayor parte de los plásmidos endógenos de pequeño tamaño son crípticos,
careciendo de marcadores fenotípicos que puedan ser utilizados para la selección de
colonias transformantes. Los vectores de clonación para corinebacterias se construyeron
ligando pequeños plásmidos (crípticos) aislados de corinebacterias (Fig. 1.4) con otros
vectores construidos para otros microorganismos, que llevaban marcadores fácilmente
seleccionables.
La primera generación de vectores de clonación para corinebacterias fue descrita por
Santamaría y col. (1984) utilizando los plásmidos pBL1 y pBR322 y posteriormente se
introdujo el gen de resistencia a kanamicina del transposón Tn5. Vectores de clonación
más eficaces conteniendo un segundo marcador fueron desarrollados por Santamaría y
col. (1987) a partir del replicón pBL1, obteniendo los plásmidos pULRS6 (resistencias a
kanamicina e higromicina) y pULRS8 (resistencias a kanamicina y cloranfenicol).
En Corynebacterium glutamicum se expresaron todos los marcadores de resistencia
introducidos, pero en la mayoría de los casos resultaron ser marcadores de selección
poco eficaces, ya que los niveles existentes de las enzimas inactivadoras de los distintos
antibióticos eran muy inferiores a los que se detectan en Escherichia coli.
En una siguiente fase se diseñaron vectores sonda para la clonación de promotores
en corinebacterias, como el plásmido bifuncional (E. coli-corinebacterias) pEB003
(Morinaga y col. 1987a), así como otros vectores sonda de promotores que contenian
diferentes genes testigo (Barák y col., 1990; Cadenas y col., 1991 y 1996).
El rango de hospedadores de los plásmidos de corinebacterias suele ser estrecho, sin
embargo algunos de los plásmidos analizados han sido capaces de replicar y mantenerse
estables en hospedadores heterólogos; este es el caso del plásmido pCG4 de
Corynebacterium
glutamicum,
introducido
en
Corynebacterium
herculis,
Brevibacterium flavum y Mycobacterium ammoniaphilum (Katsumata y col., 1984), o
derivados del pBL1 que transforman Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium
callunae, Brevibacterium linens (Santamaría y col., 1985) y Rhodococcus fascians
(Fernández-González y col., 1994).
1.2.1.2 Fagos y sus derivados
Ozaki y col. (1984) describieron tres fagos de C. glutamicum (,CG1, ,CG3 y
,CG5) que transfectan protoplastos de Corynebacterium, Brevibacterium y
Microbacterium. Otros autores han descrito nuevos fagos para su utilización en sistemas
de clonación en corinebacterias (Smith y col., 1986; Trautwetter y Blanco, 1988). El
fago temperado !16 de Corynebacterium glutamicum ATCC 21792 ha sido usado en la
construcción de un vector de integración (Moreau y col., 1999), mientras que otros
fagos han sido desarrollados con objeto de usarlos para la clonación de secuencias con
actividad promotora y terminadora (Koptides y col., 1992). Miwa y col. (1985) han
descrito el primer cósmido de corinebacterias.
1.2.1.3 Transposones y elementos de inserción
Se han identificado en C. glutamicum los elementos de inserción IS1206 (Bonamy y
col., 1994), IS31831 (Vertés y col., 1994) e ISCg2 (Quast y col. 1999); los dos primeros
describieron a su vez la construcción de dos transposones artificiales, Tn31831 y
miniTn31831 que pueden ser utilizados para producir mutagénesis por inserción en este
grupo de microorganismos. En B. lactofermentum se ha descrito el elemento de
inserción IS13869 que presenta una elevada homología con los descritos para C.
glutamicum (Correia y col., 1996).
1.2.2. Métodos de introducción de DNA exógeno en corinebacterias
Este es un proceso clave en el desarrollo de las técnicas de ingeniería genética que
en el caso de las corinebacterias su dificultad se ve incrementada debido a la
composición y complejidad de la pared celular.
1.2.2.1 Transformación de protoplastos
Los primeros métodos de transformación de estas bacterias se basaron en la
obtención
de protoplastos que fueron obtenidos por primera vez por Kaneko y
Sakaguchi en 1979. Los protocolos para transformar protoplastos de corinebacterias han
sido descritos por Santamaría y col. (1984 y 1985), Katsumata y col. (1984), Yoshihama
y col. (1985). Estos protocolos implican degradación parcial de la pared celular con
lisozima, captación del DNA por los protoplastos mediado por PEG y posterior
regeneración y selección de los protoplastos transformados. La acción de la lisozima es
facilitada al crecer las células al principio de la fase logarítmica en presencia de
penicilina en el caso de Brevibacterium o de glicina en el caso de Corynebacterium.
1.2.2.2 Electroporación o electrotransformación
La eficiencia de transformación se ve incrementada cuando las células son
sometidas a pulsos eléctricos de alto voltaje, denominándose a este proceso
electroporación o electrotransformación. Un gran número de autores ha descrito las
condiciones de cultivo de las células y los parámetros óptimos para obtener una alta
eficiencia de transformación en diferentes especies de corinebacterias (Dunican y
Shivnan, 1989; Kurusu y col., 1990; Hayness y Britz, 1990; Bonnassie y col., 1990;
Van der Rest y col., 1999), siendo algunas de las constantes la recolección de las células
en fases tempranas del crecimiento exponencial y la utilización de agentes que
sensibilicen la pared (glicina, penicilina, etc.).
Los sistemas de restricción presentes en corinebacterias constituyen una barrera para
la entrada eficiente de DNA exógeno. Estos sistemas se pueden contrarrestar por
calentamiento de los protoplastos a 48-49ºC durante diez minutos antes de ser
transformados (Thierbach y col., 1988).
1.2.2.3 Conjugación
La conjugación entre bacterias Gram-negativas y corinebacterias fue descrita por
primera vez por Schäfer y col. (1990); estos autores conjugaron eficientemente diversas
cepas de corinebacterias utilizando E. coli S17-1 como cepa donadora en el proceso y
diferentes especies de corinebacterias como receptoras. La eficiencia de transferencia
mediante conjugación en C. glutamicum se incrementa mediante un pretratamiento de
las células receptoras con calor, solventes orgánicos, cambios de pH o detergentes
(Schäfer y col., 1994).
1.2.3 Clonación de genes de corinebacterias
Hasta ahora, se han aislado y caracterizado un número importante de genes
procedentes de corinebacterias, con una amplia representación de genes cuyos
productos están implicados en la biosíntesis de metabolitos de interés industrial,
especialmente aminoácidos (Cremer y col., 1990, 1991; Ishino y col. , 1987; Kalinowski
y col., 1990; Yeh y col., 1988a, 1988b). El desarrollo de los sistemas de clonación en
corinebacterias ha permitido, por lo tanto la clonación, caracterización y expresión de
estos genes, pudiendo así esclarecer los mecanismos que regulan los procesos de
expresión génica y contribuyendo de esta forma al conocimiento de los procesos de
biosíntesis de aminoácidos en corinebacterias.
Las estrategias empleadas para la clonación de genes de corinebacterias han sido
variadas y en algunos casos no exentas de ingenio; a continuación se enumeran los
procedimientos más utilizados: (i) complementación heteróloga de auxótrofos de E.
coli, (ii) complementación homóloga de auxótrofos, (iii) hibridación de DNA total con
sondas homólogas, (iv) clonación mediante amplificación de secuencias por PCR, (v)
detección de la actividad enzimática codificada por el gen, (vi) efecto del número de
copias del gen clonado en la resistencia a análogos de aminoácidos.
1.2.4 Expresión de genes en corinebacterias
Como se ha indicado anteriormente uno de los sistemas de clonación de genes ha
sido la clonación y expresión heteróloga de los genes de corinebacterias en E. coli
(Mateos y col, 1987; Guerrero y col., 1988; Eikmanns y col. 1992), siendo esta una
prueba de que los genes de corinebacterias son eficientemente expresados en otros
hospedadores, al igual que genes de E. coli y algunos otros microorganismos han sido
expresados eficientemente en corinebacterias (Katsumata y col., 1982; Tsuchiya y
Morinaga, 1988; Smith y col., 1986; Archer y col., 1989; Paradis y col., 1987; Cadenas
y col., 1992). No ocurre lo mismo con la expresión de genes de Streptomyces en
corinebacterias, donde parece existir una barrera transcripcional; en ocasiones esta
barrera se ha evitado por sustitución de las regiones reguladoras originales por
promotores funcionales en corinebacterias (Cadenas y col., 1992).
1.2.4.1 Regiones reguladoras: Promotores, operadores y terminadores
Los análisis de regiones del DNA adyacentes a los genes en corinebacterias han
puesto de manifiesto la existencia de cajas promotoras análogas a las descritas para los
promotores de E. coli, presentando en la caja -10 la secuencia consenso TATAAT
(Pribnow y col., 1975) y una caja –35 con la secuencia consenso TTGACA localizada a
una distancia de 17±1 nucleótidos de acuerdo a un estudio estadístico donde se
compararon secuencias promotoras de E. coli (Rosenberg y Court, 1979; Hawley y
McClure, 1983). El factor - principal de la RNA polimerasa se unirá a la caja -35
cubriendo una región del DNA que va desde el nucleótido -60 al -1. El proceso de
desnaturalización se producirá en la caja –10 (por su abundancia en AT), iniciándose el
transcrito en el nucleótido +1 que suele coincidir con un purina (AG). La actividad de
un promotor también depende de las secuencias que se encuentran fuera de las cajas,
aumentando o disminuyendo su fuerza relativa (Pérez-Martín y col., 1994). En
corinebacterias la caja promotora –10 consenso se conserva frecuentemente, aunque no
suele ocurrir lo mismo ni con la caja –35 ni con la distancia existente entre cajas. Un
estudio realizado por Pátek y col. (1996) en promotores de corinebacterias y
corinefagos, indica la existencia de una secuencia consenso para la caja –10:
5´
TANAAT3´ con dos nucleótidos de guanina (GG) precediendo dicha caja. La caja –35
presenta la secuencia consenso 5´TTGCCA3´, precedida por otra T, aunque esta caja está
poco conservada. Entre las cajas, suele haber un alto porcentaje de A y T. Otros estudios
adicionales realizados con regiones promotoras en corinebacterias, parecen indicar que
nucleótidos adyacentes a la caja –10 (extensión de esta caja) pueden suplir la falta de
consenso en la caja –35 (Vasicova y col. 1999). Esta diferencia podría explicar el que
algunos genes de E. coli no se expresen en corinebacterias, y el que algunos promotores
de genes de corinebacterias no sean reconocidos en E. coli.
En corinebacterias, al igual que ocurre en E. coli es habitual la existencia de
regiones operadoras en agrupaciones génicas que conforman operones; algunos
ejemplos de agrupamientos génicos con operadores corresponden a sistemas genéticos
implicados en biosíntesis de aminoácidos (Guerrero y col., 1994).
Igualmente es habitual la presencia de regiones terminadoras de la transcripción en
genes u operones de corinebacterias; han sido descritas secuencias atenuadoras en el
operón del triptófano de B. lactofermentum (Sano y Matsui, 1987), y terminadoras en el
RNA transcrito a partir de los genes hom y thrB (Folletie y col., 1988; Mateos, 1990),
lysA (Yeh y col., 1988b) y del operón de triptófano de B. lactofermentum (Sano y
Matsui, 1987), similares a los existentes en E. coli.
1.2.5 Mecanismos de regulación de la expresión génica a nivel de
transcripción: inducción y represión catabólica
Un ejemplo importante de regulación de la expresión génica en procariotas donde no
hay sistemas de control nervioso u hormonal es el que se lleva a cabo con enzimas
implicadas en el catabolismo de determinadas fuentes de energía que se utilizan de
forma ocasional por parte de las bacterias; para ello existen enzimas inducibles, en
contraposición a las enzimas constitutivas (que siempre se expresan), las cuales sólo se
detectan en presencia del sustrato metabolizable, por lo que la célula no “malgasta”
energía sintetizando enzimas cuando no se encuentra presente dicho sustrato.
1.2.5.1 Sistemas inducibles y de represión catabólica
El ejemplo más estudiado de sistema inducible es el que tiene lugar con la lactosa;
los genes que forman parte del operón de la lactosa codifican para una proteína
reguladora (lacI: represor), una !-galactoxidasa (lacZ), una permeasa (lacY) y una
transacetilasa (lacA). En presencia de lactosa, la proteína represora se une al inductor
(lactosa) y no interacciona con el operador, por lo que la RNA polimerasa puede iniciar
la transcripción a partir de la región promotora del operón (control negativo). Un
sistema análogo es el que regula el catabolismo del ácido glucónico en los
microorganismos estudiados; el ácido glucónico actúa de inductor uniéndose al represor
y facilitando de esta forma la expresión de los genes del operón que transformará el
glucónico en otros productos intermediarios del metabolismo.
El sistema de represión catabólica es un mecanismo de regulación más general que
los sistemas inducibles y reprimibles, y suele ir asociado a operones implicados con el
catabolismo de fuentes de carbono; cuando se encuentran dos nutrientes en el medio de
cultivo, el hecho de metabolizar uno de ellos suele impedir el uso de la otra fuente de
carbono. Este proceso se observó inicialmente con glucosa y con otra fuente de carbono
presente en el cultivo, comprobando que primero se metaboliza la glucosa y luego el
otro nutriente, por lo que al proceso se le solía denominar efecto glucosa. El término
“represión catabólica” fue introducido por Magasanik (1970) definiéndolo como el
fenómeno en que la presencia de determinados componentes en el medio reprime la
expresión de determinados genes u operones. El fundamento consiste en que en
presencia de glucosa los niveles de adenilato ciclasa (enzima formadora de AMPc) eran
escasos; en ausencia de glucosa una proteína reguladora del catabolismo (CRP o
también CAP) interacciona con AMPc y se unen a una región reguladora específica
(CBS) del operón correspondiente a la fuente de carbono inducible favoreciendo los
procesos de transcripción. Se trata en este caso de un sistema de control positivo que no
tendrá lugar en presencia de glucosa porque los bajos niveles de AMPc impedirán la
formación del complejo AMPc-CRP y su interacción con CBS. La secuencia de
nucleótidos consenso presente en la región CBS de operones implicados en el
catabolismo de azúcares (lactosa, maltosa, arabinosa, etc.) de procariotas es la siguiente:
5’
TGTGA-6N-ACACT3’, siendo N cualquier nucleótido y estando menos conservado el
pentanucleótido del extremo 3’ (De Crombrugghe y col., 1984).
1.3 Metabolismo del ácido glucónico en bacterias
Una gran cantidad de microorganismos, así como la gran mayoría de las células
animales se comportan desde el punto de vista nutricional como quimioorganotrofos,
utilizando compuestos químicos orgánicos como fuente de carbono y fuente de energía.
Los azúcares suelen utilizarse como nutrientes fácilmente metabolizables por una
enorme variedad de organismos, siendo la glucosa el metabolito estrella para explicar
los procesos metabólicos que ocurren en una célula, principalmente debido a la
presencia de enzimas constitutivas que permiten su rápida utilización. Los ácidos
orgánicos suelen estar en un estado de oxidación mayor que los azúcares por la
presencia de un grupo carboxílico en la molécula, en comparación con el grupo
carbonilo (aldehído o cetona) presente en los azúcares.
El ácido glucónico es un ácido azucarado de 6 átomos de carbono (Fig. 1.5) que se
suele encontrar en el intestino de animales carnívoros procedente bien de la propia dieta,
o a partir de las secreciones de las células del epitelio intestinal en forma de “mucus”;
los ácidos glucónico y cetoglucónico se encuentran en tejido muscular, siendo
generados por procesos de oxidación (Farber y Idziak, 1982).
COOH
H
C
OH
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
CH2OH
Ác. Glucónico
Figura 1.5.- Formula estructural del ácido glucónico.
El ácido glucónico penetra dentro de la bacteria atravesando la pared celular y
utilizando un mecanismo específico de transporte en la membrana (permeasa de
glucónico), para posteriormente ser fosforilado a 6-fosfoglucónico mediante una kinasa.
El ácido 6-P-glucónico se podrá incorporar a dos rutas del metabolismo central de las
células: (i) puede ser catabolizado a través de la vía de las pentosas fosfato que le
conducirá a la producción de metabolitos precursores de cinco y cuatro átomos de
carbono (pentosa-fosfato y eritrosa-fosfato), así como obtención de poder reductor en
forma de NADPH necesario para los procesos de biosíntesis; (ii) o bien puede
incorporarse a la vía de Entner-Doudoroff (Entner y Doudoroff, 1952) vía catabólica
alternativa a la ruta de Embden-Meyerhof (glucólisis) presente en algunos
microrganismos procariotas (Fig. 1.6). Tal es el caso de algunas especies del género
Pseudomonas como P. putida (Schleissner y col., 1997), P. aeruginosa, P. doudoroffii y
otras (Lessie y Phibbs, 1984).
Figura 1.6.- Via Entner-Doudoroff (Madigan y col., 1997).
Dependiendo del tipo de microorganismo de que se trate, la entrada de glucosa en la
célula se realizará utilizando distintos mecanismos; si la entrada se realiza mediante un
transporte activo con gasto de ATP, la glucosa entra como tal en la célula, se fosforila y
posteriormente mediante la acción de una glucosa oxidasa la transforma en 6-Pgluconolactona que de forma espontánea se transformará en ácido glucónico. En caso de
incorporación de glucosa mediante un mecanismo de translocación de grupo, esta se
acoplaría al sistema PTS (sistema de la fosfo-transferasa) mediante el cual el ácido
fosfoenolpirúvico se convierte en pirúvico y dona el grupo fosfato a la glucosa
generando así glucosa 6-fosfato. La oxidación de glucosa 6-P por la acción de la enzima
glucosa 6-P-deshidrogenasa generará 6-P-glucónico que servirá de sustrato para la ruta
de las pentosas fosfato y la de Entner-Doudoroff. Un esquema de los compuestos
iniciales, algunos productos intermediarios y las principales enzimas implicadas se
puede ver en la Figura 1.7.
Glucosa
Glucosa
Ác. Glucónico
Glucosa
deshidrogenasa
PTS
PEP
ATP
Ác. Pirúvico
Glucosa6-fosfato
Ác. Glucónico
Reacción
espontánea
Glucono-lactona
Glucosa
oxidasa
ADP
+
Pi
Glucosa
Glucokinasa
Glucosa 6-fosfato
deshidrogenasa
6-fosfoglucónico
6-fosfoglucónico
deshidratasa (edd)
2-ceto,3-deoxi,6-fosfoglucónico
2-ceto,3-deoxi,6-fosfoglucónico aldolasa
(eda)
2 ác. Pirúvico
Ruta Entner-Doudoroff
Figura 1.7.- Formas de entrada de glucosa y sus destinos catabólicos.
Algunos microorganismos curiosamente no son capaces de interiorizar glucosa de
forma directa, sino que previamente deben oxidar la glucosa a ácido glucónico mediante
la acción de una enzima glucosa deshidrogenasa para poder interiorizar el metabolito;
esto se ha observado en un importante número de especies de Pseudomonas las cuales
presentan una deshidrogenasa constitutiva asociada a la membrana (Schleissner y col.,
1997). En algunos hongos filamentosos como Aspergillus y Penicillium se ha observado
un mecanismo análogo con la presencia de una glucosa deshidrogenasa o una glucosa
oxidasa asociada a la superficie celular (Witteveen y col., 1990), presente en
peroxisomas o libre en el caldo de cultivo. Algunos microorganismos que presentan
glucosa oxidasa utilizan como cofactor flavín adenin dinucleótido (FAD), el cual en su
forma reducida (FADH2) cede los electrones al oxígeno y forma peróxido de hidrógeno
(H2O2) que a su vez presenta actividad antimicrobiana.
1.4 Genes implicados en el metabolismo del glucónico en
bacterias
Los genes implicados en el metabolismo del glucónico (genes gnt) se han estudiado
de forma detallada en E. coli y Bacillus subtilis, donde se ha observado su disposición
en operones. A continuación se explicará su organización cromosómica en los dos
microorganismos indicados.
1.4.1 Genes gnt en Escherichia coli
El ácido glucónico es un nutriente muy importante para E. coli en su ambiente
natural que es el intestino de mamíferos; hasta el comienzo de la década de los años 90,
todo el conocimiento del metabolismo del glucónico en E. coli se basaba en
aproximaciones genéticas tradicionales (Bächi y Kornberg, 1975; Istúriz y col., 1986),
encontrándose que los pasos iniciales del catabolismo estaban catalizados por las
enzimas permeasa y kinasa para generar el producto intermediario 6-P-glucónico. En
E. coli el precursor 6-P-glucónico puede seguir la vía de las pentosas fosfato o bien la
vía de Entner-Doudoroff (Egan y col., 1992). Por otra parte, en el metabolismo de
glucónico de E. coli se ha observado la presencia de más de una enzima para realizar la
misma transformación bioquímica, describiéndose la existencia de varias enzimas con
actividad gluconato permeasa y varias con actividad gluconato kinasa, estando en todo
caso cada una de ellas sometidas a distintos tipos de regulación como se comentará a
continuación.
Hasta hace pocos años se mencionaba la existencia de dos sistemas implicados en el
metabolismo de glucónico, considerando a uno de ellos un sistema específico que se
localiza en la región del minuto 77 de su mapa físico (GntI), mientras que al otro (GntII)
se le consideraría un sistema inespecífico o secundario. Los primeros genes adscritos al
sistema GntI fueron publicados por Tong y col., (1996), señalando la existencia de un
agrupamiento de genes gntR-gntK-gntU que codifican para una proteína reguladora, una
gluconato kinasa y una permeasa respectivamente. En relación con el mecanismo de
regulación de la expresión, el gen mRNA transcrito a partir del gntR es monocistrónico
y se expresa de forma constitutiva, mientras que los genes gntUK conforman un operón
inducible por glucónico y sometido a represión catabólica. En el sistema principal de
glucónico (GntI) también se encuentra una actividad gluconato permeasa de alta
afinidad codificada por el gen gntT y que se localiza en el minuto 76,5 del mapa
genómico de E. coli, pero no adyacente al cluster de genes gntRKU (Porco y col., 1997;
Izu y col., 1997); el gen gntT está regulado negativamente por la presencia de una
molécula represora (producto del gen gntR) actuando como inductor el ácido glucónico
o el 6-P-glucónico (inducible de control negativo), y sobre este gen existe un sistema de
regulación global mediante represión catabólica.
Un aspecto llamativo consiste en que una región promotora-operadora inducible por
glucónico controla la expresión de los genes del operón edd-eda que participan en la
formación de las enzimas 6-P-glucónico-deshidratasa y 2-ceto-3-desoxi-6-P-glucónicoaldolasa respectivamente, pertenecientes a la vía de Entner-Doudoroff, que están
negativamente regulados por el represor producto del gen gntR (Egan y col., 1992).
Un análisis reciente de las secuencias nucleotídicas presentes aguas arriba del gen
gntT ha revelado la existencia de dos marcos abiertos de lectura de 729 y 573 pb que
mediante estudios de complementación se ha visto su implicación en el metabolismo de
glucónico, denominando a los genes correspondientes gntX al marco mayor y gntY al
menor (Porco y col., 1998). Según estos estudios los genes gntX-Y conforman un
operón cuyo control está ejercido por el represor producto del gen gntR y que por lo
tanto formaría parte del regulón GntR. Los productos de los genes gntX-gntY se
corresponden con una proteína periplásmica con especifidad por glucónico y una
proteína de unión a membrana respectivamente, que conjuntamente con la permeasa de
glucónico (gntT) parecen conformar un sistema de transporte para glucónico de alta
afinidad análogos a los sistemas de transporte TRAP (Rabus y col., 1999). Podemos
hablar por tanto de la existencia del regulón GntR que comprende el sistema GntI, el
operón gntXY y el operón edd-eda, gobernados por la misma molécula reguladora, por
lo que mutantes afectados en el gen gntR, expresarán los genes implicados en glucónico
y los de la vía de Entner-Doudoroff de forma constitutiva.
Se ha descrito la existencia de otra actividad gluconato permasa de alta afinidad
independiente del sistema GntI, cuyo gen gntP se ha localizado en el minuto 98 (Klemm
y col., 1996); la expresión del gen es monocistrónica, pero a diferencia de las anteriores
permeasas su expresión no se induce por la adición de glucónico, aunque si que existe
un fuerte mecanismo de represión catabólica cuando se cultiva el microorganismo en
presencia de glucónico y otros azúcares.
Un sistema alternativo implicado en el metabolismo de glucónico en E. coli llamado
GntII había sido descrito en la década de los años 80 (Istúriz y col., 1986), el cual se
localizaba en la región del minuto 96 del mapa genético y que contenía al menos los
genes gntS y gntW (permeasas de alta afinidad), gntV (glucokinasa termosensible) y
con mecanismos de regulación de la expresión totalmente distintos a los descritos para
el sistema GntI. La secuenciación reciente del genoma de E. coli permitió conocer los
posibles marcos de lectura existentes en la región del minuto 96 del cromosoma, lo que
ha llevado a postular una nueva ruta metabólica implicada en el catabolismo del ácido
L-idónico, y donde el ácido glucónico es un producto intermediario en el catabolismo
de idónico que desemboca en la vía de Entner-Doudoroff (Bausch y col., 1998); en este
caso, los genes encontrados (designados idn) además de los que presuntamente
participaban en glucónico, idnT (permeasa) e idnK (gluconokinasa termosensible)
existen otros genes con actividades: deshidrogena (idnD), reductasa (idnO) y reguladora
(idnR).
Minuto en el
cromosoma de
E.coli
A) Sistema GntI y otros genes específicos de glucónico
77.0
T
gntR
gntK
gntU
T
76.3
gntX
gntY
gntT
T
98.0
gntP
T
B) Tramo vía Entner-Doudoroff
41.6
edd
eda
Figura 1.8.- Disposición cromosómica de los genes implicados en el metabolismo del glucónico en
E.coli.
1.4.2 Genes gnt en Bacillus
Los genes implicados en el metabolismo del ácido glucónico fueron identificados en
Bacillus subtilis por el grupo de Fujita y col. (1986), los cuales describen la presencia de
un operón de glucónico en este microorganismo que carece de la vía de EntnerDoudoroff, por lo que la canalización del intermediario se realizaría a partir de la vía de
las pentosas fosfato. El análisis de la secuencia correspondiente al operón de glucónico
(gnt) puso de manifiesto la existencia de 4 marcos abiertos de lectura en un fragmento
de 5,4 Kb, los que correspondían a los genes gntR, gntK, gntP y gntZ, que codifican
respectivamente para un regulador negativo, una kinasa, una permeasa y para una
actividad desconocida en ese momento (Fujita y col., 1986; Fujita y Fujita, 1987);
posteriormente Reizer y col. (1991) realiza un estudio analítico del operón de glucónico
e indica que el gen gntZ correspondería a una actividad 6-P-glucónico deshidrogenasa
por analogía de secuencias con otras deshidrogenasas de bacterias y animales. Mediante
la realización de mutaciones se demostró que la actividad del gen gntZ asociada al
operón gnt no era esencial para el catabolismo de glucónico (Fujita y Fujita, 1989),
sugiriéndose que B. subtilis posee una enzima adicional con actividad 6-P-glucónico
deshidrogenasa codificado por un gen distinto del gntZ y que no estaría sometido a
represión (Reizer y col. 1991). Unos resultados análogos a los descritos para B. subtilis
han sido obtenidos en estudios genéticos del operón gnt en Bacillus licheniformis
(Yosida y col. 1994); estos autores describen la existencia de un único operón gnt
conteniendo cinco marcos abiertos de lectura (ORF) de los cuales los cuatro últimos
coinciden con los genes descritos para B. subtilis, a saber gntRKP Z. En este caso los
autores postulan que se debería haber producido una reorganización del cromosoma en
la región anterior al operón gnt durante la evolución, favoreciendo la divergencia entre
especies.
Esquema de la organización del operón
gnt en Bacillus subtilis
gntR
gntK
gntP
gntZ
T
Figura 1.9
1.5 Producción y aplicaciones del ácido glucónico y sus
derivados
El ácido glucónico se puede obtener mediante dos tipos de procesos: químicos y
biológicos (fermentación). A partir de D-glucosa se puede producir ácido glucónico o
sus derivados (el precursor .-D-gluconolactona) o sus sales de calcio o sódicas, siendo
éstas últimas las más interesantes debido a su acción como agentes quelantes o
secuestrantes de cationes con aplicación en procesos industriales. La producción
mediante procesos fermentativos en sus inicios se llevaron a cabo con cepas de
Pseudomonas, para usar posteriormente el hongo Penicillium luteum cultivado en
superficie; actualmente se usan cepas superproductoras del hongo Aspergillus niger y de
la bacteria Acetobacter suboxydans, en cultivos sumergidos. Durante la fermentación la
glucosa es convertida a gluconolactona por la enzima glucosa oxidasa, para
posteriormente convertirse en ácido glucónico por hidrólisis espontánea. Las
condiciones de la fermentación incluyen la adición de un inóculo del micelio en
crecimiento activo (1/10 del volumen total), mantener una elevada aireación en el
sistema durante 60-70 horas, una temperatura de 30-33 ºC y pH entre 5-7, con
suficientes cantidades de manganeso. En todo caso las producciones óptimas de
glucónico se alcanzarán en condiciones de limitación de la fuente de fósforo y de
nitrógeno. En estas fermentaciones se logra equilibrar el pH mediante la adición de
carbonato cálcico como agente tamponante o hidróxido sódico, obteniéndose de esta
forma las correspondientes sales de glucónico, siendo la de sodio la más frecuente.
En cuanto a sus aplicaciones, el ácido glucónico o la lactona correspondiente
(gluconolactona) son utilizados (i) en industrias de alimentación, actuando como
agentes ligeramente acidulantes que confieren a los alimentos unos sabores
característicos: industrias cárnicas, industrias de lechería y productos de panadería; (ii)
como potenciadores de sabor y equilibradores del pH se utilizan en la preparación de
salsas; (iii) la gluconolactona añadida a grasas y aceites sirve para controlar el pH y para
acomplejar posibles elementos metálicos (trazas) que promueven los procesos de
oxidación; (iv) en medicina las sales férricas y cálcicas del glucónico se utilizan para
proporcionar los correspondientes cationes en pacientes con anemias y deficiencias de
calcio, el gluconato de zinc se utiliza en el tratamiento del acné vulgar (Meynadier,
2000) y el gluconato de magnesio se ha descrito como un potente protector celular ya
que actúa como agente reductor frente a radicales libres (Mak y col., 2000); (v) es
también frecuente recurrir al gluconato en estudios citológicos para modificar la
concentración de aniones en el medio interno o externo celular (Hubber y col., 2001).
1.6 Uso de bases de datos en campos científicos
Existen en la actualidad una gran cantidad de bases de datos del ámbito biológico en
todo el mundo (LiMB Databases) que contienen secuencias nucleotídicas y proteicas,
estructuras en 3D, mapas físicos y genéticos y toda la bibliografía pertinente: GenBank
(Benson y col., 1993), EMBL (European Molecular Biology Laboratory), DDBJ (DNA
Data Bank of Japan), agrupan secuencias nucleotídicas, PIR (Protein Identification
Resource; George y col., 1986), SWISS-PROT (Bairoch y Boeckmann, 1992) y PDB
(Protein Data Bank; Bernstein y col., 1977) compilan secuencias proteicas, mientras que
PROSITE (Bairoch y col., 1997) agrupan secuencias codificantes para dominios y
motivos proteicos, etc.
El manejo de estas bases de datos se da de forma “online” por la necesidad de tener
datos actualizados de forma constante. Por ello se requieren programas de bajo coste en
tiempo y dinero así como la aplicación de estrategias para acelerar el proceso
computacional que requiere la identificación de una secuencia. Estas estrategias son por
ejemplo (i) el uso de varios procesadores de forma paralela y que permiten fraccionar la
base de datos y procesar mucha mas información en el mismo tiempo para determinar
una única consulta (Tieng y col., 1996); (ii) el uso de programas heurísticos que
permiten obtener resultados rápidos y de bajo coste pero de menor exactitud pues
aportan aproximaciones, no resultados exactos. El uso de este tipo de aplicaciones ha
sido el desencadenante fundamental del auge de la bioinformática.
1.6.1 Aplicaciones bioinformáticas de tipo heurístico
El objeto de estos programas es el establecimiento de las similitudes que hay entre
dos secuencias y esto se puede hacer de dos formas: (i) a nivel local, estudiando las
similitudes entre subsecuencias; esto se utiliza para realizar búsquedas rápidas en la
base de datos como en aplicaciones tipo BLAST (Altschul y col., 1990) o FASTA
(Lipman y Pearson, 1985). (ii) A nivel global, donde se establecen comparativas
utilizando la secuencia completa y cada unidad de una secuencia A se compara con cada
unidad de una secuencia B; esto se utiliza para alinear y establecer árboles filogenéticos
mediante aplicaciones como CLUSTAL (Thompson y col., 1994).
El concepto determinante es establecer la mínima distancia evolutiva posible entre
las dos secuencias problema. Esta distancia se define como el menor número de
operaciones (sustituciones, inserciones/deleciones = InDel) necesarias para convertir
una secuencia A en otra B. Se penaliza a cada tipo de alteración en función de su
frecuencia biológica, gravedad y longitud. La mejor alineación será por tanto la que
menos penalizaciones tenga y se puede establecer la distancia entre dos secuencias por
el número y peso de las mutaciones que las diferencian. Todo ello se resuelve utilizando
matrices.
Para secuencias nucleotídicas se establecen matrices de identidad según el método
de Needleman y Wunsch (1970) (Fig. 1.10). El fundamento es simple y se basa en la
creación de una matriz con las dos secuencias, una en filas y la otra en columnas, y se
otorga 0 si hay similitud entre nucleótidos o 1 si no la hay. Esto se hace más complejo
pues el algoritmo que computa la identificación debe tener en cuenta la posibilidad de
sustituciones en la secuencia y debe incluir penalizaciones por el tamaño de los posibles
gaps (zonas In/Del). El algoritmo de N-W (Needleman-Wunsch) fue conceptuado para
el alineamiento de dos secuencias dadas y en principio se puede extender añadiendo
para cada nueva secuencia otra dimensión en la matriz. Pero esto es inviable a nivel
computacional si el número de las secuencias aumenta de forma exponencial. Por ello
finalmente se describieron métodos heurísticos de alineamiento múltiple.
Figura 1.10.- Matriz de identidad entre dos secuencias nucletotídicas.
Para el caso de alineamientos de secuencias proteicas se utilizan matrices que
contienen las frecuencias relativas por las que un aminoácido determinado sustituye a
otro por azar, y estas frecuencias esperadas se comparan con las frecuencias observadas.
Se otorgan valores positivos en la matriz si la frecuencia observada es mayor que la
esperada por azar y negativos si es menor, que corresponderán respectivamente a
cambios conservativos y cambios no conservativos. Manteniendo esta base, las matrices
más utilizadas son las matrices PAM (Allowed Point Mutations; Dayhoff y col., 1978).
Otro tipo de matrices son las llamadas Blosum (Henikoff y Henikoff, 1992) que están
basadas en bloques muy conservados extraídos de alineamientos múltiples, son los
llamados “motivos”, que representan las secuencias de mayor conservación de ciertas
familias proteicas. Hay distintas matrices Blosum en función del tipo de segmentos
utilizados, así Blosum 62 contiene bloques con al menos un 62% de similitud con una o
más secuencias del cluster y se utilizan secuencias de un amplio rango de distancias
evolutivas. Estas matrices dependen por tanto de la forma de alineamiento por las que se
obtuvieron.
Una vez establecidas los tipos de matrices para el alineamiento, podemos distinguir
fundamentalmente 3 programas utilizados en el presente trabajo:
• CLUSTAL, está enfocado por la distancia que haya entre las distintas secuencias a
alinear, que pueden ser tanto nucleotídicas como proteicas. Se alinean las secuencias
más similares en primer lugar, se establece una secuencia consenso y se alinea la
secuencia más parecida con ese consenso o las 2 secuencias mas parecidas entre sí de
forma progresiva y consecutiva, para establecer un árbol filogenético.
• FASTA, fue desarrollado por Lipman y Pearson en 1985 y se mejoró en 1988 por
los mismos autores. El algoritmo busca en primer lugar establecer las unidades de
similitud entre 2 secuencias dadas, utilizando subunidades de 4-6 nucleótidos para DNA
y para secuencias proteicas 1-2 aminoácidos. Regular este tamaño condiciona la
velocidad y lo sensible que sea el alineamiento. Se establecen diagonales con las zonas
de similitud, se les da un valor a esas diagonales en función de su longitud y de los gaps
(zonas InDel) que tenga. Se establece la mejor secuencia a nivel “local” combinando las
mejores diagonales con el mínimo espacio entre ellas (producido por InDel). Se
eliminan las diagonales que no se encuentren dentro un margen establecido previamente
y se juntan los espacios determinando un valor de similitud entre las dos muestras en
función de las diferencias y similitudes obtenidas (Fig. 1.11).
Figura 1.11.- Ejemplo gráfico que describe el establecimiento de la mejor diagonal en la matriz de
identidad de comparativa de dos secuencias. A) Se establecen las diagonales de similitud, B) se
determinan las que tienen mejor puntuación, C) se eliminan aquellas que no se encuentren dentro de un
rango determinado, D) se unen especificando los gaps que haya entre las diagonales seleccionadas para
dar un valor al alineamiento que podrá ser utilizado como distancia evolutiva entre ambas secuencias.
• BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), se desarrolló por Altschul y col.
(1990). Realiza una búsqueda para encontrar la máxima similitud entre unidades de
secuencia, una vez encontrada una similitud de un grado determinado se concentra en
buscar similitudes de mayor grado. Esta estrategia permite una mayor rapidez de
procesamiento de datos sin perder por ello sensibilidad. Posteriormente coteja el
número de unidades de similitud de forma local y establece un valor progresivamente.
La longitud de la unidad de secuencia puede ser determinada previamente aunque se
establecen un estándar de 12 nt o 3-5 aa. Además podemos establecer el mínimo de
grado de similitud entre las secuencias encontradas con lo cual se regula la rapidez del
programa y una restricción para la búsqueda de distancias filogenéticas de mayor o
menor magnitud. Posteriormente se mejoró este sistema (Altschul y col., 1997)
introduciendo la posibilidad de computar la presencia de inserciones/deleciones de la
misma forma que en FASTA: se establecen subalineamientos locales y se compone una
alineamiento general incluyendo las inserciones/deleciones presentes, gráficamente se
eliminan subdiagonales que estén fuera de un rango establecido y las que quedan se
unen para obtener una diagonal general con el mejor alineamiento posible.
Al mismo tiempo se desarrolló el sistema PSI-BLAST (Position Specific Iterated
BLAST; Altschul y col., 1997) que permite la búsqueda de motivos y dominios
conservados en distintas familias de proteínas. Este método de alineamiento se puede
aplicar para estudiar la estructura de una proteína por comparativa con bases de datos de
dominios y motivos proteicos bien establecidos como PROSITE. Estas secuencias son
las más conservadas dentro de la proteína pues son las que determinan la función de esta
en gran medida, son elementos de muy diversa índole como unión a DNA en elementos
de trascripción, unión a ATP/AMP en kinasas de distintos tipos, etc. Esta información
nos confirma la posible identidad de la proteína codificada por la secuencia problema en
concordancia con los alineamientos obtenidos previamente.
1.7 Objetivos del presente trabajo
C. glutamicum ha sido tradicionalmente utilizado en procesos industriales en la
producción de metabolitos primarios, principalmente aminoácidos, por lo que los
aspectos fisiológicos-metabólicos relacionados con biosíntesis de aminoácidos suelen
estar bien establecidos; sin embargo los procesos relacionados con el metabolismo
energético o catabolismo de estos microorganismos en función de los nichos ecológicos
que ocupan y de su potencial versatilidad metabólica no son tan conocidos. En base a
ello se plantearon los siguientes objetivos:
(i)
Localización y análisis de genes implicados en el catabolismo del ácido
glucónico
(ii)
Posicionamiento de estos genes en el cromosoma de C. glutamicum y
estudio de su posible agrupamiento (“cluster”)
(iii)
Obtención y análisis funcional de mutantes afectados en los genes gnt.
2
Materiales y Métodos
2. Materiales y Métodos
2.1 Materiales
2.1.1 Reactivos químicos, bioquímicos y enzimas comerciales
Para la realización de este trabajo se emplearon diversos materiales y reactivos
químicos y bioquímicos adquiridos a las siguientes casas comerciales: Amersham
International (Reino Unido), Boehringer Mannheim (Alemania), MBI Fermentas
(Lituania), Merck (Alemania), Millipore (Massachusetts, USA), New England BioLabs
(Massachusetts, USA), Pharmacia (Suecia), Perkin-Elmer (Columbia, USA), Promega
(Wisconsin, USA), Qiagen (Alemania), Sigma Chemical (Missouri, USA), Stratagene
(California, USA), Whatman (Reino Unido).
Las enzimas de restricción utilizadas se adquirieron a Boehringer Mannheim
(Alemania), New England BioLabs (Massachusetts, USA) y MBI Fermentas (Lituania).
Además, se utilizaron las siguientes enzimas de modificación: DNA ligasa del fago T4
y fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim, Alemania), RNasa y DNasa (Sigma
Chemical, Missouri, USA). Otras enzimas utilizadas fueron: lisozima (Fulka ChemikaBiochemika, Suiza) y proteinasa K (Sigma Chemical, Missouri, USA).
2.1.1.1 Ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos comerciales que se utilizaron fueron los siguientes: DNA de
fago Lambda (Boehringer Mannheim, Alemania) y el vector de clonación para E. coli
pBluescript KS/SK (2.98 kpb; bla; lacZ; ori f1), de Stratagene (California, USA).
2.1.2 Microorganismos utilizados
Todos los microorganismos que han sido utilizados en este trabajo, junto con sus
características más destacables, origen o referencia bibliográfica, se encuentran
enumerados en la siguiente tabla:
Características
Fuente/Referencia
ATCC
Corinebacterias
C. glutamicum ATCC 13032
Silvestre (wt); colonias ligeramente amarillas
C. glutamicum TRA-8
B. lactofermentum R31
gntMateos y col., 1996
MeLysR AECR, colonias blancas. Carece del Santamaría y col., 1985
plásmido pBL1.
E. coli
E. coli DH5(
F- recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(r-km+k) Hanahan, 1983
sup44 relA1 /- !80dlacZM15 (lacZYAargF)U169.
E. coli XL1Blue
F’::Tn10 proA+B+ lacIq 0(lacZ)M15 recA1 Bullock y col., 1987
endA1 gyrA96 (NalR) thi hsdR17 (r-km+k) supE44
relA1 lac
E. coli S17-1
hsdR pro recA Tc::Mu; contiene integrados los Simon y col., 1983
genes tra (RP4) en el cromosoma
Tabla 2.1.- Microorganismos utilizados en el presente trabajo.
2.1.3 Plásmidos utilizados
En la Tabla 2.2 se indican los plásmidos utilizados en el presente trabajo así como
sus principales características y la referencia.
Plásmidos
Referencia
pBluescript KS y SK
Stratagene Cloning Systems (San
2,96 kb. fagémidos derivados de pUC118 y pUC119 con origen de Diego, CA).
cadena sencilla del fago f1. Vectores de E. coli, bla, lacZ.
pK18mob
Schäfer y col., 1994
3,7 kb; plásmido movilizable de E. coli derivado de pUC18 usado en
procesos de interrupción génica. kan, lacZ
pULMV1
Valbuena, 1999.
3,7 Kb; plásmido recombinante derivado de pBluescript KS
conteniendo un fragmento del gen gntP de Corynebacterium
glutamicum. Origen de cadena sencilla del fago f1, vector de E. coli,
bla.
Tabla 2.2.- Plásmidos utilizados en este trabajo
2.1.4 Medios usados y condiciones de cultivo
Para el crecimiento de los microorganismos se utilizaron diferentes medios de
cultivo. La composición para un volumen final de 1 litro (l) se detalla a continuación;
después de la preparación, el medio fue repartido a razón de 100 mililitros (ml) por
botella. Todos los medios se esterilizaron en autoclave a 120ºC durante 20 minutos.
2.1.4.1 Medios de cultivo para E. coli
Medio Luria-Bertani (LB) (Miller, 1972): 10 g triptona; 10 g NaCl; 5 g de extracto
de levadura. El pH debe se ajustado a un valor de 7,3 con NaOH. Añadir agua destilada
hasta 1 l. Para el medio sólido se debe añadir agar a una concentración final de 20 g/l.
Medio SOB (Hanahan, 1983): 20 g triptona; 5 g extracto de levadura; 0,5 g NaCl;
Ajustar a pH 7,5. Agua destilada hasta 1 l. Por separado se preparan dos soluciones de
MgCl2 1 M y MgSO4 1 M que se esterilizan por filtración a través de una membrana de
0,22 µm. Se deben añadir 1 ml de cada solución al medio antes de su utilización.
2.1.4.2 Medios de cultivo para C. glutamicum
Medio Tripticasa-Soja, TSB. (Sambrook y col., 1989) 16 g peptona de caseína; 3 g
peptona de soja; 6 g NaCl; 2,5 g K2HPO4; 2,5 g glucosa. Se ajusta el pH a 7,2. Para
medio sólido, TSA, se suplementa con 20 g de agar.
Medio mínimo para corinebacterias, MMC. (Fernández, 1991) 10 g SO4(NH4)2; 3 g
urea, 1 g KH2PO4; 0,41 g MgSO4·7H2O; 2 mg FeSO4·4H2O; 2 mg MnSO4·4H2O; 50 mg
NaCl; 50 µg biotina; 200 µg tiamina; 20 g glucosa. Las vitaminas se esterilizan por
filtración en una solución concentrada y la glucosa se esteriliza en autoclave por
separado. Ajustar el pH a 7,3. Para el medio sólido se añaden 20 g de agar.
2.1.4.3 Antibióticos y otros aditivos
Ampicilina (Ap): solución acuosa a una concentración de 200 mg/ml. Se utilizó a
una concentración final de 100 µg/ml.
Kanamicina (Km): Solución acuosa a una concentración de 100 mg/ml. Se utilizó a
una concentración final de 50 µg/ml.
IPTG: solución acuosa a una concentración de 100 mM. Se utilizó a una
concentración final de 80 µg/ml .
X-Gal: Solución en dimetilformamida a una concentración de 20 mg/ml. Se utilizó a
una concentración final de 40 mg/ml.
2.1.5 Soluciones de uso general
-CIA: mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico en proporción 24:1.
-Fenol ácido: 500 g fenol; 0,5 g hidroxiquinoleína; 100 ml H2O.
-Fenol cloroformo isoamílico: mezcla de fenol neutro y CIA en proporción 1:1.
-Fenol neutro: el fenol ácido se equilibra realizando varias extracciones con 1
volumen de Tris-HCl pH 8 1 M, hasta que la fase orgánica tenga un pH igual o superior
a 7,6.
-RNasa: RNasa 10 mg/ml; Tris-HCl pH 7,5; 10 mM; NaCl 15 mM. Hervir a 100ºC
durante 10 minutos para eliminar las DNasas. Almacenar a –20ºC.
-Tampón TE: Tris-HCl, 10 mM; EDTA 1 mM; pH 8.
2.1.6 Conservación de las cepas bacterianas
Las diferentes cepas utilizadas fueron conservadas mediante dos métodos:
-El primer método (a corto plazo) se realizó mediante siembra periódica (cada 2
meses en el caso de E. coli y cada 4 meses en el caso de las corinebacterias) en placas
de Petri con el medio de cultivo sólido más adecuado y los aditivos necesarios en cada
caso. Las placas se guardaron, rodeadas de Parafilm, a 4ºC. Con este método se pueden
conservar varias semanas.
-El segundo método (a largo plazo) se realizó añadiendo al medio de cultivo líquido
donde se creció el organismo una solución de glicerol concentrado, dejando la
concentración final al 20%; posteriormente se congela y se almacena a -20ºC. Con este
método se pueden conservar hasta 4 años.
2.2 Métodos para el análisis de ácidos nucleicos
2.2.1 Preparación del DNA
2.2.1.1 Aislamiento de DNA total de corinebacterias.
Este método se aplicó a volúmenes de cultivo comprendidos entre 5 y 100 ml,
obteniéndose normalmente cerca de 4 µg de DNA por ml de cultivo, y se realizó de
acuerdo al protocolo de Altenbuchner y Cullum (1984).
PROTOCOLO I: MÉTODO RÁPIDO DE PREPARACIÓN DE DNA TOTAL
1. Cultivar las células en medio TSB suplementado con glicina al 1% , durante 16 horas.
2. Recoger las células por centrifugación a 5000 r.p.m. durante 10 minutos.
3. Resuspender en 1/20 del volumen de TES.
4. Añadir 5 mg/ml de lisozima e incubar a 37ºC durante 2 horas.
5. Añadir " del volumen de EDTA 50mM, Sarcosil 0,5% y RNasa 5mg/ml. Mezclar bien e incubar a 37ºC durante
30 minutos.
6. Añadir 10 µg/ml de Proteinasa K e incubar a 50ºC durante al menos una hora. La solución debe clarear.
7. Extraer con un volumen de fenol neutro y centrifugar para separar las fases.
8. Extraer la fase acuosa con un volumen de fenol cloroformo isoamílico, volviendo a separar las fases por
centrifugación.
9. Repetir la extracción de la fase acuosa con cloroformo isoamílico. Centrifugar.
10. Precipitar el DNA con 0,6 volúmenes de isopropanol.
11. Recoger el precipitado por centrifugación y lavar con etanol al 70%.
12. Resuspender en TE.
!
TES: Tris-HCl 25 mM; pH 8,0; EDTA 25 mM, pH 8,0; sacarosa 10,3%
2.2.1.2 Minipreparación de DNA plasmídico de E. coli.
Este procedimiento, consistente en una modificación del protocolo descrito por
Holmes y Quigley (1981), se utilizó para la extracción de DNA plasmídico a partir de
colonias de E. coli en placa. Aunque el DNA obtenido no es muy limpio, es un
protocolo rápido con el que se obtiene la suficiente cantidad de DNA para realizar los
primeros ensayos (digestión con enzimas de restricción, etc.) en el análisis de un
plásmido recombinante.
PROTOCOLO II: MINIPREPARACIÓN DE PLÁSMIDOS DE E.coli
1.
Inocular con una colonia aislada 1 ml de medio LB líquido suplementado con el antibiótico selectivo. Sembrar
con cada colonia picada una pequeña zona de una placa de LB sólido suplementado con el antibiótico adecuado,
para poder recuperar fácilmente las colonias recombinantes. Incubar entre 8 y 16 horas a 37º C, y en agitación a
250 r.p.m. los cultivos líquidos.
2.
Centrifugar 5 minutos a 10.000 r.p.m. (en centrífuga Eppendorf). Resuspender las células en 200 µl de STET y 3
µl de lisozima 10 mg/ml.
3.
Hervir la muestra durante 40 segundos. Centrifugar inmediatamente a 14.000 r.p.m. (en centrífuga Eppendorf)
durante 15 minutos.
4.
Eliminar el precipitado mucoso (restos celulares y DNA cromosómico) con un palillo estéril.
5.
Añadir 250 µl de isopropanol y mezclar por inversión. Dejar a temperatura ambiente entre 10 y 15 minutos.
Centrifugar a 14.000 r.p.m. durante 15 minutos.
6.
Lavar el precipitado con 1 ml de etanol 70% frío. Centrifugar 5 minutos a 14.000 r.p.m., eliminar el sobrenadante
y secar el precipitado.
7.
Resuspender en 30 µl de agua MilliQ (Millipore) o tampón TE.
!
!
Solución de lisis STET: Sacarosa, 8 %; Tritón X-100, 0,5 %; EDTA pH 8, 50 mM; Tris-HCl pH 8, 10 mM.
Lisozima: lisozima, 50 mg/ml; Tris-HCl pH 8, 10 mM.
2.2.1.3 Preparación de DNA plasmídico de E. coli mediante lisis alcalina.
Este protocolo se empleó para la obtención de DNA plasmídico en gran cantidad y
con una alta pureza, limpio de proteínas. Consiste en una modificación del protocolo de
lisis alcalina descrito por Birnboim y Doly (1979).
PROTOCOLO III: PREPARACIÓN DE PLÁSMIDOS DE E. coli POR LISIS ALCALINA
1.
Inocular un matraz de 500 ml, conteniendo 100 ml de medio TB suplementado con el antibiótico necesario, con
una colonia de E. coli. Crecer en agitación a 250 r.p.m. y a 37 ºC durante 14 a 18 horas.
2.
Centrifugar a 5.000 r.p.m. (en rotor GSA de Sorvall o equivalente) durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante.
3.
Resuspender el precipitado en 5 ml de solución TEG y añadir lisozima a una concentración final de 5 mg/ml.
Mezclar con agitador e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
4.
Añadir 2 volúmenes de solución SDS-alcalina recién preparada y mezclar por inversión. Incubar en hielo durante
10 minutos.
5.
Añadir " volumen de solución de acetato potásico y mezclar con agitador. Incubar en hielo durante 10 minutos.
6.
Centrifugar a 8000 r.p.m. (en rotor SS-34 de Sorvall o equivalente) durante 30 minutos. Recuperar el
sobrenadante.
7.
Añadir 0,6 volúmenes de isopropanol, mezclar por inversión y centrifugar a 8000 r.p.m. (en rotor SS-34 de
Sorvall o equivalente) durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante y secar el precipitado dejándolo escurrir
sobre papel de filtro.
8.
Resuspender el precipitado en 2 ml de agua Milli-Q (Millipore) o tampón TE y pasarlo a tubos de 10 ml estériles.
9.
Añadir 2 ml de LiCl 5 M estéril y mantener en hielo durante 15 minutos. Centrifugar a 4000 r.p.m. durante 15
minutos a 4ºC. Recuperar el sobrenadante.
10. Añadir 10 ml de etanol absoluto frío y dejar a –20ºC durante al menos 1 hora.
11. Centrifugar a 8000 r.p.m. (en rotor SS-34 de Sorvall o equivalente) durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante
y secar el precipitado.
12. Resuspender el precipitado en 400 ml de agua Milli-Q (Millipore), teniendo cuidado de llevarse el DNA que está
pegado a la pared del tubo. Pasarlo a un microtubo de 2 ml.
13. Añadir 4 ml de solución RNasa 10 mg/ml (libre de DNasa). Incubar a 37ºC durante 15 a 30 minutos.
14. Añadir " volumen de fenol neutro y " volumen de CIA, mezclar con agitador y centrifugar a 14000 r.p.m. (en
centrífuga Eppendorf) durante 5 minutos. Recoger la fase acuosa (superior) y pasarla a otro microtubo. Repetir
este paso.
15. Añadir 1 volumen de CIA, mezclar con agitador y centrifugar a 14000 r.p.m. durante 5 minutos. Recoger la fase
acuosa (superior) y pasarla a otro microtubo. Repetir este paso.
16. Añadir 1/10 volumen de acetato sódico 3 M pH 7 y 2,5 volúmenes de etanol absoluto frío. Mantener a –20ºC
durante al menos 2 horas.
17. Centrifugar a 14000 r.p.m. durante 30 minutos a 4ºC. Eliminar el sobrenadante.
18. Añadir 100 ml de etanol 70 % frío y centrifugar a 14000 r.p.m. durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Eliminar el sobrenadante y secar el precipitado. Resuspender en 100 ml de agua Milli-Q (Millipore) o tampón
TE.
!
!
!
Solución TEG: Tris-HCl pH 8, 25 mM; EDTA pH 8, 10 mM; glucosa, 50 mM.
Solución SDS-alcalina: NaOH, 0,2 N; SDS, 1%.
Solución de acetato potásico: acetato potásico, 5 M; ácido acético glacial 11,5 %.
2.2.2 Métodos de limpieza y conservación de ácidos nucleicos
2.2.2.1 Fenolización y concentración del DNA
El proceso de fenolización (Sambrook y col., 1989) sirve para limpiar el DNA
principalmente de proteínas, aunque, como va seguido de una precipitación, también se
eliminan iones, nucleótidos y demás moléculas que pudieran interferir en las reacciones
enzimáticas. Si lo que se pretende es simplemente concentrar el DNA, sólo se deben
realizar los últimos pasos. El fenol es sumamente tóxico tanto por contacto como por
inhalación, por lo que debe ser manejado con suma precaución, utilizando ropa y
guantes adecuados y se debe de manipular bajo una campana de extracción.
PROTOCOLO IV: FENOLIZACIÓN Y CONCENTRACIÓN DEL DNA
FENOLIZACIÓN
1.
Añadir a la solución de DNA un volumen de fenol neutro. Mezclar con agitador (si el tamaño del DNA es grande
conviene mezclar más suavemente, por inversión). Centrifugar 5 minutos a 14000 r.p.m. (en centrífuga
Eppendorf).
2.
Recuperar la fase acuosa (superior) y añadir " volumen de fenol neutro y " volumen de CIA. Mezclar y
centrifugar como en el paso anterior. Opcionalmente se puede repetir este paso, obteniéndose un mayor grado de
limpieza del DNA a costa de una menor eficiencia en su recuperación.
3.
Recuperar la fase acuosa y añadir 1 volumen de CIA. Mezclar y centrifugar como en los pasos anteriores. La
repetición de este paso proporciona una más eficiente eliminación de fenol residual, aunque disminuye la
cantidad de DNA recuperada.
4.
Recuperar la fase acuosa.
PRECIPITACIÓN Y CONCENTRACIÓN DEL DNA
5.
Añadir 1/10 volumen de acetato potásico pH 7, 3 M y 2,5 volúmenes de etanol frío. Mezclar por inversión y
mantener a –20ºC durante al menos 2 horas (o a –70ºC durante 30 minutos). Centrifugar a 14000 r.p.m. (en
centrífuga Beckman) a 4ºC durante 30 minutos. Eliminar el sobrenadante.
6.
Alternativamente se puede precipitar el DNA con 0,6 volúmenes de isopropanol, mezclando por inversión y
manteniendo a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos. Centrifugar a 14000 r.p.m. durante 15 minutos a
temperatura ambiente.
7.
Añadir 1 ml de etanol 70 % frío y centrifugar a 14000 r.p.m. (en centrífuga Eppendorf) durante 5 minutos.
Eliminar el sobrenadante y secar el precipitado.
8.
Resuspender en el volumen adecuado de agua Milli-Q (Millipore) o tampón TE.
2.2.3 Manipulación del DNA
2.2.3.1 Digestión del DNA con enzimas de restricción
Para llevar a cabo el tratamiento con enzimas de restricción se siguieron las
recomendaciones de las casas comerciales proveedoras de cada enzima (Boehringer
Mannheim, New England BioLabs y MBI Fermentas). Aunque el esquema general de la
reacción, que se detalla en el protocolo V fue el mismo, la cantidad de enzima utilizada
pudo ser superior a la indicada cuando el DNA a tratar no estaba muy limpio. Además,
el tampón de digestión recomendado para cada enzima no fue el utilizado en el caso de
algunas digestiones con dos enzimas, para las cuales el tampón de digestión
recomendado no coincidía. En estos casos se intentó utilizar el tampón más adecuado
según las indicaciones de cada casa comercial, y en el caso en que esto no fuera posible,
se digirió primero con una enzima, se realizó una extracción fenol-CIA y se precipitó el
DNA, para posteriormente llevar a cabo la segunda digestión.
PROTOCOLO V: DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
1.
Mezclar en un microtubo:
• tampón de digestión 10X (1/10 del volumen final)
• DNA a digerir (la cantidad de mg deseada)
• Enzima de restricción (2 unidades de enzima por cada mg de DNA)
• agua Milli-Q (Millipore) necesaria para alcanzar el volumen final
2.
Incubar 3 horas a la temperatura adecuada.
2.2.3.2 Desfosforilación de los extremos 5´-fosfato libres del DNA
Los extremos resultantes de la digestión de los vectores de clonación con enzimas
de restricción fueron desfosforilados para evitar en la medida de lo posible la religación.
Para ello se realizó un tratamiento con fosfatasa alcalina, enzima que hidroliza los
enlaces 5’- fosfato de los extremos de una molécula de DNA, impidiendo la religación
por formación de un enlace fosfodiéster entre los dos extremos del vector, de modo que
la única manera teórica de volver a anillarse el vector es por introducción de nuestro
inserto durante la reacción de ligación. Para la realización del protocolo se siguieron las
recomendaciones de la casa comercial proveedora (Boehringer Mannheim).
PROTOCOLO VI: DESFOSFORILACIÓN DE EXTREMOS 5’ LIBRES
1.
• tampón 10X (1/10 del volumen final)
• vector de clonación (la cantidad de mg deseada)
• fosfatasa alcalina
• agua Milli-Q (Millipore) necesaria hasta alcanzar el volumen final
2.
Incubar 30 minutos a 37º C.
3.
Fenolizar y concentrar.
!
Tampón 10x: Tris-HCl, 0,1 M, pH 8,3; ZnCl2, 10 mM; MgCl2, 10 mM.
2.2.3.3 Ligación de fragmentos de DNA
La DNA ligasa del fago T4 cataliza la formación de los enlaces fosfodiéster entre
los extremos 3´-hidroxilo y los extremos 5´-fosfato de DNA de doble cadena
(Sambrook y col., 1989). En esta reacción se requieren iones Mg2+ y ATP que se
encuentran en el tampón de ligación. Esta ligasa cataliza la formación de enlaces
fosfodiéster tanto de extremos romos como de extremos protuberantes.
PROTOCOLO VII: LIGACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA
1.
• tampón de ligación 10X (1/10 del volumen final)
• vector (la cantidad de mg deseada)
• inserto (la cantidad de mg necesaria teniendo en cuenta la anterior)
• DNA ligasa del fago T4 (2 unidades de enzima por cada mg de DNA)
• agua Milli-Q (Millipore) necesaria para alcanzar el volumen final (10 a 20 ml)
2.
Incubar a 14ºC durante 4 a 16 horas.
2.2.3.4 Electroforesis de DNA en geles de agarosa
La electroforesis de DNA en geles de agarosa es una de las herramientas de biología
molecular más utilizadas, debido en gran parte a la facilidad de preparación y
realización y a la enorme información que puede ofrecer, permitiendo realizar mapas de
restricción, calcular la cantidad de DNA presente en una muestra, averiguar el tamaño
de un fragmento de DNA, etc. Para su realización se siguieron los protocolos publicados
por Sambrook y col. (1989), con algunas modificaciones.
Dos factores son los que influyen en la preparación de geles de agarosa: la
concentración de agarosa y el tampón en el que ésta se prepara. En todos los casos el
tampón utilizado fue TAE. La concentración de agarosa empleada varió entre 0.8 y 1.2
%, dependiendo del tamaño de las bandas que se pretendía separar. El voltaje utilizado
nunca superó los 5 V/cm, y siempre sin sobrepasar los amperios permitido por la fuente
de alimentación. Paralelamente a las muestras se cargaron marcadores de peso
molecular, consistentes en DNA del fago Lambda digerido con distintas enzimas de
restricción. Se utilizaron en paralelo digestiones de Lambda con PstI y con HindIII.
PROTOCOLO VIII: ELECTROFORESIS DE DNA EN GELES DE AGAROSA
1.
Disolver la cantidad de agarosa apropiada en tampón TAE por calentamiento. Dejar solidificar en un molde con
el número y tipo de pocillos deseado.
2.
Una vez preparado el gel, se pone éste en la cubeta de electroforesis y se llena con tampón TAE hasta cubrir el
gel con aproximadamente 2 o 3 mm de tampón. Cargar la muestra en los pocillos y conectar la fuente de
electroforesis al amperaje y voltaje apropiados.
3.
Añadir y mezclar con la muestra de DNA a analizar 1/6 volumen de tampón de carga 6x. El tampón de carga
confiere mayor densidad a la muestra, haciendo que ésta descienda por el pocillo y no difunda por el tampón. El
volumen final debe ser tenido en cuenta a la hora de seleccionar el tamaño de los pocillos.
TINCIÓN Y FOTOGRAFIADO DEL GEL
4.
Sumergir el gel en una solución del agente intercalante bromuro de etidio 0,5 mg/ml en oscuridad
(aproximadamente durante unos 20 minutos).
5.
Observar el gel bajo una fuente de luz ultravioleta (se utilizó el transiluminador Spectroline TR-302 a una
longitud de onda de 302 nm).
6.
Fotografiar el gel (la imagen de los geles se capturó y se imprimió con el sistema Video Graphic Printer UP890CE de Sony).
!
!
Tampón TAE: Tris-HCl pH 8, 40 mM; acetato sódico, 5mM; EDTA, 2 mM.
Tampón de carga 6x: azul de bromofenol, 0,25 % (avanza a través del gel de manera equivalente a un fragmento
de DNA de unos 750 pb); xilencianol, 0,25 %; EDTA, 25 mM; sacarosa, 40 %.
2.2.3.5 Extracción de fragmentos de DNA de geles de agarosa-TAE
Para la extracción de fragmentos de DNA a partir de los geles de agarosa se siguió
el método comercial de la casa Amersham (Gel Band Purification Kit) siguiendo las
instrucciones del fabricante.
PROTOCOLO IX: EXTRACCIÓN DE ADN MEDIANTE GBPK.
1. - Cortar la banda de interés del gel de agarosa y pesarla.
2. - Añadir 10 µl de “capture buffer “ por cada 10 mg de azarosa presente en la banda
3. - Incubar en un baño a 60ºC hasta que la agarosa esté disuelta (5-15’)
4. - Colocar el liquido en una micro columna GFX, e incubar a temperatura ambiente 1’.
5. - Centrifugar 30’’ en centrífuga Eppendorf (máxima velocidad)
6. - Añadir a la columna 500 µl de bufer de lavado y centrifugar 30’’
7. - Añadir 30-60 µl de agua destilada e incubar a temperatura ambiente 1’.
8. - Centrifugar 1’ y recoger el DNA purificado.
!
!
Capture buffer: Solución tampón que contiene acetato y caotropo.
Búfer de lavado: Tris-EDTA (10mM Tris-HCl pH 8, 1mM EDTA). Añadir etanol absoluto hasta una
concentración final de 80 %.
2.2.4 Técnicas de introducción de DNA en bacterias
2.2.4.1 Transformacion en E. coli
La introducción de DNA en células de E. coli se llevó a cabo mediante
transformación de células competentes, siguiendo los protocolos publicados por
Sambrok y col. (1989). Para conseguir células competentes se siguió el método del
cloruro de rubidio que se describe a continuación, utilizando como hospedadoras las
cepas de E. coli DH5( y XL1Blue.
2.2.4.2 Obtención de células de E. coli competentes por el método del cloruro de
rubidio
Este protocolo fue descrito por Hanahan (1983; 1985) y permite obtener eficiencias
de 108 transformantes/mg de DNA.
PROTOCOLO X: CÉLULAS DE E. coli COMPETENTES CON CLORURO DE RUBIDIO
1.
A partir de una colonia aislada preparar un preinóculo en medio SOB, cultivando a 37ºC durante 12 a 16 horas
con agitación orbital a 250 r.p.m..
2.
Inocular 100 ml de medio SOB con 1 ml del preinóculo. Cultivar a 37º C con agitación a 250 r.p.m. hasta que el
cultivo alcance una densidad óptica a 600 nm de 0,4.
3.
Enfriar el cultivo en hielo y centrifugar 5 minutos a 6000 r.p.m. (en rotor GSA de Sorvall o equivalente) a 4ºC.
4.
Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 30 ml de solución RF1, en frío. Centrifugar 5 minutos a
6000 r.p.m. (en centrífuga Sorvall) a 4ºC.
5.
Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 8 ml de solución RF2 fría.
6.
Repartir alícuotas de 200 µl en tubos Eppendorf de 1,5 ml y congelar inmediatamente en nitrógeno líquido.
Conservar a –70ºC.
!
Solución RF1: RbCl, 100 mM; MnCl2, 50 mM; acetato potásico, 30 mM; CaCl2, 10 mM; glicerol, 15 %. Ajustar
el pH a 5,8 con ácido acético 0,2 M. Esterilizar por filtración.
!
Solución RF2: MOPS pH 7, 10 mM; RbCl, 10 mM; CaCl2, 75 mM; glicerol, 15 %. Ajustar el pH a 6,8 con
NaOH. Esterilizar por filtración a través de una membrana de 0,22 mm.
2.2.4.3 Transformación de células competentes de E. coli
Este protocolo de transformación fue descrito por Hanahan (1983) y, además de ser
prácticamente universal para cualquier cepa de E. coli, permite la transformación de
células competentes obtenidas por cualquiera de los dos métodos anteriormente
descritos.
PROTOCOLO XI: TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES DE E. coli
1.
Descongelar las células competentes, manteniendo el microtubo en hielo.
2.
Añadir el DNA en un volumen de 1 a 10 ml. Mantener la mezcla en hielo durante 30 minutos.
3.
Aplicar un choque térmico a 42ºC durante 90 segundos y volver rápidamente a enfriar en hielo.
4.
Añadir cuatro volúmenes de LB e incubar durante 1 hora a 37ºC.
5.
Sembrar en placas con medio selectivo.
2.2.4.4 Selección por color de los transformantes
Algunos plásmidos poseen un fragmento del gen lacZ, correspondiente a la
subunidad (, que permite complementar la deleción presente en el gen lacZ del operón
lac de la cepa de E. coli DH5( que , por tanto, carece de actividad !-galactoxidasa.
Cuando las células de E. coli DH5( son transformadas con alguno de estos plásmidos,
recuperan su actividad !-galactoxidasa. De esta forma se pueden seleccionar los
transformantes, ya que aparece un color azul al incubarlos en presencia de IPTG, que es
un fuerte inductor del gen lacZ, y de X-Gal, que es el responsable de que aparezca ese
color azul ya que el X-Gal es utilizado como sustrato por la !-galactoxidasa. Si se
produce la inserción de un fragmento de DNA dentro de la región múltiple de clonación
presente en estos plásmidos, se produce la interrupción del gen lacZ, no se degrada el
sustrato X-Gal, y por lo tanto, no aparece el color azul. Este método permite diferenciar
los transformantes sin inserto (color azul) de los recombinantes (color blanco)
(Sambrook y col., 1989).
2.2.4.5 Conjugación en corinebacterias
El protocolo utilizado es el descrito por Schäfer y col. (1990). En todos los ensayos
de conjugación se utilizó como cepa donadora E. coli S17-1, transformada con las
construcciones adecuadas, y como cepas aceptoras se utilizaron Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032 y Brevibacterium lactofermentum R31.
PROTOCOLO XII: CONJUGACIÓN EN CORINEBACTERIAS
1.
Transformar el plásmido de interés en la cepa de E. coli S17-1.
2.
Crecer la cepa donadora E.coli S17-1 que porta el plásmido en medio LB suplementado con el antibiótico
adecuado, a partir de 1 ml de preinóculo crecido durante 12-14 horas hasta unos valores de DO600 entre 1-1,5.
3.
Inocular 100 ml de medio TSB con 1 ml de preinóculo de C. glutamicum o B. lactofermentum crecido durante
12-14 horas. Crecer a 30ºC en agitación hasta una DO600 entre 3-4.
4.
Recoger 3.108 células receptoras y donadoras en un Eppendorf mezclando suavemente. Centrifugar y lavar a
continuación las células recogidas en medio TSB.
5.
Repetir la centrifugación y resuspender cuidadosamente en un volumen de 0,5 ml de medio TSB.
6.
Aplicar 300 µl de la mezcla celular sobre un filtro de acetato de celulosa con un diámetro de poro de 0,45 µm
(Millipore) situado sobre una placa de medio TSA. Incubar a 30ºC durante 20 horas.
7.
Recoger la mezcla del filtro y resuspender en 200 µl de medio TSB.
8.
Plaquear la mezcla celular en medio TSB suplementando con el antibiótico correspondiente y ácido nalidíxico.
2.2.5 Técnicas de hibridación de DNA
La técnica de hibridación de DNA fue descrita por Southern (1975) y se conoce
como transferencia de Southern (“Southern blotting”). Durante este proceso, el DNA se
transfiere desde el gel de agarosa a una membrana de nailon (en este trabajo se utilizó la
membrana Nylon Hybond-N de Amersham), sobre la cual se realiza la hibridación
propiamente dicha entre el DNA transferido y la sonda.
2.2.5.1 Transferencia de DNA desde un gel de agarosa a un soporte sólido
El método que se utilizó para transferir los fragmentos de DNA separados
previamente por electroforesis en gel de agarosa fue el sistema de vacío VacuGene XL
de LKPB.
PROTOCOLO XIII: TRANSFERENCIA DE DNA DESDE GELES DE AGAROSA A MEMBRANAS DE
NAILON
1.
Cortar una membrana de nailon de dimensiones ligeramente mayores que el gel de agarosa.
2.
Empapar la membrana en SSC 2x y colocarla en la unidad de transferencia, siguiendo las instrucciones del
fabricante.
3.
Comenzando por un extremo, colocar el gel sobre la membrana, evitando la formación de burbujas entre el gel y
la membrana que impidan el paso del DNA. Conectar la bomba de vacío, asegurándose que alcanza una presión
de 50 mb.
4.
Cubrir toda la superficie del gel con HCl 0,25 M y dejar 20 minutos.
5.
Retirar la solución de HCl y lavar el gel con agua destilada.
6.
Cubrir el gel con solución desnaturalizante y dejar 30 minutos, asegurándose de que siempre haya solución
encima del gel.
7.
Retirar la solución desnaturalizante y lavar con agua destilada.
8.
Cubrir el gel con solución neutralizante y dejar 30 minutos.
9.
Retirar la solución neutralizante y lavar con agua destilada.
10. Cubrir el gel con SSC 20x y mantener durante 90 minutos.
11. Retirar todo el líquido, marcar la posición de los pocillos sobre la membrana y retirar el gel. Desmontar el
sistema de vacío y retirar la membrana.
12. Lavar la membrana con SSC 2x, dejar secar y fijar el DNA con luz ultravioleta (se utilizó el UV-Stratalinker
2400, Cultec).
1
SSC 20X: NaCl, 3 M; citrato sódico, 0,3 M; pH 7.
2.2.5.2 Marcaje de DNA con digoxigenina
Los fragmentos de DNA que se utilizaron como sonda fueron marcados mediante la
técnica de iniciación o cebado al azar (“random primer”) por medio del sistema
comercial no radiactivo DIG System (Boehringer Mannheim). Esta técnica se basa en la
incorporación al azar en el DNA del hapteno esteroide digoxigenina, molécula que se
introduce en el DNA como dUTP-digoxigenina por acción del fragmento Klenow de la
DNA polimerasa I de E. coli. Durante la reacción, los hexanucleótidos (que representa
todas las posibles combinaciones con repetición de los cuatro nucleótidos tomados de 6
en 6) actúan de cebadores y el Klenow extiende esos cebadores copiando la cadena de
DNA que se ha introducido en la mezcla de reacción para sintetizar la sonda.
PROTOCOLO XIV: MARCAJE DE LA SONDA CON DIGOXIGENINA
1.
1 mg del DNA se emplea como sonda de hibridación, se linealiza y posteriormente se purifica por extracción con
fenol-CIA y después se precipita. Resuspender en 16 ml de agua Milli-Q estéril.
2.
Desnaturalizar el DNA por calentamiento a 95ºC durante 10 minutos y pasar rápidamente a hielo con metanol
para evitar la renaturalización.
3.
Añadir 2 ml de la mezcla de nucleótidos, 2 ml de la mezcla de hexanucleótidos y 1 ml del fragmento Klenow.
Incubar a 37ºC durante 2 a 20 horas.(*)
4.
Parar la reacción con 2 ml de EDTA pH 8, 0,25 mM.
5.
Precipitar con 2,5 ml de LiCl 4 M y 75 ml de etanol. Mantener a –20ºC varias horas, centrifugar a 14000 r.p.m.
(en centrífuga Eppendorf 5415 C o equivalente) durante 30 minutos a 4ºC y resuspender en agua Milli-Q.
(*) Es posible adquirir una mezcla de todos los reactivos utilizados en este paso (DIG-High Prime)
2.2.5.3 Hibridación
Una vez transferido el DNA a la membrana de nailon y disponiendo de la sonda
marcada, el siguiente paso es la preparación de la membrana para la hibridación, de
modo que queden bloqueados todos los posibles lugares de unión inespecífica de la
sonda a la membrana. Este paso de preparación recibe el nombre de prehibridación, y
debe realizarse a la misma temperatura que la hibridación. Para ello se cubre la
superficie de la membrana que no tiene DNA fijado con un agente bloqueante, como
DNA de esperma de salmón. Una vez realizada la prehibridación se procede con la
hibridación propiamente dicha.
La temperatura a la que se realiza la hibridación determina la especificidad de unión
entre la sonda y los ácidos nucleicos fijados a la membrana, de forma que a mayor
temperatura de hibridación mayor debe ser la homología entre la sonda y el DNA para
que se unan. La astringencia de la hibridación puede ser aumentada también mediante la
adición de formamida a la solución de hibridación. Se debe desnaturalizar la sonda antes
de añadirla a la bolsa de hibridación, evitando así la formación de estructuras
secundarias que dificultarían la unión de la sonda al DNA de la membrana.
PROTOCOLO XV: PREHIBRIDACIÓN E HIBRIDACIÓN
PREHIBRIDACIÓN
1.
Colocar la membrana en una bolsa de plástico y añadir a la misma 20 ml de solución de hibridación por cada 100
cm2 de membrana. Sellar la bolsa e incubar a la temperatura de hibridación(*) durante 1 a 6 horas.
HIBRIDACIÓN
2.
Diluir la sonda en la solución de hibridación a razón de 5 a 25 ng/ml.
3.
Desnaturalizar la sonda por calentamiento a 95ºC durante 10 minutos y enfriar rápidamente en hielo.
4.
Eliminar la solución de prehibridación y añadir la solución de hibridación con la sonda. Incubar a la temperatura
de hibridación (*) un mínimo de 8 a 10 horas.
5.
Recuperar la solución de hibridación con la sonda y mantener a –20ºC, ya que se puede reutilizar en otras
hibridaciones.
6.
Lavar dos veces la membrana con solución de lavado I durante 15 minutos a temperatura ambiente.
7.
Lavar dos veces la membrana con solución de lavado II durante 15 minutos a la temperatura de hibridación.
8.
Proseguir con la detección (Protocolo XV).
!
!
!
Solución de hibridación: SSC, 5x; Agente Bloqueante (Boehringer Mannheim); sarcosil, 0,1 %; SDS, 0,02 %.
(*)
Solución de lavado I: SSC, 2x; SDS, 0,1 %.
Solución de lavado II: SSC, 0,1x; SDS, 0,1 %.
La temperatura de hibridación óptima para cada sonda debe ser calculada experimentalmente. Para sondas
homólogas en un 100 %, la temperatura debe ser de 65 a 68ºC, con soluciones de hibridación sin formamida.
2.2.5.4 Detección colorimétrica
Para detectar las bandas donde se ha unido la sonda se utiliza una reacción de los
compuestos “nitrobluetetrazolium” (NBT) y 5-bromo,4-cloro,3-indolil-fosfato (BCIP o
X-fosfato) catalizada por la enzima fosfatasa alcalina, que se encuentra conjugada a un
anticuerpo antidigoxigenina. En los lugares donde se ha unido la sonda, se produce la
precipitación de un compuesto de color violeta como consecuencia de la actividad de la
fosfatasa alcalina. Después de la hibridación hay que bloquear la superficie de la
membrana que no tiene unida la sonda, para evitar la unión inespecífica del anticuerpo.
PROTOCOLO XVI: DETECCIÓN COLORIMÉTRICA CON NBT Y X-FOSFATO
1.
Lavar la membrana con tampón de detección I durante 1 minuto.
2.
Bloquear la membrana con tampón de detección II durante 30 minutos.
3.
Diluir el anticuerpo antidigoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim) en tampón de
detección II en proporción 1:15000.
4.
Cambiar el tampón de detección II por la mezcla con anticuerpos. Incubar 2 horas.
5.
Eliminar la solución anterior y lavar dos veces con tampón de detección I durante 15 minutos.
6.
Lavar con tampón de detección III durante 2 minutos.
7.
Mezclar 45 ml de solución NBT y 35 ml de solución BCIP con 10 ml de tampón III. Colocar la membrana
en una bolsa de plástico, añadir la mezcla de reactivos y sellar la bolsa.
8.
Incubar a temperatura ambiente en oscuridad. Observar cada cierto tiempo la aparición de las manchas.
9.
Cuando la señal de hibridación es lo suficientemente buena, detener la reacción con tampón TE. Se debe
prestar atención para que el filtro no adquiera una tonalidad amarilla por una reacción demasiado
prolongada.
!
!
!
!
!
Tampón de detección I: ácido maléico, 100 mM; NaCl, 150 mM; pH 7,5.
Tampón de detección II: Tampón I más 1 % de agente bloqueante.
Tampón de detección III: Tris-HCl pH 9,5, 100 mM; NaCl, 100 mM; MgCl2, 50 mM.
Solución NBT: NBT, 75 mg/ml en dimetilformamida 70 %.
Solución BCIP: 50 mg/ml en dimetilformamida 70 %.
2.2.6 Reacción en cadena de la DNA polimerasa
Esta técnica permite la amplificación de ácidos nucleicos (Mullis y Faloona, 1987).
Partiendo de una molécula de DNA diana podremos amplificar entre 105 y 109 veces
una secuencia específica contenida en ella, mediante la utilización de unos
oligonucleótidos o cebadores diseñados al efecto.
Procedimiento experimental
Se prepara en un tubo Eppendorf de 500 µl en un baño de hielo y agua, la siguiente mezcla de
reacción con un volumen final de 100 µl: 60,5 µl de agua destilada estéril, 10 µl de Buffer PCR (10x), 10
µl de mezcla de desoxinucleótidos (2mM), 5 µl de Cebador 1 (20 µM), 5 µl de Cebador 2 (20 µM), 0,5 µl
de Taq Polimerasa (5 unidades), 8 µl de MgCl2 (25 mM) y 1 µl de DNA molde. Se añade 50 µl de aceite
mineral estéril y se introduce el tubo en un termociclador programado con las siguientes condiciones:
1. Desnaturalización inicial: 1 ciclo de 5 minutos a 95ºC.
2. Amplificación: consta de 30 ciclos cada uno de los cuales dividido en tres partes:
- desnaturalización: 45 segundos a 95ºC
- anillamiento: 45 segundos a la temperatura adecuada según las
características de los cebadores.
- extensión 60 segundos a 72ºC.
3. Extensión final: 1 ciclo de 8 minutos a 72ºC.
2.2.7 Técnicas de secuenciación de DNA
2.2.7.1 Determinación de la secuencia de nucleótidos
El proceso de secuenciación se ha realizado por el método de los dideoxinucleótidos
de Sanger y col. (1977). Se ha empleado el sistema de secuenciación no radiactiva
Thermo Sequenasa fluorescent labelled primer cycle sequencing kit (Amersham
Pharmacia Biotech). La síntesis de DNA complementario a partir de un iniciador
(primer) , marcado en posición 5’ con fluoresceína, la realiza la termosecuenasa, que se
trata de una DNA polimerasa termoestable. La polimerización se realiza en cuatro
mezclas separadas, cada una de las cuales contiene los cuatro dNTPs y una baja
concentración de uno de los ddNTPs. La incorporación de los ddNTPs a la cadena
provoca el final de la polimerización; esto ocurre a distintos tiempos, dando lugar a una
población de moléculas fluorescentes de diferentes tamaños en cada una de las cuatro
mezclas. Entonces las reacciones son cargadas en cuatro pocillos adyacentes de un gel
de acrilamida y sometidos a electroforesis. Los fragmentos de DNA migran a lo largo
del gel y atraviesan un haz fijo de luz láser, generando señales fluorescentes que son
inmediatamente detectadas y almacenadas por el sistema.
PROTOCOLO
XVII: SECUENCIACIÓN CÍCLICA CON Thermo sequenasa CON UN PRIMER
MARCADO CON FLUORESCEÍNA
1.
Sacar los reactivos A, C, G y T del kit para que se descongelen y mantener en hielo.
2.
Sacar también los primers universal y reverso
3.
Tomar de 0,5 - 5 µg de DNA de doble cadena, (aproximadamente 2 µg) en un volumen de 22 µl.
4.
Marcar los tubos de PCR
5.
Preparar 4 premezclas que contengan por reacción:
• 1 µl de primer fluorescente que contenga 1 - 2 pmoles/µl
• 2 µl de reactivo A, C, G o T.
Mezclar bien y mantener en hielo estas premezclas.
6.
Poner 3 µl de cada una de las 4 premezclas a los tubos de PCR y añadirles 5 µl de DNA. Mezclar bien.
7.
Poner las reacciones en el termociclador usando el siguiente programa:
• 95ºC durante 5 minutos
• 20 ciclos: 95ºC 30 segundos y 60ºC 30 segundos
• 72ºC 7 minutos
• 4ºC 2
8.
Añadir 3 µl de buffer de parada (de Pharmacia), pipeteando arriba y abajo para mezclarlo bien. Mantener en hielo
y guardar a -70ºC hasta cargar el gel.
2.2.7.2 Métodos de análisis informático de secuencias
Programa
BLAST
CLUSTAL
DAS
EBI
(European Bioinformatics
Institute)
EDITSEQ
FASTA
MAPDRAW
NCBI (Pubmed)
Origen
Aplicaciones
Identificación
problema.
de
secuencias
(Altschul y col., 1997)
Estudios
filogenéticos
alineamientos de secuencias.
y
www.ebi.ac.uk/clustalw/
(Thompson y col., 1994)
Establecimiento
de
segmentos
hidrofóbicos en secuencias proteicas.
www.sbc.su.se/~miklos/DAS/
Obtención de las secuencias de genes
o proteínas ya descritas y publicadas
en las bases de datos.
www.ebi.ac.uk/services/
Manejo de secuencias: conversión de
secuencias nucleotídicas en sus
complementarias o sus reversas
complementarias y traducción de las
mismas a secuencias proteicas.
DNASTAR
Identificación
problema.
www.ebi.ac.uk/fasta33/index.html
de
secuencias
(Cserzo y col., 1997)
(Wellcome Trust Genome Campus, Cambridge,
UK)
(DNAstar Inc., Madison, Wisconsin, USA)
(Lipman y Pearson, 1985)
Establecimiento de mapas de
restricción y marcos de lectura
abiertos en una secuencia de DNA
problema.
DNASTAR
Búsquedas bibliográficas.
www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/
(Rockville Pike, Bethesda, USA)
(National Center for
Biotechnology Information)
NCBI (Taxonomy)
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
Búsquedas taxonómicas.
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/
query.fcgi?db=Taxonomy
(National Center for
Biotechnology Information)
(Rockville Pike, Bethesda, USA)
Neural Network
Promoter Prediction
Identificación de posibles
promotores.
www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html
PROSITE
Determinación
de
motivos
y
dominios conservados con función
establecida.
us.expasy.org/prosite/
(Reese y Eeckman, 1995)
(Bairoch y col., 2002)
PRIMERSELECT
PROTPARAM
Diseño de oligonucleótidos para la
amplificación de fragmentos de DNA
por PCR.
DNASTAR
Obtención de parámetros
químicos de proteínas.
us.expasy.org/tools/protparam.html
físico-
(Bairoch y col., 2002)
3
Resultados
3. Resultados
3.1 Fundamentos del presente trabajo de investigación.
La caracterización de las enzimas implicadas en el metabolismo del ácido
glucónico en Corynebacterium glutamicum fue iniciada por Mateos y col. (1996).
Estudiando el proceso de conjugación entre E. coli y Corinebacterias se obtuvieron
vectores suicidas conjugativos portadores de fragmentos al azar de C. glutamicum
mediante el cual podían recombinar con la zona del genoma bacteriano homóloga al
fragmento portado por el plásmido. Usando esta metodología se aislaron mutantes
denominados TRA que presentaban distintas características, siendo uno de ellos
incapaz de crecer en medio mínimo con glucónico como única fuente de carbono (clon
TRA-8). El plásmido integrado fue rescatado del cromosoma y su posterior
secuenciación permitió determinar que la integración afectaba al gen gntP, el cual
codifica para la actividad enzimática gluconato permeasa (Valbuena, 1999). Dado que
en microorganismos como E. coli o B. subtilis el gen gntP se encuentra formando un
operón con el gen gntK (gluconato kinasa), intentamos estudiar la organización de los
genes de C. glutamicum implicados en la utilización del glucónico.
3.2 Identificación del gen gntK (gluconato kinasa) en el
genoma de Corynebacterium glutamicum
El primer paso para identificar el gen implicado en la actividad enzimática
gluconato kinasa fue analizar el genoma total del microorganismo estudiado. Para ello
se realizó una búsqueda en las bases de datos de los genes ya caracterizados como
codificantes para la actividad gluconato kinasa en distintos microorganismos tales
como: Streptomyces coelicolor, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis,
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteriditis,
Vibrio cholerae, Yersinia pestis, etc.
Así pues se recurrió a una amplia lista de
distintos genes gntK de los cuales la mayoría presentaban un tamaño similar de 500 pb
aproximadamente, exceptuando B. subtilis y S. aureus con un tamaño de casi el triple
de nucleótidos. El resultado de esta búsqueda nos permitió identificar una secuencia,
no caracterizada en la base de datos, dentro del genoma total de C. glutamicum tomada
como probable gen gntK. Es interesante señalar que cuando se realizó este trabajo se
disponía de la secuencia del genoma de C. glutamicum en “bruto”, es decir, no
anotada. En la Figura 3.1 se representa un alineamiento de la proteina para la cual
codificaba esta secuencia problema con respecto a 4 enzimas gluconato kinasa de los
microorganismos que podrían considerarse como los más representativos a la hora de
establecer identidades.
Con la secuencia establecida como posible gen gntK, se realizó una búsqueda
dentro del genoma completo no anotado de C. glutamicum para posicionarla. Para ello
se utilizaron los primeros 40 nucleótidos de la secuencia encontrada (extremo 5´ del
gen) como palabra a buscar dentro de un archivo de texto que contenía el genoma
completo de C. glutamicum; de esta forma se localizó el gen gntK con respecto al
origen de replicación tomado como punto inicial del archivo que contenía la secuencia
completa del genoma y se determinó la longitud total del gen correspondiente que es
de 504 nucleótidos. Igualmente se identificaron los marcos de lectura adyacentes al gen
gntK para posicionarlos dentro de un hipotético operón y comprobar si alguna de las
secuencias adyacentes tenía alguna función relacionada con el metabolismo del ácido
glucónico. Los resultados obtenidos nos indujeron a pensar que este gen se encuentra
de forma aislada en el genoma de C. glutamicum, sin formar parte de operón alguno.
Streptomyces coelicolor
Escherichia coli(gntK)
Pseudomonas aeruginosa
Neisseria meningitidis
60
MSAAEGLHIVV-MGVSGCGKSSVGKALAAELG-IEYKDGDELHPQENIDKMASGQALDD
MQQLHTPHVVVVMGVAGTGKTTIGPLLAARLG-VPYAEGDDFHPPANIAKMTAGTPLTD
MSTTNHDHHIYVLMGVSGSGKSAVASEVAHQLH-AAFLDGDFLHPRRNIEKMASGEPLND
MHPPLQALVIMGVAGCGKSSVSQALCQRSG-AHGIEGDSFHPAANIRKMSAGIPLTD
MTTHFVVMGVCGCGKTTAALSLQKHLGQCPYAEGDEFHTQANRDKMGAGIPLTD
* *** * **: :. :
::
: :** :*: :*: ** :*.:*:*
Secuencia consenso
...........V.MGV.GcGKs.va..l...lg...y.#GD.fHp.aNi.KM.aGipLtD
120
DDRAWWLVQVG--KWLRDRPS---GVIACSALKRSYRDLLRTKCPGTVFVHLHGDYDLLL
EDRWPWLDAIG--GWAHGRAG-LGGVVSSSALKRSYRDRLRAAAPGVVFVHLTGSRELIE
DDRKPWLQALNDAAFAMQRTN-KVSLIVCSALKKHYRDLLREGNPNLSFIYLKGDFDVIE
DDRAGWLDTLAEQLRQAVAAG-KLPVLTCSALKRAYRDRLRRAVPGLGIVYLELTPAVAA
EDRYPWLGNLRDWMTQQAQNGANHTIVTCSALKRGYRDILRGAEGKAAFIHLSPPQDINL
*** :** : :
.
:
:****: *** ** : :
:*:*
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Secuencia consenso
#DR.pWL..l.d...q....g......tcSALKr.YRD.LR.a.p...f!hL....d...
180
SRMKAREDHFMPSTLLDSQFATLE-PLEDDEDGKVFDVAHTISELAAQSAEWVRNK
DRMSHRQGHFMPTALLDSQFATLQ-PLQPDEAGVAVDVAGTPEEITERAVDALKGLPGPVQ
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ERMMSRKGHYMKAGMLDSQLEILEELGEGEYGVKIANPGTP-EAVEADILNWVASENLL
:*: *.:**:.. *:::*:. **.:. :* .
*
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:
Secuencia consenso
eRm..RkgH%mka.$ldsQfe.L#epg.d#..v...#...p.e.v.a....w.........
Figura 3.1.- Alineamiento proteico correspondiente al gen gntK
algunos de los microorganismos analizados.
(actividad gluconato kinasa) en
3.2.1 Amplificación del hipotético gen gntK por Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR)
Una vez identificado el posible gen gntK se procedió a realizar una amplificación
de la secuencia problema. En primer lugar, se realizó una extracción de DNA total de
C. glutamicum siguiendo el método previamente descrito (MyM 2.2.1.1). A partir de
las secuencias adyacentes al gen gntK se diseñaron dos oligonucleótidos que serían
utilizados como cebadores para dicha amplificación. A los oligonucleótidos diseñados
se les añadieron extremos de reconocimiento para las endonucleasas BamHI (oligo de
la región 5´ del gen) y HindIII (oligo del extremo 3´del gen) para que el fragmento
amplificado resultante del proceso de amplificación por PCR (MyM 2.2.6) pudiera
insertarse de forma sencilla y dirigida en un vector de clonación. El resultado de la
amplificación se sometió a una electroforesis en gel de azarosa (MyM 2.2.3.4) para
establecer si el tamaño del fragmento obtenido se correspondía con el esperado: 738
nucleótidos (Fig. 3.2); el aislamiento de la banda del gel se realizó mediante el
protocolo descrito (MyM 2.2.3.5).
1
2
B)
A)
BamHI
0,7 Kb
HindI I I
11,5 Kb
5,1 Kb
4,5 Kb
2,8 Kb
2,4 Kb
2,1 Kb
1,7 Kb
1,1 Kb
0,8 Kb
0,5 Kb
Figura 3.2.- A) Mapa de restricción del fragmento gntK incluyendo una representación gráfica de los
oligonucleótidos diseñados que permitieron amplificar esta secuencia. B) Foto del gel realizado para
comprobar el tamaño del fragmento amplificado por PCR. Carril 1, se observa una banda de DNA
correspondiente al fragmento del tamaño esperado (738 pb); carril 2, como marcador de tamaños,
genoma del fago lambda digerido con PstI.
3.2.2 Subclonación del gen gntK
El fragmento amplificado del genoma de C. glutamicum fue sometido a una
digestión doble con las enzimas de restricción BamHI y HindIII (MyM 2.2.3.1); al
mismo tiempo se sometió al vector pBluescript SK a digestión con las mismas enzimas
de restricción, obteniéndose en el vector extremos compatibles con los del fragmento
amplificado. La posterior ligación y selección de tansformantes en la cepa E. coli
XL1Blue (por resistencia al antibiótico ampicilina) nos permitió identificar el plásmido
recombinante pKSK11 que presentaba un tamaño de 3,7 Kb acorde al esperado y con
las características que se reseñan en la Figura 3.3.
BamHI
gntK
LacZ
bla
HindIII
HindI I I
Bam HI
pBluescript SK
2.9 kb
MCS
PCR
LacI
BamHI
HindI I I
E.coli Ori
PstI
HindBam
III+HI
HindBam
III+HI
Ligasa T4
HindIII
PstI
Bam HI
LacI
LacZ
pKSK 11
3.7 kb
E.coli Ori
bla
Figura 3.3.- Subclonación del fragmento conteniendo el gen gntK en el vector pBluescript KS para
obtener el plásmido recombinante pKSK11.
3.2.3 Secuenciación y análisis del gen gntK
Se realizó una secuenciación de la construcción pKSK11, utilizando para ello el
método enzimático de Sanger o método de los didesoxinucleótidos (MyM 2.2.7.1) en
un sentido y en el contrario, mediante primers directos y reversos correspondientes al
vector pBluescriptSK. Se comprobó que el fragmento portado por esta construcción era
realmente el correspondiente al gen gntK y en la Figura 3.4 se muestra la secuencia
nucleotídica obtenida. Posteriormente se obtuvieron los parámetros físico-químicos de
la enzima (Tabla 3.1) y se estudiaron las secuencias adyacentes al gen para buscar
potenciales regiones reguladoras, así como regiones internas que pudieran constituir
motivos o dominios importantes. Se realizó una búsqueda de un posible promotor para
la región 5´ de la secuencia estudiada; de esta forma se identificó un potencial
nucleótido de inicio de la trascripción (+1) posicionando las cajas -10 (5’TATGAT3’) y
-35 (5’CTTACA3’) como se muestra en la Figura 3.4. De una forma análoga se localizó
una posible región de unión con la proteína CRP en un sistema de represión catabólica,
siendo la secuencia: 5’TGTGA-N6-ACACC3’ (De Combrudghe, 1984). Por último la
comparación del gen gntK con la base de datos PROSITE, ha permitido localizar un
sitio de unión a ATP/GTP propio de kinasas: 5´[AG]-x(4)-G-K-[ST]3´.
(BamHI) CGCGGATCC>>>>>>> >>>>>>>>>> >>>>
tatccgctcc acgtgagaat cattccgaac ggaaaagacc aataaacata cagtccccgt gatgtgacca 70
tacacaccac ggggactgtg gcgtaggtct tacaaaattc cccaaaaaga gttatgatag taccaataag 140
tttttgtggc agcctcctgc attcggcagt cgagacgcca ccaaagaaag gataagacat gtcagcagcc 210
M
S
A
A
gaaggcttac atattgtcgt catgggcgtt tctggctgcg gcaaatcctc cgtcggtaaa gccctagcag 280
E
G
L
H
I
V
V
M
G
V
S
G
C
G
K
S
S
V
G
K
A
L
A
cggagctcgg aatcgaatac aaagacggcg acgaacttca cccccaggaa aacatcgaca agatggcctc 350
A
E
L
G
I
E
Y
K
D
G
D
E
L
H
P
Q
E
N
I
D
K
M
A
S
cggccaggca cttgacgacg acgaccgtgc atggtggcta gtccaggttg gcaagtggct ccgcgaccga 420
G
Q
A
L
D
D
D
D
R
A
W
W
L
V
Q
V
G
K
W
L
R
D
R
ccaagcggcg tcatcgcatg ctccgccctc aagcgctcct accgcgatct cctgcgcacc aaatgcccag 490
P
S
G
V
I
A
C
S
A
L
K
R
S
Y
R
D
L
L
R
T
K
C
P
gaaccgtctt cgtccacctc cacggcgact acgatctcct actttcccgc atgaaggccc gcgaagatca 560
G
T
V
F
V
H
L
H
G
D
Y
D
L
L
L
S
R
M
K
A
R
E
D
H
cttcatgcca tccaccttgc tagattccca atttgcaacc ctcgagccgc tcgaagatga cgaagatggc 630
F
M
P
S
T
L
L
D
S
Q
F
A
T
L
E
P
L
E
D
D
E
D
G
aaggttttcg acgttgccca caccatcagc gaactggccg cccaatctgc agagtgggtt cgcaacaaat 700
K
V
F
D
V
A
H
T
I
S
E
L
A
A
Q
S
A
E
W
V
R
N
K
aaacccctaa cccatattag aacaaggatt tgtgcgcttt ttcctgttct ggtgtggctt ttcctcacat 770
.
<<< <<<<<<<<<<
ctaacaatcg aataactgtt cgaataaaag gttgaaggtg tcccaccccc acggcacaat ggatggcaag 840
<<<<<<<<<< <AAGCAAGGG (HindIII)
aacacatgaa tccaggggga tactcatgac cactgacatc tacttcagcc acaacaaccc acacgaccca 910
tacgcccacc acaccaccga actcaaccgc gacacccacc acctctgggt caccctcacc accgactcca 980
acttcgacgc agactccttc accaccgaag tcatccggat caccggctac tcccgccacg aagtcaacaa 1050
Figura 3.4.- Representación del gen gntK: en gris se resalta una posible secuencia de represión
catabólica, en amarillo el posible promotor con sus cajas -10 y -35 y un posible inicio de la trascripción
(+1), en rojo motivo de unión a ATP/GTP propio de una kinasa. También se han representado los
oligonucleótidos diseñados para amplificar el gen gntK por PCR.
Número de aminoácidos: 167
Teórico punto Isoeléctrico: 5.07
Peso Molecular: 18 KDa
Índice de inestabilidad (II): 48.33 (inestable)
Índice alifático: 86.47
Residuos de carga positiva (Asp + Glu): 28
Residuos de carga negativa (Arg + Lys): 19
Tabla 3.1.- Parámetros físico-químicos del enzima Gluconato Kinasa de C. glutamicum.
3.2.4 Interrupción del gen gntK en corinebacterias
El objetivo de este apartado era realizar un análisis funcional que nos permitiera
dilucidar que el gen clonado era realmente el gen gntK. Para este fin se realizó un
ensayo de interrupción del hipotético gen gntK (Shortle y col., 1980) usando el vector
movilizable pK18mob, el cual funciona como plásmido suicida en corinebacterias.
Cuando se clona en pK18mob un fragmento interno de un gen de corinebacterias, la
presión selectiva favorecerá la integración por recombinación homóloga del plásmido
recombinante con la consiguiente interrupción de ese gen en C. glutamicum y B.
lactofermentum. En el caso del gen gntK, y dado el pequeño tamaño del mismo, era
difícil conseguir un fragmento interno que por una parte provoque una interrupción
génica en el cromosoma del hospedador y que tenga un tamaño suficientemente grande
para favorecer los procesos de recombinación homóloga. Para obtener este inserto se
procedió a digerir el fragmento BamHI-HindIII de 0,8 Kb (gen gntK) con la
endonucleasa HaeIII que reconoce una diana de 4 pares de bases; los fragmentos
generados fueron adecuadamente separados en geles de agarosa (al 1,5 %),
seleccionando la banda que presentaba un tamaño de 200 pb.
La banda HaeIII recuperada fue ligada con el plásmido movilizable pK18mob que
había sido previamente digerido con la endonucleasa SmaI y desfosforilado con
fosfatasa alcalina (MyM 2.2.3.2) para evitar en la medida de lo posible los procesos de
reasociación consigo mismo en vez de obtener moléculas recombinantes. Las
construcciones fueron seleccionadas originalmente en la cepa E. coli XL1Blue mediante
selección por resistencia al antibiótico kanamicina y fenotipo blanco en presencia de
IPTG/X-gal para el sistema de #-complementación de la $-galactoxidasa (MyM
2.2.4.4). Los clones seleccionados como positivos fueron denominados pKMM, siendo
posible obtener dos tipos posibles de construcciones (pKMM3 y pKMM4) ya que los
extremos romos generados en las digestiones no permiten mantener la direccionalidad
en la ligación. Posteriormente los plásmidos pKMM3 y pKMM4 fueron utilizados para
transformar la cepa E. coli S17-1 (MyM 2.2.4.1), cepa esta que permite la movilización
de estas construcciones desde E. coli a distintas cepas de C. glutamicum y B.
lactofermentum.
SmaI
BamHI
HindI I I
Hae I I I
Hae I I I
LacZ
gntK
Kan
pK18mob
3.7 Kb
o rV
i
HaeIII
200 pb
o rTi
SmaI+(P)
Ligasa T4
LacZ
LacZ
Kan
Kan
o rV
i
pKMM3
3.9 Kb
o rT
i
o rV
i
pKMM4
3.9 Kb
o rT
i
Figura 3.5.- Construcción de los plásmidos pKMM3 y pKMM4 por digestión HaeIII del fragmento
portador del gen gntK y ligación con el vector pK18mob. Las construcciones obtenidas se diferencian
únicamente por el sentido del inserto.
3.2.5 Conjugación E. coli-corinebacterias y análisis de los
transconjugantes
Una vez obtenidos las cepas de E. coli S17-1 portadores de los vectores pMM3/4, se
realizaron experimentos de conjugación con las cepas de corinebacterias C. glutamicum
ATCC 13032 (silvestre) y la cepa mutante B. lactofermentum R31 (MyM 2.2.4.5). Los
clones transconjugantes de corinebacterias se seleccionaron por resistencia a
kanamicina, y tal como se esperaba, el plásmido se integró en el cromosoma como se
comprobó al intentar aislar plásmidos de estos clones. La integración de estos plásmidos
movilizables recombinantes en el genoma de corinebacterias debe producir una
interrupción génica a nivel del gen gntK, obteniéndose clones que deben presentar una
alteración en la actividad gluconato kinasa. Cabe resaltar que debido al pequeño tamaño
del fragmento homólogo interno al gen (200 pb) el número de transconjugantes
obtenidos fue bajo, entre 30 y 60 por ensayo, utilizando 108 células donadoras. Los
ensayos fueron realizados por duplicado, en todos los casos se obtuvieron resultados
positivos.
3.2.6 Comprobación de interrupción del gen gntK por hibridación
Southern
Con el fin de comprobar si realmente se había producido una interrupción del gen en
los transconjugantes, se realizaron ensayos de hibridación Southern (MyM 2.2.5). La
sonda utilizada en la hibridación fue la banda BamHI-PstI de 0,7 Kb. obtenida a partir
del plásmido pKSK11 (Fig. 3.3). El producto de esta digestión se sometió a una
electroforesis en gel de agarosa y la banda correspondiente fue sometida a marcaje no
radiactivo con digoxigenina.
Se extrajo DNA total de 4 clones transconjugantes distintos: 2 clones de la
conjugación entre E. coli pKMM3/4 con la cepa silvestre de C. glutamicum, 2 clones
del ensayo con el mutante B. lactofermentum R31; como controles se utilizaron las
cepas C. glutamicum ATCC13032 y B. lactofermentum R31. Los DNAs totales de
todas las muestras fueron digeridas con la endonucleasa EcoRI posteriormente
sometidas a electroforesis en gel de agarosa. Las muestras del gel fueron posteriormente
transferidas a una membrana de nylon y sometidas a hibridación con la sonda marcada.
En la Figura 3.6-A se muestran los resultados de la hibridación donde se puede apreciar
claramente que los procesos de integración de los vectores movilizables han ocurrido en
todos los clones transconjugantes interrumpiendo el gen gntK en el cromosoma
bacteriano. En el caso de los dos clones transconjugantes de B. lactofermentum se
observan las 2 posibilidades existentes de la interrupción génica. Los tamaños de las
bandas de hibridación concuerdan con los tamaños estimados para esas bandas después
de producirse la integración de los vectores, tal y como se muestra en el esquema de la
Figura 3.6-B.
A)
M 1
2
3
4
5
6 1
2
3
4
5
6
1) C.glutamicum gntK-1
2) C.glutamicum gntK-2
3) B.lactofermentum gntK-1
11,5 Kb
4) B.lactofermentum gntK-2
5,1 Kb
4,6
4,5
2,8
2,6
2,4
2,1
1,7
6,5 Kb
4,6 Kb
Kb
Kb
Kb
Kb
Kb
Kb
Kb
3,6 Kb
2,8 Kb
1,1 Kb
5) C.glutamicum 13032
6) B.lactofermentum R31
M) Marcador de tamaños: % x PstI
0,9 Kb
B)
Eco RI
Eco RI
Eco RI
Eco RI
3.6 kb
3.6 kb
gnK
t
gnK
t
pKMM 3
pKMM 4
Kan
Eco RI
Kan
Eco RI
Eco RI
Eco RI
Eco RI
Eco RI
Kan
Kan
0.9kb
6.5kb
4.6kb
2.8kb
Figura 3.6.- A) Fotos del gel y membrana de hibridación Southern realizados para comprobar la
interrupción génica de gntK. B) Esquema de los patrones de bandas esperados. En los carriles 1, 2 y 3 de
la membrana de hibridación el patrón de bandas es el esperado para la integración con pKMM4, mientras
que en el cuarto carril se ha producido el patrón de bandas esperado según la integración con pKMM3. En
los controles (carriles 5 y 6) se observan bandas de 3,6 Kb por no presentar la integración del vector. El
resto de las bandas observadas en la membrana de hibridación son producto de una incompleta digestión
EcoRI.
Una vez establecida la interrupción génica hay que comprobar si realmente esta
interrupción provoca algún tipo de mutación que sea fenotípicamente detectable; para
realizar estos análisis, los clones transconjugantes de corinebacterias fueron incubados
en medio mínimo para corinebacterias (MyM 2.1.4.2) con glucosa o ácido glucónico
como únicas fuentes de carbono. En todos los casos el crecimiento de las colonias
analizadas en medio mínimo con glucosa fue positivo tanto en los clones
transconjugantes como en los controles de las cepas originales. Por el contrario cuando
se analizaron los clones tansconjugantes en medio mínimo con glucónico como fuente
de carbono, únicamente fueron capaces de crecer los controles correspondientes a las
cepas originales, pero no los transconjugantes. Los resultados de este experimento se
muestran en la Figura 3.7. La foto A) muestra un crecimiento normal de todos los
clones ya que se trata de una placa petri que contiene medio mínimo con glucosa como
única fuente de carbono. En la foto B) (MM con glucónico como única fuente de
carbono) se observa que sólo crecen correctamente las cepas silvestres; en el caso de C.
glutamicum gntK- se observa un cierto número de revertientes que surgen por la presión
selectiva provocada por la falta de capacidad de metabolizar la única fuente de carbono
presente en el medio. En el caso de las cepas de B. lactofermentum R31 gntK- se
observa que no existe crecimiento y que no hay revertientes, esto es debido a que esta
cepa de B. lactofermentum no crece eficientemente en MM con glucónico.
Figura 3.7.- A) Medio Mínimo con glucosa: 1) Control de positivo de B. lactofermentum R31, sobre ese
control se observan los correspondientes transconjugantes gntK- de esta cepa. 2) Control positivo de C.
glutamicum ATCC13032, sobre este control se sembraron los correspondientes transconjugantes gntK-.
B) Medio Mínimo con glucónico. Se sembraron en idéntica disposición tanto los controles como los
transconjugantes.
3.3 Interrupción del gen gntP (gluconato permeasa)
Como ya hemos explicado, el origen de este estudio fue el descubrimiento del
mutante C. glutamicum TRA-8 que presentaba el gen gntP interrumpido por integración
al azar de un plásmido suicida. Esta interrupción se localizaba cercana al extremo 5´ del
gen gntP. En el presente trabajo se realizó un experimento similar al descrito para
interrumpir el gen de la gluconato kinasa; mediante este procedimiento se pretendía
interrumpir de forma dirigida el gen gntP de una manera distinta a la encontrada en el
mutante TRA-8, es decir, más cercana al extremo 3´ del gen. Para ello se eligió el
fragmento BglII-PstI como fragmento mutagénico (Fig. 3.8). Se esperaba conseguir un
mutante que previsiblemente requerirá ácido glucónico en un medio definido, de forma
análoga al requerimiento que presenta el mutante TRA-8.
*
PstI BglII
gntP (1,5 Kb)
Figura 3.8.- Representación del gen gntP de C. glutamicum. El asterisco (*) indica la zona de integración
en el mutante TRA-8. La zona delimitada por las endonucleasas PstI y BglII ha sido la utilizada en este
trabajo para interrumpir de forma dirigida el gen gntP.
El fundamento del ensayo es análogo al descrito para interrumpir el gen gntK
(Resultados 3.2). Un fragmento PstI-BglII interno al gen gntP fue obtenido del vector
pULMV1 (MyM 2.1.3); el fragmento PstI-BglII de 600 nucleótidos fue purificado de
un gel de agarosa y ligado con el vector movilizable pK18mob, el cual había sido a su
vez digerido con las mismas enzimas de restricción. La mezcla de ligación fue usada
para transformar la cepa E. coli XL1-blue, seleccionando los clones recombinantes por
ausencia de color y resistencia al antibiótico kanamicina; el plásmido recuperado de
estos clones de E. coli presentaba el tamaño y patrón de restricción esperado y se
denominó pKP1 (Fig. 3.9).
BglI I
PstI
LacZ
EcoR I
EcoR I
pKP1
4.3 Kb
oriV
Kan
oriT
Figura 3.9.- Representación del vector pKP1 obtenido de la subclonación de un fragmento del gen gntP
en el vector pK18mob.
Para intentar interrumpir el gen gntP de corinebacterias, se transformaron células de
la cepa E. coli S17-1 con el plásmido pKP1, y se conjugaron C. glutamicum
ATCC13032 y B. lactofermentum R31, cepas en las que el plásmido pKP1 se comporta
como plásmido suicida. Los transconjugantes se obtuvieron por medio TSB con
kanamicina y carecían de plásmido tal y como se esperaba.
3.3.1 Hibridación Southern
Para comprobar que los transconjugantes de corinebacterias obtenidos con el
plásmido pKP1 presentaban integración del plásmido suicida en el cromosoma, y que
dicha integración había ocurrido en la diana cromosómica que estaba siendo objeto de
nuestro análisis (gen gntP), se procedió a realizar un ensayo de hibridación Southern.
Por una parte se realizaron extracciones del DNA total de varios de los transconjugantes
obtenidos pertenecientes a las cepas C. glutamicum y B. lactofermentum R31; los DNAs
totales fueron sometidos a digestión con las endonucleasas de restricción BamHI y
HindIII. La sonda utilizada para la hibridación se obtuvo por digestión del plásmido
pKP1 con la endonucleasa EcoRI (Fig. 3.9); el fragmento obtenido de aproximadamente
500 pb fue purificado y marcado con digoxigenina. Los resultados obtenidos en el
ensayo de hibridación se muestran en la Figura 3.10-A; los tamaños de las bandas de
hibridación obtenidas en cada una de las muestras concuerdan con los tamaños
estimados para esos fragmentos después de recombinar con el gen gntP, tal y como se
muestra en el esquema de la Figura 3.10-B. En los carriles 1 y 6 se pueden ver bandas
de 7,9 y 6 Kb, correspondientes a las digestiones HindIII de DNA transconjugante con
el gen gntP interrumpido. En los carriles 2, 3 y 7 se observa una banda de 7,8 Kb
correspondiente a la digestión por BamHI de los DNA transconjugantes. Los carriles 4,
5, 8 y 9 presentan el patrón esperado para los controles, DNA de B. lactofermentum y C.
glutamicum silvestres, digeridos por BamHI: una banda de 4,1 Kb. En el carril 10 se
observa el patrón de bandas del mutante TRA-8 que posee un mapa de restricción
distinto (Mateos y col, 1996).
A)
1) B. lactofermentum R31 gntP- x HindIII
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2) B. lactofermentum R31 gntP- x BamHI
3) B. lactofermentum R31 gntP-x BamHI
11,5 Kb
7,8 Kb
6 Kb
5,1 Kb
4,6 Kb
4,5 Kb
2,8 Kb
2,6 Kb
2,4 Kb
2,1 Kb
1,7 Kb
4,1 Kb
4) B. lactofermentum R31 gntK- x BamHI
5) B. lactofarmentum R31 x BamHI
6) C. glutamicum gntP- x HindIII
7) C. glutamicum gntP- x BamHI
8) C. glutamicum gntK- x BamHI
1,1 Kb
9) C. gltuamicum 13032 x BamHI
10) C. glutamicum TRA-8 x BamHI
M) Marcador de tamaños: % x PstI
B)
4,1 kb
HindIII
BamHI
BamHI
HindIII
g n Pt
HindIII
pKP1
Kan
7,8 kb
HindIII
HindIII
BamHI
BamHI
HindIII
Kan
7,9 kb
6 kb
Figura 3.10.- A) Resultados de la hibridación Southern que demuestra la interrupción génica de gntP. B)
Esquema de los patrones de bandas esperados.
Los clones transconjugantes que presentaban interrupción del gen gntP fueron
analizados en diferentes medios de cultivo. Cuando estos clones fueron cultivados en
medio mínimo de corinebacterias con glucosa como fuente de carbono y energía, todos
ellos, tanto los controles como los transconjugantes crecieron eficientemente (Fig.
3.11-A). Esos mismos clones fueron cultivados en medio mínimo con ácido glucónico
como única fuente de carbono. Los resultados mostraron incapacidad de crecimiento en
este medio mínimo de los clones transconjugantes (tanto en cepas de C. glutamicum
como de B. lactofermentum) mientras que las cepas control no interrumpidas crecieron
en este mismo medio (Fig. 3.11-B). El comportamiento de estos clones recombinantes
es análogo al observado en el mutante C. glutamicum TRA-8 previamente descrito
(Valbuena 1999).
Figura 3.11.- A) Placa conteniendo MM de corinebacterias con glucosa: 1- Control positivo de B.
lactofermentum R31, sobre el mismo se sembraron los transconjugantes gntP- de la misma cepa. 2Control positivo de C. glutamicum ATCC13032, sobre el mismo se sembraron a su vez sus
correspondientes clones gntP-. B) Placa Petri conteniendo MM de corinebacterias con glucónico, se ha
sembrado de forma idéntica a la placa A.
3.4 Mapa físico de Corynebacterium glutamicum
Teniendo en cuenta la identificación y caracterización de una serie de genes
perteneciente al grupo de corinebacterias (dos de los cuales se mencionan en el apartado
anterior) y dado que recientemente se depositó en la base de datos la secuencia completa
sin anotar del genoma de Corynebacterium glutamicum, se procedió a la realización de
un mapa físico de genes ya caracterizados y publicados con el fin de posicionarlos con
respecto al origen de replicación del cromosoma bacteriano y ver su posición relativa.
Las secuencias obtenidas de la base de datos del EBI se introdujeron en el programa
BLAST del genoma completo de C. glutamicum localizado en la página Web de NCBI
en el apartado “BLAST of Microbial Genomes”. BLAST alinea las secuencias
problema con respecto al genoma total en ambos sentidos (5’&3’ y 3’'5’ en
complementaria) y proporciona su posición con respecto al origen de replicación
(“Ori”) que se encuentra en el punto 0 del genoma circular. Una vez obtenida la
posición se introduce en un archivo EXCEL junto con todas las demás secuencias
problema obtenidas en la base de datos de EBI para posteriormente dibujar el mapa
físico.
Como un control interno adicional, se utilizó en paralelo un archivo de texto que
contenía el genoma completo de C. glutamicum para introducir las secuencias
nucleotídicas encontradas en EBI, como palabras a buscar dentro del genoma total, cuyo
punto inicial era también el origen de replicación.
Todos los genes analizados fueron agrupados en 9 categorías distintas, siendo estas
categorías una simplificación de las utilizadas para clasificar los genes en E. coli
establecidas por Monica Riley (Karp y col., 2002). Hemos posicionado genes
implicados en la biosíntesis de aminoácidos, genes de división celular, codificantes para
proteínas y RNA ribosomales, implicados en el metabolismo celular, en el transporte de
compuestos a través de la membrana y en la transcripción o la síntesis de cofactores.
Figura 3.12.- Mapa físico de C. glutamicum. En el gráfico se representa la disposición de los genes,
externamente al cromosoma bacteriano se representan los genes cuya transcripción se da en el sentido
de las agujas del reloj e internamente al cromosoma se han dispuesto los nombres de aquellos genes
cuyo sentido es el contrario. Resaltadas de rojo se encuentran los genes caracterizados en el presente
trabajo.
En la siguiente tabla se representa un listado alfabético de los marcadores
señalando el producto de su codificación, sentido en el cromosoma y posición. Los
genes utilizados en la elaboración de este mapa físico provienen de la base de datos
EBI. No se han incluido aquellas secuencias con una posible función no demostrada
de forma experimental (secuencias putativas) ni aquellas presentes de forma parcial o
repetida en la base de datos. Tan solo se han podido obtener 220 genes en total que
cumplan estos requisitos, teniendo en cuenta que el genoma de C. glutamicum tiene
un tamaño de 3.309 Kb en total se estima que deberían existir 3.300 genes en este
microorganismo aproximadamente, por tanto el 93 % aún no se ha caracterizado de
forma definitiva.
Gen
Proteina
Sentido
Inicio
Fin
Gen
Proteina
Sentido
IInicio
Fin
accBC
ACoA Carboxilasa
(-)
718576
720352
dnaN
DNA polimerasa III subunidad beta
(+)
2292
3476
accDA
Subunidad carboxiltransferasa de acetil-CoA
carboxilasa
(-)
879638
881114
dtsR1
dtsR 1
(-)
728692
730324
aceA
Isocitrato Liasa
(+)
2470739
2472032
dtsR2
dtsR 2
(-)
726738
728351
aceB
Malato sintasa
(-)
2467921
2470141
dtxr
Represor de la toxina difterica
(+)
2022265
2022952
ackA
Acetato kinasa
(-)
2935311
2936505
ectp
Ectp proteina
(-)
2448324
2450172
alr
Alanina racemasa
(+)
600970
602056
fda
Fructosa bifosfato aldolasa
(-)
2954237
2955272
amt
Transporte de amonio
(-)
1675264
1676623
ftsI
Proteina de union a penicilina
(-)
2291208
2293323
amtP
Proteina de captacion de amonio de baja afinidad
(-)
2172150
2173467
ftsQ
ftsQ
(-)
2280466
2281135
amtR
Represor del sistema captacion de amonio de alta
afinidad
(-)
922392
923061
ftsY
ftsY
(-)
2173755
2174163
apt
Adenina fosforibosil transferasa
(-)
1754915
1755473
ftsZ
ftsZ
(-)
2278886
2280203
argB
N-acetilglutamato kinasa
(+)
1460492
1461377
g6pd
Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa
(+)
1667949
1669404
argC
N-acetilglutamato-5-semialdehido deshidrogenasa
(+)
1464082
1465126
gap
Gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa
(-)
1682616
1683627
argD
Actilornitina transaminasa
(+)
1461378
1462548
gdh
Glutamato deshidrogenasa
(-)
2194738
2196082
argF
Ornitina carbamoil transferasa
(+)
1462562
1463522
glk
Glucosa kinasa
(-)
2316578
2317550
argG
Argininosuccinato sintetasa
(+)
1470210
1471416
glnA
Glutamina sintetasa I
(+)
2348828
2350262
argH
Argininosuccinato liasa
(+)
1471476
1472913
glnA2
Glutamina sintetasa 2
(-)
2362814
2364098
argJ
Ornitina acetiltrasnferasa
(+)
1465210
1460377
glnB
Proteina PII
(-)
2171747
2172086
argR
Represor de la arginina
(+)
1469537
1470053
glnD
Uridiltransferasa
(-)
2169662
2171741
argS
Arginil-tRNA sintetasa
(+)
1238273
1239926
glnE
Adenililtransferasa
(-)
2359610
2362748
aroA
5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase
(-)
801186
802683
glt
Citrato sintasa
(+)
877837
879151
(+)
195239
199772
(+)
199772
201293
Glutamina 2 oxoglutarato aminotrasnferasa
(subunidad grande)
Glutamina 2 oxoglutarato aminotrasf. (subunidad
pequeña)
aroB
Deshidroquinato sintetasa
(-)
1717927
1719010
gltB
aroC
Corismato sintasa
(-)
1719665
1720898
gltD
aroD
3-dehidroquinato deshidratasa
(+)
446086
446524
gluA
gluA
(+)
2059773
2060502
aroE
Shikimato deshidrogenasa
(+)
446537
447380
gluB
gluB
(+)
2060619
2061507
aroK
Shikimato kinasa
(-)
1719103
1719613
gluC
gluC
(+)
2061628
2062306
aroP
Permeasa de aminoacidos aromaticos
(-)
1153291
1154683
gluD
gluD
(+)
2062441
2063263
asd
Aspartato semialdehido deshidrogenasa
(+)
270659
271694
glyA
Serina hydroximetiltransferasa
(+)
1050623
1051928
aspC
Aspartato aminotransferasa
(+)
256598
257897
gntK
Gluconato kinasa
(+)
2630668
2631139
atpA
Subunidad alfa de ATPasa
(+)
1275012
1276656
gntP
Gluconato permeasa
(+)
3108130
3109523
atpB
Subunidad a de ATPasa
(+)
1272184
1273153
grcC
Heptaprenil difosfato syntetasa
(+)
494768
495113
atpC
Subunidad epsilon de ATPasa
(+)
1279158
1279533
groEL
GroEL
(-)
2888973
2890620
atpD
Subunidad beta de ATPasa
(+)
1277694
1279146
guaA
GMP-sintasa
(+)
620003
621575
atpE
Subunidad c de ATPasa
(+)
1273287
1273530
gyrA
DNA girasa (topoisomerasa II) subunidad A
(+)
11831
14401
atpF
Subunidad b de ATPasa
(+)
1273561
1274128
gyrB
DNA girasa (topoisomerasa II) subunidad B
(+)
5435
7489
atpG
Subunidad gamma de ATPasa
(+)
1275012
1276656
hdh
Homoserina deshidrogenasa
(+)
1242506
1243844
atpH
Subunidad delta de ATPasa
(+)
1274134
1274950
hisA
Fosforibosilformimino-5-amino-1-fosforibosyl-4imidazolcarboxamida isomerasa
(-)
2211878
2212616
atpI
atpI
(+)
1271879
1272122
hisC
Histidinol-phosphate aminotransferase
(-)
2216490
2217591
betP
Sistema de transporte glicina betaina
(+)
944995
946783
hisD
Histidinol deshidrogenasa
(-)
2217596
2218895
bioA
Diaminopelargonato aminotransferasa
(+)
2770713
2771985
hisE
Fosforibosil-ATP-pirofosfohidrolasa
(-)
1586461
1586725
brnQ
transportador de aa- branched-chain
(+)
2445716
2446997
hisF
Ciclasa
(-)
2210269
2211043
cglIM
cglIM
(+)
1878311
1879403
hisG
ATP fosforibosil transferasa
(-)
1585599
1586439
clpB
Proteina heat shock, ATP-binding protein
(-)
2963602
2966161
hisH
Glutamina amidotransferasa
(-)
2212630
2213266
cmr
Proteina de resistencia "multidrug"
(+)
2961341
2962723
hk
Homoserina kinasa
(+)
1243855
1244784
cop1
csp1
(-)
3071646
3073620
icd
Isocitrato deshidrogenasa
(-)
677827
680044
cox2
Citocromo c oxidasa subunidad 2
(-)
2326917
2327997
ilvB
Acetohidroxiacido sintasa subunidad grande
(+)
1338130
1340011
ctaD
Citocromo aa3 oxidasa subunidad I
(-)
2671059
2672814
ilvC
Acetohidroxiacido isomeroreductasa
(+)
1340723
1341740
ctaE
Citocromo aa3 oxidasa
(-)
2325269
2325887
ilvD
Dihidroacido deshidratasa
(-)
1333438
1335277
cytB
Citocromo b subunidad
(-)
2321468
2323088
ilvE
Transaminasa B
(-)
2335911
2337051
dapA
Dihidrodipicolinato sintetasa
(-)
2079277
2080183
ilvN
Acetohidroxiacido sintasa subunidad pequeña
(+)
1340024
1340543
dapB
Dihidrodipicolinato reductasa
(-)
2081187
2081934
impA
Inositol monofosfato fosfatasa
(-)
2211047
2211827
dapD
Tetrahidrodipicolinato succinilasa
(-)
1152369
1153062
iso
HCCA isomerasa
(-)
18792
19557
dapE
Succinil diaminopimelato desuccinilasa
(+)
1155730
1156840
leuA
2-isopropilmalato sintasa
(-)
266150
268067
dciAE
Proteina de union a dipeptidos
(-)
1755714
1757223
leuB
3-isopropilmalato sintasa
(+)
1353488
1354511
ddh
Mesodiaminopimelato D-deshidrogenasa
(-)
2786752
2787715
lpd
Dihidrolipoamida deshidrogenasa
(+)
387691
389101
dnaA
ATPasa de iniciación de la replicación
(+)
1
1575
lrmB
Resistencia a lincomicina
(-)
2857609
2859055
Gen
Proteina
Sentido
IInicio
Fin
Gen
Proteina
Sentido
IInicio
Fin
ltsA
ltsA
(+)
2328515
2330438
rplA
Proteina ribosomal L1
(+)
499161
499872
lysA
Diaminopimelato descarboxilasa
(+)
1239932
1241266
rplK
Proteina ribosomal 50S L11
(+)
498598
499036
lysA
Diaminopimelato deshidrogenasa
(-)
2523232
2524195
rpoD
Factor sigma de RNA polimerasa
(+)
2012244
2013360
lysC
Aspartato kinasa
(+)
269370
270636
rrfE
rRNA 5s
(+)
81753
81873
lysE
Proteína exportadora de Lys
(-)
1328242
1328944
rrfE
rRNA 5s
(+)
861222
861342
lysG
Proteina de regulacion de la exportacion de lisina
(+)
1329014
1329887
rrfE
rRNA 5s
(+)
1484475
1484595
lysI
L-Lisina permeasa
(-)
1030365
1031871
rrfE
rRNA 5s
(-)
2703710
2703830
mdh
L-malato deshidrogenasa
(-)
2113860
2115363
rrfE
rRNA 5s
(-)
2712577
2712697
mdh
Malato deshidrogenasa
(+)
2522261
2523248
rrfE
rRNA 5s
(-)
3145969
3146089
men
Enzima malica
(+)
3208278
3209457
rrlE
rRNA 23s
(+)
78554
81641
metA
Homoserina O-acetil transferasa
(-)
665179
666319
rrlE
rRNA 23s
(+)
858033
861120
metB
Cistathionina gamma-sintasa
(-)
2590308
2591469
rrlE
rRNA 23s
(+)
1481277
1484364
metC
Cistathionina beta-liasa
(+)
2444605
2445712
rrlE
rRNA 23s
(-)
2703946
2707033
metK
Metionina adenosil trasnferasa
(-)
1699173
1700397
rrlE
rRNA 23s
(-)
2712813
2715900
metX
S-adenosil metionina sintetasa
(-)
1699160
1700807
rrlE
rRNA 23s
(-)
3146201
3149288
metY
O-acetylhomoserine sulfhydrylase
(-)
666456
667770
rrsE
rRNA 16s
(+)
76642
78165
murC
murC
(-)
2281162
2282623
rrsE
rRNA 16s
(+)
856118
857641
murE
Mesodiaminopimelato ligasa
(-)
2289529
2291196
rrsE
rRNA 16s
(+)
1479363
1480886
murF
D-alanil-D-alanina ligasa
(-)
2288639
2289519
rrsE
rRNA 16s
(-)
2707424
2708947
murI
D-glutamato racemasa
(-)
2658602
2659457
rrsE
rRNA 16s
(-)
2716291
2717814
ndh
NADH deshidrogenasa
(-)
1543150
1544554
rrsE
rRNA 16s
(-)
3149678
3151201
nrdE
Ribonucleotido reductasa subunidad alfa
(-)
2677474
2679598
ruvA
Holliday junction DNA-helicasa
(-)
1762512
1763133
nrdf
Ribonucleotido reductasa subunidad beta
(-)
2673335
2673943
ruvB
Holliday junction DNA-helicasa
(-)
1761413
1762505
nrdH
Glutaredoxina
(-)
2680415
2680649
ruvC
Crossover junction endodeoxiribonucleasa
(-)
1763173
1763839
nrdI
nrdI
(-)
2679679
2680126
secA
Proteina secA
(+)
796249
798787
nusG
Antiterminador transcripcional
(+)
497373
498330
secD
SecD
(-)
1758796
1760710
ocd
Ornitina ciclodescarboxilasa
(-)
1674119
1675208
secE
Componente del sistema de translocacion de
proteinas
(+)
496809
497145
odhA
2-oxoglutarato deshidrogenasa
(-)
1172497
1176271
secF
SecF
(-)
1757581
1758793
oriC
Origen de replicación
(+)
1575
2292
secG
Proteina secG
(-)
1677045
1677279
panB
3-metil-2-oxobutanoato hydroxymetiltransferasa
(-)
127188
128004
secY
Subunidad secY de la preproteina translocasa
(+)
569451
570774
panC
Pantoato-beta alanina ligasa
(-)
126349
127189
sod
Superoxido dismutasa
(+)
3126391
3126994
panD
Precursor L-aspartato-alpha-decarboxilasa
(-)
147569
147980
soxA
Sarcosina oxidasa
(-)
1673489
1674105
pck
PEP carboxikinasa
(-)
3052058
3053891
thrC
Treonina sintasa
(-)
2353596
2355042
pgk
Fosfoglicerato kinasa
(-)
1681186
1682398
thrE
Exportador de treonina
(+)
2790981
2792451
pgsA2
Fosfatidil glicerofosfato sintasa
(-)
2070515
2071148
tkt
Transketolasa
(+)
1664474
1666505
pheA
Prefenato deshidratasa
(-)
3098574
3099522
tnp
Transposasa
(+)
1114485
1115796
pntP
Transporte de prolina
(-)
1218027
1219602
tpi
Triosafosfato isomerasa
(-)
1680328
1681108
porA
Porina
(-)
2887940
2888078
trp
Operon triptofano
(+)
3232696
3240422
ppc
PEP carboxilasa
(-)
1677383
1680143
trpA
Triptofano sintasa
(+)
3239817
3240438
proA
Gamma glutamil fosfato reductasa
(-)
2494335
2495634
trpD
Antranilato fosforibosiltransferasa
(+)
3235601
3236648
proB
Gamma glutamil kinasa
(-)
2496666
2497776
trpE
Antranilato sintasa componente I
(+)
3233402
3234959
proC
L-prolina NADP+ 5-oxidoreductasa
(+)
434885
435698
trpL
Secuencia leader de operon triptofano
(+)
3233150
3233204
proP
proP
(-)
3272559
3274074
tuf
Proteina del factor de elongacion Tu
(+)
526375
527566
pta
Fosfato acetil transferasa
(-)
2936504
2937494
ureA
Subunidad gamma de ureasa
(+)
91173
91476
pts1
PEP fosfotransferasa sistema 1
(-)
2039614
2041312
ureB
Subunidad beta de ureasa
(+)
91502
91991
ptsM
PEP fosfotransferasa sistema 2
(+)
1423216
1425268
ureC
Subunidad alfa de ureasa
(+)
91992
93705
pyc
Piruvato carboxilasa
(+)
705210
708633
ureD
Proteina accesoria de ureasa
(+)
95521
96373
pykA
Piruvato kinasa
(-)
2205664
2207092
ureE
(+)
93730
94294
pyrA
Carbamoil fosfato sintetasa
(-)
1707702
1708884
ureF
(+)
94294
94885
qcrA
Proteina rieske (operon QcrCAB)
(-)
2321891
2323117
ureG
(+)
94902
95529
qcrB
Citocromo del complejo bc1
(-)
2320269
2321888
xylB
Xilulokinasa
(+)
126190
126353
qcrC
Citocromo c1
(-)
2323120
2323971
ytqA
Desthiobiotin sintasa
(+)
2771692
2772367
recA
recA
(-)
2063985
2065116
Regulador de Respuesta
(+)
928116
928815
recF
ATPasa de reparación en recombinación
(+)
3585
4769
Sensor de la kinasa
(+)
928883
930251
rel
GTP pirofosfokinasa
(-)
1752604
1754887
3.5 Análisis de la disposición cromosómica de los genes gnt en
C. glutamicum
Los trabajos previos realizados sobre el metabolismo del ácido glucónico en
C. glutamicum indicaban que los genes implicados, a diferencia de otros
microorganismos tales como E. coli o Bacillus subtillis, no forman un operón. En el
presente trabajo se han localizado dentro del genoma de este microorganismo ambos
genes y se observa una distancia entre ellos de aproximadamente 500 Kb. Para
establecer si este patrón se repite en otras bacterias se ha realizado la siguiente
comparación.
Streptomyces coelicolor
gntR gntK
Deinococcus radiodurans
gntR
gntP
gntK
Pasteurella multocida
gntK
gntP
Schizosaccharomyces pombe
gntP
gntK
Neisseria meningitidis
gntP
gntK
Staphylococcus aureus
gntR
gntK
gntP
Bacillus subtilis
gntR
gntP
gntK
gntZ
Pseudomonas aeruginosa
gntR
gntK
gntP
Corynebacterium diphteriae
gntK
gntP
gntK
gntP
E.coli
gntR
gntK
gntU
gntP
Figura 3.13.- Comparativa de la disposición cromosómica de genes implicados en el metabolismo del
glucónico. Genes: gntK, gluconato kinasa; gntP, gluconato permeasa; gntR, regulador del operon gnt;
gntU, permeasa de glucónico de baja afinidad; gntZ, glucosa-6-P deshidrogenasa.
Los datos reflejan que la disposición de los genes gnt en los distintos
microorganismos analizados es dispar, no hay un patrón que se repita. Se puede deducir
que la necesidad de una forma de regulación finamente establecida solo es necesaria en
aquellas bacterias que utilicen ácido glucónico como una fuente de energía y carbono
constante, como es el caso de E. coli y algunos patógenos. El hábitat natural de las
corinebacterias no patógenas es el suelo, donde este compuesto tiene menor
importancia, aunque puedan tener contacto con él pues son microorganismos saprofitos
y durante el proceso de descomposición orgánica se generan este tipo de compuestos.
En cambio, en el caso de corinebacterias patógenas, al poder crecer en un medio interno
rico en nutrientes, tienen un contacto mayor con todo tipo de derivados orgánicos y por
ello la coordinación en la expresión de estos genes puede tener mayor relevancia, por
ello se da una disposición adyacente de los genes gnt dentro del cromosoma bacteriano
de C. diphteriae. Si las actividades enzimáticas no son esenciales para la célula, no
están sometidas a una presión selectiva tal que impida la ruptura de la disposición en
operones por movimientos de estos genes, de forma que pueden haberse originado
pérdidas y adquisiciones de los mismos a lo largo de la historia evolutiva de C.
glutamicum. Esto en principio es lo que refleja un análisis filogenético de las secuencias
proteicas de las enzimas gluconato kinasa y permeasa donde se observa que tienen
relaciones filogenéticas distintas (Fig. 3.14 y 3.15).
Figura 3.14.- Filograma de distintas enzimas gluconato kinasas.
Figura 3.15.- Filograma de distintas enzimas gluconato permeasas.
Otro dato adicional es el obtenido mediante una búsqueda en el cromosoma de
C. glutamicum de los genes edd y eda, implicados en la ruta de Entner-Doudoroff,
encontrándose solo al primero de estos genes.
Esto puede indicar que de forma
ancestral C. glutamicum pudo tener esta vía activa, que es un destino catabólico del
ácido glucónico introducido en la célula gracias a los productos de la expresión de los
genes gnt, pero la falta de una ventaja evolutiva clara de dicha ruta en el ambiente de
estos microorganismos hizo que se perdiese el gen eda. Por ello se piensa que el único
destino final en C. glutamicum para el glucónico introducido debe ser la ruta de las
pentosas fosfato.
3.6 Aplicaciones prácticas del presente trabajo
La caracterización de las rutas biosintéticas de aminoácidos en corinebacterias ha
sido objetivo fundamental en la investigación centrada en estos microorganismos,
dejando de lado aspectos metabólicos de los mismos. Por otro lado, el estudio de la vía
de catabolismo del ácido glucónico en corinebacterias ha cobrado especial relevancia
gracias a la caracterización de la enzima 2,5-diketo-D-gluconato reductasa. Se ha
descubierto que dicha enzima puede participar en una nueva forma de producción de
vitamina C alternativa a la síntesis orgánica de Reichstein y Grussner, procedimiento
actualmente empleado en su producción industrial y que tiene cierta problemática
debido a lo complejo del proceso. Mediante el uso de bacterias capaces de oxidar
parcialmente glucosa por fermentación, se obtiene 2,5-diketo-D-gluconato (25DKG) el
cual es reducido por esta reductasa de corinebacterias produciéndose 2-keto-L-gulonato
(2KLG), intermediario directo del ácido L-ascórbico (vitamina C) (Khurana y col.,
2000). Se desconocían las características de los genes capaces de permitir un
crecimiento de corinebacterias con glucónico como única fuente de carbono debido a la
falta de información sobre las rutas metabólicas en estos microorganismos. Los
resultados obtenidos en el presente trabajo han confirmado la existencia de esta ruta
catabólica, lo cual permite comprender mejor el comportamiento de estas bacterias en
los medios de cultivo utilizados para la producción industrial de la vitamina y da pie a
posibles alteraciones de los genes gnt para una posible mejora de las cepas utilizadas.
4
Conclusiones
4. Conclusiones
1.- Se ha identificado el gen gntK en Corynebacterium glutamicum que codifica
para una actividad enzimática gluconato kinasa que, junto con la actividad gluconato
permeasa, establece la existencia de una ruta catabólica del ácido glucónico en este
microorganismo.
2.-La interrupción del gen gntK conduce a la incapacidad de crecer en medio
mínimo con ácido glucónico como única fuente de carbono. La interrupción del gen
gntP en el extremo carboxilo conduce igualmente a la obtención de mutantes incapaces
de crecer en medio mínimo con ácido glucónico.
3.-Los análisis realizados sobre la disposición cromosómica de los genes gntK y
gntP en C. glutamicum, una corinebacteria no patógena, ponen de manifiesto que no se
encuentran agrupados como ocurre en la mayoría de las bacterias patógenas analizadas.
5
Bibliografía
5. Bibliografía
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Identificación y análisis funcional de genes implicados en el

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