6CFE01-378 - congreso forestal español

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6CFE01-378
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Feromona agregativa y respuestas cairomonales del perforador de los pinos
Monochamus sutor (Coleoptera: Cerambycidae)
PAJARES ALONSO, J.A.1, ÁLVAREZ BAZ G.1, ETXEBESTE LARRAÑAGA, I.1,
SÁNCHEZ HUSILLOS, E.1, CENTENO ROBLES, F.2, IBARRA IBÁÑEZ, N.2,
DOUGLAS, P.3 y HALL, D.3.
1
Instituto Universitario de Gestión Forestal Sostenible, Universidad de Valladolid-INIA, 34071 Palencia.
Consejería de Medio Ambiente, Gobierno de Aragón, 50059 Zaragoza
3
Natural Resources Institute, University of Greenwich, Chatham Maritime, Kent ME4 4TB, UK.
2
Resumen
Monochamus sutor es un cerambícido perforador de pinos, píceas y abetos presente en
Asia y Europa, desde los países nórdicos hasta los Pirineos. Como otras especies del género,
es un insecto secundario que coloniza árboles, o partes de ellos, recientemente muertos o
moribundos, o dañados por el fuego. Su relevancia reside, como en todos los Monochamus
asociados a coníferas, en constituir un potencial agente transmisor del Nematodo del Pino
(Pine Wood Nematode) Bursaphelenchus xylophilus (Steiner et Buhrer) Nickle, un patógeno
causante de la devastadora enfermedad del Marchitamiento del Pino (Pine Wilt Disease),
introducida en Portugal desde 1999 y que amenaza con extenderse por las masas europeas. En
el sur de Europa M. galloprovincialis ha sido confirmado como vector nativo del patógeno, y
estudios recientes han mostrado su complejo sistema de comunicación química que incluye
una feromona agregativa emitida por los machos. En este trabajo se presentan resultados
sobre la identificación de la feromona agregativa de M. sutor. Compuestos volátiles
procedentes de los machos fueron capturados y los análisis mediante GC-MS revelaron la
presencia de un compuesto específico de los machos identificado como 2-(undeciloxi)-etanol,
que resultó electrofisiológicamente activo en la antena de machos y hembras. Este compuesto
ha sido encontrado recientemente como la feromona de otras especies del mismo género en
Europa, Asia y Norteamérica. Bioensayos de campo llevados a cabo en poblaciones
pirenaicas de M. sutor mostraron que este compuesto fue atractivo tanto a machos como a
hembras, y su poder atractivo fue incrementado cuando fue emitido junto a compuestos
cairomonales de escolítidos y a volátiles de pinos. Estos resultados contribuirán al desarrollo
de un cebo atractivo eficiente para el seguimiento y manejo de este insecto.
Palabras clave
2-(undeciloxi)-etanol, ipsenol, metil-butenol, Pine wood nematode, Bursaphelenchus
xylophilus
1. Introducción
El marchitamiento, decaimiento súbito o seca de los pinos, (“Pine Wilt Disease”), una
mortal patología causada por el nemátodo del pino o de la madera del pino (“Pine wood
nematode”) Bursaphelenchus xylophilus (Steiner et Buhrer) Nickle, supone actualmente una
gravísima amenaza para muchos de nuestros pinares. Este organismo, originario de
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Norteamérica, ha causado severísimos daños que han supuesto la muerte de millones de
árboles cuando ha sido introducido en nuevas áreas: Japón (1905), China (1982), Taiwan
(1982) y Corea (1988) (FUTAI; 08; ZHAO, 08; SHIN, 08). En 1999 se observó su presencia
en la península de Setúbal en Portugal (MOTA et al., 1999), desde donde finalmente se ha
extendido por amplias zonas del centro y sur de Portugal. Desafortunadamente, en los últimos
años de han detectado tres focos de introducción de este patógeno en nuestro país, próximos a
la frontera portuguesa, en la S. de Dios Padre (Cáceres, 2008), As Neves (Pontevedra, 2011) y
Valverde del fresno (Cáceres, 2011), que se encuentran en proceso de erradicación.
Es conocido que este patógeno requiere necesariamente el concurso de insectos
cerambícidos del género Monochamus para ser transmitido e infectar a sus árboles
hospedantes. Estos insectos se reproducen en el floema y xilema de los árboles enfermos y su
biología está interrelacionada con el ciclo vital del nematodo. El nematodo inverna en la
madera de los árboles infectados o muertos, y a comienzos de primavera sus larvas del tercer
estadio dispersante se agregan en torno las cámaras de pupación de los insectos, mudando
para producir las larvas dispersantes del 4º estadio (larvas “dauer”), que penetran por los
espiráculos respiratorios de los adultos pre-emergentes. Los nuevos cerambícidos son
sexualmente inmaduros y al emerger se dirigen a alimentarse en el floema de los ramillos de
los árboles sanos, de forma que las larvas dauer abandonan entonces el insecto y penetran en
el árbol a través de estas heridas de alimentación (MAMIYA & ENDA, 1972). Los
nematodos se reproducen muy rápidamente, destruyendo las células vegetales y una vez que
el árbol está moribundo, los Monochamus adultos ovipositan bajo su corteza. Las larvas del
vector, después de alimentarse del floema y xilema externo del tronco y ramas, penetran en la
madera y finalmente pupan en ella, completando el ciclo de transmisión.
M. galloprovincialis ha sido demostrado como el insecto vector de la enfermedad en
Portugal, y seguramente es el responsable de la introducción del patógeno en nuestro país.
Esta especie está ampliamente distribuída por toda Europa, hasta el sur de Escandinavia,
aunque es más abundante en los pinares del sur del continente. Estudios recientes han
desvelado una compleja ecología química reproductiva en esta especie, en procesos
fundamentales de búsqueda y selección del hospedante y del apareamiento, con la
intervención de feromonas agregativas producidas por los machos (PAJARES et al, 2010), de
respuestas cairomonales atractivas a compuestos volátiles de hospedantes y de coleópteros
escolítidos competidores (PAJARES et al 2004, IBEAS et al 2007), y de feromonas sexuales
de contacto para la discriminación de la pareja (IBEAS et al 2008, 2009). Fruto de estos
estudios ha sido el desarrollo y comercialización de un cebo feromonal-cairomonal altamente
atractivo para el manejo de esta especie (GALLOPROTECT 2D; SEDQ, Barcelona).
Además de la anterior, existen otras especies de Monochamus en Europa que también
resultan potenciales vectores de la de la enfermedad. Así, Monochamus sutor L. está
ampliamente distribuido por Europa y Asia, si bien en España sólo parece estar presente en
los pinares de los Pirineos (VIVES, 2000). Al igual que M. galloprovincialis, esta especie
secundaria coloniza árboles muy estresados, dañados por el fuego o derribados por la nieve, y
aunque hasta ahora no se conozca su implicación en el proceso de infección de la enfermedad,
podría resultar un importante vector en las áreas donde abunda, toda vez que se conoce su
capacidad de transportar otros Bursaphelenchus no patógenos (SCHROEDER &
MAGNUSSON, 1992).
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2. Objetivos
Presentamos aquí los resultados de estudios encaminados a la identificación de los
compuestos, feromonales o cairomonales, potencialmente atractivos para M. sutor que
intervengan en su ecología química y que pudiesen ser utilizados en el desarrollo de
herramientas para el seguimiento y control de esta especie.
3. Metodología
Captura y análisis de compuestos volátiles
Los insectos adultos de M. sutor utilizados se capturaron en trampas multiembudos
dotadas con el cebo atractivo comercializado para M. galloprovincialis (GALLOPROTECT
2D; SEDQ, Barcelona) cerca de Torla, Huesca. Los insectos, una vez sexados fueron
mantenidos individualmente en frascos de vidrio dentro de cámaras de cría y fueron
alimentados con ramillas frescas de Pinus sylvestris L. Se dejó a un grupo de estos adultos
ovipositar en parejas sobre trozas frescas de pino silvestre, dentro de cajas de plástico en
condiciones de laboratorio. Se dejó evolucionar a la progenie, hasta la obtención de los
nuevos adultos emergentes al año siguiente. Adultos de M. sutor, machos y hembras por
separado, fueron mantenidos en frascos de vidrio silanizado, junto con ramillos de pino
silvestre, en condiciones de fotoperiodo (12L: 12O). Se circuló aire purificado con un filtro de
carbón activado a través del contenedor y los volátiles fueron recogidos durante 1 a 3 días en
un filtro de Porapak Q, de donde se extrajeron con diclorometano.
Los extractos de volátiles se analizaron mediante Cromatografía de Gases (GC) con un
detector FID. Las inyecciones fueron en modo splitless (200°C), usando helio como gas
transportador (2.4 ml/min), y la temperatura del horno fue mantenida a 50ºC durante 2 min,
luego subiendo 10ºC/min hasta 250ºC. Los extractos se analizaron además mediante GC-MS
en el modo ionización por impacto de electrón (EI). Las inyecciones fueron splitless (220°C),
usando helio como gas transportador (1 ml/min), y la temperatura del horno fue mantenida a
40ºC durante 2 min, luego subiendo 6ºC/min hasta 250ºC. Las cantidades de feromona en los
extractos fueron cuantificadas por comparación con muestras estándar auténticas.
Se realizaron también análisis electroantenográficos GC-EAG de los extractos bajo las
mismas condiciones de columna descritas antes, con un registrador EAG (modelo INR-02;
Syntech, Hilversum, Holanda) consistente en electrodos de plata dentro de capilares de vidrio
conteniendo una solución salina, micromanipulador y amplificador. La antena fue seccionada
por su base y suspendida entre los electrodos, que se conectaron a sus bordes. Todos los
ensayos de colección y análisis de volátiles fueron realizados en los laboratorios del Natural
Resources Institute (Kent, Reino Unido).
Bioensayos de campo
Las pruebas de campo se llevaron a cabo en los Pirineos, en las proximidades de Torla
(Huesca, Aragón) a elevaciones entre 1600 a 2000 m. El sito experimental consistió en una
laderas de montaña fuertemente empinadas, orientadas al sur y suroeste, cubiertas por
formaciones naturales de pino negro Pinus uncinata Mill. ex Mirb., y presencia de
P. sylvestris en las zonas de menor altitud. Ambas especies son hospedantes de M. sutor y se
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observó abundante material hospedante en la zona experimental, en forma de ramas y troncos
dañados por la nieve, y árboles puntisecos (Figura 1).
Se evaluó la atracción del candidatos feromonal y de varios cairomonales, agrupados
en cinco tratamientos: Fe: 2-(undeciloxi)-etanol; H: una combinación de compuestos volatiles
del hospedante formada por (±)-α-pineno y (±)-3-careno; C: una mezcla de cairomonas
formada por los compuestos feromonales de escolítidos ipsenol, ipsdienol, 2-metil-3-buten-2ol y cis-verbenol; Fe+C+H: los tres tratamientos anteriores juntos; Control: una trampa sin
cebar. Todos los dispensadores fueron preparados especialmente por la Sociedad Española de
Desarrollos Químicos, S.L. (Barcelona). Los tratamientos fueron testados en trampas
multiembudos de 12 unidades dotadas de botes colectores de 2 l preparados para la captura de
individuos vivo (Econex, Murcia). Las trampas se suspendieron 2 m sobre el suelo desde
cuerdas tendidas entre árboles. El diseño experimental consistió en cinco bloques aleatorios
completos, cada unos de los cuales contenía los cinco tratamientos asignados aleatoriamente.
Las trampas, separadas al menos 90 m dentro de cada bloque y 500 m entre bloques,
estuvieron desplegadas desde el 11 de julio al 25 de Agosto de 2011, fueron revisadas
semanalmente y las capturas fueron identificadas y sexadas.
Figura 1. Aspecto del área del bioensayo de campo con abundante material hospedante (Torla, Huesca)
Análisis estadísticos
Para el análisis se utilizaron los datos de capturas acumulados a lo largo de todo el
experimento como la variable respuesta. Se ajustó la respuesta frente a los factores
bloque y tratamiento y a una distribución del error tipo Poisson en un modelo linear
generalizado (GLM) con una función log-link. Algunos tratamientos con alta frecuencia
de respuesta cero fueron excluidos del análisis. Las diferencias entre los tratamientos se
separaron usando un test de Tukey HSD, con la aplicación de la corrección de
Bonferroni al valor de α para el intervalo de confianza. Todos los cálculos fueron
realizados usando el lenguaje R (The R Development Core Team, 2011).
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4. Resultados
Identificación de la feromona
Los análisis de los compuestos volátiles de machos y hembras de M. sutor mostraron
la presencia de un compuesto específico en los machos (Figura 2), con similar índice de
retención e índice EI del MS que el compuesto 2-(undeciloxi)-etanol. La mayor cantidad
obtenida de este compuesto fueron 40 µg en cinco machos durante un periodo de 12 h. Este
compuesto siempre se detectó en los volátiles capturados de los machos pero nunca en los
procedentes de las hembras. En los análisis GC-EAG de los volátiles de los machos, la única
respuesta consistente obtenida fue para este componente específico de los machos. Ambas
respuestas de las antenas de machos y de hembras fueron similares.
Figura 2. Análisis GC-EAG de los volátiles de los machos de M. sutor. El asterisco indica el compuesto específico.
Bioensayos de campo
Las pruebas de campo mostraron que la feromona propuesta, 2-(undeciloxi)-etanol
(Fe), resulto significativamente atractiva tanto a machos como a hembras de M. sutor (Figura
3). La mezcal de las cairomonas (C) de escolítidos fue también atractiva a individuos de
ambos sexos, pero la mezcla de volátiles de los pinos (H) sólo fue ligeramente atractiva a las
hembras pero no a los machos. La combinación de los tres cebos (Fe+C+H) resultó
significativamente más atractiva que ninguno de sus componentes por separado y este
aumento fue más bien de tipo aditivo. El sex ratio de la combinación triple resultó más
sesgado hacia los machos (1:0.6, M:H) que con la feromona sola (1:0.9 M:H).
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Figura 3. Capturas medias (+ SE) de los machos (izquierda) y de las hembras (derecha) de M. sutor en Torla, Huesca, en
trampas multiembudos sin cebar (Control) o en trampas cebadas con volátiles del hospedante (H), cairomonas de escolítidos
(C), feromona (Fe), y la combinación de las tres (Fe+C+H). Las medias con letras distintas son significativamente
diferentes (p<0.05)
5. Discusión
Los anteriores resultados evidencian que 2-(undeciloxi)-etanol es el principal, sino el
único, componente de la feromona agregativa de M. sutor. Este compuesto sólo apareció en
los volátiles capturados de los machos y provocó respuesta electrofisiológicas en las antenas
de ambos sexos. Los bioensayos de campo mostraron que este compuesto es atractivo a
machos y hembras de las poblaciones pirenaicas de la especie. Bioensayos de campo
realizados simultáneamente en Suecia y China han encontrado respuestas similares a este
compuesto y a cairomonas de escolítidos o del hospedante en las poblaciones de esta especie
del norte de Europa y del este de Asia. Estos resultados, junto con los de las poblaciones
pirenaicas, han sido reportados recientemente (PAJARES et al, 2013). Junto con M. sutor
ahora, este hidroxieter ha sido encontrado previamente como la feromona masculina
específica de M. galloprovincialis (PAJARES et al., 2010), M. alternatus (TEALE et al.,
2011), M. carolinensis (Olivier) y M. titillator (F.) (ALLISON et al., 2012), y M. scutellatus
(Say) (FIERKE et al., 2013), y está relacionado también con otros éteres de cadena lineal
encontrados como componentes feromonales de otros cerambícidos de la subfamilia Laminae,
como Anoplophora glabripennis (Motschulsky) (ZHANG et al., 2002).
En otras especies de Monochamus, como en M. galloprovincialis (PAJARES et al.,
2010), la atracción a 2-(undeciloxi)-etanol puede ser aumentada cuando se combina la
feromona con cairomonas de escolítidos. En nuestro caso, mientras que los volátiles del
hospedante α-pineno y 3-careno fueron solo débilmente atractivos a las hembras de M. sutor
pero no a los machos, la mezcla de cairomonas de escolítidos fue significativamente atractiva
para ambos sexos. Además, la combinación de la feromona con las cairomonas de escolítidos
y con los volátiles de los pinos resultó en un cebo más atractivo aún.
El alto riesgo para la supervivencia de muchos de los pinares europeos que supone la
introducción del nematodo del pino en nuestro continente obliga al desarrollo urgente de
herramientas para que permitan la detección, seguimiento y manejo de ambos organismos,
tanto el nematodo patógeno como sus insectos vectores. En la actualidad, los cebos basados
en una combinación feromonal-cairomonal desarrollados para el manejo de M.
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galloprovincialis (PAJARES et al., 2010) están siendo utilizados eficazmente en los
programas de erradicación del nematodo en los tres focos declarados en nuestro país, tanto
para la detección de nematodos transportados en los vectores como en la reducción de las
poblaciones locales del cerambícido mediante estrategias de captura masiva. Los resultados
que se aportan aquí podrían servir para desarrollar un cebo atrayente de similar eficacia útil en
el manejo de M. sutor en caso de que fuese necesario.
6. Conclusiones
Los resultados de los bioensayos de laboratorio y campo han demostrado que el hidroxiéter
2-(undeciloxi)-etanol pude ser considerado como el principal componente, sino el único, de la
feromona agregativa emitido por los machos de M. sutor. Se confirma la extensión de este
compuesto como feromona agregativa en numerosos especies de este género. Esta feromona
resultó atractiva a machos y a hembras en campo y combinada con otros compuestos
cairomonales de escolítidos o del hospedante puede formar parte de un cebo eficaz para el
manejo de esta especie.
7. Agradecimientos
Agradecemos a Enrique Martín, Manuel Grasa, José Antonio Sesé, Rodolfo García,
Amaia Gómez de Segura (Dpto. Agricultura, Ganadería y Medio Ambiente, Gobierno de
Aragón) y a Daniel Álvarez (Universidad de Valladolid) y al personal del Centro de Sanidad
Forestal de Calabazanos (Junta de Castilla y León, Palencia) por su asistencia técnica. Este
estudio ha sido financiado por la Unión Europea a través del proyecto KBBE.2010.1.4-09.
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